KR20220011373A - N-당질화 돌연변이 벼, 이의 제조방법 및 이를 이용한 단백질 생산용 벼의 제조방법 - Google Patents

N-당질화 돌연변이 벼, 이의 제조방법 및 이를 이용한 단백질 생산용 벼의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 N-당질화(N-glycosylation) 돌연변이 벼(Oryza sativa), 이의 제조방법 및 이를 이용한 단백질 생산용 벼의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 식물 특이적인 N-당질화 과정에 참여하는 총 8개의 유전자에 대한 돌연변이 세포주를 획득하였고, 이로부터 의료용 단백질의 생산 가능성을 확인하였으므로, 이를 효과적으로 단백질의 생산에 이용할 수 있다.

Description

N-당질화 돌연변이 벼, 이의 제조방법 및 이를 이용한 단백질 생산용 벼의 제조방법{N-glycosylation mutated rice, method for manufacturing thereof, and method for manufacturing rice for protein production using the same}
본 발명은 N-당질화(N-glycosylation) 돌연변이 벼(Oryza sativa), 이의 제조방법 및 이를 이용한 단백질 생산용 벼의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 식물 특이적인 N-당질화 과정에 참여하는 총 8개의 유전자를 교정하여 식물 특이적 당질화를 제거함으로써, 의료용 단백질을 생산할 수 있는 벼 세포주를 확립하는 기술에 관한 것이다.
식물체를 포함한 모든 진핵 생물체에서 단백질 번역 후 조절 과정(post translational modification)은 최종적인 단백질의 활성을 위해 필수적인 과정이다. 이 중에서 N-당질화(N-glycosylation) 과정은 막단백질이나 분비 단백질들을 위한 조절과정으로, 단백질의 서열 중 아스파라긴(ASN)-X (프롤린을 제외한 아미노산)-세린 또는 트리오닌(Ser/Thr)의 모티프에서 아스파라긴 잔기에 특별한 당사슬을 붙이는 과정이다. 이러한 당사슬의 중합과정은 당단백질들의 활성, 구조, 작용 위치 및 기질의 인식 그리고 안정성 등에 중요한 영향을 미친다.
소포체에서 시작되는 단백질의 N-당질화 과정은 연구된 모든 진핵생물에서 공통적으로 발생하며 만노오스가 노출된 형태의 당사슬(oligomannosidic N-glycan form)이 부착된다. 그러한 당사슬은 골지체에서 복잡한 형태의 당사슬로 전환되며 이 과정에서 푸코오스(fucose), 자일로스(xylose), 갈락토오스(galactose)등의 다양한 당이 부착되는데 이러한 과정을 복합(complex) N-당질화 과정이라고 한다.
그러한 복합 N-당질화 과정은 생물체마다 약간씩 다르며, 특히 식물체에서는 동물과 달리 α1,3 푸코오스와 β자일로스를 특이적으로 부착하며 트랜스 골지에서 일어나는 마지막 전환 과정에서 α1,4 푸코오스와 β갈락토스를 부착하게 된다.
환경 자극이나 스트레스를 감지하는 수용체들은 대부분 당단백질의 형태로 존재할 것으로 예상된다. 그러므로 당질화 관련 연구들은 그러한 단백질의 작용기작을 이해하기 위해 요구되며 더 나아가 스트레스에 대응하는 식물의 작용 기작을 이해하는 데에 도움이 될 것으로 예상된다.
현재까지 식물체의 N-당질화 유전자의 기능연구는 애기장대에서 주로 연구되었는데, 소포체에서 N-당질화에 참여하는 유전자들의 돌연변이체에서 세포벽 구조의 변형과 뿌리 생장의 억제가 관찰되었고, 스트레스에 대한 민감성이 증가되었다.
애기장대와 담배의 복합 N-당질화에 참여하는 유전자들의 돌연변이체에서는 뚜렷한 표현형의 변화는 관찰되지 않고 생존에도 큰 지장이 없는 것으로 나타났다.
그와 다르게 외떡잎 모델식물인 벼의 복합 N-당질화 유전자들의 변이는 발달단계에서 다양한 표현형을 나타내며, 특히 염 스트레스 처리에 대해 증가된 민감도를 보였다.
이러한 결과는 애기장대와 담배에서 복합 N-당질구조가 생명현상이나 스트레스 반응에 필수적이지 않은 반면 벼(Oryza sativa)에서는 복합적인 당질구조가 ER 스트레스(stress) 등에 더욱 민감한 영향을 끼치는 등, 아직 알려지지 않은 중요한 기능을 수행할 수 있음을 암시한다. 그러나 현재까지 벼에서 이들 유전자들의 기능적인 연구와 스트레스 관련성 연구는 아직 초기 상태에 머물러 있다. 또한 이전의 연구에 따르면 벼의 N-당질화 관련 유전자의 돌연변이 시 생명현상에 치명적인 영향을 줌으로써 해당 유전자의 기능연구에 많은 어려움을 겪고 있다.
단백질의 N-당질화 과정은 단백질의 기능이나 안정성에 중요한 영향을 미치는 것으로 알려져 있으나, 현재 식물체에서의 N-당질화에 관한 연구는 미비한 실정이다. 식물에서 환경 자극이나 스트레스를 감지하는 대부분의 수용체들과 세포벽 구성에 작용하는 단백질들이 당단백질의 형태로 존재할 것으로 예상된다. 그러므로 당질화 관련 연구들은 그러한 단백질의 작용 기작을 이해하기 위해 요구되며 더 나아가 스트레스에 대응하는 식물의 작용 기작을 이해하는 데에 도움이 될 것으로 예상된다.
전 세계적으로 바이오 의약품 시장은 급속히 증가되고 있으며 우리나라의 경우 차세대 주요사업 중 하나로 각광받고 있다. 현재까지 동물세포 혹은 대장균이나 효모를 이용하여 바이오 의약품들이 생산되고 있지만 생산비용 등 여러 가지 고질적인 문제들을 안고 있다. 따라서 그러한 단점을 보완하고자 식물시스템을 이용한 의료용 단백질 생산 시도가 이루어지고 있다.
그러나 인간을 비롯한 포유류의 N-당질화는 식물과 다르게 나타나기 때문에 이러한 문제점을 극복한 인간형 N-당질화 식물소재의 개발은 매우 시급한 사안이다.
이에 본 발명자들은 벼(Oryza sativa)에서 식물 특이적인 N-당질화 과정이 환경 스트레스에 미치는 기능을 조사하기 위해 그러한 과정에 참여하는 총 8개의 유전자에 대한 돌연변이 세포주를 획득하였고, 이를 목표 단백질을 생산하기 위한 식물 시스템으로 활용할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염기서열로 이루어진 가이드(guide) RNA를 포함하는 벼 N-당질화 유전자 교정용 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 벡터로 형질전환된 N-당질화 돌연변이 벼를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 벼 N-당질화 유전자 교정용 벡터로 형질전환하는 유전자 교정 단계를 포함하는 N-당질화 돌연변이 벼의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 벼에서 트라스트주맙(Trastzumab; TMab)이 발현되도록 코돈 최적화된 것인, 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 경쇄 합성 유전자 및 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 중쇄 합성 유전자를 포함하는 트라스트주맙 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 벼에서 트라스트주맙이 발현되도록 코돈 최적화된 것인, 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 경쇄 합성 유전자 및 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 중쇄 합성 유전자를 포함하는 트라스트주맙 발현용 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염기서열로 이루어진 가이드(guide) RNA를 포함하는 벼 N-당질화 유전자 교정용 벡터; 및
벼에서 트라스트주맙이 발현되도록 코돈 최적화된 것인, 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 경쇄 합성 유전자 및 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 중쇄 합성 유전자를 포함하는 트라스트주맙 발현용 벡터
로 형질전환된 트라스트주맙 생산용 벼를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다음 단계를 포함하는 단백질 생산용 벼의 제조방법을 제공하는 것이다:
서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 벼 N-당질화 유전자 교정용 벡터로 벼를 형질전환시키는 유전자 교정 단계; 및
목표 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 벼를 형질전환시키는 유전자 도입 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 식물 특이적 N-당질화 돌연변이 벼의 단백질 생산 용도에 관한 것이다.
본 발명은 N-당질화(N-glycosylation) 돌연변이 벼(Oryza sativa), 이의 제조방법 및 이를 이용한 단백질 생산용 벼의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 N-당질화 돌연변이 벼는 목표 단백질을 생산하기 위한 식물 시스템으로 활용할 수 있다.
본 발명자들은 식물 특이적인 당질화 과정에 참여하는 유전자들의 돌연변이 세포주를 이용하여 이러한 유전자의 기능의 결함이 생명현상에 미치는 영향을 식물세포수준에서 연구함으로써 식물에서 N-당질화의 이해를 돕고자 하였다.
이에, 벼에서 식물 특이적인 N-당질화 과정이 환경 스트레스에 미치는 기능을 조사하기 위해 그러한 과정에 참여하는 총 8개의 유전자를 CRISPR-Cas9 기술을 이용하여 돌연변이시켰고, 그 결과 8개 유전자(β1,2-XylT, α1,3-FucT, β1,3-GalT, α1,4-FucT, HEXO1, HEXO2, HEXO3, HEXO4)의 기능적인 돌연변이 세포주와 4개 유전자(α1,3-FucT, β1,2-XylT, β1,3-GalT, α1,4-FucT)의 돌연변이 세포주를 각각 획득하였으며, 이를 목표 단백질을 생산하기 위한 식물 시스템으로 활용할 수 있음을 확인하였다.
이러한 식물 특이적 당질화를 제거시킨 세포주 시스템을 이용하여 세포 수준에서의 스트레스 기작을 더욱 효과적으로 수행하고, 단백질 생산 시스템을 구축하여 단백질 의약품 등 유용 단백질의 생산을 위한 플랫폼으로 사용할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염기서열로 이루어진 가이드(guide) RNA이다.
본 발명에 있어서, 가이드 RNA는 β1,2-XylT, α1,3-FucT, β1,3-GalT, α1,4-FucT, HEXO1, HEXO2, HEXO3 및 HEXO4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 표적으로 하는 것일 수 있다.
상기 유전자들은 식물 특이적인 당질화 과정에서 기능하는 유전자에 해당한다.
본 발명에 있어서, 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 염기서열을 발현할 수 있도록 디자인된 다시스트론성(polycistronic) 가이드 RNA인 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어 “다시스트론성”은 하나의 전사단위에서 유래하는 mRNA에 번역개시, 번역종결 시그널에 따라 규정하는 아미노산 배열(시스트론)이 복수로 존재하는 상태를 의미한다. 이에 대하여 1개만 존재할 때에는 단일시스트론이라 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 8종의 염기서열을 발현할 수 있도록 디자인된 다시스트론성 가이드 RNA를 합성하여 사용하였다. 상기 8종의 염기서열은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 또는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 벼 N-당질화 유전자 교정용 벡터(vector)이다.
상기 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 의미하며, DNA를 복제하고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다.
"발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현벡터는 진핵세포에서 이용 가능한 하나 이상의 복제기점, 프로모터, 선택마커, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘 다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입시, 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터를 의미한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능한 것들 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.
공지된 벡터로는 pROKII, pBI76, pET21, pSK(+), pLSAGPT, pUC 및 pGEM가 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다.
본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 식물 발현 벡터의 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다. 또한 상기 벡터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.
"식물"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명에 있어서, 가이드 RNA는 β1,2-XylT, α1,3-FucT, β1,3-GalT, α1,4-FucT, HEXO1, HEXO2, HEXO3 및 HEXO4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 표적으로 하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 염기서열을 발현할 수 있도록 디자인된 다시스트론성 가이드 RNA인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 벡터로 형질전환된 N-당질화 돌연변이 벼이다.
본 발명에 있어서, 가이드 RNA는 β1,2-XylT, α1,3-FucT, β1,3-GalT, α1,4-FucT, HEXO1, HEXO2, HEXO3 및 HEXO4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 표적으로 하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 염기서열을 발현할 수 있도록 디자인된 다시스트론성 가이드 RNA인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 벼는 세포, 캘러스, 종자 및 성체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어, 세포인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 벼 N-당질화 유전자 교정용 벡터로 형질전환하는 유전자 교정 단계를 포함하는 N-당질화 돌연변이 벼의 제조방법이다.
본 발명에 있어서, 가이드 RNA는 β1,2-XylT, α1,3-FucT, β1,3-GalT, α1,4-FucT, HEXO1, HEXO2, HEXO3 및 HEXO4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 표적으로 하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 염기서열을 발현할 수 있도록 디자인된 다시스트론성 가이드 RNA인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 벼는 세포, 캘러스, 종자 및 성체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어, 세포인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 벼에서 트라스트주맙(Trastzumab; TMab)이 발현되도록 코돈 최적화(codon optimization)된 것인, 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 경쇄 합성 유전자 및 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 중쇄 합성 유전자를 포함하는 트라스트주맙 생산용 조성물이다.
본 명세서상의 용어 “코돈 최적화”는 단백질 합성을 최적화하기 위해 각 생물종 마다 코돈의 사용이 최적화된 것을 의미한다. 생물 종에 따라 최적화 코돈이 다르기 때문에 원하는 단백질을 다른 생물 종에서 효율적으로 발현시키고자 하는 경우에도 코돈 최적화가 필요하다. 예를 들어, 사람의 단백질을 대장균에서 발현시킬 경우. 같은 아미노산을 암호화하고 있는 코돈들 중에서 대장균이 주로 사용하는 코돈으로 바꾸게 되면 단백질이 더 효율적으로 발현될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 벼에서 트라스트주맙이 발현되도록 코돈 최적화된 것인, 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 경쇄 합성 유전자 및 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 중쇄 합성 유전자를 포함하는 트라스트주맙 발현용 벡터이다.
본 발명의 다른 양태는 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 벼 N-당질화 유전자 교정용 벡터; 및
벼에서 트라스트주맙이 발현되도록 코돈 최적화된 것인, 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 경쇄 합성 유전자 및 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 중쇄 합성 유전자를 포함하는 트라스트주맙 발현용 벡터
로 형질전환된 트라스트주맙 생산용 벼이다.
본 발명에 있어서, 가이드 RNA는 β1,2-XylT, α1,3-FucT, β1,3-GalT, α1,4-FucT, HEXO1, HEXO2, HEXO3 및 HEXO4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 표적으로 하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 염기서열을 발현할 수 있도록 디자인된 다시스트론성 가이드 RNA인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 벼는 세포, 캘러스, 종자 및 성체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어, 세포인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 다음 단계를 포함하는 단백질 생산용 벼의 제조방법을 제공하는 것이다:
서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 벼 N-당질화 유전자 교정용 벡터로 벼를 형질전환시키는 유전자 교정 단계; 및
목표 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 벼를 형질전환시키는 유전자 도입 단계.
본 발명에 있어서, 목표 단백질은 트라스트주맙인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 가이드 RNA는 β1,2-XylT, α1,3-FucT, β1,3-GalT, α1,4-FucT, HEXO1, HEXO2, HEXO3 및 HEXO4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 표적으로 하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 염기서열을 발현할 수 있도록 디자인된 다시스트론성 가이드 RNA인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 벼는 세포, 캘러스, 종자 및 성체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 예를 들어, 세포인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 N-당질화(N-glycosylation) 돌연변이 벼(Oryza sativa), 이의 제조방법 및 이를 이용한 단백질 생산용 벼의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 식물 특이적인 N-당질화 과정에 참여하는 총 8개의 유전자에 대한 돌연변이 세포주를 획득하였고, 이로부터 의료용 단백질의 생산 가능성을 확인하였으므로, 이를 효과적으로 단백질의 생산에 이용할 수 있다.
도 1은 sgRNA(single guide RNA)와 Cas9의 활성도 확인을 위한 in vitro 클리비지(cleavage) 실험 결과 사진이다.
도 2a는 CRISPR-Cas9 벡터인 pSK437 벡터의 모식도이다.
도 2b는 CRISPR-Cas9 벡터인 pSK438 벡터의 모식도이다.
도 3은 #1-12-20-11 캘러스 라인의 현탁배양에서 획득된 단일세포(좌) 혹은 단일세포유래 세포군(우)을 나타낸 사진이다.
도 4는 획득된 단일세포주의 α1,3-Fucose와 β에 대한 면역블로팅 결과 사진이다.
도 5는 식물특이적 당질화 유전자 돌연변이 단일세포주에서 발현된 트라스트주맙(Trastzumab; TMab)의 확인 결과 사진이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 표적서열 디자인과 CRISPR-Cas9 벡터 건축
식물 특이적 N-당질화 및 N-당질 조절 과정에 참여하는 8개의 유전자(β1,2-XylT, α1,3-FucT, β1,3-GalT, α1,4-FucT, HEXO1, HEXO2, HEXO3, HEXO4) 그리고 4개의 유전자(β1,2-XylT, α1,3-FucT, β1,3-GalT, α1,4-FucT)에 대한 돌연변이 벼(Oryza sativa) 세포주를 만들기 위해 CRISPR-P gRNA 디자인 툴(design tool)(Liu et al., (2017) CRISPR-P 2.0: an improved CRISPR/Cas9 tool for genome editing in plants. Mol Plant 10: 530-532)을 이용하여 각 유전자의 엑손 부위에서 유전자 당 2개의 최적 표적서열을 선발하여 CRISPR-Cas9 벡터 건축에 사용하였다.
8개 유전자의 표적부위를 PCR로 증폭하여 선별된 sgRNA(single guide RNA)-Cas9 복합체(complex)가 실제로 DNA를 절단할 수 있는지의 여부를 in vitro 클리비지(cleavage) 실험을 통하여 확인하였다. 이러한 실험을 위해 Cas9 발현벡터인 pET28b-Cas9-His (#47327, addgene, www.addgene.org/47327/)를 함유하는 대장균을 이용하여 IPTG 유도방법을 통해 Cas9을 합성하여 정제하였다. in vitro 전사시킨 각각의 gRNA들과 정제된 Cas9 단백질을 각각의 유전자들의 표적서열을 포함하는 PCR 산물과 섞어 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 후 효소(proteinase K)를 처리함으로써 반응을 종결한 후 반응액의 일부를 1% 아가로오스 겔에 전기영동하여 DNA 절단여부를 확인하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 각각의 표적에 대한 sgRNA-Cas9 복합체가 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.
이 중 8개 유전자에 대한 벡터 건축을 위해 하기 표 1에서 T1에 해당하는 유전자 당 1개의 표적 가이드(guide) RNA 서열을 선택하였고, 4개 유전자의 벡터 건축을 위해서는 T1 및 T2에 해당하는 선발된 두가지 표적서열을 모두 이용하였다.
N-당질화에 기능하는 8개 유전자의 표적 서열
서열번호 유전자명 가이드 서열 영역
1 α1,3-FucT T1 AGAGAGTATCCTCAGATCGA Exon 2
2 T2 GGCCTTTGAGAATTCCAACG Exon 4
3 β1,2-XylT T1 ACTCCTGTGAGGGGTACTTC Exon 1
4 T2 GTTAGGTAAATCCGTGACTC Exon 2
5 α1,4-FucT T1 GTACGGCGCCAACTCGACCG Exon 1
6 T2 CGACCTTCCAAAGTTACCCA Exon3 (or Exon 4)
7 β1,3-GalT T1 TCATTCTTCGAATGGAATAT Exon 1
8 T2 ATAAAAGTATCTCATCCACA Exon 6 (or Exon 7)
9 Hexo1 T1 GCTGCCGAGGAACTTCACCT Exon 1
10 T2 TGCCTGGCCATGCAGAATCA Exon 7
11 Hexo2 T1 GACCGGGTAGAAATTCCTGG Exon 1
12 T2 GGGTGGAGCGAGCACCAGAG Exon 2
13 Hexo3 T1 CTTGAAGGATGCCTTCCAGA Exon 2
14 T2 ATGCCAACGTCGGTGAGCCA Exon 1
15 Hexo4 T1 AGGGGAGCGTCGTCGAGGTG Exon 1
16 T2 TTACTCAGAGAGATATACAA Exon 7
도 2a 및 2b에서 확인할 수 있듯이, 8개 유전자의 표적 가이드 RNA 서열(서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15) 및 4개 유전자의 gRNA 서열(서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8)을 발현할 수 있도록 디자인한 다시스트론성(polycistronic) gRNA 서열을 벼의 U6 프로모터(promoter)에 각각 합성(GenScript, USA)한 후, pSB11-Cas9 벡터(Shim et al., 2018)의 선별마커인 제초제저항성 PPT 유전자를 하이그로마이신 저항성 유전자(HPT)로 치환한 pSK429를 건축하였다.
pSK429를 HindIII와 XbaI로 절단하고 상기 합성된 다시스트론성 gRNA 서열을 삽입함으로써 벡터 pSK437 및 pSK438을 각각 제조하였다. 식물 형질전환을 위해 아그로벡테리움 투메파시엔시스(Agrobacterium tumefaciencs, LBA4404)를 클로닝된 상기 CRISPR-Cas9 벡터들로 형질전환하였다.
실시예 2: 식물 형질전환 및 선별
표면 살균한 벼(Oryza sativa) 종자를 2N6 salt (Duchefa, Haarlem, Netherlands)와 2 mg/L 2,4-D가 첨가된 2N6 배지(이하 캘러스 유도배지)에 치상하여 3-4주 동안 캘러스 형성을 유도하였다. 벼의 형질전환은 Hiei 등(1994)의 방법을 변형하여 수행하였다. 간략히, 형성된 캘러스를 pSK437과 pSK438로 형질전환된 아그로박테리움 현탁 용액(OD600 = 0.3)과 23℃에서 3일간 공조배양하였으며, 3일 후, 캘러스를 캘러스 유도배지에 40 mg/L 하이그로마이신(hygromycin)과 200 mg/L 세포탁심(cefotaxime)을 첨가한 2N6CH 배지(이하 캘러스 선발배지)로 옮겨주었다. 이 후 캘러스들을 2주마다 새 배지로 계대배양하였고 이로부터 형질전환된 캘러스를 최종 선별하였다.
실시예 3: 유전자교정 캘러스 선별
2N6CH 배지에서 하이그로마이신 저항성 캘러스를 선발한 후, 해당 캘러스에서의 유전자교정(transgenic) 여부는 표 2와 같이 표적 서열을 포함하는 주변 서열에 대한 프라이머 서열을 이용하여 PCR 방법으로 조사하였다.
PCR에 사용된 프라이머
서열번호 명칭 서열 (5' to 3') 크기
17 α1,3-FucT-F_T1 CCCTCAAGCTTTATGCTCAACT 803 bp
　
18 α1,3-FucT-R_T1 GTTCCGTAGCTGGGGATACAT
19 α1,3-FucT-F_T2 TTGTTTTGGACATTGATGCAC 456 bp
　
20 α1,3-FucT-R_T2 TTCCACCCCAGAGAGATGAC
21 β1,2-XylT-F_T1 CACCACAACAACAGCAACAAC 531 bp
　
22 β1,2-XylT-R_T1 GTACTTGGGCAGCTCCTCCT
23 β1,2-XylT-F_T2 CCTATTGTTATATTGCAGGATTCA 458 bp
　
24 β1,2-XylT-R_T2 GAATCACATTATAAAGGAGCGAAGG
25 β1,3-Gal-F_T1 TGCAGTTCAGAATCCACAGAA 469 bp
　
26 β1,3-Gal-R_T1 AAGCACAATTGGAGGGTCTG
27 β1,3-Gal-F_T2 CCATCTGCATCTATGGGGTA 323 bp
　
28 β1,3-Gal-R_T2 TGATGGTGCACACAATAACTTAAA
29 α1,4-FucT-F_T1 CTCCCACCCTTTCCACTGTA 691 bp
　
30 α1,4-FucT-R_T1 ACGTGTACACCCCGTCGAG
31 α1,4-FucT-F_T2 TCTTCACTGCGCAATGTCAC 482 bp
　
32 α1,4-FucT-R_T2 GCCACAAAAATATCACCTCGT
33 Hexo1-F_T1 ATACCCGGGCACATTTACAG 483 bp
　
34 Hexo1-R_T1 CCACTCCAAGCTCCAGCTAC
35 Hexo2-F_T1 CGACGAGTCCTACACGCTCT 369 bp
　
36 Hexo2-R_T1 GAGTAGGAGCCGGAGTTGG
37 Hexo3-F_T1 CATTACGAAATGGCTTTTCCAT 535 bp
　
38 Hexo3-R_T1 TGCTATTCAACAGGCCAAGTTA
39 Hexo4-F_T1 GGCGTTTCTCTTCATCTTCTTG 559 bp
　
40 Hexo4-R_T1 CAGCTCTATCAGCGTCACCA
PCR 산물은 키트(Expin PCR SV mini kit, GeneAll, 한국)를 이용하여 정제 후, 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)하였고 그 서열을 분석하였다.
분석 툴(Inference of CRISPR Edits (ICE) analysis tool(ice.synthego.com/#/))을 이용하여 표적 서열 주변 염기서열의 INDEL 분석을 수행하였고, 이로부터 가장 높은 교정 효율을 보이는 캘러스들을 선별하였다.
그 결과 pSK437 벡터를 이용한 군으로부터 8개 유전자들의 돌연변이 세포주를 획득함에 있어서, β1,3-GalT, α1,4-FucT 유전자를 제외한 6개의 유전자에서 거의 100%에 가까운 유전자 교정효율을 나타내는 벼 캘러스 라인 #1-12-20-11을 선발하였다.
pSK438 벡터를 이용한 군으로부터 4개 유전자들의 돌연변이 세포주 획득을 위한 선별작업도 이와 동일한 방법으로 수행되었다.
실시예 4: 현탁배양을 이용한 유전자 교정 단일 세포주 획득
가장 높은 교정 효율을 보인 #1-12-20-11 라인의 캘러스를 2N6 액체 배지에 접종하여, 28℃, 110 rpm 조건에서 현탁 배양하였으며 2주마다 계대배양하여 단일 세포주를 얻었다.
현탁배양체를 거름망(100 μm pore size)으로 걸러서 이로부터 획득한 단일세포 혹은 단일세포 유래의 세포군을 도 3과 같이 나타내었다.
원심분리에 의해 포집된 세포들을 1 ml의 2N6 액체배지에 재현탁 후 2N6CH 한천배지에 도말하여 눈에 보이는 크기가 될 때까지 생장시키고, 2N6CH 한천배지에서 생장한 각각의 세포주들을 증식시킨 후, 새로운 2N6CH 한천배지에 분리하여 생장시켰다. 단일세포유래 세포주를 최종 획득하기 위해서, 생장된 각각의 세포주 캘러스마다 서로 다른 두 부위에서 캘러스를 떼어내고, 이로부터 유전체 DNA를 추출한 후 표적 서열 주변의 PCR을 각각 수행하였다.
한 세포주의 다른 두 부위에서의 PCR 산물의 염기서열을 이용하여 INDEL 분석을 수행하여 서로 동일한 INDEL 패턴을 보이는 세포주는 최종적으로 단일세포유래 세포주(#SC)로 평가하였다. 그 결과 8개 유전자 돌연변이 세포주인 #SC-26에서 세포주 2개 라인을 획득하였고 이를 각각 PMOsC1과 PMOsC2라고 명명하였다. 4개 유전자 돌연변이 세포주 획득을 위해 #19의 캘러스를 이용하여 동일한 방법으로 단일세포유래 세포주 2개 라인을 최종 선발하였으며, 이를 각각 PMOsC3와 PMOsC4라고 명명하였다. 각각의 세포주에 대한 유전자 교정 효율은 표 3에 정리하였다.
최종 선별된 세포주 라인에서 유전자에 대한 유전자 교정 효율
Line number β1,2-XylT α1,3-FucT β1,3-GalT α1,4-FucT Hexo1 Hexo2 Hexo3 Hexo4
PMOsC1 96 97 66 7 98 95 99 100
PMOsC2 95 98 78 16 97 91 98 100
PMOsC3 97 95 97 100 - - - -
PMOsC4 97 95 97 100 - - - -
실시예 5: 획득된 세포주의 N-당질구조 분석
선별된 세포주의 N-당질 구조를 조사하기 위해서 면역블롯팅 방법과 액체크로마토그래피 질량분석법(LC-MS)을 사용하였다.
면역블롯팅을 위하여 먼저, 세포주에서 총 단백질을 추출하였고, 웨스턴 블롯을 통하여 식물 특이적 N-당질인 α1,3-Fucose와 β의 상대적인 양을 야생형(WT)인 동진벼와 비교하였다. 단백질은 PBS 완충용액(pH 7.4)에서 추출하였으며, 총 단백질 10 ug을 PAGE 전기영동 후, 항-α1,3-Fucose(Agrisera, Sweden)와 항-β1,2-Xylose(Agrisera, Sweden)를 이용하여 면역블롯팅 하였다(M, size marker; Lane 1, 동진벼 (WT); lane 2, PMOsC1; lane 3, PMOsC2; lane 4, PMOsC3; lane 5, PMOsC4).
도 4에서 확인할 수 있듯이, 그 결과 선발된 세포주에서 α1,3-Fucose와 β는 거의 검출되지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 α1,3-FucT와 β1,2-XylT 효소 유전자들의 돌연변이가 정상적으로 일어났음을 확인할 수 있었다. 나아가서, 선발된 세포주의 N-당질 구조 변화를 더욱 자세하게 분석하고자 하였다.
이를 위해서, 추출된 단백질을 트립신 처리한 후, PNGase A를 처리하여 단백질로부터 N-당질을 분리하였고, 이를 MALDI-TOF MS(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry)를 이용하여 분석하였다.
PMOsC 세포주들의 총단백질에서 N-당질 구조의 상대비율
당질구조 WT_cell PMOsC1_cell PMOsC2_cell PMOsC3_cell PMOsC4_cell
MM 0.0 0 0 50.8 42.3
MMX 18.0 0 0 0 0
MMXF 55.8 0 0 0 0
MGn 0.0 19.2 7.7 13.8 26.4
MGnX 0.6 0 0 0 0
MGnXF 7.5 0 0 0 0
GnGn 0.0 80.8 92.3 35.4 31.3
GnGnX 0.0 0 0 0 0
GnGnXF 3.3 0 0 0 0
AGnX 0.1 0 0 0 0
AGnF 0.8 0 0 0 0
AGnXF 4.1 0 0 0 0
AGnGnXF 2.4 0 0 0 0
AFGnGnXF 3.8 0 0 0 0
AAGnGnXF 1.6 0 0 0 0
AAFFGnGnXF 1.9 0 0 0 0
Total 100 100 100 100 100
표 4에서 확인할 수 있듯이, WT에서 다양한 N-당질 구조가 검출된 것과는 다르게, PMOsC1과 PMOsC2 세포주에서는 MGn과 GnGn 2가지의 N-당질구조가 검출되었으며 PMOsC3와 PMOsC4에서는 MM, MGn, GnGn의 3가지 당질구조가 검출되었다. 특히 PMOsC1과 PMOsC2 세포주에서 GnGn 구조의 비율은 각각 80.8%와 92.3%로 나타났다. 반면에 PMOsC3와 PMOsC4 단일 세포주의 경우 MM구조가 가장 많이 검출되었는데 그러한 상대양은 각각 50.8%와 42.3%로 관찰되었다.
이러한 세포주의 차이는 Hexo1 내지 Hexo4에 해당하는 헥소사미니데이즈(hexosaminidase; HEXA) 유전자의 돌연변이 여부에 기인되는 것으로 사료된다.
PMOsC1 세포주의 배지로 분비된 분비단백질의 N-당질 구조의 상대비율
당질구조 WT_media PMOsC1_media
MM 0.0 1.0
MMX 2.7 0.0
MMXF 81.6 0.0
MGn 0.0 1.6
MGnXF 11.4 0.0
GnGn 0.0 97.4
GnGnXF 1.3 0.0
AGnXF 2.1 0.0
AGnGnXF 0.8 0.0
Total 100.0 100.0
표 5에서 확인할 수 있듯이, PMOsC1 세포주의 현탁배양 배지로 분비된 분비단백질로부터의 결과에서 MM, MGn, GnGn 구조는 각각 1.0%, 1.6%, 97.4%의 비율을 보이며 세포에서의 결과보다 더 심화된 GnGn 구조의 편향성을 관찰하였다.
이러한 결과를 통해, PMOsC1과 PMOsC2에서 거의 100%의 유전자 교정 효율을 보였던 6개 유전자의 돌연변이를 재확인하였으며, 비교적 낮은 유전자교정 효율을 보여주었던 β1,3-GalT와 α1,4-FucT 유전자들은 실제적으로는 단백질 N-당질화에는 검출할 만한 기능을 나타내지 못하는 것으로 밝혀졌다.
이러한 선발된 세포주에서의 β1,3-GalT와 α1,4-FucT 효소의 기능억제현상은 아마도 이러한 효소들에 선행하여 작용하는 α1,3-FucT와 βT의 돌연변이로 인하여 비정상적인 N-당질화가 일어났고, 따라서 β1,3-GalT와 α1,4-FucT 효소의 기질인 α1,3-Fucose와 β로 수식된 정상적인 N-당질화가 결여된 비정상적인 기질 단백질이 만들어진 결과인 것으로 사료된다.
더불어 MM구조의 매우 낮은 양의 검출 혹은 미검출의 결과는 헥소사미니데이즈 유전자들이 돌연변이되었음을 나타낸다.
위의 결과로부터 우리는 최종적으로 8개의 유전자에서 돌연변이를 일으킨 PMOsC1 및 PMOsC2 단일세포주를 획득하였고, 이들의 N-당질화 구조분석으로부터 결과적으로 표적 8개 효소의 기능을 억제한 세포주를 확립할 수 있었다. 또한 PMOsC3 및 PMOsC4 세포주의 당질구조분석을 통해 4개의 유전자가 성공적으로 돌연변이 되었음을 확인하였다.
이러한 세포주들은 앞으로 환경 자극 및 스트레스 관련 실험을 수행하기 위해 효율적인 세포주 시스템 확립과 해당 유전자의 기능을 연구할 수 있는 유용한 자원이 될 것으로 예상된다. 또한 이러한 식물특이적 당질화 유전자의 돌연변이 세포주를 여러가지 유용단백질을 생산할 수 있는 생산플랫폼으로 이용할 수 있을 것이다.
실시예 6: 식물 특이적 당질화 돌연변이 세포주에서 유방암 치료제인 트라스트주맙의 발현
식물 특이적 당질화 유전자 돌연변이 세포주에서 유방암 치료제인 트라스트주맙(Trastzumab)의 발현을 시도하였다. 트라스트주맙의 경쇄와 중쇄의 5' 말단에 벼의 Amylase 3E (RAmy3E) 단백질의 신호펩타이드 서열(GKHHVTLCCVVFAVLCLASSLAQA)을 첨가한 후 벼의 코돈에 최적화된 트라스트주맙 경쇄 및 중쇄 유전자를 합성(GeneArt, Germany)하여 pEAQ-HT 벡터(Sainsbury et al., 2009)로 도입한 pSK446 벡터를 건축하였다. 그러한 발현벡터를 PMOsC1 세포주에 형질전환한 후 50 mg/L의 G418(Geneticin)에서 선별하였다. 대조군으로는 형질전환하지 않은 WT(동진) 캘러스라인에서 추출한 단백질을 사용하였다.
서열번호 명칭 서열
41 트라스트주맙 경쇄 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
42 트라스트주맙 중쇄 아미노산 서열 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
43 RAmy3E 신호펩타이드 아미노산 서열 GKHHVTLCCVVFAVLCLASSLAQA
44 트라스트주맙 경쇄 합성 유전자(RAmy3E 신호펩타이드 서열 포함) ATGGGCAAGCACCACGTGACCCTGTGCTGCGTGGTGTTTGCTGTTCTGTGCCTGGCAAGCAGCCTGGCACAGGCAGACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCATCTGTGGGCGATCGCGTGACAATTACATGCCGCGCAAGCCAGGACGTGAACACCGCAGTTGCATGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCTTCCTGTACAGCGGCGTGCCATCTCGCTTTAGCGGTTCTCGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACAATCTCTAGCCTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACACCACCAACATTCGGCCAGGGCACCAAGGTCGAGATCAAGCGAACAGTGGCAGCCCCAAGCGTGTTCATCTTCCCACCATCTGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCTTCTGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCACGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTTGACAACGCACTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTTACAGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGTCCAGCACACTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACACACCAGGGCCTGTCATCTCCAGTGACCAAGTCTTTCAACCGCGGCGAGTGCTGATGA
45 트라스트주맙 중쇄 합성 유전자(RAmy3E 신호펩타이드 서열 포함) ATGGGCAAGCACCACGTGACCCTGTGCTGCGTGGTGTTTGCTGTTCTGTGCCTGGCAAGCAGCCTGGCACAGGCAGAGGTTCAGCTGGTTGAGTCTGGCGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTTCTCTGCGACTGTCTTGCGCAGCAAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTGCGCCAGGCACCAGGTAAGGGCCTGGAGTGGGTTGCACGCATCTACCCTACCAACGGCTACACCCGCTACGCCGATTCTGTGAAGGGCCGCTTTACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGCGCTGAGGACACCGCAGTGTACTACTGCTCTCGATGGGGCGGTGACGGCTTCTACGCAATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTAGCGCATCTACAAAGGGCCCAAGCGTGTTCCCACTGGCACCAAGCAGCAAGTCTACAAGCGGCGGTACAGCAGCACTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTTCCAGAGCCAGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGTGCACTGACATCTGGCGTGCACACATTCCCAGCAGTGCTGCAGTCAAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCTTCTTCACTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTCGAGCCAAAGAGCTGCGACAAGACCCACACATGCCCACCATGCCCTGCACCAGAGCTGCTCGGTGGCCCATCTGTGTTTCTGTTCCCACCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCAGCCGCACACCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTCGAGGTGCACAACGCAAAGACAAAGCCACGCGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGAGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCAGCACCAATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGAGAGCCACAGGTTTACACCCTGCCACCATCTCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTCGTCAAGGGCTTCTACCCAAGCGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCACCAGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCAGGCAAGTGATGA
선별된 캘러스들은 2주간 현탁배양하였으며, 이로부터 배양액을 회수하였고 440 g x 5분 원심분리 후 Vivaspin(50 MWCO, Sartorius)으로 농축하였다. 농축된 용액을 human IgG gamma chain과 kappa chain 특이적인 항체를 이용하여(AP309P, AP502, PMillipore, USA) 면역 블롯팅을 수행하였다(1, size marker; 2, TMab 형질전환 세포주 현탁배양에 사용된 배지의 농축액; 3, WT (negative control); 4, Herzuma (트라스트주맙의 유사체, positive control).
도 5에서 확인할 수 있듯이, 경쇄 및 중쇄 모두 정상적으로 세포주에서 생산됨을 확인하였다.
<110> PhytoMab Co., Ltd. SOGANG UNIVERSITY RESEARCH & BUSINESS DEVELOPMENT FOUNDATION <120> N-glycosylation mutated rice, method for manufacturing thereof, and method for manufacturing rice for protein production using the same <130> PN200177 <160> 45 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 agagagtatc ctcagatcga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 ggcctttgag aattccaacg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 3 actcctgtga ggggtacttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 4 gttaggtaaa tccgtgactc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 5 gtacggcgcc aactcgaccg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 6 cgaccttcca aagttaccca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 7 tcattcttcg aatggaatat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 8 ataaaagtat ctcatccaca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 9 gctgccgagg aacttcacct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 10 tgcctggcca tgcagaatca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 11 gaccgggtag aaattcctgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 12 gggtggagcg agcaccagag 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 13 cttgaaggat gccttccaga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 14 atgccaacgt cggtgagcca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 15 aggggagcgt cgtcgaggtg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 16 ttactcagag agatatacaa 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a1,3-FucT-F T1 <400> 17 ccctcaagct ttatgctcaa ct 22 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a1,3-FucT-R T1 <400> 18 gttccgtagc tggggataca t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a1,3-FucT-F_T2 <400> 19 ttgttttgga cattgatgca c 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a1,3-FucT-R_T2 <400> 20 ttccacccca gagagatgac 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b1,2-XylT-F_T1 <400> 21 caccacaaca acagcaacaa c 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b1,2-XylT-R_T1 <400> 22 gtacttgggc agctcctcct 20 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b1,2-XylT-F_T2 <400> 23 cctattgtta tattgcagga ttca 24 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b1,2-XylT-R_T2 <400> 24 gaatcacatt ataaaggagc gaagg 25 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b1,3-Gal-R_T1 <400> 25 tgcagttcag aatccacaga a 21 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b1,3-Gal-R_T1 <400> 26 aagcacaatt ggagggtctg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b1,3-Gal-F_T2 <400> 27 ccatctgcat ctatggggta 20 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b1,3-Gal-R_T2 <400> 28 tgatggtgca cacaataact taaa 24 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a1,4-FucT-F_T1 <400> 29 ctcccaccct ttccactgta 20 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a1,4-FucT-R_T1 <400> 30 acgtgtacac cccgtcgag 19 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a1,4-FucT-F_T2 <400> 31 tcttcactgc gcaatgtcac 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a1,4-FucT-R_T2 <400> 32 gccacaaaaa tatcacctcg t 21 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hexo1-F_T1 primer <400> 33 atacccgggc acatttacag 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hexo1-R_T1 primer <400> 34 ccactccaag ctccagctac 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hexo2-F_T1 primer <400> 35 cgacgagtcc tacacgctct 20 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hexo2-R_T1 primer <400> 36 gagtaggagc cggagttgg 19 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hexo3-F_T1 primer <400> 37 cattacgaaa tggcttttcc at 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hexo3-R_T1 primer <400> 38 tgctattcaa caggccaagt ta 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hexo4-F_T1 primer <400> 39 ggcgtttctc ttcatcttct tg 22 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hexo4-R_T1 primer <400> 40 cagctctatc agcgtcacca 20 <210> 41 <211> 214 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> trastuzumab light chain <400> 41 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 42 <211> 450 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> trastuzumab heavy chain <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 43 <211> 24 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 43 Gly Lys His His Val Thr Leu Cys Cys Val Val Phe Ala Val Leu Cys 1 5 10 15 Leu Ala Ser Ser Leu Ala Gln Ala 20 <210> 44 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trastuzumab light chain <400> 44 atgggcaagc accacgtgac cctgtgctgc gtggtgtttg ctgttctgtg cctggcaagc 60 agcctggcac aggcagacat ccagatgaca cagagcccta gcagcctgag cgcatctgtg 120 ggcgatcgcg tgacaattac atgccgcgca agccaggacg tgaacaccgc agttgcatgg 180 taccagcaga agccaggcaa ggccccaaag ctgctgatct acagcgccag cttcctgtac 240 agcggcgtgc catctcgctt tagcggttct cgcagcggca ccgatttcac cctgacaatc 300 tctagcctgc agccagagga cttcgccacc tactactgcc agcagcacta caccacacca 360 ccaacattcg gccagggcac caaggtcgag atcaagcgaa cagtggcagc cccaagcgtg 420 ttcatcttcc caccatctga cgagcagctg aagtccggca cagcttctgt ggtgtgcctg 480 ctgaacaact tctacccacg cgaggccaag gtgcagtgga aggttgacaa cgcactgcag 540 agcggcaaca gccaggagag cgttacagag caggacagca aggactccac ctacagcctg 600 tccagcacac tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgag 660 gtgacacacc agggcctgtc atctccagtg accaagtctt tcaaccgcgg cgagtgctga 720 tga 723 <210> 45 <211> 1431 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trastuzumab heavy chain <400> 45 atgggcaagc accacgtgac cctgtgctgc gtggtgtttg ctgttctgtg cctggcaagc 60 agcctggcac aggcagaggt tcagctggtt gagtctggcg gtggtctggt tcagcctggt 120 ggttctctgc gactgtcttg cgcagcaagc ggcttcaaca tcaaggacac ctacatccac 180 tgggtgcgcc aggcaccagg taagggcctg gagtgggttg cacgcatcta ccctaccaac 240 ggctacaccc gctacgccga ttctgtgaag ggccgcttta ccatcagcgc cgacaccagc 300 aagaacaccg cctacctgca gatgaacagc ctgcgcgctg aggacaccgc agtgtactac 360 tgctctcgat ggggcggtga cggcttctac gcaatggatt actggggcca gggcaccctg 420 gtgacagtgt ctagcgcatc tacaaagggc ccaagcgtgt tcccactggc accaagcagc 480 aagtctacaa gcggcggtac agcagcactg ggctgcctgg tgaaggacta ctttccagag 540 ccagtgaccg tgagctggaa cagcggtgca ctgacatctg gcgtgcacac attcccagca 600 gtgctgcagt caagcggcct gtactctctg agcagcgtgg tgaccgtgcc atcttcttca 660 ctgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aaccacaagc caagcaacac caaggtggac 720 aagaaggtcg agccaaagag ctgcgacaag acccacacat gcccaccatg ccctgcacca 780 gagctgctcg gtggcccatc tgtgtttctg ttcccaccaa agccaaagga caccctgatg 840 atcagccgca caccagaggt gacatgcgtg gtggtggatg tgagccacga ggaccctgag 900 gtgaagttca actggtacgt ggacggcgtc gaggtgcaca acgcaaagac aaagccacgc 960 gaggagcagt acaacagcac ctaccgagtg gtgtccgtgc tcactgtgct gcaccaggat 1020 tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtgagcaaca aggccctgcc agcaccaatc 1080 gagaagacca tcagcaaggc caagggccag ccacgagagc cacaggttta caccctgcca 1140 ccatctcgcg aggagatgac caagaaccag gtgagcctga cctgcctcgt caagggcttc 1200 tacccaagcg acattgccgt cgagtgggag tctaacggcc agcctgagaa caactacaag 1260 accacaccac cagtgctgga cagcgacggc tcattcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg 1320 gacaagtccc gatggcagca gggcaacgtg ttcagctgct ctgtgatgca cgaggccctg 1380 cacaaccact acacccagaa gtccctgagc ctgtctccag gcaagtgatg a 1431

Claims (9)

  1. 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염기서열로 이루어진 가이드(guide) RNA를 포함하는 벼(Oryza sativa) N-당질화 유전자 교정용 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 가이드 RNA는 β1,2-XylT, α1,3-FucT, β1,3-GalT, α1,4-FucT, HEXO1, HEXO2, HEXO3 및 HEXO4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 표적으로 하는 것인, 벼 N-당질화 유전자 교정용 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 염기서열을 발현할 수 있도록 디자인된 다시스트론성(polycistronic) 가이드 RNA인 것인, 벼 N-당질화 유전자 교정용 벡터.
  4. 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염기서열로 이루어진 가이드(guide) RNA를 포함하는 벡터로 형질전환된 N-당질화 돌연변이 벼(Oryza sativa).
  5. 벼(Oryza sativa)에서 트라스트주맙(Trastzumab; TMab)이 발현되도록 코돈 최적화(codon optimization)된 것인, 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 경쇄 합성 유전자 및 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 중쇄 합성 유전자를 포함하는 트라스트주맙 생산용 조성물.
  6. 벼(Oryza sativa)에서 트라스트주맙(Trastzumab; TMab)이 발현되도록 코돈 최적화된 것인, 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 경쇄 합성 유전자 및 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 중쇄 합성 유전자를 포함하는 트라스트주맙 발현용 벡터.
  7. 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 염기서열로 이루어진 가이드(guide) RNA를 포함하는 벼(Oryza sativa) N-당질화 유전자 교정용 벡터; 및
    벼에서 트라스트주맙(Trastzumab; TMab)이 발현되도록 코돈 최적화된 것인, 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 경쇄 합성 유전자 및 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 트라스트주맙 중쇄 합성 유전자를 포함하는 트라스트주맙 발현용 벡터
    로 형질전환된 트라스트주맙 생산용 벼.
  8. 제7항에 있어서, 가이드 RNA는 β1,2-XylT, α1,3-FucT, β1,3-GalT, α1,4-FucT, HEXO1, HEXO2, HEXO3 및 HEXO4로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 표적으로 하는 것인, 트라스트주맙 생산용 벼.
  9. 제7항에 있어서, 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 염기서열을 발현할 수 있도록 디자인된 다시스트론성(polycistronic) 가이드 RNA인 것인, 트라스트주맙 생산용 벼.
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