CN104364374B - 癌的检测方法及识别胰脏特异性的核糖核酸酶1的抗体 - Google Patents

癌的检测方法及识别胰脏特异性的核糖核酸酶1的抗体 Download PDF

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Abstract

制备在胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位没有结合糖链的情况下与该部位结合、在结合有N型糖链的情况下与该部位的结合被阻碍的单克隆抗体；另外，制备能够与该抗体同时地与相同胰脏特异性的RNase 1结合的单克隆抗体，使用它们，求出A与B的比，由此检测胰腺癌。A＝胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量。B＝胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位的量。

Description

癌的检测方法及识别胰脏特异性的核糖核酸酶1的抗体
技术领域
本发明涉及癌的检测方法及识别胰脏特异性的核糖核酸酶1的抗体。更详细而言涉及，通过测定糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位是否结合糖链而进行癌的检测的方法。
背景技术
作为诊断初期阶段的癌的检测方法，优选将非侵入的来源于生物的试样例如血液、尿等比较容易采集的体液作为被检体。作为现在的胰腺癌的诊断时所使用的血清标记物，有：CA19-9、DUPAN-2等。然而，存在如下缺点：这些标记物的脏器特异性低、从遗传的理由出发有该标记物不反应的情况等、不能成为决定性的确定诊断。
作为核糖核酸酶家族之一的胰脏特异性的核糖核酸酶1(以下，将核糖核酸酶1称为“RNase 1”)为胰脏特异性地表达、并且被分泌至细胞外的体液中的糖蛋白。该蛋白质是被翻译成包含156个氨基酸的肽(序列号1)，在分泌信号的去除、接受糖链修饰之后，成为具有128个氨基酸的肽序列(序列号2)的成熟糖蛋白，从而被分泌至细胞外。能够进行N型糖链修饰的部位、即有可能接受N型糖链修饰的氨基酸残基为序列号2中的第34位、第76位、第88位的天冬酰胺残基。
一直以来都在研究胰脏特异性的RNase 1，虽然报告了癌的表达、活性的变化等，但没有实际临床应用的例子。1980年Doran等人报告了胰腺癌患者血清中的核糖核酸酶活性增加(非专利文献1)，只有活性的记载，对于核糖核酸酶的分子种类没有限定。关于胰脏特异性的RNase 1的糖链修饰，1994年报告了由健康人得到的核糖核酸酶，对于3处能够进行糖链修饰的部位的各自的糖链附加的程度有所报告，但是对于与胰腺癌的关联性没有报告(非专利文献2)。2000年，Fernandez-Salas等人报告了由源自胰腺癌的培养细胞分泌的胰脏特异性的RNase 1的分子量大于由正常的胰脏得到的RNase 1的分子量，作为其理由之一，指出了糖链修饰量的增加(非专利文献3)。进而，同一研究组在2003年和2007年，发表了关于胰脏特异性的RNase 1的糖链修饰的报告，其中指出了由胰腺癌(Pancreatic cancer)患者的血清得到的胰脏特异性的RNase 1的N型糖链结构有变化，特别是明确了被核心岩藻糖化的2条支链复合型糖链增加，胰脏特异性的RNase 1的分子量增加起因于附加的糖链结构自身的分子量增加(非专利文献4、5)。然而，至今并没有将糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的有无结合糖链与癌关联的报告。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：J.Clin.Pathol.33，1212-13(1980)
非专利文献2：Biol.Chem.Hoppe Seyler 375，357-63(1994)
非专利文献3：Eur J Biochem.267，1484-1494(2000)
非专利文献4：Glycobiology 13，227-244(2003)
非专利文献5：Glycobiology 17，388-400(2007)
发明内容
发明要解决的问题
本发明着眼于糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位，目的在于提供癌的检测方法和识别胰脏特异性的RNase 1的抗体。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现：癌患者与健康人相比，在胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位结合有糖链的情况增加，至此完成了本发明。另外，本发明人等发现了与胰脏特异性的RNase 1特异地结合的抗体，即将胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位作为抗原识别位点的一部分，在N型糖链修饰的部位结合有糖链的情况下与胰脏特异性的RNase 1的结合被阻碍的抗体，至此完成了本发明。
即，本发明如下。
(1)一种癌的检测方法，其特征在于，测定糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量。
(2)根据(1)所述的方法，其中，癌为胰腺癌。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，糖蛋白为胰脏特异性的RNase 1。
(4)根据(2)或(3)所述的方法，其中，胰腺癌患者与健康人相比，结合有N型糖链的部位的量增加。
(5)一种癌的检测方法，其特征在于，求出下述A、B中的A与B的比。
A＝糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量
B＝糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的量
(6)根据(5)所述的方法，其中，癌为胰腺癌。
(7)根据(5)或(6)所述的方法，其中，糖蛋白为胰脏特异性的RNase 1。
(8)根据上述(6)或(7)所述的方法，其为A＝没有结合N型糖链的部位的量，胰腺癌患者与健康人相比A/B的值减小的方法。
(9)根据上述(6)或(7)所述的方法，其为A＝结合有N型糖链的部位的量，胰腺癌患者与健康人相比A/B的值增大的方法。
(10)根据上述(7)～(9)中的任一项所述的方法，其为求出胰脏特异性的RNase 1的量、换算该值作为B的值的方法。
(11)根据(1)～(10)中的任一项所述的方法，其中，能够进行N型糖链修饰的部位为选自序列号2所示的序列的第34位、第76位和第88位的1个以上的天冬酰胺残基。
(12)根据(11)所述的方法，其中，能够进行N型糖链修饰的部位为序列号2所示的序列的第88位的天冬酰胺残基。
(13)根据(11)所述的方法，其中，能够进行N型糖链修饰的部位为序列号2所示的序列的第76位的天冬酰胺残基。
(14)根据(11)所述的方法，其中，能够进行N型糖链修饰的部位为序列号2所示的序列的第34位的天冬酰胺残基。
(15)一种单克隆抗体或其片段，其将胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位作为抗原识别位点的一部分。
(16)根据(15)所述的单克隆抗体或其片段，其中，在胰脏特异性的RNase1的能够进行N型糖链修饰的部位没有结合糖链的情况下，单克隆抗体或其片段与该部位结合；在胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位结合有N型糖链的情况下，单克隆抗体或其片段与该部位的结合被阻碍。
(17)根据(15)或(16)所述的单克隆抗体或其片段，其中，抗原识别位点为包含序列号2所示的序列的第88位的天冬酰胺残基的区域。
(18)一种单克隆抗体或其片段，其特征在于，能够与上述(15)～(17)中的任一项所述的单克隆抗体或其片段同时地结合于胰脏特异性的RNase 1。
(19)根据上述(1)～(14)中的任一项所述的方法，其中，使(a)上述的(15)～(17)中的任一项所述的单克隆抗体或其片段与试样接触，测定与(a)的单克隆抗体或其片段形成了复合体的胰脏特异性的RNase 1。
(20)根据上述(19)所述的方法，其中，进一步使(b)上述(18)所述的单克隆抗体或其片段与试样接触，测定与(a)和(b)的两种单克隆抗体或抗体片段形成了复合体的胰脏特异性的RNase 1。
(21)根据上述(20)所述的方法，其包括：使试样与(a)或(b)的一者接触的第一接触工序；和使第一接触工序中得到的物质与(a)或(b)的另一者接触的第二接触工序。
(22)一种药品，其特征在于，含有上述(15)～(17)中的任一项所述的单克隆抗体或其片段。
(23)根据(1)～(14)中的任一项所述的方法，其中，通过质谱分析法求出糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量。
(24)根据上述(23)所述的方法，其为通过质谱分析法测定糖蛋白的肽片段和/或糖肽片段的质量的方法。
以下，更详细地说明本发明。本发明为通过测定糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量从而检测癌的发明。此时，测定糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的“部位”的量或没有结合N型糖链的“部位”的量，而并非测定与能够进行N型糖链修饰的部位结合的“糖链”的量。作为癌，没有特别的限定，特别是能够检测胰腺癌。
对于作为测定对象的糖蛋白，没有特别的限定，优选为胰脏特异性的RNase 1。另外，其优选为来源于人的生物试样。通过将糖蛋白作为测定对象，能够特异地检测人的胰腺癌。此时，胰腺癌患者与健康人相比，在能够进行N型糖链修饰的部位结合有N型糖链的情况多，能够进行N型糖链修饰的部位中，结合有N型糖链的部位增加，因此能够将其作为指标而检测胰腺癌。
另外，本发明为一种癌的检测方法，其特征在于，求出下述A、B中的A与B的比。
A＝糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量
B＝糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的量
作为癌，没有特别的限定，特别是能够检测胰腺癌。对于作为测定对象的糖蛋白，没有特别的限定，优选为胰脏特异性的RNase 1。
另外，优选为A＝没有结合N型糖链的部位的量，胰腺癌患者与健康人相比A/B值减小的方法。另外，优选为A＝结合有N型糖链部位的量，胰腺癌患者与健康人相比A/B值增大的方法。
B＝胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位的量的情况下，对于其求出方法没有特别的限定，例如，可以求出胰脏特异性的RNase 1的量，换算该值而作为B的值。具体而言，胰脏特异性的RNase 1，如前所述，具有3个能够进行N型糖链修饰的部位(序列号2的第34位，第76位，第88位的天冬酰胺残基)，所以测定作为测定对象的其任一个或2个部位或者所有的部位的量时，与其相应地，B＝胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位的量也可以分别换算成胰脏特异性的RNase 1的量的1倍、2倍或3倍。需要说明的是，胰脏特异性的RNase 1的量例如可以通过使用免疫学的测定法、质谱分析的方法而求出。
需要说明的是，胰脏特异性的RNase 1如前所述具有3个能够进行N型糖链修饰的部位(序列号2的第34位，第76位，第88位的天冬酰胺残基)。其任一个或两个部位或者所有的部位中，可以通过测定结合有N型糖链的部位的量或没有结合N型糖链的部位的量，或者可以通过求出该量与胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位的量的比而检测癌。特别是，作为能够进行N型糖链修饰的部位，如果对于序列号2的第88位的天冬酰胺残基测定上述的量，则可见癌患者与健康人的这些值存在显著的差异，所以作为癌的检测方法而优选。同样地，也优选针对序列号2的第76位或第34位的天冬酰胺残基测定上述的量。
另外，本发明为一种单克隆抗体或其片段，其将胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位作为抗原识别位点的一部分。对于这样的单克隆抗体，例如，可以将胰脏特异性的RNase 1或包含其能够进行N型糖链修饰的部位的附近的肽序列作为免疫原，按照常规方法进行制作。另外，抗体的抗原特异性可以使用标准分析例如，ELISA或FACS分析确定该抗体与抗原决定基的结合。另外，作为单克隆抗体的片段，可列举出：用各种各样的酶将全部抗体消化而得到的Fab或F(ab’)2片段等。这样的单克隆抗体或其片段中，本发明中，特别优选在胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位没有结合糖链的情况下与该部位结合，在结合有N型糖链的情况下与该部位的结合被阻碍。
进而，这样的单克隆抗体或其片段中，本发明中，抗原识别位点优选为包含序列号2所示的序列的第88位的天冬酰胺残基的区域。特别优选为将胰脏特异性的RNase 1的能够进行糖链修饰的部位中位于羧基最末端侧的部位的氨基酸序列(序列号3)包含于识别位点的一部分的单克隆抗体或其片段。作为这样的单克隆抗体，可列举出：本发明中制作的抗人胰脏特异性的RNase 1单克隆抗体RrhRN0723。该单克隆抗体RrhRN0723的胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位中，序列号2的第88位的天冬酰胺残基结合有N型糖链的情况下，与胰脏特异性的RNase 1的结合被阻碍。
另外，本发明为一种单克隆抗体或其片段，其特征在于，能够与将胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位作为抗原识别位点的一部分的单克隆抗体或其片段同时地结合于胰脏特异性的RNase 1。这样的单克隆抗体例如筛选如下的单克隆抗体即可：将胰脏特异性的RNase 1作为免疫原、按照常规方法制作的、能够与识别上述的胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位的单克隆抗体或其片段同时地结合于胰脏特异性的RNase。另外，单克隆抗体的片段，可列举出例如，用各种各样的酶将全部抗体消化而得到的Fab或F(ab’)2片段等。作为这样的单克隆抗体，可列举出：本发明中制作的抗人胰脏特异性的RNase 1单克隆抗体MrhRN0614。该单克隆抗体MrhRN0614能够与前述的单克隆抗体RrhRN0723同时地结合于胰脏特异性的RNase 1。
本发明中，这样的单克隆抗体或其片段可以用碱性磷酸酶、过氧化物酶、生物素、异硫氰酸荧光素等标记。
另外，本发明为一种癌的检测方法，使(a)将胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位作为抗原识别位点的一部分的单克隆抗体或其片段与试样接触，测定与(a)的单克隆抗体或其片段形成复合体的胰脏特异性的RNase 1。作为这样的方法，可列举出例如：竞争法、抗体芯片法(antibody array method)。
另外，本发明为一种癌的检测方法，在上述(a)的单克隆抗体或其片段的基础上，使作为(b)的能够与(a)同时地结合于胰脏特异性的RNase 1的单克隆抗体或其片段与试样接触，测定与(a)和(b)的2种单克隆抗体或抗体片段形成复合体的、胰脏特异性的RNase 1的能够进行糖链修饰的、结合有N型糖链的部位或没有结合的部位的量。此时，(a)和(b)的单克隆抗体或其片段可以同时地与试样接触，但优选依次使之接触。依次使之接触的情况下，包括：使试样与(a)或(b)的一者接触的第一接触工序；和，接着使第一接触工序中得到的物质与(a)或(b)的另一者接触的第二接触工序。此时，优选在第一接触工序中使试样与(b)接触，接着在第二接触工序中使其与(a)接触。作为(a)、(b)，可以使用前述的本发明的单克隆抗体或其片段；特别是，作为(a)进而优选使用单克隆抗体RrhRN0723或其片段，作为(b)进而优选使用单克隆抗体MrhRN0614或其片段。作为这样的方法，例如，除了ELISA法、EIA法之外，还可以通过液相色谱法、高效液相色谱法、免疫层析法等，分离并测定形成的免疫复合体。
这样，将胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位作为抗原识别位点的一部分的单克隆抗体或其片段可以作为诊断药物等药品使用。
本发明中，作为求出糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量的方法，没有特别的限定，可以为使用了如上述的免疫分析的方法，也可以通过质谱分析法而求出。通过质谱分析法求出的情况下，例如用酶等分解糖蛋白，用质谱分析器等测定得到的肽片段和/或糖肽片段的质量，由此能够求出糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量。使用质谱分析器的方法中，作为由糖蛋白得到肽片段的方法，可列举出例如：如J.Proteome Res.3，556-566(2004)所报告那样，利用糖苷酶的一系列去除糖链的处理和利用内切型肽酶的蛋白质的肽骨架的片段化。如果列举利用糖苷酶的一系列去除糖链的处理的一例，则有如下方法：使用选自作为外切型糖苷酶的唾液酸酶、半乳糖苷酶、氨基己糖苷酶、甘露糖苷酶、岩藻糖苷酶中的一种以上的酶、以及对于N型糖链的主干结构部分的壳二糖结构起作用的内切型糖苷酶例如内切糖苷酶H等，使N-乙酰基葡萄糖胺的单糖结构残留于能够进行N型糖链修饰的部位的天冬酰胺残基上。该方法中，由于N-乙酰基葡萄糖胺的单糖结构残留于蛋白质的肽骨架上，所以通过任意的内切型肽酶处理而得到的片段中，由氨基酸序列通过计算求出的推定分子量检测与N-乙酰基葡萄糖胺的分子量相应地质量增加了的糖肽片段，由此能够判断特定的能够进行N型糖链修饰的部位中的糖链的附加状态。通过以上所列举的方法分析胰脏特异性的RNase 1，由此能够通过质谱分析法确认糖链附加状态的有无。
发明的效果
通过本发明，能够进行癌的检测、特别是胰腺癌的检测。另外，通过本发明，能够提供将胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位作为抗原识别位点的一部分的单克隆抗体、及能够与该单克隆抗体同时地结合于胰脏特异性的RNase 1的单克隆抗体。使用这2种抗体，能够进行前述的癌的检测。
附图说明
图1为表示实施例2中测定抗人胰脏特异性的RNase 1抗体对于导入糖链修饰缺失突变的抗原的结合性的结果的图。
图2为表示实施例2中测定抗人胰脏特异性的RNase 1抗体对于导入氨基酸置换突变的抗原的结合性的结果的图。
图3为表示实施例2中对于导入糖链修饰缺失突变的抗原m001的糖链结合状态进行分析的结果的图。
图4为表示实施例2中对于各组分中的α-甲基甘露糖苷的浓度、与抗人胰脏特异性的RNase 1抗体的结合性进行测定的结果的图。
图5为表示实施例3中测定被检体中的糖链修饰胰脏特异性的RNase 1的结果的图。
图6为表示实施例3中胰腺癌与非胰腺癌的测定值的分布和2组间的显著性差异的图。
图7为表示实施例3中胰腺癌与非胰腺癌的ROC统计分析的结果的图。
图8为表示实施例4中，用免疫印迹法(Western blot)研究抗人胰脏特异性的RNase 1肽抗体的抗原识别性能的结果的图。
图9为表示实施例4中，通过使用了抗人胰脏特异性的RNase 1肽抗体的免疫印迹法，考察定健康人血清和胰腺癌患者血清中的胰脏特异性的RNase1的Asn88中有无糖链结合的结果的图。
图10为表示实施例5中，抗人胰脏特异性的RNase 1抗体RrhRN1111对于导入糖链修饰缺失突变的抗原的结合性的结果的图。
图11为表示实施例5中，由健康人和胰腺癌的RNase 1的测定值求出F3/t值和G3/t值的结果的图。
图12为表示实施例6中，通过使用了RrhRN0723抗体的抗原固相竞争法测定竞争抗原的稀释系列的结果的图。
具体实施方式
实施例1
实施例1抗体的制备
免疫原的调制
为了取得包含人胰脏特异性的RNase 1全长的多肽，在昆虫细胞中能够表达的质粒载体中插入编码成熟型人胰脏特异性的RNase 1(序列号2)的基因序列，从而制备表达质粒。详细地说，在昆虫细胞重组蛋白质表达用质粒即pIZ/V5His vector(LifeTechnologies Japan Ltd.)的多克隆位点从5’上游侧起依序插入编码人免疫球蛋白κ链(kappa chain)的基因序列、编码His标记的基因序列、编码FLAG标记的基因序列、编码人胰脏特异性的RNase 1的基因序列(序列号1)中去除了相当于作为信号肽的氨基酸第1位至第28为止的84个核酸残基的基因的区域(序列号2)。对于所制备的表达质粒pIZ-KFH-hRNase1确认到重组体人胰脏特异性的RNase 1被分泌至培养基中，所述重组体人胰脏特异性的RNase 1是通过对昆虫细胞株Sf9使用Cellfectin II(Life Technologies Japan Ltd.)实施基因导入而在N末端侧附加有人免疫球蛋白κ链而成的。从培养上清中将被分泌至培养基中的蛋白质通过使用了抗人免疫球蛋白κ轻链抗体的亲和纯化进行浓缩纯化，制成为免疫原。
对免疫动物的免疫
使用上述的免疫原对小鼠和大鼠实施免疫。详细而言，为对小鼠进行免疫的情况下，将100μg的免疫原与弗氏完全佐剂(Complete Freund's adjuvant)一起，对6周龄Balb/c雌小鼠腹腔进行给予，作为初次免疫。之后，在7天后、14天后、21天后、28天后、35天后将免疫原100μg与弗氏不完全佐剂(incomplete Freund's adjuvant)一起进行腹腔给予，作为追加免疫。进而，在42天后，将免疫原100μg与生理盐水一起进行腹腔给予，作为最终免疫。对大鼠进行免疫的情况下，将100μg的免疫原与弗氏完全佐剂一起，对6周龄WHY雌大鼠两后肢足垫进行给予，作为初次免疫。之后，在28天后将免疫原100μg与生理盐水一起对后肢足垫进行给予，作为最终免疫。
抗体产生杂交瘤的制备
最终免疫3天后，由小鼠摘除脾脏，回收脾脏细胞。由大鼠摘除髂淋巴结(iliaclymph nodes)和鼠腹股沟淋巴结(inguinal lymph nodes)，得到淋巴结细胞。使小鼠脾脏细胞和大鼠淋巴结细胞分别与小鼠骨髓瘤细胞株通过电细胞融合法融合之后，用添加了次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的GIT培养基(和光纯药工业株式会社)接种至细胞培养用96孔板，由此选择融合细胞。
小鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体产生融合细胞株的选定
小鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体产生融合细胞株如下选择：以融合细胞在培养基中分泌的抗体对于重组体人胰脏特异性的RNase 1的反应性作为指标，利用ELISA法进行筛选，从而选择。筛选中所使用的ELISA如下。向96孔微量滴定板(Greiner bio-one制)的各孔中加入包含25ng的山羊抗人免疫球蛋白κ链抗体(Sigma-Aldrich Japan K.K.制)的磷酸缓冲液(50mM磷酸钠、150mM NaCl、pH7.4)50μl，在4℃下固定16小时。将这些孔用300μl的洗涤液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)洗涤3次之后，加入包含3％BSA的封闭溶液(3％BSA，20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)200μl，在室温下放置2小时进行封闭(抗人免疫球蛋白κ链抗体固相化板)。将各孔用300μl的洗涤液洗涤3次之后，加入用稀释液(1％BSA、20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0.05％Tween-20、pH7.4)以0.5μg/ml的方式稀释的重组体人胰脏特异性的RNase 1，在室温下放置1小时。将各孔用包含300μl的表面活性剂的洗涤液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0.05％Tween-20、pH7.4)洗涤3次之后，加入50μl的融合细胞培养上清，在室温下放置1小时。接着，将各孔用300μl的包含表面活性剂的洗涤液洗涤3次之后，加入包含0.01μg的用辣根过氧化物酶(HRP)标记过的抗小鼠IgG抗体(Rockland公司制)的稀释液50μl，在室温下放置1小时。最后，将各孔用300μl的包含表面活性剂的洗涤液洗涤3次之后，添加50μl的四甲基联苯胺(TMB)溶液(KPL公司制)，使之显色15分钟之后，添加1M的磷酸溶液而停止反应，测定450nm的吸光度。根据筛选的结果，得到产生对胰脏特异性的RNase 1表现出强的亲和性的抗体的融合细胞。得到的融合细胞通过有限稀释法被单克隆化，得到单克隆抗体MrhRN0614。
大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体产生融合细胞株的选定
对于大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体产生融合细胞株，以融合细胞在培养基中分泌的抗体对于来源于人胰腺癌细胞(Capan1)的胰脏特异性的RNase 1的反应性作为指标，通过ELISA法进行筛选，从而选择。筛选中所使用的ELISA如下。向96孔微量滴定板(Greiner bio-one制)的各孔中加入包含25ng的小鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体(MrhRN0614)的磷酸缓冲液(50mM磷酸钠、150mMNaCl、pH7.4)50μl，在4℃下固定16小时。将这些孔用300μl的洗涤液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)洗涤3次之后，加入包含3％BSA的封闭溶液(3％BSA，20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)200μl，在室温下放置2小时进行封闭(抗人胰脏特异性的RNase 1抗体固相化板)。将各孔用300μl的洗涤液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)洗涤3次之后，加入用稀释液(1％BSA、20mM Tris-HCl，150mMNaCl、0.05％Tween-20、pH7.4)稀释至2倍的人胰腺癌细胞(Capan1)的培养上清，在室温下放置1小时。将各孔用300μl的包含表面活性剂的洗涤液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0.05％Tween-20、pH7.4)洗涤3次之后，加入50μl的融合细胞培养上清，在室温下放置1小时。接着，将各孔用300μl的包含表面活性剂的洗涤液洗涤3次之后，加入包含0.01μg的被HRP标记过的抗大鼠IgG抗体(American Qualex Antibodies公司制)的稀释液50μl，在室温下放置1小时。最后，将各孔用300μl的包含表面活性剂的洗涤液洗涤3次之后，添加50μl的TMB溶液使之显色15分钟之后，添加1M的磷酸溶液而停止反应，测定450nm处的吸光度。根据筛选的结果，得到产生对胰脏特异性的RNase 1表现出强的亲和性的抗体的融合细胞。得到的融合细胞通过有限稀释法被单克隆化，得到单克隆抗体RrhRN0723。
实施例2抗体的特异性测定
利用哺乳动物表达系统的重组体人胰脏特异性的RNase 1的调制
为了在哺乳动物细胞中取得包含人胰脏特异性的RNase 1全长的多肽，在pcDNA3.1-mycHis载体(Life Technologies Japan Ltd.)中插入编码人胰脏特异性的RNase 1的基因序列(序列号2)，制备表达载体。更详细而言，将用于免疫原的调制而制备的昆虫细胞表达用质粒(pIZ-KFH-hRNase 1)的编码重组体蛋白质的基因序列部分通过分子生物学的手法插入至pcDNA3.1-mycHis载体(Life Technologies Japan Ltd.)中，从而制备pcDNA-KFH-hRNase 1。对于所制备的哺乳动物细胞用表达质粒确认到有重组体人胰脏特异性的RNase1被分泌至培养基中；所述重组体人胰脏特异性的RNase 1是通过对来源于中国仓鼠卵巢的培养细胞株(以下、CHO-K1株)使用Lipofectamine 2000(Life TechnologiesJapan Ltd.)实施基因导入而在N末端侧附加有人免疫球蛋白κ链而成的。从培养上清中将被分泌至培养基中的蛋白质通过使用了抗人免疫球蛋白κ轻链抗体的亲和纯化进行浓缩纯化，得到重组体人胰脏特异性的RNase1。被纯化的重组体人胰脏特异性的RNase 1供于用于明确抗体的特异性的实验中。
糖链修饰缺失突变抗原的调制
将前项制备的表达载体(pcDNA-KFH-hRNase 1)作为模板，用PCR突变导入法重复导入氨基酸置换突变，制备表达导入了糖链修饰缺失突变的抗原的质粒。PCR突变导入法中，使用PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit(TAKARA BIO INC.)，按照附加的说明书进行实施。详细而言，通过将能够进行N型糖链修饰的部位的共有序列(Asn-Xaa-Ser/Thr、Xaa是指脯氨酸以外的氨基酸残基)的第3位的氨基酸残基置换成丝氨酸残基或苏氨酸残基以外的氨基酸，从而制备表达糖链修饰缺失突变重组体人胰脏特异性的RNase 1的质粒(表1)。对于所制备的导入了糖链修饰缺失突变的表达质粒，确认到有糖链修饰缺失突变重组体人胰脏特异性的RNase 1被分泌至培养基中，所述糖链修饰缺失突变重组体人胰脏特异性的RNase 1是通过对CHO-K1株使用Lipofectamine2000(Life Technologies Japan Ltd.)实施基因导入而在N末端侧附加有人免疫球蛋白κ链而成的。被分泌至培养基中的糖链修饰缺失突变重组体人胰脏特异性的RNase 1供于用于明确抗体的特异性的实验中。
[表1]
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抗人胰脏特异性的RNase 1抗体对于糖链修饰缺失突变抗原的反应性的测定
抗人胰脏特异性的RNase 1抗体对于糖链修饰缺失突变重组体人胰脏特异性的RNase 1的反应性，通过以下记载的夹心法ELISA而测定。向96孔微量滴定板(Greiner bio-one制)的各孔中加入包含25ng的山羊抗人免疫球蛋白κ链抗体(Sigma-Aldrich JapanK.K.制)的磷酸缓冲液(50mM磷酸钠、150mM NaCl、pH7.4)50μl，在4℃下固定16小时。将这些孔用300μl的洗涤液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)洗涤3次之后，加入包含3％BSA的TBS溶液200μl，在室温下放置2小时进行封闭(抗人免疫球蛋白κ链抗体固相化板)。将各孔用300μl的洗涤液洗涤3次之后，加入基因导入了前述的导入了糖链修饰缺失突变的表达质粒的CHO-KI细胞的培养上清，室温下放置1小时。将各孔用300μl的包含表面活性剂的洗涤液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0.05％Tween-20、pH7.4)洗涤3次之后，加入包含25ng的HRP标记小鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体(MrhRN0614)或25ng的HRP标记大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体(RrhRN0723)的稀释液50μl，在室温下放置1小时。最后，将各孔用300μl的包含表面活性剂的洗涤液洗涤3次之后，添加50μl的TMB溶液使之显色10分钟之后，添加1M的磷酸溶液而停止反应，测定450nm处的吸光度。
图1表示测定的结果。横轴表示：将各抗体对于未导入突变的重组抗原WT的结合量设为1.0时的相对值。纵轴表示：各导入了糖链修饰缺失突变的抗原。涂实的横条表示RrhRN0723抗体的结合量，空白的横条表示MrhRN0614抗体的结合量。通过将第90位的丝氨酸残基置换成丙氨酸残基从而RrhRN0723抗体对于第88位的天冬酰胺残基没有被糖链修饰的突变体(m110，m010，m100，m000)的反应性，相对于MrhRN0614抗体的反应性降低，由此可知，大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体(RrhRN0723)识别第88位的天冬酰胺残基的能够进行糖链修饰的部位周边。另外可知，小鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体(MrhRN0614)对于任意种糖链修饰缺失突变抗原均与未导入突变的重组抗原WT同等地维持了反应性，所以其为不依赖于能够进行糖链修饰的部位而识别胰脏特异性的RNase 1的抗体。
氨基酸置换突变抗原的调制
以前述的表达载体(pcDNA-KFH-hRNase 1)作为模板，通过PCR突变导入法导入氨基酸置换突变，由此制备表达导入了氨基酸置换突变的抗原的质粒。PCR突变导入法中，使用PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit(TAKARA BIO INC.)，按照附加的说明书进行实施。详细而言，通过将序列号2中第85位的氨基酸至第92位的氨基酸残基分别置换为其它的氨基酸残基，制备表达氨基酸置换突变重组体人胰脏特异性的RNase 1的质粒(表2)。对于所制备的导入了氨基酸置换突变的表达质粒，确认到有氨基酸置换突变导入重组体人胰脏特异性的RNase 1被分泌至培养基中；所述重组体人胰脏特异性的RNase 1是通过对于CHO-K1株使用Lipofectamine 2000(Life Technologies Japan Ltd.)实施基因导入而在N末端侧附加有人免疫球蛋白κ链而成的。被分泌至培养基中的氨基酸置换突变导入重组体人胰脏特异性的RNase 1供于用于明确抗体的特异性的实验中。
[表2]
突变体名称 导入氨基酸空变的部位
WT 没有导入突变
R85K Arg 85 -＞ Lys
L86I Leu 86 -＞ Ile
T87S Thr 87 -＞ Ser
N88D Asn 88 -＞ Asp
G89S Gly 89 -＞ Ser
S90A Ser 90 -＞ Ala
R91K Arg 91 -＞ Lys
Y92F Thy 92 -＞ Phe
抗人胰脏特异性的RNase 1抗体对于导入了氨基酸置换突变的抗原的反应性的测定
抗人胰脏特异性的RNase 1抗体对于导入了氨基酸置换突变的抗原的反应性通过以下所示的夹心法ELISA测定。向96孔微量滴定板(Greiner bio-one制)的各孔中加入包含25ng的山羊抗人免疫球蛋白κ链抗体(Sigma-Aldrich Japan K.K.制)的磷酸缓冲液(50mM磷酸钠、150mM NaCl、pH7.4)50μl，在4℃下固定16小时。将这些孔用300μl的洗涤液(20mMTris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)洗涤3次之后，加入包含3％BSA的TBS溶液200μl，在室温下放置2小时进行封闭(抗人免疫球蛋白κ链抗体固相化板)。将各孔用300μl的洗涤液洗涤3次之后，加入基因导入了表达导入了氨基酸置换突变的抗原的质粒的CHO-KI细胞的培养上清，在室温下放置1小时。将各孔用300μl的包含表面活性剂的洗涤液(20mM Tris-HCl，150mMNaCl、0.05％Tween-20、pH7.4)洗涤3次之后，加入包含25ng的HRP标记小鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体(MrhRN0614)或25ng的HRP标记大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体(RrhRN0723)的稀释液50μl，在室温下放置1小时。最后，将各孔用300μl的包含表面活性剂的洗涤液洗涤3次之后，添加50μl的TMB溶液使之显色10分钟之后，添加1M的磷酸溶液而停止反应，测定450nm处的吸光度。
图2表示其结果。横轴表示：将各抗体对于未导入突变的重组抗原WT的结合量设为1.0时的相对值。纵轴表示：各导入了氨基酸置换突变的抗原。涂实的横条表示RrhRN0723抗体的结合量，空白的横条表示MrhRN0614抗体的结合量。RrhRN0723对于突变体R85K，L86I，N88D，G89S，S90A的反应性与对于MrhRN0614的反应性相比较极端地降低，所以可以确认：抗人胰脏特异性的RNase 1抗体RrhRN0723识别能够进行糖链修饰的部位即从第88位天冬酰胺残基周围的氨基酸残基、特别是第85位的精氨酸残基起至第90位的丝氨酸残基为止。
抗人胰脏特异性的RNase 1抗体对于Asn88能够进行糖链修饰的部位的糖链修饰抗原的反应性
通过免疫印迹法分析CHO-K1细胞中表达的只有第88位天冬酰胺残基接受糖链修饰的导入了糖链修饰缺失突变的人胰脏特异性的RNase 1(m001)。即，将未导入突变的重组抗原WT与导入了糖链修饰缺失突变的抗原m001使用抗人免疫球蛋白κ轻链抗体进行免疫沉淀之后，用SDS-PAGE法进行分离。将被分离的蛋白质转印到PVDF膜上之后，与识别胰脏特异性的RNase 1的N末端侧14个氨基酸序列的抗人胰脏特异性的RNase 1抗体(RN15013)反应，从而进行检测。可知，表达的重组体蛋白质中，对于WT，从没有附加糖链的分子检测到至1、2、3位点附加了糖链的分子，糖链附加量有偏差；对于m001，包含附加了一位点糖链的分子、和没有附加糖链的分子两种(图3)。
接着，研究抗体对于第88位天冬酰胺残基接受了糖链修饰的导入了糖链修饰缺失突变的抗原m001的反应性。即，使用将识别并结合糖蛋白的N型糖链的伴刀豆球蛋白A凝集素固定化而成的凝集素柱，将第88位天冬酰胺残基接受了糖链修饰的导入了糖链修饰缺失突变的抗原m001进行分级。具体而言，在用凝集素柱结合缓冲液(20mMTris-HCl、150mMNaCl、1mM CaCl2、0.5mM MgCl2、pH7.4)平衡化后的伴刀豆球蛋白A凝集素结合柱(HiTrap-ConA、GE Healthcare制)中流通使导入了糖链修饰缺失突变的人胰脏特异性的RNase 1(m001)表达的CHO-K1培养细胞上清，使之结合导入了糖链修饰缺失突变的人胰脏特异性的RNase 1(m001)。伴刀豆球蛋白A凝集素结合柱用凝集素柱结合缓冲液充分地洗涤之后，使用包含α-甲基甘露糖苷(Sigma-Aldrich Japan K.K.)的凝集素柱结合缓冲液，将所结合的导入了糖链修饰缺失突变的人胰脏特异性的RNase 1(m001)洗脱。用组分收集器回收从注入样品起至所有的洗脱级分，用夹心法ELISA测定分级的各级分所包含的重组体抗原的量。检测中使用没有受到糖链修饰的影响的抗体MrhRN0614、和识别Asn88能够进行糖链修饰的部位附近的抗体RrhRN0723。
将结果示于图4。横轴表示柱分离中的各级分，第一纵轴表示ELISA分析的测定值，第二纵轴表示α-甲基甘露糖苷的浓度。虚线表示MrhRN0614抗体的结合量的变化，实线表示RrhRN0723抗体的结合量。点线表示作为洗脱糖的α-甲基甘露糖苷在各组分中的浓度。如图4所示可知，对于MrhRN0614，伴刀豆球蛋白A结合级分(α-甲基甘露糖苷洗脱级分)中有抗原洗脱；也可知，RrhRN0723对于相同级分没有表现出反应性。另一方面，可知，没有与伴刀豆球蛋白A结合的级分(直接出来的级分)与两抗体均表现出反应性。如果通过免疫印迹法解析伴刀豆球蛋白A结合级分所包含的抗原，则显示该级分中只包含被糖链修饰的抗原。以上的结果表示：新取得的抗人胰脏特异性的RNase 1抗体(RrhRN0723)为不与第88位天冬酰胺残基接受了糖链修饰的胰脏特异性的RNase 1反应，而仅在该残基没有接受糖链修饰的情况下才结合胰脏特异性的RNase 1的抗体。即可知，使用了抗人胰脏特异性的RNase 1抗体(RrhRN0723)的免疫学的测定体系中，测定胰脏特异性的RNase 1的第88位天冬酰胺残基没有结合糖链的情况下的量。
实施例3利用夹心法ELISA进行人血清被检体的测定
将生物试样作为被检体通过以下的夹心法ELISA进行测定。
来源于胰腺癌患者的生物试样中的胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位中的、没有结合N型糖链的部位的测定。
为了测定人生物试样中的胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位中的、没有结合N型糖链的部位，准备：健康人血清(40个被检体)、胰腺癌患者血清(50个被检体、BioTheme公司)、胰脏病患者血清(非癌、12个被检体、BioTheme公司)、乳腺癌患者血清(20个被检体BioTheme公司)、良性乳腺肿瘤患者血清(18个被检体)、前列腺癌患者血清(24个被检体、SLR公司)、前列腺肥大症患者血清(24个被检体、SLR公司)(表3)。
[表3]
被检体分类 被检体数
健康人血清 40
胰腺癌患者血清 50
非癌胰脏疾病患者血清 12
乳腺癌患者血清 20
良性乳腺肿瘤患者血清 18
前列腺癌患者血清 24
前列腺肥大患者血清 24
总计 188
测定按照以下所示的方法实施。向96孔微量滴定板(Greiner bio-one制)的各孔中加入包含25ng的小鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体(MrhRN0614)的磷酸缓冲液(50mM磷酸钠、150mM NaCl、pH7.4)50μl，在4℃下固定16小时。将这些孔用300μl的洗涤液(20mMTris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)洗涤3次之后，加入包含3％BSA的封闭溶液(3％BSA，20mMTris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)200μl，在室温下放置2小时进行封闭(抗人胰脏特异性的RNase 1抗体固相化板)。将各孔用300μl的洗涤液洗涤3次之后，加入用稀释液(1％BSA、20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0.05％Tween-20、pH7.4)稀释至10倍的胰腺癌患者血清或作为对照被被检体的健康人血清，在室温下放置1小时。将各孔用300μl的包含表面活性剂的洗涤液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0.05％Tween-20、pH7.4)洗涤3次之后，加入包含25ng的HRP标记大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体(RrhRN0723)的稀释液50μl，在室温下放置1小时。接着，将各孔用300μl的洗涤液洗涤3次之后，添加50μl的TMB溶液并使之显色10分钟之后，添加1M的磷酸溶液而停止反应，测定450nm处的吸光度。对于其他的被检体，也同样地进行测定。
图5表示其结果。横轴表示癌的种类，纵轴表示ELISA测定的测定值。黑色圆圈表示各被检体的测定值，用箱线图表示其统计学分布。胰腺癌以外表现出某特定的值以上，与此相对，胰腺癌表现出与其他的组相比显著低的值。即表示，胰腺癌患者与健康人相比较，胰脏特异性的RNase 1的RrhRN0723所识别的能够进行N型糖链修饰的部位没有结合N型糖链的情况少。反过来说，表示胰腺癌患者与健康人相比较，该能够进行N型糖链修饰的部位结合有N型糖链的情况多。另外，分成胰腺癌以外的共计6个组(非胰腺癌群)与胰腺癌组的情况下的显著性差异检验的结果，可以确认p值表为非常地低至7.3×10-15的值，确认到明显地显著性差异(图6)。
以该测定结果作为基础，将胰腺癌的判定精度解析结果示于图7和表4中。ROC统计分析使用作为统计分析软件的R进行实施。被最优化的截止值(ABS450nm＝0.811)下的特异性为96％、灵敏度为78％，作为诊断性能的指标之一的AUC显示出充分地高达0.933的值。
[表4]
特异性 96％
灵敏度 78％
AUC 0.933
实施例4胰腺癌患者血清中的胰脏特异性的RNase 1的能够进行糖链修饰的部位Asn88的糖链结合的研究
按照以下的步骤，制备识别并结合胰脏特异性的RNase 1的能够进行糖链修饰的部位Asn88的抗体，作为免疫印迹法的1次抗体而使用。
对免疫动物的免疫
化学合成相当于序列号2的氨基酸序列85～95的部分而成的肽(序列号4)，使之与血蓝蛋白(KLH)缀合而制成免疫原，使用其对大鼠实施免疫。详细而言，将100μg的免疫原与弗氏完全佐剂一起，向6周龄WHY雌大鼠两后肢足垫给予，进行初次免疫。之后，在28天后将免疫原100μg与生理盐水一起对后肢足垫进行给予，作为最终免疫。
抗体产生杂交瘤的制备
最终免疫3天后，摘除免疫过的大鼠的骼淋巴结和鼠腹股沟淋巴结，得到淋巴结细胞。大鼠淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤细胞株通过电细胞融合法融合之后，用添加了次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的GIT培养基(和光纯药工业株式会社)接种至细胞培养用96孔板，由此选择融合细胞。
大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1肽抗体产生融合细胞株的选定
对于前述的融合细胞向培养基中分泌的抗体，使用筛选用肽(序列号5或6)与牛血清蛋白(BSA)缩合而成的筛选抗原，通过ELISA法进行筛选，选择大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1肽抗体产生融合细胞株。筛选中所使用的ELISA如下。向96孔微量滴定板(Greinerbio-one制)的各孔中分别加入包含25ng的筛选用肽缩合BSA的磷酸缓冲液(50mM磷酸钠、150mM NaCl、pH7.4)50μl，在4℃下固定16小时。将这些孔用300μl的洗涤液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl、pH7.4)洗涤3次之后，加入包含3％BSA的封闭溶液(3％BSA，20mM Tris-HCl，150mM NaCl、pH7.4)200μl，在室温下放置2小时，进行封闭(筛选用肽缩合BSA固相化板)。将各孔用300μl的洗涤液洗涤3次之后，向各孔中加入50μl的融合细胞培养上清，在室温下放置1小时。接着，将各孔用300μl的包含表面活性剂的洗涤液洗涤3次之后，加入包含0.01μg的被HRP标记的抗大鼠IgG抗体(American Qualex Antibodies公司制)的稀释液50μl，在室温下放置1小时。最后，将各孔用300μl的包含表面活性剂的洗涤液洗涤3次之后，添加50μl的TMB溶液使其显色15分钟。之后，通过添加1M的磷酸溶液停止反应，测定450nm处的吸光度。抗人胰脏特异性的RNase 1肽抗体产生融合细胞株的选定基准设为前述的筛选用肽中，产生与序列号5的肽反应并且与序列号6的肽不反应的抗体的融合细胞。需要说明的是，序列号5的肽为包含相当于天然型的胰脏特异性的RNase 1(序列号2)的第85～95位的序列的肽。另外，序列号6的肽相当于将序列号5的肽中第5位的Asn残基置换成Asp残基而成的序列，该置换位点相当于序列号2的第88位Asn残基。
所选择的融合细胞株的上清进而通过免疫印迹法实施筛选，最终选择融合细胞株，该融合细胞株产生能够确认在免疫印迹的PVDF膜上与无突变导入的重组体抗原WT结合的抗体。
根据筛选的结果，得到产生能够特异地检测胰脏特异性的RNase 1的抗体作为免疫印迹法的一次抗体的融合细胞。得到的融合细胞通过有限稀释法被单克隆化，得到单克隆抗体RN3F34。
大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1肽抗体的抗原识别特异性的确认
为了确认得到的大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1肽抗体(RN3F34)的抗原识别特异性，通过免疫印迹法确认对于只残留有Asn88能够进行糖链修饰的部位的导入了糖链修饰缺失突变的人胰脏特异性的RNase 1(m001)的反应性。如图8所示，对于与胰脏特异性的RNase 1的N末端侧14个氨基酸序列结合的抗体RN15013，检测到m001的结合有糖链的高分子量侧的分子、和没有结合糖链的低分子量侧的分子两者。与此相对，RN3F34抗体只检测到没有结合糖链的低分子量侧的分子。由以上的结果可以确认，制备的大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1肽抗体(RN3F34)为不与Asn88结合有糖链的结构的胰脏特异性的RNase 1结合的抗体。
通过以前述的表达载体(pcDNA-KFH-hRNase 1 m001)作为模板的PCR突变导入法将突变体m001的第88位的Asn置换为天冬氨酸，从而制备突变体表达载体(pcDNA-KFH-hRNase 1 m000-N88D)，对于使CHO-K1细胞株表达的突变导入抗原(m000-N88D、表1)的反应性，也同样地进行确认。如图8所示，可以确认，通过与胰脏特异性的RNase 1的N末端侧14个氨基酸序列结合的抗体RN15013，检测到m000-N88D，与此相对，大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1肽抗体(RN3F34)不能检测到m000-N88D。这样，对于Asn88置换成天冬氨酸的肽，确认到没有结合RN3F34抗体。即，这意味着通过PNGaseF等与Asn88结合的糖链进行脱糖链处理的情况下，与此相伴，进行了由天冬酰胺向天冬氨酸的氨基酸转换的胰脏特异性的RNase1，不与RN3F34抗体结合。因此，胰脏特异性的RNase 1的Asn88结合有糖链且伴随着利用PNGaseF的脱糖链向天冬氨酸进行氨基酸转换的部位，不与大鼠抗人胰脏特异性的RNase1肽抗体(RN3F34)结合；而Asn88没有结合糖链且即便通过脱糖链处理也不发生氨基酸转换的部位与大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1肽抗体(RN3F34)结合。这样，可见利用PNGaseF等进行脱糖链处理后的反应性的情况下，在序列号2的氨基酸序列的第88位的Asn没有结合糖链的情况下RN3F34抗体与之结合，而结合有糖链的情况下RN3F34抗体不与之结合，从这种意义上讲，具有与RrhRN0723同等的性能。
人血清中的胰脏特异性的RNase 1的Asn88的糖链结合的变化的确认
使用大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1肽抗体(RN3F34)，用免疫印迹法检测利用PNGaseF进行了脱糖链处理的人血清中的胰脏特异性的RNase 1，测定人血清中的胰脏特异性的RNase 1的Asn88是否结合有糖链。即，由健康人血清5个被检体与胰腺癌患者血清6个被检体，使用MrhRN0614抗体通过免疫沉淀法提取胰脏特异性的RNase 1，用可溶化变性缓冲液使胰脏特异性的RNase1变性之后，用PNGaseF进行脱糖链处理。处理后的试样用免疫印迹法进行解析。检测中，使用识别胰脏特异性的RNase 1的N末端侧14个氨基酸序列的RN15013、和抗人胰脏特异性的RNase 1肽抗体RN3F34。如图9所示，RN15013中，健康人血清、胰腺癌患者血清均检测到一定量的胰脏特异性的RNase 1，两者之间没有显著的差异。另一方面，结果是：利用RN3F34的检测中，健康人血清中检测到胰脏特异性的RNase 1，与此相对，胰腺癌患者血清中没有检测到；或者，检测量与健康人血清相比较，显著地低。由该结果可以确认，胰腺癌患者血清中的胰脏特异性的RNase 1与健康人血清相比较，Asn88结合有N型糖链的情况多。
实施例5通过求出RNase 1的Asn88能够进行糖链修饰的部位没有结合糖链的部位的量与Asn88能够进行糖链修饰的部位的量的比来检测胰腺癌
制备使用了能够特异性地识别人胰脏特异性的RNase 1并且3个能够进行糖链修饰的部位中无论是否有糖链都能结合的2个的抗体的免疫测定试剂、以及特异性地测定Asn88没有结合糖链的RNase 1的免疫测定试剂，用各个试剂测定血清试样中的RNase 1。具体而言，作为能够特异地识别人胰脏特异性的RNase 1并且3个能够进行糖链修饰的部位中无论是否有糖链都能结合的2个的抗体，使用前述的MrhRN0614和RrhRN1111。在得到RrhRN0723时，RrhRN1111作为3个能够进行糖链修饰的部位中无论有无糖链均能够结合的抗体被分离出来。RrhRN1111的抗原识别特异性，按照与实施例2中抗体的特异性的测定中使用的、使用了糖链修饰缺失突变抗原的ELISA法同样的方法进行研究。将结果示于图10中。横轴表示：将各抗体与未导入突变的重组抗原WT的结合量设为1.0时的相对值。纵轴表示：各导入了糖链修饰缺失突变的抗原。涂实的横条表示RrhRN0723抗体的结合量，空白的横条表示RrhRN1111抗体的结合量。如图10所示，RrhRN0723对于能够进行糖链修饰的部位全部引入突变且完全没有接受糖链修饰的突变体m000，没有反应性；与此相对，RrhRN1111对于m000的反应性与未导入突变的重组抗原WT相比较，保持了约90％的反应性。由此，确认到RrhRN1111为3个能够进行糖链修饰的部位无论有无糖链均能够结合的抗体。
以下，表示使用了这些抗体构筑的免疫测定体系的测定试剂的调制法、评价方法。使MrhRN0614以90ng/载体通过物理方式吸附于水不溶性载体(内部混炼有铁氧体的、粒径约1.5mm的EVA制)，吸附后使用BSA进行封闭处理。对于水不溶性载体，能够物理地吸附每1个约100ng的蛋白质。向磁力透过性的容器(容量1.2ml)中加入12个载体之后，加入包含0.5μg/mL的实施了碱性磷酸酶标记的抗体RrhRN0723或0.5μg/mL的实施了碱性磷酸酶标记的抗体RrhRN1111的缓冲液(1％BSA、2.5％葡聚糖、150mM NaCl、0.05％Tween-20，20mMTris-缓冲液、pH7.4)，进行冷冻干燥。将该试剂使用市售的全自动免疫测定装置(TOSOHCORPORATION.制、商品名AIA-600II)进行全自动的测定。其测定原理如下。即，加入150μL测定样品，在37℃下使用磁体使水不溶性载体运动10分钟，在搅拌混合液的状态下进行免疫反应。反应后，进行B/F分离操作而分离去除游离的标记抗体，加入作为碱性磷酸酶的底物的4-甲基伞形酮磷酸酯(4-Methylumbelliferyl phosphate)，添加该底物之后，测定从20秒至295秒为止的酶反应分解物(4-甲基伞形酮，4-methylumbelliferone)的每单位时间的生成速度(nM/秒)。使用包含前述的标记化抗体RrhRN0723的冷冻干燥试剂进行样品的测定，求出胰脏特异性的RNase 1的第88位的能够进行糖链修饰的部位中没有结合糖链的部位的量(以下，称为F3值)。另外，使用包含前述的标记化抗体RrhRN1111的冷冻干燥试剂进行样品的测定，求出胰脏特异性的RNase 1的量(以下，称为总计值)。接着，通过以下的式(1)求出其比(F3/t)。
F3/t＝F3值/总计值 (1)
图11表示其结果。由健康人得到的血清被检体中的F3/t值为0.8-1.0左右，与此相对，由胰腺癌患者被检体得到的被检体中，广泛地分布于0.1-0.7左右，可以确认，与健康人被检体有显著的差异。
另外，通过求出以下式(2)的值，求出胰脏特异性的RNase 1的总计值与第88位的能够进行糖链修饰的部位中结合有糖链的部位的量的比(G3/t)。将该结果示于图11中。由胰腺癌患者被检体得到的被检体可以确认，与健康人被检体有显著的差异。
G3/t＝1-(F3/t) (2)
实施例6利用抗原固相竞争法的测定
构筑如下方法：通过抗原固相竞争法测定胰脏特异性的RNase 1的Asn88能够进行糖链修饰的部位中没有结合糖链的部位的量。即，从来源于胰腺癌的培养细胞株Capan 1的培养上清中，使用RrhRN0723固定化柱，将与RrhRN0723抗体反应的RNase 1纯化。将该抗原浓缩后，通过蛋白质测定试剂盒确定抗原溶液的蛋白质浓度。纯化后的RNase 1使用生物素导入试剂(sulfoNHS-LCLC-biotin、Thermo scientific公司制)进行生物素化，作为固相用抗原。对于链亲合素固定化免疫磁珠(Dynal公司)，将相对于100μl微珠悬浮液为约2.5μg的上述的RNase 1固定化，制备抗原固相化微珠。
将该抗原固相化微珠(4μl)、HRP标记RrhRN0723抗体(10ng)、连续稀释后的竞争抗原(0ng-100ng)混合之后，使之反应1小时。由反应后的溶液中，使用磁体只回收磁性微珠，用洗涤液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0.05％Tween-20、pH7.4)洗涤3次之后，对微珠添加TMB溶液使之显色10分钟。向显色后的溶液中添加1M磷酸而使反应停止，通过测定450nm处的吸光度，测定与微珠结合的HRP标记RrhRN0723抗体量。图12表示利用抗原固相化竞争法的前述的纯化RNase 1的测定结果。实线(第1轴)表示测定值，虚线(第2轴)为抗原浓度为0时的测定值除以各浓度下的测定值而得到的值。可知，依赖于作为竞争抗原引入到反应中的RNase 1的量，测定值变化。由以上的结果显示，通过使用了RrhRN0723抗体的抗原固相化竞争法，能够测定Asn88没有结合糖链的RNase 1的量。
Figure IDA0000630855800000011
Figure IDA0000630855800000021
Figure IDA0000630855800000031

Claims (6)

1.抗体或其片段在制备用于人的癌的检测的医药产品中的用途，其特征在于，测定糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量，其中，所述能够进行N型糖链修饰的部位为选自序列号2所示的序列的第34位、第76位和第88位的1个以上的天冬酰胺残基；其中，
所述癌为胰腺癌；
所述糖蛋白为胰脏特异性的核糖核酸酶1；
所述胰腺癌患者与健康人相比，结合有N型糖链的部位的量增加。
2.抗体或其片段在制备用于人的癌的检测的医药产品中的用途，其特征在于，求出下述A、B中的A与B的比：
A＝糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量，
B＝糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的量；
其中，所述能够进行N型糖链修饰的部位为选自序列号2所示的序列的第34位、第76位和第88位的1个以上的天冬酰胺残基；其中，
所述癌为胰腺癌；
所述糖蛋白为胰脏特异性的核糖核酸酶1；
所述用途为A＝没有结合N型糖链的部位的量，胰腺癌患者与健康人相比A/B的值减小的用途；或者
所述用途为A＝结合有N型糖链的部位的量，胰腺癌患者与健康人相比A/B的值增大的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其为求出胰脏特异性的核糖核酸酶1的量、换算该值作为B的值的用途。
4.根据权利要求1～3中的任一项所述的用途，其中，能够进行N型糖链修饰的部位为序列号2所示的序列的第88位的天冬酰胺残基。
5.根据权利要求1～3中的任一项所述的用途，其中，能够进行N型糖链修饰的部位为序列号2所示的序列的第76位的天冬酰胺残基。
6.根据权利要求1～3中的任一项所述的用途，其中，能够进行N型糖链修饰的部位为序列号2所示的序列的第34位的天冬酰胺残基。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6500397B2 (ja) 2013-12-25 2019-04-17 東ソー株式会社 Ｎ型糖鎖が付加している部位又はその割合の測定方法
JP6604081B2 (ja) * 2014-08-13 2019-11-13 東ソー株式会社 Ｎ型糖鎖が付加している膵臓リボヌクレアーゼ１の測定方法
JP6834747B2 (ja) 2016-05-18 2021-02-24 東ソー株式会社 肺癌を検出する方法及び検出用キット
CA3052553A1 (en) * 2017-02-03 2018-08-09 Sumitomo Chemical Company, Limited Pancreatic cancer detection method

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001021830A1 (en) * 1999-09-24 2001-03-29 Ambion, Inc. Nuclease inhibitor cocktail
EP1714970A1 (en) * 2005-04-22 2006-10-25 Universität des Saarlandes Use of inhibitors of RNAse A-family enzymes for stabilizing oligonucleotides having RNA interfering activity
WO2008024457A2 (en) * 2006-08-24 2008-02-28 Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Rnase a peptides, fragments and uses thereof
WO2008063479A2 (en) * 2006-11-17 2008-05-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Pancreatic cancer biomarkers
JP2010180174A (ja) * 2009-02-06 2010-08-19 Tokyo Univ Of Science 膵癌の診断方法および膵癌の診断用キット
CN101921336A (zh) * 2009-06-11 2010-12-22 北京华大蛋白质研发中心有限公司 一种抗人α1酸性糖蛋白的单克隆抗体及其制备方法
CN102372773A (zh) * 2010-08-11 2012-03-14 中国科学院生物物理研究所 人膀胱癌肿瘤标志物及其抗体和应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001021830A1 (en) * 1999-09-24 2001-03-29 Ambion, Inc. Nuclease inhibitor cocktail
EP1714970A1 (en) * 2005-04-22 2006-10-25 Universität des Saarlandes Use of inhibitors of RNAse A-family enzymes for stabilizing oligonucleotides having RNA interfering activity
WO2008024457A2 (en) * 2006-08-24 2008-02-28 Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Rnase a peptides, fragments and uses thereof
WO2008063479A2 (en) * 2006-11-17 2008-05-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Pancreatic cancer biomarkers
JP2010180174A (ja) * 2009-02-06 2010-08-19 Tokyo Univ Of Science 膵癌の診断方法および膵癌の診断用キット
CN101921336A (zh) * 2009-06-11 2010-12-22 北京华大蛋白质研发中心有限公司 一种抗人α1酸性糖蛋白的单克隆抗体及其制备方法
CN102372773A (zh) * 2010-08-11 2012-03-14 中国科学院生物物理研究所 人膀胱癌肿瘤标志物及其抗体和应用

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