JP2012070711A

JP2012070711A - Ｎ結合型糖鎖の本数を制御したタンパク質

Info

Publication number: JP2012070711A
Application number: JP2010220057A
Authority: JP
Inventors: Akira Takashima; 晶高島; Junko Amano; 純子天野
Original assignee: Noguchi Institute
Current assignee: Noguchi Institute
Priority date: 2010-09-29
Filing date: 2010-09-29
Publication date: 2012-04-12

Abstract

【課題】タンパク質の性質、活性に影響を与えずに、Ｎ結合型糖鎖の本数と結合位置を制御する方法の提供。
【解決手段】ＡｓｎにＮ結合型糖鎖が結合した下記（１）のアミノ酸配列モチーフを少なくとも１つ有するタンパク質において、ＡｓｎにＮ結合型糖鎖が結合した下記（１）のアミノ酸配列モチーフの少なくとも１つでＴｈｒがＳｅｒに置換されＡｓｎにＮ結合型糖鎖が結合していないことを特徴とする、Ｎ結合型糖鎖の本数を制御したタンパク質。（１）ＡｓｎＸａａＴｈｒ（ただし、ＸａａはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す。）
【選択図】なし

Description

本発明は、Ｎ結合型糖鎖の本数を制御したタンパク質に関する。詳細には、ＡｓｎにＮ結合型糖鎖が結合した下記（１）のアミノ酸配列モチーフを少なくとも１つ有するタンパク質において、ＡｓｎにＮ結合型糖鎖が結合した下記（１）のアミノ酸配列モチーフの少なくとも１つでＴｈｒがＳｅｒに置換されＡｓｎにＮ結合型糖鎖が結合していないことを特徴とする、Ｎ結合型糖鎖の本数を制御したタンパク質に関する。
（１）ＡｓｎＸａａＴｈｒ
（ただし、（１）で、ＸａａはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す。）

多くのタンパク質には翻訳後修飾として糖鎖付加がなされている。糖鎖付加の様式には2種類あって、タンパク質中のＮ（Ａｓｎ）−Ｘ（Ｐｒｏ以外のアミノ酸）−Ｓ（Ｓｅｒ）／Ｔ（Ｔｈｒ）という配列中のＡｓｎに糖鎖が付加される場合はＮ結合型糖鎖、タンパク質中のＳｅｒ、Ｔｈｒの水酸基を介して糖鎖が付加される場合はＯ結合型糖鎖とよぶ。一般に、Ｎ結合型糖鎖には上記のようなコンセンサス配列があるため、糖鎖付加の予測や制御がやりやすいといえる。

有用糖タンパク質を組換えタンパク質として生産する際、糖鎖に何らかの機能がある場合は、糖鎖が確実にタンパク質に付加される必要がある。しかし、糖鎖が有効性に大きく影響を与えない場合は、むしろ、糖鎖が付加しないタンパク質を作成した方が糖鎖構造の不均一性を除去するので、純度および製品管理が容易になる。特に、一分子内に複数の糖鎖付加部位が存在する場合、有効性に寄与する糖鎖付加部位の糖鎖のみを残して、他の糖鎖付加部位の糖鎖を選択的に除去する方法はきわめて有用である。さらに、後述するように、糖鎖によってタンパク質機能が抑制されているような場合には、糖鎖を除去して機能向上を目指すことも重要である。

Ｎ結合型糖鎖の場合、その付加の程度はコンセンサス配列の内容や数、タンパク質中の位置などによって影響をうけるため、糖鎖付加効率を改善する目的で、コンセンサス配列の改変や追加が検討されてきている（特許文献１、非特許文献１参照）。

例えば、コンセンサス配列ＮＸＳ／Ｔにおいて、Ｘ部分のアミノ酸を置換することによって糖鎖付加効率を改善することが可能である（非特許文献１参照）。しかし、置換するアミノ酸の種類によっては立体構造変化が大きくなり、タンパク質機能に影響を及ぼす恐れがある。また、目的にあった糖鎖付加効率を追求するためには、もともとのアミノ酸とプロリンを除く１８種類のアミノ酸について検討する必要があり、手間がかかる。

一方、コンセンサス配列ＮＸＳ／Ｔにおいて、ＮＸＴのほうがＮＸＳよりも糖鎖付加効率が高い場合があることが報告されている（Ｘは同じアミノ酸で、いずれの配列もタンパク質中の同じ位置にある場合）（非特許文献２〜５参照）。例えば、血液凝固因子ＦａｃｔｏｒＶ（ＦＶ）が活性化されたＦＶａの場合、そのＣ２ドメインにあるコンセンサス配列は野生型ではＮＨＳで、糖鎖が１５−３０％結合している状態にある。この配列をＮＨＴに変えた場合、糖鎖の結合状態は９０％程度に引き上がった（非特許文献３参照）。タンパク質に糖鎖をより多く結合させることによって、当該タンパク質の安定化や機能向上をはかる場合には、この方法は有効であると考えられる。しかし、この血液凝固因子ＦＶａの場合では、Ｃ２ドメインに糖鎖がより結合している状態（ＦＶａ１）の方が、糖鎖が結合していない状態（ＦＶａ２）よりも膜リン脂質分子への結合能力が低く、リン脂質レベルの低い環境下ではプロコアグラント（procoagulant）活性が低いことが指摘されている（非特許文献３参照）。また、糖鎖がより多く結合しているＦＶの場合（ＦＶ１）、活性化プロテインＣの活性発現に必要な補因子（cofactor）としての活性は、糖鎖が結合していないＦＶ（ＦＶ２）よりも低い（非特許文献３参照）。すなわち、糖鎖を意図的に結合させないほうが、タンパク質の機能発現において都合がよい場合もある。

このような場合、従来はコンセンサス配列ＮＸＳ／Ｔにおいて、ＮをＱ（Ｇｌｎ）やＤ（Ａｓｐ）に変える、あるいはＳ／ＴをＡ（Ａｌａ）に変えることにより、糖鎖が全く付加されなくする手法が用いられてきた（非特許文献３、４参照）。これらはコンセンサス配列そのものを変えてしまう手法である。

特開平５−８６０９９号公報

ＳｕｓａｎＨ．Ｓｈａｋｉｎ−Ｅｓｈｌｅｍａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，６３６３−６３６６（１９９６）ＥｒｎｓｔＢａｕｓｅｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９５，６３９−６４４（１９８１）ＧｅｒｒｙＡ．Ｆ．Ｎｉｃｏｌａｅｓｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８，１３５８４−１３５９１（１９９９）ＡｔｓｕｓｈｉＮｉｓｈｉｋａｗａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５５，２４５−２４８（２００１）ＬａｋｓｈｍｉＫａｓｔｕｒｉｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２３，４１５−４１９（１９９７）ＭａｒｃＲｉｂｏｅｔａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ３７５，３５７−３６３（１９９４）

本発明の課題は、糖タンパク質の機能を改善するために、糖タンパク質の立体構造変化や諸性質への影響を最小限に抑えつつ、特定の部位だけに限定して、糖タンパク質のN結合型糖鎖の結合を抑制することである。

本発明者らは、Ｎ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列であるＮＸＴ／Ｓ配列（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸）において、ＮＸＴにはＮＸＳより糖鎖が付加されやすく、かつＮＸＳにはしばしば糖鎖が結合していないことに着目して、各種糖タンパク質上にある糖鎖が実際に結合しているＮＸＴ配列でＴとＳの交換を行い、その糖鎖付加への影響を検討した。その結果、驚くべきことにＮＸＴからＮＸＳへの変換で、極めて効果的に糖鎖付加効率が低下し、糖鎖が付加されなくなる場合があることを見出して、本発明を完成するに至った。

＜１＞ＡｓｎにＮ結合型糖鎖が結合した下記（１）のアミノ酸配列モチーフを少なくとも１つ有するタンパク質において、
ＡｓｎにＮ結合型糖鎖が結合した下記（１）のアミノ酸配列モチーフの少なくとも１つでＴｈｒがＳｅｒに置換されＡｓｎにＮ結合型糖鎖が結合していないことを特徴とする、Ｎ結合型糖鎖の本数を制御したタンパク質。
（１）ＡｓｎＸａａＴｈｒ
（ただし、（１）で、ＸａａはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す。）
＜2＞＜１＞に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
＜3＞＜2＞に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
＜4＞＜3＞に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
＜5＞＜4＞に記載の形質転換体により＜１＞に記載のタンパク質を製造する方法。

本発明者らは、タンパク質中のＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列ＮＸＴに糖鎖がすでに結合している場合、同じくＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列であるにもかかわらずこれをＮＸＳに変えることにより、その糖鎖付加部位の糖鎖付加効率を著しく減少させることができることを見出した。ＳとＴはアミノ酸としての性質や大きさが類似していることから（ＳとＴの違いは、Ｓの場合、β炭素には水酸基と２つの水素原子が結合しているが、Ｔの場合はこのうち１つの水素原子がメチル基になっているだけである）、タンパク質の立体構造や諸性質への影響を最小限に抑えつつ、糖鎖付加効率を減少させたタンパク質を調製することできる。

ヒト膵臓由来リボヌクレアーゼ１（RNase 1）の構造の特徴を示す模式図。 RNase 1に存在する各ＮＸＳ／Ｔ配列の糖鎖付加状況を示すブロット。下線はアミノ酸を置換した部分。ＡＡＡはＮ結合型糖鎖が全く結合しない変異体。Ｎ６２：ＮＭＴをＮＭＳにした場合のRNase 1全体の糖鎖付加状況の変化を示すブロット。下線はアミノ酸を置換した部分。＊の位置のバンドはＮ結合型糖鎖付加以外の翻訳後修飾をうけたもの。

本発明のタンパク質は、ＡｓｎにＮ結合型糖鎖が結合した下記（１）のアミノ酸配列モチーフを少なくとも１つ有するタンパク質において、ＡｓｎにＮ結合型糖鎖が結合した下記（１）のアミノ酸配列モチーフの少なくとも１つでＴｈｒがＳｅｒに置換されＡｓｎにＮ結合型糖鎖が結合していないことを特徴とする、Ｎ結合型糖鎖の本数を制御したタンパク質である。
（１）ＡｓｎＸａａＴｈｒ
（ただし、（１）で、ＸａａはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す。）

本発明のタンパク質としては、上記（１）のアミノ酸配列モチーフを有するタンパク質であれば特に限定はないが、例えばリボヌクレアーゼ、アミラーゼなどの各種酵素、インターロイキンやエリスロポエチン、ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）といった各種サイトカイン、ホルモン、増殖因子などのタンパク質が挙げられる。

Ｎ結合型糖鎖の結合の確認は、糖鎖除去反応前後の分子量変化を観察することにより行う。糖鎖除去反応に用いる酵素として、例えばペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ（Peptide:N-glycosidase F、PNGase F）が好ましい。

本発明のＤＮＡは、元のタンパク質のアミノ酸配列において、ＴｈｒからＳｅｒへ置換したアミノ酸配列をコードする塩基配列のＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase
chain reaction、ＰＣＲ）を利用した部位特異的変異導入法などの方法により合成し、Ｔ４リガーゼを用いて各種組換えベクターに挿入する。

本発明における組換えベクターは、特にその種類は限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミドやファージベクター）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。

好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて、本発明のＤＮＡは、プロモーター等の転写に必要な要素が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。また、これらの発現ベクターはアンピシリン耐性遺伝子などの適当な選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。発現ベクターの例としては、例えば、pBluescript II SK+ベクター（Stratagene）、pcDNA3.1/Myc-His ver. A（Invitrogen）などが挙げられるが、本発明に用いる発現ベクターはこれらに限定されるものではない。

本発明のＤＮＡは、遺伝子導入試薬、例えばリン酸カルシウムやリポソームを利用するもの、あるいはFuGene 6 transfection reagent（Roche）などの非リポソーム系トランスフェクション試薬などを用いて、あるいはエレクトロポレーション法やマイクロインジェクション法などにより、宿主細胞へ導入する。

本発明における形質転換体として、細胞は糖鎖付加能を有する細胞、例えば、原核生物ではカンピロバクターやオリゴサッカリルトランスフェラーゼ遺伝子を導入された大腸菌など、また真核生物では、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類由来培養細胞などが挙げられるが、遺伝子導入のしやすさ、タンパク質生産量の高さ、哺乳類型糖鎖が付加できる点などで、哺乳類由来培養細胞のうち、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞などを用いるのが特に好ましい。

本発明の形質転換体を用いて本発明のタンパク質を製造する方法として、形質転換体の培養、タンパク質の取得、精製などの工程が挙げられる。形質転換体の培養は、３７℃のＣＯ₂インキュベーター内で、遺伝子導入後一定時間（５〜１５時間）までは１０％牛血清含有培地にて行い、その後は目的タンパク質の精製を容易にするために無血清培地に交換して継続培養する（＋９〜４８時間）。目的タンパク質の取得は、当該タンパク質が分泌タンパク質で、培地中に分泌されているようであれば、培地を回収してタンパク質源とし、これをアフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーに供して精製する。目的タンパク質が培地中に分泌されず、細胞内に蓄積している場合には、細胞を回収し、ここに細胞溶解剤を加えるとともに超音波破砕により細胞を破砕して目的タンパク質を細胞溶解剤中に放出させ、これを適当な緩衝液などで希釈するなどしたものをタンパク質源として、上記と同様にして各種クロマトグラフィーにより精製する。

本発明のタンパク質を製造する方法は、細胞を用いる方法に限定されるものではなく、無細胞タンパク質合成系によって製造することもできる。無細胞タンパク質合成系としては、例えば、コムギ胚芽、大腸菌、ウサギ網状赤血球、昆虫細胞などから調製したものが挙げられる。目的タンパク質をコードするＤＮＡを逆転写が可能なベクターに組み込み、これより逆転写反応によって合成したｍＲＮＡを適当な無細胞タンパク質合成系に加えて目的タンパク質を合成する。そして、その反応液より目的タンパク質を上記と同様にして精製する。

以下に記載する実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。

ヒト膵臓由来リボヌクレアーゼ1（RNase 1）の場合
＜方法＞
本実施例ではヒト膵臓由来のリボヌクレアーゼ1（RNase 1）をモデルとして、Ｎ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列ＮＸＳ／ＴのＳ／Ｔ交換による糖鎖付加への影響を調べた。RNase 1には、ＮＸＳ／Ｔ配列が３カ所存在するが（Ｎ６２：ＮＭＴ、Ｎ１０４：ＮＳＳ、Ｎ１１６：ＮＧＳ）（図１）、各部位の糖鎖付加効率は異なることが報告されている（非特許文献６参照）。

まず、ヒト膵臓由来ｃＤＮＡ（Clontech）を鋳型として、プライマーＮＧ１１２＋、ＮＧ１１３−（配列表配列番号１、２）とPrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA）を用いて、RNase１の全長ｃＤＮＡをpBluescript II SK+ベクター（Stratagene）のＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。これよりＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩで切り出したＤＮＡ断片をpcDNA3.1/Myc-His ver. A（Invitrogen）のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入したものを、野生型RNase 1（ＴＳＳ）の発現ベクターとした。また、Ｎ６２：ＮＭＴのＴｈｒをＳｅｒに交換するためにはプライマーＮＧ１１４＋、ＮＧ１１５−（配列表配列番号３、４）の各プライマーの組み合わせと、PrimeSTAR HS DNA polymerase（TAKARA）を用いて、上記RNase 1 ｃＤＮＡを含むpBluescript IIプラスミドを鋳型としてＰＣＲ法による変異導入でＳ／Ｔ交換を行った。

さらに、コントロールとして各ＮＸＳ／Ｔ配列のＳ／Ｔ部分をＡｌａに置換して糖鎖が付加されないようにした変異体（ＡＡＡ）や、３カ所あるＮＸＳ／Ｔ配列のうち、２カ所に糖鎖が付加されないようにした変異体（ＳＡＡ、ＴＡＡ、ＡＳＡ、ＡＡＳ）は、プライマーＮＧ１３０＋、ＮＧ１３１−（配列表配列番号５、６、Ｎ６２：ＮＭＡ用）、プライマーＮＧ１３２＋、ＮＧ１３３−（配列表配列番号７、８、Ｎ１０４：ＮＳＡ）、プライマーＮＧ１３４＋、ＮＧ１３５−（配列表配列番号９、１０、Ｎ１１６：ＮＧＡ用）の各プライマーの組み合わせを用いて、上記と同様にＰＣＲによる変異導入を順次行って作製した。いずれの変異導入断片もＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩで切り出した後、pcDNA3.1/Myc-His
ver. AのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入して発現ベクターとした。

それぞれの発現ベクターはFuGene 6 transfection reagent（Roche）を用いてＨＥＫ２９３細胞に導入した。トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３細胞は３７℃のＣＯ₂インキュベーターで一晩培養し、ここで培地交換を行って（３．５ｃｍ dish、ＭＥＭ培地＋１０％牛血清２ｍｌをＭＥＭ培地１ｍｌに交換)、さらに一定時間培養を行った（トランスフェクションから２４時間後まで）。なお、RNase 1は本来分泌タンパク質であるが、ＨＥＫ２９３細胞ではほとんど分泌されなかったため、細胞内に存在している組換えRNase 1の糖鎖付加状況を解析した。培養終了後、細胞をＰＢＳで洗浄し、これを回収して０．１ｍｌのＴＮＥ lysis buffer（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）に懸濁し、超音波処理を施して溶解した。この溶液を遠心して、その上清１５ｍｌを５ｍｌの４×ＳＤＳ sample bufferと混合し、煮沸処理後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。

泳動終了後、ウェスタンブロットを行うため、ゲル中のタンパク質はブロッティング装置を用いてＰＶＤＦメンブレン（Immobilon-P、Millipore）に転写し、これを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ buffer内で室温１時間震盪してブロッキング処理を行った。つぎにこのメンブレンを一次抗体溶液（抗myc-tag抗体、MBLを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ bufferで１０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。その後、メンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ bufferで２回洗浄し、二次抗体溶液（ＨＲＰ-conjugated抗マウスＩｇＧ抗体、Zymedを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ bufferで５０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。そして、メンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ bufferで２回洗浄し、SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate（Thermo）を用いて化学発光反応を行い、Chemidoc XRS（Bio-Rad）で陽性バンドを検出した。

＜結果＞
まず、ＨＥＫ２９３細胞におけるRNase 1に存在する各ＮＸＳ／Ｔ配列の糖鎖付加状況を調べるため、ＴＡＡ、ＡＳＡ、ＡＡＳの各変異体、およびＮ６２：ＮＭＴをＮＭＳに変換した変異体ＳＡＡの糖鎖付加状況を解析した（図２）。これらの変異体では、RNase 1のアミノ酸配列中に３カ所存在するＮＸＳ／Ｔ配列のうち、糖鎖が付加し得るのはいずれかの1カ所だけである。解析の結果、通常、Ｎ６２：ＮＭＴ、Ｎ１０４：ＮＳＳには糖鎖が付加されるが、Ｎ１１６：ＮＧＳには糖鎖が付加されにくいことが判明した。このとき、Ｎ６２：ＮＭＴをＮＭＳにすると、この部位に糖鎖が付加されにくくなった。

野生型のRNase 1（ＴＳＳ）の場合、糖鎖が１〜３本結合しているグリコアイソフォーム（glycoisoforms）が観察された（図３）。そこで、Ｎ６２：ＮＭＴのＳ／Ｔ交換により、RNase 1全体での糖鎖付加パターンがどのようになるのかを調べてみた。その結果、野生型のＮ６２：ＮＭＴのＴｈｒをＳｅｒに変えた場合（ＳＳＳ）、主に観察されたものは糖鎖が１本結合しているグリコアイソフォーム（glycoisoform）で、糖鎖が２本結合しているものもわずかに観察された。以上の結果は、糖タンパク質中にある任意のＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列ＮＸＴをＮＸＳに変換をすると、糖鎖付加部位によっては糖鎖付加効率を大きく変えることができ、これを利用して糖タンパク質に結合する糖鎖の数を減少させることできることを示している。

本発明のＮ結合型糖鎖の本数を制御したタンパク質は、性質、活性を保持した医薬品などとして利用可能である。Ｎ結合型糖鎖が機能に影響しない場合は、その本数を減らすことにより、タンパク質の均一性（純度）が向上し、品質管理が容易になると考える。また、Ｎ結合型糖鎖が機能を抑制する場合には、その本数を減らすことにより、タンパク質の機能を向上できると考える。

Claims

ＡｓｎにＮ結合型糖鎖が結合した下記（１）のアミノ酸配列モチーフを少なくとも１つ有するタンパク質において、
ＡｓｎにＮ結合型糖鎖が結合した下記（１）のアミノ酸配列モチーフの少なくとも１つでＴｈｒがＳｅｒに置換されＡｓｎにＮ結合型糖鎖が結合していないことを特徴とする、Ｎ結合型糖鎖の本数を制御したタンパク質。
（１）ＡｓｎＸａａＴｈｒ
（ただし、（１）で、ＸａａはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す。）
請求項１に記載のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
請求項２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
請求項３に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
請求項４に記載の形質転換体により請求項１に記載のタンパク質を製造する方法。