CN116813742A - 人gdf-15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人GDF‑15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用，涉及人GDF‑15抗原表位肽、重组蛋白、单克隆抗体、试剂盒及应用。抗原表位肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，为增强其免疫效果，将抗原表位肽偶联载体蛋白；重组蛋白包含人GDF‑15两个抗原表位肽，通过柔性肽连接后重复三次，其基因序列经密码子优化后化学合成，构建重组蛋白表达载体，在原核表达系统表达；GDF‑15抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的免疫原免疫小鼠能够产生高度特异性的单克隆抗体，可用于人GDF‑15体外诊断检测。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体为人GDF-15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用。
具体涉及人生长分化因子15(GDF-15)抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的GDF-15重组蛋白和特异性单克隆抗体、所述抗体在制备人GDF-15体外诊断试剂盒上的应用、人GDF-15体外诊断试剂盒、以及该试剂盒在定量检测血清中的人GDF-15蛋白中的应用。
背景技术
生长分化因子15(GDF-15)，是转化生长因子p(TGF-p)超家族的一员，成熟的GDF-15是以二硫键结合的同源二聚体，是一种分泌型应激性蛋白，在心血管疾病的检测和治疗、炎症反应、癌症治疗和神经元的保护等生理病理过程中发挥重要作用。
在正常情况下，GDF-15在心脏中有微量表达，但是在心肌缺血、心衰和动脉粥样硬化等情况下，GDF-15会在心肌细胞中大量表达。研究表明血清中GDF-15的浓度与多种心血管不良事件密切相关，对心力衰竭、急性心肌梗死、急性冠脉综合征等疾病的早期预测和预后风险提示有较高的价值，是为数不多的极具潜力的心血管疾病生物标志物。
近年来大量临床研究表明，GDF-15也可以作为是冠心病死亡率的独立预测标记物，已用于对ACS患者进行危险分层。快速、准确的危险分层对于心血管疾病患者的诊疗具有重要意义，有助于医生根据不同危险分层选择合适的个体化干预措施与诊疗方案，助力优化患者预后、减轻医疗负担。
目前全球市场上检测GDF-15厂家仅有罗氏一家，且国内尚未注册，寻找合适的具有免疫原性的GDF-15抗原表位肽、制备特异性的GDF-15重组蛋白及单克隆抗体、开发GDF-15体外诊断试剂盒即成了重点。
发明内容
为解决免疫学检测人GDF-15不足之处，通过设计人GDF-15抗原表位肽，制备人GDF-15免疫原、特异性GDF-15重组蛋白及单克隆抗体，其在制备人GDF-15试剂盒上的应用，人GDF-15体外诊断试剂盒，以及该试剂盒在定量检测血清中的人GDF-15蛋白中的应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种抗人GDF-15特异性抗体的制备方，包括以下步骤：
步骤S101：以人GDF-15蛋白为靶抗原，分析并筛选两个优势抗原表位，氨基酸序列与小鼠无明显同源性。
步骤S102：为增强免疫效果，将所选择的两个抗原表位肽偶联载体蛋白，用其免疫小鼠。
步骤S103：为获得特异性的人GDF-15单克隆抗体筛选物，将所选择的两个抗原表位肽分别通过柔性肽连接后重复三次，形成重组人GDF-15蛋白氨基酸序列。
步骤S104：为提高该重组蛋白表达量，采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列。
步骤S105：化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET-20b，构建重组人GDF-15蛋白表达载体。
步骤S106：重组人GDF-15蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组蛋白表达菌株，大规模培养后收集细胞，超声破碎离心后取上清过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，纯化重组人GDF-15蛋白。
步骤S107：用偶联载体蛋白抗原表位肽多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，使用重组人GDF-15蛋白多轮筛选，最终得到分泌人GDF-15单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
步骤S108：将杂交瘤细胞株分别制备Balb/c小鼠腹水，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体。
步骤S109：DAS-ELISA确定C75单抗包被与D92单抗标记配对为最佳检测人GDF-15组合。
步骤S110：并使用生物素放大系统，建立测定血清人GDF-15的含量检测方法，具有较强的特异性和较高的灵敏度，检测范围到达16.08～2500pg/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的试剂盒可有效且特异性地检测血清中的GDF-15含量，从而检测出心力衰竭患者和正常人之间的GDF-15含量差异，由此可在心力衰竭和其他心血管疾病中发挥辅助诊断作用，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为本发明GDF-15优势抗原表位肽(1)；
图2为本发明GDF-15优势抗原表位肽(2)；
图3为本发明重组人GDF-15蛋白氨基酸序列；
图4为本发明重组人GDF-15蛋白核苷酸序列；
图5为本发明标准品浓度和对应的吸光度(OD)值的折线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
人GDF-15优势抗原表位肽的选择
人GDF-15蛋白及其氨基酸序列是本领域已知的，可在NCBI数据库查询(NCBI登录号：NP_004855.2)，根据各氨基酸区段的亲水性、表面可接触性、抗原倾向性等大量的理论研究和实验摸索，最终筛选得到两个优势抗原表位肽。
GDF-15优势抗原表位肽(1)包含人GDF-15蛋白(NCBI登录号：NP_004855.2)第243至第255位的肽段，并在该肽段的C末端加上半胱氨酸，由此构成了具有14个氨基酸的GDF-15优势抗原表位肽(1)，其具体序列如序列表SEQ ID No：1所示。
GDF-15优势抗原表位肽(2)包含人GDF-15蛋白(NCBI登录号：NP_004855.2)第288至第303位的肽段，并在该肽段的C末端加上半胱氨酸，由此构成了具有17个氨基酸的GDF-15优势抗原表位肽(2)，其具体序列如序列表SEQ ID No：2所示。
上述两个优势抗原表位肽由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
实施例2：
优势表位肽偶联载体蛋白
可用的载体蛋白包括KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，并且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此优选。
将10mg SMCC溶于1mL DMF，将0.8mL KLH加入到25mL圆底烧瓶中，补加1×PBS(pH7.2)使蛋白终浓度为15mg/mL。将溶解的SMCC溶液缓慢滴加到120mg KLH蛋白体系中，室温搅拌反应1h。于4℃用1×PBS(pH7.2)透析12小时，除去游离的SMCC。将透析后KLH蛋白倒入50mL离心管中，得到体积为20mL。取出417uL KLH-SMCC溶液转移到5mL离心管中。将3.0mg多肽用0.6mL 1×PBS(pH7.2)溶液溶解。用Ellman试剂检测多肽中的巯基，0D值为0.17，将多肽液滴加KLH-SMCC管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时。用Ellman试剂检测得到0D值为0.01，且试剂不显黄色，得到KLH偶联蛋白。
实施例3：
重组人GDF-15蛋白的制备
将GDF-15优势抗原表位肽(1)、(2)序列分别通过柔性肽连接后重复三次，得到重组人GDF-15蛋白氨基酸序列，其具体序列如序列表SEQ ID No：3所示。
在重组人GDF-15蛋白氨基酸序列不变的前提下，为了提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，根据大肠杆菌密码子偏爱性，将编码重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，具体序列如序列表SEQ ID No：4所示，并在其上下游分别添加酶切位点NdeI和XhoI，对应的核苷酸序由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并插入pMD18-T载体。
将含目的基因的pMD18-T载体和PET-20b载体(Novagen公司)通过限制性内切酶NdeI和XhoI(宝生物工程大连有限公司)分别于37℃双酶切1小时，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因和PET-20b载体。
使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和PET-20b载体进行连接，连接产物转化DH5α感受态细胞(宝生物工程大连有限公)，涂布于含氨苄青霉素抗性(100μg/mL)的LB平板，于37℃恒温培养过夜，挑取单克菌落进行PCR鉴定，并委外测序，阳性克隆用LB液体培养基37℃恒温摇床培养15小时后，采用质粒纯化试剂盒提取质粒(宝生物工程大连有限公)。
将构建好的表达载体转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性(100μg/mL)的LB平板，于37℃恒温培养过夜，挑选单菌落用LB液体培养基培养，扩大培养后加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(终浓度为1.Ommol/L)诱导表达4个小时，离心收集菌体后，冰水浴超声破菌，低温离心后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，经洗涤、洗脱最终得到重组人GDF-15蛋白。
实施例4：
抗人GDF-15鼠单克隆抗体的制备
取偶联KLH的GDF-15优势抗原表位肽(1)(2)分别与等体积的弗氏完全佐剂(购自sigma生物公司)充分混合后，免疫Balb/c小鼠，初免剂量为100ug/只小鼠，第一次免疫后间隔21天、42天分别进行第二次和第三次免疫，免疫剂量均为50ug/只小鼠。
第三次免疫后7天后眼眶采血、分离血清，用上述重组人GDF-15蛋白采用间接法检测血清效价，取血清效价大于105的小鼠进行脾内加强免疫，免疫剂量为100ug/只小鼠。
加强免疫后3天取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞按照7：1的比例融合，融合后的细胞使用含HAT的DMEM培养基上进行培养。融合后6-7天左右，用包被重组人GDF-15蛋白的96孔板间接法检测细胞培养上清中的特异性抗体含量，选择OD值不低于0.5的阳性孔用有限稀释法进行3轮亚克隆，最终得到能稳定分泌抗人GDF-15的杂交瘤细胞株。
将抗人GDF-15的杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔内，收集腹水通过SPA纯化得到纯度超过95％的抗人GDF-15的鼠单克隆抗体。
实施例5：
抗体配对筛选
用CB将包被抗体稀释到4μg/ml，以每孔100μl加入到酶标板孔中，4℃包被过夜。翌日将酶标板拍干，每孔加入200μl封闭液(含1％BSA的PBS)，于37℃下封闭2h，封闭结束后并拍干。将重组人GDF-15蛋白用PBS稀释至2ng/ml，每孔加样100μl，以PBS为对照。37℃孵育1h后洗板3次，洗液为0.05％的PBST。
用含1％BSA的洗液将标记抗体稀释成1000倍的工作液，每孔加100μl，37℃孵育1h，然后洗板4次并拍干。每孔加入100μl TMB显色液，37℃孵育10min。每孔加50μl加入终止液，在酶标仪上用450nm读取OD值。部分数据如表1所示。
表1抗体配对筛选
C75单抗包被与D92单抗标记配对为最佳检测人GDF-15为最佳组合。
实施例6：
生物素-链霉亲和素ELISA检测人GDF-15方法建立。
1、生物素偶联D92单克隆抗体
将D92单克隆抗体溶于pH9.6碳酸盐缓冲液中，调节浓度为10mg/mL。将生物素酰-N-羟基丁二酰亚胺酯(Biotin-NHS)溶解于DMF，浓度为10mg/mL。按150μg Biotin-NHS每1mg抗体的比例缓慢滴加Biotin-NHS，轻微震荡后置4℃反应过夜。用30kD截留量的分子筛管进行分离纯化，加入等体积甘油4℃保存备用。
2、酶标记链霉亲和素(SA-HRP)
称取1mg HRP溶解于0.5mL蒸馏水，加入0.5mL新配的0.06M NaIO4溶液，4℃静置避光30min后加入0.16M的乙二醇0.5mL终止反应。加入链霉亲和素1mg，室温静置30min后装入透析袋中，置0.05M碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜。加入0.2mL新配的5mg/mL NaIO4混匀。最后加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后4℃静置30min，于低温离心机离心(4℃，4000rpm，30min)分离。沉淀物用0.1mL 0.05M碳酸盐缓冲液后加入等量甘油-20℃保存备用。
3、预包被板的制备
将C75单克隆抗体用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释至2.0μg/mL，每孔100μl加入酶标板(购自深圳金灿华公司)，置4℃放置过夜，倾去包被液，加入封闭液(含1％BSA的碳酸盐缓冲液)每孔200μL，37℃放置2小时，倾去封闭液，洗涤2次，过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。
4、试剂最低检测限及线性范围
在预包被板中加入不同浓度标准品，每孔100μL，37℃孵育1小时，倾去样品，洗涤4次，每孔加入100μL生物素化D92单克隆抗体，37℃孵育1小时，倾去样品，洗涤4次，每孔加入100μL SA-HRP(1：3000稀释)，37℃孵育30分钟，倾去样品，用洗涤液冲洗5次，拍干，加入TMB底物反应液100μL避光反应15min，最后加入终止液50μL，450nm波长下测量吸光值并绘制标准曲线。以P/N值大于等于2作为阳性结果。
以零参考标准品测量20次，计算其平均OD值及标准差，以OD平均值加上2倍标准差所得的OD值代入标准曲线方程计算得出的浓度为其最低检测量。
以标准品度和对应吸光度的对数值绘制标准曲线，标准曲线的R2＝0.9997
本试剂最低检测限16.08pg/mL，有效线性范围在16.08～2500pg/mL，检测灵敏度3.9pg/mL(P/N＞2)。
表2标准品浓度和对应的吸光度(OD)值
表3零值标准品检测的吸光度(OD)值
对73例心力衰竭患者和112例健康者按上述方式进行血清GDF-15检测，心力衰竭患者血清中的GDF-15含量明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表2。
表4两组不同心功能者GDF-15浓度比较
5、试剂检测紧密度
取浓度为50pg/mL的低浓度GDF-15标准品和1000pg/mL高浓度GDF-15标准品，每个样品每个浓度各做10次平行测试，用3批试剂进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明上述GDF-15试剂盒批内及批间差均＜10％。
表5分析批内精密度检测结果(n＝10)
表6分析批间精密度检测结果(3批，n＝30)
| 项目 | 浓度(pg/mL) | CV(％) |
| C1 | 46.598±3.9919 | 8.71％ |
| C2 | 1007.792±58.8405 | 5.94％ |
本发明的试剂盒可有效且特异性地检测血清中的GDF-15含量，从而检测出心力衰竭患者和正常人之间的GDF-15含量差异，由此可在心力衰竭和其他
心血管疾病中发挥辅助诊断作用，具有广阔的市场前景。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.人GDF-15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用，其特征在于：包括以下步骤:
步骤S101：以人GDF-15蛋白为靶抗原，分析并筛选两个优势抗原表位，氨基酸序列与小鼠无明显同源性。
步骤S102：为增强免疫效果，将所选择的两个抗原表位肽偶联载体蛋白，用其免疫小鼠。
步骤S103：为获得特异性的人GDF-15单克隆抗体筛选物，将所选择的两个抗原表位肽分别通过柔性肽连接后重复三次，形成重组人GDF-15蛋白氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的人GDF-15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用，其特征在于：为提高该重组蛋白表达量，采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的人GDF-15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用，其特征在于：化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体PET-20b，构建重组人GDF-15蛋白表达载体。
4.根据权利要求1所述的人GDF-15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用，其特征在于：重组人GDF-15蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到重组蛋白表达菌株，大规模培养后收集细胞，超声破碎离心后取上清过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，纯化重组人GDF-15蛋白。
5.根据权利要求4所述的人GDF-15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用，其特征在于：用偶联载体蛋白抗原表位肽多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，使用重组人GDF-15蛋白多轮筛选，最终得到分泌人GDF-15单克隆抗体的杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞株分别制备Balb/c小鼠腹水，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的人GDF-15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用，其特征在于：DAS-ELISA确定C75单抗包被与D92单抗标记配对为最佳检测人GDF-15组合。
7.根据权利要求6所述的人GDF-15抗原表位肽、抗原、抗体、试剂盒及应用，其特征在于：并使用生物素放大系统，建立测定血清人GDF-15的含量检测方法，具有较强的特异性和较高的灵敏度，检测范围到达16.08～2500pg/mL。
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