JP2002512790A - 組換えセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼ、および使用方法 - Google Patents

組換えセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼ、および使用方法

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JP2002512790A
JP2002512790A JP2000545990A JP2000545990A JP2002512790A JP 2002512790 A JP2002512790 A JP 2002512790A JP 2000545990 A JP2000545990 A JP 2000545990A JP 2000545990 A JP2000545990 A JP 2000545990A JP 2002512790 A JP2002512790 A JP 2002512790A
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secoisolariciresinol dehydrogenase
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ズヒ−キアン ザイア，
マイケル エイ． コスタ，
ローレンス ビー． ダビン，
ノーマン ジー． ルイス，
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ワシントン ステイト ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション
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Abstract

(57)【要約】 セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質は、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａから、この種からのセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼをコードするｃＤＮＡとともに単離されている。従って、セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼの発現をコードする、単離されたＤＮＡ配列が提供される。他の局面において、本発明は、セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする核酸配列を含む複製可能組換えクローニングビヒクル、またはセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼのＤＮＡもしくはＲＮＡの少なくとも一部に十分に相補的であり、それらとのハイブリダイゼーションを可能にする塩基配列に関する。従って、その後の使用のための有意な量の組換えセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼの産生、単離、および精製を容易にし、リグナン生合成を増強または他の様式で改変するために植物中のセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼの発現または増強した発現を得るために使用され得るか、あるいはセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼの調節または発現のために他の様式で使用され得る、セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼの組換え発現のための系および方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、単離されたセコイソラリシレシノール（ｓｅｃｏｉｓｏｌａｒｉｃ
ｉｒｅｓｉｎｏｌ）デヒドロゲナーゼタンパク質、セコイソラリシレシノールデ
ヒドロゲナーゼタンパク質をコードする核酸配列、およびその配列を含有するベ
クター、その配列を含有する宿主細胞、ならびに組換えセコイソラリシレシノー
ルデヒドロゲナーゼタンパク質およびそれらの変異体を生成する方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） リグナンは、広い範囲の生理学的機能および薬理学的に重要な特性を有する、
巨大な構造多様性クラスの維管束植物代謝物である（Ａｙｒｅｓ，Ｄ．Ｃ．，お
よびＬｏｉｋｅ，Ｊ．Ｄ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
ｏｇｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｌｉｇｎａｎｓ．Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔ
ｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９０）；Ｌｅｗｉｓら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｏｆ ｔｈｅ Ａｍａｚｏｎ，Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ，ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｉｓｓｕｅｓ，５８８
，（Ｐ．Ｒ．Ｓｅｉｄｌ，Ｏ．Ｒ．ＧｏｔｔｌｉｅｂおよびＭ．Ａ．Ｃ．Ｋａｐ
ｌａｎ）１３５−１６７，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．（１９９５））。それらの明白な抗生物質特性（Ｍａ
ｒｋｋａｎｅｎ，Ｔ．ら、Ｄｒｕｇｓ Ｅｘｐｔｌ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．７：７
１１−７１８（１９８１））、抗酸化剤性特性（Ｆａｕｒｅ，Ｍ．ら、Ｐｈｙｔ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：３７７３−３７７５（１９９０）；Ｏｓａｗａ，
Ｔら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４９：３３５１−３３５２（１９８５
））、および摂食抑制物質特性（Ｈａｒｍａｔｈａ，Ｊ．，およびＮａｗｒｏｔ
，Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｙｓｔ．Ｅｃｏｌ．１２：９５−９８（１９８４）
）のために、維管束植物におけるリグナンの主な役割は、種々の日和見性生物学
的病原体および捕食動物に対する抵抗性を付与するのを補助することである。リ
グナンはまた、サイトカインとして（Ｂｉｎｎｓ，Ａ．Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：９８０−９８４（１９８７））、およ
び木化における中間体として（Ｒａｈｍａｎ，Ｍ．Ｍ．Ａ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ２９：１８６１−１８６６（１９９０））提唱されており、こ
れは、植物生長および発生における重要な役割を示唆する。生化学経路のリグニ
ン／リグナンへの同化作用およびフェニルアラニンからの関連基質（チロシン）
は、４億８０００年前の（Ｇｒａｈａｍ，Ｌ．Ｅ．，Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｌａ
ｎｄ Ｐｌａｎｔｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，ＮＹ（１９９３））水生植物のそれらの維管束乾燥地帯対応物への首尾
良い変異（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）（Ｌｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．，およびＤａｖｉｎ
，Ｌ．Ｂ．，Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｎａｔｕｒａｌ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，５６２（
Ｗ．Ｄ．Ｎｅｓ，編）２０２−２４６，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｒｅｉ
ｅｓ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９９４））に必須であったことが、幅広
く支持される。
【０００３】 存在する化学分類学的データに基づいて、リグナンは、シダ類Ｂｌｅｃｈｎｕ
ｍ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ（Ｗａｄａ，Ｈ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ
．４０：２０９９−２１０１（１９９２））およびマツモ（例えば、Ｄｅｎｄｒ
ｏｃｅｒｏｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓおよびＭｅｇａｃｅｒｏｓ ｆｌａｇｅｌｌ
ａｒｉｓ）（Ｔａｋｅｄａ，Ｒ．ら、Ｂｒｙｏｐｈｙｔｅｓ．Ｔｈｅｉｒ Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ，第２９巻（Ｚ
ｉｎｓｍｅｉｓｔｅｒ，Ｈ．Ｄ．およびＭｕｅｓ，Ｒ．編）２０１−２０７頁、
Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（
１９９０）；Ｔａｋｅｄａ，Ｒ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３１
：４１５９−４１６２（１９９０））のような「原始」植物において存在し、後
者はシシル紀に発生するとして最近分類されている（Ｇｒａｈａｍ，Ｌ．Ｅ．，
Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓ．１０９：２４１−２５２（１９９６））。興味深いこ
とに、裸子植物および被子植物の両方の進化は、リグナンの構造複雑性および酸
化的修飾における主な変化によって達成された（Ｌｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．，および
Ｄａｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．，Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｎａｔ
ｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
，５６２（Ｗ．Ｄ．Ｎｅｓ，編）２０２−２４６，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
Ｓｅｒｉｅｓ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９９４）；Ｇｏｔｔｌｉｅｂ
，Ｏ．Ｒ．およびＹｏｓｈｉｄａ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｏｆ Ｗｏｏｄｙ Ｐｌａｎｔｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ
ｔｏ ｔｈｅ Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｏｌｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ（Ｒｏ
ｗｅ，Ｊ．Ｗ．およびＫｉｒｋ，Ｃ．Ｈ．編）４３９−５１１頁、Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ（１９８９））。実際は、Ｗｅｓｔｅｒｎ
Ｒｅｄ Ｃｅｄｅｒ（Ｔｓｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ）のようないくつかの種にお
いて、リグナンは、生じる心材色、質、芳香、および耐久性を増強することよっ
て、心材形成／生成に広範に寄与し得る。
【０００４】 植物におけるそれらの機能に加えて、リグナンはまた、重要な薬理学的役割を
有する。例えば、ポドフィロトキシンは、そのエトポシドおよびテニポシド（ｔ
ｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）誘導体と同様に、抗ガン剤として首尾良く使用されている
植物化合物の例である（Ａｙｒｅｓ，Ｄ．Ｃ．，およびＬｏｉｋｅ，Ｊ．Ｄ．Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｌｉｇｎａｎｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１
９９０））。抗ウイルス特性はまた、選択されたリグナンについて報告されてい
る。例えば、（−）−アークタイゲニン（ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ）（Ｓｃｈｒｏ
ｄｅｒ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．４５ｃ，１２１５−１２２
１（１９９０））、（−）−トラシェロゲニン（ｔｒａｃｈｅｌｏｇｅｎｉｎ）
（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．４５ｃ，１２
１５−１２２１（１９９０））、およびノルジヒドログアヤレン酸（ｎｏｒｄｉ
ｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（Ｇｎａｂｒｅ，Ｊ．Ｎ．ら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１２３９−１１２４３
（１９９５））は、それらの明白な逆転写酵素阻害活性に起因して、ＨＩＶに対
して各々有効である。いくつかのリグナン（例えば、マタイレシノール（ｍａｔ
ａｉｒｅｓｉｎｏｌ）（Ｎｉｋａｉｄｏ，Ｔ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕ
ｌｌ．２９：３５８６−３５９２（１９８１））は、ｃＡＭＰホスホジエステラ
ーゼを阻害する一方、他は、心血管活性を増強する（例えば、シリンガレシノー
ル（ｓｙｒｉｎｇａｒｅｓｉｎｏｌ）β−Ｄ−グルコシダーゼ）（Ｎｉｓｈｉｂ
ｅ，Ｓ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ． ３８：１７６３−１７６５（
１９９０））。また、食餌における、高繊維食餌の消化後に形成される「哺乳動
物」リグナンまたは「フィトエストロゲン」、エンテロラクトン（ｅｎｔｅｒｏ
ｌａｃｔｏｎｅ）およびエンテロジオール（ｅｎｔｅｒｏｄｉｏｌ）の存在と、
乳ガンおよび前立腺ガンの減少した発生率との間の高い相関関係が存在する（い
わゆる、化学防御）（Ａｘｅｌｓｏｎ，Ｍ．，およびＳｅｔｃｈｅｌｌ，Ｋ．Ｄ
．Ｒ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１２３：３３７−３４２（１９８１）；Ａｄｌｅ
ｒｃｒｅｕｔｚら、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ
ｌ．４１：３−８（１９９２）；Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚら、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉ
ｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．５２：９７−１０３（１９９５）
）。「哺乳動物リグナン」は、順に、マタイレシノールおよびセコイソラリシレ
シノール（ｓｅｃｏｉｓｏｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ）のようなリグナンに由
来すると考えられる（Ｂｏｒｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，５８：３７−４３（１９８５））。
【０００５】 リグナンへの生合成経路は、現在定義されているところである。Ｆｏｒｓｙｔ
ｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａからの粗酵素抽出物に関する放射性標識実験に基
づいて、８−８’結合リグナン（これは、公知のほとんどの一般的なジリグノー
ル（ｄｉｌｉｇｎｏｌ）結合（Ｄａｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．，およびＬｅｗｉｓ，Ｎ．
Ｇ．， Ｒｅｃ．Ａｄｖ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２６巻（Ｓｔａｆ
ｆｏｒｄ，Ｈ．Ａ．，およびＩｂｒａｈｉｍ，Ｒ．Ｋ．編）、３２５−３７５頁
、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２））を示す）
への侵入が、２つのアキラルコニフェリルアルコール分子の立体選択的カップリ
ングを介して、酸素化フリーラジカルの形態において生じ、フロフラン（ｆｕｒ
ｏｆｕｒａｎ）リグナン（＋）−ピノレシノールを産出することが最初に確認さ
れた（Ｄａｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．，Ｂｅｄｇａｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｋａｔａｙａｍａ，Ｔ
．，およびＬｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：３８
６９−３８７４（１９９２）；Ｐａｒｅ，Ｐ．Ｗ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ．３５：４７３１−４７３４（１９９４））。
【０００６】 現在、８−８’結合リグナン生合成経路における最初の工程が、Ｆ．ｉｎｔｅ
ｒｍｅｄｉａにおいて分類されている（Ｄａｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．、Ｗａｎｇ，Ｈ．
−Ｂ．、Ｃｒｏｗｅｌｌ，Ａ．Ｌ．、Ｂｅｄｇａｒ，Ｄ．Ｌ．、Ｍａｒｔｉｎ，
Ｄ．Ｍ．、Ｓａｒｋａｎｅ，Ｓ．、Ｌｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
７５：３６２−３６６（１９９７））。これは、７８ｋＤａのディリジェント（
ｄｉｒｉｇｅｎｔ）タンパク質および１電子オキシダーゼ（例えば、ラッカーゼ
）の存在下での２分子のコニフェリルアルコールの立体選択的モノリグノールカ
ップリングに関する。１電子オキシダントは、ディリジェントタンパク質結合、
配向性およびフリーラジカル形態のカップリングおよび（＋）−ピノレシノール
の放出をともなう酸化許容量のみを提供すると考えられる。ディリジェントタン
パク質は、Ｆ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの茎組織から精製され、そしてそのコード
遺伝子がクローニングされた（Ｇａｎｇ，Ｄ．Ｒ．、Ｃｏｓｔａ，Ｍ．Ａ．、Ｆ
ｕｊｉｔａ，Ｍ．、Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ，Ａ．Ｔ．、Ｗａｎｇ，Ｈ
．Ｂ．、Ｂｕｒｌａｔ，Ｖ．、Ｍａｒｔｉｎ，Ｗ．、Ｓａｒｋａｎｅｎ，Ｓ．、
Ｄａｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．、Ｌｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ ６：１４３−１５１（１９９９））。
【０００７】 Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、およびおそらく他の種において
、（＋）−ピノレシノールは、逐次還元を受けて、（＋）−ラリシレシノール、
次いで（−）−セコイソラリシレシノールを生じる（Ｋａｔａｙａｍａ，Ｔ．ら
、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：５８１−５９１（１９９３）；Ｃｈｕ
，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：２７０２６−２７０３３（１９
９３））。ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼによって触媒される
還元は、ＮＡＤＰＨのプロ−Ｒヒドリドの除去によって進行し、産物（（＋）−
ラリシレシノールおよび（−）−セコイソラリシレシノール）のＣ−７位および
Ｃ−７’位の両方で、立体配置の「反転」を生じる（Ｃｈｕ，Ａら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２７０２６−２７０３３（１９９３））。ピノレシノー
ル／ラリシレシノールレダクターゼは、可溶性粗タンパク質抽出物から、見かけ
の電気泳動的均質性まで約３２００倍精製された；これは、一連のアフィニティ
ー、疎水的相互作用、ヒドロキシアパタイト、ゲル濾過およびイオン交換クロマ
トグラフィー工程の使用により達成された（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ，
Ａ．Ｔ．、Ｇａｎｇ，Ｄ．Ｒ．、Ｄａｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．、Ｂｅｄｇａｒ，Ｄ．Ｌ
．、Ｃｈｕ，Ａ．、Ｌｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：
２９４７３−２９４８２（１９９６））。精製されたタンパク質は、Ａ型ＮＡＤ
ＰＨ−依存レダクターゼであることが実証された。
【０００８】 対応するピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ遺伝子（ｐｌｒ−Ｆ
ｉ１と呼ばれる）は、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｃＤＮＡライブラリーからクローニ
ングされ（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ，Ａ．Ｔ．、Ｇａｎｇ，Ｄ．Ｒ．、
Ｄａｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．、Ｂｅｄｇａｒ，Ｄ．Ｌ．、Ｃｈｕ，Ａ．、Ｌｅｗｉｓ，
Ｎ．Ｇ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９４７３−２９４８２（１９９
６））、次いで、その十分に機能的な組換えタンパク質が、ｐＥＴに基づく発現
系（ｐＳＢＥＴａベクター）を使用してＥ．ｃｏｌｉにおいて過剰発現された（
Ｓｃｈｅｎｋ，Ｐ．Ｍ．、Ｂａｕｍａｎｎ，Ｓ．、Ｍａｔｔｅｓ，Ｒ．、Ｓｔｅ
ｉｎｂｉβ，Ｈ．−Ｈ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：１９６−２００
（１９９５））。ＮＡＤＰＨの存在下における（±）−ピノレシノールとの組換
えピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼのインキュベーションに続い
て形成された産物のみが、（＋）−ラリシレシノールおよび（−）−セコイソラ
リシレシノールであることが見出された。すなわち、（＋）−ピノレシノールお
よび（＋）−ラリシレシノールのみが基質として供され、そして、（−）−ピノ
レシノールおよび（−）−ラリシレシノールはどちらも供されなかった。従って
、組換え酵素は、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ由来のネイティブの植物タンパク質と同様
に、正確に同じエナンチオ特異的な転換を触媒した（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔ
ｏｖａ，Ａ．Ｔ．、Ｇａｎｇ，Ｄ．Ｒ．、Ｄａｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．、Ｂｅｄｇａｒ
，Ｄ．Ｌ．、Ｃｈｕ，Ａ．、Ｌｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７１：２９４７３−２９４８２（１９９６）；Ｌｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．、Ｄａｖ
ｉｎ，Ｌ．Ｂ．：Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１巻（Ｂａｒｔｏｎ、Ｓｉｒ Ｄ．Ｈ．Ｒ．、Ｎ
ａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．およびＭｅｔｈ−Ｃｏｈｎ，Ｏ．編）６３９−７１２頁
、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９９９））。続いて、（−）−マタイレ
シノール（ｍａｔａｉｒｅｓｉｎｏｌ）は、（−）−セコイソラリシレシノール
の脱水素により形成される。このさらなる代謝物は、おそらくＩｐｏｍｏｅａ
ｃａｉｒｉｃａの抗ウイルス（−）−トラケロゲニン（ｔｒａｃｈｅｌｏｇｅｎ
ｉｎ）およびＰｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ ｐｅｌｔａｔｕｍの（−）−ポドフィロ
トキシン（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）のようなリグナンを与える。
【０００９】 従って、（＋）−ピノレシノールの立体特異的形成、ならびに（＋）−ラリシ
レシノールおよび（−）−セコイソラリシレシノールを生じる続く還元工程は、
リグナン代謝における中枢点である。なぜなら、それらは、フラノ、ジベンジル
ブタン、ジベンジルブチロラクトン、およびアリールテトラヒドロナフタレンリ
グナンサブクラスへの侵入を示すからである。さらに、リグナンは通常、光学活
性であるが、存在する特定の鏡像異性体は、植物種の間で異なり得ることに注意
するべきである。例えば、（−）−ピノレシノールは、Ｘａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ
ａｉｌａｎｔｈｏｉｄｅｓにおいて生じ（Ｉｓｈｉｉら、Ｙａｋｕｇａｋｕ
Ｚａｓｓｈｉ， １０３：２７９−２９２（１９８３））、そして（−）−ラリ
シレシノールは、Ｄａｐｈｎｅ ｔａｎｇｕｔｉｃａにおいて存在する（Ｌｉｎ
−Ｇｅｎら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ， ４５：１７２−１７６（１９８２
））。特定のリグナンの光学活性は、生物学的活性に関する重要な分岐を有し得
る。例えば、（−）−トラシェロゲニンは、ＨＩＶ−１のインビトロ複製を阻害
し、一方、（＋）−鏡像異性体は、あまり有効ではない（Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、
Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ， ４５ｃ：１２１５−１２１１（１９９０））。
【００１０】 リグナン（マタイレシノール）は、植物貯蔵（ｐｌａｎｔ ａｒｓｅｎａｌ）
の重要な成分である。これは、ヒトに対して、特に乳癌および前立腺癌の発症に
対して、食餌性の利点を付与するのを助ける（Ａｄｌｅｒｃｒｕｅｔｚ，Ｈ．お
よびＭａｚｕｒ，Ｗ．Ａｎａｌ．Ｍｅｄ．、１９９７、２９：９５−１２０）。
このリグナンは、種々の穀物食全体、種子および穀粒において見出され、そして
エンテロラクトンを形成する腸内細菌により転換される；後者の化合物は、健全
な防御を付与する際の一次代謝物であると考えられる。さらに、リグナン（マタ
イレシノール）はまた、ｐｌｉｃａｔｉｃ酸およびその同族種へのその変換を介
して、特定の心材（例えば、高価なベイスギ（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ）種
）に対する質、色および耐久性の付与において重要な機能を有する。モデル系と
してＦｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａを使用して、マタイレシノール
が、セコイソラリシレシノールの脱水素を介して植物中（ｉｎ ｐｌａｎｔａ）
で形成されることを確立した（図１）（Ｕｍｅｚａｗａ，Ｔ．、Ｄａｖｉｎ，Ｌ
．Ｂ．およびＬｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ
．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９０、１７１（３）、１００８−１０１４；Ｕｍｅｚａ
ｗａ，Ｔ．、Ｄａｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｇ．Ｌ．、Ｙａｍ
ａｍｏｔｏ，Ｅ．およびＬｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９０、１４０５−１４０８；Ｕｍｅｚａｗａ，Ｔ．、Ｄ
ａｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．およびＬｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、
１９９１、２６６：１０２１０−１０２１７）。
【００１１】 （発明の要旨） 前述に従って、セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質は、Ｆ
ｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａから精製された。従って、本発明の１
つの局面は、例えば、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａから単離され
た組換えセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質に関する。現在
好ましい、本発明の単離された組換えセコイソラリシレシノールデヒドロゲナー
ゼタンパク質は、被子植物種または裸子植物種において天然に存在するセコイソ
ラリシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質に対応する；約２７ｋＤａ〜約３
１ｋＤａ、より好ましくは約２９ｋＤａの分子量を有する；約５．９〜約６．８
５の等電点を有し、そして補助因子としてＮＡＤまたはＮＡＤＰを必要とする。
【００１２】 本発明の他の局面において、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａから
のセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼをコードするｃＤＮＡは、単離お
よび配列決定され、そして対応するアミノ酸配列は、推定された。従って、本発
明は、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来の、配列番号１、配列番
号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９と示された配列のような、セコイソ
ラリシレシノールデヒドロゲナーゼの発現をコードする単離されたＤＮＡ配列（
これはそれぞれ配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８および配列番
号１０と示されたセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質をコー
ドする）に関する。現在、セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼをコード
する好ましいＤＮＡ配列は、裸子植物種または被子植物種から単離される。
【００１３】 別の局面において、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番
号７、および配列番号９に示された核酸配列を有する核酸分子のいずれか一つの
フラグメント（少なくとも１５塩基長を有する）にストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件下でハイブリダイズする、単離された核酸分子に関する。
【００１４】 従って、本発明は、単離されたタンパク質、およびセコイソラリシレシノール
デヒドロゲナーゼの発現をコードする単離されたＤＮＡ配列に関する。他の局面
において、本発明は、セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質を
コードする核酸配列を含む複製可能組換えクローニングビヒクルに関する。本発
明はまた、セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼＤＮＡまたはＲＮＡの少
なくとも一部に十分に相補的な、それらとのハイブリダイゼーションを可能にす
る塩基配列に関する。前述の相補的塩基配列は、以下を含むがこれらに限定され
ない：アンチセンスセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼＲＮＡ；セコイ
ソラリシレシノールデヒドロゲナーゼＤＮＡに相補的なＤＮＡのフラグメント、
そしてこれらはそれゆえ、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーとして、またはセコ
イソラリシレシノールデヒドロゲナーゼ遺伝子、もしくは関連遺伝子のためのプ
ローブとして有用である。
【００１５】 本発明のなお別の局面において、本発明の組換えクローニングビヒクルおよび
／またはＤＮＡ配列で形質転換され、トランスフェクトされ、感染され、そして
／または注入された改変された宿主細胞が提供される。従って、本発明は、植物
、動物、微生物、および細胞培養物におけるセコイソラリシレシノールデヒドロ
ゲナーゼの組換え発現を提供する。本明細書中に記載される発明概念は、例えば
、植物、動物、微生物、または細胞培養物における、有意な量の組換えセコイソ
ラリシレシノールデヒドロゲナーゼ、またはその酵素産物の産生、単離、および
精製を容易にするために使用され得る。
【００１６】 （好ましい実施態様の詳細な説明） 本明細書中で用いられるように、用語「アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」
および「アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）」は、全ての天然に存在するＬ−
α−アミノ酸またはその残基をいう。アミノ酸は、１文字表記または３文字表記
のいずれかによって識別される：
【００１７】
【表１】 本明細書中で用いられるように、用語「ヌクレオチド」は、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａのモノマー単位をいい、これは、糖部分（ペントース）、リン酸、および窒素
複素環式塩基を含む。塩基は、グリコシド炭素（ペントースの１’炭素）を介し
て糖部分に結合し、そして塩基および糖の組合せは、ヌクレオシドと称される。
この塩基がヌクレオチドを特徴付け、ＤＮＡの４つの塩基は、アデニン（「Ａ」
）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）、およびチミン（「Ｔ」）である
。イノシン（「Ｉ」）は合成塩基であり、これは、４つの天然に存在する塩基（
Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）のいずれかの代わりとなるのに使用され得る。４つのＲ
ＮＡ塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびウラシル（「Ｕ」）である。本明細書中に記載
されるヌクレオチド配列は、隣接するペントースの３’炭素と５’炭素との間の
リン酸ジエステル結合によって結合されるヌクレオチドの線状配列を含む。
【００１８】 「オリゴヌクレオチド」は、リン酸ジエステル結合を介して結合された、デオ
キシリボヌクレオチドの短い長さの一本鎖配列または二本鎖配列をいう。オリゴ
ヌクレオチドは、公知の方法によって化学的に合成され、そして例えば、ポリア
クリルアミドゲル上で、精製される。
【００１９】 用語「改変」、「アミノ酸配列改変」、「改変体」、および「アミノ酸配列改
変体」は、対応する天然のセコイソラリシレシノールレダクターゼと比較して、
それらのアミノ酸配列においていくつかの相違を有するセコイソラリシレシノー
ルレダクターゼ分子をいう。通常は、改変体は、対応する天然のセコイソラリシ
レシノールレダクターゼと少なくとも約７０％の相同性を有し、そして好ましく
は、対応する天然のセコイソラリシレシノールレダクターゼと少なくとも約８０
％相同性である。本発明内にあるセコイソラリシレシノールレダクターゼのアミ
ノ酸配列改変体は、特定の位置での置換、欠失、および／または挿入を有する。
セコイソラリシレシノールレダクターゼの配列改変体は、所望の増強または減少
された酵素活性、改変された位置化学または立体化学、あるいは改変された基質
利用性または産物分布を達成するために使用され得る。
【００２０】 置換セコイソラリシレシノールレダクターゼ改変体は、対応する天然のセコイ
ソラリシレシノールレダクターゼ配列における少なくとも１つのアミノ酸残基が
除去され、および同じ位置で代わりに異なるアミノ酸が挿入されたものである。
置換は単一であり得、ここで分子中の１つのアミノ酸のみが置換されているか、
または複数であり得、ここで同じ分子中の２つ以上のアミノ酸が置換されている
。セコイソラリシレシノールレダクターゼ分子の活性における置換変化は、天然
のアミノ酸の側鎖とは、電荷および／または構造において有意に異なる側鎖を有
するアミノ酸を置換することによって得られ得る。この型の置換は、ポリペプチ
ド骨格の構造および／または置換の領域における分子の電荷もしくは疎水性に影
響を及ぼすことが予測される。
【００２１】 セコイソラリシレシノールレダクターゼ分子の活性における穏和な変化は、天
然の分子の側鎖と電荷および／または構造において類似である側鎖を有するアミ
ノ酸の置換によって予測される。この型の置換（保存的置換といわれる）は、ポ
リペプチド骨格の構造または置換の領域における分子の電荷もしくは疎水性のい
ずれかを実質的に変更させないと予測される。
【００２２】 挿入セコイソラリシレシノールレダクターゼ改変体は、天然のセコイソラリシ
レシノールレダクターゼ分子における特定の位置でアミノ酸のすぐ隣に挿入され
る１つ以上のアミノ酸を有するものである。アミノ酸のすぐ隣とは、そのアミノ
酸のαカルボキシまたはαアミノ官能基のいずれかに結合されることを意味する
。挿入は、１つ以上のアミノ酸であり得る。通常は、挿入は、１つまたは２つの
保存的アミノ酸からなる。挿入の部位に隣接するアミノ酸に電荷および／または
構造において類似のアミノ酸は、保存的であるとして定義される。あるいは、本
発明は、挿入の部位に隣接するアミノ酸とは実質的に異なる電荷および／または
構造を有するアミノ酸の挿入を含む。
【００２３】 欠失改変体は、天然のセコイソラリシレシノールレダクターゼ分子における１
つ以上のアミノ酸が除去されているものである。通常は、欠失改変体は、セコイ
ソラリシレシノールレダクターゼ分子の特定の領域において１つまたは２つのア
ミノ酸が欠失している。
【００２４】 セコイソラリシレシノールレダクターゼのアミノ酸配列改変体は、例えば、改
変された反応速度論、基質利用性、産物分布、または位置化学および立体化学の
ような他の特徴を含む所望される改変された生物学的活性を有し得る。
【００２５】 用語「アンチセンス」または「アンチセンスＲＮＡ」または「アンチセンス核
酸」は、メッセンジャーＲＮＡ分子の全てまたは一部に相補的である核酸分子を
意味するように、本明細書中で使用される。アンチセンス核酸分子は、代表的に
は、相補的な発現されるメッセンジャーＲＮＡ分子のインビボでの発現を阻害す
るために使用される。
【００２６】 用語「コードするＤＮＡ配列」、「コードするＤＮＡ」および「コードする核
酸」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順番または
配列をいう。これらのデオキシリボヌクレオチドの順番は、翻訳されたポリペプ
チド鎖に沿ったアミノ酸の順番を決定する。従って、ＤＮＡ配列は、アミノ酸配
列をコードする。
【００２７】 用語「複製可能発現ベクター」および「発現ベクター」は、ＤＮＡの小片、通
常は二本鎖をいい、ここで、外来ＤＮＡの小片がそれに挿入されている。外来Ｄ
ＮＡは、異種ＤＮＡとして規定され、これは宿主において天然には見い出されな
いＤＮＡである。ベクターは、外来または異種ＤＮＡを適切な宿主細胞に輸送す
るのに使用される。一旦宿主細胞に入ると、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡと独
立的または同時に複製し得、そしてベクターおよびその挿入した（外来）ＤＮＡ
のいくつかのコピーが生成され得る。さらに、ベクターは、外来ＤＮＡのポリペ
プチドへの翻訳を可能にする必要なエレメントを含む。従って、外来ＤＮＡによ
ってコードされるポリペプチドの多くの分子は、迅速に合成され得る。
【００２８】 用語「形質転換宿主細胞」、「形質転換された」、および「形質転換」は、Ｄ
ＮＡの細胞への導入をいう。細胞は「宿主細胞」と称され、そして原核生物細胞
または真核生物細胞であり得る。代表的な原核生物宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏ
ｌｉの種々の株が挙げられる。代表的な真核生物宿主細胞は、植物細胞（例えば
、トウモロコシ細胞）、酵母細胞、昆虫細胞、または動物細胞である。導入され
たＤＮＡは、通常、ＤＮＡの挿入小片を含むベクターの形態である。導入された
ＤＮＡ配列は、宿主細胞と同じ種由来、または宿主細胞とは異なる種由来であり
得るか、またはハイブリッドＤＮＡ配列（いくつかの外来ＤＮＡおよび宿主種に
由来するいくつかのＤＮＡを含む）であり得る。
【００２９】 略語「ＳＳＣ」は、核酸ハイブリダイゼーション溶液に使用される緩衝剤をい
う。１リットルの２０Ｘ（２０倍濃度）ストックＳＳＣ緩衝溶液（ｐＨ７．０ は、１７５．３ｇの塩化ナトリウムおよび８８．２ｇのクエン酸ナトリウムを含
む。
【００３０】 本発明に従って、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のセコイソ
ラリシレシノールレダクターゼタンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、ＤＥＡＥ
−セルロース、ＡＤＰ−セファロース、およびＭｏｎｏＰ（ＨＲ５／２０）クロ
マトグラフィーおよびカラムの組み合わせを使用して、６０００倍より高い精製
を介して見かけの均質性まで精製されている。精製されたセコイソラリシレシノ
ールレダクターゼタンパク質のＮ末端を配列決定し、Ｎ末端配列（配列番号１１
）を得た。精製されたセコイソラリシレシノールレダクターゼタンパク質のトリ
プシン処理フラグメントを単離し、そして配列決定した（配列番号１２（ペプチ
ド１）および配列番号１３（ペプチド２））。
【００３１】 Ｎ末端アミノ酸配列（配列番号１１）および中間ペプチド（配列番号１２およ
び配列番号１３）は、変性オリゴヌクレオチドプライマーを構築するために使用
された。プライマーＤＥＨＹＦ２６（配列番号１４）を、配列番号１２で示され
るアミノ酸配列を有するペプチド１のアミノ酸配列に基づいて構築した。プライ
マーＤＥＨＹＦ３０ＲｅｖＡ（配列番号１５）およびＤＥＨＹＦ３０ＲｅｖＢ（
配列番号１６）を、それぞれ配列番号１３で示したアミノ酸配列を有するペプチ
ド２のアミノ酸配列に基づいて構築した。精製されたＦ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ
ｃＤＮＡライブラリＤＮＡ（２ｎｇ）を、プライマーＤＥＨＹＦ２６（配列番
号１４）とプライマーＤＥＨＹＦ３０ＲｅｖＡ（配列番号１５）またはプライマ
ーＤＥＨＹ３０ＲｅｖＢ（配列番号１６）のいずれかとを用いたＰＣＲ増幅反応
におけるテンプレートとして使用された。得られたＰＣＲ産物の２００ｂｐフラ
グメントを、Ｆ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ｃＤＮＡライブラリをスクリーンする
ためのプローブとして使用した。１つのポジティブでシグナルは、このスクリー
ニングから得られたが、このクローンは、（−）−セコイソラリシレシノールレ
ダクターゼの元のＮ末端配列分析との比較によって示されたように、約６０個の
アミノ酸残基がＮ末端において切断されていると見積もられた。
【００３２】 プライマー、ＤＥＨＹ１９ＲＥＶ（配列番号１７）を、短縮型クローンの３’
末端から作製し、そしてテンプレートとして元のＦｏｒｓｙｔｈｉａ ｃＤＮＡ
ライブラリ精製ファージＤＮＡを用いて使用したが、完全なＮ末端を有するｃＤ
ＮＡクローンを得るのに失敗した。結果として、別のプライマー、ＤＥＨＹＦ３
０ＲＥＶＢ（配列番号１８）を、短縮型クローンの３’末端から合成し、そして
テンプレートとして元のＦｏｒｓｙｔｈｉａ ｃＤＮＡライブラリ精製ファージ
ＤＮＡを用いたＰＣＲにおいてＴ３プライマー（配列番号１９）と共に使用した
。このＰＣＲ産物は、ＴＡベクター内へクローン化される場合、ブロットしたタ
ンパク質（配列番号１１）の初期アミノ酸配列決定から得られる完全なＮ末端を
有するクローンを生じた。このクローンのＮ末端ＤＮＡ配列から作製した新しい
プライマー、ＤＥＨＹＮＴＥＲＭ１（配列番号２０）を、Ｔ７プライマー（配列
番号２１）と共に、テンプレートとして元の精製したＦｏｒｓｙｔｈｉａ ｃＤ
ＮＡライブラリと共に使用した。得られた１ｋｂのＰＣＲバンドを、アガロース
ゲル上で精製し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ３０（ＡＭＩＣＯＮ）を使用することにより
溶出し、ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に直接クローン化した。これ
は、元のタンパク質（配列番号１１）内に存在する完全なＮ末端アミノ酸配列を
含むＤＮＡ配列を有するクローン（ＤＥＨＹ１３０）（配列番号２２）を提供し
た。ＤＥＨＹ１３０（配列番号２２）によってコードされたアミノ酸配列（配列
番号２３）は、開始メチオニンを欠いた。新しい５’（プライマー（ＤＥＨＹ１
３０ＮＴＥＲＭ（配列番号２４）と称する）を配列の始めに開始メチオニンを含
むように合成した。また、５’プライマー（配列番号２４）および３’プライマ
ー（ＤＥＨＹ１３０ＣＴＥＲＭ（配列番号２５）と称する）を、Ｅ．ｃｏｌｉ．
内のタンパク質の産生のためのＳＢＥＴ発現ベクター内への後の挿入のためのク
ローンの両端にて、ＮｄｅＩ制限酵素部位を組み込むように設計した。約８５９
ｂｐ（配列番号１）の得られたＰＣＲ産物（ＤＥＨＹ１３３と称する）は、ＴＡ
ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に直接クローン化した。このＤＮＡ配列は
、ＤＥＨＹ１３３レダクターゼクローン（配列番号１）がここでＭｅｔ開始コド
ンを含むことを示した。
【００３３】 さらに、操作されたＤＥＨＹ１３３クローン（配列番号１）由来のＮｄｅＩフ
ラグメントを、元のＦ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ｃＤＮＡライブラリから３００
，０００ｐｆｕを再スクリーンするためのプローブとして使用した。これは、追
加のセコイソラリシレシノールレダクターゼクローンの単離を生じた。４つのこ
れらのクローンの核酸配列を、以下に記載する：配列番号３（ＳＭＤＥＨＹ３２
１と称する）、配列番号５（ＳＭＤＥＨＹ４３１と称する）、配列番号７（ＳＭ
ＤＥＨＹ５１１と称する）、配列番号９（ＳＭＤＥＨＹ６３１と称する）。ＳＭ
ＤＥＨＹ３２１（配列番号３）およびＳＭＤＥＨＹ６３１（配列番号９）のよう
な、これらのクローンの幾つかは、Ｅ．ｃｏｌｉ内で、（−）−セコイソラリシ
レシノールの（−）−マタイレシノールへの立体化学的変換を触媒するタンパク
質を産生した。
【００３４】 セコイソラリシレシノールレダクターゼをコードするｃＤＮＡの単離は、この
機能性酵素の効率的な発現系の発達を可能にし、リグナン生合成の発達調節を試
験するための有用なツールを提供し、他のセコイソラリシレシノールレダクター
ゼの単離を可能にする。セコイソラリシレシノールレダクターゼｃＤＮＡの単離
はまた、リグナン生合成を向上するかまたは改変するために、広範囲の生物の形
質転換を可能にする。
【００３５】 非制限的な例として、本発明のタンパク質および核酸は、蔬菜、穀物および果
実、およびこのような遺伝学的に改変された植物由来の物質を取り込む食物品目
を含むがこれらに限定されない、植物種内のエンテロラクトンおよびエンテロジ
オールのような植物性発情ホルモン様物質を含む、健常保護リグナンのレベルを
向上するかまたは他に改変するために；例えば、中性食品（ｎｅｕｔｒｉｃｅｕ
ｔｉｃａｌｓ）および栄養補助食品として種々の目的に有用なリグナンの豊富な
天然供給を提供するために植物種を遺伝学的に改変するために；所望される生物
学的特性を有する光学活性的に純粋なリグナン（例えば、抗ウィルス特性を有す
る（−）−トラケロゲニンおよび（−）−ポドフィロトキシン）の豊富な供給を
産生するために生物を遺伝学的に改変するために、利用され得る。
【００３６】 当該分野で周知のＮ末端輸送配列（例えば、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．ら、
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １８０：５３５−５４５（１９８９）；Ｓｔｒｙ
ｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍ
ｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ，７６９頁（１９８８）を参照のこと）
は、種々の細胞または細胞外位置に、セコイソラリシレシノールレダクターゼを
指向させるのに使用され得る。
【００３７】 欠失、置換、変異、および／または挿入によって産生され得る、野生型セコイ
ソラリシレシノールレダクターゼクローンの配列改変体は、先行技術によって制
限される範囲を除いて、本発明の範囲内であることが意図される。セコイソラリ
シレシノールレダクターゼアミノ酸配列改変体は、野生型セコイソラリシレシノ
ールレダクターゼをコードするＤＮＡ配列を、例えば、部位特異的変異誘発と通
常呼ばれる技術を用いることにより変異させることによって構築され得る。現在
、当該分野において周知である種々のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（例え
ば、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ
Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットのような２プライマー系）が、この目的のため
に使用され得る。
【００３８】 この系における標的プラスミドの変性に続いて、２つのプライマーを、プラス
ミドに同時にアニールさせる；これらのプライマーのうちの一方は、所望の部位
特異的変異を含み、他方は、プラスミドにおける別の点での変異を含み、制限部
位の排除を生じる。次いで、第２鎖合成を行い、これらの２つの変異を強固に連
結させ、そして得られるプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＳ株に形質転換さ
れる。プラスミドＤＮＡを、形質転換細菌から単離し、問題の制限酵素で制限し
（これにより、非変異プラスミドを線状化する）、次いでＥ．ｃｏｌｉに形質転
換させる。この系は、サブクローニングまたは一本鎖ファージミドの生成を必要
とせずに、発現プラスミドにおいて直接変異の生成を可能にする。２つの変異の
強固な連結および続く非変異プラスミドの線状化は、高い変異効率を生じ、そし
て最小スクリーニングを可能にする。最初の制限部位プライマーの合成に続いて
、この方法は、１変異部位あたり１つの新規なプライマー型のみの使用を必要と
する。各位置変異体を別々に調製するよりはむしろ、「設計された縮重」オリゴ
ヌクレオチドプライマーのセットが、所定の部位で所望の変異の全てを同時に導
入するために合成され得る。形質転換体は、変異された領域を通じてプラスミド
ＤＮＡを配列決定して変異クローンを同定および選別することによってスクリー
ニングされ得る。次いで、各変異体ＤＮＡを制限し、そしてＭｕｔａｔｉｏｎ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔゲル（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）で電
気泳動することによって分析して、配列に他の改変が生じていないことを（未変
異誘発コントロールに対するバンドシフト比較によって）確認し得る。
【００３９】 検証した変異体二重鎖は、既にこの型のベクターにクローン化されていない場
合、複製可能発現ベクターにクローン化され得、そして得られる発現ベクター構
築物は、変異体タンパク質の高レベルの産生および続くそのタンパク質の精製の
ため、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株
）を形質転換するために使用され得る。ＦＡＢ−ＭＳマッピングの方法は、変異
体発現の忠実度を迅速にチェックするために使用され得る。この技術は、全体タ
ンパク質を通じてセグメントを配列決定することを提供し、そして配列の割り当
てにおける必要な確信を提供する。この型のマッピング実験において、タンパク
質をプロテアーゼで消化する（選択は、改変される特定領域に依存する。なぜな
ら、このセグメントが最重要であり、そして残りのマップは未変異誘発タンパク
質のマップと同一であるはずだからである）。切断フラグメントのセットは、微
小孔（ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ）ＨＰＬＣ（逆相またはイオン交換、再度、改変され
る特異的領域に依存する）によって分画されて、各々の画分においていくつかの
ペプチドを提供し、そしてペプチドの分子量は、ＦＡＢ−ＭＳによって決定され
る。次いで、質量を、予測配列の消化から予測したペプチドの分子量と比較し、
そして配列の正確さが素早く確認する。タンパク質改変へのこの変異誘発アプロ
ーチが指向されるので、改変したペプチドの配列決定は、ＭＳが予測と一致する
場合、必要ではない。変化した残基を検証することが必要な場合、ＣＡＤタンデ
ムＭＳ／ＭＳを使用して、問題の混合物のペプチドを配列決定し得るか、または
標的ペプチドを、改変の位置に依存して、減算エドマン分解またはカルボキシペ
プチダーゼＹ消化のために精製し得る。
【００４０】 特定の部位特異的変異体の設計において、非保存的置換（例えば、Ｃｙｓ、Ｈ
ｉｓまたはＧｌｕをＡｌａに）を最初に行い、そして活性が結果的に大きく損な
われるかどうかを決定することが一般的に所望され得る。次いで、変異誘発した
タンパク質の特性は、改変した機能の感受性指標としてのＫmおよびｋcatの速度
パラメーターに対して特別の注意をもって試験され、そこから、結合および／ま
たは触媒作用における変化自体は、天然の酵素に対する比較によって推定され得
る。残基が、この手段によって、活性減損またはノックアウトによって重要であ
ると実証される場合、保存的置換が行われ得る（例えば、側鎖の長さを改変する
ためのＧｌｕをＡｓｐに；ＣｙｓをＳｅｒに、またはＨｉｓをＡｒｇに）。芳香
族もまた、アルキル側鎖を置換され得るが、疎水性セグメントについては、改変
されるのは主にサイズである。正常な産物分布における変化は、反応シーケンス
のどの工程が、変異によって改変されているかを示し得る。
【００４１】 他の部位特異的変異誘発技術もまた、本発明のヌクレオチド配列とともに使用
され得る。例えば、ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化に続く連結は、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋらの第１５．３節に記載されるように、セコイソラリシレシノールレ
ダクターゼ欠失改変体を生成するのに使用され得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ， ＮＹ（１９８９））。同様のストラテジーは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
（前出）の第１５．３節に記載されるように、挿入改変体を構築するのに使用さ
れ得る。
【００４２】 オリゴヌクレオチド特異的変異誘発もまた、本発明の置換改変体を調製するの
に使用され得る。本発明の欠失および挿入改変体を簡便に調製するためにもまた
使用され得る。この技術は、Ａｄｅｌｍａｎら（ＤＮＡ ２：１８３（１９８３
））によって記載されるように、当該分野で周知である。一般的には、少なくと
も２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが、セコイソラリシレシノールレダ
クターゼ遺伝子において２つ以上のヌクレオチドを挿入、欠失、または置換する
ために使用される。至適オリゴヌクレオチドは、変異をコードするヌクレオチド
のどちらの側でも１２〜１５の完全に一致したヌクレオチドを有する。野生型セ
コイソラリシレシノールレダクターゼを変異誘発するために、オリゴヌクレオチ
ドを、適切なハイブリダイゼーション条件下で、一本鎖ＤＮＡテンプレート分子
にアニールさせる。次いで、ＤＮＡ重合化酵素（通常は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ
ポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント）を添加する。この酵素は、ＤＮＡ
の変異保有鎖の合成を完了するためのプライマーとして、オリゴヌクレオチドを
使用する。従って、ヘテロ二重鎖分子が形成され、その結果、ＤＮＡの１つの鎖
は、ベクターに挿入された野生型セコイソラリシレシノールレダクターゼをコー
ドし、そしてＤＮＡの第２の鎖は、同じベクターに挿入されたセコイソラリシレ
シノールレダクターゼの変異形態をコードする。次いで、このヘテロ二重鎖分子
は、適切な宿主細胞に形質転換される。
【００４３】 置換された１より多いアミノ酸を有する変異体は、いくつかの方法のうちの１
つにおいて生成され得る。アミノ酸がポリペプチド鎖においてともに近接して位
置する場合、それらは、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌ
クレオチドを用いて、同時に変異され得る。しかし、アミノ酸が、互いにいくら
か離れて位置する場合（例えば、１０アミノ酸以上によって隔てられる）、所望
の変化の全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを作製するのはより困難で
ある。代わりに、２つの別の方法のうち１つが使用され得る。第１の方法におい
て、別々のオリゴヌクレオチドを、置換される各アミノ酸のために作製する。次
いで、このオリゴヌクレオチドを、一本鎖テンプレートＤＮＡに同時にアニール
させ、そしてテンプレートから合成されるＤＮＡの第２鎖は、所望のアミノ酸置
換の全てをコードする。
【００４４】 別の方法は、所望の変異体を産生するための２回以上の変異誘発を包含する。
１回目は、単一の変異体について記載されるとおりである：野生型セコイソラリ
シレシノールレダクターゼＤＮＡを、テンプレートのために使用し、第１の所望
のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドを、このテンプレートにアニー
ルし、そして次いで、ヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子を生成する。２回目の変異誘発は
、１回目の変異誘発において産生した変異ＤＮＡをテンプレートとして利用する
。従って、このテンプレートは既に、１つ以上の変異を含む。次いで、さらなる
所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドを、このテンプレートにア
ニールさせ、そしてＤＮＡの得られた鎖は今や、一回目および２回目の変異誘発
の両方からの変異をコードする。この得られたＤＮＡは、３回目の変異誘発にお
いて、テンプレートとして使用され、この後同様に続き得る。
【００４５】 真核生物発現系は、セコイソラリシレシノールレダクターゼ産生のために利用
され得る。なぜなら、それらは、任意の必要な翻訳後改変を行い得、そして適切
な膜位置に酵素を指向させ得るからである。この目的のための代表的な真核生物
発現系は、組換えバキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ｃａ核多核体ウイルス（ＡｃＮＰＶ；Ｍ．Ｄ．ＳｕｍｍｅｒｓおよびＧ．Ｅ．Ｓ
ｍｉｔｈ， Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏ
ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ （１９８６）；Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ−ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ ６：４７−５５（１９８７））を、本発明のセコイソラリシレシ
ノールレダクターゼの発現のために使用する。昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐ
ｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ種の細胞）の組換えバキュロウイルスによる感
染は、大量のセコイソラリシレシノールレダクターゼタンパク質の産生を可能に
する。さらに、バキュロウイルス系は、組換えセコイソラリシレシノールレダク
ターゼの産生についての他の重要な利点を有する。例えば、バキュロウイルスは
ヒトに感染せず、そしてそれゆえ、大量に安全に扱われ得る。バキュロウイルス
系において、セコイソラリシレシノールレダクターゼをコードするＤＮＡセグメ
ントおよびベクターを包含するＤＮＡ構築物が調製される。ベクターは、バキュ
ロウイルスの多核体遺伝子プロモーター領域、組換えの間の適切な交差に必要な
バキュロウイルス隣接配列（この隣接配列は、プロモーター配列に隣接する約２
００〜３００塩基対を含む）、および構築物が細菌において複製することを可能
にする細菌の複製起点を含み得る。ベクターが構築され、その結果、（ｉ）ＤＮ
Ａセグメントが、多核体遺伝子プロモーターに隣接して（または、これに作動可
能に連結して、またはこれの「下流」または「制御下に」）配置され、そして（
ｉｉ）プロモーター／セコイソラリシレシノールレダクターゼの組合せの両側に
、バキュロウイルスＤＮＡの２００〜３００塩基対（隣接配列）が隣接する。
【００４６】 セコイソラリシレシノールレダクターゼＤＮＡ構築物を産生するために、全長
セコイソラリシレシノールレダクターゼをコードするｃＤＮＡクローンは、本明
細書中に記載されるような方法を用いて得られる。ＤＮＡ構築物を、宿主細胞に
おいて、適切なバキュロウイルス（すなわち、構築物においてコードされるプロ
モーターと同じ種のバキュロウイルス）のバキュロウイルスＤＮＡと、組換えが
成立する条件下で接触させる。得られる組換えバキュロウイルスは、完全なセコ
イソラリシレシノールレダクターゼをコードする。例えば、昆虫宿主細胞を、Ｄ
ＮＡ構築物および機能的バキュロウイルスで、同時トランスフェクトし得るかま
たは別々にトランスフェクトし得る。次いで、得られる組換えバキュロウイルス
を単離し、そしてこれを細胞に感染させて、セコイソラリシレシノールレダクタ
ーゼの産生をもたらすために使用し得る。宿主昆虫細胞としては、例えば、Ｓｐ
ｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞が挙げられる。次いで、本発明の
組換えバキュロウイルスに感染した昆虫宿主細胞を、バキュロウイルスにコード
されるセコイソラリシレシノールレダクターゼの発現を可能にする条件下で培養
する。このように、産生される組換えタンパク質を、次いで、当該分野で公知の
方法を用いて細胞から抽出する。
【００４７】 酵母のような他の真核微生物もまた、本発明を実施するために使用され得る。
いくつかの他の株が利用可能であるが、パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが、一般的に使用される酵母である。プラスミドＹＲｐ７
（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎ
ｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇ
ｅｎｅ １０：１５７（１９８０））は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける
発現ベクターとして、一般的に使用される。このプラスミドは、トリプトファン
において増殖する能力を欠く酵母の変異体株（例えば、ＡＴＣＣ番号４４，０７
６およびＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２（１９７７
）））についての選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子を含む。次いで、酵母
宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンの非存在
下において増殖することにより形質転換を検出するための有効な環境を提供する
。酵母宿主細胞は一般的に、Ｈｉｎｎｅｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９（１９７８））に記載のように、ポリエチレング
リコール法を用いて形質転換される。さらなる酵母形質転換プロトコルは、Ｇｉ
ｅｔｚら、Ｎ．Ａ．Ｒ． ２０（１７）：１４２５（１９９２）；Ｒｅｅｖｅｓ
ら、ＦＥＭＳ ９９：１９３−１９７（１９９２）に示される。
【００４８】 酵母ベクターにおける適切なプロモート配列は、３−ホスホグリセリン酸キナ
ーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９
８０））または他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ
．７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １
７：４９００（１９７８））（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホ
スホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリ
セリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホス
ホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）についてのプロモーターを
含む。適切な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝子に関連する終結配
列もまた、発現されることが所望される配列の３’側で発現ベクターに連結され
て、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終結を提供する。増殖条件によって制御さ
れる転写のさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ２、イソシトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素
、および前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマル
トースおよびガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域である。酵母適合
性プロモーター、複製起点、および終結配列を含む任意のプラスミドベクターが
適切である。
【００４９】 多細胞生物（例えば、植物）に由来する細胞培養物は、本発明を実施するため
の宿主として使用され得る。トランスジェニック植物は、例えば、セコイソラリ
シレシノールレダクターゼをコードするプラスミド、ならびに選択マーカー遺伝
子（例えば、カナマイシン耐性をコードするｋａｎ遺伝子）を、Ｈｏｅｃｋｅｍ
ａら、Ｎａｔｕｒｅ ３０３：１７９−１８１（１９８３）に記載されるように
、ヘルパーＴｉプラスミドを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｉｆａｃ
ｉｅｎｓに移入し、そしてＡｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ８１：
３０１−３０５（１９８６）に記載されるように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
細胞を形質転換される植物の葉スライスとともに培養することによって得られ得
る。培養した植物宿主細胞の形質転換は、通常、上記のように、Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓを介して達成される。哺乳動物宿主細胞
および固い細胞膜バリアを有さない他の宿主細胞の培養物は、通常、Ｇｒａｈａ
ｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：５４６（１９７８）
）によって元々記載され、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）の第１６．３２〜
１６．３７節に記載されるように改変されたリン酸カルシウム法を用いて形質転
換する。しかし、ＤＮＡを細胞に導入するための他の方法もまた使用され得る：
例えば、ポリブレン（ＫａｗａｉおよびＮｉｓｈｉｚａｗａ， Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ． ４：１１７２（１９８４））、プロトプラスト融合（Ｓｃｈａ
ｆｆｎｅｒ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１６
３（１９８０））、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ
． １：８４１（１９８２））、および核への直接マイクロインジェクション（
Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｃｅｌｌ ２２：４７９（１９８０））。さらに、動物形
質転換ストラテジーは、Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ Ｇ．Ｍ．およびＲｏｂｌ，Ｊ
．Ｍ．， Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．
（１９９５）に概説される。形質転換植物カルスを、選択マーカーを介して、例
えば、カナマイシンおよび適切な量の植物ホルモン（例えば、カルスおよびシュ
ート誘導のためナフタレン酢酸およびベンジルアデニン）を含む培地で細胞を増
殖させることによって選択し得る。次いで、植物細胞を再生させ得、そして得ら
れた植物を、当業者に周知の技術を用いて土壌に移す。
【００５０】 さらに、セコイソラリシレシノールレダクターゼ産生を調節する遺伝子を、誘
導可能な必要なプロモーターとともに植物に取り込み得る。本発明のこの実施態
様の実施において、特定の外部または内部刺激のみに応答するプロモーターが、
標的ｃＤＮＡに融合される。従って、遺伝子は、特定の刺激に応答する以外には
、転写されない。遺伝子が転写されない限りは、その遺伝子産物は産生されない
。
【００５１】 本発明の実施において使用され得る応答性プロモーター系の例示的な例は、ト
ウモロコシにおけるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）系である
。ＧＳＴは、発芽前除草剤としてしばしば使用される多数の疎水性求電子化合物
を解毒し得る酵素のファミリーである（Ｗｅｉｇａｎｄら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：２３５−２４３（１９８６））。研究は、
ＧＳＴが、この増強された除草剤耐性を生じることに直接関与することを示して
いる。この作用は、主に、特定の１．１ｋｂ ｍＲＮＡ転写産物を通して媒介さ
れる。要約すれば、トウモロコシは、外部刺激に応答し得、そして遺伝子産物を
産生するように誘導され得る、既に存在する天然に存在する静止遺伝子を有する
。この遺伝子は、以前に同定およびクローニングされている。従って、本発明の
１つの実施態様において、プロモーターは、ＧＳＴ応答遺伝子から取り出され、
そして前もってその天然のプロモーターが除去されている、セコイソラリシレシ
ノールレダクターゼ遺伝子に付着される。この操作された遺伝子は、外部化学刺
激に応答するプロモーターと、セコイソラリシレシノールレダクターゼタンパク
質の首尾良い産生を担う遺伝子との組合せである。
【００５２】 上記の方法に加えて、クローン化ＤＮＡを広範な種々の植物種（裸子植物、被
子植物、単子葉植物、および双子葉植物を含む）に移入するためのいくつかの方
法が、当該分野で公知である（例えば、ＧｌｉｃｋおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ編、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９３）
を参照のこと）。例示的な例としては、プロトプラストによるエレクトロポレー
ション促進性ＤＮＡ取り込み（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０（４８
４９）：２０４−２０７（１９８８））：プロトプラストのポリエチレングリコ
ールでの処理（Ｌｙｚｎｉｋら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ １３：１５１−１６１（１９８９））；および細胞のＤＮＡ荷積（ｌａｄ
ｅｎ）微粒子銃のボンバードメント（Ｋｌｅｉｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ． ９１：４４０−４４４（１９８９）およびＢｏｙｎｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４０（４８５８）：１５３４−１５３８（１９８８））が挙げられる。
多数の方法が、例えば、禾穀類の形質転換について現在存在する（例えば、Ｍｃ
Ｋｉｎｎｏｎ，Ｇ．Ｅ．およびＨｅｎｒｙ，Ｒ．Ｊ．， Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ， ２２（３）：２０３−２１０（１９９５）；Ｍｅｎｄｅｌ，Ｒ
．Ｒ．およびＴｅｅｒｉ，Ｔ．Ｈ．， Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａ
ｌ Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ， ３：
８１−９８， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９
９５）；ＭｃＥｌｒｏｙ，Ｄ．およびＢｒｅｔｔｅｌｌ， Ｒ．Ｉ．Ｓ．， Ｔ
ｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １２（２）：６２−６８（
１９９４）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ， １０（７）：２３９−２４６（１９９２）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．
およびＦｏｒｄ，Ｔ．Ｌ．， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ， ７５（５
）：４４９−４５４（１９９５）；Ｐａｒｋら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３２（６）：１１３５−１１４８（１９９６）；Ａｌｔ
ｐｅｔｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， １６：１２−１７（
１９９６）を参照のこと）。さらに、植物形質転換ストラテジーおよび技術は、
Ｂｉｒｃｈ，Ｒ．Ｇ．， Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：２９７（１９９７）；Ｆｏｒｅｓｔｅｒら、Ｅｘｐ
．Ａｇｒｉｃ． ３３：１５−３３（１９９７）に概説される。わずかな改変に
より、これらの技術が広範な植物種に適用可能である。遺伝学的に形質転換する
植物のための方法を開示する上記の刊行物の各々は、本明細書中で参考として援
用される。
【００５３】 非限定的例示のために、本発明の実施において、以下の植物属および種が、セ
コイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする核酸分子およ
び／またはセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする
核酸分子の少なくとも一部に相補的な核酸分子を用いて遺伝的に形質転換され得
る：
【００５４】
【数１】 これらの植物形質転換技術の各々は、利点と欠点を有する。各々の技術におい
て、プラスミドからのＤＮＡは、目的の遺伝子のみでなく、選択可能マーカー遺
伝子およびスクリーニング可能マーカー遺伝子をも含むように遺伝子操作される
。選択可能マーカー遺伝子は、プラスミドのコピーを取り込んでいるこれらの細
胞のみを選択するのに使用される（目的の遺伝子および選択可能遺伝子およびス
クリーニング可能遺伝子が、一単位として移入されるように構築される）。スク
リーニング可能な遺伝子は、目的の遺伝子を有するこれらの細胞のみの首尾良い
培養のための別のチェックを提供する。一般的に使用される選択可能マーカー遺
伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ ＩＩ）である。
この遺伝子は、カナマイシン（細胞が増殖する増殖培地に、直接添加され得る化
合物）に対する耐性を伝達する。植物細胞は、通常、カナマイシンに感受性であ
り、そして結果として死亡する。ＮＰＴ ＩＩ遺伝子の存在は、カナマイシンの
影響を克服し、そしてこの遺伝子を有する各々の細胞は、生存したままである。
本発明の実施において使用され得る、別の選択可能マーカー遺伝子は、除草剤グ
ルフォシネート（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ）（Ｂａｓｔａ）への耐性を付与する
遺伝子である。一般的に使用されるスクリーニング可能な遺伝子は、βグルクロ
ニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である。この遺伝子の存在は、組織化学反応（形質転
換されたと推定される細胞のサンプルが、ＧＵＳアッセイ溶液で処理される）を
用いて特徴づけられる。適切なインキュベーションの後、ＧＵＳ遺伝子を含む細
胞は青色に変わる。好ましくは、プラスミドは、選択可能マーカー遺伝子および
スクリーニング可能マーカー遺伝子の両方を含む。
【００５５】 これらの遺伝子の１つ以上を含むプラスミドは、植物プロトプラストまたはカ
ルス細胞のいずれかに、以前に言及した技術のいずれかによって導入される。マ
ーカー遺伝子が選択可能な遺伝子である場合、ＤＮＡパッケージを取り込んでい
るこれらの細胞のみが、適切な植物毒素試薬での選択下で生存可能である。一旦
、適切な細胞が同定されそして繁殖されると、植物は再生される。形質転換植物
からの子孫は、ＤＮＡパッケージが植物ゲノムに首尾良く取り込まれていること
を保証するために、試験されなければならない。
【００５６】 哺乳動物宿主細胞もまた、本発明の実施において使用され得る。適切な哺乳動
物細胞株の例としては、以下が挙げられる：ＳＶ４０によって形質転換されたサ
ル腎臓ＣＶＩ株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児性腎臓
株２９３Ｓ（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｌ．３６：５９（１９７７）
）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニ
ーズハムスター卵巣細胞（ＵｒｌａｂおよびＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルト
ーリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ． ２３：２４３
（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ−７６、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；ア
フリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；
ヒト子宮頚ガン細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤ
ＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ
、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ
７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍細胞（
ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；ラット肝臓ガン細胞（ＨＴ
Ｃ、ＭＩ５４、Ｂａｕｍａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８５：１（１９８
０））；ならびにＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ３８３：４４（１９８２）。これらの細胞についての発現ベク
ターは、本来（必要であれば）、複製起点、発現される遺伝子の前に位置するプ
ロモーター、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位
、および転写終結部位のＤＮＡ配列を含む。
【００５７】 哺乳動物発現ベクターに使用されるプロモーターは、しばしば、ウイルス起源
である。これらのウイルスプロモーターは、一般的には、ポリオーマウイルス、
アデノウイルス２、および最も頻繁には、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に
由来する。ＳＶ４０ウイルスは、初期および後期プロモーターと称される２つの
プロモーターを含む。これらのプロモーターは特に有用である。なぜなら、それ
らは両方、ウイルス複製起点も含む１つのＤＮＡフラグメントとして、ウイルス
から容易に得られるからである（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３
（１９７８））。より小さなまたはより大きなＳＶ４０ ＤＮＡフラグメントも
また使用され得る。ただし、これらのフラグメントは、ウイルス複製起点に位置
するＢｇｌＩ部位に向かうＨｉｎｄＩＩＩ部位から伸張される約２５０ｂｐ配列
を含む。
【００５８】 あるいは、外来遺伝子と天然に会合するプロモーター（同種プロモーター）が
使用され得る。ただし、これらのプロモーターは、形質転換のために選択される
宿主細胞株と適合可能である。
【００５９】 複製起点は、外因性供給源（例えば、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、
ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）から得られ得、そしてクローニングベク
ターに挿入され得る。あるいは、複製起点は、宿主細胞染色体複製機構によって
提供され得る。外来遺伝子を含むベクターが、宿主細胞染色体に取り込まれる場
合、後者はしばしば十分である。
【００６０】 二次ＤＮＡコード配列の使用は、形質転換細胞株におけるセコイソラリシレシ
ノールデヒドロゲナーゼタンパク質の産生レベルを増強し得る。二次コード配列
は、代表的には、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を含む。ＤＨＦＲ
の野生型形態は、通常、化学物質メトトレキセート（ＭＴＸ）によって阻害され
る。細胞におけるＤＨＦＲ発現のレベルは、培養宿主細胞に添加されるＭＴＸの
量に依存して変化する。二次配列としてＤＨＦＲを特に有用にするそのさらなる
特徴は、形質転換細胞を同定するための選択マーカーとして使用され得ることで
ある。ＤＨＦＲの２つの形態は、二次配列、野生型ＤＨＦＲ、およびＭＴＸ耐性
ＤＨＦＲとしての使用に利用可能である。特定の宿主細胞に使用されるＤＨＦＲ
の型は、宿主細胞がＤＨＦＲ欠損（内因的に非常に低いレベルのＤＨＦＲを産生
するか、または全く機能的ＤＨＦＲを産生しないかのいずれかであるような）で
あるかどうかに依存する。ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（前出）によって記
載されるＣＨＯ細胞株のようなＤＨＦＲ欠損細胞株は、野生型ＤＨＦＲコード配
列で形質転換される。形質転換後、これらのＤＨＦＲ欠損細胞株は、機能的ＤＨ
ＦＲを発現し、そして栄養性ヒポキサンチン、グリシン、およびチミジンを欠如
する培養培地において増殖し得る。非形質転換細胞は、この培地において生存し
ない。
【００６１】 ＤＨＦＲのＭＴＸ耐性形態は、ＭＴＸ感受性である正常な量の機能的ＤＨＦＲ
を内因的に産生するこれらの宿主細胞における、形質転換宿主細胞についての選
択手段として使用され得る。ＣＨＯ−Ｋｌ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＬ６１）は、
これらの特徴を所有し、従って、この目的のための有用な細胞株である。ＭＴＸ
の細胞培養培地への添加は、ＭＴＸ耐性ＤＨＦＲをコードするＤＮＡで形質転換
したこれらの細胞のみを、増殖することを可能にする。非形質転換細胞は、この
培地において生存し得ない。
【００６２】 原核生物もまた、本発明の最初のクローニング工程のための宿主細胞として使
用され得る。それらは、大量のＤＮＡの迅速な産生のため、部位特異的変異誘発
のために使用される一本鎖ＤＮＡテンプレートの産生のため、同時に多くの変異
体をスクリーニングするため、および生成した変異体のＤＮＡ配列決定のために
特に有用である。適切な原核生物宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株２
９４（ＡＴＣＣ番号３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号
２７，３２５）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１，５３７）、お
よびＥ．ｃｏｌｉ Ｂが挙げられる；しかし、Ｅ．ｃｏｌｉの多くの他の株（例
えば、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９）、なら
びに桿菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、他の腸内細菌科（
例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＳｅｒｒａｔｉ
ａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）、および種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種を含む原核
生物の多くの他の種および属は全て、宿主として使用され得る。原核生物宿主細
胞または強固な細胞壁を有する他の宿主細胞は、好ましくは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら（前出）のセクション１．８２に記載されるような塩化カルシウム法を用いて
形質転換される。あるいは、エレクトロポレーションが、これらの細胞の形質転
換のために使用され得る。原核生物形質転換技術は、Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．，
ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａ
ｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １２：２７５−２９６， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．（１９９０）；Ｈａｎａｈａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｘｙ
ｍｏｌ， ２０４：６３（１９９１）に示される。
【００６３】 代表的な例として、セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼをコードする
ｃＤＮＡ配列は、異種宿主としてのＥ．ｃｏｌｉにおける過剰発現のために、市
販の（Ｎｏｖａｇｅｎから）（Ｈｉｓ）6・Ｔａｇ ｐＥＴベクターに移入され
得る。このｐＥＴ発現プラスミドは、高レベルの異種発現系におけるいくつかの
利点を有する。所望のｃＤＮＡインサートは、インフレームで、６ヒスチジンを
コードするプラスミドベクター配列に連結され、続いて標的タンパク質のアミノ
末端コドンに結合される高度に特異的なプロテアーゼ認識部位（トロンビン）に
連結される。発現される融合タンパク質のヒスチジン「ブロック」は、固定化金
属イオンへの非常に強固な結合を促進し、そして固定化金属イオンアフィニティ
クロマトグラフィーによる組換えタンパク質の迅速な精製を可能にする。次いで
、ヒスチジンリーダー配列は、特異的なタンパク質分解部位で、精製タンパク質
のトロンビンでの処理によって切断され、そしてセコイソラリシレシノールデヒ
ドロゲナーゼタンパク質が溶出される。この過剰発現−精製系は、高能力で優れ
た分解能を有し、迅速であり、そして（トロンビンタンパク質分解の前および後
に）同様の結合挙動を示すＥ．ｃｏｌｉタンパク質が夾雑する機会を極めて小さ
くする。
【００６４】 当業者に明らかなように、宿主細胞に適合する種に由来するレプリコンおよび
制御配列を含む任意のプラスミドベクターもまた、本発明の実施において使用さ
れ得る。ベクターは通常、複製部位、形質転換細胞における表現型選択を提供す
るマーカー遺伝子、１つ以上のプロモーター、および外来ＤＮＡの挿入のための
いくつかの制限部位を含むポリリンカー領域を有する。Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換
のために代表的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、
ｐＵＣ１９、ｐＵＣＩ１８、ｐＵＣ１１９、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｍ１
３が挙げられ、これらは全て、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）の第１．１２〜１．
２０章に記載される。しかし、多くの他の適切なベクターも同様に利用可能であ
る。これらのベクターは、アンピシリンおよび／またはテトラサイクリン耐性を
コードする遺伝子を含み、これは、これらのベクターで形質転換した細胞が、こ
れらの抗生物質の存在下で増殖することを可能にする。
【００６５】 原核生物ベクターに最も一般的に使用されるプロモーターは、βラクタマーゼ
（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３７５：６１５（１９７８）；Ｉｔａｋｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９
８：１０５６（１９７７）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４
（１９７９））ならびにトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄ
ｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）；ＥＰＯ
Ａｐｐｌ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．３６，７７６）、ならびにアルカリホスファターゼ
系を含む。これらは最も一般的に使用されるが、他の微生物プロモーターが利用
されており、そしてそれらのヌクレオチド配列に関する詳細は刊行されており、
当業者が、プラスミドベクターにそれらを機能的に連結することを可能にする（
Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ ２０：２６９（１９８０）を参照のこと）
。
【００６６】 細胞から通常分泌される多くの真核生物タンパク質は、アミノ酸配列の一部と
して、内因性分泌シグナル配列を含む。従って、細胞質に通常見いだされるタン
パク質は、シグナル配列をタンパク質に連結することによって分泌のために標的
化され得る。これは、シグナル配列をコードするＤＮＡを、タンパク質をコード
するＤＮＡの５'末端に連結し、次いでこの融合タンパク質を適切な宿主細胞に
おいて発現することによって容易に達成される。シグナル配列をコードするＤＮ
Ａは、シグナル配列を有するタンパク質をコードする任意の遺伝子からの制限フ
ラグメントとして得られ得る。従って、原核生物、酵母、および真核生物シグナ
ル配列は、本発明を実施するのに利用される宿主細胞の型に依存して、本明細書
中で使用され得る。いくつかの真核生物遺伝子（例えば、ヒト成長ホルモン、プ
ロインシュリン、およびプロアルブミンを含む）のシグナル配列部分をコードす
るＤＮＡおよびアミノ酸配列は公知であり（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ， ＮＹ， ７６９頁（１９８８）を参照のこと）、そして適切な真核生物
宿主細胞におけるシグナル配列として使用され得る。例えば、酸性ホスファター
ゼ（Ａｒｉｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１：１６５７（
１９８３））、α因子、アルカリホスファターゼ、およびインベルターゼのよう
な酵母シグナル配列は、酵母宿主細胞からの分泌を指向するために使用され得る
。例えば、ＬａｍＢもしくはＯｍｐＦ（Ｗｏｎｇら、Ｇｅｎｅ ６８：１９３（
１９８８））、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡ、またはβラクタマーゼをコードする遺伝子
ならびに他の遺伝子からの原核生物シグナル配列は、原核生物細胞からのタンパ
ク質を培養培地に標的するために使用され得る。
【００６７】 植物、動物、および微生物からの輸送配列は、本発明の実施において、遺伝子
産物を、細胞質、小胞体、ミトコンドリア、もしくは他の細胞成分に指向するた
め、または培地への搬出のためにタンパク質を標的するために使用され得る。こ
れらの考察は、セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼの過剰発現、および
任意の所望の位置における遺伝子産物の機能を可能にするための細胞またはイン
タクトな生物内での発現の指向に適用される。
【００６８】 目的の複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子をコードするＤＮＡ、およびセ
コイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼＤＮＡを含む適切なベクターの構築物
は、標準的な組換えＤＮＡ手順を用いて調製される。単離されたプラスミドおよ
びＤＮＡフラグメントは、当該分野で周知のように（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら（前出）を参照のこと）、切断され、仕立てられ、そして所望のベクターを作
製するために特定の順序で一緒に連結される。
【００６９】 上記で議論したように、セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼ改変体は
、好ましくは、部位特異的変異誘発の方法を用いて作製される変異（単数または
複数）によって産生される。この方法は、オリゴヌクレオチドがＤＮＡテンプレ
ートに安定にハイブリダイズすることを可能にするために、所望の変異の配列お
よび十分な数の隣接ヌクレオチドの両方をコードする特定のオリゴヌクレオチド
の合成および使用が必要である。
【００７０】 セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼ遺伝子、またはセコイソラリシレ
シノールデヒドロゲナーゼ遺伝子の全てまたは一部に相補的なアンチセンス核酸
フラグメントは、適切な場合には、種々の目的のための任意の植物種に導入され
得、この目的には以下が含まれるがこれらに限定されない：木組織（特に心材組
織）の色、手触り、耐久性、および害虫耐性を改変または改善すること；トウモ
ロコシ（これは、動物飼料として有用である）のような植物種におけるリグナン
および／またはリグニンの形成を低減するかさもなければそのレベルを変更し、
それにより植物材料を摂取する動物の消化系への植物材料のセルロース画分の利
用可能性を増強すること；パルプおよび紙産生において利用される植物種のリグ
ナン／リグニン含有量を低減するかさもなければそのレベルを変更し、それによ
り、より容易および安価にパルプおよび紙を産生すること；捕食動物および病原
体に対する植物の防御能力を、防御的リグナンまたはリグニンの産生を増強する
ことによって改善すること；リグナンまたはリグニンによって媒介される他の生
態学的相互作用の改変；医薬または食物添加剤として、上昇したレベルの光学的
に純粋なリグナン鏡像異性体を産生すること；セコイソラリシレシノールデヒド
ロゲナーゼの産生、またはマタイレシノール（ｍａｔａｉｒｅｓｉｎｏｌ）およ
びその誘導体の産生を誘導するか、増強するか、または阻害すること。セコイソ
ラリシレシノールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、種々の目的のために任意の生物に
導入され得、この目的は以下を含むがこれらに限定されない；セコイソラリシレ
シノールデヒドロゲナーゼの産生、またはマタイレシノールおよびその誘導体の
産生を誘導するか、増強するか、または阻害すること。任意の当該分野で認識さ
れた技術（本発明の核酸分子を利用する）を使用して、セコイソラリシレシノー
ルデヒドロゲナーゼの産生、またはマタイレシノールおよびその誘導体の産生を
増強するか、阻害するか、またはそうでなければ改変し得る。
【００７１】 前述は、以下の例示的な実施例と組み合わせてより完全に理解され得、ここで
「プラスミド」は、英小文字ｐ、続く英数字によって示される。本発明において
使用される開始プラスミドは、市販されるか、無制限の基準に基づいて公に入手
可能であるか、または公開された手順を用いてこのような入手可能なプラスミド
から構築され得る。さらに、他の等価なプラスミドは当該分野で公知であり、そ
して当業者には明らかである。
【００７２】 ＤＮＡの「消化」、「裁断」、または「切断」は、ＤＮＡにおける特定の位置
でのみ作用する酵素での、ＤＮＡの触媒切断をいう。これらの酵素は、制限エン
ドヌクレアーゼと称され、そして各酵素が切断するＤＮＡ配列に沿った部位は、
制限部位と称される。本発明において使用される制限酵素は市販され、そして製
造業者によって提供される説明書に従って使用される。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（
前述）の第１．６０〜１．６１章および第３．３８〜３．３９章もまた参照のこ
と） 制限消化物からのＤＮＡの所定のフラグメントの「回収」または「単離」は、
電気泳動によるポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上での得られたＤ
ＮＡフラグメントの分離、その移動度対公知の分子量のマーカーＤＮＡフラグメ
ントの移動度の比較による目的のフラグメントの同定、所望のフラグメントを含
むゲル区画の切り出し、およびゲルのＤＮＡからの分離を意味する。この手順は
一般的に公知である。例えば、Ｌａｗｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ． ９：６１０３−６１１４（１９８２））、およびＧｏｅｄｄｅｌら（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，（前出））を参照のこと。
【００７３】 以下の実施例は、本発明を実施するために現在意図される最良の態様を単に例
示するに過ぎないが、本発明を制限すると解釈されるべきではない。
【００７４】 （実施例１；Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａからのセコイソラリ
シレシノール（ｓｅｃｏｉｓｏｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ）デヒドロゲナーゼ
タンパク質の単離） 以下の材料および方法を、実施例１および２において、他に記載しない限り、
使用した。
【００７５】 （植物材料） Ｆ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ植物を、Ｂａｉｌｅｙ’ｓ Ｎｕｒｓｅｒｙ（改変
体Ｌｙｎｗｏｏｄ Ｇｏｌｄ．Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）より得て、Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ温室施設において維持したか、ま
たは地方の団体から与えられたかのいずれかであった。
【００７６】 （材料） 使用した全ての溶媒、化合物は、試薬等級またはＨＰＬＣ等級であった。ＤＥ
ＡＥセルロースおよびアデノシン２’，５’−二リン酸−セファロースを、Ｓｉ
ｇｍａより購入した；ＭｏｎｏＰ ＨＲ−５／２０およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子
量標準をＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．
から購入した。Ｔａｑ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび制限酵素（ＢａｍＨＩ
、ＮｄｅＩ、ＳｐｅＩ）を、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した。ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ
−ベクターおよびコンピテントＮｏｖａＢｌｕｅ細胞をＮｏｖａｇｅｎより購入
し、放射性標識ヌクレオチド（［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ）をＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ
から購入した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および配列決定のためのオリゴ
ヌクレオチドプライマーを、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓが合成した。
【００７７】 （装置） 1Ｈおよび13Ｃ核磁気共鳴スペクトルを、ＣＤＣｌ3を溶媒として用い、テトラ
メチルシラン（内部標準）からの報告された低磁場化学シフト（δｐｐｍ）を用
いて、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ３００において記録した。高速液体クロマトグラフ
ィーは、逆相（Ｗａｔｅｒｓ、Ｎｏｖａｐａｋ Ｃ18、１５０×３．９ｍｍ内径
）カラムまたはキラル（Ｄａｉｃｅｌ、Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ、２５０×４
．６ｍｍ内径）カラムのいずれかを使用して、２８０ｎｍでの検出で、行った。
放射性サンプルを、ＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ）において分析し、そして液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋ
ａｒｄ、Ｔｒｉｃａｒｂ ２０００ ＣＡ）を使用して測定した。質量スペクト
ル（ＥＩモード）を、ＴｈｅｒｍａｂｅａｍTM Ｍａｓｓ Ｄｅｒｅｃｔｏｒを
備えたＷａｔｅｒｓ ＩｎｔｅｇｒｉｔｙTM Ｓｙｓｔｅｍを使用して、得た。
アミノ酸配列を、オンラインＨＰＬＣ検出器を有するＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ タンパク質配列決定機を用い、製造業者の指示書に従って、得た
。ＵＶ（２６０ｎｍでのＲＮＡおよびＤＮＡの測定を含む）スペクトルを、Ｌａ
ｍｂｄａ６ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で記録した。ＴｅｍｐｔｒｏｎｉｃＩＩサ
ーモサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ）を、全てのＰＣＲ増幅のために使用し
た。配列決定のためのプラスミドＤＮＡの精製は、Ｗｉｚａｒｄ ＰｌｕｓＳＶ
Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を使用し、ＤＮＡ配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａ自動配列決定機を使用した。
【００７８】 （（±）−［９，９’−3Ｈ2］セコイソラリシレシノールの合成） ［９−3Ｈ2］コニフェリルアルコール（酢酸中に０．５ｍＭ、６５ＭＢｑ、７
ｍｌ）を室温でＦｅＣｌ3（水溶液、７００ｍｇ、２４ｍｌ）に添加した。１０
分間の撹拌の後、反応混合物をエーテルで抽出した（３０ｍｌ×３）。エーテル
可溶物を合わせ、水で抽出し（２０ｍｌ）、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、真空中で乾燥
までエバポレートした。残渣を最小量のＣＨ2Ｃｌ2で再構成し、そしてシリカゲ
ルカラム（１５×２．５ｃｍ内径）にアプライし、ＣＨ2Ｃｌ2：エーテル（４：
１）で溶出し、純粋な（±）−［９，９’−3Ｈ2］ピノレシノール（０．１ｍＭ
、１３ＭＢｑ、３６ｍｇ、２０％）を得た。撹拌した（±）−［９，９’−3Ｈ2 ］ピノレシノール（ＭｅＯＨ中に０．１ｍＭ、１３ＭＢｑ、５ｍｌ）溶液にＨ2
下で、Ｐｄ／Ｃ（１０％、８０ｍｇ）を添加した。２４時間の還元の後、触媒を
濾過によって取り除き、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）で洗浄した；ＭｅＯＨ可溶物を合わ
せ、そして真空中で乾燥までエバポレートし、分取用シリカＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ
：ヘキサン：メタノール １０：１０：１で展開）の後に、（±）−［９，９’
−3Ｈ2］セコイソラリシレシノール（０．０７ｍＭ、９．１ＭＢｑ、２５ｍｇ、
７０％）を得た。
【００７９】 （（±）−［Ａｒ−2Ｈ］セコイソラリシレシノールの合成）［Ａｒ−2Ｈ］セ
コイソラリシレシノールをＵｍｅｚａｗａ、Ｔ．、Ｄａｖｉｎ、Ｌ．Ｂ．および
Ｌｅｗｉｓ、Ｎ．Ｇ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１０２１０〜１０
２１７（１９９１）に記載されるように合成した。
【００８０】 （酵素アッセイ） （（１）（±）−［９，９’−3Ｈ2］セコイソラリシレシノールを用いる放射
性化学アッセイ） セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼ活性を、（−）−［９’−3Ｈ2］
マタイレシノール（ｍａｔａｉｒｅｓｉｎｏｌ）の形成をモニターすることによ
ってアッセイした。各アッセイは、ＮＡＤ（０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ７）中に５０ｍＭ、５μｌ）、（±）−［９，９’−3Ｈ2］セコイソラリシ
レシノール（２８ｎＭ、エタノール中に１３０ＭＢｑ／ｍｍｏｌ、５μｌ）およ
び緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、４７０μｌ）からなった
。この酵素反応を、酵素調製物（２０μｌ）の添加によって開始した。振とうし
ながら、３０℃での１時間のインキュベーションの後、この混合物を、非標識の
（±）−マタイレシノール（２００μｇ）を放射性化合物のキャリアとして含有
するＥｔＯＡｃ（５００μｌ×２）で抽出した。遠心分離（１３，８００×ｇ、
５分）の後、ＥｔＯＡｃ可溶物を除去し、真空中で乾燥するまでエバポレートし
、ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ中の３％酢酸（１：１、２００μｌ）中に再構成し、アリコ
ート（２０μｌ）を逆相カラムクロマトグラフィーに供した。溶出条件は、以下
のとおりであった：アセトニトリル／Ｈ2Ｏ中の３％酢酸の１０：９０〜３０：
７０の直線勾配、０と３５分との間；次に、５分間で５：９５まで、そして最後
に５：９５で一定に５分間、１ｍｌ／分の流速、および２８０ｎｍでの検出。マ
タイレシノールに対応する画分を、個別に収集し、アリコートを液体シンチレー
ションカウンターのために除去し、そして残りを凍結乾燥した。
【００８１】 （（２）（±）−［Ａｒ−2Ｈ］セコイソラリシレシノールを用いるアッセイ
） ５００μｌのＥｔＯＨ中の２ｍｇの［Ａｒ−2Ｈ］セコイソラリシレシノール
を、約２μｇのデヒドロゲナーゼおよび４０μｍｏｌのＮＡＤを有する１０ｍＬ
の５０ｍＭ ｐＨ８．８ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に添加した。振とうしながら
、３０℃での１時間のインキュベーションの後、この混合物を、ＥｔＯＡｃ（１
０ｍｌ×２）で抽出した。溶媒をエバポレートし、抽出物をＨＰＬＣで精製した
。マタイレシノールのピークを収集し、凍結乾燥し、ＭＳで分析した場合、０．
８ｍｇのマタイレシノールを生じた。
【００８２】 （酵素的に形成された［９’−3Ｈ2］マタイレシノールの［９’−3Ｈ2］セコ
イソラリシレシノールへの化学的変換） 逆相カラムクロマトグラフィーの後に収集された［９’−3Ｈ2］マタイレシノ
ール（０．５ｋＭｑ）を、ＬｉＡｌＨ4を用いて還元し、［９’−3Ｈ2］セコイ
ソラリシレシノール（０．２６ｋＢｑ）を得た。キラルＨＰＬＣ（Ｄａｉｃｅｌ ＯＤ）分析では、（−）−［９’−3Ｈ2］セコイソラリシレシノールのみが形
成されたことが示された。このことは、（−）−［９’−3Ｈ2］マタイレシノー
ルのみが酵素的に生成されたことを示す。
【００８３】 （ラクトール（Ｌａｃｔｏｌ）の合成） マタイレシノール（トルエン中、０．５ｍＭ、２ｍｌ）に、水素化ジイソブチ
ルアルミニウム（ヘキサン中、１Ｍ、０．６ｍｌ）を−７８℃で滴下した。反応
混合物を−７８℃で１時間攪拌し、数滴のＨＣｌ（２Ｎ）でクエンチし、次にＥ
ｔＯＡｃ（２０ｍｌ）で抽出した。ＥｔＯＡｃ可溶物を水（６ｍｌ）で抽出し、
真空中で乾燥するまでエバポレートし、分取用ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン：
メタノール １０：１０：１で展開）に供して、必要なラクトール（０．３５ｍ
Ｍ、７０％）を得た。
【００８４】 セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質を、Ｆｏｒｓｙｔｈｉ
ａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａより単離し、そして以下の様式において部分配列決定
した。
【００８５】 （酵素精製のための一般的手順） 全ての操作を、他に記載しなければ、４℃で行い、クロマトグラフィーの溶出
物を２８０ｎｍでモニターした。γグロブリンを標準物質として使用して、タン
パク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ．Ｍ．、Ａｎａｌｙｔ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１７：２４８（１９７６））の方法によって決定した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、Ｌａｅｍｍｌｉの緩衝液系を用いて、変性
条件下または非変性条件下、および勾配ゲルを用いて行った（４〜１５％、Ｂｉ
ｏＲａｄ）（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ．Ｋ．、Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０（１９
７０））；次にタンパク質を銀染色によって可視化した（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、
Ｊ．Ｈ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１７、３０７（１９８１））。
【００８６】 （無細胞抽出物の調製） Ｆ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの茎（２ｋｇ）を凍結し（液体窒素）、そしてＷａ
ｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｍｏｄｅｌ ＣＢ６）中で粉末にした。生じた粉末
を、５ｍＭのジチオスレイトールを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ
、ｐＨ７．５、２Ｌ）（緩衝液Ａ）とともにホモジナイズした。このホモジネー
トを、４層のチーズクロースを通過して、ポリビニルポリピロリドン（１０％
重量／容量）を含有するビーカー中にろ過した。濾液を遠心分離（１０，０００
×ｇ、１５分）し、生じる上清を（ＮＨ4）2ＳＯ4を用いて分画した。３０〜６
０％飽和の間のタンパク質沈殿物を遠心分離（１０，０００×ｇ、３０分）でペ
レットとともに回収し、次に最小量の緩衝液Ａに再構成した。
【００８７】 （ＤＥＡＥクロマトグラフィー） 粗酵素調製物（９０ｍｌの緩衝液Ａ中に４４５ｍｇ、４．１ｎｍｏｌ・ｈ-1・
ｍｇ-1）を、緩衝液Ａ中に平衡化したＤＥＡＥセルロースカラム（４０×２．６
ｃｍ内径）にアプライした。セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼを、緩
衝液Ａ中の直線のＮａＣｌ勾配（５００ｍｌ中の０〜２Ｍ）、流速２．５ｍｌ・
分-1で溶出した（カラムを２５ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した後）。活性画分を組み
合わせ、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ、ＹＭ１０メンブレン）によって５０ｍｌにま
で濃縮し、一晩透析した（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５）。
【００８８】 （アフィニティー（２’，５’−ＡＤＰ−セファロース）クロマトグラフィー
） ＤＥＡＥセファロースクロマトグラフィーからの活性画分（２０１ｍｇ、１４
．４ｎｍｏｌ・ｈ-1・ｍｇ-1）を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２５ｍＭ，ｐＨ７
．５）で予め平衡化した２’，５’−ＡＤＰ−セファロースカラム（１０×１ｃ
ｍ内径）にアプライした。このカラムを、最初に２０ｍｌ同一の緩衝液で洗浄し
、次に１ｍｌ／分の流速で５００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍｌの緩衝液Ａ
で洗浄し、最後に緩衝液Ａ中のＮＡＤ（１０ｍＭ）を用いてセコイソラリシレシ
ノールデヒドロゲナーゼを溶出した。活性画分を合わせ、緩衝液Ａに対して１６
時間透析した。
【００８９】 （ＭｏｎｏＰ（ＨＲ ５／２０）カラムクロマトグラフィー） 前の工程からの活性タンパク質（１８５μｇ、８４０５ｎｍｏｌ・ｈ-1・ｍｇ -1 ）を、緩衝液Ａで平衡化したＭｏｎｏＰカラムにアプライし、緩衝液Ａ（８ｍ
ｌ）で洗浄し、緩衝液Ａ中の直線ＮａＣｌ勾配（１４５ｍｌ中に０〜２Ｍ）を、
流速１ｍｌ／分で溶出した。活性画分（７４μｇ、１７．７μｍｏｌ・ｈ-1・ｍ
ｇ-1）を合わせ、緩衝液Ａに対して透析し、次に上記の手順を用いてＭｏｎｏＰ
カラム上で再度クロマトグラフィーをした。得られたセコイソラリシレシノール
デヒドロゲナーゼ（３１μｇ、２４．２７μｍｏｌ・ｈ-1・ｍｇ-1）を、次に、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００９０】 （アミノ酸配列決定） （−）−セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼを最初にＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動に供し、次に、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら（Ｈｕｎｋａ
ｐｉｌｌｅｒ、Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９１：２２７）およ
びＭａｔｓｕｄａｉｒａ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ、Ｐ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、２６２：１００３５（１９８７））に記載の手順をそれぞれ使用して、Ｐ
ＶＤＦメンブレン上に電気ブロットした。手短には、ミニゲルを最初に還元化グ
ルタチオン（５μＭ）を含有する泳動緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ
グリシンおよび０．１％ ＳＤＳ）中で３０分間、８ｍＡ一定電流で、カソー
ド緩衝液を０．１Ｍチオグリコレートを含有する新鮮な泳動緩衝液に置き換えて
から、電気泳動した。
【００９１】 （−）−セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼに対して、ローディング
緩衝液を添加し、次に混合物を５５℃で１５分間加熱し、ミニゲルにロードし、
次に２０ｍＡの一定電流で４５分間電気泳動した。電気泳動後、ゲルをトランス
ファー緩衝液（１０ｍＭ ＣＡＰＳ、１０％メタノール、ｐＨ １１．０）に１
０分間浸漬し、次にブロッティング装置に配置し、１時間、１５０ｍＡの一定電
流で、トランスファー緩衝液中で、４℃で、電気溶出した。クマシーブルーＲ−
２５０での染色の後、（−）−セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼに対
応するバンドを切り出し、脱イオンＨ2Ｏでリンスし、直接アミノ酸配列決定に
供し、Ｎ末端配列（配列番号１１）を得た。
【００９２】 （トリプシン消化） 精製した（−）−セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼ（６０μｌの水
中に２００ｐｍｏｌ）に対して、尿素を最終濃度８Ｍまで添加した。３７℃で３
０分のインキュベーションの後、０．２Ｍ重炭酸アンモニウム／１ｍＭ ＣａＣ
ｌ2（６０μｌ）およびトリプシン（０．０１％ＴＦＡ中に０．５μｇ／μｌ、
２μｌ）を添加し、この混合物をより多量のトリプシン（２μｌ）を添加した後
、３７℃で１２時間消化し、この消化をもう１２時間続けさせた。この酵素反応
を、ＴＦＡ（４μｌ）の添加によって停止した。生じた混合物を逆相ＨＰＬＣ分
析に供し（Ｃ−８カラム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０〜１０
０％のアセトニトリルの直線勾配（０．１％ ＴＦＡ中）で、２時間、０．２ｍ
ｌ・分-1の流速で、２１４ｎｍでの検出を用いて溶出した。個別のオリゴペプチ
ドのピークを含有する画分を手動で回収し、濃縮し（ＳｐｅｅｄＶａｃ）、そし
て前記のようにアミノ酸配列決定に供した。２つのセコイソラリシレシノールデ
ヒドロゲナーゼのトリプシンによる遊離オリゴペプチドのアミノ酸配列を、配列
番号１２（ペプチド１）および配列番号１３（ペプチド２）に示す。
【００９３】 （実施例２；Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａからのセコイソラリ
シレシノールデヒドロゲナーゼｃＤＮＡのクローニング） （Ｆ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ茎ｃＤＮＡライブラリーの合成） 総ＲＮＡ（約３００μｇ・ｇ-1新鮮重量）を、温室で生長したＦ．ｉｎｔｅｒ
ｍｅｄｉａ植物（改変体Ｌｙｎｗｏｏｄ Ｇｏｌｄ）の若年緑色茎から得た（Ｄ
ｏｎｇ、Ｊ．Ｚ．およびＤｕｎｓｔａｎ、Ｄ．Ｉ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒ
ｅｐｒｏｔｓ １５：５１６〜５２１（１９９６））。Ｆ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉ
ａ茎ｃＤＮＡライブラリーを、５μｇの精製ポリＡ+ ｍＲＮＡ（Ｏｌｉｇｏｔ
ｅｘ−ｄＴ（懸濁液）ＱＩＡＧＥＮ）を、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ ＩＩ Ｇｏｌｄ
パッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）とともに用いて、初期ライブラ
リーについて１．２×１０6ｐｆｕの力価で構築した。増幅したライブラリー（
１．２×１０10ｐｆｕ／ｍｌ；総量１５８ｍｌ）の３０ｍｌ部分（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、（１９
８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ）を使用して、ＰＣＲのための純粋なｃＤＮＡライブラリーを得
た（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．、Ｂｒｅｎｔ、Ｒ．、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｒ．Ｅ
．、Ｍｏｏｒｅ、Ｄ．Ｄ．、Ｓｅｉｄｍａｎ、Ｊ．Ｇ．、Ｓｍｉｔｈ、Ｊ．Ａ．
およびＳｔｒｕｈｌ、Ｋ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉ
ｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）。
【００９４】 （（−）−セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼのＤＮＡプローブの合
成） Ｎ末端アミノ酸配列（配列番号１１）および内部ペプチドアミノ酸配列（配列
番号１２および１３）を使用して、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを構築し
た。プライマーＤＥＨＹＦ２６（配列番号１４）を、配列番号１２に示されるア
ミノ酸配列を有するペプチド１のアミノ酸配列に基づいて構築した。プライマー
ＤＥＨＹＦ３０ＲｅｖＡ（配列番号１５）およびＤＥＨＹＦ３０ＲｅｖＢ（配列
番号１６）を、各々、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するペプチド２
のアミノ酸配列に基づいて構築した。精製したＦ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ｃＤ
ＮＡライブラリーのＤＮＡ（２ｎｇ）を、１００μｌ ＰＣＲ反応物（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ９．０］、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ１００、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭ 各ｄＮＴＰ、および２．
５単位のＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ）中で、プライマーＤＥＨＹＦ２６（配
列番号１４）、およびプライマーＤＥＨＹＦ３０ＲｅｖＡ（配列番号１５）また
はプライマーＤＥＨＹ３０ＲｅｖＢ（配列番号１６）のいずれかとともに、鋳型
として使用した。ＰＣＲ増幅をサーモサイクラー中で、９４℃変性１分、５０℃
アニーリング２分、および７２℃伸長３分の３５サイクルを用いて行った。ＰＣ
Ｒ産物を１．５％アガロースゲルで分離し、ここで約２００ｂｐの単一のバンド
が得られた。次に、生じるＰＣＲ産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔベクターに連結し、
コンピテントＮｏｖａＢｌｕｅ細胞中に、Ｎｏｖａｇｅｎの指示書に基づいて、
形質転換した。この組換えプラスミドをＤＮＡ配列決定に使用した。ＤＮＡ配列
決定分析は、この挿入物が天然の植物タンパク質より得られた最初の内部トリプ
シン消化フラグメントの１つをコードしたことを明らかにした。約２００ｂｐの
ＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩフラグメントを、プラスミド調製物より切り出し、ｃＤＮ
Ａライブラリーのスクリーニングのためのプローブとして使用した。
【００９５】 （ライブラリースクリーニング） 約３００，０００ｐｆｕのＦ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの増幅したｃＤＮＡライ
ブラリーを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの指示書に基づき、スクリーニングのために
プレートした。プラークをＭａｇｎａ Ｎｙｌｏｎ円形メンブレン（Ｍｉｃｒｏ
ｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．）にブロットし、次にこのメンブレンを風
乾させた。このメンブレンを、Ｗｈａｔｍａｎ ３ＭＭクロマトグラフィーペー
パーの２つの層の間に配置した。ｃＤＮＡライブラリーファージを、２分間１０
０℃でオートクレーブして迅速に排気することにより、１工程で、メンブレンに
固定および変性をした。このメンブレンを３０分間、３７℃で、２×ＳＳＣ中で
洗浄し、そして１２時間、４５℃で、ハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ
、０．５％ ＳＤＳおよび５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬）中で温和に振とうしなが
らプレハイブリダイズした。［32Ｐ］放射性標識した２００ｂｐプローブを、１
０分間ボイルすることによって変性し、迅速に氷上で１０分間冷却し、そして３
０ｍｌの新鮮なハイブリダイゼーション溶液中のプレハイブリダイズしたメンブ
レンに添加した。ハイブリダイゼーションを、４５℃で２４時間、穏やかに振と
うしながら行った。次に、メンブレンを４×ＳＳＣ中で、室温で１０分間洗浄し
、その後、４×ＳＳＣ中で、４５℃で１０分間さらに洗浄した。メンブレンを、
増感スクリーンとともに、Ｘ線フィルム（Ｊｅｒｓｅｙ Ｌａｂ Ｓｕｐｐｌｙ
）に対して、−８０℃で２４時間、曝露した。
【００９６】 １つのポジティブシグナルが、３回のスクリーニングの後、このスクリーニン
グから得られた。このシグナルをインビボで切り出し、配列決定のために使用す
るプラスミド調製物のために増殖させた。ＢＬＡＳＴサーチ比較は、この遺伝子
によってコードされるタンパク質は、Ｓｏｌａｍｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕ
ｍ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｊａｃｏｂｓｅｎ、Ｓ．Ｅ．およびＯｌ
ｓｚｅｗｓｋｉ、Ｎ．Ｅ．、Ｐｌａｎｔａ、１９８：７８（１９９６））と７６
％の類似性を有した。しかし、このクローンは、（−）−セコイソラリシレシノ
ールデヒドロゲナーゼの最初のＮ末端配列分析との比較によって示されたように
、Ｎ末端で、約６０アミノ酸残基まで短縮化していた。類似のハイブリダイゼー
ション条件を使用するＦｏｒｓｙｔｈｉａ ｃＤＮＡライブラリーのさらなるス
クリーニングを、この短縮型クローンの制限酵素消化したフラグメントより得ら
れたプローブを用いて行った。これらのプローブは、１つのさらなるクローンの
みを生じ、このクローンは、最初のクローンと同一の配列、および同一の短縮を
有した。
【００９７】 完全なクローンを、最初のｃＤＮＡライブラリーストックより得るために、代
わりのスキームを使用した。プライマーＤＥＨＹ１９ＲＥＶ（配列番号１７）を
、短縮型クローンの３’末端から作製し、鋳型として最初のＦｏｒｓｙｔｈｉａ
ｃＤＮＡライブラリーの精製ファージＤＮＡを用い、ＰＣＲにおいて、Ｔ３プ
ライマーとともに使用したが、完全なＮ末端を有するｃＤＮＡクローンは、得ら
れなかった。結果として、別のプライマーＤＥＨＹＦ３０ＲＥＶＢ（配列番号１
８）を、短縮クローンの３’末端から合成し、そして、鋳型として最初のＦｏｒ
ｓｙｔｈｉａ ｃＤＮＡライブラリーの精製ファージＤＮＡを用い、ＰＣＲにお
いて、Ｔ３プライマー（配列番号１９）とともに使用した。このＰＣＲ産物をベ
クター中にクローニングした場合、ブロットしたタンパク質の最初のアミノ酸配
列決定によって得られた完全なＮ末端を有するクローン（配列番号１１）を生じ
た。このクローンのＮ末端ＤＮＡ配列から作製された新たなプライマーＤＥＨＹ
ＮＴＥＲＭ１（配列番号２０）を、Ｔ７プライマー（配列番号２１）および、再
度、最初の精製したＦｏｒｓｙｔｈｉａ ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用
いた。生じたＰＣＲの１ｋｂのバンドをアガロースゲルで精製し、Ｍｉｃｒｏｃ
ｏｎ３０（ＡＭＩＣＯＮ）を使用して溶出し、そしてＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）中に直接クローニングした。これによって、最初のタンパク質（配
列番号１１）中に存在する完全Ｎ末端アミノ酸配列を含有するＤＮＡ配列を有す
る、クローン（ＤＥＨＹ１３０）（配列番号２２）が提供された。ＤＥＨＹ１３
０（配列番号２２）によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２３）は、開
始メチオニンを欠く。しかし、このタンパク質との類似性を示すデータベース配
列のとの比較は、開始メチオニンに加えて、あったとしても、せいぜい見かけ上
ほんの２〜３のアミノ酸残基が欠失し得ることを示す。この情報に基づき、ＤＥ
ＨＹ１３０ＮＴＥＲＭ（配列番号２４）と称する新規の５’プライマーを合成し
、この配列の最初に開始メチオニンを含ませた。また、５’プライマー（配列番
号２４）およびＤＥＨＹ１３０ＣＴＥＲＭ（配列番号２５）と称する３’プライ
マーを設計して、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのこのタンパク質の産生のためのＳＢＥＴ発
現ベクター（１４）中に将来挿入するために、ＮｄｅＩ制限酵素部位をクローン
の両方の末端に組み込んだ。これらの新しいプライマー（配列番号２４および配
列番号２５）を、鋳型として以前に得たＤＥＨＹ１３０クローン（配列番号２２
）の２ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いてＰＣＲのために使用した。約８５９ｂｐ
の生じたＰＣＲ産物（配列番号１）（ＤＥＨＹ１３３と称する）を、直接ＴＡベ
クター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。ＤＮＡ配列は、このＤ
ＥＨＹ１３３デヒドロゲナーゼクローンが、今やＭｅｔ開始コドンを含んだこと
を示した。
【００９８】 さらに、ＴＡベクター中の操作したＤＥＨＹ１３３クローン（配列番号１）の
ＮｄｅＩフラグメントをプローブとして使用して、最初のＦ．ｉｎｔｅｒｍｅｄ
ｉａ ｃＤＮＡライブラリーより、再度３００，０００ｐｆｕをスクリーニング
した。これは、多数の強力なシグナルを生じ、これらの内１１個を単離し、さら
にスクリーニングした。単離されたクローンの全てが、最初のＤＥＨＹ１３３ク
ローン（配列番号１）と類似か、または同一のいずれかの配列を提供した。これ
らの数個は、Ｎ末端にさらなる残基を有し、そして開始Ｍｅｔを含んだ。このこ
とは、最初のＤＥＨＹ１３０クローン（配列番号２２）から、ほんの数個のＮ末
端残基のみが欠けていることを確認した。これらのクローンの内の４つの核酸配
列を以下に示す：配列番号３（ＳＭＤＥＨＹ３２１と称する）、配列番号５（Ｓ
ＭＤＥＨＹ４３１と称する）、配列番号７（ＳＭＤＥＨＹ５１１と称する）、配
列番号９（ＳＭＤＥＨＹ６３１と称する）。これらのクローンのいくつか（例え
ば、ＳＭＤＥＨＹ１３３（配列番号１）およびＳＭＤＥＨＹ６３１（配列番号９
）は、以下に示すように、（−）−セコイソラリシレシノールの（−）−マタイ
レシノールへの立体化学的変換を触媒したタンパク質を生じる。
【００９９】 （（−）−セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼのＥ．ｃｏｌｉにおけ
る発現） 操作されたＤＥＨＹ１３３（配列番号１）構築物はまた、もともとのＴＡクロ
ーニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のｌａｃＺとともに正しいリーデ
ィングフレームにあったので、デヒドロゲナーゼ活性についての最初のスクリー
ニングを、このプラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ培養物からの産物を用いて行
った。デヒドロゲナーゼコード領域をまた、５’末端および３’末端のＮｄｅ
Ｉ部位を用いて切り出し、そしてＳＢＥＴベクター中にクローニングした。次い
で、この構築物を、Ｂ８３４（ＤＥ３）（クローニングされたデヒドロゲナーゼ
タンパク質の過剰発現のためのＥ．ｃｏｌｉ株）中に形質転換した。
【０１００】 このデヒドロゲナーゼクローンを含むこのＥ．ｃｏｌｉ培養物を、２５ｍｌの
ＳＯＣ Ｋｎ５０培地中で０．５のＯ．Ｄ．になるまで３７℃にて増殖させた。
これに対してＩＰＴＧを添加して、最終濃度を０．５ｍＭとし、そしてこの培養
物を、１８℃でさらに２０時間増殖させた。この細胞を、６００×ｇ、４℃にて
１２分間ペレットし、５ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍ
Ｍ ＤＴＴ緩衝液中に再懸濁し、そして再度ペレット化した。最終的な細菌ペレ
ットを、２００μＬの上記の緩衝液中に再懸濁し、そして−０．６４の最大出力
に設定したＢｒａｕｎ Ｓｏｎｉｃ ２０００ソニケーターを用いて１５秒間ず
つ４回超音波処理した。次いで、このサンプルを、２０，８００×ｇ、４℃にて
１５分間遠心分離し、そして粗上清（ｃｒｕｄｅ ｓｕｐｅｒｎａｔｅ）を、デ
ヒドロゲナーゼ活性についてアッセイした。このタンパク質は、標識された（−
）−セコイソラリシレシノール基質の、中間的な（−）−ラクトールへの変換、
および（−）−マタイレシノール（ｍａｔａｉｒｅｓｉｎｏｌ）へのさらなる変
換を触媒した（図１および図２を参照のこと）。セコイソラリシレシノールの（
＋）−対掌体は、基質として役立たなかった。クローンＳＭＤＥＨＹ６３１（配
列番号９）をまた、上記の様式でＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。
【０１０１】 （実施例３） （セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼをコードするメッセンジャーＲ
ＮＡ分子へのセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼｃＤＮＡ ＳＭＤＥＨ
Ｙ６３１（配列番号９）のハイブリダイゼーション） 以下の手順を利用して、他の植物種においてセコイソラリシレシノールデヒド
ロゲナーゼをコードするｍＲＮＡ分子を検出した。総ＲＮＡを、以下の植物種か
ら単離した：Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（コントロール）；Ｐ
ｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ ｐｅｌｔａｔｕｍ（リグナンポドフィロトキシンを合成
する種）；Ｌｉｎｕｍ ｆｌａｖｕｍ（リグナンポドフィロトキシンを合成する
種）およびＴｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ（リグナンプリカチオン酸（ｐｌｉｃａ
ｔｉｃ ａｃｉｄ）を合成する種）。総ＲＮＡを、塩化リチウム沈澱法（Ｄｏｎ
ｇ，Ｊ．−Ｚ．およびＤｕｎｓｔａｎ，Ｄ．Ｉ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ
ｏｒｔｓ １５：５１６−５２１（１９９６））によって若い葉の組織から単離
した。放射性標識したプローブ（ＳＭＤＥＨＹ６３１（配列番号９））を、Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋｐｒｉｍｅ Ｋｉｔ ＃２７−９２５２−０
１を用いて調製した。セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼクローンを含
むＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ＡｇａｒＡｃｅ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ
）を用いて液化したアガロースを用いる低融点（ＬＭＰ）アガロース（ＧＩＢＣ
Ｏ／ＢＲＬ Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＬＭＰ Ａｇａｒｏｓｅ）において分離した
。単離したプローブＤＮＡを、１０分間煮沸し、次いで氷上で迅速に短時間で冷
却し、そして３７℃にて１０分間保持した。この反応緩衝液混合物、酵素および
放射性同位体α−32Ｐ−ｄＣＴＰを添加し、そしてこのフラグメントを、２０分
間、３７℃にてインキュベートした。次いで、標識したＤＮＡフラグメントを、
Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｐｉｎ ２０カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉ
ｏｎ）に通すことにより、取り込まれていない遊離の放射性ヌクレオチドから分
離した。
【０１０２】 上記の植物種からの総ＲＮＡを、１．３％アガロース／ホルムアルデヒドゲル
で分離し、そして１０×ＳＳＣ中で１８時間、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ
ナイロンメンブレンにブロッティングした。ブロッティングしたメンブレンを、
以下の組成を有するプレハイブリダイゼーション溶液中で４２℃にて５時間、プ
レハイブリダイゼーションした：５×ＳＳＰＥ；１５０μｇ／ｍｌ剪断サケ精子
ＤＮＡ；２×デンハルト溶液；１％ ＳＤＳ；０．０５×ＢＬＯＴＴＯおよび５
０％のホルムアミド。メンブレン１平方センチメートルあたり０．２ｍｌのプレ
ハイブリダイゼーション溶液を用いた。デンハルト溶液の５０×ストック溶液は
、５ｇ Ｆｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ ４００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５ｇのポリ
ビニルピロリドン、５ｇのウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ，Ｓｉｇ
ｍａ）および合わせて５００ｍｌにするための水を含む。ハイブリダイゼーショ
ンを、プレハイブリダイゼーションのために用いたのと同じ溶液中で４２℃にて
１６時間行った。ハイブリダイゼーションが完了した後、このブロットを、以下
の様式で洗浄した：１回の洗浄あたり２×ＳＳＰＥ、３０℃中で５分間を３回；
次いで２×ＳＳＰＥ／０．５％ ＳＤＳ、３０℃中で１０分間を１回。約１Ｋｂ
の単一のハイブリダイゼーションｍＲＮＡバンドが、各々のブロッティングした
ＲＮＡサンプル中で可視であった。
【０１０３】 （実施例４） （ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーシ
ョン） １つの局面では、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下で配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９に示す
核酸分子のいずれか１つのフラグメント（少なくとも１５塩基の長さを有する）
にハイブリダイズする単離された核酸分子を提供する。ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションを、以下の通りに達成す
る。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションについては、ニトロセルロー
スメンブレン（または核酸分子をブロッティングするために適切な他のメンブレ
ン）を、６×ＳＳＣ、５×デンハルト、０．５％ ＳＤＳ中で５５℃にて少なく
とも１時間ハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズさせたフィルターを
、２×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中で５５℃にて少なくとも１５分間洗浄する。
中程度ストリンジェンシーハイブリダイゼーションについては、ニトロセルロー
スメンブレン（または核酸分子をブロッティングするために適切な他のメンブレ
ン）を、６×ＳＳＣ、５×デンハルト、０．５％ ＳＤＳ中で４２℃にて少なく
とも１時間ハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズさせたフィルターを
、４×ＳＳＣ（または６×ＳＳＣ）、０．５％ ＳＤＳ中で３０℃〜３５℃にて
少なくとも１５分間洗浄する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条
件を、好ましくは、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ種由来の核酸分子へのハイブリダイゼー
ションに用いる。中程度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を、好
ましくは、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ属に含まれない種由来の核酸分子へのハイブリダ
イゼーションに用いる。
【０１０４】 本発明の単離された核酸分子にハイブリダイズさせるために有用な現在好まし
い核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番
号９に記載される配列を有する核酸分子を含む。本実施例に従うハイブリダイゼ
ーションを、当該分野で認識される任意のハイブリダイゼーション手順によって
、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（第２版），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈおよ
びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ編の第９．５２〜９．５５頁（この引用頁は、本明細書
中に参考として援用される）に記載されるように、例えば、放射性標識した核酸
プローブを、ニトロセルロースフィルターまたはナイロンメンブレンに固定化し
た核酸にハイブリダイズさせる技術を利用することにより達成し得る。
【０１０５】 上記のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いて、以下を含む
がこれらに限定されない広範な範囲の植物の属から、セコイソラリシレシノール
デヒドロゲナーゼタンパク質をコードする核酸分子を同定し得る：Ｐｏｄｏｃａ
ｒｐｕｓ、Ｔｓｕｇａ、Ｐｉｎｕｓ、Ｔｈｕｊａ、Ａｒａｕｃａｒｉａ、Ｊｕｎ
ｉｐｅｒｕｓ、Ｔａｉｗａｎｉａ、Ｖｉｒｏｌａ、Ｐｉｐｅｒ、Ａｒｃｔｉｕｍ
、ＰｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍおよびＬｉｎｕｍ。
【０１０６】 本発明の好ましい実施態様が、例示および記載されているが、種々の変更が、
本発明の精神および範囲から逸脱せずに本明細書中においてなされ得ることは理
解される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
本発明の前述の局面および多くの付随する利点は、添付する図面と組み合わせ
た場合、以下の詳細な説明を参照することによってより理解されるように、より
容易に理解されるようになる、ここで：
【図１】 図１は、（−）ラクトール（中央の構造）を介した（−）−マタイレシノール
（右の構造）への（−）−セコイソラリシレシノール（左の構造）の酵素的変換
を示す。
【図２】 図２Ａは、（−）−セコイソラリシレシノールおよび（＋）−セコイソラリシ
レシノールの標準的な研究室混合物のキラルＨＰＬＣ分離を示す。 図２Ｂは、組換えセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼの作用の様式を
示す。（±）−［９，９−3Ｈ］セコイソラリシレシノールを、セコイソラリシ
レシノールデヒドロゲナーゼとともにインキュベートした。形成された生じたマ
タイレシノール産物は、化学的に還元されており、そしてＨＰＬＣキラルカラム
（Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ，Ｄａｉｃｅｌ）分析に供された。この分析は、（
−）−対掌体のみが化学的に還元された産物（（−）−セコイソラリシレシノー
ル）のキラルカラム分析により調べられた場合に、存在した。従って、酵素的還
元は、完全にエナンチオ特異的であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 コスタ， マイケル エイ． アメリカ合衆国 ワシントン 99163， プルマン， エヌ．ダブリュー． サンラ イズ ドライブ 275 (72)発明者 ダビン， ローレンス ビー． アメリカ合衆国 ワシントン 99163， プルマン， アッパー ドライブ 1710 (72)発明者 ルイス， ノーマン ジー． アメリカ合衆国 ワシントン 99163， プルマン， エヌ．イー． アッパー ド ライブ 1710 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA07 AA17 BA08 CA02 DA01 DA02 FA01 4B050 CC03 DD13 LL05 LL10 4B064 AG01 CA11 CA19 DA16 4B065 AA87X AA88Y AB01 BA02 CA28

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配
    列番号９からなる群より選択される核酸分子、または配列番号１、配列番号３、
    配列番号５、配列番号７および配列番号９からなる群の任意のメンバーのアンチ
    センス相補体に、３５℃にて４×ＳＳＣの条件下でハイブリダイズする、セコイ
    ソラリシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする単離された核酸分
    子。
  2. 【請求項２】 裸子植物のセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼタン
    パク質をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 【請求項３】 Ｐｏｄｏｃａｒｐｕｓ、Ｔｓｕｇａ、Ｐｉｎｕｓ、Ｔｈｕｊ
    ａ、Ａｒａｕｃａｒｉａ、ＪｕｎｉｐｅｒｕｓおよびＴａｉｗａｎｉａからなる
    群より選択される属由来のセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク
    質をコードする、請求項２に記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】 被子植物のセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼタン
    パク質をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】 Ｖｉｒｏｌａ、Ｐｉｐｅｒ、Ａｒｃｔｉｕｍ、Ｐｏｄｏｐｈ
    ｙｌｌｕｍおよびＬｉｎｕｍからなる群より選択される属由来のセコイソラリシ
    レシノールデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする、請求項４に記載の核酸分
    子。
  6. 【請求項６】 Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ種由来のセコイソラリシレシノールデヒ
    ドロゲナーゼタンパク質をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  7. 【請求項７】 Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のセコイソ
    ラリシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする、請求項６に記載の
    核酸分子。
  8. 【請求項８】 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８および配
    列番号１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有するセコイソラリシレシノールデ
    ヒドロゲナーゼタンパク質をコードする、請求項７に記載の核酸分子。
  9. 【請求項９】 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配
    列番号９のいずれか１つの核酸配列を有する、請求項７に記載の核酸分子。
  10. 【請求項１０】 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７および
    配列番号９に記載のいずれか１つの核酸分子のフラグメント、または配列番号１
    、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９からなる群の任意のメ
    ンバーのアンチセンス相補体に、３５℃にて４×ＳＳＣの条件下でハイブリダイ
    ズする単離された核酸分子であって、該フラグメントが、少なくとも１５塩基の
    長さを有する、単離された核酸分子。
  11. 【請求項１１】 単離された組換えセコイソラリシレシノールデヒドロゲナ
    ーゼタンパク質。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の単離された組換え裸子植物セコイソラ
    リシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質。
  13. 【請求項１３】 前記タンパク質が、Ｐｏｄｏｃａｒｐｕｓ、Ｔｓｕｇａ、
    Ｐｉｎｕｓ、Ｔｈｕｊａ、Ａｒａｕｃａｒｉａ、ＪｕｎｉｐｅｒｕｓおよびＴａ
    ｉｗａｎｉａからなる群より選択される裸子植物の属において天然に存在する、
    請求項１２に記載の単離された組換え裸子植物セコイソラリシレシノールデヒド
    ロゲナーゼタンパク質。
  14. 【請求項１４】 請求項１１に記載の単離された組換え被子植物セコイソラ
    リシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質。
  15. 【請求項１５】 前記タンパク質が、Ｖｉｒｏｌａ、Ｐｉｐｅｒ、Ａｒｃｔ
    ｉｕｍ、ＰｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍおよびＬｉｎｕｍからなる群より選択される被
    子植物の属において天然に存在する、請求項１４に記載の単離された組換え被子
    植物セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質。
  16. 【請求項１６】 請求項１１に記載の単離された組換えＦｏｒｓｙｔｈｉａ
    セコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼタンパク質。
  17. 【請求項１７】 前記タンパク質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６
    、配列番号８および配列番号１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、請求
    項１１に記載の単離された組換えＦｏｒｓｙｔｈｉａ セコイソラリシレシノー
    ルデヒドロゲナーゼタンパク質。
  18. 【請求項１８】 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７および
    配列番号９からなる群より選択される配列、または配列番号１、配列番号３、配
    列番号５、配列番号７および配列番号９からなる群の任意のメンバーのアンチセ
    ンス相補体に、３５℃にて４×ＳＳＣの条件下でハイブリダイズする、セコイソ
    ラリシレシノールデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を含む、複製可能発現
    ベクター。
  19. 【請求項１９】 Ｐｏｄｏｃａｒｐｕｓ、Ｔｓｕｇａ、Ｐｉｎｕｓ、Ｔｈｕ
    ｊａ、Ａｒａｕｃａｒｉａ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ、Ｔａｉｗａｎｉａ、Ｖｉｒｏ
    ｌａ、Ｐｉｐｅｒ、Ａｒｃｔｉｕｍ、ＰｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍおよびＬｉｎｕｍ
    からなる群より選択される属由来のセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼ
    をコードする核酸配列を含む、請求項１８に記載の複製可能発現ベクター。
  20. 【請求項２０】 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８および
    配列番号１０のいずれか１つのアミノ酸配列を有するタンパク質の生物学的活性
    を有するセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を含
    む、請求項１８に記載の複製可能発現ベクター。
  21. 【請求項２１】 請求項１８、請求項１９、または請求項２０のいずれか１
    項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  22. 【請求項２２】 適切な宿主細胞においてセコイソラリシレシノールデヒド
    ロゲナーゼタンパク質の発現を増強する方法であって、該宿主細胞に、配列番号
    １、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９からなる群の任意の
    メンバーのアンチセンス相補体に３５℃にて４×ＳＳＣの条件下でハイブリダイ
    ズするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する工程を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 適切な宿主細胞においてセコイソラリシレシノールデヒド
    ロゲナーゼタンパク質の発現を改変する方法であって、該宿主細胞に、配列番号
    １、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９からなる群より選択
    される核酸配列を有する核酸分子の全体もしくは一部、または配列番号１、配列
    番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９のいずれか１つのアンチセン
    ス相補体に３５℃にて４×ＳＳＣの条件下でハイブリダイズするＲＮＡを発現す
    るヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する工程を包含する、方法。
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