CN108084255B

CN108084255B - 一种重组犬c反应蛋白及其单克隆抗体的制备

Info

Publication number: CN108084255B
Application number: CN201711343332.XA
Authority: CN
Inventors: 胡祥叶; 余铭恩; 项美华; 朱伟; 王璐; 刘清泉; 吴琼杉; 曹丹琴; 武戌青; 王立童
Original assignee: HANGZHOU XIANZHI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: HANGZHOU XIANZHI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2037-12-14
Also published as: CN108084255A

Abstract

本发明属于生物技术领域。本发明提供了一种多肽，该多肽包含犬C反应蛋白(CRP)两个优势抗原表位，为增强其免疫效果，将该多肽偶联KLH蛋白。本发明提供了一种犬CRP重组蛋白，该重组蛋白主要包含犬CRP两个优势抗原表位。为提高该重组蛋白在原核表达系统中的产量，采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应核苷酸序列，通过化学合成该核苷酸序列并构建重组蛋白表达载体。本发明还涉及该重组蛋白单克隆抗体的制备，经过抗原免疫、细胞融合及多轮筛选后得到单克隆细胞株，纯化单克隆抗体并分别标记荧光微球，通过正交实验确定最佳单抗配对组合，可用于炎症诊断。

Description

一种重组犬C反应蛋白及其单克隆抗体的制备

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种多肽，化学合成该多肽并偶联KLH蛋白。同时涉及一种重组蛋白、编码该重组蛋白的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的质粒载体、转化含有上述质粒载体的菌株，还涉及使用上述KLH偶联蛋白制备犬C反应蛋白单克隆抗体，使用上述重组蛋白筛选犬C反应蛋白单克隆抗体并应用于犬炎症早期诊断。

背景技术

机体在受到创伤、感染等刺激时，会出现急性期反应，受到刺激的巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞会释放一些促炎因子，促进肝脏合成一些血急性期反应蛋白。不同物种急性期反应蛋白略有不同，C反应蛋白(CRP)是犬最主要的急性期反应蛋白。在发挥机体固有免疫反应方面起着积极作用，在多种疾病中会出现显著变化，是急性感染和炎症性疾病的一种生物标志物，在疾病治疗监测和预后方面起着非常重要作用。因此，能够在疾病早期对犬C反应蛋白做出正确诊断显得尤为重要。

近30年来，研究者探索出了多种CRP检测方法，主要包括：乳胶凝集法、ELISA、以及免疫层析法。在这些检测方法中，乳胶凝集法是半定量检测法，目前已经基本上被淘汰；ELISA能检出极低浓度CRP，但试验流程繁琐、消耗时间长且极低浓度CRP的临床意义有限；免疫层析法由于其操作极为简单，且结果不受脂血症和溶血的影响，适合临床应用。

免疫层析法具体采用单克隆抗体识别检测犬C反应蛋白，该方法特异性及灵敏度俱佳。若结合荧光微球平台，一般能在10～15分钟内获得准确结果，适合大批量样本快速检测，无特殊人员要求。

目前，免疫学方法检测犬C反应蛋白由于操作简便、结果易于判定，已成为主流方向。该方法通常需要制备可识别犬C反应蛋白的单克隆抗体，常规犬C反应蛋白单克隆抗体制备所使用的免疫原是基因工程技术表达的完整蛋白，由于碱基密码子的缘故，该蛋白在大肠杆菌中表达困难、表达量极低，导致后续纯化工作难以开展，严重阻碍其单克隆抗体制备。另外，由于抗原表位氨基酸序列同源性缘故，使用犬C反应蛋白全长序列作为免疫原制备得到的单克隆抗体特异性差，与其它物种蛋白具有高度同源性，从而导致检测结果失真。

发明内容

设计目的：为解决免疫学方法检测犬C反应蛋白的不足之处，通过设计、合成KLH偶联蛋白并制备其单克隆抗体，同时通过设计、表达重组犬C反应蛋白筛选其单克隆抗体来实现对犬C反应蛋白特异性检测识别，既增强了检测灵敏度兼顾其广谱性，又不会导致检测结果失真。

设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以犬C反应蛋白为靶抗原，分析并选择该抗原两个优势抗原表位，序列比较结果显示所选择的两个抗原表位是所有犬C反应蛋白共有表位并与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为增强免疫效果并缩短单克隆抗体制备时间，将所选择的两个优势抗原表位串联并偶联KLH蛋白，用其免疫小鼠。(3)将所选择的两个优势抗原表位序列分别通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接后重复，形成重组犬C反应蛋白氨基酸序列。(4)为提高该重组蛋白表达量，采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列。(5)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET-28a(+)，构建重组犬C反应蛋白表达载体。(6)重组犬C反应蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选得到重组蛋白表达菌株。(7)重组蛋白表达菌株大规模培养后，经超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化重组犬C反应蛋白。(8)KLH偶联蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，使用重组犬C反应蛋白多轮筛选最终得到分泌犬C反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(9)将杂交瘤细胞株分别制备Balb/c小鼠腹水，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体，并分别标记荧光微球。(10)正交实验筛选显示7E6单抗包被与2A9单抗标记配对为最佳检测犬C反应蛋白组合。

设计方案1：一种重组蛋白，该重组蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。

设计方案2：一种重组蛋白，该重组蛋白质的氨基酸序列包含如序列表SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示氨基酸序列。

设计方案3：一种多肽，该多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。

设计方案4：一种多肽，该多肽的氨基酸序列包含如序列表SEQ ID No：3和SEQ IDNo：4所示氨基酸序列。

设计方案5：一种核苷酸序列，该核苷酸序列如序列表SEQ ID No：5所示，可编码权利1-2所述的重组犬C反应蛋白。

设计方案6：一种质粒载体，该质粒载体含有权利要求5所述的核苷酸序列。

设计方案7：一种菌株，该菌株包含采用权利要求6所述的质粒载体。

本发明与背景技术相比，一是采用大肠杆菌偏爱密码子优化重组蛋白对应的核苷酸序列，从而大大提高了重组蛋白在大肠杆菌中的表达水平；二是作为免疫原的KLH偶联蛋白仅含有犬C反应蛋白特有的优势抗原表位，保证了最终得到的单克隆抗体仅特异性识别犬C反应蛋白，并筛选得到了最优单抗配对组合，提高了检测灵敏度；三是免疫原含有的优势抗原表位是所有犬C反应蛋白的共有抗原表位，保证了检测广谱性，避免漏检。

具体实施方式

以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。

实施例1：犬C反应蛋白优势抗原表位选择

以犬C反应蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择A优势抗原表位(SEQ ID No：3)和B优势抗原表位(SEQ ID No：4)。同时，序列比较结果显示所选择的A、B两个优势抗原表位序列具备广谱性，是所有犬C反应蛋白共有表位；并且A、B表位与其它蛋白序列无明显同源性，仅存在于犬C反应蛋白序列。

实施例2：合成含有犬C反应蛋白优势抗原表位的多肽

为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的激活效果以缩短单克隆抗体制备时间，化学合成犬C反应蛋白A、B两个优势抗原表位序列并串联，同时在末端连接半胱氨酸(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，得到多肽，其具体序列如序列表SEQ ID No：2所示。

实施例3：多肽偶联KLH蛋白

将20mg SMCC溶于2mlDMF(二甲基甲酰胺)，将0.8mlKLH加入到25ml圆底烧瓶中，补加1×PBS(pH7.2)使蛋白终浓度为15mg/ml。将溶解的SMCC溶液缓慢滴加到120mgKLH蛋白体系中，室温搅拌反应1h。用1L 1×PBS(PH7.4)溶液于4℃下透析6小时，除去游离的SMCC。将透析后KLH蛋白倒入50ml离心管中，得到体积为20ml。取出417ul KLH-SMCC溶液转移到5m1离心管中。将3.0mg多肽用0.6ml1×PBS(pH 7.2)溶液溶解。用E1lman试剂检测多肽中的巯基，0D值为0.18，将多肽液滴加KLH-SMCC管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时。用Ellman试剂检测得到0D值为0.02，且试剂不显黄色，得到KLH偶联蛋白。

实施例4：犬C反应蛋白优势抗原表位的串联

将犬C反应蛋白A、B两个优势抗原表位序列分别通过柔性片段(连续四个甘氨酸)连接后重复，得到重组犬C反应蛋白氨基酸序列，其具体序列如序列表SEQ ID No：1所示。

实施例5：优化编码重组犬C反应蛋白的核苷酸序列

在重组犬C反应蛋白氨基酸序列不变的前提下，为了提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，具体序列如序列表SEQ ID No：5所示，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列后，由杭州贤至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因连接于pMD20-T载体(宝生物工程大连有限公司)中。

实施例6：构建重组犬C反应蛋白表达载体

将含目的基因的pMD20-T载体和PET-28a(+)载体(德国Novagen公司)通过限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝生物工程大连有限公司)分别于37℃双酶切12小时，酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和PET-28a(+)载体(本发明所使用的胶回收试剂盒均来自宁波中鼎生物技术有限公司)。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和PET-28a(+)载体按一定的比例于4℃连接12小时后，连接产物转化DH5α感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃恒温培养12小时之后，于平板上挑取单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒(本发明所使用的质粒纯化试剂盒均来自于宁波中鼎生物技术有限公司)提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。

实施例7：构建重组犬C反应蛋白表达菌株

将构建好的重组表达载体转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃过夜培养。第二日，挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养8小时后，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(终浓度为1.0mmol/L)诱导表达4个小时后制备蛋白电泳样品。13.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明重组蛋白成功表达，得到重组犬C反应蛋白表达菌株。

实施例8：纯化重组犬C反应蛋白

接种重组蛋白表达菌株至LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃恒温摇床培养8小时后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1∶100比例稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.8，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为1.0mmol/L，继续培养诱导4小时。离心收集菌体后，4度低温超声破菌，低温离心后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，经洗涤、洗脱最终得到纯化重组蛋白。

实施例9：杂交瘤细胞株构建

取4-6周龄雌性Balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射福氏完全佐剂乳化的100ug KLH偶联蛋白，共400ul/只。20天后进行第二次加强免疫，方法为取80ug KLH偶联蛋白用福氏不完全佐剂乳化，共400ul/只，皮下多点注射。第三次加强免疫在15天以后，方法与第二次加强免疫相同。20天后，取120ug KLH偶联蛋白腹腔加强注射，于72小时后，眼眶取血，并处死小鼠，取其脾脏制备细胞悬液，细胞计数，按1/5于脾细胞的数量取生长状态良好的sp2/0(小鼠骨髓瘤细胞)，混和离心后，加入聚乙二醇(Sigma公司)使二者融合。另外，再加入等体积的饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板(200μL/孔)，于37℃、5％二氧化碳培养箱培养。5天后，半保留换液，10天后采用间接酶联免疫吸附法检测96孔细胞培养板中培养杂交瘤细胞的上清。具体方法如下：

重组犬C反应蛋白经包被液稀释后(终浓度为1μg/mL)，以100μL/孔加入酶标板(无锡国盛生物工程有限公司)，4℃包被12小时后通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤1次；加入封闭液，200μL/孔，37℃封闭1小时，洗板机洗板1次；加待检细胞培养上清、阳性对照血清及阴性对照样本，100μL/孔，37℃孵育35min后，洗涤液洗涤3次；加HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育30分钟后，洗涤液洗涤四次；每孔加显色液A和显色液B各50μL，37℃避光显色10分钟后，加终止液终止反应，50μL/孔，酶标仪450nm波长空白孔校零后读取OD值。相关溶液配方如下：

包被液：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加双蒸水定容至1000mL(pH9.6)。

封闭液：Na₂HPO₄.12H₂O2.68g，NaH₂PO4.2H₂O0.39g，NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。

洗涤液：Na₂HPO₄.12H₂O2.68g，NaH₂PO₄.2H₂O0.39g，NaCl 8.5g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。

显色液A：200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加双蒸水定容至1000mL。

显色液B：柠檬酸2.1g，Na₂HPO₄.12H₂O71g，加双蒸水定容至1000mL。

使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％H₂O₂

终止液：2M H₂SO₄，21.7mL浓H₂SO₄加双蒸水定容至1000mL。

对于检测阳性的杂交瘤细胞克隆，再使用有限稀释法进行亚克隆，挑选单个细胞培养并通过间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测。经过三次亚克隆，共筛选得到8株单克隆细胞株(1B3、1E6、2A9、3F7、4D2、5F8、5A3、7E6)。

实施例10：单克隆抗体制备及纯化

取6-8周龄的健康Balb/c雄鼠，腹腔注射液体石蜡，每只500μL，3天后腹腔注射单克隆细胞(约1.2×10⁶个/只)，79天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水。用50ml平衡缓冲液PBS(pH＝7.4)平衡琼脂糖亲和介质Protein A层析柱(南京金斯瑞生物科技有限公司)，至电脑核酸蛋白检测仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)显示吸光度为0。腹水12000rpm离心5分钟，收集上清过0.45um滤器并上样后加PBS洗涤至吸光度为0，接着用0.1M甘氨酸(pH＝3.0)洗脱，收集流出液并加入500Mm Tris-HCl(pH＝8.5)缓冲液中和至pH＝7.0左右，得到的即为单克隆抗体。

实施例11：标记犬C反应蛋白单克隆抗体荧光微球垫的制备

选用直径为190nm的荧光微球(Bangslab公司，Dragongreen)，用0.05M pH4.5MES缓冲液调节微球浓度为1％，然后使用碳二亚胺(EDC)和琥珀酰亚胺(NHS)共价偶联的方式将犬C反应蛋白单克隆抗体标记到荧光微球上，抗体浓度为0.2mg/ml。将制备好的荧光微球使用定量喷膜仪以4μl/cm的量喷涂于荧光微球垫上，25℃真空干燥1～2h，放于干燥环境备用。

实施例12：硝酸纤维素膜(NC膜)的制备

用0.01M pH＝7.4PBS(磷酸盐缓冲液，其中包含5％蔗糖和0.05％吐温-20)分别调节犬C反应蛋白单克隆抗体(1B3、1E6、2A9、3F7、4D2、5F8、5A3、7E6)至其浓度为0.4mg/mL，将所得溶液分别喷涂在NC膜上形成检测线(T线)；用0.01M pH＝7.2PBS(磷酸盐缓冲液，其中包含5％蔗糖和0.05％吐温20)调节羊抗鼠浓度为0.5mg/mL，将所得溶液喷涂在NC膜上形成质控区(C线)。两区的喷膜量均为1μL/cm，两区相隔5mm，质控区距离NC膜一端2mm，37℃烘干过夜后，于室温干燥环境下保存备用.

实施例13：荧光微球免疫检测卡的制备

组装试纸条：在PVC底板上依次搭接粘贴：(1)滤纸和样本垫，样本垫为一种经过5％Tween-20处理的玻璃纤维膜；(2)喷涂有荧光微球标记犬C反应蛋白的荧光微球垫；(3)喷涂犬C反应蛋白作为检测区和羊抗鼠作为质控区的硝酸纤维素膜；(4)吸水纸，组装完成后剪切成4mm的宽度，装上试剂卡条壳并压紧，即成为免疫层析试纸卡。

实施例14：配对单抗筛选

犬C反应蛋白临床血清样本及正常犬血清样本，100μL/孔上样，室温放置15min后，通过荧光分析仪(基蛋生物科技股份有限公司)分别读值并计算P/N值(阳性样本检测值与阴性样本检测值的比值)，详见表1。

表1配对单抗P/N值统计

通过上表可知，2A9单抗包被与7E6标记配对检测犬C反应蛋白为最佳组合。

SEQ ID NO1：重组犬C反应蛋白氨基酸序列；

SEQ ID NO2：犬C反应蛋白多肽氨基酸序列；

SEQ ID NO3：犬C反应蛋白A优势抗原表位氨基酸序列；

SEQ ID NO4：犬C反应蛋白B优势抗原表位氨基酸序列；

SEQ ID NO5：编码重组犬C反应蛋白的核苷酸序列；

序列表

<110> 杭州贤至生物科技有限公司

<120> 一种重组犬C反应蛋白及其单克隆抗体的制备

<130> 17-1

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 148

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Ala Thr Lys Ser Gln Ser Asn Glu Ile Leu Leu Phe Lys Glu Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Glu Gln Asp Ser Phe Gly Gly Gly Phe Asp Lys Asn Gln

20 25 30

Ser Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Ala Thr Lys Ser Gln Ser Asn Glu Ile

35 40 45

Leu Leu Phe Lys Glu Gly Gly Gly Gly Glu Gln Asp Ser Phe Gly Gly

50 55 60

Gly Phe Asp Lys Asn Gln Ser Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Ala Thr Lys

65 70 75 80

Ser Gln Ser Asn Glu Ile Leu Leu Phe Lys Glu Gly Gly Gly Gly Glu

85 90 95

Gln Asp Ser Phe Gly Gly Gly Phe Asp Lys Asn Gln Ser Leu Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Tyr Ala Thr Lys Ser Gln Ser Asn Glu Ile Leu Leu Phe Lys

115 120 125

Glu Gly Gly Gly Gly Glu Gln Asp Ser Phe Gly Gly Gly Phe Asp Lys

130 135 140

Asn Gln Ser Leu

145

<210> 2

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Tyr Ala Thr Lys Ser Gln Ser Asn Glu Ile Leu Leu Phe Lys Glu Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Glu Gln Asp Ser Phe Gly Gly Gly Phe Asp Lys Asn Gln

20 25 30

Ser Leu Cys

35

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Tyr Ala Thr Lys Ser Gln Ser Asn Glu Ile Leu Leu Phe Lys Glu

1 5 10 15

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Gln Asp Ser Phe Gly Gly Gly Phe Asp Lys Asn Gln Ser Leu

1 5 10 15

<210> 5

<211> 444

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatgccacca aaagccagag caacgaaatt ctgctgttta aagaaggcgg cggcggcgaa 60

caggatagct ttggcggcgg ctttgataaa aaccagagcc tgggcggcgg cggctatgcc 120

accaaaagcc agagcaacga aattctgctg tttaaagaag gcggcggcgg cgaacaggat 180

agctttggcg gcggctttga taaaaaccag agcctgggcg gcggcggcta tgccaccaaa 240

agccagagca acgaaattct gctgtttaaa gaaggcggcg gcggcgaaca ggatagcttt 300

ggcggcggct ttgataaaaa ccagagcctg ggcggcggcg gctatgccac caaaagccag 360

agcaacgaaa ttctgctgtt taaagaaggc ggcggcggcg aacaggatag ctttggcggc 420

ggctttgata aaaaccagag cctg 444

Claims

1.一种重组蛋白，其特征在于该重组蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：1所示氨基酸序列。

2.一种多肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：2所示氨基酸序列。

3.一种核酸分子，其特征在于该核酸分子的核苷酸序列如序列表SEQ ID No：5所示，可编码权利 1所述的重组蛋白。

4.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求3所述的核酸分子的核苷酸序列。

5.一种菌株，其特征在于该菌株包含采用权利要求4所述的质粒载体。

6.权利要求1所述的重组蛋白用于犬C反应蛋白单克隆抗体的制备应用，包括： (a)化学合成权利要求3所述的核酸分子的核苷酸序列，并连接质粒载体，构建重组犬C反应蛋白表达载体； (b)将步骤(a)中重组犬C反应蛋白表达载体转化到大肠杆菌，筛选得到重组犬C反应蛋白表达菌株； (c)大规模培养重组犬C反应蛋白表达菌株，经纯化获取重组犬C反应蛋白； (d)化学合成权利要求2所述的氨基酸序列，并偶联KLH蛋白。 (e)KLH偶联蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经重组犬C反应蛋白多轮筛选得到单克隆细胞株； (f)纯化单克隆抗体并分别标记荧光微球，通过正交实验确定最佳单抗配对组合。