JP2002521027A

JP2002521027A - 組換えデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼおよび使用方法

Info

Publication number: JP2002521027A
Application number: JP2000561296A
Authority: JP
Inventors: ノーマンジー．ルイス，; 博幸笠原; デイビッドアール．ガング，; ローレンスビー．デイビン，
Original assignee: ワシントンステートユニバーシティリサーチファウンデーション
Priority date: 1998-07-24
Filing date: 1999-07-23
Publication date: 2002-07-16
Also published as: NZ509872A; WO2000005350A1; AU5226199A; CA2336488A1; BR9912407A; KR20010071027A; EP1100881A4; MXPA01000843A; EP1100881A1

Abstract

(57)【要約】デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼの発現をコードする単離されたＤＮＡ配列が提供される。他の局面において、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼをコードするか、またはデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼＤＮＡもしくはＲＮＡの少なくとも一部に対して、それらとのハイブリダイゼーションを可能にするに充分に相補的な塩基配列をコードする、複製可能な組換えクローニングビヒクルが提供される。さらに他の局面において、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼをコードする組換えクローニングビヒクルおよび／またはＤＮＡ配列を用いて、形質転換され、トランスフェクトされ、感染され、そして／または注入された、改変された宿主細胞が提供される。従って、植物細胞のような宿主細胞における、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼの組換え発現のための方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願）本願は、１９９８年７月２４日に出願した米国特許仮出願番号第６０／０９４
，０１２号からの優先権の利益を主張する。

【０００２】（発明の分野）本発明は、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ
タンパク質、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ
タンパク質をコードする核酸配列、およびその配列を含むベクター、その配列を
含む宿主細胞、ならびにデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレ
ダクターゼタンパク質およびその変異体を産生する方法に関する。

【０００３】（発明の背景）デヒドロジコニフェリルアルコール（ＤＤＣ）は、８，５’結合したリグナン
であり、ペルオキシダーゼおよびラッカーゼによって容易にされるＥ−コニフェ
リルアルコールのインビトロラジカル結合の３つの主要な産生物の１つである（
例えば、リグニン化において提唱されている産物（Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ，Ｋ
．、Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｃｈｉｍ．Ｆｒａｎｃｅ、１７４８−１７５３（１９５
９）；Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ，Ｋ．およびＮｅｉｓｈ，Ａ．Ｃ．、Ｃｏｎｓｔ
ｉｔｕｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＬｉｇｎｉｎ１
−１２３（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ，１９６
８））。ＤＤＣは、植物界において遍在し、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓｔａｅｄ
ａ）（Ｎｏｓｅ，Ｍ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３９：７１−７９（
１９９５））およびタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）（Ｂｉｎｎ
ｓ，Ａ．Ｎ．，Ｃｈｅｎ，Ｒ，Ｈ．，Ｗｏｏｄ，Ｈ．Ｎ．およびＬｙｎｎ，Ｄ．
Ｇ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：９８０−９８４
（１９８７））のような多岐に亙る植物において見出される。テーダマツの懸濁
培養細胞もまた、ＤＤＣおよびその７’，８’−（アリル結合）還元誘導体であ
るジヒドロデヒドロジコニフェリルアルコール（ＤＤＤＣ）を含むことが示され
ている（Ｎｏｓｅ，Ｍ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３９：７１−７９
（１９９５））。しかし、その形成および引き続く代謝に関連する酵素は、これ
までに記載されていない。

【０００４】（発明の要旨）前記に従って、ＰｉｎｕｓｔａｅｄａおよびＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａ
ｐｏｎｉｃａ由来のデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダク
ターゼをコードするｃＤＮＡが、単離されそして配列決定された。そして対応す
るアミノ酸配列が推定された。従って、本発明は、デヒドロジコニフェリルアル
コールベンジルエーテルレダクターゼの発現をコードする単離されたＤＮＡ配列
、例えば、Ｐｉｎｕｓｔａｅｄａ由来のデヒドロジコニフェリルアルコールベ
ンジルエーテルレダクターゼ（配列番号２）をコードする配列番号１と呼ばれる
配列、ならびにＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ由来のデヒドロジコ
ニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ（配列番号４および配列番
号６）をコードするそれぞれ、配列番号３および配列番号５と呼ばれる配列に関
する。他の局面において、本発明は、核酸配列、例えば、デヒドロジコニフェリ
ルアルコールベンジルエーテルレダクターゼをコードするＤＮＡ配列か、または
少なくともデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼを
コードするＤＮＡまたはＲＮＡの一部に対して、それとのハイブリダイゼーショ
ンを可能にするに十分に相補的である塩基配列をコードするＤＮＡ配列（例えば
、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼをコードす
るＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の一部に相補的な、アンチセンスＲＮＡまたはＤ
ＮＡのフラグメントであって、これは、この上記のレダクターゼまたは関連遺伝
子のいずれかについてのポリメラーゼ連鎖反応プライマーとしてかまたはプロー
ブとして有用である）を含む、複製可能な組換えクローニングビヒクルに関する
。本発明のなお他の局面において、本発明の組換えクローニングビヒクルおよび
／またはＤＮＡ配列を用いて形質転換され、トランスフェクトされ、感染され、
そして／または注入された、改変された宿主細胞が提供される。従って、本発明
は、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼの組換え
発現を提供し、そして進歩的概念が使用されて、後の使用のために有意な量の組
換えデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ（または
その一次酵素生成物）の生成、単離および精製が容易にされて、植物、微生物ま
たは動物におけるデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクタ
ーゼの発現または増強された発現が得られ得るか、あるいは進歩的概念が、デヒ
ドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼの調節または発現
がこのレダクターゼ、もしくはその酵素生成物、またはこれらの誘導体の生成に
所望される環境において、他の方法で使用され得る。別の局面において、本発明
は、適切な宿主細胞（例えば、植物細胞）において、デヒドロジコニフェリルア
ルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質の発現を増強するか、または
改変する方法に関する。

【０００５】（好ましい実施態様の詳細な説明）本明細書において使用される場合、用語「アミノ酸（単数および複数）」とは
、天然に存在する全てのＬ−α−アミノ酸、またはその残基をいう。このアミノ
酸は、１文字記号または３文字記号のいずれかによって同定される：

【０００６】

【化１】。

【０００７】本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド」とは、糖部分（五単糖）
、リン酸および含窒素複素環式塩基を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡのモノマー単位
を意味する。この塩基は、グリコシド炭素（五単糖の１’炭素）を介してこの糖
部分に結合されており、そして塩基と糖の組合せは、ヌクレオシドと呼ばれる。
この塩基はヌクレオチドに特徴を与え、ＤＮＡの４つの塩基は、アデニン（「Ａ
」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）、およびチミン（「Ｔ」）であ
る。イノシン（「Ｉ」）は、この４つの天然に存在する塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、また
はＴ）のいずれかの代わりに使用され得る合成塩基である。４つのＲＮＡ塩基は
、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびウラシル（「Ｕ」）である。本明細書中に記載されるヌク
レオチド配列は、隣接する五単糖の３’炭素および５’炭素間のホスホジエステ
ル結合により連結された、直鎖上のヌクレオチドのアレイを含む。

【０００８】「オリゴヌクレオチド」とは、ホスホジエステル結合を介して連結されたデオ
キシリボヌクレオチドの短い長さの一本鎖配列または二本鎖配列をいう。オリゴ
ヌクレオチドは、公知の方法によって化学的に合成され、そして例えば、ポリア
クリルアミドゲル上で精製される。

【０００９】用語「デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ」と
は、本明細書中で使用される場合、デヒドロジコニフェリルアルコールを７−Ｏ
−４’−イソジヒドロデヒドロジコニフェリルアルコールへと変換し得る酵素を
意味し、これは、例えば、本明細書中の実施例３に記載のアッセイにおいて決定
される。

【００１０】用語「変化」「アミノ酸配列変化」「改変体」および「アミノ酸配列改変体」
とは、対応する天然のデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダ
クターゼと比較して、そのアミノ酸配列においていくつかの差異を有するデヒド
ロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ分子をいう。通常、
この改変体は、対応する天然のデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエー
テルレダクターゼと少なくとも約７０％相同性を有し、そして好ましくは、この
改変体は、対応する天然のデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテル
レダクターゼと少なくとも約８０％相同である。本発明中にあるデヒドロジコニ
フェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼのアミノ酸配列改変体は、特
定の位置に置換、欠失、および／または挿入を有する。デヒドロジコニフェリル
アルコールベンジルエーテルレダクターゼの配列改変体は、所望の、増強された
酵素活性または減少された酵素活性、改変された位置化学（ｒｅｇｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）または立体化学、あるいは変化した基質利用または生成物分布を得
るために使用され得る。

【００１１】置換型デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ改変
体は、対応する天然のデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダ
クターゼ配列において少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、そして同じ位
置のその場所に異なるアミノ酸が挿入されたものである。この置換は、単一（こ
の分子中の１つのアミノ酸のみが置換されている）であり得るか、またはこの置
換は、複数（２つ以上のアミノ酸が同じ分子中で置換されている）であり得る。
デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ分子の活性に
おける実質的な変化は、アミノ酸を、天然のアミノ酸の側鎖と電荷および／構造
が有意に異なる側鎖を有するアミノ酸で置換することによって得られ得る。この
型の置換は、この置換の領域におけるこの分子のポリペプチド骨格の構造および
／あるいは電荷または疎水性に影響すると予期される。

【００１２】このデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ分子の
活性における中程度の変化は、アミノ酸を、天然の分子の側鎖と電荷および／ま
たは構造が類似する側鎖を有するアミノ酸で置換することによって、予期される
。この型の置換は、保存的置換と呼ばれ、この置換の領域におけるこの分子のポ
リペプチド骨格の構造、あるいは電荷または疎水性のいずれかを実質的に変化さ
せないと予期される。

【００１３】挿入型デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ改変
体は、天然のデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ
分子の特定の位置のアミノ酸にすぐに隣接して挿入された１つ以上のアミノ酸を
備えるものである。アミノ酸にすぐに隣接してとは、そのアミノ酸のα−カルボ
キシ官能基またはα−アミノ官能基のいずれかへ連結されていることを意味する
。この挿入は、１つ以上のアミノ酸であり得る。通常、挿入は、１つまたは２つ
の保存的アミノ酸からなる。挿入の部位に隣接するアミノ酸に電荷および／また
は構造が類似したアミノ酸は、保存的であると規定される。あるいは、本発明は
、挿入の部位に隣接したアミノ酸と実質的に異なる電荷および／または構造を備
えるアミノ酸の挿入を含む。

【００１４】欠失改変体とは、天然のデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテル
レダクターゼ分子中の１つ以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失
改変体は、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ分
子の特定の領域において欠失された１つ以上のアミノ酸を有する。

【００１５】用語「アンチセンス」または「アンチセンスＲＮＡ」または「アンチセンス核
酸」とは、本明細書中で、メッセンジャーＲＮＡ分子の全てまたは一部に相補的
である、核酸分子を意味するために使用される。アンチセンス核酸分子は、代表
的に、相補的な、発現されるメッセンジャーＲＮＡ分子のインビボでの発現を阻
害するために使用される。

【００１６】デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼのアミノ酸
改変体は、例えば、変化した、反応速度論、基質利用、生成物分布、または他の
特徴（例えば、位置化学および立体化学）を含む望ましい変化した生物学的活性
を有し得る。

【００１７】用語「コードするＤＮＡ配列」、「コードするＤＮＡ」および「コードする核
酸」とは、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序また
は配列をいう。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、翻訳されるポリペ
プチド鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。従って、ＤＮＡ配列は、そのアミ
ノ酸配列をコードする。

【００１８】用語「ベクター」、「複製可能な発現ベクター」、および「発現ベクター」と
は、通常、二本鎖の、その中にＤＮＡ片（インサートＤＮＡ）が挿入されている
かもしれないＤＮＡ片をいう。このベクターは、適切な宿主細胞中にインサート
ＤＮＡを輸送するために使用される。一旦、宿主細胞にあると、このベクターは
、宿主の染色体ＤＮＡと独立してか、または一致して複製し得、そしていくつか
のコピー数のベクターおよびそのインサートＤＮＡが生成され得る。さらに、発
現ベクター（複製可能な発現ベクターを含む）は、そのインサートＤＮＡをポリ
ペプチドへと翻訳するのを可能にする必要なエレメントを含む。このインサート
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドの多くの分子は、このように容易に合成
され得る。

【００１９】用語「形質転換された宿主細胞」、「形質転換された」、および「形質転換」
とは、細胞へのＤＮＡの導入をいう。この細胞は、「宿主細胞」と呼ばれ、そし
てこれは、原核生物細胞であっても真核生物細胞であってもよい。代表的な原核
生物宿主細胞とは、種々のＥ．ｃｏｌｉ株を含む。代表的真核生物宿主細胞とは
、植物細胞（例えば、トウモロコシ細胞）、酵母細胞、昆虫細胞、または動物細
胞である。導入されたＤＮＡは、通常、挿入されたＤＮＡ片を含むベクターの形
態である。導入されたＤＮＡ配列は、宿主細胞と同じ種由来であってももよいし
、または宿主細胞と異なる種由来であってもよく、あるいは、これは、いくつか
の外来ＤＮＡおよびいくつかのその宿主細胞由来のＤＮＡを含む、ハイブリッド
ＤＮＡであってもよい。

【００２０】本発明に従って、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダク
ターゼをコードするｃＤＮＡ分子（配列番号１）が、２，４−Ｄ媒地において増
殖されたＰｉｎｕｓｔａｅｄａ細胞懸濁物培養細胞から抽出されたＲＮＡ由来
のλファージベースのｃＤＮＡライブラリーから単離された。このｃＤＮＡライ
ブラリーは、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のピノレシノール
（ｐｉｎｏｒｅｓｉｎｏｌ）−ラリシレシノール（ｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ
）レダクターゼをコードするｃＤＮＡ（ＰＬＲ−Ｆｉｌ）からの５’末端フラグ
メント（配列番号７）を使用してスクリーニングされた。２０個の陽性なファー
ジプラークが精製され、そしてそのｃＤＮＡインサートが配列決定されて、推定
レダクターゼクローンが明らかにされた。このクローンによりコードされるβ−
ガラクトシダーゼ融合タンパク質は、ピノレシノール−ラリシレシノール活性を
欠いた。この推定レダクターゼをコードするｃＤＮＡ（配列番号１）が発現プラ
スミドｐＳＢＥＴａにクローニングされ、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そし
て生じたネイティブのタンパク質（配列番号２）（すなわち、β−ガラクトシダ
ーゼドメインを欠く）がＥ．ｃｏｌｉ粗抽出物から精製されて、そしてピノレシ
ノール−ラリシレシノール活性およびそれがデヒドロジコニフェリルアルコール
を還元する能力の両方についてアッセイされた。この精製されたＰ．ｔａｅｄａ
レダクターゼ（配列番号２）は、デヒドロジコニフェリルアルコールのベンジル
エーテル結合の還元に影響して、これを７−Ｏ−４’−（イソ）ジヒドロデヒド
ロジコニフェリルアルコールへと変換した。

【００２１】さらに、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼを
コードする２つのｃＤＮＡ分子が、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ
のｃＤＮＡライブラリーから以下の様式で単離された。Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａの
ｃＤＮＡライブラリーが、５ｎｇのＰＣＲ増幅されたＰｉｎｕｓｔａｅｄａデ
ヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼｃＤＮＡ（配列
番号１）を使用してスクリーニングされた。約３００，０００ｐｆｕの増幅され
たＣ．ｊａｐｏｎｉｃａのｃＤＮＡライブラリーがスクリーニングされ、そして
２０個の陽性プラークが生じ、２つのｐＣｊ−ＰＣＢＥＲ１（配列暗号３）およ
びｐＣｊ−ＰＣＢＥＲ２（配列番号５）は、各々デヒドロジコニフェリルアルコ
ールベンジルエーテルレダクターゼ（それぞれ、配列番号４および配列番号６）
をコードすることが見出された。

【００２２】デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼをコードす
るｃＤＮＡの単離は、この機能的酵素の有効な発現系の開発を可能にし、リグナ
ン生合成の発達的調節を試験するための有用な道具を提供し、そして他のデヒド
ロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼの単離を可能にする
。デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼｃＤＮＡの
単離はまた、リグナン生合成を増強または改変するための広範な生物の形質転換
を可能にする。

【００２３】非制限的例として、本発明のタンパク質および核酸は、植物種において、そし
てこのように遺伝的に変化された植物に由来する物質を組み込む食物品目におい
て、リグナンのレベルを上昇させるか、さもなければ変化させるように利用され
得る。デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼをコー
ドする核酸配列、またはデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレ
ダクターゼをコードする核酸配列の全てまたは一部に相補的なアンチセンス核酸
フラグメントが、適切なように、以下を含むがこれらに限定されない種々の目的
のために任意の植物種に導入され得る：木質組織（特に、芯材組織）の色、木目
、耐久性、および病害虫体生を変化または改変すること；植物種におけるリグナ
ンおよび／またはリグニンの形成を減少または改良させること；パルプ生成およ
び紙生成において利用される植物種のリグナン／リグニン含量の減少または変化
させ、それによりよりパルプ生成および紙生成を容易にかつより安価にすること
；捕食者および病原体に対する植物の防御能力を、防御リグナンまたはリグニン
の生成を増強することによって改良すること；リグナンまたはリグニンにより媒
介される他の生態学的相互作用の変化；デヒドロジコニフェリルアルコールベン
ジルエーテルレダクターゼまたはその生成物の生成を導入、増強、または阻害す
ること。デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼをコ
ードする核酸配列は、以下を含むがこれらに限定されない種々の目的のために、
任意の生物に導入され得る：デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテ
ルレダクターゼの生成、あるいはその酵素生成物またはこれらの誘導体の生成を
導入、増強、または阻害すること。

【００２４】当該分野において周知のＮ末端輸送配列（例えば、ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ，Ｇ
．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ１８０：５３５〜５４５（１９８９）；Ｓ
ｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ＮＹ，７６９頁（１９８８）を参照のこと）を使用して、デヒドロジ
コニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質を、種々の細
胞局在または細胞外局在に指向し得る。

【００２５】欠失、置換、変異および／または挿入によって生成され得る野生型デヒドロジ
コニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼのクローンの配列改変体
は、先行技術によって限定される範囲を除き、本発明の範囲内であることが意図
される。デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼのア
ミノ酸配列改変体は、例えば、部位特異的変異と一般的に言われる技術を使用す
ることにより、野生型デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダ
クターゼをコードするＤＮＡ配列を変異することによって構築され得る。現在、
この分野において周知である種々のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法（例え
ば、ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔ
ｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットのような２つのプライマーの系）が、この
目的のために使用され得る。。

【００２６】この系における標的プラスミドの変性の後に、２つのプライマーを同時にプラ
スミドにアニールする；こららのプライマーの１つは、所望の部位特異的変異を
含み、他方は、制限部位を除去を生じるプラスミド中の別の点変異を含む。次に
、第２鎖合成を行い、これた２つの変異を密接に連結させ、生じるプラスミドを
Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＳ株中に形質転換する。プラスミドＤＮＡを形質転換した
細菌から単離し、関連する制限酵素を用いて制限し（それによって、変異されて
いないプラスミドが直鎖状となる）、次に、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換する。この
系は、サブクローニングまたは１本鎖ファージミドの生成の必要がなく、発現プ
ラスミド中に直接的に変異を生成することを可能とする。２つの変異の密接な連
結、およびその後の変異されていないプラスミドの直鎖状化は、高い変異効率を
生じ、そして最小限のスクリーニングを可能とする。最初の制限部位プライマー
の合成に続き、この方法は、変異部位１つあたり、１つの新しいプライマーのタ
イプのみの使用を必要とする。所定の部位に所望の変異の全てを同時に導入する
ために、各位置の変異体を別々に調製するよりもむしろ、一組の「設計された縮
重」のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し得る。形質転換体を、変異導入さ
れた領域にわたってプラスミドＤＮＡを配列決定することによって、スクリーニ
ングし、変異型クローンを同定および分類し得る。次に、各変異ＤＮＡを、制限
し、そしてＭｕｔａｔｉｏｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔゲ
ル（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）での電気泳動によって分析し、配列における他の変異
が生じていないことを確認する（変異誘発していないコントロールと比較するバ
ンドのシフトによる）。

【００２７】確認された変異二重鎖を、もしまだこのタイプのベクター中にクローニングさ
れていないならば、複製可能な発現ベクター中にクローニングし得、そして生じ
る発現構築物使用して、変異型タンパク質の高レベル産生およびその後のタンパ
ク質の精製のために、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株のような
Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換する。ＦＡＢ−ＭＳマッピングの方法を使用して、変
異体発現の忠実度を迅速に確認し得る。この技術は、タンパク質全体にわたるセ
グメントの配列決定を提供し、そして配列の割り当てにおける必要な信頼性を提
供する。このタイプのマッピング実験において、タンパク質をプロテアーゼで消
化しする（このセグメントは、最も興味のあるところであり、そして残りのマッ
プは、変異誘発していないタンパク質のマップと同一であるべきであるので、そ
の選択は、改変した特定の領域に依存する）。一組の切断フラグメントを、微小
口径ＨＰＬＣ（逆相またはイオン交換、再度、改変する特定の領域に依存する）
によって分画し、各画分中のいくつかのペプチドを提供し、そしてこれらのペプ
チドの分子量をＦＡＢ−ＭＳによって決定する。次に重量を、予測された配列の
消化から予想されるペプチドの分子量と比較し、配列の正確性を迅速に確認する
。この変異誘発アプローチは、タンパク質改変に対して向けられるものなので、
ＭＳが予測と一致するならば、改変されたペプチドの配列決定は必要でない。変
化した残基の確認が必要な場合、ＣＡＤ−直列ＭＳ／ＭＳを使用して、問題の混
合物のペプチドを配列決定し得るか、または、改変の位置に依存して、標的タン
パク質を、サブトラクティブ（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）エドマン分解またはカ
ルボキシペプチダーゼＹ消化のために精製する。

【００２８】特定の部位特異的変異の設計において、第１に、非保存的置換（例えば、Ｃｙ
ｓ、ＨｉｓまたはＧｌｕの代わりにＡｌａ）を作製することが一般に所望され、
そして結果として、活性が非常に損なわれるか決定する。次に、変異誘発された
タンパク質の性質を、改変された機能の敏感な指標としてＫ_mおよびｋ_catの速度
論的パラメーターに特に注意して試験する。このパラメーターから、天然の酵素
との比較によって、結合自体および／または触媒自体の変化が推定され得る。も
しその残基が、この手段によって、活性の障害、またはノックアウトによって重
要であると実証されるならば、保存的置換（例えば、側鎖長を変化するためのＧ
ｌｕの代わりのＡｓｐ、Ｃｙｓの代わりのＳｅｒ、Ｈｉｓの代わりのＡｒｇ）を
作製し得る。疎水性セグメントについて、変化させるのは、主としてサイズであ
るが、アルキル側鎖を芳香族にも置換し得る）。通常の産物の分布における変化
は、反応順序のどの工程が変異によって変更されたのか示し得る。

【００２９】他の部位特異的変異誘発技術もまた、本発明のヌクレオチド配列とともに使用
し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭｏｌｕｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：
ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ（
１９８９））の１５．３節に記載されるように、ＤＮＡの制限エンドヌクレアー
ゼ消化、およびその後の連結を使用して、デヒドロジコニフェリルアルコールベ
ンジルエーテルレダクターゼ改変体を生成し得る。類似の戦略を使用して、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋらの１５．３節（前出）に記載されるように、挿入改変体を構築し
得る。

【００３０】オリゴヌクレオチドによる変異誘発もまた、本発明の置換変異の調製のために
使用し得る。オリゴヌクレオチドによる変異誘発はまた、本発明の欠失および挿
入改変体を都合よく調製するために使用し得る。この技術は、Ａｄｅｌｍａｎら
（ＤＮＡ２：１８３（１９８３））に記載される技術において周知である。一
般に、少なくとも、２５オリゴヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを、デヒド
ロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ遺伝子の２つ以上の
ヌクレオチドの挿入、欠失、置換のために使用し得る。最適なオリゴヌクレオチ
ドは、変異をコードするヌクレオチドのいずれかの鎖のヌクレオチドについて、
１２〜１５完全にマッチするオリゴヌクレオチドを有する。野生型デヒドロジコ
ニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼの変異誘発のために、オリ
ゴヌクレオチドを、適切なハイブリダイゼーション条件下で１本鎖ＤＮＡ鋳型分
子とアニールする。次に、ＤＮＡ重合酵素（通常、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメ
ラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント）を添加する。この酵素は、オリゴヌクレ
オチドをプライマーとして使用して、変異を有するＤＮＡ鎖合成を完了する。従
って、ＤＮＡの１つの鎖が、ベクター中に挿入された野生型デヒドロジコニフェ
リルアルコールベンジルエーテルレダクターゼをコードし、そしてＤＮＡの第２
鎖が、同一のベクター中に挿入された変異型形態のデヒドロジコニフェリルアル
コールベンジルエーテルレダクターゼをコードするように、ヘテロ二重鎖分子が
形成される。次に、このヘテロ二重鎖分子を、適切な宿主に形質転換する。

【００３１】置換された１つより多いアミノ酸を有する変異体を、いくつかの方法の１つに
おいて生成し得る。そのアミノ酸がポリペプチド鎖中でともに近接して位置する
場合、全ての所望されるアミノ酸置換をコードする１つのオリゴヌクレオチドを
使用して、同時に変異させ得る。しかし、アミノ酸がお互いにいくらか離れて位
置する場合（例えば、１０より多いアミノ酸によって離れる）、全ての所望の変
化をコードする１つのオリゴヌクレオチドを生成することは、より困難である。
その代わり、２つの代替的な方法の１つを使用し得る。第１の方法において、置
換される各アミノ酸について別々のオリゴヌクレオチドを生成する。次に、オリ
ゴヌクレオチドを同時に、１本鎖鋳型ＤＮＡにアニールし、鋳型より合成される
ＤＮＡの第２鎖は、全ての所望されるアミノ酸置換をコードする。

【００３２】代替的な方法は、所望の変異体を生成するために、２回以上の変異誘発の回を
含む。第１回は、単一の変異について記載されるとおりである：野生型デヒドロ
ジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼＤＮＡを鋳型のために
使用して、第１の所望されるアミノ酸置換（単数または複数）をコードするオリ
ゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールして、次に、ヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子を生
成する。変異誘発の第２回は、変異誘発の第１回において生成された変異ＤＮＡ
を鋳型として利用する。従って、この鋳型は、既に１つ以上の変異を含む。次に
、さらなる所望されるアミノ酸置換（単数または複数）をコードするオリゴヌク
レオチドを、この鋳型とアニールし、ここで、生じるＤＮＡの鎖は、第１回およ
び第２回の両方の変異誘発からの変異をコードする。この生じるＤＮＡを、第３
回の変異誘発などにおいて鋳型として使用し得る。

【００３３】真核生物発現系は、任意の必要とされる翻訳後修飾を行い得、そして酵素を適
切な膜局在に指向し得るので、真核生物発現系を、デヒドロジコニフェリルアル
コールベンジルエーテルレダクターゼ産生のために利用し得る。本発明のデヒド
ロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼの発現のために、こ
の目的のための代表的な真核生物発現系は、組換えバキュロウイルスであるＡｕ
ｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ；
Ｍ．Ｄ．ＳｕｍｍｅｒｓおよびＧ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ、ＡＭａｎｕａｌｏｆ
ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓａｎｄ
ＩｎｓｅｃｔＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（１９８６）
；Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７−５５（１９８７
））を使用する。組換えバキュロウイルスを用いる昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄ
ｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ種の細胞）の感染は、デヒドロジコニフェ
リルアルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質の大量の産生を可能と
する。さらに、バキュロウイルス系は、組換えデヒドロジコニフェリルアルコー
ルベンジルエーテルレダクターゼの産生について、他の重要な利点を有する。例
えば、バキュロウイルスは、ヒトに感染せず、従って、安全に大量に操作し得る
。バキュロウイルス系において、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエ
ーテルレダクターゼをコードするＤＮＡセグメントおよびベクターを含むＤＮＡ
構築物を、調製する。このベクターは、バキュロウイルスの多角体遺伝子プロモ
ーター領域、組換えの間の適切な交差に必要なバキュロウイルス側方配列（プロ
モーター配列に隣接する約２００〜３００塩基対を含む側方配列）、および構築
物を細菌中で複製させる細菌の複製起点を含み得る。このベクターは、（ｉ）Ｄ
ＮＡセグメントが、多角体遺伝子プロモーターに隣接して配置され（または多角
体遺伝子プロモーターに作動可能に連結されるか、「下流」にあるか、「制御下
」にある）、そして（ｉｉ）プロモーター／デヒドロジコニフェリルアルコール
ベンジルエーテルレダクターゼの組み合わせが、両側で、バキュロウイルスＤＮ
Ａの２００〜３００塩基対（側方配列）によって隣接される。

【００３４】デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼＤＮＡ構築
物を生成するために、全長デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテル
レダクターゼをコードするｃＤＮＡクローンを、本明細書において記載されるよ
うな方法を使用して得る。このＤＮＡ構築物を、適切なバキュロウイルスのバキ
ュロウイルスＤＮＡ（すなわち、その構築物においてコードされるプロモーター
と同一種のバキュロウイルスのもの）と、組換えが生じる条件下で、宿主細胞中
で接触する。生じる組換えバキュロウイルスは、全長デヒドロジコニフェリルア
ルコールベンジルエーテルレダクターゼをコードする。例えば、昆虫宿主細胞を
、ＤＮＡ構築物および機能的バキュロウイルスを用いて、同時トランスフェクト
し得るか、または別々にトランスフェクトし得る。次に、生じる組換えバキュロ
ウイルス単離して、細胞に感染するために使用して、デヒドロジコニフェリルア
ルコールベンジルエーテルレダクターゼの産生を生じる。宿主昆虫細胞としては
、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞が挙げられる。次
に、本発明の組換えバキュロウイルスによって感染された昆虫宿主細胞を、バキ
ュロウイルスによってコードされるデヒドロジコニフェリルアルコールベンジル
エーテルレダクターゼを発現させるために培養する。このようにして、組換えタ
ンパク質が産生され、次に、当該分野において公知の方法を使用して、細胞から
抽出する。

【００３５】他の真核生物微生物（例えば、酵母）もまた使用して、本発明を実施し得る。
パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般に使用さ
れる酵母であるが、いくつかの他の株も利用可能である。プラスミドＹＲｐ７（
Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇ
ｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅ
ｎｅ１０：１５７（１９８０））が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発
現ベクターとして一般に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中で増
殖する能力を欠く変異型酵母株（例えば、ＡＴＣＣ第４４，０７６番株およびＰ
ＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ８５：１２（１９７７））株）に
ついての選択マーカーを提供する。次に、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔ
ｒｐ１の損傷の存在が、トリプトファンの非存在下での増殖による形質転換体の
検出のための効果的な環境を提供する。酵母宿主細胞は、一般に、Ｈｉｎｎｅｎ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：１９２９（１９７
８））によって記載されるように、ポリエチレングリコール法を使用して形質転
換される。さらなる酵母形質転換プロトコールが、Ｇｉｅｔｚら、Ｎ．Ａ．Ｒ．
２０（１７）：１４２５（１９９２）；Ｒｅｅｖｅｓら、ＦＥＭＳ９９：１９
３−１９７（１９９２）に示される。

【００３６】酵母ベクターにおける適切なプロモーティング配列は、３−ホスホグリセレー
トキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３
（１９８０））または他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ
Ｒｅｇ．７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ１７：４９００（１９７８））（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド
−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキ
シラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−イソメラーゼ、３−ホス
ホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメ
ラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）についてのプ
ロモーターが挙げられる。適切な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝
子と関連する終結配列もまた、発現が所望される配列の３’側の発現ベクター中
に連結されて、ｍＲＮＡおよび終結のポリアデニル化を提供する。増殖条件によ
り制御される転写のさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する
分解酵素、および上述のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、ならびにマルトースよびガラクトース利用を担う酵素についてのプロモータ
ー領域である。酵母適合性プロモーター、複製起点および終結配列を含む任意の
プラスミドベクターが適切である。

【００３７】多細胞生物（例えば、植物）由来の細胞培養物を宿主として用いて、本発明を
実施し得る。トランスジェニック植物は、例えば、デヒドロジコニフェリルアル
コールベンジルエーテルレダクターゼおよび選択マーカー遺伝子（例えば、カナ
マイシン耐性をコードするｋａｎ遺伝子）をコードするプラスミドを、Ｈｏｅｃ
ｋｅｍａら、Ｎａｔｕｒｅ３０３：１７９〜１８１（１９８３）に記載される
ようなヘルパーＴｉプラスミドを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｉｆ
ａｃｉｅｎｓ中へ移入し、そしてＡｎら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ
８１：３０１〜３０５（１９８６）によって記載されるように形質転換される植
物の葉の切片とともにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を培養することによって
、得られ得る。培養された植物宿主細胞の形質転換は、通常、上記のように、Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓを通して達成される。哺乳
動物の宿主細胞および他の宿主細胞（これは、硬い細胞膜の障壁を有さない）の
培養物は、通常、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎｄｅｒＥｂ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
５２：５４６（１９７８））によって元々記載され、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ
ら、前出の１６．３２〜１６．３７の節に記載されるように改変されたリン酸カ
ルシウム法を用いて形質転換される。しかし、ＤＮＡを細胞中に導入するための
他の方法（例えば、ポリブレン（ＫａｗａｉおよびＮｉｓｈｉｚａｗａ、Ｍｏｌ
．Ｃｅｌｌ。Ｂｉｏｌ．４：１１７２（１９８４））、プロトプラスト融合（Ｓ
ｃｈａｆｆｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：２
１６３（１９８０））、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ
Ｊ．１：８４１（１９８２））、および核への直接的なマイクロインジェンク
ション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ２２：４７９（１９８０）））もまた使
用され得る。さらに、動物の形質転換戦略が、ＭｏｎａｓｔｅｒｓｋｙＧ．Ｍ
．およびＲｏｂｌ，Ｊ．Ｍ．、ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｉｎＴｒａｎｓｇｅｎ
ｉｃＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＡＳＭＰｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔ
ｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９５）において総説される。形質転換された植物カルスは
、例えば、カナマイシンおよび適切な量の植物ホルモン（例えば、カルスおよび
シュートの誘導のためのナフタレン酢酸およびベンジルアデニン）を含む培地で
細胞を増殖させることによって、選択マーカーを通じて選択され得る。次いでこ
の植物細胞は、再生され、そして得られた植物は、当業者に周知の技術を用いて
土壌へ移される。

【００３８】さらに、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼを
コードする核酸配列は、誘導性である必要なプロモーターとともに植物中に組込
まれ得る。本発明のこの実施態様における実施において、特定の外部刺激または
内部刺激に対してのみ応答するプロモーターが、標的ｃＤＮＡに融合される。従
って、この遺伝子は、特定の刺激に対する応答においてを除き転写されない。こ
の遺伝子が転写されない限り、この遺伝子産物は、産生されない。

【００３９】本発明の実施において使用され得る応答性プロモーター系の例示的な例は、ト
ウモロコシのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）系である。ＧＳ
Ｔは、発芽前処理用除草剤としてしばしば使用される多くの疎水性求電子性化合
物を解毒し得る酵素のファミリーである（Ｗｅｉｇａｎｄら、ＰｌａｎｔＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ７：２３５〜２４３（１９８６））。研究に
より、ＧＳＴがこの除草剤耐性の増強をもたらすのに直接的に関与するというこ
とが示されている。この作用は、主に、特定の１．１ｋｂのｍＲＮＡ転写産物を
通じて媒介される。簡単に言うと、トウモロコシは、既存の天然に存在する静止
遺伝子を有し、これは、外部刺激に応答し得、かつ遺伝子産物の産生を誘導し得
る。この遺伝子は、あらかじめ同定されそしてクローン化されている。従って、
本発明の１つの実施態様において、プロモーターは、ＧＳＴ応答遺伝子から除去
され、そしてその除去された天然のプロモーターを予め有するデヒドロジコニフ
ェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ遺伝子に連結される。この操作
された遺伝子は、外部の化学的刺激およびデヒドロジコニフェリルアルコールベ
ンジルエーテルレダクターゼタンパク質の首尾良い産生を担う遺伝子に応答する
プロモーターの組合わせである。

【００４０】上記の方法に加えて、クローン化ＤＮＡを広範な種々の植物種（裸子植物、被
子植物、単子葉植物および双子葉植物を含む）に移入するためのいくつかの方法
は、当該分野において公知である（例えば、ＧｌｉｃｋおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ
編、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９３）を
参照のこと）。代表的な例としては、プロトプラストによるエレクトロポレーシ
ョンが容易なＤＮＡの取り込み（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０（４
８４９）：２０４〜２０７（１９８８））；ポリエチレングリコールを用いたプ
ロトプラストの処理（Ｌｙｚｎｉｋら、ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢＩ
ｏｌｏｇｙ１３：１５１〜１６１（１９８９））；およびＤＮＡ積載微粒子銃
を用いた細胞のボンバードメント（Ｋｌｅｉｎら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ
．９１：４４０〜４４４（１９８９）およびＢｏｙｎｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０（４８５８）：１５３４〜１５３８（１９８８））が、挙げられる。例
えば、穀物類の形質転換について多数の方法が、ここに存在する（例えば、Ｍｃ
ｋｉｎｎｏｎ，Ｇ．Ｅ．およびＨｅｎｒｙ，Ｒ．Ｊ．、Ｊ．ＣｅｒｅａｌＳｃ
ｉｅｎｃｅ２２（３）：２０３〜２１０（１９９５）；Ｍｅｎｄｅｌ．Ｒ．Ｒ
．およびＴｅｅｒｉ，Ｔ．Ｈ．、ＰｌａｎｔａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＢ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｉｅｓ，３：８１〜９８
、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９５）；Ｍ
ｃＥｌｒｏｙ，Ｄ．およびＢｒｅｔｔｅｌｌ，Ｒ．Ｉ．Ｓ．、Ｔｒｅｎｄｓｉ
ｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ，１２（２）：６２〜６８（１９９４）；Ｃｈｒ
ｉｓｔｏｕら、ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０（７）
：２３９〜２４６（１９９２）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．およびＦｏｒｄ，Ｔ．
Ｌ．、ＡｎｎａｌｓｏｆＢｏｔａｎ、７５（５）：４４９〜４５４（１９９
５）；Ｐａｒｋら、ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ、３２（６
）：１１３５〜１１４８（１９９６）；Ａｌｔｐｅｔｅｒら、ＰｌａｎｔＣｅ
ｌｌＲｅｐｏｒｔ、１６：１２〜１７（１９９６）を参照のこと）。さらに、
植物の形質転換戦略および技術は、Ｂｉｒｃｈ，Ｒ．Ｇ．、ＡｎｎＲｅｖＰ
ｌａｎｔＰｈｙｓＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ４８：２９７（１９９７
）；Ｆｏｒｅｓｔｅｒら、Ｅｘｐ．Ａｇｒｉｃ．３３：１５〜３３（１９９７）
において総説される。マイナーなバリエーションは、これらの技術を広範な植物
種に適用可能にし得る。

【００４１】これらの技術の各々は、利点および欠点を有する。この技術の各々のおいて、
プラスミドからのＤＮＡは、遺伝的に操作されて、その結果、それは、目的の遺
伝子のみを含むだけでなく、選択可能でかつスクリーニング可能なマーカー遺伝
子も含む。選択可能なマーカー遺伝子を使用して、プラスミド（この構築の結果
、目的の遺伝子および選択可能でかつスクリーニング可能な遺伝子がユニットと
して移動される）のコピーを組み込んだ細胞のみを選択し得る。スクリーニング
可能な遺伝子は、目的の遺伝子を保有する細胞のみの首尾良い培養について別の
検査基準を提供する。一般的に使用される選択可能なマーカー遺伝子は、ネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）である。この遺伝子は、
カナマイシン（細胞が増殖する増殖培地に直接添加され得る化合物）に対する耐
性を付与する。植物細胞は、通常、カナマイシンに対して感受性であり、そして
その結果枯死する。ＮＰＴＩＩ遺伝子の存在は、カナマイシンのこの効果を克
服し、そしてこの遺伝子を有する各細胞は、生存したままである。本発明の実施
において使用され得る別の選択可能なマーカー遺伝子は、除草剤グルホシネート
（Ｂａｓｔａ）に対する耐性を付与する遺伝子である。一般に使用される選択可
能な遺伝子は、β−グルクロニダーゼ遺伝子である。この遺伝子の存在は、組織
化学的反応を用いて特徴付けられる。この反応において、形質転換されたと推定
される細胞のサンプルは、ＧＵＳアッセイ溶液を用いて処理される。適切なイン
キュベーションの後、ＧＵＳ遺伝子を含む細胞は、青色に変化する。好ましくは
、プラスミドは、選択マーカー遺伝子およびスクリーニング可能なマーカー遺伝
子の両方を含む。

【００４２】１つ以上のこれらの遺伝子を含むプラスミドは、植物のプロトプラストまたは
カルス細胞のいずれかに、以前に述べた任意の技術によって導入される。マーカ
ー遺伝子が選択可能な遺伝子である場合、ＤＮＡパッケージを組み込まれた細胞
のみが、適切な植物毒素剤を用いた選択下で生存する。一旦この適切な細胞が同
定され、そして増殖させると、植物が再生する。形質転換された植物からの子孫
は、ＤＮＡパッケージが植物ゲノムへ首尾良く組み込まれたことを保証するため
に試験しなければならない。

【００４３】哺乳動物宿主細胞はまた、本発明の実施において使用され得る。適切な哺乳動
物細胞株の例としては、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−
７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株２９３Ｓ（Ｇｒａｈａｍら、
Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細
胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｕ
ｒｌａｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ
７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅ
ｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３（１９８０））；サル腎臓細胞（Ｃ
ＶＩ−７６、ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲ
Ｏ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴ
ＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣｌ３４）；バッフ
ァローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細
胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８
０６５）；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ラ
ット肝癌細胞（ＨＴＣ、ＭＬ５４、Ｂａｕｍａｎｎら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ
．８５：１（１９８０））；およびＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎｎａｌ
ｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４（１９８２））が挙げられる。こ
れらの細胞についての発現ベクターは、通常（必要ならば）、複製起点、発現さ
れるべき遺伝子の前に位置するプロモーター、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプ
ライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター部位についてのＤ
ＮＡ配列を含む。

【００４４】哺乳動物発現ベクターにおいて使用されるプロモーターは、しばしばウイルス
起源である。これらのウイルス性プロモーターは、一般に、ポリオーマウイルス
、アデノウイルス２、および最も頻繁にはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由
来である。このＳＶ４０ウイルスは、初期プロモーターおよび後期プロモーター
と呼ばれる２つのプロモーターを含む。これらのプロモーターは、特に有用であ
る。なぜならば、それらは、両方共に、ウイルス複製起点をまた含むひとつのＤ
ＮＡフラグメントのようなウイルスから容易に得られるからである（Ｆｉｅｒｓ
ら、Ｎａｔｕｒｅ２７３：１１３（１９７８））。小さいまたは大きいＳＶ４
０ＤＮＡフラグメントもまた、それらが、ウイルスの複製起点に位置するＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位に向かって広がる約２５０ｂｐの配列を含む場
合に使用され得る。

【００４５】あるいは、外来遺伝子（相同なプロモーター）と天然に付随するプロモーター
は、それらが、形質転換のために選択された宿主細胞株に適合する場合、使用さ
れ得る。

【００４６】複製起点は、異種供給源（例えば、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポ
リオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）から得られ得、そしてクローニングベクタ
ー中へ挿入され得る。あるいは、複製起点は、宿主細胞の染色体複製機構により
提供され得る。外来遺伝子を含むベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれる場
合、後者はしばしば十分である。

【００４７】二次ＤＮＡコード配列の使用は、形質転換された細胞株におけるデヒドロジク
ニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質の産生レベルを
増強し得る。この二次コード配列は、代表的には、酵素ジヒドロ葉酸レダクター
ゼ（ＤＨＦＲ）を含む。ＤＨＦＲの野生型は、通常、化学物質メトトレキサート
（ＭＴＸ）により阻害される。細胞におけるＤＨＦＲ発現レベルは、培養した宿
主細胞へ添加されたＭＴＸの量に依存して変化する。ＤＨＦＲを二次配列として
特に有用にする、ＤＨＦＲのさらなる特徴は、これが形質転換された細胞を同定
するための選択マーカーとして使用され得ることである。ＤＨＦＲの２つの形態
は、二次配列、野生型ＤＨＦＲ、およびＭＴＸ耐性ＤＨＦＲとしての使用に適用
可能である。特定の宿主細胞において使用されるＤＨＦＲの型は、宿主細胞がＤ
ＨＦＲ欠損（その結果、宿主細胞は非常に低いレベルのＤＨＦＲを内因的に産生
するか、または機能的ＤＨＦＲを全く産生しないかのいずれかとなる）であるか
否かに依存する。ＤＨＦＲ欠損細胞株（例えば、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉ
ｎ、前出に記載されるＣＨＯ細胞株）は、野生型ＤＨＦＲコード配列で形質転換
される。形質転換後、これらのＤＨＦＲ欠損細胞株は、機能的ＤＨＦＲを発現し
、そして栄養素ヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠く培養培地におい
て増殖し得る。形質転換されなかった細胞は、この培地において生存できない。

【００４８】ＤＨＦＲのＭＴＸ耐性形態は、ＭＴＸ感受性である、正常な量の機能的ＤＨＦ
Ｒを内因的に産生する宿主細胞において形質転換された宿主細胞を選択するため
の手段として使用され得る。ＣＨＯ−ＫＩ細胞株（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＬ６１）
は、これらの特徴を有し、従って、この目的のための有用な細胞株である。細胞
培養培地へのＭＴＸの添加は、ＭＴＸ耐性ＤＨＦＲをコードするＤＮＡで形質転
換された細胞のみを増殖させ得る。形質転換されなかった細胞は、この培地では
生存不可能である。

【００４９】原核生物もまた、本発明の最初のクローニング工程のために宿主細胞として使
用され得る。これらは、多量のＤＮＡの迅速な生成、部位特異的変異誘発に使用
される一本鎖ＤＮＡ鋳型の産生、多くの変異体を同時にスクリーニングすること
、および生成される変異体のＤＮＡ配列決定のために特に有用である。適切な原
核生物宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２株２９４（ＡＴＣＣＮｏ．３
１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１００（ＡＴＣＣＮｏ．２７，３２５）、
Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣＮｏ．３１，５３７）、およびＥ．ｃｏ
ｌｉＢが挙げられる；しかしＥ．ｃｏｌｉの他の多くの株（例えば、ＨＢ１０
１、ＪＭ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９）ならびに多くのほかの
種および以下を含む原核生物の属がすべて宿主として使用され得る：Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓのようなｂａｃｉｌｌｉ、他の腸内細菌科（例えば、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ，またはＳｅｒｒａｔｉａｍａ
ｒｃｅｓａｎｓ）および種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種。原核生物宿主胃細胞
または硬い細胞壁を有する他の宿主細胞は、好ましくは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
前出の節１．８２に記載されるような塩化カルシウム法を用いて形質転換される
。あるいは、エレクトロポレーションは、これらの細胞の形質転換に使用され得
る。原核生物の形質転換技術は、Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．、ＧｅｎｅｔｉｃＥｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ，１２：
２７５〜２９６、ＰｌｅｎｕｍＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｒｐ．（１９９０
）；Ｈａｎａｈａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０４：６３（１９９１
）に示される。

【００５０】代表的な例としては、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレ
ダクターゼをコードするｃＤＮＡ配列が、異種宿主としてＥ．ｃｏｌｉにおける
過剰発現のために市販されている（Ｈｉｓ）６・ＴａｇｐＥＴベクター（Ｎｏ
ｖａｇｅｎから）に移入され得る。このｐＥＴ発現プラスミドは、高レベルの異
種発現系においていくつか利点を有する。所望のｃＤＮＡインサートは、６つの
ヒスチジン、それに続く、標的タンパク質のアミノ末端コドンに結合される非常
に特異的なプロテアーゼ認識部位（トロンビン）をコードするプラスミドベクタ
ー配列にインフレームで連結される。発現された融合タンパク質のヒスチジン「
ブロック」は、固定された金属イオンへの非常に強固な結合を促進し、そして固
定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによる組換えタンパク質
の迅速な精製を可能にする。次いで、ヒスチジンリーダー配列は、精製タンパク
質のトロンビンでの処理により特定のタンパク質分解部位で切断され、そしてデ
ヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質が溶
出される。この過剰発現精製系は、高い能力、優れた分解能を有し、そして速く
、そして同じ結合挙動を示す（トロンビンでのタンパク質分解の前後）Ｅ．ｃｏ
ｌｉタンパク質の混入の機会は、非常に小さい。

【００５１】当業者に明白であるように、宿主細胞に適合する種から誘導されるレプリコン
およびコントロール配列を含有する任意のプラスミドベクターがまた、本発明の
実施に用いられ得る。このベクターは通常、複製部位、形質転換細胞に表現型選
択を提供するマーカー遺伝子、１つ以上のプロモーター、および外来ＤＮＡの挿
入のためのいくつかの制限部位を含有するポリリンカー領域を有する。Ｅ．ｃｏ
ｌｉの形質転換のために代表的に用いられるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２
、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣＩ１８、ｐＵＣ１１９、およびＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔＭ１３（これらすべては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、の第１．１２
節〜第１．２０節に記載される）が挙げられる。しかし、多くの他の適切なベク
ターが同様に利用可能である。これらのベクターは、アンピシリン耐性および／
またはテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子を含み、これらのベクターで形
質転換された細胞がこれらの抗生物質の存在下で、増殖することを可能にする。

【００５２】原核生物ベクターで最も通常に用いられるプロモーターとしては、βラクタマ
ーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（ＣｈａｎｇらＮａ
ｔｕｒｅ３７５：６１５（１９７８）；Ｉｔａｋｕｒａら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
１９８：１０５６（１９７７）；ＧｏｅｄｄｅｌらＮａｔｕｒｅ２８１：
５４４（１９７９））およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅ
ｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）；ＥＰ
ＯＡｐｐｌ．Ｐｕｂｌ．第３６，７７６号）、ならびにアルカリホスファター
ゼ系が挙げられる。これらが最も通常に用いられるが、他の微生物プロモーター
が利用されており、そしてそれらのヌクレオチド配列に関する詳細は公開されて
おり、当業者は、それらをプラスミドベクターに機能的に連結することが可能で
ある（例えば、Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ２０：２６９（１９８０）
を参照のこと）。

【００５３】細胞から通常に分泌される多数の真核生物タンパク質は、アミノ酸配列の一部
として内因性分泌シグナル配列を含む。従って、細胞質で通常見出されるタンパ
ク質は、タンパク質へのシグナル配列の連結により分泌のために標的化され得る
。これは、このタンパク質をコードするＤＮＡの５’末端に、シグナル配列をコ
ードするＤＮＡを連結すること、次いで、この融合タンパク質を適切な宿主細胞
で発現することにより、容易に達成される。シグナル配列をコードするＤＮＡは
、シグナル配列を有するタンパク質をコードする任意の遺伝子から制限フラグメ
ントとして獲得され得る。従って、本発明を実行するために利用される宿主細胞
の型に依存して、原核生物、酵母、および真核生物のシグナル配列が本明細書に
おいて用いられ得る。例えば、ヒト成長ホルモン、プロインシュリンおよびプロ
アルブミンを含む、いくつかの真核生物遺伝子のシグナル配列部分をコードする
ＤＮＡおよびアミノ酸配列が公知であり（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙＷ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，
ＮＹ，７６９頁（１９８８）を参照のこと）、そして適切な真核生物宿主細胞に
おいて、シグナル配列として用いられ得る。酵母のシグナル配列（例えば、酸性
ホスファターゼ（Ａｒｉｍａら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１１：
１６５７（１９８３））、α因子、アルカリホスファターゼおよびインベルター
ゼ）が、酵母宿主細胞からの直接分泌に用いられ得る。例えば、ＬａｍＢまたは
ＯｍｐＦ（Ｗｏｎｇら、Ｇｅｎｅ６８：１９３（１９８８））、ＭａｌＥ、Ｐ
ｈｏＡ、またはβラクタマーゼならびに他の遺伝子をコードする遺伝子由来の原
核生物シグナル配列が、原核生物細胞から培養培地へタンパク質を標的するため
に用いられ得る。

【００５４】植物、動物および微生物由来の輸送配列が、本発明の実施において使用され、
細胞質、小胞体、小網、ミトコンドリア、または他の細胞成分へ遺伝子産物を指
向し得るか、または培地への輸送のためにタンパク質を標的し得る。このような
考察は、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼの過
剰発現、および任意の所望の位置で遺伝子産物の機能を可能にするための細胞ま
たはインタクトな生物内での発現の指向に適用する。

【００５５】複製配列、調節配列、表現形選択遺伝子および目的のデヒドロジコニフェリル
アルコールベンジルエーテルレダクターゼＤＮＡをコードするＤＮＡを含有する
適切なベクターの構築物は、標準的な組換えＤＮＡ手順を用いて調製される。単
離されたプラスミドおよびＤＮＡフラグメントは、当業者に周知のように切断さ
れ、あつらえられ、そして所望のベクターを特異的に生成するために一緒に連結
される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。

【００５６】上記で考察したように、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテル
レダクターゼの改変体は、好ましくは、部位特異的変異誘発の方法を用いて生成
される変位の手段により生成される。この方法は、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ
テンプレートに安定にハイブリダイズすることを可能にする所望の変位体の配列
および隣接する十分な数のヌクレオチドの両方をコードする特定のオリゴヌクレ
オチドの合成および使用を必要とする。

【００５７】上記は、以下の代表的な例と組み合わせてより完全に理解され得る。ここで、
「プラスミド」は、小文字のｐの後の英数字の記号表示により命名される。本発
明において用いられる開始プラスミドは、市販されているか、制限無く公的に利
用可能であるか、または公開された手順を用いてこのような利用可能なプラスミ
ドから構築され得るかのいずれかである。さらに、他の等価なプラスミドが当該
分野で公知であり、そして当業者に明白である。

【００５８】ＤＮＡの「消化」、「切断」、または「開裂」とは、ＤＮＡの特定の位置での
み作用する酵素でのＤＮＡの触媒的開裂をいう。これらの酵素は、制限エンドヌ
クレアーゼと呼ばれ、そしてそれぞれの酵素が開裂するＤＮＡ配列の部位は制限
部位と呼ばれる。本発明において用いられる制限酵素は、市販されており、そし
て製造業者により供給される指示に従って用いられる。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
前出、第１．６０節〜第１．６１節および弟３．３８節〜弟３．３９節もまた参
照のこと）。

【００５９】制限消化からのＤＮＡの所定のフラグメントの「回収」または「単離」は、電
気泳動によりポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上で得られるＤＮＡ
フラグメントの分離、公知の分子量のマーカーＤＮＡフラグメントの移動度と目
的のフラグメントの移動度の比較によるそのフラグメントの同定、所望のフラグ
メントを含むゲル切片の切り出し、およびＤＮＡからのゲルの分離を意味する。
この手順は一般的に公知である。例えば、Ｌａｗｎら（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄｓＲｅｓ．９：６１０３〜６１１４（１９８２））およびＧｏｅｄｄｅｌら
（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，前出）を参照のこと。

【００６０】（実施例１）（Ｐｉｎｕｓｔａｅｄａ由来のデヒドロジコニフェリルアルコールベンジル
エーテルレダクターゼのクローニング）他に示さない限り、以下の材料、方法および器具を、実施例１およびすべての
以降の実施例において用いた。

【００６１】植物材料：Ｐ．ｔａｅｄａ細胞懸濁液培養物を以前に記載の様に（ｖａｎＨ
ｅｅｒｄｅｎ，Ｐ．Ｓ．、Ｔｏｗｅｒｓ，Ｇ．Ｈ．Ｎ．＆Ｌｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１２３５０〜１２３５５（１９９６））、２
，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を含有する培地中で、維持した。
新鮮培地への移入の７日後に、濾過により細胞を収集し、液体窒素中で凍結し、
そして−８０℃で貯蔵した。

【００６２】一般的方法：全ての分子生物学的技術を、以下に表示的に記載されない限り、
標準的方法に従って実行した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．
Ｆ．＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第３巻、第３版（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
，ＮＹ，１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔ
ｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，第２巻（Ｇｒｅｅｎ
ｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎ
ｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９１））
。

【００６３】材料：用いられる全ての溶媒および化合物は、試薬またはＨＰＬＣ等級であっ
た。Ｔａｑ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをＰｒｏｍｅｇａから得た。コンピテン
トなＮｏｖａＢｌｕｅ細胞をＮｏｖａｇｅｎから購入し、そして放射線標識した
ヌクレオチド（［α^-32Ｐ］ｄＣＴＰ）をＤｕｐｏｎｔＮＥＮから購入した。
ｐＣＲＩＩＴＡクローニングキットをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。制
限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩをＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから
購入した。

【００６４】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および配列決定のためのオリゴヌクレオチド
プライマーをＧｉｂｃｏＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより
合成した。ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ（登録商標）キット（ＢＩＯ１０１Ｉ
ｎｃ．）を、１．５％アガロースゲルにおける低ＤＮＡ量ラダー（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）への比較により決定されたゲル精製したＤＮＡ濃度とともに、ＰＣＲフ
ラグメントの精製のために用いた。

【００６５】器具：ＵＶ（ＯＤ₂₆₀でのＲＮＡ決定およびＤＮＡ決定を含む）スペクトルを
ラムダ６ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計上で記録した。ＴｅｍｐｔｒｏｎｉｃＩＩサ
ーモサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ）を全てのＰＣＲ増幅に用いた。配列決
定のためのプラスミドＤＮＡの精製は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｍｏｄｅｌ３７３Ａ自動シーケンサーを用いて決定したＤＮＡ配列を用いて
、ＱＩＡｗｅｌｌＰｌｕｓプラスミド精製系（Ｑｉａｇｅｎ）、その後ＰＥ
Ｇ沈殿またはＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＰｌｕｓＳＶＭｉｎｉｐｒｅｐＤ
ＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した
。全ての高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離を、２８０ｎｍでの溶出
モニタリングを用いて、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ）またはＡ
ｌｌｉａｎｃｅ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ）の装置のいずれかで実行した。

【００６６】ＰｉｎｕｓｔａｅｄａｃＤＮＡライブラリーの合成：全ＲＮＡ（１００μ
ｇ／ｇ新鮮重量）を、上記のように増殖した凍結テーダマツ（Ｐｉｎｕｓｔａ
ｅｄａ）細胞から、ＤｏｎｇおよびＤｕｎｓｔｅｎ（Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ｚ．および
Ｄｕｎｓｔａｎ，Ｄ．Ｉ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ１５（１９
９６））の方法を用いて得た。Ｐ．ｔａｅｄａｃＤＮＡライブラリーを、初代
ライブラリーについて１×１０⁶ｐｆｕの力価で、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標
）合成キット、ＵｎｉＺＡＰ^TMＸＲベクター、およびＧｉｇａｐａｃｋ（登録
商標）ＩＩＧｏｌｄパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて
、５μｇの精製したポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ^TM Ｓｕｓ
ｐｅｎｓｉｏｎ，Ｑｉａｇｅｎ）を用いて構築した。増幅したライブラリー（１
×１０⁹ｐｆｕ／ｍｌ；総量１２０ｍｌ）をスクリーニングに用いた（Ｄｉｎｋ
ｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ，Ａ．Ｔ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、２９４
７３〜２９４８２（１９９６））。

【００６７】ＤＮＡプローブ合成：配列番号７に記載の核酸配列を有する、以前に単離され
たピノレシノール−ラリシレシノールリダクターゼｃＤＮＡ（ＰＬＲ−Ｆｉｌ）
（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ，Ａ．Ｔ．，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７１：２９４７３〜２９４８２（１９９６））の５’末端をプローブとして用
いて、類似の酵素／相同な酵素についてＰ．ｔａｅｄａｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングした。このプローブは以下のように構築した：精製した１０ｎ
ｇのｐＢＳＰＬＲ−Ｆｉｌプラスミド（クローニングプラスミドｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔＳＫ［−］に含まれたＰＬＲ−Ｆｉｌ）を、５００μｌのＰＣＲ反応
溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ９．０］、５０ｍＭＫＣｌ，０．１
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、各ｄＮＴＰ０．２
ｍＭおよび２．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）において、プライマ
ーＰＬＲＮＴ１（ＡＴ（Ａ／Ｔ／Ｃ）ＡＴ（Ａ／Ｔ／Ｃ）ＧＧＩＧＧＩＡＣ
ＩＧＧＩＴＡ）（配列番号８）（１００ｐｍｏｌ）およびプライマーＰＬ
ＲＩ５Ｒ（ＴＣ（Ｔ／Ｃ）ＴＣＩＡ（Ａ／Ｇ）ＩＧＴＩＡＣ（Ｔ／Ｃ）Ｔ
ＴＩＣＣ）（配列番号９）（１００ｐｍｏｌ）とともに、テンプレートとし
て用いた。ＰＣＲ増幅を以下のようにサーモサイクラーにおいて実行した：９４
℃１分の３５サイクル、５０℃２分および７２℃３分；７２℃５分、そして最終
サイクル後４℃で不定期間維持。５つの反応物を濃縮（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ３０
，ＡｍｉｃｏｎＩｎｃ．）し、そしてＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭＥＤＴＡ；２×２００μｌ）で洗浄し、続いて、ＴＥ
緩衝液（２×５０μｌ）中にＰＣＲ産物を回収した。ＰＬＲ−Ｆｉｌ５’末端
反応産物（約４００ｂｐのバンド）を分離用１．５％アガロースゲル中で分離し
、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ（登録商標）キット（ＢＩＯ１０１Ｉｎ
ｃ．）を用いてアガロースから精製した。ゲル精製したＰＬＲ−Ｆｉｌ５’末
端フラグメント（配列番号７）（５０ｎｇ）を、ＰｈａｒｍａｃｉａのＴ７Ｑｕ
ｉｃｋＰｒｉｍｅ（登録商標）キットおよび［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰで、キットの
指示に従って、用い、放射線標識プローブ（０．１ｍｌ中）を生成した。これを
、ＢｉｏＳｐｉｎ６カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を通して精製し、そしてキャリア
ＤＮＡ（０．９ｍｌの０．５ｍｇ／ｍｌのせん断サケ精子ＤＮＡ［Ｓｉｇｍａ］
）に添加した。

【００６８】ライブラリーのスクリーニング：６０００，０００ｐｆｕのＰ．ｔａｅｄａ増
幅ｃＤＮＡライブラリーを、Ｓｔｒａｒａｇｅｎｅの指示に従い、初回スクリー
ニングのためにプレーティングした。プラークをＭａｇｎａＮｙｌｏｎメンブ
レンサークル（ＭｉｃｒｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＩｎｃ．）上にブロッ
トした。次いでこれを風乾させた。このメンブレンをＷｈａｔｍａｎ（登録商標
）３ＭＭＣｈｒ紙の２層の間に挟んだ。ｃＤＮＡライブラリーファージＤＮＡ
をメンブレンに固定し、そして高速排気を伴う２分１００℃のオートクレーブ工
程により１段階で変性させた。このメンブレンを、６×標準生理食塩水クエン酸
（ＳＳＣ）および０．１％ＳＤＳ中で３７℃で３０分間洗浄し、そして結晶化シ
ャーレ（１９０×７５ｍｍ）中の、予め加熱した６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳお
よび５×デンハート試薬（ハイブリダイゼーション溶液、３００ｍｌ）中で、４
５℃で穏やかに振盪しながら５時間、プレハイブリダイズした。［³²Ｐ］放射線
標識プローブ（配列番号７）を、変性し（煮沸、１０分）、素早く冷却し（氷、
１５分）、そして結晶化シャーレ（１５０×７５ｍｍ）中、予め加熱した新鮮ハ
イブリダイゼーション溶液（６０ｍｌ、４５℃）に添加した。次に、このプレハ
イブリダイズしたメンブランをこのシャーレに添加した、次いで、これをプラス
チックラップでカバーした。穏やかに振盪しながら４５℃で１８時間ハイブリダ
イゼーションを実行した。この膜を、５分間室温で、４×ＳＳＣおよび０．５％
ＳＤＳ中で、洗浄し、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳに移し（室温で）、そし
て穏やかに振盪しながら２０分間４５℃でインキュベートし、乾燥しないように
プラスチックラップで覆い、そして最終的に−８０℃で２４時間ＫｏｄａｋＸ
−ＯＭＡＴＡＲフィルムに曝露し画面を増感させた。２０の陽性のプラークを
、上記のようなハイブリダイゼーション条件で、さらに２回のスクリーニングを
通じて精製した。

【００６９】推定レダクターゼタンパク質ｃＤＮＡ含有ファージミドのインビボでの切り出
しおよび配列決定：精製したｃＤＮＡクローンをＳｔｒａｔｅｇｅｎｅのインビ
ボ切り出しプロトコールに従ってファージからレスキューした。ＰＬＲ−Ｆｉｌ
に対して相同な遺伝子をコードするいくつかの異なるｃＤＮＡの両鎖を、重複す
る配列決定プライマーを用いて、完全に配列決定した。２つのｃＤＮＡを同定し
たが、これはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ［−］クローニングプラスミドへの
挿入の部位でそれらの５’非翻訳領域および３’非翻訳領域においてのみ異なっ
た。これらの２つのｃＤＮＡの間の差異は、クローニングの人為的影響であった
。従って、Ｆ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａのピノレシノール−ラリシレシノールリダ
クターゼに相同な単一の遺伝子のみが、このＰ．ｔａｅｄａ細胞懸濁液培養物ｃ
ＤＮＡライブラリーからクローニングされた。このリダクターゼ遺伝子のヌクレ
オチド配列は、上記の２つのリダクターゼｃＤＮＡの両方に対して共通である配
列を示す、配列番号１に示される。

【００７０】配列分析：ＤＮＡおよびアミノ酸配列分析をＵｎｉｘ−ｂａｓｅｄＧＣＧ
ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ，１９９４）；Ｒｉｃｅ，Ｐ．（ＴｈｅＳａｎｇｅｒＣ
ｅｎｔｒｅ，ＨｉｎｘｔｏｎＨａｌｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ
（１９９６））およびＥｘＰＡＳｙＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｓｅｒｖｅｒ（ＧｅｎｅｖａＵｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙＨｏｓｐｉｔａｌａｎｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｅｎｅｖａ
，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて実行した。

【００７１】（実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるデヒドロジコニフェリルアルコールベンジ
ルエーテルレダクターゼタンパク質の融合タンパク質としての発現）（デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク
質の融合タンパク質としてのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにおける発現）Ｐ．ｔａｅｄａ由来の推定レダクターゼのオープンリーディングフレームは、
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにおけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα相補性粒子と
インフレームであった。従って、その精製されたプラスミドＤＮＡを、Ｎｏｖａ
ｇｅｎの説明書に従って、ＮｏｖａＢｌｕｅ細胞に形質転換した。形質転換した
細胞（５ｍｌ培養）を、３７℃で振盪しながら（２２５ｒｐｍ）対数増殖期中期
（ＯＤ₆₀₀＝０．５）まで、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンおよび５０μ
ｇ／ｍｌアンピシリンを補充したＬＢ培地中で増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（
イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度が１０ｍＭになるまで
添加し、そして細胞を２時間増殖させた。細胞を遠心分離により収集し、そして
５００μｌ（５０ｍｌの培養チューブあたり）の緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭジチオスレイトール）に再懸濁した。次いで、リ
ゾチーム（０．１ｍｇ／ｍｌを５μ、ＲｅｓｅａｒｃｈＯｒｇａｎｉｃｓ，Ｉ
ｎｃ．）を添加し、１０分間インキュベートし、細胞を超音波処理することによ
り溶解した（３×１５秒）。１４，０００×ｇで４℃、１０分間の遠心分離の後
、上清を取り出し、そしてピノレシノール−ラリシレシノールレダクターゼおよ
びデヒドロジコニフェリルアルコールレダクターゼの両方の活性について、本明
細書中および実施例３に記載のようにアッセイした（アッセイあたり２１０μｌ
の上清）。β−ガラクトシダーゼ遺伝子のα相補性粒子との融合物としてのタン
パク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ抽出物においては、アッセイが２４時間インキュ
ベートさせたときすら、ピノレシノール−ラリシレシノールレダクターゼ活性は
観察されなかったが、同一な系を用いて、Ｆ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａから触媒的
に活性な（＋）−ピノレシノール／（＋）−ラリシレシノールレダクターゼを生
成した（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ，Ａ．Ｔ．，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７１：２９４７３−２９４８２（１９９６））。

【００７２】（ピノレシノール−ラリシレシノールレダクターゼ活性についての放射化学ア
ッセイ）ピノレシノールレダクターゼ活性を、［³Ｈ］ラリシレシノールおよ
び［³Ｈ］セコイソラリシレシノールの形成をモニタリングすることにより評価
した。ピノレシノールレダクターゼ活性についての各アッセイは、２０ｍＭＢ
ｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ｐＨ７．０、０．４ｍＭ（±）−ピノレシノール（
２０μｌＭｅＯＨ中に添加）および酵素調製物（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉから
の総タンパク質抽出物、２１０μｌ）からなっていた。酵素反応を、０．８ｍＭ
［４Ｒ−³Ｈ］ＮＡＤＰＨ（６．７９ＭＢｑ／ｍｍｏｌ）の添加により開始し
た。振盪しながら３０℃で３時間インキュベーションした後、アッセイ混合物を
、放射化学キャリアとして、（±）−ラリシレシノール（２０μｇ）および（±
）−セコイソラリシレシノール（２０μｇ）を含むＥｔＯＡｃ（５００μｌ）を
用いて抽出した。遠心分離（１７，０００×ｇ、５分）後、ＥｔＯＡｃ可溶性物
を取り出し、そして抽出手順を５００μｌのＥｔＯＡｃで続けた。各アッセイに
ついて、ＥｔＯＡｃ可溶性物を合わせ、アリコート（１００μｌ）を液体シンチ
レーションカウンティングを用いるその放射活性の決定のために取り出した。残
りの合わせたＥｔＯＡｃ可溶性物は、減圧下で乾燥するまでエバポレートし、Ｍ
ｅＯＨ／Ｈ₂Ｏ（３：７、１００μｌ）中で再構成し、そして逆相ＨＰＬＣに供
した。ラリシレシノールレダクターゼ活性を、［³Ｈ］セコイソラリシレシノー
ルの形成をモニタリングすることにより評価した。放射化学キャリアとして添加
した（±）−セコイソラリシレシノール（２０μｇ）とともに、０．４ｍＭ（±
）−ラリシレシノールを基質として使用したこと以外は、上記のとおり正確にア
ッセイを行った。ＨＰＬＣを以前に記載のように行って（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏ
ｓｔｏｖａ，Ａ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９４７３−２９
４８２（１９９６））、リグナン基質および生成物を分離した。簡潔には、逆相
カラムクロマトグラフィーとして、ＭｅＯＨ：３％酢酸（Ｈ₂Ｏ中）（３０：７
０）、０．５ｍｌ／分の流速からなるアイソクラチック溶媒系とともにＮｏｖａ
−ｐａｋＣ₁₈カラム（３．５ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を利用した。
０．５ｍｌの画分を、シンチレーションカウンティングのために収集して、アッ
セイ産物中の³Ｈ取り込みレベルを決定した。

【００７３】（ピノレシノール−ラリシレシノールレダクターゼ活性についての非放射活性
アッセイ）ピノレシノールレダクターゼ活性を、以下の例外とともに上記のよ
うに行ったアッセイにおいてさらに評価した：総容量は、１５０μｌであった；
４ｍＭＮＡＤＰＨ（放射活性ではない）を使用した；２ｍＭ（±）−ピノレシ
ノールまたは（±）−ラリシレシノールを基質として使用した；（±）−ラリシ
レシノールまたは（±）−セコイソラリシレシノールは放射化学キャリアとして
添加しなかった；３分間沸騰させることにより反応を停止した；次いで、５０μ
ｌＭｅＯＨを濃度が３０％になるまで添加し、そしてアッセイ混合物を遠心分
離（１７，０００×ｇ、３分）した；１５０μｌの得られた混合物をＨＰＬＣに
直接注入して、任意のラリシレシノールおよびセコイソラリシレシノールが形成
されるか否かを決定した。

【００７４】アッセイを２４時間まで続けた場合（すなわち、Ｆ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａレ
ダクターゼ［ＰＬＲ−Ｆｉｌ］での全ての利用可能な基質を枯渇させた条件下で
）（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ，Ａ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７１：２９４７３〜２９４８２（１９９６））、ピノレシノールもラリシレシ
ノールも還元されず、それぞれ、ラリシレシノールまたはセコラリシレシノール
のいずれにもならないことを見出した。

【００７５】（実施例３：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるネイティブのデヒドロジコニフェリルアル
コールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質（配列番号２）の発現）（推定レダクターゼのｐＳＢＥＴａへの移入）過剰発現プラスミドであるｐ
ＳＢＥＴａは、ｐＥＴ３ａ発現カセットを含み、２つの制限部位（ネイティブな
発現のためにＮｄｅＩおよび低分子融合を用いた発現のためにＢａｍＨＩ）、な
らびにａｒｇＵ遺伝子（稀なＡＧＡ−ＡｒｇｔＲＮＡ_arg4の生成のため）およ
びカナマイシン耐性（液体培養物における高いプラスミド安定性のため）がサブ
クローニングのために利用可能である。Ｐ．ｔａｅｄａ由来の推定レダクターゼ
は、内部にＮｄｅＩ部位を有さないので、２つのプライマーを設計して、開始メ
チオニンに（プライマーＰＴ−ＡＴＧ−ＮｄｅＩ：ＴＴＣＡＧＧＧＣＣ
ＣＡＴＡＴＧＧＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＧＡＴＡＣＣＴ）
（配列番号１０）および３’末端非翻訳領域に（プライマーＰＴ−ＲＥＶ−Ｎ
ｄｅＩ：ＴＧＴＣＧＡＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＴ
ＡＡＣＣＡＡＣＡＡＴＴＴ）（配列番号１１）ＮｄｅＩ部位を導入した。
これらの２つのプライマー（配列番号１０および配列番号１１）（各５ｐｍｏｌ
）を、上記のようにＰ．ｔａｅｄａ推定レダクターゼ（配列番号２）をコードす
る１０ｎｇのｃＤＮＡ（配列番号１）を用いた５つのＰＣＲ反応において使用し
、そしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書に従って、ｐＣＲＩＩプラスミドにサブ
クローニングした。推定レダクターゼを含む、得られたｐＣＲＩＩを精製し、そ
してＮｄｅＩで消化し、得られた約１ｋｂのフラグメントをゲル精製し、そして
ＮｄｅＩで予め消化したｐＳＢＥＴａに連結し、そしてコンピテントなＮｏｖａ
Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。推定レダクターゼを含む、得られたｐＳＢＥＴ構
築物を精製し、そしてＰＣＲの間に変異が導入されていないことを確認するため
に両方の鎖に対して完全に、発現領域（所望のｃＤＮＡを含む）を配列決定した
。

【００７６】（酵素精製のための一般的手順）タンパク質精製手順を４℃で行い、クロマ
トグラフィー溶出液を２８０ｎｍでモニタリングした。タンパク質濃度をＢｉｏ
Ｒａｄのタンパク質測定キットを用いて決定した。ポリアクリルアミドゲル電気
泳動は、勾配（４〜１５％、直線勾配、ＢｉｏＲａｄ）ゲルを、Ｌａｅｍｍｌｉ
緩衝液系の変性および還元条件下で使用し、次いで、銀染色によりタンパク質を
可視化した。

【００７７】（ネィティブ酵素（配列番号２）のＥ．ｃｏｌｉにおける過剰発現）Ｐ．ｔ
ａｅｄａ由来の推定レダクターゼ（配列番号２）を含む、得られたｐＳＢＥＴａ
プラスミドを、Ｂ８３４（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に発現のために形質転換し
た。推定レダクターゼ（配列番号２）の高レベルの発現が、５０μｇ／ｍｌカナ
マイシンを補充した１リットルのＬＢブロスに、同じ培地中で一晩培養した１０
ｍｌ培養物の２〜４ｍｌを接種することにより達成された。次いで、細胞を２５
０ｒｐｍで振盪しながら、密度がＯＤ₆₀₀＝０．６５に達するまで３７℃で増殖
させた。この時点で増殖条件を、２６５ｒｐｍで振盪しながら２０℃に変更した
。一旦細胞が約２２℃に達したら（インキュベーター温度が低下した後約３０分
）、レダクターゼ（配列番号２）の生成を、終濃度が１ｍＭになるまでＩＰＴＧ
を添加することにより誘導した。次いで、細胞を２１時間増殖させた後に４×２
５０ｍｌ遠心ボトル中で３０００×ｇ、２５分遠心分離することにより収集した
。その後ペレットを、−８０℃で少なくとも２時間凍結して、細胞溶解を補助し
た。

【００７８】（粗タンパク質調製）前工程において得たＥ．ｃｏｌｉ細胞の４つのペレッ
トを室温で融解して、そして各２×１０ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、ｐＨ８．０；２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；１ｍＭ
フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）；（Ｐａｒｅ，Ｐ．Ｗ．、Ｗ
ａｎｇ，Ｈ．−Ｂ．，Ｄａｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．およびＬｏｕｉｓ，Ｎ．Ｇ．、Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３５：４７３１〜４７３４（１９９４））、５
ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））中に再懸濁し、次いで、合わせ、そして３
×３０秒間超音波処理した。超音波処理物を２０，０００×ｇで３０分間遠心分
離して、細胞細片をペレットにし、そして０．２μｍシリンジフィルターに通し
て濾過した。得られた濾液（２９０ｍｌ）を硫酸アンモニウム沈澱に供して、４
０〜７０％硫酸アンモニウム飽和で中断し、２０，０００×ｇで３０分間遠心分
離した後、ＰＤ−１０脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通して、緩衝液Ａに
戻して脱塩した。

【００７９】（アフィニティーカラム（Ａｆｆｉ−Ｂｌｕｅゲル）精製）１．６ｃｍ直径
、１１．５ｃｍ長（２３ｍｌベッド容積）のＡｆｆｉ−Ｇｅｌブルーゲル（Ｂｉ
ｏＲａｄ）カラムを、緩衝液Ａで予備平衡化した。次いで、脱塩した４０〜７０
％中断（１５ｍｌ、５１３ｍｇ）をカラムにアプライした。３００ｍｌの緩衝液
Ａ（１ｍｌ／分）で洗浄した後、レダクターゼ（配列番号２）を、５００ｍＬで
０〜１００％の緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋５ＭＮａＣｌ）の直線勾配を実行し、１
００％緩衝液Ｂを６０ｍＬまで保持し、そして３０ｍｌで１００％緩衝液Ｂから
１００％緩衝液Ａまで戻すことにより溶出した。４ｍｌの画分を採取した。推定
レダクターゼ（配列番号２）は、画分３３〜４３において溶出された。次いで、
これらの画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０微少遠心分離機（Ａｍｉｃ
ｏｎ，Ｉｎｃ．）で約５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、ＰＤ１０カラムにかけて脱塩し
、そして活性についてアッセイした。

【００８０】（陰イオン交換クロマトグラフィー）次に、得られた酵素溶液（１１８ｍｇ
）を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ｐＨ６．８、５ｍＭ
ＤＴＴ）で予備平衡化したＰＯＲＯＳ２０ＱＥ灌流陰イオン交換カラムにアプ
ライし、そして素通り画分（すなわち、カラムに結合しなかった）を溶出させた
が、夾雑するＥ．ｃｏｌｉタンパク質の大部分は、これらの条件下で陰イオン交
換カラムに結合したままであった。

【００８１】（陽イオン交換クロマトグラフィー）次に、得られた酵素溶液（５９ｍｇ）
を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭＢｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ｐＨ６．８、５ｍＭＤ
ＴＴ）で予備平衡化したＰＯＲＯＳ２０ＳＰ灌流陽イオン交換カラムにアプ
ライし、そして素通り画分（すなわち、カラムに結合しなかった）を溶出させた
が、夾雑するＥ．ｃｏｌｉタンパク質の残りの大部分は、これらの条件下で陽イ
オン交換カラムに結合したままであった。このように、３６ｍｇの精製推定レダ
クターゼタンパク質（配列番号２）が得られた。

【００８２】（酵素の特徴付け）至適温度およびｐＨを、緩衝液濃度を１９ｍＭに変更し
、そしてＡｆｆｉ−Ｂｌｕｅカラムクロマトグラフィー工程後のタンパク質を使
用した（３０μｌ）ことを除いて、本明細書中に記載の標準的な（非放射活性）
アッセイ条件を使用して決定した。産物形成分析を、以下の例外をともなって、
逆相ＨＰＬＣ分析により調べた：至適温度については、インキュベーションを一
定のｐＨ（７．０）で温度を変化させて（６〜５８℃）行い；至適ｐＨについて
は、インキュベーションを一定温度（３０℃）でｐＨを変化させて（５．５〜９
．５）行った。初期の速度反応論を、ｐＨ７．０の標準的な（非放射活性）条件
下で、しかし１１の異なる濃度のリグナン基質（０．１６７〜２．５ｍＭ）およ
び２２℃で６時間でタンパク質活性をアッセイすることにより分析した。しかし
、ＮＡＤＰＨ濃度を５ｍＭで一定に保った。ＮＡＤＰＨ補因子の４Ｒ水素または
４Ｓ水素が酵素によって触媒される還元において利用されるか否かを決定するた
めに、放射化学アッセイを、特に標識した（４Ｒ−［³Ｈ］ＮＡＤＰＨまたは４
Ｓ−［³Ｈ］ＮＡＤＰＨ）で行い、そして７−Ｏ−４’−（イソ）ジヒドロデヒ
ドロジコニフェリルアルコール産物への放射化学取り込みについて分析した。

【００８３】（デヒドロジコニフェリルアルコールレダクターゼ活性についての放射化学ア
ッセイ）各１５０μｌのアッセイは、１９ｍＭＭＥＳ：ＢＩＳ−Ｔｒｉｓプ
ロパン、ｐＨ６．５、精製の対応する段階での２０μｌのタンパク質溶液、５ｍ
ＭＤＴＴ、２．５ｍＭ（±）−デヒドロジコニフェリルアルコールおよび５ｍ
Ｍ４Ｒ−［³Ｈ］−ＮＡＤＰＨ（１４．２×１０³ｋＢｑ／ｍｍｏｌ）からなっ
ていた。２２℃で６時間のインキュベーション後、このアッセイ混合物を、本明
細書中に記載のように、ＥｔＯＡｃ（２×５００μｌ）で抽出した。ＥｔＯＡｃ
可溶性画分を、減圧下で乾燥するまでエバポレートし、１００μｌのＣＨ₃ＣＮ
：３％酢酸（１：９）中に再構成し、そしてＵＶおよび放射化学検出の両方を用
いて、逆相ＨＰＬＣに供した。１ｍｌの画分を回収し、各々のアリコート（１０
０μｌ）を、シンチレーションカウンティングのために取り出して、アッセイ産
物への³Ｈの取り込みレベルを決定した。変性した（１００℃で５分）酵素また
は（±）デヒドロジコニフェリルアルコール基質なしを用いたコントロールはも
また、行った。

【００８４】（デヒドロジコニフェリルアルコールレダクターゼ活性についての非放射活性
アッセイ）各１５０μｌのアッセイは、２２ｍＭＭＥＳ：Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ
プロパン、ｐＨ６．５、純度の対応する段階での２０μｌのタンパク質溶液、５
ｍＭＤＴＴ、２ｍＭ（±）−デヒドロジコニフェリルアルコールおよび４ｍＭ
ＮＡＤＰＨからなっていた。３０℃で３時間インキュベーションした後、この
アッセイ混合物を、３分間沸騰させ、そして遠心分離し（１７，０００×ｇ、３
分）、１６．６μｌのＣＨ₃ＣＮを添加した後、アリコート（１２５μｌ）を、
逆相ＨＰＬＣに供した。７−Ｏ−４’−ジヒドロデヒドロジコニフェリルアルコ
ールの形成の定量を予め調製した標準曲線を用いて測定した。変性した酵素（１
００℃で５分間）および基質として（±）−デヒドロジコニフェリルアルコール
なしを使用するコントロールもまた、行った。

【００８５】（デヒドロジコニフェリルアルコールおよびその還元産物のＨＰＬＣ分離）
デヒドロジコニフェリルアルコール、ジヒドロデヒドロジコニフェリルアルコー
ル（７’，８’−アリル結合還元）、７−Ｏ−４’−（イソ）ジヒドロデヒドロ
ジコニフェリルアルコールおよび７’，８’，７−Ｏ−４″−テトラヒドロデヒ
ドロジコニフェリルアルコールの分離を、以下の通り、アセトニトリル：３％酢
酸（Ｈ₂Ｏ中）溶媒系を利用して、逆相カラム（ＳｙｍｍｅｔｒｙＳｈｉｅｌ
ｄＲＰ₈、３．９ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．）にかけて達成
した。カラムをＣＨ₃ＣＮ：３％酢酸（Ａ：Ｂ、１：９）で予備平衡化した。分
析されるサンプルを注入した後、３つの化合物の溶出を、以下の溶出プロファイ
ルを用いて達成した：１ｍｌ／分の流速で、Ａ：Ｂ（１：９）５分間、次いで、
３０分間にわたってＡ：Ｂ（２５：７５）への直線勾配、および最終的に２５分
間にわたって１００％Ａへの直線勾配。

【００８６】（７’，８’−ジヒドロデヒドロジコニフェリルアルコールレダクターゼ活性
についてのアッセイ）−−−アッセイを、（±）−デヒドロジコニフェリルアル
コールについて上述したように、但し、基質として７’，８’−ジヒドロデヒド
ロジコニフェリルアルコールを添加して、非標識化基質および放射標識化基質の
両方を使用して、実施した。

【００８７】このレダクターゼ（配列番号２）は、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質と
して発現される場合、ピノレシノールまたはラリシレシノールを還元する能力は
示さなかったので、ネガティブな発現を試みた。過剰発現プラスミド、ｐＳＢＥ
Ｔａは、ｐＥＴ３ａ発現カセットを含み、サブクローニングのために利用できる
２個の制限部位（ネガティブな発現についてはＮｄｅＩ、少しの融合での発現に
ついてはＢａｍＨＩ）、ならびにａｒｇＵ遺伝子（希なＡＧＡ−ＡｒｇｔＲＮ
Ａ_arg4の産生のため）およびカナマイシン抵抗性（液体培養中での高いプラスミ
ド安定性のため）を有する。Ｐ．ｔａｅｄａ由来の推定レダクターゼは内部Ｎｄ
ｅＩ部位を有さなかったので、ｐＳＢＥＴａへのサブクローニングは、比較的簡
単であった。２つのプライマーを、ＰＣＲ反応において使用して、開始メチオニ
ン（プライマーＰＴ−ＡＴＧ−ＮｄｅＩ）（配列番号１０）で、およびこのレ
ダクターゼ（配列番号２）の３’末端の非翻訳領域（プライマーＰＴ−Ｒｅｖ
−ＮｄｅＩ）（配列番号１１）内にＮｄｅＩ部位を導入した。得られたＰＣＲフ
ラグメントを、ＰＣＲクローニングプラスミド（ｐＣＲＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）へサブクローニングし、そしてＮｄｅＩでの切断によって切除した。この
推定レダクターゼ（配列番号２）を含有する約１ｋｂフラグメントを、ゲル精製
し、そしてＮｄｅＩで予め消化したｐＳＢＥＴａへ結合させた。この得られた推
定レダクターゼ（配列番号２）を含有するｐＳＢＥＴを、コンピテントなＥ．ｃ
ｏｌｉ細胞へ形質転換し、精製し、そして所望のｃＤＮＡを含有するこの発現領
域を、ＰＣＲの間に変異が導入されなかったことを確証するために、両方の鎖に
おいて完全に配列決定した。

【００８８】ｐＳＢＥＴ過剰発現系中の推定レダクターゼ（配列番号２）の誘導は、このｐ
ＳＣＥＴ構築物でＢ８３４（ＤＥ３）発現細胞を形質転換させる工程、次いで５
０μｇ・ｍｌ^-1のカナマイシンが補充されたＬＢブロス中の４個の１リットル培
養物をＯＤ₆₀₀の密度（約０．６）にこれの培養物が達するまで増殖させる工程
によって達成され、この時点で、これらの培養物を、約２２℃へ冷却し、そして
ＩＰＴＧとともに最終濃度の１ｍＭまで播種する。２１時間約２０〜２２℃での
増殖後、これらの細胞を遠心分離によって収穫する。

【００８９】この不均質に発現されたネガティブな酵素（配列番号２）の見かけ上の均質へ
の精製は、細胞溶解（本明細書中に示す通り）および遠心分離による細胞片除去
に引き続く、４回のクロマトグラフィー工程において達成された。第１工程は、
硫酸アンモニア沈殿を利用し、この所望のタンパク質は、４０〜７０％飽和カッ
トでペレット化した。このタンパク質の画分（５１３ｍｇ）を、緩衝液Ａ中で脱
塩し、そしてアフィニティー（ＡｆｆｉＢｌｕｅゲル）カラムへ適用し、そし
て線形塩勾配で溶出した。得られたタンパク質（１１８ｍｇ）を、再度、緩衝液
Ａ中で脱塩し、次いで、連続的な陰イオン交換（ＰＯＲＯＳ２０ＱＥ）およ
び陽イオン交換（ＰＯＲＯＳ２０ＳＰ）クロマトグラフィーへ供した。両方
ともを、条件（ｐＨ６．８）下（ここでは、所望のタンパク質は結合せず、一方
、混入Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質は結合した）で行い、そしてこのようにして除去
した。さらに、各工程後、レダクターゼ（配列番号２）を、ピノレシノール−ラ
リシレシノールレダクターゼ活性についてアッセイしたが、何も検出されなかっ
た。

【００９０】さらに、このレダクターゼ（配列番号２）をほぼ均質にまで精製した後でさえ
、ピノレシノールまたはラリシレシノールのいずれかを還元することは依然とし
て不可能であった。Ｐｉｎｕｓｔａｅｄａ由来のこの推定レダクターゼ（配列
番号２）を、いわゆるイソフラボン／ピノレシノール−ラリシレシノールレダク
ターゼ「相同体」に近接に整列されたので（推定アミノ酸配列類似性に基づく）
、代替の機能は、次に考慮された。この点において、デヒドロジコニフェリルア
ルコールは、共役エノンを形成し得る基質を含むので、かつＰ．ｔａｅｄａは、
有意なレベルのデヒドロジコニフェリルアルコールおよびその代謝産物を含み得
るので、本発明者らは、次に、アリル位またはベンジルエーテル位のいずれかで
、このレダクターゼ（配列番号２）がデヒドロジコニフェリルアルコールを還元
する能力についてこのレダクターゼを評価した。ベンジルエーテル位は、ピノレ
シノール−ラリシレシノールレダクターゼによって触媒される位置と類似する（
Ｇａｎｇ、Ｄ．Ｒ．Ｆｕｊｉｔａ，Ｍ．、Ｄａｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．およびＬｅｗｉ
ｓ，Ｎ．Ｇ．ＡＣＳＳｙｍｐ．Ｓｅｒ．６９７：３８９−４２１（１９９８
））。

【００９１】このような反応が分析され得る前に、デヒドロジコニフェリルアルコール、７
’，８’−ジヒドロデヒドロジコニフェリルアルコール（アリル結合還元）、７
−Ｏ−４’−（イソ）ジヒドロデヒドロジコニフェリルアルコール（ベンジルエ
ーテル結合還元）および７’，８’，７−Ｏ−４’テトラヒドロデヒドロジコニ
フェリルアルコール’（アリル結合およびベンジルエーテル還元の両方）のＨＰ
ＬＣ分離のための条件が、開発されねばならなかった。これは、勾配アセトニト
リル：３％酢酸（Ｈ₂Ｏ中）溶液系を使用して達成された（前述に記載の通り）
。この溶媒系は、図１Ａに示すように、４個全てのリグナンの近ベースライン分
離（ｎｅａｒｂａｓｅｌｉｎｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を提供した。

【００９２】デヒドロジコニフェリルアルコールレダクターゼ活性（アリルまたはベンジル
エーテルのいずれか）に関するこの推定レダクターゼ（配列番号２）についての
アッセイを、本明細書中に記載されるように実施した。図１Ｂに示すように、精
製Ｐ．ｔａｅｄａレダクターゼは、デヒドロジコニフェリルアルコールのベンジ
ルエーテル結合の還元を実施して、それを７−Ｏ−４’−（イソ）ジヒドロデヒ
ドロジコニフェリルアルコールへ還元する。これらの精製スキームの全工程での
このＰ．ｔａｅｄａ推定レダクターゼ（配列番号２）のデニドロジコニフェリル
に対する活性を、以下の表１において列挙する。

【００９３】（表１）Ｐｉｎｕｓｔａｅｄａ由来のベンジルエーテルレダクターゼ（配列番号２）
のための精製スキーム

【００９４】

【表１】この基質およびこの産物の正当性を、ＬＣ−ＭＳを使用して測定した（図１Ｄ
および１Ｅを参照のこと）。従って、いわゆるイソフラボン／ピノレシノール−
ラレシレシノールレダクターゼ「相同体」は、実際に、デヒドロジコニフェリル
アルコールを７−Ｏ−４’位で還元し得るフェニルクマランベンジルエーテルレ
ダクターゼ（ＰＣＢＥＲ）のようである。表２において示すように、この酵素（
配列番号２）の初期特徴付けは、６．５〜７．０のｐＨの最適プラトーおよび４
９℃での最適温度を示した。さらに、それはタイプＡレダクターゼであり、この
ニコチンアミド環のほとんど４Ｒ位からのみ生じるＮＡＤＰＨ補因子のヒドリド
の移動を伴う。

【００９５】（表２）（Ｐｉｎｕｓｔａｅｄａ由来のベンジルエーテルレダクターゼ（配列番号２
）の特性）

【００９６】

【表２】７’８’−ジヒドロデヒドロジコニフェリルアルコールを基質として試験した
場合、このベンジルエーテルの還元がまた、テトラヒドロデヒドロジコニフェリ
ルアルコールの形成によって立証されるように、達成された（図１ＣおよびＡＦ
を参照のこと）。

【００９７】初速度研究を、Ｐ．ｔａｅｄａベンジルエーテルレダクターゼ（配列番号２）
がこれらの基質の一方に対して他方を好むかどうかを決定するために、実施した
。これらの結果を、表２に列挙する。見られ得るように、比活性（Ｖ_max）は、
基質として７’，８’−ジヒドロデヒドロジコニフェリルアルコールについてよ
りもデヒドロジコニフェリルアルコールが２倍高い。さらに、デヒドロジコニフ
ェリルアルコール還元についてのＫ_Mは、７’，８’−ジヒドロデヒドロジコニ
フェリルアルコール還元よりも３倍低い。興味深いことに、観察された反応速度
論同位体効果

【００９８】

【化２】（これは、この反応のヒドリド移動工程が、この反応の律速工程（単数または複
数）に寄与することを示す）は、有意に、デヒドロジコニフェリルアルコール還
元についての方がより高い。デヒドロジコニフェリルアルコールが基質である場
合、このヒドリド移動は、有意に（高い反応速度論同位体効果、

【００９９】

【化３】によって示されるように）この酵素触媒反応の律速工程に寄与する。しかしなが
ら、７’８’−ジヒドロデヒドロジコニフェリルアルコールが基質として提供さ
れる場合、この反応速度論同位体効果は、

【０１００】

【化４】まで減少し、これは、このヒドリド移動が、この反応の律速工程にもはや有意に
は寄与しないことを示唆する。このことはまた、７’８’−ジヒドロデヒドロジ
コニフェリルアルコール還元についてのＫ_M値の有意な増加によって支持され、
これは、この基質の結合がデヒドロジコニフェリルアルコールについてよりもこ
のリグナンについてはるかに効率的でないことを示唆する。これらの結果は、Ｐ
．ｔａｅｄａベンジルエーテルレダクターゼ（配列番号２）は、基質としてデヒ
ドロジコニフェリルアルコールに対して有意により高い親和性を有することを示
唆する。

【０１０１】（実施例４）（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａからのデヒドロジコニフェリル
アルコールレダクターゼｃＤＮＡ（配列番号３）および（配列番号５）のクロー
ニング）（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａｃＤＮＡライブラリー合成）
−−−総ＲＮＡ（２００μｇ／ｇ新鮮重量）を、ＤｏｎｇおよびＤｕｎｓｔｅｎ
（Ｄｏｎｇ、Ｊ．Ｚ．およびＤｕｎｓｔａｎ，Ｄ．Ｉ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ
Ｒｅｐｏｒｔｓ１５（１９９６））の方法を使用して、温室栽培のＣ．ｊａ
ｐｏｎｉｃａ樹の葉から得た。Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａｃＤＮＡライブラリーを
、５μｇの精製ポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡ（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴＴＭＳｕｓｐ
ｅｎｓｉｏｎ、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）合成
キット、ＵｎｉＺＡＰ^TM ＸＲベクター、およびＧｉｇａｐａｃｋ（登録商標
）ＩＩＧｏｌｄパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に、一次
ライブラリーについて２．２×１０⁶ｐｆｕの力価で、構築した。この増幅され
たライブラリー（８．３×１０⁹ｐｆｕ／ｍｌ；１７５ｍｌ総計）を、スクリー
ニング（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ，Ａ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７１，２９４７３〜２９４８２（１９９６））のために使用した。

【０１０２】ＤＮＡプローブ合成−−−上記のＰ．ｔａｅｄａデヒドロジコニフェリルアル
コールレダクターゼｃＤＮＡ（５ｎｇ）（配列番号１）を含むｐＳＢＥＴａプ
ラスミドを、５個の１００μｌのＰＣＲ反応物（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［
ｐＨ９．０］、５０ｍＭＫＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２．５
ｍＭＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰおよび２．５単位ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼ）におけるテンプレートとして、プライマーＣ_j−ＰＣＢＥＲＮＴ（１
００ｐｍｏｌ）（配列番号１２）およびプライマーＣ_j−ＰＣＢＥＲＣＴ（１０
０ｐｍｏｌ）（配列番号１３）と共に、使用した。このＰＣＲ増幅を、以下のよ
うなサーモサイクラーにおいて実施した：９４℃で１分、５０℃で２分、および
７２℃で３分の３５サイクル；７２℃で５分およびこの最後のサイクル後４℃で
不定時間保持。単一のプライマー、テンプレートのみおよびプライマーのみの反
応を、コントロールとして実施した。

【０１０３】５個の反応物を濃縮し（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ３０、Ａｍｉｃｏｎ．Ｉｎｃ．）
、そしてＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤ
ＴＡ；２×２００μｌ）で洗浄し、このＰＣＲ産物を引き続いてＴＥ緩衝液（２
×５０μｌ）中に回収した。このＰＣＲ産物（約９８０ｂｐのバンド）を、分取
１．０％アガロースゲルに再溶解させ、そしてＧＥＮＥＣＬＥＮＩＩ（登録商
標）キット（ＢＩＯ１０１Ｉｎｃ．）を使用してこのアガロースから精製し
た。このゲル精製ＰＣＲ産物（４０ｎｇ）を、キット使用説明書に従って、Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａのＱｕｉｃｋＰｒｉｍｅ（登録商標）キットおよび［α−³²Ｐ］
ｄＣＴＰを用いて使用して、放射標識化プローブ（０．１ｍｌ中）を作製し、こ
のプローブをＢｉｏＳｐｉｎ６カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で精製し、そしてキャ
リアＤＮＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ剪断サケ精子ＤＮＡ［Ｓｉｇｍａ］、０．９ｍｌ
）へ添加した。

【０１０４】ライブラリースクリーニング−−−３００，０００ｐｆｕのＣ．ｊａｐｏｎｉ
ｃａ増幅ｃＤＮＡライブラリーを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの説明書に従って、一
次スクリーニングのためにプレートした。プラークが、ＭａｇｎａＮｙｌｏｎ
サークル（ＭｉｃｒｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎＩｎｃ．）上にブロットされ
、こらを、次いで、空気乾燥させた。これらの膜を、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標
）３ＭＭＣｈｒペーパーの２層間へ配置した。ｃＤＮＡライブラリーファージ
ＤＮＡを、この膜へ固定し、そして速効排出を伴う１００℃での２分間オートク
レーブによって一段階で変性させた。これらの膜を、３０分間３７℃で、６×標
準のクエン酸塩生理食塩水（ＳＳＣ）および０．１％ＳＤＳで洗浄し、そして結
晶化皿（１９０×７５ｍｍ）において、予め加熱した６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤ
Ｓおよび５×Ｄｅｎｈａｒｄ試薬（ハイブリダイゼーション試薬、３００ｍｌ）
中、４９℃で、穏やかに攪拌しながら、５時間、プレハイブリダイゼーションし
た。この［³²Ｐ］放射標識化プローブを、変性させ（沸騰、１０分）、迅速に冷
却し（氷、１５分）、そして結晶化皿（１５０×７５ｍｍ）中の予め加熱した新
鮮なハイブリダイゼーション溶液（６０ｍｌ、４９℃）へ添加した。このプレハ
イブリダイゼーションした膜を、次に、この皿へ添加し、これを次いで、プラス
チックラップで覆った。ハイブリダイゼーションを、穏やかに攪拌しながら、４
９℃で１８時間、実施した。これらの膜を、４×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳ
で、室温で５分間洗浄し、２×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳ（室温）へ移し、
そして穏やかに攪拌しながら、乾燥を防ぐためにプラスチックラップで覆いなが
ら、４９℃で２０分間インキュベートし、そして最終的に、増幅用スクリーンと
ともに、ＫｏｄａｋＸ−ＯＭＡＴＡＲフィルムへ、−８０℃で２４時間曝し
た。２０個の陽性のプラークを、上記のハイブリダイゼーション条件での２以上
の回数のスクリーニングによって、そして２個が上記の予期される酵素をコード
することが見出された。

【０１０５】ｐＣ_j−ＰＣＢＥＲ１およびｐＣ_j−ＰＣＢＥＲ２のファージミドのインビボ切
除および配列決定−−−精製ｃＤＮＡクローンを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのイン
ビボ切除プロトコルに従って、上記ファージから奪還した。２つの異なるｃＤＮ
Ａ（ｐＣ_j−ＰＣＢＥＲ１（配列番号３））およびｐＣ_j−ＰＣＢＥＲ２（配列番
号５）の両方の鎖を、オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）配列決定プラ
イマーを使用して、完全に配列決定した。

【０１０６】（実施例５）（本発明の現在好ましいデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテル
レダクターゼタンパク質の特性）本発明の現在好ましいデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレ
ダクターゼタンパク質は、約３３ｋＤａ〜約３４ｋＤａの分子量（ＳＤＳＰＡ
ＧＥによって測定）、および約６．０〜約７．０の範囲の最適ｐＨ、および約６
．０〜約７．０のｐＩ値（コンピュータで算出）を有する、ＮＡＤＰＨ依存レダ
クターゼである。さらに、本発明の現在最も好ましいデヒドロジコニフェリルア
ルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質は、１０４．２±１０．８ｎ
ｍｏｌ／時間／ｍｇ、および０．６１±０．０３ｍＭのＫｍを有する。本発明の
現在好ましいデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ
タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、裸子植物または被子植物種に
由来する。

【０１０７】本発明の好ましい実施態様は、例示され、そして説明されるが、本発明の精神
および範囲を逸脱することなく、種々の改変が実施され得ることが、理解される
。

【０１０８】本発明の上記の局面および付随する多くの利点は、上記の詳細な説明を参照す
ることによってより良好に理解されるのと同様に、添付の図面を組合せる場合に
、より容易に理解される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａは、以下のスタンダードのＨＰＬＣ分離を示す：ピーク１：テトラヒド
ロデヒドロジコニフェリルアルコール（ＴＤＤＣ）、ピーク２：イソジヒドロデ
ヒドロジコニフェリルアルコール（ＩＤＤＤＣ）、ピーク３：ジヒドロデヒドロ
ジコニフェリルアルコール（ＤＤＤＣ）、ピーク４：デヒドロジコニフェリルア
ルコール（ＤＤＣ）。図１Ｂは、ＤＤＣからＩＤＤＤＣへの還元のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１Ｃは、ＤＤＤＣからＴＤＤＣへのこのベンジルエーテルレダクターゼ（配
列番号２）による還元のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１Ｄは、ＤＤＣ（基質）のマススペクトルを示す。図１Ｅは、ＩＤＤＤＣ（このベンジルエーテルレダクターゼ（配列番号２）に
よるＤＤＣ還元の生成物）のマススペクトルを示す。図１Ｆは、ＴＤＤＣ（このベンジルエーテルレダクターゼ（配列番号２）によ
るＤＤＤＣ還元の生成物）のマススペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者笠原博幸アメリカ合衆国ワシントン 99163，プルマン，エヌ．ダブリュー．アンソニーストリート 215，アパートメント８ (72)発明者ガング，デイビッドアール．アメリカ合衆国ミシガン 48108，アンアーボー，ストーンロード 2336 (72)発明者デイビン，ローレンスビー．アメリカ合衆国ワシントン 99163，プルマン，アッパードライブ 1710 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA08 BA08 CA04 CA11 EA04 HA01 4B050 CC01 CC04 DD11 EE10 FF03E FF11E FF14E LL05 4B065 AA26X AA88X AA88Y AB01 AB02 AC14 CA28 CA53 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダク
ターゼタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項２】裸子植物のデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエー
テルレダクターゼタンパク質をコードする、請求項１に記載の単離された核酸分
子。
【請求項３】Ｐｉｎｕｓ属由来のデヒドロジコニフェリルアルコールベン
ジルエーテルレダクターゼタンパク質をコードする、請求項１に記載の単離され
た核酸分子。
【請求項４】Ｐｉｎｕｓｔａｅｄａ由来のデヒドロジコニフェリルアル
コールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質をコードする、請求項３に記載
の単離された核酸分子。
【請求項５】配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の単
離された核酸分子。
【請求項６】配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする
、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ属由来のデヒドロジコニフェリルア
ルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質をコードする、請求項１に記
載の単離された核酸分子。
【請求項８】Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａ由来のデヒドロ
ジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質をコードす
る、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の単
離された核酸分子。
【請求項１０】配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の
単離された核酸分子。
【請求項１１】配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードす
る，請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードす
る，請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】単離されたデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエ
ーテルレダクターゼタンパク質。
【請求項１４】被子植物の、請求項１３に記載の単離されたデヒドロジコ
ニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質。
【請求項１５】裸子植物の、請求項１３に記載の単離されたデヒドロジコ
ニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質。
【請求項１６】Ｐｉｎｕｓの、請求項１３に記載の単離されたデヒドロジ
コニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質。
【請求項１７】Ｐｉｎｕｓｔａｅｄａの、請求項１３に記載の単離され
たデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質
。
【請求項１８】請求項１３に記載の単離されたデヒドロジコニフェリルア
ルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質であって、該タンパク質が配
列番号２のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項１９】Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａの、請求項１３に記載の単離され
たデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質
。
【請求項２０】Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａｊａｐｏｎｉｃａの、請求項１
３に記載の単離されたデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダ
クターゼタンパク質。
【請求項２１】請求項１３に記載の単離されたデヒドロジコニフェリルア
ルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質であって、該タンパク質が配
列番号４のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項２２】請求項１３に記載の単離されたデヒドロジコニフェリルア
ルコールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質であって、該タンパク質が配
列番号６のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項２３】デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダ
クターゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能な発現ベク
ター。
【請求項２４】裸子植物のデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエ
ーテルレダクターゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２
３に記載の複製可能な発現ベクター。
【請求項２５】被子植物のデヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエ
ーテルレダクターゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２
３に記載の複製可能な発現ベクター。
【請求項２６】Ｐｉｎｕｓのデヒドロジコニフェリルアルコールベンジル
エーテルレダクターゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項
２３に記載の複製可能な発現ベクター。
【請求項２７】Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａのデヒドロジコニフェリルアルコ
ールベンジルエーテルレダクターゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を
含む、請求項２３に記載の複製可能な発現ベクター。
【請求項２８】適切な宿主細胞においてデヒドロジコニフェリルアルコー
ルベンジルエーテルレダクターゼタンパク質の発現を増強する方法であって、該
宿主細胞に、デヒドロジコニフェリルアルコールベンジルエーテルレダクターゼ
タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する工程を
包含する、方法。
【請求項２９】前記宿主細胞が植物細胞である、請求項２８に記載の方法
。
【請求項３０】適切な宿主細胞においてデヒドロジコニフェリルアルコー
ルベンジルエーテルレダクターゼタンパク質の発現を改変する方法であって、該
宿主細胞に、配列番号１に示すｃＤＮＡ分子とハイブリダイズし得るＲＮＡを発
現するヌクレオチド配列を含むベクターを導入する工程を包含する、方法。
【請求項３１】前記宿主細胞が植物細胞である、請求項３０に記載の方法
。
【請求項３２】適切な宿主細胞においてデヒドロジコニフェリルアルコー
ルベンジルエーテルレダクターゼタンパク質の発現を改変する方法であって、該
宿主細胞に、配列番号３に示すｃＤＮＡ分子とハイブリダイズし得るＲＮＡを発
現するヌクレオチド配列を含むベクターを導入する工程を包含する、方法。
【請求項３３】前記宿主細胞が植物細胞である、請求項３２に記載の方法
。