JP6244779B2 - 膵臓癌の病期を検出する方法及び検出用キット - Google Patents

Description

本発明は、膵臓癌の病期の検出方法及び検出用キットに関する。より詳しくは、膵臓特異的リボヌクレアーゼ１のＮ型糖鎖修飾可能部位における糖鎖の結合の有無を測定することによる膵臓癌の病期、特にステージＩおよびＩＩの検出方法及びその検出用キットに関する。

診断初期段階での癌の検出方法としては、非侵襲的な生体由来の試料、例えば血液や尿などの比較的採取が容易な体液を被検体とすることが好ましい。現在の膵臓癌の診断の際に使用される血清マーカーとしてＣＡ１９−９、ＤＵＰＡＮ−２などがある。しかしながら、これらのマーカーは臓器特異性が低いことや、遺伝的理由から当該マーカーに反応しない場合があるなど、決定的な確定診断にはならないという欠点がある。

リボヌクレアーゼファミリーの１つである膵臓特異的リボヌクレアーゼ１（以下、リボヌクレアーゼ１を「ＲＮａｓｅ １」と称する）は膵臓特異的に発現し、細胞外の体液中に分泌される糖タンパク質である。このタンパク質は、１５６アミノ酸からなるペプチドとして翻訳され、分泌シグナルの除去、糖鎖修飾を受けた後、１２８アミノ酸のペプチド配列（配列番号１）を持つ成熟糖タンパク質として細胞外に分泌される。Ｎ型糖鎖修飾可能部位、即ちＮ型糖鎖修飾を受ける可能性があるアミノ酸残基は、配列番号１における３４番目、７６番目、８８番目アスパラギン残基である。

膵臓特異的ＲＮａｓｅ １は古くから研究され、癌における発現や活性の変化などが報告されているが、実際に臨床応用されている例はない。１９８０年にＤｏｒａｎらは、血清中のリボヌクレアーゼ活性が、膵臓癌患者で増加すると報告しているが（非特許文献１）、活性のみの記載であり、リボヌクレアーゼの分子種に関しては特定されていない。膵臓特異的ＲＮａｓｅ １の糖鎖修飾に関しては、１９９４年に健常人から得たリボヌクレアーゼに関して報告され、３カ所ある糖鎖修飾可能部位のそれぞれの糖鎖付加の程度について報告が有るが、膵臓癌との関連性に付いては報告されていない（非特許文献２）。２０００年に、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓらは膵臓癌由来培養細胞から分泌された膵臓特異的ＲＮａｓｅ １の分子量が、正常の膵臓から得られたものと比べて大きくなることを報告し、その理由の１つとして糖鎖修飾量の増加を指摘した（非特許文献３）。さらに同研究グループは、２００３年と２００７年に、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １の糖鎖修飾に関する報告を発表し、その中で膵癌患者の血清から得られた膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖構造が変化していることを指摘し、特にコアフコシル化された２本分岐複合型糖鎖が増加することを明らかにし、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １の分子量増加は付加している糖鎖構造自体の分子量増加に起因しているとした（非特許文献４、５）。しかしながら、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位における糖鎖結合の有無と癌とを関連付ける報告はこれまでになく、さらにいえば、これまでに膵臓癌の病期を決定する方法としては画像診断や手術時の組織診断による方法しかなく、侵襲性の低い腫瘍マーカーによる病期の識別はできなかった。

Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． ３３， １２１２−１３ （１９８０） Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ ３７５， ３５７−６３ （１９９４） Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７， １４８４−１４９４ （２０００） Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １３， ２２７−２４４ （２００３） Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １７， ３８８−４００ （２００７）

本発明は、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位に着目し、膵臓癌の病期を検出する方法を提供することを目的とする。

本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、膵臓癌患者では膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位において糖鎖が結合している場合が健常人と比べて増加していることを見いだし、特に、ステージＩおよびＩＩの患者で顕著であることを見いだし、本発明を完成するに至った。 即ち本発明は、以下のとおりである。

（１）膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量を測定することを特徴とする、膵臓癌の病期を検出する方法。
（２）（１）に記載の方法において、病期がステージＩ及びＩＩである方法。
（３）膵臓癌の他の病期に比べてＮ型糖鎖が結合している部位の量が増加する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）下記Ａ，Ｂにおいて、ＡとＢとの比を求めることを特徴とする、膵臓癌の病期を検出する方法。
Ａ＝膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量
Ｂ＝膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位の量
（５）（４）に記載の方法において、病期がステージＩ及びＩＩである方法。
（６）（４）又は（５）に記載の方法において、Ａ＝Ｎ型糖鎖が結合していない部位の量、であり、膵臓癌の他の病期と比べて、Ａ／Ｂの値が小さくなる方法。
（７）（４）又は（５）に記載の方法において、Ａ＝Ｎ型糖鎖が結合している部位の量、であり、膵臓癌の他の病期と比べて、Ａ／Ｂの値が大きくなる方法。
（８）（４）〜（７）いずれかに記載の方法において、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １の量を求め、その値を換算してＢの値とする方法。
（９）Ｎ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１に示された配列の３４番目、７６番目及び８８番目から選ばれる１つ以上のアスパラギン残基である、（１）〜（８）いずれか１項に記載の方法。
（１０）Ｎ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１に示された配列の８８番目のアスパラギン残基である、（９）に記載の方法。
（１１）Ｎ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１に示された配列の７６番目のアスパラギン残基である、（９）に記載の方法。
（１２）Ｎ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１に示された配列の３４番目のアスパラギン残基である、（９）に記載の方法。
（１３）（ａ）膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位を抗原認識部位の一部とするモノクローナル抗体またはその断片、及び試料、を接触させ、（ａ）のモノクローナル抗体またはその断片と複合体を形成した膵臓特異的ＲＮａｓｅ １を測定する、（１）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法。
（１４）（１３）に記載の方法において、さらに（ｂ）膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位を抗原認識部位の一部とするモノクローナル抗体またはその断片と同時に膵臓特異的リボヌクレアーゼ１に結合できるモノクローナル抗体またはその断片、を試料と接触させ、（ａ）及び（ｂ）の２つのモノクローナル抗体または抗体断片と複合体を形成した膵臓特異的ＲＮａｓｅ １を測定する方法。
（１５）（１４）に記載の方法において、試料を、（ａ）又は（ｂ）の一方と接触させる第一の接触工程と、第一の接触工程で得られたものに（ａ）又は（ｂ）の他方を接触させる第二の接触工程を含む方法。
（１６）膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位を抗原認識部位の一部とするモノクローナル抗体またはその断片を含有することを特徴とする、膵臓癌の病期検出用キット。
（１７）（１６）に記載のキットにおいて、病期がステージＩ及びＩＩであるキット。
（１８）膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量を質量分析法によって求める、（１）〜（１２）いずれか１項に記載の方法。
（１９）（１８）に記載の方法において、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のペプチド断片および／または糖ペプチド断片の質量を質量分析法によって測定する方法。

以下に本発明を更に詳細に説明する。本発明は、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量を測定することにより、膵臓癌の病期を検出するものである。このとき、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している「部位」の量、またはＮ型糖鎖が結合していない「部位」の量を測定するものであって、Ｎ型糖鎖修飾可能部位に対して結合している「糖鎖」の量を測定するものではない。

測定対象となる膵臓特異的ＲＮａｓｅ １はヒト生体試料由来であることが好ましい。これらを測定対象とすることにより、ヒトの膵臓癌の病期を検出することができる。このとき、病期ステージがＩおよびＩＩの膵臓癌患者では、他のステージや健常人と比べてＮ型糖鎖修飾可能部位にＮ型糖鎖が結合している場合が多く、Ｎ型糖鎖修飾可能部位の中でＮ型糖鎖が結合している部位が増加するため、これを指標として膵臓癌の病期、特にステージＩ及びＩＩを検出することができる。

また本発明は、下記Ａ，Ｂにおいて、ＡとＢとの比を求めることを特徴とする、膵臓癌の病期の検出方法である。
Ａ＝膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量
Ｂ＝膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位の量
この方法により、特に病期ステージＩ及びＩＩを検出することができる。

また、Ａ＝Ｎ型糖鎖が結合していない部位の量、であり、他のステージや健常人と比べて、Ａ／Ｂの値が小さくなる方法であることが好ましい。またＡ＝Ｎ型糖鎖が結合している部位の量、であり、他のステージや健常人と比べて、Ａ／Ｂの値が大きくなる方法であることも好ましい。

Ｂ＝膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位の量、の場合、その求め方には特に限定はなく、例えば膵臓特異的ＲＮａｓｅ １の量を求め、その値を換算してＢの値とすることができる。具体的には、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １は前述のように３つのＮ型糖鎖修飾可能部位（配列番号１の３４，７６，８８番目のアスパラギン残基）を有するので、測定対象としてそのいずれか１つ、もしく２つの部位、またはすべての部位の量としたときには、それに応じてＢ＝膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位の量も、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １の量のそれぞれ１倍、２倍または３倍と換算することができる。なお、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １の量は、例えば免疫学的測定法や質量分析を使用した方法により求めることができる。

なお、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １は、前述のように３つのＮ型糖鎖修飾可能部位（配列番号１の３４，７６，８８番目のアスパラギン残基）を有する。そのいずれか１つもしくは２つの部位またはすべての部位において、Ｎ型糖鎖が結合している部位の量または結合していない部位の量を測定することにより、又はその量と膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位の量との比を求めることにより、膵臓癌の病期、特にステージＩ及びＩＩを検出することができる。特にＮ型糖鎖修飾可能部位として、配列番号１の８８番目のアスパラギン残基に対して上述の量を測定すると、膵臓癌の病期ステージがＩおよびＩＩの患者と、病期ステージＩＩＩ及びＩＶの患者又は健常人とでは、その値に顕著な差がみられるため、膵臓癌の病期、特にステージＩ及びＩＩの検出方法として好ましいものである。同様に、配列番号１の７６番目又は３４番目のアスパラギン残基に対して上述の量を測定することも好ましい。

本発明では、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位を抗原認識部位の一部とするモノクローナル抗体またはその断片を用いることができる。このようなモノクローナル抗体は、例えば膵臓特異的ＲＮａｓｅ １またはそのＮ型糖鎖修飾可能部位を含む近傍のペプチド配列を免疫原とし、常法に従い作製することができる。また抗体の抗原特異性は、その抗原決定基への抗体の結合を標準アッセイ、たとえばＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析を用いて決定することができる。またモノクローナル抗体の断片としては、様々な酵素で全抗体を消化して得られるＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２フラグメント等があげられる。このようなモノクローナル抗体又はその断片の中で、本発明においては、特に膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位に、糖鎖が結合していない場合に結合し、Ｎ型糖鎖が結合している場合に結合が阻害されるものを用いることが好ましい。

さらに、このようなモノクローナル抗体またはその断片の中でも、本発明においては、抗原認識部位が、配列番号１に示された配列の８８番目のアスパラギン残基を含む領域であるものを用いることが好ましい。とりわけ、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １の糖鎖修飾可能部位のうち最もカルボキシル末端側に位置する部位の近傍のアミノ酸配列を認識部位の一部に含むモノクローナル抗体またその断片であることが好ましい。このようなモノクローナル抗体として、後述の参考例１で作製した抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １モノクローナル抗体ＲｒｈＲＮ０７２３をあげることができる。このモノクローナル抗体ＲｒｈＲＮ０７２３は、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位のうち、配列番号１の８８番目のアスパラギン残基にＮ型糖鎖が結合している場合には、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １への結合が阻害されるものである。

また本発明では、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位を抗原認識部位の一部とするモノクローナル抗体またはその断片と同時に膵臓特異的ＲＮａｓｅ １に結合できることを特徴とする、モノクローナル抗体またはその断片を用いることができる。このようなモノクローナル抗体は、例えば膵臓特異的ＲＮａｓｅ １を免疫原とし、常法に従い作製し、上述の膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位を認識するモノクローナル抗体またはその断片と同時に膵臓特異的ＲＮａｓｅに結合することができるものをスクリーニングすればよい。またモノクローナル抗体の断片は、例えば様々な酵素で全抗体を消化して得られるＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２フラグメントなどがあげられる。このようなモノクローナル抗体として、本発明で作製した抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １モノクローナル抗体ＭｒｈＲＮ０６１４をあげることができる。このモノクローナル抗体ＭｒｈＲＮ０６１４は、前述のモノクローナル抗体ＲｒｈＲＮ０７２３と同時に膵臓特異的ＲＮａｓｅ １に結合することができる。

本発明においては、このようなモノクローナル抗体またはその断片は、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ビオチン、フルオレセインイソチオシアネート等で標識されたものを用いてもよい。

本発明は、（ａ）膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位を抗原認識部位の一部とするモノクローナル抗体またはその断片、及び試料、を接触させ、（ａ）のモノクローナル抗体またはその断片と複合体を形成した膵臓特異的ＲＮａｓｅ １を測定する、膵臓癌の病期を検出する方法である。このような方法としては、例えば競合法や抗体アレイ法をあげることができる。

また本発明は、上述の（ａ）のモノクローナル抗体又はその断片に加えて、さらに（ｂ）として（ａ）と同時に膵臓特異的ＲＮａｓｅ １に結合できるモノクローナル抗体またはその断片を試料と接触させ、（ａ）及び（ｂ）の２つのモノクローナル抗体または抗体断片と複合体を形成した膵臓特異的ＲＮａｓｅ １の糖鎖修飾可能部位であってＮ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量を測定する膵臓癌の病期を検出する方法である。このとき、（ａ）および（ｂ）のモノクローナル抗体又はその断片は、試料に対して同時に接触させてもよいが、順次接触させる方が好ましい。順次接触させる場合、試料と（ａ）または（ｂ）の一方と接触させる第一の接触工程と、次いで第一の接触工程で得られたものに（ａ）又は（ｂ）の他方を接触させる第二の接触工程とを含む。このとき、第一の接触工程では試料と（ｂ）とを接触させ、次いで第二の接触工程で（ａ）と接触させることが好ましい。（ａ）、（ｂ）としては、前述のモノクローナル抗体又はその断片を用いることができ、特に（ａ）としてはモノクローナル抗体ＲｒｈＲＮ０７２３またはその断片、（ｂ）としてはモノクローナル抗体ＭｒｈＲＮ０６１４またはその断片を用いることが更に好ましい。このような方法としては、たとえばＥＬＩＳＡ法やＥＩＡ法のほか、液体クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法、イムノクロマト法等により、形成された免疫複合体を分離し測定してもよい。

このように膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位を抗原認識部位の一部とするモノクローナル抗体またはその断片は、膵臓癌の病期を検出するキットとして使用することができる。

本発明において、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量を求める方法としては、特に限定はなく、上述のようなイムノアッセイを用いた方法でもよく、また質量分析法によって求めてもよい。質量分析法によって求める場合、例えば膵臓特異的ＲＮａｓｅ １を酵素等で分解し、得られたペプチド断片及び／又は糖ペプチド断片の質量を質量分析器等で測定することにより、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量を求めることができる。質量分析器を使用する方法において、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １からペプチド断片を得る方法としては、例えばＪ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．３，５５６−５６６ （２００４）に報告されているように、糖鎖分解酵素による一連の糖鎖除去処理とエンド型ペプチダーゼによるタンパク質のペプチド骨格の断片化が挙げられる。糖鎖分解酵素による一連の糖鎖除去処理の一例を挙げると、エキソ型糖鎖分解酵素であるシアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼの中から選ばれる１つ以上の酵素と、Ｎ型糖鎖の基幹構造部分のキトビオース構造に作用するエンド型グリコシダーゼ、例えばエンドグリコシダーゼＨなどを使用して、Ｎ−アセチルグルコサミンの単糖構造をＮ型糖鎖修飾可能部位のアスパラギン残基上に残す方法がある。この方法では、Ｎ−アセチルグルコサミンの単糖構造がタンパク質のペプチド骨格上に残るため、任意のエンド型ペプチダーゼ処理によって得られた断片のうち、アミノ酸配列から計算上求められる推定分子量からＮ−アセチルグルコサミンの分子量だけ質量が増加した糖ペプチド断片を検出することで、特定のＮ型糖鎖修飾可能部位における糖鎖の付加状態が判別可能となる。以上に挙げた方法によって膵臓特異的ＲＮａｓｅ １を分析することで、質量分析法によって糖鎖付加状態の有無を確認することができる。

本発明により、膵臓癌の病期、特に病期ステージＩおよびＩＩを検出することができる。

参考例２で、抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体の糖鎖修飾欠損変異導入抗原に対する結合性を測定した結果を示す図である。 参考例２で、抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体のアミノ酸置換変異導入抗原に対する結合性を測定した結果を示す図である。 参考例２で、各フラクションにおけるアルファーメチルマンノシドの濃度と、抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体の結合性を測定した結果を示す図である。 実施例１で、抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体ＲｒｈＲＮ１１１１の糖鎖修飾欠損変異導入抗原に対する結合性を測定した結果を示す図である。 実施例２で、ステージ別の膵臓癌患者血清の総膵臓特異的ＲＮａｓｅ １量（図５Ａ）とＡｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加していない膵臓特異的ＲＮａｓｅ １量（図５Ｂ）とを示す図である。 実施例２で、ステージ別の膵臓癌患者血清とＧ_３／ｔとの関係を示す図である。 実施例２で、膵臓癌患者血清を、病期ステージＩおよびＩＩの群と、ＩＩＩ及びＩＶの群の２つに分けた場合の、両者間のＲＯＣ解析をした結果を示す図である。

［参考例１］ 抗体の作製
免疫原の調製
ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １全長を含むポリペプチドを取得するために、昆虫細胞で発現可能なプラスミドベクターに成熟型ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １（配列番号１）をコードする遺伝子配列を挿入した発現プラスミドを作製した。詳しく説明すると、昆虫細胞組換えタンパク質発現用プラスミドであるｐＩＺ／Ｖ５Ｈｉｓ ｖｅｃｔｏｒ（ライフテクノロジー社）のマルチクローニングサイトに、５’上流側からヒトイムノグロブリンカッパー鎖をコードする遺伝子配列、Ｈｉｓタグをコードする遺伝子配列、ＦＬＡＧタグをコードする遺伝子配列、ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １をコードする遺伝子配列からシグナルペプチドであるアミノ酸１番から２８番までに相当する８４核酸残基の遺伝子を除いた領域（配列番号１）を挿入した。作製された発現プラスミドｐＩＺ−ＫＦＨ−ｈＲＮａｓｅ１は、昆虫細胞株Ｓｆ９にＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ ＩＩ（ライフテクノロジー社）を用いて遺伝子導入を実施したことにより、Ｎ末端側にヒトイムノグロブリンカッパー鎖が付加した組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １が培地中に分泌されることを確認した。培地中に分泌されたタンパク質は、培養上清から抗ヒトイムノグロブリンカッパー軽鎖抗体を用いたアフィニティー精製により濃縮精製して免疫原とした。

免疫動物への免疫
上述の免疫原を用いてマウスおよびラットに免疫を実施した。詳しくは、マウスへの免疫の場合、１００μｇの免疫原をフロイント完全アジュバンドと共に、６週齢Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス腹腔に投与し初回免疫とした。その後、７日後、１４日後、２１日後、２８日後、３５日後に免疫原１００μｇをフロイント不完全アジュバンドと共に腹腔投与し、追加免疫とした。さらに、４２日後に免疫原１００μｇを生理食塩水と共に腹腔投与し、最終免疫とした。ラットへの免疫の場合は、１００μｇの免疫原をフロイント完全アジュバンドと共に、６週齢ＷＨＹ雌ラット両後肢フットパッドへ投与し初回免疫とした。その後、２８日後に免疫原１００μｇを生理食塩水と共に後肢フットパッドへ投与し、最終免疫とした。

抗体産生ハイブリドーマの作製
最終免疫の３日後に、マウスから脾臓を摘出し、脾臓細胞を回収した。ラットからは、腸骨リンパ節と鼠蹊リンパ節を摘出し、リンパ節細胞を得た。マウス脾臓細胞およびラットリンパ節細胞は、それぞれマウスミエローマ細胞株と電気細胞融合法により融合させた後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを添加したＧＩＴ培地（和光純薬工業株式会社）で細胞培養用９６ウェルプレートに播種することにより、融合細胞を選択した。

マウス抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体産生融合細胞株の選定
マウス抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体産生融合細胞株は、融合細胞が培地中に分泌する抗体の、組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １に対する反応性を指標にしたＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングにより選択した。スクリーニングに用いたＥＬＩＳＡは以下の通りである。９６穴マイクロタイタープレート（グライナー社製）の各ウェルに２５ｎｇのヤギ抗ヒトイムノグロブリンカッパー鎖抗体（シグマアルドリッチ社製）を含むリン酸緩衝液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を５０μｌ加えて４℃１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、３％ＢＳＡを含むブロッキング溶液（３％ＢＳＡ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を２００μｌ加えて室温で２時間放置してブロッキングを行った（抗ヒトイムノグロブリンカッパー鎖抗体固相化プレート）。各ウェルを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した後、０．５μｇ／ｍｌとなるように希釈液（１％ＢＳＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で希釈した組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １を加え、室温で１時間放置した。各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、５０μｌの融合細胞培養上清を加えて室温で１時間放置した。次に、各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液で３回洗浄した後、０．０１μｇのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識された抗マウスＩｇＧ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）を含む希釈液を５０μｌ加えて、室温で１時間放置した。最後に、各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液で３回洗浄した後、５０μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液（ＫＰＬ社製）を添加して１５分間発色させた後に、１Ｍのリン酸溶液を添加することで反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。スクリーニングの結果から、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １に強い親和性を示す抗体を産生する融合細胞を得た。得られた融合細胞は、限界希釈法によりモノクローン化され、モノクローナル抗体ＭｒｈＲＮ０６１４を得た。

ラット抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体産生融合細胞株の選定
ラット抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体産生融合細胞株は、融合細胞が培地中に分泌する抗体の、ヒト膵臓癌細胞（Ｃａｐａｎ１）由来の膵臓特異的ＲＮａｓｅ １に対する反応性を指標にしたＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングにより選択した。スクリーニングに用いたＥＬＩＳＡは以下の通りである。９６穴マイクロタイタープレート（グライナー社製）の各ウェルに２５ｎｇのマウス抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体（ＭｒｈＲＮ０６１４）を含むリン酸緩衝液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を５０μｌ加えて４℃、１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、３％ＢＳＡを含むブロッキング溶液（３％ＢＳＡ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を２００μｌ加えて室温で２時間放置してブロッキングを行った（抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体固相化プレート）。各ウェルを３００μｌの洗浄液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、希釈液（１％ＢＳＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で２倍に希釈したヒト膵臓癌細胞（Ｃａｐａｎ１）の培養上清を加え、室温で１時間放置した。各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、５０μｌの融合細胞培養上清を加えて室温で１時間放置した。次に、各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液で３回洗浄した後、０．０１μｇのＨＲＰ標識された抗ラットＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製）を含む希釈液を５０μｌ加えて、室温で１時間放置した。最後に、各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液で３回洗浄した後、５０μｌのＴＭＢ溶液を添加して１５分間発色させた後に、１Ｍのリン酸溶液を添加することで反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。スクリーニングの結果から、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １に強い親和性を示す抗体を産生する融合細胞を得た。得られた融合細胞は、限界希釈法によりモノクローン化され、モノクローナル抗体ＲｒｈＲＮ０７２３を得た。

［参考例２］ 抗体の特異性測定
哺乳動物発現系による組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １の調製
哺乳動物細胞でヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １全長を含むポリペプチドを取得するために、ｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃＨｉｓベクター（ライフテクノロジー社）にヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １をコードする遺伝子配列（配列番号１）を挿入した発現ベクターを作製した。より詳しくは、免疫原の調製のために作製した昆虫細胞発現用プラスミド（ｐＩＺ−ＫＦＨ−ｈＲＮａｓｅ１）の組換え体タンパク質をコードする遺伝子配列部分を分子生物学的手法によりｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃＨｉｓベクター（ライフテクノロジー社）に挿入してｐｃＤＮＡ−ＫＦＨ−ｈＲＮａｓｅ１を作製した。作製した哺乳動物細胞用発現プラスミドは、チャイニーズハムスター卵巣由来培養細胞株（以下、ＣＨＯ−Ｋ１株）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ライフテクノロジー社）を用いて遺伝子導入を実施したことにより、Ｎ末端側にヒトイムノグロブリンカッパー鎖が付加した組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １が培地中に分泌されることを確認した。培地中に分泌されたタンパク質は、培養上清から抗ヒトイムノグロブリンカッパー軽鎖抗体を用いたアフィニティー精製により濃縮精製して組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １を取得した。精製された組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １は、抗体の特異性を明らかにする実験に供された。

糖鎖修飾欠損変異抗原の調製
前項で作製した発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ＫＦＨ−ｈＲＮａｓｅ１）を鋳型として、ＰＣＲ変異導入法によってアミノ酸置換変異を繰り返し導入することで、糖鎖修飾欠損変異導入抗原を発現するプラスミドを作製した。ＰＣＲ変異導入法には、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を使用し、添付の説明書に従って実施した。詳しくは、Ｎ型糖鎖修飾可能部位のコンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｘａａはプロリン以外のアミノ酸残基を指す）の３番目のアミノ酸残基をセリン残基もしくはスレオニン残基以外のアミノ酸に置換することで、糖鎖修飾欠損変異組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １を発現するプラスミドを作製した（表１）。作製した糖鎖修飾欠損変異導入発現プラスミドは、ＣＨＯ−Ｋ１株にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ライフテクノロジー社）を用いて遺伝子導入を実施したことにより、Ｎ末端側にヒトイムノグロブリンカッパー鎖が付加した糖鎖修飾欠損変異組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １が培地中に分泌されることを確認した。培地中に分泌された糖鎖修飾欠損変異組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １は、抗体の特異性を明らかにする実験に供された。

糖鎖修飾欠損変異抗原に対する抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体の反応性の測定
糖鎖修飾欠損変異組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １に対する抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体の反応性は、以下に記載するサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。９６穴マイクロタイタープレート（グライナー社製）の各ウェルに２５ｎｇのヤギ抗ヒトイムノグロブリンカッパー鎖抗体（シグマアルドリッチ社製）を含むリン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を５０μｌ加えて４℃１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、３％ＢＳＡを含むＴＢＳ溶液を２００μｌ加えて室温で２時間放置してブロッキングを行った（抗ヒトイムノグロブリンカッパー鎖抗体固相化プレート）。各ウェルを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した後、前述の糖鎖修飾欠損変異導入発現プラスミドが遺伝子導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養上清を加え、室温で１時間放置した。各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、２５ｎｇのＨＲＰ標識マウス抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体（ＭｒｈＲＮ０６１４）または、２５ｎｇのＨＲＰ標識ラット抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体（ＲｒｈＲＮ０７２３）を含む希釈液を５０μｌ加え、室温で１時間放置した。最後に、各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液で３回洗浄した後、５０μｌのＴＭＢ溶液を添加して１０分間発色させた後に、１Ｍのリン酸溶液を添加することで反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

図１に測定した結果を示す。横軸は、各抗体が変異未導入組換え抗原ＷＴに対する結合量を１．０とした時の相対値を示す。縦軸は、各糖鎖修飾欠損変異導入抗原を示す。塗りつぶしの横棒はＲｒｈＲＮ０７２３抗体の結合量、白抜きの横棒はＭｒｈＲＮ０６１４抗体の結合量を示す。９０番目のセリン残基をアラニン残基に置換することにより、８８番目アスパラギン残基が糖鎖修飾されなくなった変異体（ｍ１１０，ｍ０１０，ｍ１００，ｍ０００）に対してのＲｒｈＲＮ０７２３抗体の反応性が、ＭｒｈＲＮ０６１４抗体の反応性に対して低下していることから、ラット抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体（ＲｒｈＲＮ０７２３）が、８８番目のアスパラギン残基の糖鎖修飾可能部位周辺を認識していることが明らかとなった。また、マウス抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体（ＭｒｈＲＮ０６１４）は、どの糖鎖修飾欠損変異抗原に対しても変異未導入組換え抗原ＷＴと同等に反応性を維持していることから、糖鎖修飾可能部位に依存せずに膵臓特異的ＲＮａｓｅ １を認識する抗体であることが明らかとなった。

アミノ酸置換変異抗原の調製
前述の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ＫＦＨ−ｈＲＮａｓｅ１）を鋳型として、ＰＣＲ変異導入法によってアミノ酸置換変異を導入することで、アミノ酸置換変異導入抗原を発現するプラスミドを作製した。ＰＣＲ変異導入法には、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を使用し、添付の説明書に従って実施した。詳しくは、配列番号１において８５番目のアミノ酸から９２番目のアミノ酸残基をそれぞれ別のアミノ酸残基に置換することで、アミノ酸置換変異組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １を発現するプラスミドを作製した（表２）。作製したアミノ酸置換変異導入発現プラスミドは、ＣＨＯ−Ｋ１株にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ライフテクノロジー社）を用いて遺伝子導入を実施したことにより、Ｎ末端側にヒトイムノグロブリンカッパー鎖が付加したアミノ酸置換変異導入組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １が培地中に分泌されることを確認した。培地中に分泌されたアミノ酸置換変異導入組換え体ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １は、抗体の特異性を明らかにする実験に供された。

アミノ酸置換変異導入抗原に対する抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体の反応性の測定
アミノ酸置換変異導入抗原に対する抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体の反応性は、以下に記載するサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。９６穴マイクロタイタープレート（グライナー社製）の各ウェルに２５ｎｇのヤギ抗ヒトイムノグロブリンカッパー鎖抗体（シグマアルドリッチ社製）を含むリン酸緩衝液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を５０μｌ加えて４℃１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、３％ＢＳＡを含むＴＢＳ溶液を２００μｌ加えて室温で２時間放置してブロッキングを行った（抗ヒトイムノグロブリンカッパー鎖抗体固相化プレート）。各ウェルを３００μｌの洗浄液で３回洗浄した後、アミノ酸置換変異導入抗原を発現するプラスミドが遺伝子導入されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養上清を加え、室温で１時間放置した。各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、２５ｎｇのＨＲＰ標識マウス抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体（ＭｒｈＲＮ０６１４）または、２５ｎｇのＨＲＰ標識ラット抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体（ＲｒｈＲＮ０７２３）を含む希釈液を５０μｌ加え、室温で１時間放置した。最後に、各ウェルを３００μｌの界面活性剤を含む洗浄液で３回洗浄した後、５０μｌのＴＭＢ溶液を添加して１０分間発色させた後に、１Ｍのリン酸溶液を添加することで反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

図２にその結果を示す。横軸は、各抗体が変異未導入組換え抗原ＷＴに対する結合量を１．０とした時の相対値を示す。縦軸は、各アミノ酸置換変異導入抗原を示す。塗りつぶしの横棒はＲｒｈＲＮ０７２３抗体の結合量、白抜きの横棒はＭｒｈＲＮ０６１４抗体の結合量を示す。変異体Ｒ８５Ｋ，Ｌ８６Ｉ，Ｎ８８Ｄ，Ｇ８９Ｓ，Ｓ９０Ａに対するＲｒｈＲＮ０７２３の反応性が、ＭｒｈＲＮ０６１４に対する反応性に比べ極端に低下していることから、抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体ＲｒｈＲＮ０７２３が、糖鎖修飾可能部位である８８番目アスパラギン残基の周辺のアミノ酸残基、特に８５番目のアルギニン残基から、９０番目のセリン残基までを認識していることが確認された。

次に、８８番目アスパラギン残基が糖鎖修飾を受けた糖鎖修飾欠損変異導入抗原ｍ００１に対する抗体の反応性を検討した。即ち、糖タンパク質のＮ型糖鎖を認識して結合するコンカナバリンＡレクチンを固定化したレクチンカラムを使用して、８８番目アスパラギン残基が糖鎖修飾を受けた糖鎖修飾欠損変異導入抗原ｍ００１を分画した。具体的には、レクチンカラム結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．４）で平衡化したコンカナバリンＡレクチン結合カラム（ＨｉＴｒａｐ−ＣｏｎＡ、ＧＥヘルスケア社製）に、糖鎖修飾欠損変異導入ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １（ｍ００１）を発現させたＣＨＯ−Ｋ１培養細胞上清を流して、糖鎖修飾欠損変異導入ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １（ｍ００１）を結合させた。コンカナバリンＡレクチン結合カラムは、レクチンカラム結合緩衝液で充分に洗浄した後、アルファーメチルマンノシド（シグマアルドリッチ社製）を含むレクチンカラム結合緩衝液を使用して、結合した糖鎖修飾欠損変異導入ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １（ｍ００１）を溶出した。サンプル注入からすべての溶出画分をフラクションコレクターで回収して、分画した各画分に含まれる組換え体抗原の量をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。検出には、糖鎖修飾の影響を受けない抗体ＭｒｈＲＮ０６１４と、Ａｓｎ８８糖鎖修飾可能部位近傍を認識する抗体ＲｒｈＲＮ０７２３を使用した。

結果を図３に示す。横軸は、カラム分離での各画分を示し、第一縦軸はＥＬＩＳＡ分析の測定値を示し、第二縦軸はアルファーメチルマンノシドの濃度を示している。破線はＭｒｈＲＮ０６１４抗体の結合量の変化を示し、実線はＲｒｈＲＮ０７２３抗体の結合量を示す。点線は、溶出糖であるアルファーメチルマンノシドの各フラクションでの濃度を示す。図４に示した通り、ＭｒｈＲＮ０６１４では、コンカナバリンＡ結合画分（アルファーメチルマンノシド溶出画分）に抗原が溶出されてきていることが明らかとなったが、同じ画分に対してＲｒｈＲＮ０７２３は反応性を示さないことが明らかとなった。一方、コンカナバリンＡに結合しない画分（素通り画分）は、両抗体とも反応性を示すことが明らかとなった。コンカナバリンＡ結合画分に含まれる抗原をウエスタンブロット法により解析すると、この画分には糖鎖修飾された抗原のみが含まれることが示された。以上の結果から、新たに取得した抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体（ＲｒｈＲＮ０７２３）は、８８番目アスパラギン残基が糖鎖修飾を受けた膵臓特異的ＲＮａｓｅ １には反応せず、当該残基が糖鎖修飾を受けていない場合にのみ結合する抗体であることが示された。すなわち、抗ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １抗体（ＲｒｈＲＮ０７２３）を使用した免疫学的測定系においては、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １の８８番目アスパラギン残基に糖鎖が結合していない場合の量を測定していることが明らかとなった。

［実施例１］ 免疫学的測定試薬の調製
ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １を特異的に認識し、かつ３つの糖鎖修飾可能部位における糖鎖の有無に拘らず結合可能な２つの抗体を使用した免疫測定試薬と、Ａｓｎ８８に糖鎖が結合していないＲＮａｓｅ １を特異的に測定する免疫測定試薬を作製して、それぞれの試薬で血清試料中のＲＮａｓｅ １を測定した。具体的には、ヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １を特異的に認識し、かつ３つの糖鎖修飾可能部位における糖鎖の有無に拘らず結合可能な２つの抗体としては、前述のＭｒｈＲＮ０６１４とＲｒｈＲＮ１１１１を用いた。ＲｒｈＲＮ１１１１は、ＲｒｈＲＮ０７２３を取得した際に、３つの糖鎖修飾可能部位における糖鎖の有無に拘らず結合可能な抗体として単離されたものである。ＲｒｈＲＮ１１１１の抗原認識特異性は、参考例２で抗体の特異性の測定に使用した、糖鎖修飾欠損変異抗原を用いたＥＬＩＳＡ法と同じ方法で検討した。結果を図４に示す。横軸は、各抗体が変異未導入組換え抗原ＷＴに対する結合量を１．０とした時の相対値を示す。縦軸は、各糖鎖修飾欠損変異導入抗原を示す。塗りつぶしの横棒はＲｒｈＲＮ０７２３抗体の結合量、白抜きの横棒はＲｒｈＲＮ１１１１抗体の結合量を示す。図４に示した通り、ＲｒｈＲＮ０７２３は、糖鎖修飾可能部位全てに変異を入れ糖鎖修飾を全く受けない変異体ｍ０００に対して反応性がないのに対して、ＲｒｈＲＮ１１１１のｍ０００に対する反応性は、変異未導入組換え抗原ＷＴと比べて約９０％の反応性を保持している。よって、ＲｒｈＲＮ１１１１は３つの糖鎖修飾可能部位における糖鎖の有無に拘らず結合可能な抗体であると確認された。

以下に、これらの抗体を用いて構築した免疫測定系の測定試薬の調製法、評価方法を示す。水不溶性担体（内部にフェライトを練り込んだ粒子径約１．５ｍｍのＥＶＡ製）にＭｒｈＲＮ０６１４を９０ｎｇ／担体となるよう物理的に吸着させ、吸着後ＢＳＡを用いてブロッキング処理を行った。水不溶性担体については、１個当たり約１００ｎｇの蛋白質を物理的に吸着可能である。磁力透過性の容器（容量１．２ｍｌ）に１２個の担体を入れた後、０．５μｇ／ｍＬのアルカリ性フォスファターゼ標識を施した抗体ＲｒｈＲＮ０７２３または０．５μｇ／ｍＬのアルカリ性フォスファターゼ標識を施した抗体ＲｒｈＲＮ１１１１を含む緩衝液（１％ ＢＳＡ、２．５％デキストラン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０，２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４）を加え、凍結乾燥した。この試薬を市販の全自動免疫測定装置（東ソー（株）製、商品名ＡＩＡ−６００ＩＩ）を用いて全自動での測定を行った。その測定原理は以下の通りである。即ち、測定サンプルを１５０μＬ加え、水不溶性担体を３７℃で１０分間磁石を用いて運動させ、混合液を攪拌した状態で免疫反応させた。反応後、Ｂ／Ｆ分離操作を行って遊離の標識抗体を分離除去し、アルカリ性フォスファターゼの基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸を加え、該基質添加後２０秒から２９５秒までの酵素反応分解物（４メチルウンベリフェロン）の単位時間あたりの生成速度（ｎＭ／秒）を測定した。前述の標識化抗体ＲｒｈＲＮ０７２３を含む凍結乾燥試薬を用いてサンプルの測定を行い、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １の８８番目の糖鎖修飾可能部位において糖鎖が結合していない部位の量（以下、Ｆ_３値という）を求めた。また前述の標識化抗体ＲｒｈＲＮ１１１１を含む凍結乾燥試薬を用いてサンプルの測定を行い、膵臓特異的ＲＮａｓｅ１の量（以下、トータル値という）を求めた。この測定試薬を使用して、精製したヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １を測定すると、精製したヒト膵臓特異的ＲＮａｓｅ １の濃度に依存して測定値が増加していることがわかった。このデータは、以後の試料中膵臓特異的ＲＮａｓｅ １の測定において、検量線を描くデータとして使用した。

［実施例２］ 膵臓癌患者由来血清検体の測定
上述の免疫学的測定試薬を使用して、健常人から得られた血清２９検体と、膵臓癌患者から得られた血清４１検体の、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １を測定した。なお膵臓癌患者から得られた血清は、医学的診断の結果病期が決定されているものであり、その内訳を表３に示した。この病期は、国際体がん連合（ＵＩＣＣ）膵癌病期分類によるものである。

図５は、健常人血清、膵臓癌患者血清中の膵臓特異的ＲＮａｓｅ １量をプロットしたグラフである。膵臓癌患者血清を国際体がん連合（ＵＩＣＣ）膵癌病期分類に従ってステージ別にプロットし、前述の標識化抗体ＲｒｈＲＮ１１１１を含む凍結乾燥試薬を用いて測定した総膵臓特異的ＲＮａｓｅ １量（トータル値）を図５Ａに、前述の標識化抗体ＲｒｈＲＮ０７２３を含む凍結乾燥試薬を用いて測定したＡｓｎ８８にＮ型糖鎖が付加してない膵臓特異的ＲＮａｓｅ １量（Ｆ_３値）を図５Ｂに示した。

またＦ_３／ｔを以下の式（１）によって求め、
Ｆ_３／ｔ＝Ｆ_３値／トータル値 （１）
さらに以下の式（２）の値を求めることにより、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のトータル値と、８８番目の糖鎖修飾可能部位において糖鎖が結合している部位の量との比（Ｇ_３／ｔ）を求めた。
Ｇ_３／ｔ＝１−（Ｆ_３／ｔ） （２）
図６に、健常人血清、病期分類の膵臓癌患者血清中における、式（２）によって算出されたＧ_３／ｔをプロットしたグラフを示す。図６から明らかなように、病期がステージＩとＩＩの試料では、他の病期ステージに比べて（Ｇ_３／ｔ）が高くなっていることがわかる。病期がステージＩ及びＩＩの群と、ＩＩＩおよびＩＶの群の２つに分けて有意差検定を実施すると、ｐ値が５．７×１０^−５となり十分に有意差があることがわかる。

この２群を使用して、ＲＯＣ解析により感度及び特異度を統計的に算出した（図７）ところ、最適化されたカットオフ値を０．１０３とすると、感度８６．４％、特異度７８．９％となり、測定の精度を示すＡＵＣ値は０．８４９となり十分な測定精度があることがわかる。ステージＩＩＩおよびＩＶでカットオフ値０．１０３を超える試料は、それぞれ１１検体中３検体（２７％）、８検体中１検体（１３％）であった。このように試料中の８８番目の糖鎖修飾可能部位において糖鎖が結合している部位の量の比が高い値を示す場合には、ステージＩ及びＩＩの早期膵臓癌である可能性が高いことを示している。

以上の結果から、膵臓特異的ＲＮａｓｅ １のトータル値と、糖鎖修飾可能部位において糖鎖が結合している部位の量の比を測定することにより、膵臓癌の病期を検出することが可能であり、特に病期ステージＩ及びＩＩの早期癌を検出することが可能である。

Claims (16)

1. 膵臓特異的リボヌクレアーゼ１のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量を測定することを特徴とする、膵臓癌の病期ステージＩ及びＩＩを検出する方法。
2. 膵臓癌の他の病期に比べてＮ型糖鎖が結合している部位の量が増加する、請求項１に記載の方法。
3. 下記Ａ，Ｂにおいて、ＡとＢとの比を求めることを特徴とする、膵臓癌の病期ステージＩ及びＩＩを検出する方法。
   Ａ＝膵臓特異的リボヌクレアーゼ１のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量
   Ｂ＝膵臓特異的リボヌクレアーゼ１のＮ型糖鎖修飾可能部位の量
4. 請求項３に記載の方法において、Ａ＝Ｎ型糖鎖が結合していない部位の量、であり、膵臓癌の他の病期と比べて、Ａ／Ｂの値が小さくなる方法。
5. 請求項３に記載の方法において、Ａ＝Ｎ型糖鎖が結合している部位の量、であり、膵臓癌の他の病期と比べて、Ａ／Ｂの値が大きくなる方法。
6. 請求項３〜５いずれかに記載の方法において、膵臓特異的リボヌクレアーゼ１の量を求め、その値を換算してＢの値とする方法。
7. Ｎ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１に示された配列の３４番目、７６番目及び８８番目から選ばれる１つ以上のアスパラギン残基である、請求項１〜６いずれか１項に記載の方法。
8. Ｎ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１に示された配列の８８番目のアスパラギン残基である、請求項７に記載の方法。
9. Ｎ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１に示された配列の７６番目のアスパラギン残基である、請求項７に記載の方法。
10. Ｎ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１に示された配列の３４番目のアスパラギン残基である、請求項７に記載の方法。
11. （ａ）膵臓特異的リボヌクレアーゼ１のＮ型糖鎖修飾可能部位を抗原認識部位の一部とするモノクローナル抗体またはその断片、及び試料、を接触させ、（ａ）のモノクローナル抗体またはその断片と複合体を形成した膵臓特異的リボヌクレアーゼ１を測定する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 請求項１１に記載の方法において、さらに（ｂ）膵臓特異的リボヌクレアーゼ１のＮ型糖鎖修飾可能部位を抗原認識部位の一部とするモノクローナル抗体またはその断片と同時に膵臓特異的リボヌクレアーゼ１に結合できるモノクローナル抗体またはその断片、を試料と接触させ、（ａ）及び（ｂ）の２つのモノクローナル抗体または抗体断片と複合体を形成した膵臓特異的リボヌクレアーゼ１を測定する方法。
13. 請求項１２に記載の方法において、試料を、（ａ）又は（ｂ）の一方と接触させる第一の接触工程と、第一の接触工程で得られたものに（ａ）又は（ｂ）の他方を接触させる第二の接触工程を含む方法。
14. 膵臓特異的リボヌクレアーゼ１のＮ型糖鎖修飾可能部位を抗原認識部位の一部とするモノクローナル抗体またはその断片を含有することを特徴とする、膵臓癌の病期ステージＩ及びＩＩ検出用キット。
15. 膵臓特異的リボヌクレアーゼ１のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量を質量分析法によって求める、請求項１〜１０いずれか１項に記載の方法。
16. 請求項１５に記載の方法において、膵臓特異的リボヌクレアーゼ１のペプチド断片および／または糖ペプチド断片の質量を質量分析法によって測定する方法。

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