JP2001507931A

JP2001507931A - 組換えピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ、組換えディリジェントタンパク質、および使用方法

Info

Publication number: JP2001507931A
Application number: JP52181698A
Authority: JP
Inventors: ジー．レウィス，ノーマン; ビー．デイビン，ローレンス; ティー．ディンコバ―コストバ，アルベナ; 政之藤田; アール．ガン，デイビッド; サルカネン，シモ
Original assignee: ワシントンステートユニバーシティリサーチファウンデーション
Priority date: 1996-11-08
Filing date: 1997-11-07
Publication date: 2001-06-19
Also published as: EP0948602A1; AU5199398A; WO1998020113A1; CA2270905A1; AU728116B2

Abstract

(57)【要約】ディリジェントタンパク質およびピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼは、Forsythia intermedia、Thuja plicata、およびTsuga heterophyllaから、これらの種からのディリジェントタンパク質およびピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードするcDNAとともに単離されている。従って、ディリジェントタンパク質およびピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの発現をコードする、単離されたDNA配列が提供される。他の局面において、ディリジェントタンパク質もしくはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ、または少なくともディリジェントタンパク質もしくはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼのDNAもしくはRNAの一部に十分に相補的であり、それらとのハイブリダイゼーションを可能にする塩基配列をコードする、複製可能組換えクローニングビヒクルが提供される（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーとして、あるいはディリジェントタンパク質もしくはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードする遺伝子または関連遺伝子のためのプローブとして有用である、アンチセンスディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼRNA、または相補的なディリジェントタンパク質もしくはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼのDNAフラグメント）。なお他の局面において、組換えクローニングビヒクルおよび／またはディリジェントタンパク質もしくはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードするDNA配列で、形質転換され、トランスフェクトされ、感染され、そして／または注入された、改変された宿主細胞が提供される。従って、その後の使用のための有意な量の組換えディリジェントタンパク質および／またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの産生、単離、および精製を容易にし、リグナン生合成を増強または他の様式で改変するために植物中のディリジェントタンパク質および／またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの発現または増強した発現を得るために使用され得るか、あるいはディリジェントタンパク質およびピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの調節または発現のために他の様式で使用され得る、ディリジェントタンパク質および／またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの組換え発現のための系および方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】組換えピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ、組換えディリジェントタンパク質、および使用方法発明の分野本発明は、Forsythia intermedia、Tsuga heterophylla、およびThuja plicat aから単離されたディリジェント（dirigent）タンパク質およびピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ、Forsythia intermedia、Tsuga heterophylla 、およびThuja plicataからのディリジェントタンパク質およびピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードする核酸配列、ならびにそれらの配列を含むベクター、それらの配列を含む宿主細胞、および組換えピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ、組換えディリジエントタンパク質、およびそれらの改変体を生成する方法に関する。発明の背景リグナンは、広い範囲の生理学的機能および薬理学的に重要な特性を有する、巨大な構造多様性クラスの維管束植物代謝物である(Ayres,D.C.,およびLolke,J. D.、Chemistry and Pharmacology of Natural Products．Lignans．Chemilcal， Biological and Clinical Properties，Cambridge University Press，Cambridg e，England(1990)；Lewisら、Chemistry of the Amazon，Biodiversity Natural Products，and Environmental Issues，588,(P.R.Seidl，O.R.GottliebおよびM .A.C.Kaplan)135-167，ACS Symposium Serles，Wasington D.C.(1995))。それらの明白な抗生物質特性（Markkanen,T.ら、Drugs Exptl.Clin.Res.7:711-718(198 wa,Tら、Agric.Biol.Chem．49:3351-3352(1985)）、および摂食抑制物質特性（H armantha,J.,およびNawrot,J.，Biochem.Syst.Ecol．12:95-98(1984)）のために、維管束植物におけるリグナンの主な役割は、種々の日和見性生物学的病原体および捕食動物に対する抵抗性を付与するのを補助することである。リグナンはまた、サイトカインとして（Binns,A.N．ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:980-984(198 7)）、および木化における中間体として（Rahman,M.M.A．ら、Phytochemistry 2 9:1861-1866(1990)）提唱されており、これは、植物生長および発生における重要な役割を示唆する。生化学経路のリグニン／リグナンへの同化作用およびフェニルアラニンからの関連基質（チロシン）は、水生植物のそれらの維管束乾燥地帯対応物への首尾良い変異(transition)（Lewis,N.G.,およびDavin,L.B.，Isopr enoids and Other Natural Products．Evolution and Function，562(W.D.Nes, 編)202-246，ACS Symposium Sreies:Washington，DC(1994)）、４億8000年前のいくつか（Graham,L.E.，Origin of Land Plants，John Wiley&Sons,Inc.,New Y ork,NY(1993)）に必須であったことが、幅広く支持される。存在する化学分類学的データに基づいて、リグナンは、シダ類Blechum orient ale（Wada,H.ら、Chem.Pharm.Bull．40:2099-2101(1992)）およびマツモ（例えば、Dendroceros japonicusおよびMegaceros flagellaris）（Takeda,R.ら、Bry ophytes．Their Chemistry and Chemical Taxonomy,第29巻（Zinsmeister,H.D. およびMures,R.編）201-207頁、Oxford University Press:New York，NY(1990) ；Takeda,R.ら、Tetrahedron Lett．31:4159-4162(1990)）のような「原始」植物において存在し、シシル紀に発生するとして最近分類されている（Graham,L.E .，J.Plant Res．109:241-252(1996)）。興味深いことに、裸子植物および被子植物の両方の進化は、リグナンの構造複雑性および酸化改変における主な変化によって達成された（Lewis,N.G.,およびDavin,L.B.，Isoprenoids and Other Nat ural Products．Evolution and Function，562(W.D.Nes,編)202-246，ACS Sympo sium Series:Washington，DC(1994)；Gottlieb,O.R.およびYoshida,M.，Natural Products of Woody Plants．Chemicals Extraneous to the Lignocelluosic Ce ll Wall（Rowe,J.W.およびKirk,C.H.編）439-511頁、Springer Verlag:Berlin(1 989)）。実際は、Western Red Ceder（Tsuja plicata）のようないくつかの種において、リグナンは心材色、質、芳香、および耐久性を増強することよって、心材形成／作製に広範に寄与し得る。植物におけるそれらの機能に加えて、リグナンはまた、重要な薬理学的役割を有する。例えば、ポドフィロトキシンは、そのエトポシドおよびテニポシド（te niposide）誘導体と同様に、抗ガン剤として首尾良く使用されている植物化合物の例である（Ayres,D.C.,およびLoike,J.D．Chemistry and Pharmacology of Na tural Products．Lignans．Chemical,Biological and Clinical Properties，Ca mbridge University Press，Cambridge，England(1990)）。抗ウイルス特性はまた、選択されたリグナンについて報告されている。例えば、(-)-アークタイゲニ 5c,1215−1211(1990)）、およびノルジヒドログアヤレン酸（nordihydroguaiare tic acid）（Gnabre，J.N.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11239-11243(1995) ）は、それらの明白な逆転写酵素阻害活性に起因して、HIVに対して各々有効である。いくつかのリグナン（例えば、マタイレジノール（matairesinol）（Nika ido,T.ら、Chem.Pharm.Bull．29:3586-3592(1981)））は、cAMPホスホジエステラーゼを阻害する一方、他は、心血管活性を増強する（例えば、シリンガレジノール（Syringaresinol）β-D-グルコシダーゼ）（Nishibe,S.ら、Chem.Pharm.Bu ll.38:1763-1765(1990)）。また、常食における、高繊維常食の消化後に形成される「哺乳動物」リグナンまたは「フィトエストロゲン」、エンテロラクトン（ enterolactone）およびエンテロジオール（enterodiol）の存在と、乳ガンおよび前立腺ガンの減少した発生率との間の高い相関関係が存在する（いわゆる、化学防御）（Axelson,M.,およびSetchell,K.D.R.，FEBS Lett．123:337-342(1981) ；Adlercreutzら、J.Steroid Biochem.Molec.Biol．41:3-8(1992)；Adlercreutz ら、J.Steroid Biochem.Molec.Biol．52:97-103(1995)）。「哺乳動物リグナン」は、順に、マタイレジノールおよびセコイソラリシレシノール（secoisolaric iresinol）のようなリグナンに由来すると考えられる（Borielloら、J.Applied Bacteriol.，58:37-43(1985)）。リグナンへの生合成経路は、リグナン生合成経路に関与する酵素または遺伝子の単離の先行技術の報告が存在しないが、現在定義されているところである。Fo rsythia intermediaからの粗酵素抽出物に関する放射性標識実験に基づいて、8, 8'結合リグナン（これは、公知のほとんどの一般的なジリグノール（dilignol）結合（Davin,L.B.,およびLewis,N.G.，Rec.Adv.Phytochemistry,第26巻（Staffo rd,H.A.,およびIbrahim,R.K.編）、325-375頁、Plenum Press，New York，NY(19 92)）を示す）への侵入が、２つのアキラルコニフェリルアルコール分子の立体選択的カップリングを介して、酸素化フリーラジカルの形態において生じ、フロフラン（furofuran）リグナン(+)-ピノレシノールを産出することが最初に確認された（Davin,L.B.，Bedgar,D.L.，Katayama,T.,およびLewis,N.G.，Phytochem 94)）（図１）。二分子フェノキシラジカルカップリング反応（例えば、フロフランリグナン(+ )-ピノレシノールを産出する、２つのアキラルコニフェリルアルコール分子の立体選択的カップリング）には、多数の生物学的プロセスに関与する。これらは、維管束植物におけるリグニン形成（M.Noseら、Phytochemistry 39:71(1995)）、維管束植物におけるリグナン形成（N.G.LewisおよびL.B.Davin，ACS Symp.Ser．におけるスベリン形成（M.A.Bernardsら、J.Biol.Chem.270:7382(1995)）、真菌における子実体発生（J.D.Bu'Lockら、J.Chem.Soc.2085(1962)）、昆虫クチクラメラニン沈着および硬化（M.Miessnerら、Helv.Chim.Acta 74:1205(1991)；V.J. Marmarasら、Arch．Insect Biochem.Physiol．31:119(1996)）、アブラムシ色素の形成（D.W.CameronおよびLoad Todd，Organic Substances of Natural Origin .Oxidative Coupling of Phenols，W.I.TaylorおよびA.R.Battersby編(Dekker,N ew York，1967)第１巻、203頁）、および藻類細胞壁ポリマーの形成（M.A.Ragan ,Phytochemistry 23:2029(1984)）を含むと推定される。前述のリグニンおよびリグナン基質のインビボでの生合成において観察される顕著な位置化学（regiochemical）および／または立体化学特異性とは対照的に、全ての以前に記載の化学的インビトロ二分子フェノキシラジカルカップリング反応（J.Iqbalら、Chcm.Rev．94:519(1994)））および酵素的インビトロ二分子フェノキシラジカルカップリング反応（K.Freudenberg，Science 148:595(1965) ）は、厳密な位置特異的制御および立体特異的制御を欠如している。すなわち、キラル中心が、インビトロでのカップリングの間に導入される場合、産物はラセミ体であり、そして１つより多い潜在的カップリング部位が存在する場合、異なる位置化学が生じ得る。従って、特定の鏡像異性形態またはインビトロでの特異的カップリング産物を生じる能力は、明白な制御下ではない。結果的に、二分子フエノキシラジカルカップリング反応の位置化学および立体化学を制御して、例えばリグナンの形成を導くという機構がインビボで存在することが推測される。 Forsythia intermedia、およびおそらく他の種において、(+)-ピノレシノール（２つのE-コニフェリルアルコール分子の立体特異的カップリングの産物）は、逐次還元を受けて、(+)-ラリシレシノール、次いで(-)-セコイソラリシレシノールを生じる（Katayama,T.ら、Phytochemistry 32:581-591(1993)；Chu,A.ら、J. Biol.Chem．268:27026-27033(1993)）（図１）。今までは、１つより多いレダクターゼが、逐次工程を触媒するのに必要とされるか否かは不明であったが、還元は、NADPHのプロR水素化物の抽出を介して進行し、産物（(+)-ラリシレシノールおよび(-)-セコイソラリシレシノール）のC-7およびC-7'位置の両方で立体配置の「反転」を生じた（Chu,A.ら、J.Biol.Chem．268:27026-27033(1993)）。(-)- マタイレジオールは、(-)-セコイソラリシレシノールの脱水素化を介して続いて形成され、さらにその代謝はおそらく、Ipomoea cairicaにおける抗ウイルス(-) -トラシェロゲニンおよびPodophyllum peltatumにおける(-)-ポドフィロトキシンのようなリグナンを産出する。従って、(+)-ピノレシノールの立体特異的形成、ならびに(+)-ラリシレシノールおよび(-)-セコイソラリシレシノールを生じる続く還元工程は、リグナン代謝における中枢点である。なぜなら、それらは、フラノ、ジベンジルブタン、ジベンジルブチロラクトン、およびアリールテトラヒドロナフタレンリグナンサブクラスへの侵入を示すからである。さらに、リグナンは通常、光学活性であるが、存在する特定の鏡像異性体は、植物種の間で異なり得ることに注意するべきである。例えば、(-)-ピノレシノールは、Xanthoxylum ailanthoidesにおいて生じ（ Ishiiら、Yakugaku Zasshi，103:279-292(1983)）、そして(-)-ラリシレシノールは、Daphne tanguticaにおいて存在する（Lin-Genら、Planta Medica，45:172 -176(1982)）。特定のリグナンの光学活性は、生物学的活性に関する重要な結果を有し得る。例えば、(-)-トラシェロゲニンは、HIV-1のインビトロ複製を阻害し、一方、(+)-鏡像異性体は、あまり有効ではない（Schroderら、Naturforsc h，45c:1215-1211(1990)）。発明の要旨前述に従って、本発明の１つの局面において、78kDディリジェントタンパク質が、8,8'-結合リグナン形成における立体特異性を付与することに関与することが、今や発見された。このタンパク質は、検出可能な触媒活性酸化中心を有さず、そして明らかに、コニフェリルアルコール由来フリーラジカルへの結合および配向のみに供し、これは、次いで、立体選択的なカップリングを受け、(+)-ピノレシノールを形成する。フリーラジカルの形成は、最初の場合には、非特異的オキシダーゼまたは非酵素的電子酸化剤のいずれかの酸化許容量を必要とする。本発明の別の局面において、単一の酵素（ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼと称される）は、ピノレシノールからラリシレシノール、次いでセコイソラリシレシノールへの変換を触媒する。従って、本発明の１つの局面は、例えば、Forsythia intermedia、Thuja plicata、およびTsuga heterophyllaからのもののような、単離されたディリジェントタンパク質および単離されたピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼに関する。本発明の他の局面において、Forsythia intermedia（配列番号12および14）、 Thuja plicata（配列番号20、22、24、26、28、30、32、および34）、およびTsu ga heterophylla（配列番号16および18）からのディリジェントタンパク質をコードするcDNAは、単離および配列決定されており、そして対応するアミノ酸配列は、推定されている。また、Forsythia intermedia（配列番号47、49、51、53、 55、および57）、Thuja plicata（配列番号61、63、65、および67）、およびTsu ga heterophylla（配列番号69および71）からのピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードするcDNAは、単離および配列決定されており、そして対応するアミノ酸配列は、推定されている。従って、本発明は、単離されたタンパク質、およびディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの発現をコードする単離されたDNA配列に関する。他の局面において、本発明は、ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼまたはディリジェントタンパク質をコードする核酸配列を含む複製可能組換えクローニングビヒクルに関する。本発明はまた、ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼDNAまたはRNAの少なくとも一部、またはディリジェントタンパク質DNAまたはRNAの少なくとも一部に十分に相補的な、それらへのハイブリダイゼーションを可能にする塩基配列に関する。前述の相補的塩基配列は、以下を含むがこれらに限定されない：アンチセンスピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼRNA；アンチセンスディリジェントタンパク質RNA；ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼDNAまたはディリジェントタンパク質DNAに相補的なDNAのフラグメント、そしてこれらはそれゆえ、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーとして、またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ遺伝子、ディリジェントタンパク質遺伝子、もしくは関連遺伝子のためのプローブとして有用である。本発明のなお別の局面において、本発明の組換えクローニングビヒクルおよび／またはDNA配列で形質転換され、トランスフェクトされ、感染され、そして／または注入された改変された宿主細胞が提供される。従って、本発明は、植物、動物、微生物、および細胞培養物におけるピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼおよびディリジェントタンパク質の組換え発現を提供する。本明細書中に記載される発明概念は、植物、動物、微生物、または細胞培養物における、有意な量の組換えピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼもしくはディリジェントタンパク質、またはそれらの酵素産物の産生、単離、および精製を容易にするために使用され得る。図面の簡単な説明本発明の前述の局面および多くの付随する利点は、添付する図面と組み合わせた場合、以下の詳細な説明を参照することによってより理解されるように、より容易に理解されるようになる、ここで：図１は、Forysythia intermediaにおける、E-コニフェリルアルコールの(+)- ピノレシノールへの立体特異的変換を示す。この反応の立体選択性は、ディリジェントタンパク質によって制御される。次いで、(+)-ピノレシノールは、(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼによって、(+)-ラリシレシノールおよび(-)-セコイソラリシレシノールに連続的に変換される。(+)-ピノレシノール、(+)-ラリシレシノール、および(-)-セコイソラリシレシノールは、それぞれリグナンのフロフラン、フラノ、およびジベンジルブタン系統群の前駆体である。好ましい実施態様の詳細な説明本明細書中で用いられるように、用語「アミノ酸（amino acid）」および「アミノ酸(amino acids)」は、全ての天然に存在するL-α-アミノ酸またはその残基をいう。アミノ酸は、１文字表記または３文字表記のいずれかによって識別される： Asp Ｄアスパラギン酸 Ile Ｉイソロイシン Thr Ｔスレオニン Leu Ｌロイシン Ser Ｓセリン Tyr Ｙチロシン Glu Ｅグルタミン酸 Phe Ｆフェニルアラニン Pro Ｐプロリン His Ｈヒスチジン Gly Ｇグリシン Lys Ｋリジン Ala Ａアラニン Arg Ｒアルギニン Cys Ｃシステイン Trp Ｗトリプトファン Val Ｖバリン Gln Ｑグルタミン Met Ｍメチオニン Asn Ｎアスパラギン本明細書中で用いられるように、用語「ヌクレオチド」は、DNAまたはRNAのモノマー単位をいい、これは、糖部分（ペントース）、リン酸、および窒素複素環式塩基を含む。塩基は、グリコシド炭素（ペントースの1'炭素）を介して糖部分に結合し、そして塩基および糖の組合せは、ヌクレオシドと称される。塩基は、アデニン（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）、およびチミン（「Ｔ」）であるDNAの４つの塩基で、ヌクレオチドを特徴づける。イノシン（「Ｉ」）は合成塩基であり、これは、４つの天然に存在する塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）のいずれかを置換するのに使用され得る。４つのRNA塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびウラシル（「Ｕ」）である。本明細書中に記載されるヌクレオチド配列は、隣接するペントースの3'炭素と5'炭素との間のホスホジエステル結合によって結合されるヌクレオチドの線状配列を含む。用語「パーセント同一性」（％Ｉ）は、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列が並行して配列される場合、同じ相対的位置を占有するアミノ酸またはヌクレオチドの割合を意味する。用語「パーセント類似性」（％Ｓ）は、２つの比較タンパク質配列の関連性の程度の統計学的基準である。パーセント類似性は、コンピュータープログラムによって計算され、これは、化学的類似性（例えば、比較されるアミノ酸は、酸性、塩基性、疎水性、芳香族などであるか否か）、および／または塩基対変化の最小数によって測定されるような進化的距離（これは、比較されるアミノ酸の対の１つのメンバーをコードするコドンを対の他のメンバーをコードするコドンに変換するのに必要とされる）に基づくアミノ酸の各比較対に対する数値を割り当てる。計算は、２つの配列の最良適合アラインメントが全ての可能なアラインメントの反復比較によって経験的に作製された後、行われる。（Henikoff,S.およびH enikoff,J.G.，Proc.Nat'l Acad Sci USA 89:10915-10919(1992)）。「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合を介して結合したデオキシリボヌクレオチドの短い長さの一本鎖または二本鎖配列をいう。オリゴヌクレオチドは、公知の方法によって化学的に合成され、そして例えば、ポリアクリルアミドゲルで精製される。用語「ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ」は、２つの還元反応：ピノレシノールのラリシレシノールへの還元、およびラリシレシノールのセコイソラリシレシノールへの還元を触媒し得る酵素を意味するように、本明細書中で使用される。これらの反応の産物（ラリシレシノールおよびセコイソラリシレシノール）は、(+)-または(-)-鏡像異性体のいずれかであり得る。用語「ディリジェントタンパク質」は、二分子フェノキシラジカルカップリング反応を先導し、それにより反応の産物および／またはそのポリマー誘導体の維立体化学および位置化学を決定し得るタンパク質を意味するように、本明細書中で使用される。用語「改変」、「アミノ酸配列改変」、「改変体」、および「アミノ酸配列改変体」は、対応する天然のディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼと比較して、それらのアミノ酸配列においていくつかの相違を有するディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ分子をいう。通常は、改変体は、対応する天然のディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼと少なくとも約70％の相同性を有し、そして好ましくは、対応する天然のディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼと少なくとも約80％相同性である。本発明内にあるディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼのアミノ酸配列改変体は、特定の位置での置換、欠失、および／または挿入を有する。ディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの配列改変体は、所望の増強または減少された酵素活性、改変された位置化学または立体化学、あるいは改変された基質利用性または産物分布を達成するために使用され得る。置換ディリジェントタンパク質改変体またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ改変体は、除去された対応する天然のディリジェントタンパク質配列またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ配列における少なくとも１つのアミノ酸残基、および同じ位置でのその位置において挿入された異なるアミノ酸を有するものである。置換は単一であり得、ここで分子中の１つのアミノ酸のみが置換されているか、または複数であり得、ここで同じ分子中の２つ以上のアミノ酸が置換されている。ディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ分子の活性における置換変化は、天然のアミノ酸の側鎖と、電荷および／または構造において有意に異なる側鎖を有するアミノ酸の置換によって得られ得る。この型の置換は、ポリペプチド骨格の構造および／または置換の領域における分子の電荷もしくは疎水性に影響を及ぼすことが予測される。ディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ分子の活性における穏和な変化は、天然の分子の側鎖と電荷および／または構造において類似である側鎖を有するアミノ酸の置換によって予測される。この型の置換（保存的置換といわれる）は、ポリペプチド骨格の構造または置換の領域における分子の電荷もしくは疎水性のいずれかを実質的に変更させないと予測される。挿入ディリジェントタンパク質改変体またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ改変体は、天然のディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ分子における特定の位置でアミノ酸のすぐ隣に挿入される１つ以上のアミノ酸を有するものである。アミノ酸のすぐ隣は、そのアミノ酸のαカルボキシまたはαアミノ官能基のいずれかに結合されることを意味する。挿入は、１つ以上のアミノ酸であり得る。通常は、挿入は、１つまたは２つの保存的アミノ酸からなる。挿入の部位に隣接するアミノ酸に、電荷および／または構造において類似のアミノ酸は、保存的として定義される。あるいは、本発明は、挿入の部位に隣接するアミノ酸とは実質的に異なる電荷および／または構造を有するアミノ酸の挿入を含む。欠失改変体は、天然のディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ分子における１つ以上のアミノ酸が除去されているものである。通常は、欠失改変体は、ディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ分子の特定の領域において欠失した１つまたは２つのアミノ酸を有する。用語「アンチセンス」または「アンチセンスRNA」または「アンチセンス核酸」は、メッセンジャーRNA分子の全てまたは一部に相補的である核酸分子を意味するように、本明細書中で使用される。アンチセンス核酸分子は、代表的には、相補的な発現されるメッセンジャーRNA分子のインビボでの発現を阻害するために使用される。用語「生物学的活性」、「生物学的に活性な」、「活性」、および「活性な」は、ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ分子に関して使用される場合、以下の実施例８に記載されるアッセイのような酵素活性アッセイにおいて測定されるような、ピノレシノールおよびラリシレシノールを還元して、それぞれラリシレシノールおよびセコイソラリシレシノールを得る、ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ分子の能力をいう。用語「生物学的活性」、「生物学的に活性な」、「活性」、および「活性な」は、ディリジェントタンパク質に関して使用される場合、二分子フェノキシラジカルカップリング反応を先導して、それにより反応の産物およびそのポリマー誘導体の立体化学および位置化学を決定するディリジェントタンパク質の能力をいう。ディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼのアミノ酸配列改変体は、所望の改変された生物学的活性を有し得、これは、例えば、改変された反応速度論、基質利用性、産物分布、または位置化学および立体化学のような他の特徴を含む。用語「コードするDNA配列」、「コードするDNA」、および「コードする核酸」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列をいう。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、翻訳されたポリペプチド鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。従って、DNA配列は、アミノ酸配列をコードする。用語「複製可能発現ベクター」および「発現ベクター」は、DNAの小片、通常は二本鎖をいい、これは、外来DNAの小片をそれに挿入されてい得る。宿主において天然には見い出されないDNAである外来DNAは、異種DNAとして規定される。ベクターは、外来または異種DNAを適切な宿主細胞に輸送するのに使用される。一旦宿主細胞に入ると、ベクターは、宿主染色体DNAと独立的または同時に複製し得、そしてベクターおよびその挿入した（外来）DNAのいくつかのコピーが作製され得る。さらに、ベクターは、外来DNAのポリペプチドへの翻訳を可能にする必要なエレメントを含む。従って、外来DNAによってコードされるポリペプチドの多くの分子は、迅速に合成され得る。用語「形質転換宿主細胞」、「形質転換された」、および「形質転換」は、DN Aの細胞への導入をいう。細胞は「宿主細胞」と称され、そして原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。代表的な原核生物宿主細胞としては、E.coliの種々の株が挙げられる。代表的な真核生物宿主細胞としては、植物細胞（例えば、トウモロコシ細胞）、酵母細胞、昆虫細胞、または動物細胞が挙げられる。導入されたDNAは、通常、DNAの挿入小片を含むベクターの形態である。導入されたDN A配列は、宿主細胞と同じ種由来、または宿主細胞とは異なる種由来であり得るか、またはハイブリッドDNA配列（いくつかの外来DNAおよび宿主種に由来するいくつかのDNAを含む）であり得る。本発明に従って、Forsythia intermedia、Thuja plicata、およびTsuga heter ophylla由来のディリジェントタンパク質およびピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードするcDNAが、以下の様式において、単離され、配列決定され、そして発現された。 Forsythia intermedia由来のデイリジェントタンパク質をコードするcDNAに関連して、経験的に決定された精製プロトコルが開発されて、Forsythiaディリジェントタンパク質が単離された。この手順は、ディリジェントタンパク質の少なくとも６つのアイソフォームを生じた。これらのアイソフォームの各々のアミノ末端のアミノ酸配列決定は、各アイソフォームの配列が同一であることを示した。これらのアイソフォームの混合物のN-末端の配列決定は、28アミノ酸配列を生じた（配列番号１）。これらアイソフォームの混合物のトリプシン消化は、６つのペプチドフラグメントを生じ、これらは、配列番号２から７の配列決定を可能にするのに十分な量に精製された。 PSINT1（配列番号８）と称されるプライマーは、N-末端ペプチド（配列番号１）のアミノ酸９〜15の配列に基づいて合成された。PSI1R（配列番号９）と称されるプライマーは、（配列番号２）に示される内部ペプチド配列のアミノ酸３〜９の配列に基づいて合成された。PSI2R（配列番号10）と称されるプライマーは、（配列番号２）に示される内部ペプチド配列のアミノ酸13〜20の配列に基づいて合成された。PSI7R（配列番号11）と称されるプライマーは、（配列番号３）に示される内部ペプチド配列のアミノ酸６〜12の配列に基づいて合成された。 Forsythia全RNAは、大濃度のポリフェノールを含む木質組織のために特異的に設計された方法から改変されたプロトコルを用いて単離された。ポリＡ＋RNAが単離され、そしてcDNAライブラリーが、標準的な手段を用いて構築された。プライマーPSINT1（配列番号８）およびPSI7R（配列番号11）、PSI2R（配列番号10）、またはPSI1R（配列番号９）のうちの１つを、基質としてのForsythia cDNAのアリコートともに利用する各PCR反応は、それぞれ、約370bp、約155bp、および約125bpの単一のcDNAバンドを生じた。PSINT1（配列番号８）-PSI7R（配列番号1 1）反応の約370bp産物は、PCRによって増幅され、そしてForsythia intermedia cDN Aライブラリーの約600,000PFUをスクリーニングするためのプローブとして利用された。２つの別々のcDNAが同定され、pPSDFi1（配列番号12）およびpSDFi2（配列番号14）と命名された。ディリジェントタンパク質をコードするcDNAインサートは、プラスミドpPSDFi1から切り出され、そしてバキュロウイルス移入ベクターpBlueBac4にクローン化された。得られる構築物を使用して、Spodopterafru giperdaを形質転換し、そこから、機能的ディリジェントタンパク質を精製した。 Thuja plicataおよびTsuga heterophylla由来のディリジェントタンパク質のクローニングに関連して、Forsythia cDNAが、Tsuga heterophyllaからの２つのディリジェントタンパク質クローン（配列番号16、18）およびThuja plicataからの８つのディリジエントタンパク質cDNAクローン（配列番号20、22、24、26、 28、30、32、34）を単離するためのプローブとして使用された。 Forsythia intermedia由来の(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼをコードするcDNAに関連して、経験的に決定された精製プロトコル（これは、８クロマトグラフィー工程からなる）が、Forsythia(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼタンパク質を単離するために開発された。この手順は、(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼの２つのアイソフォームを生じ、これは両方とも、(+)-ピノレシノールおよび(+)-ラリシレシノールの還元を触媒し得た。これらのアイソフォーム各々のN-末端の配列決定は、同一の30アミノ酸配列（配列番号36）を生じた。これらのアイソフォームの両方の混合物のトリプシン消化は、４つのペプチドフラグメントを生じ、これらは、配列決定を可能にするのに十分な量で精製された（配列番号37〜40）。さらに、これらのアイソフォームの両方の混合物の臭化シアン切断は、３つのペプチドフラグメントを生じ、これらは、配列決定を可能にするのに十分な量で精製された（配列番号41〜43）。 PLRN5（配列番号44）と称されるプライマーは、N-末端ペプチドのアミノ酸７〜13の配列（配列番号36）に基づいて合成された。PLR14R（配列番号45）と称されるプライマーは、配列番号37に示される内部ペプチド配列のアミノ酸２〜８の配列に基づいて合成された。PLR15R（配列番号46）と称されるプライマーは、配列番号37に示される内部ペプチド配列のアミノ酸９〜15の配列に基づいて合成された。配列番号37に示される内部ペプチド配列のアミノ酸９〜15の配列（プライマーPLR15R（配列番号46）がそれに基づく）はまた、配列番号41に示される、臭化シアンで作製した内部フラグメントのアミノ酸４〜10の配列に対応した。 Forsythia全RNAは、大濃度のポリフェノールを含む木質組織のために特異的に設計された方法から改変されたプロトコルを使用して単離された。ポリＡ＋RNA が単離され、そしてcDNAライブラリーが、標準的な手段を用いて構築された。プライマーPLRN5（配列番号44）およびPLR14R（配列番号45）またはPLR15R（配列番号46）のいずれかを、基質としてのForsythia cDNAのアリコートとともに利用するPCR反応は、380bpおよび400bpの２つの増幅されたバンドを生じた。１つの4 00bp cDNAインサートは、Forsythia cDNAライブラリーをスクリーニングするためにプローブとして利用された。400bpプローブは、配列番号47の塩基22〜423に対応した。６つのcDNAクローンが、単離されそして配列決定された（配列番号47 、49、51、53、55、57）。これらのクローンは共通のコード領域を有し、多くは、異なる5'非翻訳領域およびそれぞれ異なる地点で終わる3'非翻訳領域を有した。これらのcDNA（配列番号47）のうちの１つは、E.coliにおいてβガラクトシダーゼ融合タンパク質として発現し、これは、天然の植物タンパク質として同じ鏡像異性体特異的反応を触媒した。 (+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼおよびThuja plicat a由来の(-)-ピノレシノール／(-)-ラリシレシノールレダクターゼのクローニングに関連して、cDNAを合成し、そしてPCR反応におけるテンプレートとして利用した。ここでプライマーは、3'リンカープライマー（配列番号59）および5'プライマー（CR6-NTと称される）（配列番号60）であった。予測した長さ（1.2kb）の少なくとも２つのバンドが生成し、そしてプラスミドベクターにクローン化された。１つのクローン（plr-Tp1と称される）（配列番号61）が完全に配列決定され、そしてE.coliにおいてβガラクトシダーゼ融合タンパク質として発現された。plr-Tp1は、(-)-ピノレシノール／(-)-ラリシレシノールレダクターゼをコードする。クローンplr-Tp1のcDNAインサートを使用して、T.plicata cDNAライブラリーがスクリーニングされ、そしてさらなる唯一のクローン（plr-Tp2と称される）（配列番号63）が同定された。plr-Tp2はplr-Tp1に高い相同性を有するが、(+)- ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼをコードする。クローンpl r-Tp1のcDNAインサートを使用して、T.plicata cDNAライブラリーがスクリーニングされ、そしてさらなる２つのピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼcDNA（配列番号65、67）が同定された。 Tsuga heterophylla由来のピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードする２つのcDNA（配列番号69、71）が、Tsuga heterophylla cDNAライブラリーをplr-Tp1 cDNAインサートでスクリーニングすることによって単離された。ディリジェントタンパク質、(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼ、および(-)-ピノレシノール／(-)-ラリシレシノールレダクターゼをコードするcDNAの単離は、これらの機能的酵素のための効率的な発現系の開発を可能にし；リグナン生合成の発生的調節を検査するための有用なツールを提供し、そして他のディリジェントタンパク質およびピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの単離を可能にする。ディリジェントタンパク質およびピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼcDNAの単離はまた、リグナン生合成を増強または改変するために、広範な生物の形質転換を可能にする。本発明のタンパク質および核酸は、二分子フェノキシカップリング反応（例えば、フロフラン、フラノ、およびジベンジルブタンリグナン）の産物の立体化学、位置化学（regiochemistry）、またはその両方を予め決定するのに利用され得る。限定的でない例として、本発明のタンパク質および核酸は、以下のために利用され得る：植物種における健常保護リグナン（例えば、ポドフィロトキシン）のレベルを上昇させるかまたはそうでなければ改変する（ここで、植物種は、野菜、穀物、および果実、ならびにこのような遺伝的に改変した植物由来の物質を取り込んだ食品を含むがこれらに限定されない）；植物種を遺伝的に改変して、種々の目的（例えば、ニュートラシューテイカルズ（neutriceuticals）および栄養補助食品）に有用なリグナンの豊富な天然の供給を提供する；所望の生物学的特性を有する光学的に純粋なリグナン(例えば、抗ウイルス特性を有する(-)- アルクチゲニン（arctigenin）)の豊富な供給を産生するように生存生物を遺伝的に改変する。特に、ディリジェントタンパク質結合部位の特徴付けおよび作用の機構は、立体化学的に制御されたポリマーアセンブリのためのテンプレートとして働く一連（array）のディリジェントタンパク質結合部位からなる合成タンパク質の開発を可能にする。当該分野で周知のN-末端輸送配列（例えば、von Heijne,G.ら、Eur.J.Biochem 180:535-545(1989)；Stryer，Biochemistry W.H.Freeman and Company，New Yor k，NY,769頁(1988)を参照のこと）は、種々の細胞または細胞外位置に、ディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼを指向させるのに使用され得る。欠失、置換、変異、および／または挿入によって産生され得る、野生型ディリジェントタンパク質クローンならびにピノレシノール／ラリシレシノールクローンの配列改変体は、先行技術によって制限される範囲を除いて、本発明の範囲内であることが意図される。ディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼアミノ酸配列改変体は、野生型ディリジェントタンパク質または野生型ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードするDNA配列を、例えば、部位特異的変異誘発と通常呼ばれる技術を用いることにより変異させることによって構築され得る。現在、当該分野において周知である種々のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法（例えば、ClontechのTransformer Site- Directed Mutagenesisキットのような２プライマー系）が、この目的のために使用され得る。この系における標的プラスミドの変性に続いて、２つのプライマーは、プラスミドに同時にアニールされる；これらのプライマーのうちの一方は、所望の部位特異的変異を含み、他方は、プラスミドにおける別の点での変異を含み、制限部位の排除を生じる。次いで、第２鎖合成が行われ、これらの２つの変異を強固に連結させ、そして得られるプラスミドは、E.coliのmutS株に形質転換される。プラスミドDNAは、形質転換細菌から単離され、問題の制限部位で制限され（これにより、非変異プラスミドは線状化される）、次いでE.coliに形質転換される。この系は、サブクローニングまたは一本鎖ファージミドの生成を必要とせずに、発現プラスミドにおいて直接変異の生成を可能にする。２つの変異の強固な連結および続く非変異プラスミドの線状化は、高い変異効率を生じ、そして最小スクリーニングを可能にする。最初の制限部位プライマーの合成に続いて、この方法は、１変異部位あたり１つの新規なプライマー型のみの使用を必要とする。各位置変異体を別々に調製するよりはむしろ、「設計された縮重」オリゴヌクレオチドプライマーのセットが、所定の部位で所望の変異の全てを同時に導入するために合成され得る。形質転換体は、変異された領域を通じてプラスミドDNAを配列決定して変異クローンを同定および選別することによってスクリーニングされ得る。次いで、各変異体DNAは制限され、そしてMutation Detection Enhancement ゲル（J.T.Baker）で電気泳動することによって分析されて、配列に他の改変が生じていないことを（未変異誘発コントロールに対するバンドシフト比較によって）確認され得る。検証した変異体二重鎖は、既にこの型のベクターにクローン化されていない場合、複製可能発現ベクターにクローン化され得、そして得られる発現ベクター構築物は、変異体タンパク質の高レベルの産生および続くそのタンパク質の精製のため、E.coli（例えば、E.coli BL21(DE3)pLysS株）を形質転換するために使用され得る。FAB-MSマッピングの方法は、変異体発現の正確さを迅速にチェックするために使用され得る。この技術は、全体タンパク質を通じてセグメントを配列決定することを提供し、そして配列の割り当てにおける必要な確信を提供する。この型のマッピング実験において、タンパク質はプロテアーゼで消化される（選択は、改変される特定領域に依存する。なぜなら、このセグメントが最重要であり、そして残りのマップは未変異誘発タンパク質のマップと同一であるはずだからである）。切断フラグメントのセットは、微小孔（microbore）HPLC（逆相またはイオン交換、再度、改変される特異的領域に依存する）によって分画され手、各々の画分においていくつかのペプチドを提供し、そしてペプチドの分子量は、FAB-MSによって決定される。次いで、質量は、予測配列の消化から予測したペプチドの分子量と比較され、そして配列の正確さが素早く確認される。タンパク質改変へのこの変異誘発アプローチが指向されるので、改変したペプチドの配列決定は、MSが予測と一致する場合、必要ではない。変化した残基を検証することが必要な場合、CADタンデムMS/MSが使用されて、問題の混合物のペプチドを配列決定し得るか、または標的ペプチドが、改変の位置に依存して、減算エドマン分解またはカルボキシペプチダーゼＹ消化のために精製される。特定の部位特異的変異の設計において、非保存的置換（例えば、Cys、HisまたはGluをAlaに）を最初に行い、そして活性が結果的に大きく損なわれるかどうかを決定することが一般的に所望され得る。次いで、変異誘発したタンパク質の特性は、改変した機能の感受性指標としてのKmおよびkcatの速度パラメーターに対して特別の注意をもって試験され、改変した機能から、結合および／または触媒作用における変化自体は、天然の酵素に対する比較によって推定され得る。残基が、この手段によって、活性減損またはノックアウトによって重要であると実証される場合、保存的置換が行われ得る（例えば、側鎖の長さを改変するためのGl uをAspに；CysをSerに、またはHisをArgに）。芳香族もまた、アルキル側鎖を置換され得るが、疎水性セグメントについては、改変されるのは主にサイズである。正常な産物分布における変化は、反応シーケンスのどの工程が、変異によって改変されているかを示し得る。他の部位特異的変異誘発技術もまた、本発明のヌクレオチド配列とともに使用され得る。例えば、DNAの制限エンドヌクレアーゼ消化に続く連結は、Sambrook らの第15.3節に記載されるように、ディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ欠失改変体を作製するのに使用され得る（ Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版、Cold Spring Harbor Laborat ory Press，New York，NY（1989））。同様のストラテジーは、Sambrookら（前出）の第15.3節に記載されるように、挿入改変体を構築するのに使用され得る。オリゴヌクレオチド特異的変異誘発もまた、本発明の置換改変体を調製するのに使用され得る。本発明の欠失および挿入改変体を簡便に調製するためにもまた使用され得る。この技術は、Adelmanら（DNA 2:183(1983)）によって記載されるように、当該分野で周知である。一般的には、少なくとも25ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが、ディリジェントタンパク質遺伝子またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ遺伝子において２つ以上のヌクレオチドを挿入、欠失、または置換するために使用される。至適オリゴヌクレオチドは、変異をコードするヌクレオチドのどちらの側でも12〜15の完全に一致したヌクレオチドを有する。野生型ディリジェントタンパク質または野生型ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼを変異誘発するために、オリゴヌクレオチドは、適切なハイブリダイゼーション条件下で、一本鎖DNAテンプレート分子にアニールされる。次いで、DNA重合化酵素（通常は、E.coli DNAポリメラーゼＩのKlenowフラグメント）が添加される。この酵素は、DNAの変異保有鎖の合成を完了するためのプライマーとして、オリゴヌクレオチドを使用する。従って、ヘテロ二重鎖分子が形成され、その結果、DNAの１つの鎖は、ベクターに挿入された野生型ディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードし、そしてDNAの第２の鎖は、同じベクターに挿入されたディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの変異形態をコードする。次いで、このヘテロ二重鎖分子は、適切な宿主細胞に形質転換される。置換された１より多いアミノ酸を有する変異体は、いくつかの方法のうちの１つにおいて作製され得る。アミノ酸がポリペプチド鎖においてともに近接して位置する場合、それらは、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを用いて、同時に変異され得る。しかし、アミノ酸が、互いにいくらか離れて位置する場合（例えば、１０アミノ酸以上によって隔てられる）、所望の変化の全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを作製するのはより困難である。代わりに、２つの別の方法のうち１つが使用され得る。第１の方法において、別々のオリゴヌクレオチドが、置換される各アミノ酸のために作製される。次いで、オリゴヌクレオチドは、一本鎖テンプレートDNAに同時にアニールされ、そしてテンプレートから合成されるDNAの第２鎖は、所望のアミノ酸置換の全てをコードする。別の方法は、所望の変異体を産生するための２回以上の変異誘発を包含する。１回目は、単一の変異体について記載されるとおりである：野生型ディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼDNAは、テンプレートのために使用され、第１の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドが、このテンプレートにアニールされ、そして次いで、ヘテロ二重鎖 DNA分子が作製される。２回目の変異誘発は、１回目の変異誘発において産生した変異DNAをテンプレートとして利用する。従って、このテンプレートは既に、１つ以上の変異を含む。次いで、さらなる所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドが、このテンプレートにアニールされ、そしてDNAの得られる鎖は今や、一回目および２回目の変異誘発の両方からの変異をコードする。この得られたDNAは、３回目の変異誘発において、テンプレートとして使用され、この後同様に続き得る。真核生物発現系は、ディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ産生のために利用され得る。なぜなら、それらは、任意の必要な翻訳後改変を行い得、そして適切な膜位置に酵素を指向させ得るからである。この目的のための代表的な真核生物発現系は、組換えバキュロウイルスAu tographa californica核多核体ウイルス（AcNPV；M.D.SummersおよびG.E.Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Proc edures(1986)；Luckowら、Bio-technology 6:47-55(1987)）を、本発明のディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの発現のために使用する。昆虫細胞（例えば、Spodoptera frugiperda種の細胞）の組換えバキュロウイルスによる感染は、大量のディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼタンパタ質の産生を可能にする。さらに、バキュロウイルス系は、組換えディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの産生についての他の重要な利点を有する。例えば、バキュロウイルスはヒトに感染せず、そしてそれゆえ、大量に安全に扱われ得る。バキュロウイルス系において、ディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードするDNAセグメントおよびベクターを包含するDNA構築物が調製される。ベクターは、バキュロウイルスの多核体遺伝子プロモーター領域、組換えの間の適切な交差に必要なバキュロウイルス隣接配列（この隣接配列は、プロモーター配列に隣接する約200〜3 00塩基対を含む）、および構築物が細菌において複製することを可能にする細菌の複製起点を含み得る。ベクターが構築され、その結果、（ｉ）DNAセグメントが、多核体遺伝子プロモーターに隣接して（または、これに作動可能に連結して、またはこれの「下流」または「制御下に」）配置され、そして（ii）プロモーター／ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ、またはプロモーター／-ディリジェントタンパク質の組合せの両側に、バキュロウイルスDNAの200〜3 00塩基対（隣接配列）が隣接する。ディリジェントタンパク質DNA構築物、またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼDNA構築物を産生するために、全長ディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードするcDNAクローンは、本明細書中に記載されるような方法を用いて得られる。DNA構築物は、宿主細胞において、適切なバキュロウイルス（すなわち、構築物においてコードされるプロモーターと同じ種のバキュロウイルス）のバキュロウイルスDNAと、組換えが成立する条件下で接触される。得られる組換えバキュロウイルスは、完全なディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードする。例えば、昆虫宿主細胞は、DNA構築物および機能的バキュロウイルスで、同時トランスフェクトされ得るかまたは別々にトランスフェクトされ得る。次いで、得られる組換えバキュロウイルスが単離され、そして細胞に感染させて、ディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターセの産生をもたらすために使用され得る。宿主昆虫細胞としては、例えば、Spodoptera frugiperda細胞が挙げられる。次いで、本発明の組換えバキュロウイルスに感染した昆虫宿主細胞は、バキュロウイルスにコードされるディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの発現を可能にする条件下で培養される。従って、産生される組換えタンパク質は、次いで、当該分野で公知の方法を用いて細胞から抽出される。酵母のような他の真核微生物もまた、本発明を実施するために使用され得る。いくつかの他の株が利用可能であるが、パン酵母Saccharomyces cerevisiaeは、一般的に使用される酵母である。プラスミドYRp7（Stinchcombら、Nature 282:3 9(1979)；Kingsmanら、Gene 7:141(1979)；Tschemperら、Gene 10:157(1980)）は、Saccharomycesにおける発現ベクターとして、一般的に使用される。このプラスミドは、トリプトファンにおいて増殖する能力を欠く酵母の変異体株（例えば、ATCC番号44,076およびPEP4-1（Jones,Genetics 85:12(1977)））についての選択マーカーを提供するtrp1遺伝子を含む。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのtrp1損傷の存在は、トリプトファンの非存在下において増殖することにより形質転換を検出するための有効な環境を提供する。酵母宿主細胞は一般的に、Hinnen（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929(1978)）に記載のように、ポリエチレングリコール法を用いて形質転換される。さらなる酵母形質転換プロトコルは、Gietzら、N.A.R．20(17):1425(1992)；Reevesら、FEMS 99:193-197(1992)に示される。酵母ベクターにおける適切なプロモート配列は、3-ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzemanら、J.Biol.Chem.255:2073(1980)）または他の解糖酵素（Hessら、 J.Adv.Enzyme Reg.7:149(1968)；Hollandら、Biochemistry 17:4900(1978)）（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）についてのプロモーターを含む。適切な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝子に関連する終結配列もまた、発現されることが所望される配列の3'側で発現ベクターに連結されて、mRNAのポリアデニル化および終結を提供する。増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および前述のグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域である。酵母適合性プロモーター、複製起点、および終結配列を含む任意のプラスミドベクターが適切である。多細胞生物（例えば、植物）に由来する細胞培養物は、本発明を実施するための宿主として使用され得る。トランスジェニック植物は、例えば、ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼおよび／またはディリジェントタンパク質をコードするプラスミド、ならびに選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性をコードするkan遺伝子）を、Hoeckemaら、Nature 303:179-181(1983)に記載されるように、ヘルパーTiプラスミドを含むAgrobacterium tumifaciensに移入し、そしてAnら、Plant Physiology 81:301-305(1986)に記載されるように、Agr obacterium細胞を形質転換される植物の葉スライスとともに培養することによって得られ得る。培養した植物宿主細胞の形質転換は、通常、上記のように、Agro bacterium tumifaciensを介して達成される。哺乳動物宿主細胞および固い細胞膜バリアを有さない他の宿主細胞の培養は、通常、GrahamおよびVan der Eb（Vi rology 52:546(1978)）によって元々記載され、そしてSambrookら（前出）の第1 6.32〜16.37節に記載されるように改変されたリン酸カルシウム法を用いて形質転換される。しかし、DNAを細胞に導入するための他の方法もまた使用され得る：例えば、ポリブレン（KawaiおよびNishizawa，Mol.Cell.Biol．4:1172(1984) ）、プロトプラスト融合（Schaffner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2163(1980) ）、エレクトロポレーション（Neumannら、EMBO J．1:841(1982)、および核への直接マイクロインジェクション(Capecchi，Cell 22:479(1980)。さらに、動物形質転換ストラテジーは、Monastersky G.M.およびRobl,J.M.，Strategies in Tra nsgenic Animal Science，ASM Press，Washington,D.C.(1995)に概説される。形質転換植物カルスは、選択マーカーを介して、例えば、カナマイシンおよび適切な量の植物ホルモン（例えば、カルスおよびシュート誘導のためナフタレン酢酸およびベンジルアデニン）を含む培地で細胞を増殖させることによって選択され得る。次いで、植物細胞が再生され得、そして得られる植物は、当業者に周知の技術を用いて土壌に移される。さらに、ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ産生またはディリジェントタンパク質産生を調節する遺伝子は、誘導可能な必要なプロモーターとともに植物に取り込まれ得る。本発明のこの実施態様の実施において、特定の外部または内部刺激のみに応答するプロモーターが、標的cDNAに融合される。従って、遺伝子は、特定の刺激に応答する以外には、転写されない。遺伝子が転写されない限りは、その遺伝子産物は産生されない。本発明の実施において使用され得る応答性プロモーター系の例示的な例は、トウモロコシにおけるグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）系である。GST は、発生前除草剤としてしばしば使用される多数の疎水性求電子化合物を解毒し得る酵素のファミリーである（Weigandら、Plant Molecular Biology 7:235-243 (1986)）。研究は、GSTが、この増強された除草剤耐性を生じることに直接関与することを示している。この作用は、主に、特定の1.1kb mRNA転写産物を通して媒介される。要約すれば、トウモロコシは、外部刺激に応答し得、そして遺伝子産物を産生するように誘導され得る、既に存在する天然に存在する静止遺伝子を有する。この遺伝子は、以前に同定およびクローニングされている。従って、本発明の１つの実施態様において、プロモーターは、GST応答遺伝子から取り出され、そして前もってその天然のプロモーターが除去されている、ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ遺伝子、またはディリジェントタンパク質遺伝子に付着される。この操作された遺伝子は、外部化学刺激に応答するプロモーターと、ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼまたはディリジェントタンパク質の首尾良い産生を担う遺伝子との組合せである。上記の方法に加えて、クローン化DNAを広範な種々の植物種（裸子植物、被子植物、単子葉植物、および双子葉植物を含む）に移入するためのいくつかの方法が、当該分野で公知である（例えば、GlickおよびThompson編、Methods in Plan t Molecular Biology，CRC Press，Boca Raton，Florida(1993)を参照のこと）。例示的な例としては、プロトプラストによるエレクトロポレーション促進性DN A取り込み（Rhodesら、Science 240(4849):204-207(1988)）：プロトプラストのポリエチレングリコールでの処理(Lyznikら、Plant Molecular Biology 13:151- 161(1989)）；および細胞のDNA荷積（laden）微粒子銃（Kleinら、Plant Physio l．91:440-444(1989)およびBoyntonら、Science 240(4858):1534-1538(1988)）の照射が挙げられる。多数の方法が、例えば、禾穀類の形質転換について現在存在する（例えば、McKinnon,G.E.およびHenry,R.J.，J.Cereal Science，22(3):2 03-210(1995)；Mendel,R.R.およびTeeri,T.H.，Plant and Microbial Biothechn ology Research Series，3:81-98，Cambridge University Press(1995)；McElro y,D.およびBrettell，R.I.S.，Trends in Biotechnology，12(2):62-68(1994)； Christouら、Trends in Biotechnology，10(7):239-246(1992)；Christou,P.およびFord,T.L.，Annals of Botany，75(5):449-454(1995)；Parkら、Plant Mole cular Biology，32(6):1135-1148(1996)；Altpeterら、Plant Cell Reports，1 6:12-17(1996)を参照のこと）。さらに、植物形質転換ストラテジーおよび技術は、Birch,R.G.，Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol 48:297(1997)；Forester ら、Exp.Agric．33:15-33(1997)に概説される。わずかな改変により、これらの技術が広範な植物種に適用可能である。これらの技術の各々は、利点と欠点を有する。各々の技術において、プラスミドからのDNAは、目的の遺伝子のみでなく、選択可能マーカー遺伝子およびスクリーニング可能マーカー遺伝子をも含むように遺伝子操作される。選択可能マーカー遺伝子は、プラスミドのコピーを取り込んでいるこれらの細胞のみを選択するのに使用される（目的の遺伝子および選択可能遺伝子およびスクリーニング可能遺伝子が、一単位として移入されるように構築される）。スクリーニング可能な遺伝子は、目的の遺伝子を有するこれらの細胞のみの首尾良い培養のための別のチェックを提供する。一般的に使用される選択可能マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（NPT II）である。この遺伝子は、カナマイシン（細胞が増殖する増殖培地に、直接添加され得る化合物）に対する耐性を伝達する。植物細胞は、通常、カナマイシンに感受性であり、そして結果として死亡する。NPT II遺伝子の存在は、カナマイシンの影響を克服し、そしてこの遺伝子を有する各々の細胞は、生存したままである。本発明の実施において使用され得る、別の選択可能マーカー遺伝子は、除草剤グルフォシネート（glufosinate ）（Basta）への耐性を付与する遺伝子である。一般的に使用されるスクリーニング可能な遺伝子は、βグルクロニダーゼ遺伝子（GUS）である。この遺伝子の存在は、組織化学反応（推定的に形質転換される細胞のサンプルが、GUSアッセイ溶液で処理される）を用いて特徴づけられる。適切なインキュベーションの後、GUS遺伝子を含む細胞は青色に変わる。好ましくは、プラスミドは、選択可能マーカー遺伝子およびスクリーニング可能マーカー遺伝子の両方を含む。これらの遺伝子の１つ以上を含むプラスミドは、植物プロトプラストまたはカルス細胞のいずれかに、以前に言及した技術のいずれかによって導入される。マーカー遺伝子が選択可能な遺伝子である場合、DNAパッケージを取り込んでいるこれらの細胞のみが、適切な植物毒素試薬での選択下で生存可能である。一旦、適切な細胞が同定されそして繁殖されると、植物は再生される。形質転換植物からの子孫は、DNAパッケージが植物ゲノムに首尾良く取り込まれていることを保証するために、試験されなければならない。哺乳動物宿主細胞もまた、本発明の実施において使用され得る。適切な哺乳動物細胞株の例としては、以下が挙げられる：SV40によって形質転換されたサル腎臓CVI株（COS-7、ATCC CRL 1651）；ヒト胎児性腎臓株293S（Grahamら、J.Gen.V iol.36:59(1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（BHK、ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（UrlabおよびChasin，Proc.Natl.Acad.Sci USA 77:4 216(1980)）；マウスsertoli細胞（TM4，Mather，Biol.Reprod．23:243(1980)）；サル腎臓細胞（CVI-76、ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO- 76、ATCC CRL-1587）；ヒト子宮頚ガン細胞（HELA、ATCC CCL 2）；コーニング腎臓細胞（MDCK、ATCC CCL 34）；バッファローラット肝臓細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138、ATCC CCL 75）；ヒト肝臓細胞（Hep G2、HB806 5）；マウス乳房腫瘍細胞（MMT 060562、ATCC CCL 51）；ラット肝臓ガン細胞（ HTC、MI.54、Baumanら、J.Cell Biol．85:1(1980)）；ならびにTRI細胞（Mather ら、Annals N.Y.Acad．Sci．383:44(1982)。これらの細胞についての発現ベクターは、本来（必要であれば）、複製起点、発現される遺伝子の前に位置するプロモーター、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結部位のDNA配列を含む。哺乳動物発現ベクターに使用されるプロモーターは、しばしば、ウイルス起源である。これらのウイルスプロモーターは、一般的には、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、および最も頻繁には、サルウイルス40（SV40）に由来する。 SV40ウイルスは、初期および後期プロモーターと称される２つのプロモーターを含む。これらのプロモーターは特に有用である。なぜなら、それらは両方、ウイルス複製起点も含む１つのDNAフラグメントとして、ウイルスから容易に得られるからである（Fiersら、Nature 273:113(1978)）。より小さなまたはより大きなSV40 DNAフラグメントもまた使用され得る。ただし、これらのフラグメントは、ウイルス複製起点に位置するBglI部位に向かうHindIII部位から伸張される約2 50bp配列を含む。あるいは、外来遺伝子と天然に会合するプロモーター（同種プロモーター）が使用され得る。ただし、これらのフラグメントは、形質転換のために選択される宿主細胞株と適合可能である。複製起点は、外因性供給源（例えば、SV40または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、VSV、BPV）から得られ得、そしてクローニングベクターに挿入され得る。あるいは、複製起点は、宿主細胞染色体複製機構によって提供され得る。外来遺伝子を含むベクターが、宿主細胞染色体に取り込まれる場合、後者はしばしば重要である。二次DNAコード配列の使用は、形質転換細胞株におけるピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼまたはディリジェントタンパク質の産生レベルを増強し得る。二次コード配列は、代表的には、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR ）を含む。DHFRの野生型形態は、通常、化学メトトレキセート（MTX）によって阻害される。細胞におけるDHFR発現のレベルは、培養宿主細胞に添加されるMTX の量に依存して変化する。二次配列として特に有用にするDHFRのさらなる特徴は、形質転換細胞を同定するための選択マーカーとして使用され得ることである。 DHFRの２つの形態は、二次配列、野生型DHFR、およびMTX耐性DHFRとしての使用に利用可能である。特定の宿主細胞に使用されるDHFRの型は、宿主細胞がDHFR欠損であるかどうかに依存する（その結果、内因的に非常に低いレベルのDHFRを産生するか、または全く機能的DHFRを産生しないかのいずれかである）。UrlaubおよびChasin（前出）によって記載されるCHO細胞株のようなDHFR欠損細胞株は、野生型DHFRコード配列で形質転換される。形質転換後、これらのDHFR欠損細胞株は、機能的DHFRを発現し、そして栄養性ヒポキサンチン、グリシン、およびチミジンを欠如する培養培地において増殖し得る。非形質転換細胞は、この培地において生存しない。 DHFRのMTX耐性形態は、MTX感受性である正常な量の機能的DHFRを内因的に産生するこれらの宿主細胞において形質転換宿主細胞についての選択手段として使用され得る。CHO-Kl細胞株（ATCC番号CL61）は、これらの特徴を所有し、従って、この目的のための有用な細胞株である。MTXの細胞培養培地への添加は、MTX耐性 DHFRをコードするDNAで形質転換したこれらの細胞のみを、増殖することを可能にする。非形質転換細胞は、この培地において生存し得ない。原核生物もまた、本発明の最初のクローニング工程のための宿主細胞として使用され得る。それらは、大量のDNAの迅速な産生のため、部位特異的変異誘発のために使用される一本鎖DNAテンプレートの産生のため、同時に多くの変異体をスクリーニングするため、および生成した変異体のDNA配列決定のために特に有用である。適切な原核生物宿主細胞としては、E.coli K12株294（ATCC番号31,44 6）、E.coli株W3110（ATCC番号27,325）、E.coli X1776（ATCC番号31,537）、およびE.coliBが挙げられる；しかし、E.coliの多くの他の株（例えば、HB101、JM 101、NM522、NM538、NM539）、ならびに桿菌（例えば、Bacillus subtilis）他の腸内細菌科（例えば、Salmonella typhimuriumまたはSerratia marcesans）、および種々のPseudomonas種を含む原核生物の多くの他の種および属は全て、宿主として使用され得る。原核生物宿主細胞または強固な細胞壁を有する他の宿主細胞は、好ましくは、Sambrookら（前出）のセクション1.82に記載されるような塩化カルシウム法を用いて形質転換される。あるいは、エレクトロポレーションが、これらの細胞の形質転換のために使用され得る。原核生物形質転換技術は、 Dower,W.J.，in Genetic Engineering，Principles and Methods，12:275-296， Plenum Publishing Corp.(1990)；Hanahanら、Meth.Enxymol，204:63(1991)に示される。代表的な例として、ディリジェントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードするcDNA配列は、異種宿主としてのE.coliにおける過剰発現のために、市販の（Novagenから）(His)₆・Tag pETベクターに移入され得る。このpET発現プラスミドは、高レベルの異種発現系におけるいくつかの利点を有する。所望のcDNAインサートは、インフレームで、６ヒスチジンをコードするプラスミドベクター配列に連結され、続いて標的タンパク質のアミノ末端コドンに結合される高度に特異的なプロテアーゼ認識部位（トロンビン）に連結される。発現される融合タンパク質のヒスチジン「ブロック」は、固定化金属イオンへの非常に強固な結合を促進し、そして固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーによる組換えタンパク質の迅速な精製を可能にする。次いで、ヒスチジンリーダー配列は、特異的なタンパク質分解部位で、精製タンパク質のトロンビンでの処理によって切断され、そしてディリジエントタンパク質またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼが溶出される。この過剰発現- 精製系は、高能力で優れた分解能を有し、迅速であり、そして（トロンビンタンパク質分解の前および後に）同様の結合挙動を示すE.coliタンパク質が夾雑する機会を極めて小さくする。当業者に明らかなように、宿主細胞に適合する種に由来するレプリコンおよび制御配列を含む任意のプラスミドベクターもまた、本発明の実施において使用され得る。ベクターは通常、複製部位、形質転換細胞における表現型選択を提供するマーカー遺伝子、１つ以上のプロモーター、および外来DNAの挿入のためのいくつかの認識部位を含むポリリンカー領域を有する。E.coliの形質転換のために代表的に使用されるプラスミドとしては、pBR322、pUC18、pUC19、pUCI18、pUC1 19、およびBluescript M13が挙げられ、これらは全て、Sambrookら（前出）の第 1.12〜1.20章に記載される。しかし、多くの他の適切なベクターも同様に利用可能である。これらのベクターは、アンピシリンおよび／またはテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子を含み、これは、これらのベクターで形質転換した細胞が、これらの抗生物質の存在下で増殖することを可能にする。原核生物ベクターに最も一般的に使用されるプロモーターは、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系(Changら、Nature 375:615 (1978)；Itakuraら、Science 198:1056(1977)；Goddelら、Nature 281:544(1979 )ならびにトリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddelら、Nucl.Acuds.Res. 8:4057(1980)；EPO Appl.Publ.No.36,776）、ならびにアルカリホスファターゼ系を含む。これらは最も一般的に使用されるが、他の微生物プロモーターが利用されており、そしてそれらのヌクレオチド配列を確認する詳細は刊行されており、当業者が、プラスミドベクターにそれらを機能的に連結することを可能にする（Siebenlistら、Cell 20:269(1980)を参照のこと）。細胞から通常分泌される多くの真核生物タンパク質は、アミノ酸配列の一部として、内因性分泌シグナル配列を含む。従って、細胞質に通常見いだされるタンパク質は、シグナル配列をタンパク質に連結することによって分泌のために標的化され得る。これは、シグナル配列をコードするDNAを、タンパク質をコードするDNAの5'末端に連結し、次いでこの融合タンパク質を適切な宿主細胞において発現することによって容易に達成される。シグナル配列をコードするDNAは、シグナル配列を有するタンパク質をコードする任意の遺伝子からの制限フラグメントとして得られ得る。従って、原核生物、酵母、および真核生物シグナル配列は、本発明を実施するのに利用される宿主細胞の型に依存して、本明細書中で使用され得る。いくつかの真核生物遺伝子のシグナル配列部分（例えば、ヒト成長ホルモン、プロインシュリン、およびプロアルブミンを含む）をコードするDNAおよびアミノ酸配列は公知であり（Stryer，Biochemistry W.H.Freeman and Compa ny，New York，NY，769頁(1988)を参照のこと）、そして適切な真核生物宿主細胞におけるシグナル配列として使用され得る。例えば、酸ホスファターゼ（Arim aら、Nucleic Acids Res．11:1657(1983)）、α因子、アルカリホスファターゼ、およびインベルターゼのような酵母シグナル配列は、酵母宿主細胞からの分泌を指向するために使用され得る。例えば、LamBもしくはOmpF（Wongら、Gene 68: 193(1988)）、MalE、PhoA、またはβラクタマーゼをコードする遺伝子ならびに他の遺伝子からの原核生物シグナル配列は、原核生物細胞からのタンパク質を培養培地に標的するために使用され得る。植物、動物、および微生物からの輸送配列は、本発明の実施において、遺伝子産物を、細胞質、小胞体、ミトコンドリア、もしくは他の細胞成分に指向するため、または培地への搬出のためにタンパク質を標的するために使用され得る。これらの考察は、ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼまたはディリジエントタンパク質の過剰発現、および任意の所望の位置における遺伝子産物の機能を可能にするための細胞またはインタクトな生物内での発現の指向に適用される。目的の複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子をコードするDNA、およびディリジェントタンパク質DNAまたはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼDNAを含む適切なベクターの構築物は、標準的な組換えDNA手順を用いて調製される。単離されたプラスミドおよびDNAフラグメントは、当該分野で周知のように（例えば、Sambrookら（前出）を参照のこと）、切断され、仕立てられ、そして所望のベクターを作製するために特定の順序で一緒に連結される。上記で議論したように、ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ改変体またはディリジェントタンパク質改変体は、好ましくは、部位特異的変異誘発の方法を用いて作製される変異（単数または複数）によって産生される。この方法は、オリゴヌクレオチドがDNAテンプレートに安定にハイブリダイズすることを可能にするために、所望の変異の配列および十分な数の隣接ヌクレオチドの両方をコードする特定のオリゴヌクレオチドの合成および使用が必要である。ディリジェントタンパク質遺伝子および／またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ遺伝子、あるいはディリジェントタンパク質遺伝子またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ遺伝子の全てまたは一部に相補的なアンチセンス核酸フラグメントは、適切な場合には、種々の目的のための任意の植物種に導入され得、この目的には以下が含まれるがこれらに限定されない：木組織（特に心材組織）の色、手触り、耐久性、および害虫耐性を改変または改善すること；トウモロコシ（これは、動物飼料として有用である）のような植物種におけるリグナンおよび／またはリグニンの形成を低減し、それにより植物材料を摂取する動物の消化系への植物材料のセルロース画分の利用可能性を増強すること；パルプおよび紙産生において利用される食物種のリグナン／リグニン含有量を低減し、それにより、より容易および安価にパルプおよび紙を産生すること；捕食動物および病原体に対する植物の防御能力を、防御的リグナンまたはリグニンの産生を増強することによって改善すること；リグナンまたはリグニンによって媒介される他の生態学的相互作用の改変；医薬または植物添加剤として、上昇したレベルの光学的に純粋なリグナン鏡像異性体を産生すること；ディリジェントタンパク質および/またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの産生、あるいはピノレシノールまたはラリシレシノールおよびそれらの誘導体の産生を誘導するか、増強するか、または阻害すること。ディリジェントタンパク質および／またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ遺伝子は、種々の目的のために任意の生物に導入され得、この目的は以下を含むがこれらに限定されない；ディリジェントタンパク質および/またはピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの産生、あるいはピノレシノールまたはラリシレシノールおよびそれらの誘導体の産生を誘導するか、増強するか、または阻害すること。前述は、以下の例示的な実施例と組み合わせてより完全に理解され得、ここで「プラスミド」は、英小文字ｐ、続く英数字によって示される。本発明において使用される開始プラスミドは、市販されるか、無制限の基準に基づいて公に入手可能であるか、または公開された手順を用いてこのような入手可能なプラスミドから構築され得る。さらに、他の等価なプラスミドは当該分野で公知であり、そして当業者には明らかである。 DNAの「消化」、「裁断」、または「切断」は、DNAにおける特定の位置でのみ作用する酵素での、DNAの触媒切断をいう。これらの酵素は、制限エンドヌクレアーゼと称され、そして各酵素が切断するDNA配列に沿った部位は、制限部位と称される。本発明において使用される制限酵素は市販され、そして製造業者によって提供される説明書に従って使用される。（Sambrookら(前述)の第1.60〜1.61 章および第3.38〜3.39章もまた参照のこと）制限消化物からのDNAの所定のフラグメントの「回収」または「単離」は、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上での得られたDNAフラグメントの電気泳動による分離、その移動度対公知の分子量のマーカーDNAフラグメントの比較による目的のフラグメントの同定、所望のフラグメントを含むゲル区画の除去、およびゲルのDNAからの分離を意味する。この手順は一般的に公知である。例えば、Lawnら（Nucleic Acids Res．9:6103-6114(1982)）、およびGoeddelら( Nucleic Acids Res.，(前出)）を参照のこと。以下の実施例は、本発明を実施するために現在意図される最良の態様を単に例示するに過ぎないが、本発明を制限すると解釈されるべきではない。本明細書中に引用される全ての文献は、参考として明白に援用される。実施例１ディリジェントタンパク質のForsythia intermediaからの精製植物材料。Forsythia intermedia植物は、Bailey's Nuesery（var．Lynwood G old，St.,Paul，MN）から入手して、ワシントン州立大学温室施設において維持するか、または地域団体からの贈られたかのいずれかであった。最初の抽出および硫酸アンモニウム沈殿。結合タンパク質の可溶化を、４℃で行った。冷凍Forsythia intermedia茎（２kg）を、液体窒素の存在下で、warrin g Blendor（Model CB6）において微粉砕した。得られる粉末を、５mMジチオスレイトールを含む0.1M KH₂PO₄-K₂HPO₄緩衝液（pH7.0、４リットル）で均一化し、そして４層のチーズクロスを通して濾過した。不溶性残留物を、250rpmの連続撹拌で、以下のように連続して抽出した：冷却（-20℃）再蒸留アセトン（４リットル、３×30分）；0.1%βメルカプトエタノールを含む0.1M KH₂PO₄-K₂HPO₄緩衝液（pH6.5）（溶液Ａ、８リットル、30分）；１％Triton X100を含む溶液Ａ（８リットル、４時間）および最終的に溶液Ａ（８リットル、16時間）。各抽出の間、残留物を、１層のMiracloth（Calbiochem）を通して濾過した。(+)-ピノレシノール形成系の可溶化を、１M NaClを含有する溶液Ａにおいて残留物を機械的に撹拌することによって達成した。ホモジネートをデカントし、そして得られる溶液を、Miracloth（Calbiochem）およびガラス繊維（G6、Fisher Sci.）を通して連続して濾過した。濾過物を、Amiconセル（Model 2000、YM30膜）において、最終用量約800mlまで濃縮し、そして(NH₄)₂SO₄分画に供した。40〜80％飽和のタンパク質沈殿を、遠心分離（15,000g、30分）によって回収し、そして(NH₄)₂SO₄ペレットを、必要とされるまで-20度にて保存した。 Mono Sカラムクロマトグラフィー。78kDディリジェントタンパク質の精製およびオキシダーゼの部分精製。硫安ペレット（２kgのF intermedia茎から得た）を、６M NaOHでpH5.0に調整した40mM MES（2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸）緩衝液（溶液Ｂ、30ml）で再構築し、スラリーを遠心分離し（3,600g、５分）、そして上清を溶液Ｂ（４リットル）で一晩透析した。透析抽出物を濾過し（0.22 、μm）、そしてサンプル（35〜40mgタンパク質）を、４℃にて溶液Ｂで平衡化したMono S HR5/5（50mm×５mm）カラムにアプライした。溶液Ｂ（13ml）で溶出（流速５ml min^-1cm^-2）した後、タンパク質を、溶液Ｂ中の以下のNa₂SO₄で脱着した：８mlでの０〜100mMの直線勾配を用い、そしてこの濃度で32m維持し、次いで133mMを50ml、166mMを50ml、200mMを40ml、233mMを40ml、そして最終的に333m M Na₂SO₄を40mlでの一連のステップ勾配を実行する。E-コニフェリルアルコールから(+)-ピノレシノールを形成し得る画分を、333mM Na₂SO₄で溶出し、合わせて、必要なときまで保存した（-80℃）。 POROS SP-Mマトリックスカラムクロマトグラフィー（第１カラム）。Mono S H R5/5カラム（33mM Na₂SO₄）からの15の個々の溶出物からの画分を合わせ（18.5m gタンパク質、180ml）、そして溶液Ｃに対して一晩透析した。透析した酵素溶液（190ml）を濾過し（0.22μm）、そしてアリコート（47ml）を、POROS SP-Mカラムにアプライした。予め25mM MES-HEPES-酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0，溶液Ｃ) で平衡化したPOROS SP-Mマトリックス（100mm×4.6mm）での全ての分離を、60ml min^-1cm^-2の流速および室温にて行った。溶液Ｃ（12ml）での溶出後、タンパク質を溶液Ｃにおける直線Na₂SO₄勾配（66.5ml中０から0.7M）で脱着し、ここで確立した濃度を、さらなる16.6mlについて保持した。これらの条件下で、別々の４つの画分（I、II、III、およびIV）を、それぞれ、約40、47、55、および61mSで達成した。この精製工程を、残留透析酵素抽出物で３回繰り返し、そして各実験からの画分I、II、III、およびIVを別々に合わせた。プロテアーゼインヒビター（すなわち、フェニルメタンスルホニルフルオリド（0.1mmol ml^-1）、EDTA（0. 5nmol ml^-1）、ペプスタチンＡ（１μg ml^-1）、およびアンチペイン（１μgml^- ¹ ））を、可溶化および全ての続く精製段階の間に添加した場合、画分I、II、II I、およびIVの溶出プロフィールにおいて相違は観察されなかった。 POROS SP-Mマトリックスカラムクロマトグラフィー（第２カラム）。第１PORO S SP-Mマトリックスカラムクロマトグラフィー工程からの画分I（2.62mgタンパク質、40ml、約24.6mS）を、濾過した冷蒸留水において、約８mSの伝導率を達成するまで希釈した（最終容量＝150ml）。次いで、希釈したタンパク質溶液を、P OROS SP-Mカラム（100mm×4.6mm）にアプライした。溶液Ｃ（12ml）での溶出後、画分Iを、20ml中０〜0.25Mの直線Na₂SO₄勾配で脱着し、ここで確立した濃度を、さらに25mlについて保持した。これに続いて、26ml中0.25〜0.7Mの直線Na₂SO₄ 勾配で行い、次いでさらなる16.6mlについて0.7Mで維持した。約30mSで溶出した画分（溶出物のイオン強度を、貫流検出器で測定した）を合わせ（15ml、1.3mg ）、水で希釈し、そして再クロマトグラフした。得られるタンパタ質（上記の勾配で約30mSで溶出した）を、必要なときまで保存した（-80℃）。ゲル濾過。画分Iからのアリコート（595.5μgタンパク質、３ml、約30mSで溶出）を、0.6mlまで濃縮し（Centricon 10,Amicon）、そして４℃にて50mM Na₂SO₄ を含む0.1M MES-HEPES-酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）で平衡化したS200（73. 2cm×1.6cm、Pharmacia-LKB）ゲルクロマトグラフィーカラムにロードした。見かけ上均一な78kDディリジェントタンパク質（242μg）を、133mlでの単一の成分として溶出した（流速0.25ml min^-1cm^-2）（Vo＝105ml）。分子量を、それらの溶出プロフィールの以下の標準タンパク質との比較によって見積もった：βアミラーゼ（200,000）、アルコールデヒドロゲナーゼ（150,000）、ウシ血清アルブミン（66,000）、オボアルブミン（45,000）、炭酸脱水素酵素（29,000）、およびシトクロムＣ（12,400）。実施例２精製ディリジェントタンパク質の特徴付け分子量および等電点決定。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を、Laem mliの緩衝液系において、勾配（４〜15%アクリルアミド、Bio-Rad）ゲルで、変性および還元条件下で行った。タンパク質を、銀染色によって可視化した。画分 Iのゲル濾過（S200）クロマトグラフィーは、天然の分子量約78kDのタンパク質を与え、一方SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、約27kDの一本のバンドを示し、これは、天然のタンパク質が三量体として存在することを示唆する。ポリアクリルアミドゲルにおける天然のタンパク質の等電点電気泳動（pH３〜10勾配）は、６つのバンドの存在を明らかにした。等電点電気泳動後、これらのバンドの各々を、ポリビニリデンフルオリド（PVDF）膜に電気ブロットし、そしてアミノ末端配列決定に供した。これは、全てが一連のアイソフォームを示す類似の配列を有したことを確証した。タンパク質の紫外光-可視光スペクトルは、約330nm でのわずかに認識できるショルダーとともに、280nmでの特徴的なタンパク質吸収のみを有した。誘導結合型プラズマ（ICP）分析は、タンパク質に存在する金属を全く示さなかった。従って、78kDディリジェントタンパク質は、任意の検出可能な触媒活性酸化中心を欠如する。 E-コニフェリルアルコールから(+)-ピノレシノールを形成する精製ディリジェントタンパク質の能力のアッセイ。第１POROS SP-Mカラムクロマトグラフィー工程（実施例１）からの４つの画分（I〜IV）を、別々に再クロマトグラフィーし、各画分を、続いて、基質としてのE-[9-³H]コニフェリルアルコールとの(+)-ピノレシノール形成活性について１時間アッセイした。画分I（ディリジェントタンパク質を含む）は、非常にわずかな(+)-ピノレシノール形成活性（POROS SP-Mカラムにロードした全活性の＜５％）を有し、一方、画分IIIは、非特異的酸化カップリングを触媒して(±)-デヒドロジコニフェリルアルコール、(±)-ピノレシノール、および(±)-エリスロ／スレオグアヤシルグリセロール8-o-4'-コニフェリルアルコールエーテルを生じた。従って、画分IIIは、内因性植物酸素添加タンパク質を含むようである。推定オキシダーゼ調製物（画分III）を、電気泳動的に均質まで精製していないが、このタンパク質調製物の電子常磁性共鳴（EPR）スペクトルは、代表的な植物ラッカーゼ（すなわち、天然に存在する植物オキシゲナーゼタンパク質のクラス）のスペクトルと類似した。次いで、本発明者らは、オキシダーゼ（画分II I）、78kDのディリジェント（dirigent）タンパク質（画分I）のそれぞれ、および画分IIIと78kDタンパク質の両方の存在下で、E-[9-³H]コニフェリルアルコール（２μmol ml^-1、14.7kBq）の最終結果を研究した。画分III調製物単独では、非特異的二分子ラジカルカップリングのみが生じて、(±)-デヒドロジコニフェリルアルコール、(±)-ピノレシノール、および(±)-エリスロ／スレオグアヤシルグリセロール8-o-4'-コニフェリルアルコールエーテルを生じた。しかし、78k Dタンパク質自身では、少量の(+)-ピノレシノール形成（10時間にわたって＜５％）が観察され、これは、調製物における酸化能力の残留追跡から生じると推定された。画分IIIと78kDタンパク質の両方を合わせた場合、産物中の完全な触媒活性ならびに位置特異性および立体特異性が回復され、それにより本質的に(+)- ピノレシノールのみが形成される。さらに、画分III単独で、そして画分IIIを78 kDタンパク質と合わせた場合、基質消費（depletion）および二量体産物形成の速度は、ほぼ同一であった。さらに、オキシダーゼの存在下のいずれの場合においても、試験した時間（８時間）を通じて、二量体リグナン産物は本質的に代謝代謝回転しなかった：続く二量体酸化は、E-コニフェリルアルコール（好ましい基質）がアッセイ混合物に存在したままの場合、生じない。それゆえ、78kDタンパク質は、二分子フェノキシラジカルカップリング反応の特異性を決定するようである。ゲル濾過研究もまた、任意の検出可能なタンパク質-タンパク質相互作用が、立体選択性について説明し得るかどうかを確証するために、ディリジェントと画分IIIタンパク質の混合物で行った。しかし、複合体形成を指示する証拠（すなわち、より高分子のサイズ体）は、観察されなかった。実施例３ 78kD ディリジェントタンパク質の植物ラッカーゼ触媒性モノリグノールカップリングにおける効果 E-コニフェリルアルコールカップリングアッセイ。E-[9-³H]コニフェリルアルコール（４μmol ml^-1、29.3kBq）を、120kDラッカーゼ（Forsythia intermedia 茎組織から以前に精製した）とともに、24時間にわたって、ディリジェントタンパク質の存在および非存在下で、以下のようにインキュベートした。各アッセイは、全容量250μlの緩衝液（0.1M MES-HEPES-酢酸ナトリウム、pH5.0）中、E-[9 -³H]コニフェリルアルコール（４μmol ml^-1、29.3kBq、7.3Mbq mole litele^-1 ；または画分IIIとともに２μmol ml^-1、14.7kBq）、78kDディリジェントタンパク質、オキシダーゼまたは酸化剤、あるいは両方（最終濃度：770pmpl ml^-1ディリジェントタンパク質；10.7pmolタンパク質ml^-1 Forsythiaラッカーゼ；12μg タンパク質ml^-1画分III；0.5μmolml^-1 FMN；0.5μmol ml^-1 FAD；１および10μ mol ml^-1過酸化二硫酸アンモニウム）。酵素反応を、E-[9-³H]コニフェリルアルコールの添加によって開始した。コントロールを、緩衝液のみの存在下で行った。 30℃にて振盪しながら１時間のインキュベーションの後、アッセイ混合物を、放射化学キャリアとして、(±)-ピノレシノール（7.5μg）、(±)-デヒドロジコニフェリルアルコール（3.5μg）、および(±)-エリスロ／スレオグアヤシルグリセロール8-O-4'-コニフェリルアルコールエステル（7.5μg）、ならびに内部標準としてフェルラ酸（15.0μg）を含む酢酸エチル（EtOAc、500μl）で抽出した。遠心分離（13,800g、５分）後、EtOAc可溶性成分を取り出し、そして抽出手順を、EtOAc（500μl）で反復した。各アッセイからのEtOAc可溶性成分を合わせ、溶液を真空下で吸引して乾燥し、そのアリコート（50μl）とともにメタノール- 水溶液（1:1、100μl）に再溶解し、逆相カラムクロマトグラフィー（Waters，N ova-Pak C₁₈，150mm×3.8mm）に供した。溶出条件は以下：アセトニトリル/H₂O 中３％酢酸（5:95）で０〜５分、次いで10:90の比の直線勾配で５分と20分との間、ついで20:80で20分と45分との間で、および最後に50:50で45〜60分で、流速 8.8ml min^-1cm^-2であった。 E-コニフェリルアルコール、(±)-エリスロ／スレオグアヤシルグリセロール8 -o-4'-コニフェリルアルコールエーテル、(±)-デヒドロジコニフェリルアルコール、および(±)-ピノレシノール、に対応する画分を、別々に回収し、アリコートを液体シンチレーションカウンティングのために除去し、そして残りを凍結乾燥した。ピノレシノール含有画分を、メタノール（100μl）に再溶解し、そして移動相としてヘキサンとエタノール（1:1）の溶液を有するキラルカラムクロマトグラフィー（Daicel，Chiralcel OD，50mm×4.6mm）に供し（流速３ml min^- ¹ cm^-2）、一方、デヒドロジコニフェリルアルコール画分を、Chiralcel OF（25 0mm×4.6mm）カラムクロマトグラフィーに供して、移動相としてヘキサンとイソプロパノール（9:1）の溶液で溶出（流速2.4ml min^-1 cm^-2）し、溶出物の放射活性を、フロースルー検出器（Radiomatic，Model Al20）で測定した。 E-コニフエリルアルコールカップリングアッセイの結果。ラッカーゼ里独でのインキュベーションは、優勢な(±)-デヒドロジコニフェリルを有する、ラセミ二量体産物のみを生じた。しかし、ディリジェントタンパク質の存在下で、ラッカーゼのみが存在する場合に観察される非特異性とは異なり、このプロセスは、今や、(+)-ピノレシノールを産生する一次立体選択性であった。両方のE-コニフェリルアルコール（基質）減損の速度および二量体リグナンの形成は、ディリジェントタンパク質を伴っても伴わなくても類似であった。実質的な差異は、E-コニフェリルアルコール減損後に観察されるリグナン産物の続く代謝回転にみられた。ラッカーゼ単独では代謝回転を生じないが、両方のタンパク質が存在した場合、産物の消失は顕著であった。差異を理解する目的で、ディリジェントタンパク質の重量濃度と一致したレベルのウシ血清アルブミン（BSA）およびオボアルブミンを、ラッカーゼ含有溶液に別々に添加するアッセイを行った。この方法において、産物代謝回転の差異は、高度なタンパク質濃度でのラッカーゼ活性の安定化に単純に起因することが確証されたが、興味深いことに、ディリジェントタンパク質、BSA、およびオボアルブミンは、いくらか異なる程度の保護を有した。この知見は、真菌ラッカーゼ（Trametes versicolor由来）を植物ラッカーゼのかわりに使用した場合に、非常に匹敵した。酸化力（すなわち、ラッカーゼ濃度）が５倍低い場合、(+)-ピノレシノールのみを観察した。従って、完全な立体選択性は、酸化力が、ディリジェントタンパク質が飽和する点を超えない場合に保存される。立体選択的E-コニフェリルアルコールカップリング。アッセイをまた、E-[9-² H₂,OC²H₃]コニフェリルアルコールおよびディリジェントタンパク質で、ラッカーゼの存在下で以下のように行った。E-[9-²H₂,OC²H₃]コニフェリルアルコール（２μmol ml^-1）を、全容量250μl中、ディリジェントタンパク質（770pmol ml^-1 ）、精製植物ラッカーゼ（4.1pmol ml^-1）、および緩衝液（0.1M MES-HEPES- 酢酸ナトリウム、pH5.0）の存在下でインキュベートした。１時間のインキュベーションの後、反応混合物をEtOAcで、しかし、内部標準および放射性化学キャリアの添加は省いて抽出した。逆相カラムクロマトグラフィーの後、酵素的に形成したピノレシノールを回収し、凍結乾燥し、メタノール（100μl）中に再溶解し、そしてキラルカラムクロマトグラフィー（Daicel，Chiralcel OD，50mm×4. 6mm）に供して、280nmで検出し、そしてEIモードにおいて質量分析フラグメント化によつて分析した（Waters，Integrity System）。得られた(+)-ピノレシノール（＞99％鏡像異性体過剰）の液体クロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）分析は、荷電比(m/z)368に対する質量を有する分子イオンを生じ、従って、10の²H原子の存在を確立すること、ならびにE-[9-²H₂,OC²H₃]コニフェリルアルコールの立体選択的カップリングに触媒されるラッカーゼおよびディリジェントタンパク質とともに証明された。他の補助（auxiliary）１電子酸化剤もまた、ディリジェントタンパク質との立体選択的カップリングを容易にし得る。過酸化二硫酸アンモニウムは、等方性分化を容易に行い（A.Usaitis，R.Makusuka，Polymer 35:4896(1994)）、そしてアクリルアミドポリマー化における１電子酸化剤として日常的に使用される。過酸化二硫酸アンモニウムを、最初に、E-[9-³H]コニフェリルアルコール（４μmo l ml^-1、29.3kBq）とともに、６時間、上記のE-コニフェリルアルコールカップリングアッセイ手順を用いてインキュベートした。非特異的二分子ラジカルカップリングが観察され、優性な(±)-デヒドロジコニフェリルアルコール、および他のラセミリグナンを得た（表１）。しかし、ディリジェントタンパク質を添加した場合、カップリングの立体選択性は劇的に変化して、両濃度の酸化剤で、少量のラセミリグナンとともに第一の(+)-ピノレシノールを生じた。これは、無機酸化剤（例えば、過酸化二硫酸アンモニウム）が、たとえ画分IIIオキシダーゼまたはラッカーゼと同様にモノリグノールに対して選択的に酸化性でなくても、ディリジェントタンパク質の存在下で(+)-ピノレシノール合成を促進し得ることを確証した。 E-コニフェリルアルコールの(+)-ピノレシノールへの立体特異的変換における他の酸素添加剤の効果。E-コニフェリルアルコール（４μmol ml^-1，29.3kBq）の、フラビンモノヌクレオチド（FMN）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）とのインキュベーションの効果を調査した。なぜなら、酵素補因子としてのそれらの役割に加えて、それらはまた、種々の有機基質を酸化し得るからである（T.C.Brulce，Acc.Chem.Res.13:256(1980)）。E-[9-³H]コニフェリルアルコールを、それぞれFMNおよびFADとともに、48時間インキュベートした。FMNを得るために、ヘビ（Naja naja atra，Formosanコブラ）毒をFADの溶液（H₂O中５ μmol ml^-1）に添加し、そして30℃にて30分間のインキュベーションの後、酵素的に形成したFMNを、Centricon 10（Amicon）マイクロコンセントレーターを通してフィルターによって、タンパク質混合物から分離した。どの場合も、E-コニフェリルアルコール酸化は、FADよりもFMNの存在下でより迅速であった。FMNとF ADとの間のE-コニフェリルアルコール酸化の触媒速度のこれらの差異は予測されなかったが、一致したパターンが確認された：以前のように優性である(±)-デヒドロジコニフェリルアルコールとともにラセミリグナン産物を得た。ディリジェントタンパク質の存在下で経時変化を反復した場合、本質的に(+)-ピノレシノール形成のみを生じる、立体選択性における劇的な変化が観察された。再び、E- コニフェリルアルコール消費速度は、ディリジェントタンパク質調製物における微量な残留酸化力（10時間にわたって＜５％）のために調整した場合、形成した二量体の総量として、[FMN]および[FAD]にのみ依存した。E-コニフェリルアルコールが全て消費される場合、対応するリグナン二量体は、時間の関数として酸化的変化し始め得る；特に、E-コニフェリルアルコールが全て消費された後、オープン溶液において、FMNは続いてピノレシノールを酸化し得る。基質特異的立体選択性の調査。カップリング立体選択性は基質特異性であった。E-p−[9-³H]クマリル（４μmol ml^-1，44.5kBq）またはE-[8-¹⁴C]シナピル（s inapyl）アルコール（４μmol ml^-1，8.3kBq）（これらは、芳香環のメトキシ基置換体によってのみE-コニフェリルアルコールと異なる）は、ディリジェントタンパク質の存在または非存在下で、それぞれFMNおよび過酸化二硫酸アンモニウムとともに６時間インキュベートした場合、立体選択的産物を生じた。インキュベーションを、以下の改変を伴って、上記のように行った：E-p-[9-³H]クマリル（４ μmol ml^-1，44.5kBq）またはE-[8-¹⁴C]シナピルアルコール（４μmol ml^-1，8. 3kBq）を基質として使用し、そして30℃にて６時間のインキュベーションの後、反応混合物を、放射化学的キャリアの添加なしに、EtOAcで抽出した。E-シナピルアルコールは、容易にカップリングされて、シリンガレジノールを産出したが、キラルHPLC分析により、得られる産物が、どの場合においてもラセミであることが明らかになった（表２）。興味深いことに、それ自体により、78kDディリジェントタンパク質調製物は、低レベルの二量体形成を触媒した（以前に記載）が、ラセミ(±)-シリンガレジノール形成のみを生じた。これはおそらく、タンパク質調製物中に存在する微量な夾雑した残留酸化力の結果である。類似の様式において、立体選択的カップリングは、E-p-クマリルアルコールを基質として用いては観察されなかった。すなわち、E-コニフェリルアルコールのみが、ディリジェントタンパク質の存在下で、立体選択的カップリングを受ける。将来、ディリジェントタンパク質のE-コニフェリルアルコールについての与えられた顕著な基質特異性がEucommia ulmoidesにおいて(+)-シリンガレジノールを与える基質特異性とどのように異なるか、を決定することが非常に興味深い（ T.Deyama，Chem.Pharm.Bull．31,2993（1983））。本発明者らは、立体選択的カップリングの任意の特定の機構に束縛されることを意図しないが、３つの別々の可能性が考えられ得る。最もありそうなのは、オキシダーゼまたは酸化剤が、E-コニフェリルアルコールからフリーラジカル種を作製すること、および後者が、カップリングの前にディリジェントタンパク質に結合する真の基質であるということである。他の２つの可能性は、E-コニフェリル分子がディリジェントタンパク質に結合および配向し、それにより、(+)-ピノレシノール形成のみが、続く酸化カップリングにおいて生じることを確認することを必要とする：これは、両方の基質フェノールヒドロキシル基が暴露され、その結果それらが、オキシダーゼまたは酸化剤によって容易に酸化され得る場合、または、電子転移機構が、オキシダーゼまたは酸化剤とディリジェントタンパク質の電子受容部位との間で作動性である場合、生じ得る。３つの別々の機構の間で、３つの系統の証拠は、ディリジェントタンパク質によるフェノキシラジカル中間体の「捕捉」を示唆する。第１に、基質消費および産物形成の両方の速度は、ディリジェントタンパク質の存在によって、あまり影響されない。フリーラジカル中間体の捕捉が作動可能な機構である場合、ディリジェントタンパク質は、コニフェリルアルコールの単一電子の酸化が速度決定性である場合、カップリング特異性に影響を及ぼすのみである。第２に、電子転移機構は現在除外される。なぜなら、本発明者らは、補助オキシダーゼまたは酸化剤の存在または非存在下のいずれにおいても、酸化条件下で、新規な紫外-可視発色団を観察しなかったからである。第３に、一次速度論データは（実施例４に議論するように）、E-コニフェリルアルコールの(+)-ピノレシノールへの変換を、ディリジェントタンパク質単独で、および種々のオキシダーゼまたは酸化剤の存在下で特徴づける、ミカエリス定数（K_m）および最大速度（V_max）の公式値に基づくフリーラジカル捕捉の概念を指示する。実施例４ディリジェントタンパク質および酸素添加剤の存在下における E- コニフェリルアルコールの(+)-ピノレシノールへの変換の速度論的特徴付けアッセイを、実施例３に記載のように、一連のE-[9-³H]コニフェリルアルコール濃度（8.00と0.13μmol ml^-1との間、7.3MBq mole liter^-1）を、ディリジェントタンパク質（770pmol ml^-1）単独で、そしてForsythiaラッカーゼ（2.1pmol ml^-1）、画分III（12μgタンパク質ml^-1）、またはFMN（0.5μmol ml^-1）の存在下でインキュベートすることによって行った。ディリジェントタンパク質を有するアッセイを、FMNの存在または非存在下において、30℃にて１時間インキュベートし、一方、ディリジエントタンパク質の存在または非存在下におけるFors ythiaラッカーゼまたは画分IIIでのアッセイを、30℃にて15分間インキュベートした。ディリジェントタンパク質によるフリーラジカルの捕捉が作動可能な機構である場合、得られるミカエリス-メンテンパラメーターは、真の値とは異なる公式値を示すのみである。なぜなら、E-コニフェリルアルコールの(+)-ピノレシノールへの変換の間の最も高いフリーエネルギー中間体状態は未だ未知であり、そして基質の濃度とオープン溶液中の対応する中間体フリーラジカルの濃度との間の関係は、描述されていないからである。これらの条件を考慮して、本発明者らは、ディリジェントタンパク質調製物についての公式のK_mおよびV_max値を評価した。初めに記したように、E-コニフェリルアルコールからの(+)-ピノレシノールおよびE-シナピルアルコールからのラセミ(±)-シリンガレジノールの両方の低レベルの形成を生じ得る。なぜ詑、夾雑する酸化能力の追跡のためである。この調製とともに（表３）、10±６mMの公式 K_mおよび0.02±0.02mol s^-1 mol^-1のV_maxを得た。しかし、画分III、ラッカーゼ、およびFMNの添加とともに、公式K_m値（mM）は、それぞれ、1.6±0.3、0.100± 0.003、および0.10±0.01に減少し、一方V_max値は、補助オキシダーゼ／酸化剤のこれらの濃度で、はるかに低く影響された。公式K_mおよびV_max値を、３つのラセミリグナンへのE-コニフェリルアルコール変換の点から、ラッカーゼおよび画分IIIオキシダーゼについて計算した。しかし、78kDタンパク質への直接的比較はなし得ない。なぜなら、公式K_m値は、対応するオキシダーゼにのみ関与するからである。完全性のために、K_m（mM）および V_max（mol s^-1 mol^-1酵素）は以下のようであった：ラッカーゼに関して、(±)- エリスロ／スレオグアヤシルグリセロール8-o-4'-コニフェリルアルコールエステルについて、0.200±0.001および3.9±0.2、(±)-デヒドロジコニフェリルアルコールについて、0.3000±0.0003および13.l±0.6、ならびに(±)-ピノレシノールについて、0.300±0.002および7.54±0.50；画分IIIオキシダーゼ（80kDaの天然の分子量を有することが確証された）に関して、(±)-エリスロ／スレオグアヤシルグリセロール8-o-4'-コニフェリルアルコールエステルについて、2.2± 0.3および0.20±0.03、(±)-デヒドロジコニフェリルアルコールについて、2.2 ±0.2および0.7±0.1、ならびに(±)-ピノレシノールについて、3.7±0.7および 0.6±0.1。これらの一次速度論パラメーターは、ディリジェントタンパク質が、画分III 、ラッカーゼ、およびFMNの存在下でE-コニフェリルアルコール消費速度に実質的に影響を及ぼさないという発見と調和する。両セットの結果は、ディリジェントタンパク質が、フリーラジカル中間体を捕捉することによって機能し、次いで立体選択性カップリングを受けるという作用仮説にともに従う。実施例５ Forsythia intermedia 由来のディリジェントタンパク質cDNAのクローニング植物材料‐Forsythia intermedia植物を、Bailey's Nursery（var.Lynwood Go rd，St.,Paul，MN）から入手し、そしてワシントン州立大学温室において施設維持するか、または地方群落からの寄贈であったかのいずれかであった。材料‐使用したすべての溶媒および化学物質は、試薬またはHPLCグレードであった。Taq熱安定性DNAポリメラーゼをPromegaから入手し、一方、制限酵素を、G ibco BRL（HaeIII）、Boehringer Mannheim（Sau3a）、およびPromega（TaqI）から入手した。pT7BlueＴベクターおよびコンピテントNovaBlue細胞をNovagenから購入し、そして放射標識ヌクレオチド（[α-³²P]dCTP）をDuPont NENから購入した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および配列決定のためのオリゴヌクレオチドプット（BIO 101 Inc.）を、1.5％アガロースゲルにおける低DNA質量ラダー（Gibc o BRL）と比較することによって決定したゲル精製DNA濃度で、PCRフラグメントの精製のために使用した。装置‐UV（OD₂₆₀でのRNAおよびDNA決定を含む）スペクトルを、Lamda６UV/VIS 分光光度計で記録した。Temptronic IIサーモサイクラー（Thermolyne）を、すべてのPCR増幅のために使用した。配列決定のためのDNAの精製は、QIAwell Plus プラスミド精製システム（QIAGEN）を使用し、続いてPEG沈降を行い（Sambrook ，J.，Fritsch,E.F.,およびMniatis,T．(1994)Molecular Cloning：A Laborator y Manual,第３巻、第３版、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harb or，NY）、DNA配列を、Applied Biosystems Model 373A自動配列決定機を用いて決定した。アミノ酸配列を、オンラインHPLC検出を備えたApplied Biosystemsタンパク質配列決定機を用いて、製造業者の説明書に従って得た。ディリジェントタンパク質アミノ酸配列決定‐ディリジェントタンパク質N-末端アミノ酸配列（配列番号１）を、オンラインHPLC検出を備えたApplied Biosys temsタンパク質配列決定機を用いて、精製タンパク質から得た。トリプシン消化のために、精製酵素（150pmol）を、0.1M Tris-HCl（50μl、pH8.5、Boehringer Mannheim、配列決定グレード）中に懸濁し、77.5μl中８Mの最終濃度まで尿素を添加した。混合物を、15分間50℃にてインキュベートし、続いて100mMヨードアセトアミド（2.5μl）を添加し、その全体を、室温にて15分間維持した。次いで、トリプシン（20μl中１μg）を添加し、混合物を24時間37℃にて消化し、続いてTFA（４μ）を添加して、酵素反応を停止した。得られた混合物を逆相HPLC 分析（C-8カラム、Applied Biosystems）に供し、これを、０から100％アセトニトリル（0.1％TFA中）までの２時間にわたる直線勾配で、0.2ml/分の流速にて溶出し、280nmで検出した。個々のオリゴペプチドピークを含む画分を手動で回収し、そしてアミノ酸配列決定に直接供した(配列番号２〜７)。 Forsythia intermedia stem cDNAライブラリー合成‐全RNA(約300μg/gの新鮮な量)を温室生長Forsythia intermedia植物（var．Lynwood Gold）の若い緑色茎から得た（Dong,Z.D.,およびDunstan,D.I．(1996)Plant Cell Reports 15:516- 521）。Forsythia intermedia stem cDNAライブラリーを、５μgの精製ポリＡ⁺m e）とともに構築し、一次ライブラリーについて1.2×10¹⁰PFUの力価を得た。増幅したライブラリー（1.2×10¹⁰PFU/ml、全量158ml）（Sambrook,Jら、前出）の一部（30ml）を使用して、PCRのための精製cDNAライブラリーDNAを得た（Ausube l,F.M.，Brent,R.，Kingston,R.E.，Moore,D.D，Seidnam,J.G.，Smith,J.A.,およびStruhl,K.(1991)Current Protocols in Molecular Bology,２つの巻、Green e PUblishing Associates and Wiley-Interscience John Wiley&Sons，NY）。ディリジェントタンパク質DNAプローブ合成-N-末端および内部ペプチドアミノ酸配列を使用して、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを構築した。精製F.inte rmediac DNAライブラリーDNA（５ng）を、100μlPCR反応物（10mM Tris-HCl（pH 9.0）、50mM KCl、0.1％ Triton X-100、2.5mM MgCl₂、0.2mM各dNTP、および2.5 ユニットのTaq DNAポリメラーゼ）中、プライマーPSINT1(配列番号８)（100pmol ）、およびプライマーPSI7R（配列番号11）(20pmol)、プライマーPSI2R（配列番号10）（20pmol）、またはプライマーPSI1R(配列番号９)（20pmol）のいずれかとともに、テンプレートとして使用した。PCR増幅を、サーモサイクラーにおいて、以下のように行った：１分94℃、２分50℃、および３分72℃の35サイクル； 72℃にて５分、および最終サイクルの後４℃にて無制限維持。１つのプライマー、テンプレートのみ、およびプライマーのみの反応を、コントロールとして行った。PCR産物を、1.5％アガロースゲルに溶解し、ここで一本のバンド(それぞれ、約370bp、約155bp、または約125bp)が、各反応について観察された。増幅したバンドのヌクレオチド配列を決定するために、５つの100μlのPCR反応を、PSINT1(配列番号８)およびPSI7R（配列番号11）、PSINT1(配列番号８)およびPSI2R（配列番号10）、ならびにPSINT1(配列番号８)およびPSI1R(配列番号９)のプライマー対を用いて上記のように、行った。各プライマー対からの５つの反応物を濃縮し（Microcon 30、Amicon Inc.）、そしてTE緩衝液（10mM Tris- HCl、pH8.0、１mM EDTA；２×200μl）で洗浄し、続いて、PCR産物をTE緩衝液中（２×50μl）に回収した。これらを、調製用1.5％アガロースゲル中で分離した。次いで、各ゲル精製PCR産物(約0.2pmol)を、pT7BlueＴベクターに連結し、そしてNovagenの説明書に従ってコンピテントなNovaBlue細胞に形質転換した。インサートサイズを、急速煮沸溶解およびPCR技術（R20マーおよびU19マープライマーを用いる）を用いて、製造業者の説明書に従って決定した。制限分析を行い、前述のプライマー対を利用する各反応からのすべてのインサートが、同一であるかどうか、以下のように決定した：100μl PCR反応物（R20マー（配列番号74 ）およびU19マー(配列番号75)で増幅した目的のインサート）のうち各20μlに、４ユニットのHaeIII、1.5ユニットのSau3a、または５ユニットのTaqI制限酵素を添加した。制限消化を、HaeIIIおよびSau3Aについては37℃にて、ならびにTaqI 反応については65℃にて60分進行させた。制限産物を、1.5％アガロースゲルに溶解し、試験した各インサートについて１つの制限グループを得た。PSINT1(配列番号８)およびPSI7R（配列番号11）からの５つの組換えプラスミド（pT7PSI1- pT7PSI5と称す）、およびPSINT1(配列番号８)およびPSI2R（配列番号10）からの２つの組換えプラスミド（pT7PSI6およびpT7PSI7と称す）PCR産物を、DNA配列決定のために選択した；すべてが、同じオープンリーディングフレーム（ORF）(配列番号69)を含んだ。次に、ディリジェントタンパク質プローブを、以下のように構築した：５つの100μl PCR反応を、10ngのpT7PSI1 DNA(配列番号69)で、プライマ−PSINT1(配列番号８)およびPSI7R（配列番号11）を用いて上記のように、ットおよび[α-³²P]dCTPとともに、キット説明書に従って使用して、放射性標識プローブを生成した（0.1ml中）。これを、BioSpin６カラム（Bio−Rad）を通して精製し、そしてキャリアDNA（0.5mg/ml剪断サケ精子DNA（Sigma）、0.9ml）に添加した。ライブラリースクリーニング-600,000PFUのF.intermedia増幅cDNAライブラリーを、一次スクリーニングのために、Stratageneの説明書に従ってプレートした。プラークを、Magna Nylon円形膜（Micron Separations Inc.）にブロットした。ブラリーファージDNAを膜に固定し、そして100℃にて２分間迅速な排気を伴いオートクレーブすることによって、１段階で変性させた。膜を、６×標準クエン酸生埋食塩水（SSC）および0.1％SDS中で37℃にて30分間洗浄し、そして結晶化用ディッシュ（150×75mm）において、予熱した６×SSC、0.5％SDS、および５×De nhard試薬（ハイブリダイゼーション溶液、300ml）中で57〜58℃にて穏やかに振盪しながら、５時間プレハイブリダイズした。[³²P]放射標識したプローブを変性し（煮沸、10分）、素早く冷却し（氷、15分）、そして結晶化用ディッシュ（ 190×75mm）中の予熱した新鮮なハイブリダイゼーション溶液（60ml、58℃）に添加した。次に、プレハイブリダイズした膜をこのデイッシュに添加した。次いでこれを、プラスチックラップで覆った。ハイブリダイゼーションを、57〜58℃ にて、穏やかに浸透しながら、18時間行った。膜を、４×SSCおよび0.5％SDSにおいて、５分間室温にて洗浄し、２×SSCおよび0.5％SDSに移し（室温）、そして57〜58℃にて、穏やかに浸透しながら、20分間インキュベートし、プラスチックラップで覆って乾燥を防ぎ、そして最後に増感スクリーンで-80℃にて24時間、Kodak X-OMAT ARフィルムに暴露した。20のポジティブプラークを、上記のハイブリダイゼーション条件での２回以上のスクリーニングによって精製した。ディリジェントタンパク質cDNA含有ファージミドインビボ切除および配列決定 -精製cDNAクローンを、stratageneのインビボ切除プロトコルに従って、ファージから得た。ディリジェントタンパク質をコードするいくつかの異なるcDNAの両鎖を、重複配列決定プライマーを用いて完全に配列決定した。２つの異なるcDNA を同定し、pPSD_Fi1（配列番号12）およびpPSD_Fi2（配列番号14）と命名した。配列分析：DNAおよびアミノ酸配列分析を、UnixベースのGCG Wisconsin Packa ge（Program Manual for the Wisconsin Package，Version8、1994年9月、Genet ics Computer Group，575 Science Drive Madison，Wisconsin，USA53711；Rice ，P．(1996)Program Manual for the EGCG Package，Peter Rice，The Sanger C entre，HinxtonHall，Cambridge，CB10 1 Rq，Englamd）およびthe ExPASy Worl d Wide Web分子生物学用サーバー（Geneva University Hospital and Universit y of Geneva，Geneva，Switzerland）を用いて行った。実施例６ Spodoptera frugiperda における機能的ディリジェントタンパク質の発現 Escherichia coliにおいて機能的ディリジェントタンパク質を発現する試みは失敗した。従って、本発明者らは、バキュロウイルス発現系を利用して、Spodop tera frugiperdaにおいて、ディリジェントタンパク質を発現した。F.intermedi aにおけるディリジェントタンパク質（PSD）のための全長1.2kb cDNAクローン（これは、5'および3'未翻訳領域の両方を含む）を、プラスミドpSD_Fi1（配列番号12）由来のpBlueScript（Staratagene）から、制限エンドヌクレアーゼBamHＩおよびXhoIを用いて切除した。この1.2kbフラグメントを、バキュロウイルス移入ベクターpBlueBac4（Invitrogen，San Diego，CA）のマルチクローニングサイトにおけるこれらの同じ制限部位に直接サブクローン化した。これは、6.0kb構築物pBB4/PSDを産生し、これはディリジェントタンパク質cDNAの開始コドンで開始される翻訳との非融合ディリジェントタンパク質を作製する。次いで、この構築物を線状化Bac-N-Blue DNA（Invitrogen）と、Spondoptera frugiperda Sf9細胞に、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクションの技術によって同時トランスフェクトして、同種組換えの手段によって産生した。組換えAutographa cal ifornica核多核体ウイルス（AcMNPV）DNA Bac-N-Blueディリジェントタンパク質（BB/PSD）を、Invitrogenによって記載される手順に従ってプラークから精製した。最終組換えAcMNPV-BB/PSDは、多核体プロモーター制御下でPSD遺伝子を含み、そして組換えウイルスの複製に必要な必須配列を含んだ。ディリジェントタンパク質を昆虫細胞培養物において首尾良く発現されたことを検証するために、Ac MNPV-PSD組換えウイルス高力価ストックで感染した対数期Sf9細胞を使用して、異種タンパク質産生を得た。最大のディリジェントタンパク質収率は、感染後48 〜70時間までに生じた。SDS-PAGEおよび(+)-ピノレシノール形成活性によって決定される場合、タンパク質が培地に分泌され、そして元来Forsythia intermedia から単離された固有のタンパク質に対応する分子量および活性を示すことを見いだした。実施例７ディリジェントタンパク質クローンの Thuja plicata およびTsuga heterophyllaからの単離 Forsythiaディリジェントタンパク質cDNAのコード領域（psd-Fi1（配列番号12 ））を使用して、Thuja plicataおよびTsuga heterophyllaからのcDNAライブラリーをスクリーニングした。条件および方法は、ハイブリダイゼーションを45〜 50℃にて行った以外は、実施例５に記載の通りであった。２つのディリジェントタンパク質cDNAを、Tsuga heterophyllaっから単離し（配列番号16、18）、そして８つのディリジェントタンパク質cDNAを、Thuja plicataから単離した（配列番号20、22、24、26、28、30、32、34）。実施例８ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの Forsythia intermedia からの精製植物材料。Forsythia intermedia植物は、Bailey's Nursery（var．Lynwood G old，St.,Paul，MN）から入手して、ワシントン州立大学温室施設において維持されるか、または地域集落からの贈与物のいずれかであった。材料。使用した全ての溶媒および化学物質は、試薬またはHPLCグレードであった。未標識の(±)-ピノレシノールおよび(±)-ラリシレシノールを、記載のように合成した(Katayama,T.ら、Phytochemistry 32:581-591(1993))。[4R-3H]NADPH を、以前に報告されたように、Moranらの手順（Moran,R.G.ら、Anal.Biochem.13 8:196-204(1984)）の改変（Chu,Aら、J.Biol.Chem．268:27026-27033(1993)）によって得、そして[4R-2H]NADPHを、AndersonおよびLinにしたがって調製した（A nderson,J.A.およびLin B.K.，Phytochemistry 32:811-812(1993)）。酵母グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（IX型、22.32.mmol h^-1 mg^-1）および酵母ヘキソキナーゼ(F300型、15.12mmol^-1 mg^-1）をSigmaから購入し、そしてジヒドロ葉酸レダクターゼ（Lactobacillus casei、33.48mmol h^-1 mg^-1）をBiopu re Co.から得た。Affi-Gel Blue Gel（100〜200メッシュ）およびBio-Gel HT Hy droxyapatiteをBio-Radから購入し、一方、Phenyl Sepharose CL-4B、 MonoQ HR 5/5、MonoP HR 5/20、Superose 6、Superose 12、Superdex 75、PD-10 カラム、分子量標準、およびPolybuffer 74を、Pharmacia LKB Biotechnology， Inc.から得た。アデノシン2',5'-ニリン酸SepharoseおよびReactive Yellow 3 A garoseを、Sigma Chemical Co.から得た。 00およびVarian VXR500Sスペクトロメータで記録し、テトラメチルシラン（内部標準）からの低磁場が報告される化学シフト（δppm）を有する溶媒としてCDCl₃ を用いた。UV（OD₂₆₀でのRNAおよびDNA決定を含む）および質量スペクトルを、それぞれ、Lambda 6 UV/VISおよびVG 7070E（イオン化電圧70eV）分光光度計で得た。高速液体クロマトグラフィーを、逆相（Waters，Nova-pak C18，150×3.9 mm内径）またはキラル（Daicel，Chiralce lODまたはChiralcel OC，240×4.6mm 内径）カラムのいずれかを用いて行い、280nmで検出した（Chu,A.ら、J.Biol.Ch em.268:27026-27033(1993)）。放射活性サンプルを、Ecolume（ICN）において分析し、そして液体シンチレーションカウンター（Packard，Tricarb 2000 CA）を用いて測定した。アミノ酸配列を、オンラインHPLC検出を備えたApplied Biosys temsタンパク質配列決定機を用いて、製造業者の説明書に従って得た。酵素アッセイ。ピノレシノールおよびラリシレシノールレダクターゼ活性を、 (+)-[³H]ラリシレシノールおよび(-)-[³H]セコイソラリシレシノールの形成をモニターすることによってアッセイした（Chu,A.ら、J.Biol.Chem．268:27026-270 33(1993)）。簡単には、ピノレシノールレダクターゼ活性についての各アッセイは、(±)- ピノレシノール（MeOH中５mM、20μl）、精製段階に対応する酵素調製物（100μ l）、および緩衝液（20mM Tris-HCl，pH8.0，110μl）からなる。酵素反応を、[ 4R-³H]NADPH（10mM，20μlの二重蒸留H₂O中6.79kBq/mmol）の添加によって開始した。振盪しながら30℃にて30分のインキュベーションの後、アッセイ混合物を、放射性化学キャリアとして(±)-ラリシレシノール（20μg）および(±)-セコイソラリシレシノール（20μg）を含むEtOAc（500μl）で抽出した。遠心分離後（13,800×g、５分）、EtOAc可溶物を除去し、そして抽出手順を反復した。各アッセイについて、EtOAc可溶物を、液体シンチレーションカウントを用いるその放射活性の決定のために、除去したアリコート（100μl）と合わせた。合わせた EtOAc可溶物の残留物を、減圧下でエバポレートして乾燥し、H₂O中のMeOH/３％酢酸(30:70、100μl)に再構成し、そして逆相およびキラルカラムHPLCに供した。コントロールを、変性（10分間煮沸した）酵素または基質としての(±)-ピノレシノールの非存在下のいずれかを用いて行った。ラリシレシノールレダクターゼ活性を、(-)-[³H]セコイソラリシレシノールの形成をモニターすることによってアッセイした。これらのアッセイを、(±)-ラリシレシノール（MeOH中５mM、20μl）を基質として使用し、放射化学キャリアとして(±)-セコイソラリシレシノール（20μg）を添加した以外は、上記と同様に行った。酵素精製の一般的な手順。タンパク質精製手順を、他に示さない限りは、４℃ にて、280nmでモニターしながら、クロマトグラフィー溶出で行った。タンパク質濃度を、Bradfordの方法(Bradford,M.M.，Anal．Biochem．72:248-254(1976) によって、γグロブリンを標準として用いて決定した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、勾配（４〜15％、Bio-Rad）ゲルを、変性および還元条件下で使用し、これらは、Laemmliの緩衝液系（Laemmli,U.K.，Nature 227:680-685(1970) ）において行った。タンパク質を、銀染色によって可視化した（Morrissey,J.H. ，Anal.Biochem．117:307-310(1981)）。粗抽出物の調製。F.intermediaの茎（20kg）を採集し、３〜６cm切片に切断し、そして必要なときまで-20℃で保存した。茎のバッチ（2kg）を、液体窒素中で冷凍し、そしてWaring Blendorで粉砕した。得られた粉末を、５mMジチオスレイトールを含むリン酸カリウム緩衝液（0.1mM、pH7.0、４Ｌ）で均質化した。ホモジネートを、４層のチーズクロスを通して、10％（w/v）ポリビニルポリピロリドンを含むビーカーに濾過した。濾過物を遠心分離した（12,000×g、15分）。得られた上清を、(NH₄)₂SO₄で分画し、40〜60％飽和のタンパク質沈澱を、遠心分離（10,000×g、１時間）によって回収した。次に、ペレットを、５mMジチオスレイトールを含む最小量のTris-HCl緩衝液（20mM、pH8.0）（緩衝液Ａ）に再構成し、そして緩衝液Ａで平衡化したプレパックPD-10カラム（Sephadex G-25媒体）を用いて脱塩した。アフィニティー（Affi Blue Gel）クロマトグラフィー。粗酵素調製物（緩衝液Ａ中191mg、5nmol h^-1 mg^-1）を、緩衝液Ａで平衡化したAffi Blue Gelカラム（2.6×70cm）に適用した。カラムを200mlの緩衝液Ａで洗浄した後、ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼを、緩衝液Ａ中直線NaCl勾配（300ml中1.5 〜５M）で、流速１ml分^-1にて溶出した。活性画分を、必要なときまで保存した（-80℃）。疎水性相互作用クロマトグラフィー（Phenyl Sepharose）。解凍後、Affi Blu eクロマトグラフィー工程から得られた10の調製物（150mg、51nmol h^-1 mg^-1）を合わせ、そして５M NaClを含む緩衝液Ａで平衡化したPhenyl Sepharoseカラム（１×10cm）に適用した。カラムを、２総容積の同じ緩衝液で洗浄した。ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼを、緩衝液Ａ中のNaClの減少濃度の直線勾配（40ml中５〜0M）を用いて、流速１ml分^-1こて溶出した。ピノレシノール／ラリシレシノール還元を触媒する画分を合わせて、そしてプールした。ヒドロキシアパタイトIクロマトグラフィー。Phenyl Sepharose精製工程からの活性タンパク質（31mg、91nmol h^-1 mg^-1）を、５mMジチオスレイトールを含む10mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）（緩衝液Ｂ）で平衡化した、ヒドロキシアパタイトカラム（1.6×70cm）に適用した。ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼを、リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）の直線勾配（200ml中0.01〜 0.4M）で、流速１ml分^-1にて溶出した。活性画分を合わせた。次いで、緩衝液を、PD-10プレパックカラムを用いて、緩衝液Ａと交換した。アフィニティー（2'5'-ADP Sepharose）クロマトグラフィー。次に、ヒドロキシアパタイト精製工程から得られる酵素溶液（6.5mg、463nmol h^-1 mg^-1）を、2 .5mM EDTAを含む緩衝液Ａ（緩衝液’）で事前に平衡化した、2'5'-ADP Sepharos e（１×10cm）カラムにロードし、次いで、25mlの緩衝液Ａ'で洗浄した。ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼを、緩衝液Ａ'中のNADP+の段階勾配（ 10ml中0.3mM）で、流速0.5ml分^-1にて溶出した。（NAD+（３mMまで）は、ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ活性を溶出しなかった。）NADP+の吸光度の影響で、280nmで溶離液を直接モニターするのは不可能であった。各画分についてのタンパク質濃度を、Bradford（Bradford,M.M.，Anal.Biochem．7 2:248-254(1976)）に従って分光光学的に決定した。ヒドロキシアパタイトIIクロマトグラフィー。ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ活性を示す2'5'-ADP Sepharoseカラムからの画分（0.85mg、10 51nmol h^-1 mg^-1）を合わせ、そして緩衝液Ｂで平衡化した第２ヒドロキシアパタイトカラム（１×３cm）に直接適用し、リン酸カリウム緩衝液（pH7.0）の直線勾配（45ml中0.01〜0.4M）で、流速１ml分^-1にて酵素を溶出した。アフィニティー（Affi Yellow）クロマトグラフィー-次に、第２ヒドロキシアパタイトカラム精製工程からの活性画分（160μg、7960nmol h^-1 mg^-1）を、緩衝液Ａで平衡化した、Reactive Yellow 3 Agarose colum（１×３cm）に適用した。ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼを、直線NaCl勾配（100ml 中０〜2.5）で、流速１ml分^-1にて溶出した。高速タンパク質液体クロマトグラフイー（Fast Protein Liquid Chromatograp hy）（Superose 12クロマトグラフィー）-最高の活性を有するAffi Yellow精製工程からの合わせた画分（50μg、10,940nmol h^-1 mg^-1）をプールし、そしてCe ntricon 10微小濃縮器（Amicon，Inc.）を用いて、１mlに濃縮した。次いで、酵素溶液を、200μlずつ、高速タンパク質液体クロマトグラフィーカラム（Supero se 12,HR10/30）に適用した。ゲル濾過を、20mM Tris-HCl（pH8.0）、150mM NaC l、および５mMジチオスレイトールを含む緩衝液において、流速0.4ml分^-1にて行った。ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼを、12.8mlの移動相で溶出した。UVプロフィール（280nmでの吸光度）と一致する活性な画分をプールし（20μg、15,300nmol h^-1 mg^-1）、そして脱塩した（PD-10プレパックカラム）。前述の精製プロトコルは、(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼの3060倍の精製をもたらした。フェニルプロパノイド代謝に関与する多くの酵素についてのように、タンパク質は非常に少ない含有量である。すなわち、 20kgのF.intermediaの茎は、精製(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼを約20μgしかもたらさなかった。実施例９ Forsythia Intermedia からの精製ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの特徴付け等電点およびpI決定。精製プロトコルの全段階において、(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターセ活性は同時溶出した。この観察を考えると、タンパク質の１つを超える形態が存在したかどうか（すなわち、タンパク質の１つの形態がピノレシノールの還元を触媒し、そしてそのタンパク質の別の形態がラリシレシノールの還元を触媒したかどうか）を明白に確認することが必須であった。この目的のため、ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの等電点を、MonoP HR 5/20 FPLCカラムで等電点電気泳動することによって確立した。 Superose 12ゲル濾過カラム（実施例１）からの活性な画分をプールし、そして同じ緩衝液で平衡化したプレパックPD-10カラムを用いて、25mM Bis-Tris（pH 7.1）で緩衝液交換した。このように得られた調製物を、等電点電気泳動カラムにロードし、そして7.1〜3.9のpH勾配を、溶出液としてPolybuffer 74を用いて、流速0.5ml分^-1にて形成した。各画分のアリコート（200μl）を、ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ活性についてアッセイした。画分の残留物を使用して、pH勾配を決定した。分子量決定。ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼのMonoP HR 5/2 0 FPLCカラム調製物の、SDS-勾配ゲル電気泳動（４〜15％ポリアクリルアミド）への適用によって、類似の見かけの分子量の２つのタンパク質バンドの存在が明らかになった。この分離を、MonoQ HR 5/5 FPLCマトリックスにおける陰イオン交換クロマトグラフィーを介して達成した。Superose 12精製工程（実施例１）からプールした画分を、緩衝液Ａで平衡化したMonoQ HR 5/5カラム（Pharmacia ）に適用した。カラムを、10mlの緩衝液Ａで洗浄し、そしてピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼ活性を、緩衝液Ａ中の直線NaCl勾配（50ml中０〜50 0mM）で、流速0.5ml分^-1にて溶出した。回収した画分のアリコート（30μl）を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、勾配（４〜15％アクリルアミド）ゲルを用いて分析した。タンパク質を銀染色によって可視化した。活性画分 34〜37（27,760nmol h^-1 mg^-1）および38〜41（30,790nmol h^-1 mg^-1）を別々にプールし、そしてこれをすぐ用いて特徴付けた。変性条件下でこのように分離した２つのタンパク質バンドは、それぞれ、約36 および約35kDaの見かけ上の分子量を有した。２つのレダクターゼ形態の各々は、pI約5.7を有した。各レダクターゼイソ型の天然の分子量を、Superose 12、Superose 6、およびS uperdex 75ゲル濾過FPLCカラムにおけるそれらの溶出挙動の、較正分子量標準の溶出挙動との比較を介して推定した。ゲル濾過を、実施例８に示すように行った。各レダクターゼについて、59,000の見かけ上の天然の分子量を、その溶出容量に基づいて、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による約36,000および約35,0 00と比較して算出した。ゲル濾過およびSDS-PAGEからの分子量の間の矛盾は未知のままであるが、天然のタンパク質はダイマーとして存在するようであるが、非対称形のモノマーとしてもまた存在し得、それによりその有効ストークス半径を変更すること（Cantor,C.R.,およびShimmel,P.R.，Biophysiocal Chemistry,第I I部，W.H.Freeman and Company，San Francisco,CA(1980)；Stellwagen,E.，Met hods in Emzymology 182:317-328(1990)）が、ヒトチオレドキシンレダクターゼ（Oblong,J.E.ら、Biochemistry 32:7271-7277(1993)）および酵母メタロエンドペプチドプチターゼ（Hrycyna,C.A.,およびClarke,S.,Biochemistry 32:11293-1 1301(1993)）について報告されたように、試験的に提案され得る。 pH至適および温度至適。ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼのpH 至適を決定するために、ゲルSuperose 12濾過工程（実施例８）からの酵素調製物を、緩衝液を、6.3〜9.4のpH範囲の50mM Bis-Trisプロパン緩衝液で置換したことを除いて、標準的なアッセイ条件（実施例８）を利用してアッセイした。pH 至適は、pH7.4であることが見い出された。ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの温度至適を、４℃〜80℃の範囲において、標準的なアッセイ条件（実施例８）下で、ゲル濾過工程（実施例８）からの酵素調製物を利用して実験した。至適pHで、レダクターゼ活性についての温度至適を、約30℃であることを確立した。反応速度論パラメーター。速度研究を行い、２つのレダクターゼイソ型が別々の還元を触媒するかどうか（すなわち、それぞれ、(+)-ピノレシノールから(+)- ラリシレシノール、および(+)-ラリシレシノールから(−)-セコイソラリシレシノールの変換）、または基質として(+)-ピノレシノールまたは(+)-ラリシレシノールのいずれかへの優先性を提示するかどうかを確認した。最初の速度研究を、酵素の２つのイソ型を別々に利用し、そして基質として(+)-ピノレシノールおよび(+)-ラリシレシノールの両方を別々に使用して行った。最初の速度研究を、３連の実験において、５mMジチオスレイトールを含む50mM Bis-Trisプロパン緩衝液（pH7.4）、純粋な酵素（MonoQ陰イオン交換クロマトグラフィー後）、定常NA DPH濃度（80μM）での10の異なる基質濃度（8.8〜160μM）を用いて行った。インキュベーションを、30℃にて10分間（直線速度論範囲内）行った。反応速度論パラメーターを、Lineweaver-Burkプロットから決定した。重要なことに、反応速度論パラメーターは、酵素の35kDaおよび36kDa形態の両方について本質的に同じであった（すなわち、ピノレシノールについてのK_m：酵素の35kDa形態について27±1.5μm、および酵素の36kDa形態について23±1.3μm ;ラリシレシノールについてのK_m：酵素の35kDa形態について121±5.0μm、および酵素の36kDa形態について123±6.0μm）。類似の様式において、見かけ上の最大速度（タンパク質のμmol h^-1 mg^-1として表される）もまた、本質的に同一であった（すなわち、ピノレシノールについてのVmax：酵素の35kDa形態について1 6.2±0.4、および酵素の36kDa形態について17.3±0.5；ラリシレシノールについて：酵素の35kDa形態について25.2±0.7、および酵素の36kDa形態について29.9 ±0.7）。従って、全ての入手可能な証拠は、(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼが、２つのイソ型として存在し、その各々が両基質の還元を触媒し得ることを示唆する。この還元がどのように行われるか（すなわち、両還元が、並行になされるか、キノンまたはフラノ環形態のいずれかにおいてなされるかどうか）、より豊富なタンパク質供給源を用いるさらなる研究が待たれる。 (+)-[7'R-²H]ラリシレシノールの酵素形成。２つの(+)-ピノレシノール／(+)- ラリシレシノールレダクターゼイソ型が、本質的に同一の触媒特徴を示したので、Sepharose 12酵素調製物（実施例８）（両イソ型を含む）を使用して、水素化物移入の立体特異性を実験した。適したストラテジーは、(+)-ピノレシノールの還元のための補因子としてNADP²Hを用いる選択的重水素標識を利用し、酵素産物（ (+)-ラリシレシノール）を、¹H NMRおよび質量分析によって分析した。従って、 (±)-ピノレシノールの溶液（MeOH中5.2mM、４ml）を、Tris-HCl緩衝液（20mM、 pH8.0、５mMジチオスレイトールを含む、22ml）に添加し、そしてAndersonおよびLinの方法（Anderson,J.A.,およびLin B.K.，Phytochemistry 32:811-812(199 3)）を介して立体特異性重水素標識化[4R-²H]NADPH（H₂O中20mM、４ml）を調製し、その全体を酵素調製物（20ml）に添加した。振盪しながら30℃にて１時間のインキュベーションの後、アッセイ混合物を、EtOAc（２×50ml）で抽出した。E tOAc可溶性画分を合わせ、飽和NaCl（50ml）で洗浄し、乾燥させ（Na₂SO₄）、そして減圧下でエバポレートして乾燥させた。得られる抽出物を、最小量のEtOAc に再構築し、シリカゲルカラム（0.5×７cm）に適用し、そしてEt0Ac／ヘキサン（1:2）で溶出した。酵素産物を含む画分を合わせ、そしてエバポレートして乾燥させた。酵素産物を、重水素によるその置換に起因するδ2.51ppmでの7'-プロRプロトンの消滅によって、そしてC-7での１つの重水素原子の存在に対応する（m/z）36 1（M++1）でのその分子イオンによって証明されるように、(+)-[7'R-²H]ラリシレシノールであることを確証した。従って、(+)-ピノレシノールから(+)-ラリシレシノールへの水素化物移入は、 (+)-ラリシレシノールの7'-プロRの水素位置のみを重水素化される様式において生じた。類似の結果が、(+)-ラリシレシノールの(−)-セコイソラリシレシノールへの変換についても観察され、それにより、全体の水素化物移入は、完全に立体特異性であることが確証された。実施例10 Forsythia intermedia から精製したピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼのアミノ酸配列分析ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼのアミノ酸配列決定。(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼN-末端アミノ酸配列を、オンラインHPLC検出器を備えたApplied Biosystemsタンパク質シークエンサーを用いて、精製タンパク質の各々および両方の混合物から得た。N-末端配列は、両アイソフォームについて同一であった（配列番号36）。トリプシン消化のために、Sepharose 12カラムから精製した酵素（実施例８）の150pmolを、0.1M Tris-HCl（50μl，pH8.5）に懸濁し、尿素を添加して、77.5 μlにおける最終濃度を8Mにした。混合物を50℃にて15分間インキュベートし、次いで100mMヨードアセトアミド（2.5μl）を添加し、その全体を室温にて15分間維持した。次いで、トリプシン（20μl中１μg）を添加し、混合物を37℃にて 24時間消化し、その後、TFA（４μl）を添加して、酵素反応を停止した。得られた混合物を、逆相HPLC分析（C-8カラム、Applied Biosystems）に供し、これを、２時間にわたって、０から100％のアセトニトリル（0.1％TFA中）の直線勾配で、流速0.2ml/分にて溶出し、280nmで検出した。個々のオリゴペプチドピークを含む画分を手動で回収し、そしてアミノ酸配列決定を直接受けさせた。４つのトリプシン処理フラグメントを、十分な量に分離して、アミノ酸配列決定を可能にした（配列番号37〜40）。臭化シアン消化を、Sepharose 12カラムから精製したレダクターゼ（実施例８）の150pmolの、70％蟻酸中0.5M臭化シアンとの、37℃にて40時間のインキュベーションによって行い、続いて臭化シアンおよび蟻酸を、減圧下での遠心分離（ SpeedVac）によって除去した。得られたオリゴペプチドフラグメントを、HPLCによって分離し、そして３つを、十分な量に分離して、配列決定を可能にした（配列番号41〜43）。実施例11 Forsythia intermedia からのピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼのクローニング植物材料。Forsythia intermedia植物は、Bailey's Nursery（var．Lynwood G old，St.,Paul，MN）から入手して、ワシントン州立大学温室施設において維持したか、または地域団体からの贈られたかのいずれかであった。材料。使用した全ての溶媒および化学物質は、試薬級またはHPLC級であった。 OD₂₆₀でのUV RNAおよびDNA決定を、λ6 UV/VIS分光光度計で得た。Temptronic I Iサーモサイクラー（Thermolyne）を、全てのPCR増幅に使用した。Taq熱安定性D NAポリメラーゼを、Promegaから得、一方、制限酵素を、Gibco BRL（HaeIII）、 Boehringer Mannheim（Sau3a）、およびPromega（Taql）から得た。pT7BlueＴベクターおよびコンピテントなNovaBlue細胞を、Novagenから購入し、そして放射性標識ヌクレオチド（[α-³²P]dCTPおよび[γ-³²P]ATP）を、DuPont NENから購入した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および配列決定のためのオリゴヌクレオチドプキット（BIO 101 Inc.）を、PCRフラグメントの精製に使用し、ゲル精製DNA濃度を、1.5％アガロースゲルにおける低DNA質量ラダー（Gibco BRL）と比較することによって決定した。 Forsythia RNA単離。迅速に生長する緑色茎組織から機能的F.intermedia RNA を単離する最初の試みは、不成功であった。これは、その植物フェノール性成分による容易な酸化を介して遭遇する困難に起因する。しかし、この問題は、RNA 単離手順（特に木本植物組織について設計され、これは、酸化を防ぐために、抽出緩衝液において低pHおよび還元条件を使用する）の利用によって、首尾良く克服された（Dong,Z.D.,およびDunstan,D.I.，Plant Cell Reports 15:516-521(19 96)）。 Forsythia intermedia茎cDNAライブラリー合成。全RNA（約300μg/g新鮮重量）を、温室で生長させたForsythia intermedia植物（var．Lynwood Gold）の若い緑色の茎から得た（Dong,Z.D.,およびDunstan,D.I.，Plant Cell Reports 1 5:516-521(1996)）。Forsythia intermedia茎cDNAライブラリーを、５μgの精製 tratagene）とともに構築し、1.2×10⁶PFUの力価を有する一次ライブラリーを得た。増幅したライブラリー（1.2×10¹⁰PFU/ml；全158ml）の一部（30ml）を使用して、PCRのための純粋なcDNAライブラリーDNAを得た（Sambrook，J．ら、Molec ular Cloning：A LaboratoryManual,第３巻、第３版、Cold Spring Harbor Labo ratory，Cold Spring Harbor，NY(1994);Ausubel,F.M.ら、Current Protocols i n Molecular Biology,第２巻、Greene Publishing Associates and Wiley-Inter science，John Wiley&Sons，NY(1991)）。ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターセDNAプローブ合成-N-末端および内部ペプチドアミノ酸配列を使用して、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを構築した。詳細には、プライマーPLRN5（配列番号44）は、N-末端ペプチド（配列番号36）のアミノ酸７〜13の配列に基づいた。プライマーPLR14R（配列番号45 ）は、（配列番号37）に示される内部ペプチド配列のアミノ酸２〜８の配列に基づいた。プライマーPLRI5R（配列番号46）は、（配列番号37）に示される内部ペプチド配列のアミノ酸９〜15の配列に基づいた。配列番号37に示される内部ペプチド配列のアミノ酸9〜15の配列（プライマーPLRI5R（配列番号46）の配列がこれに基づく）はまた、配列番号41に示される臭化シアン作製内部フラグメントのアミノ酸４〜10の配列に対応した。精製F.intermedia cDNAライブラリーDNA（５ng）を、100μl PCR反応物（10mM Tris-HCl（pH9.0）、50mM KCl、0.1％Triton X-100，2.5mM MgCl₂、各0.2mMのd NTP、および2.5ユニットのTaq DNAポリメラーゼ）におけるテンプレートとして、プライマーPLRN5（配列番号44）（100pmol）と、ならびにプライマーPLRI5R（配列番号46）（20pmol）またはプライマーPLR14R（配列番号45）（20pmol）のいずれかとともに使用した。PCR増幅を、サーモサイクラーにおいて、以下のように行った：94℃にて１分、50℃にて２分、および72℃にて３分の35サイクル；72 ℃にて５分、そして最終サイクル後、４℃にて無期限に維持した。シングルプライマー、テンプレートのみ、およびプライマーのみの反応を、コントロールとして行った。PCR産物を、1.5％アガロースゲルで分離した。プライマーPLRN5（配列番号44）およびプライマーPLR14R（配列番号45）の組合せは、380bpの単一のバンドを生じた。これは配列番号47の塩基22〜393に対応する。プライマーPLRN5（配列番号44）およびプライマーPLRI5R（配列番号46）の組合せは、400bpの単一のバンドを生じた。これは配列番号47の塩基22〜423に対応する。２つの増幅したバンドのヌクレオチド配列を決定するために、５つの100μl P CR反応を、以下のテンプレートとプライマーの各々の組合せで、上記のように行った：380bp増幅産物＋プライマーPLRN5（配列番号44）およびプライマーPLR14R （配列番号45）；400bp増幅産物＋プライマーPLRN5（配列番号44）およびプライマーPLRI5R（配列番号46）。プライマーおよびテンプレートの各組合せからの５つの反応物を濃縮し（Microcon 30，Amicon Inc.）、そしてTE緩衝液（10mM Tri s-HCl、pH8.0，１mM EDTA；２×200μl）で洗浄し、PCR産物を、TE緩衝液（２× 50μl）に続いて回収した。これらを、分取用1.5％アガロースゲルで分離した。次いで、各ゲル精製PCR産物（約0.2pmol）を、pT7BlueＴベクターに連結し、そしてNovagenの説明書に従ってコンピテントなNovaBlue細胞に形質転換した。インサートサイズを、急速煮沸溶解およびPCR技術を用いて決定した（R20マー（配列番号74）およびU19マー（配列番号75）プライマーを、製造業者（Novagen）の説明書にしたがって利用する）。制限分析を行い、プライマーおよびテンプレートの各組合せに対して全てのインサートが同じであるかどうか決定した。制限分析を以下のように行った：各インサートを、R20（配列番号74）およびU19（配列番号75）プライマーを利用して、PCRによって増幅した。100μl PCR反応物の各20μlに、４ユニットのHaeIII、 1.5ユニットのSau3a、または５ユニットのTaqI制限酵素を添加した。制限消化を、HaeIIIおよびSau3Aについては37℃にて、およびTaqI反応については65℃にて6 0分間進行させた。制限産物を、1.5％アガロースゲルで分離し、試験した全てのインサートについて１つの制限グループを生じた。得られる組換えプラスミドのうちの５つを、DNA配列決定のために選択した。３つの組換えプラスミド（pT7PLR1〜pT7PLR3と呼ばれる）からのインサートを、基質としての400bp PCR産物とともに、プライマーPLRN5（配列番号44）およびプライマーPLRI5R（配列番号46）の組合わせによって作製した。残りの２つの組換えプラスミド（pT7PLR4およびpT7PLR5と呼ばれる）からのインサートを、基質としての380bp PCR産物とともに、プライマーPLRN5（配列番号44）およびプライマーPLR14R（配列番号45）の組合わせから作製した。５つ全ての配列決定したPCR 産物は、同じオープンリーディングフレームを含んだ。 (+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼプローブを、以下のように構築した：５つの100μl PCR反応を、10ngのpT7PLR3 DNAとともに、プライマーPLRN5（配列番号44）およびプライマーPLRI5R（配列番号46）とともに、上記のように行った。ゲル精製pT7PLR3 cDNAインサート（50ng）を、Pharmacia用して、放射性標識プローブを産生した（0.1ml中）。これを、BioSpin 6カラム（Bio-Rad）を通して精製し、そしてキャリアDNA（Sigmaから得た0.5mg/ml剪断サケ精子DNAの0.9ml）に添加した。ライブラリースクリーニング。600,000PFUのF.intermedia増幅cDNAライブラリーを、Stratageneの説明書にしたがって、一次スクリーニングのためにプレートした。プラークを、Magna Nylon膜サークル（Micron Separations Inc.）にブロ cDNAライブラリーファージDNAを膜に固定し、そして100℃にて２分間のオートクレーブによって、迅速な消耗で１工程において変性した。膜を、６×標準クエン酸生理食塩水（SSC）および0.1％SDSにおいて37℃にて30分間洗浄し、そして結晶化皿（190×75mm）において、予熱した６×SSC、0.5％SDS、および５×Denhar dt試薬（ハイブリダイゼーション溶液、300ml）において57〜58℃にて５時間穏やかに振盪しながらプレハイブリダイズした。 [³²P]放射性標識プローブを変性し（煮沸、10分）、素早く冷却し（氷、15分）、そして結晶化皿（150×75mm）中の予熱した新鮮なハイブリダイゼーション溶液（60ml、58℃）に添加した。次に、プレハイブリダイズした膜を、この皿に添加し、次いでこれを、プラスチックラップで覆った。ハイブリダイゼーションを、穏やかに振盪しながら57〜58℃にて18時間行った。膜を４×SSCおよび0.5％ SDSにおいて室温にて５分間洗浄し、２×SSCおよび0.5％SDS（室温）に移し、そして穏やかに振盪しながら57〜58℃にて20分間インキュベートし、乾燥を防ぐためにプラスチックラップで覆い、そして最後に、増感スクリーンとともに、-8 0℃にて24時間Kodak X-OMAT ARフィルムに曝露した。このスクリーニング手順は、350を超えるポジティブなプラークを生じ、20（異なるシグナル強度）を、さらなる２回のスクリーニングに供した。最終精製の後、20のcDNAのうち６つを、インビボ切り出しによってpBluescriptにサブクローン化した。これらの６つのcDNAを、plr-Fi1〜plr-Fi6と呼んだ（配列番号47、 49、51、53、55、57）。 plr-Fi1〜plr-Fi6ファージミドのインビボ切り出しおよび配列決定。６つの精製cDNAクローンを、Stratageneのインビボ切り出しプロトコルにしたがって、ファージからレスキューした。(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼをコードする６つの異なるcDNA（plr-Fi1〜plr-Fi6）の両鎖を、重複配列決定プライマーを用いて、完全に配列決定した。配列決定のためのDNAの精製は、QIAwell Plusプラスミド精製システム（QIAGE N）を使用して、続いてPEG沈殿(Sambrook.J，MolecularClonlng；ＡLaboratory Manual,第３巻、第３版、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor ，NY（1994）を行い、DNA配列は、Applied Biosystems Model 373A自動シークエンサーを用いて決定した。DNAおよびアミノ酸の配列分析を、UnixベースのGCG W isconsin Package（Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8,19 94年９月,Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wiscons in ，USA 53711；Rice,P.，Program Manual for the EGCG Package，Peter Rice，T he Sanger Centre，Hinxton Hall，Cambridge，CB10 1Rq，England(1996)）およびExPASy Wolrd Wide Web分子生物学サーバー（Geneva University Hospital an d University of Geneva，Geneva，Switzerland）を用いて行った。全ての６つのcDNAは、同じコード領域であるが、異なる5'非翻訳領域を有した。一方、６つのcDNAの各々の3'非翻訳領域の分析は、全てが、最長cDNAの3'領域の短縮化バージョンであることを確証した。温室で生育させた植物の茎頂からの全RNAでの事前のRNAゲルブロット分析は、約1.2kbの長さの単一の転写物を確認した。 RNAゲルブロット分析。RNAゲルブロット分析のために、F.intermedia茎頂からの全RNA（１レーンあたり30μg）を、サイズによって、変性アガロースゲル電気 nt NEN）に移し、膜（StratageneからのStratalinker）に架橋し、プレハイブリダイズし、cDNAクローニングの間にcDNAライブラリーをスクリーニングするのに使用した同じプローブとハイブリダイズし、そして水性ハイブリダイゼーション条件についての製造業者の説明書に従って洗浄した。次いで、膜を、増感スクリーンとともに、-80℃にて48時間Kodak X-OMATフィルムに曝露した。実施例12 (+)- ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼcDNA plr-Fi1の E.coli おける発現 Escherichia coliにおける発現。推定(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼcDNAにコードされる機能的(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼを確認するために、おそらく(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼをコードするcDNAを、E.coliにおいて異種発現した。異種発現はまた、将来、(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼの正確な生化学機構の系統的な研究を可能にするための十分なタンパク質を得るために、必要であった。６つの推定(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼクローンの実験は、１つ（plr-Fi1（配列番号47））が、pBluescriptにおけるβガラクトシダーゼのα相補性粒子とインフレームにあることを明らかにした。これは、思いがけないことであった。なぜなら、容易な手段を潜在的に提供して、完全に機能的な融合タンパク質を発現し、従ってクローン化配列が正しいことの証拠を提供するからである。 plr-Fi1（配列番号47）からの精製プラスミドDNAを、Novagenの説明書にしたがって、NovaBlue細胞に形質転換した。形質転換細胞（５ml培養物）を、37℃にて振盪しながら（225rpm）、中期対数期（OD₆₀₀＝0.5）まで、12.5μg ml^-1テトラサイクリンおよび50μg ml^-1アンピシリンを補充したLB培地（Sambrook,J.、M ol ecular Cloning：A Laboratory Manual,第３巻、第３版、Cold Spring Harbor L aboratory，Cold Spring Harbor，NY（1994））中で増殖させた。次いで、IPTG （イソプロピルβ-D-チオグルコピラノシド）を最終濃度100mMまで添加して、そして細胞を２時間増殖させた。細胞を遠心分離によって回収し、そして500μl（５ml培養管あたり）緩衝液（20mM Tris-HCl，pH8.0，５mMジチオスレイトール）に再懸濁した。次に、リゾチーム（５μlの0.1mg ml^-1,Research Organlcs，Inc .）を添加し、そして続いて10分間インキュベーションし、細胞を超音波処理によって溶解した（３×15秒）。14,000×gで４℃にて10分間の遠心分離の後、上清を取り出し、そして(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼ活性について、実施例８に記載のようにアッセイした（１アッセイあたり210μl 上清）。触媒活性を、無細胞抽出物を、30℃にて２時間、(±)-ピノレシノール（0.4mM ）および[4R-³H]NADPH（0.8mM）とともに、標準的な条件下でインキュベートすることによって確証した。インキュベーションに続いて、未標識(±)-ラリシレシノールおよび(±)-セコイソラリシレシノールを、放射化学キャリアとして添加し、各リグナンを逆相HPLCによって単離した。コントロールは、ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼcDNAのアッセイを含んだ。これは、フレーム外のcDNAインサート（全てのアッセイ成分を含む）ならびにplr-Fi1（配列番号４7）およびフレーム外のピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼcDNA を、[4R-³H]NADPH以外の基質を伴わずに含む。産物の分離およびキラル同定を、以前に記載される（Chu,A.，ら、J.Biol.Chem．268:27026-27033(1993)）ように、HPLCによって行った。続くキラルHPLC分析は、(+)-ラリシノレシノールおよび(-)-セコイソラリシレシノールの両方（しかし、対応する対掌体ではない）が、放射性標識されていることを明らかにした（総活性：54nmol h^-1 mg^-1）。対照的に、(±)-ピノレシノールの非存在下、またはcDNAインサートがβガラクトシダーゼ遺伝子とインフレームに存在しないプラスミドを含むコントロール細胞を使用した場合ではいずれも触媒活性は検出されなかった。従って、異種発現された(+)-ピノレシノール／ (+)-ラリシレシノールレダクターゼおよび植物タンパク質は、正確に同じ鏡像特異的（enantiospeclfic）様式で機能する。実施例13 (+)- ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼをコードするクローンplr-Fi1（配列番号47）のcDNAインサートの配列および相同性分析配列分析。クローン化(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼplr-Fi1（配列番号47）の全長配列は、消化フラグメントのエドマン分解によって決定したペプチド配列のすべてを含んだ。単一のORFにより、34.9kDaの計算分子量を有する312アミノ酸のポリペプチド（配列番号48）が推測され、これは、(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼの２つのアイソフォームについてSDS-PAGEによって以前に推定した値（約35kDaまたは約36kDa）にほぼ一致する。等しい数の酸性および塩基性残基もまた存在し、等電点クロマトグラフィーによって実験的に得られた等電点（ pI約5.7）とは対照的に、7.09の理論的等電点（pI）を有する。アミノ酸組成は、7つのメチオニン残基を明らかにする。興味深いことに、植物から精製した酵素のN-末端は、最初のメチオニンを欠如する。これは、公知の最も一般的な翻訳後タンパク質修飾である。結果として、cDNAにおける最初のメチオニンは、翻訳開始の部位であると考えられ得る。配列分析はまた、残基215 での可能なＮグリコシル化部位（分泌標的化シグナルは存在しないが）、ならびに残基50および228（プロテインキナーゼＣ型）、残基228、250、302、および30 3（カゼインキナーゼII型）、ならびに残基301（チロシンキナーゼ型）での7つの可能なタンパク質リン酸化部位を明らかにする。ピノレシノール／ラリシレシノールポリペプチド鎖の領域（配列番号48）もま user Verlag，Basel（1980）；Branden,C.,およびTooze,J．Introduction to Pr otein Structure,141-159頁、Garland Publishing，Inc.，New York and London （1991）；Wierenga,R.K.ら、J.Mol.Biol．187:101-108（1986））。異なるレダクターゼの配列において、限られた数の不変アミノ酸が存在し、これらは、NADP H結合部位の指標として観察される。これらは、配列G-X-G-X-X-G（配列番号76）（ここでXは任意の残基）を有する３つの保存されたグリシン残基、および６つの保存された疎水性残基を含む。グリシンリッチ領域は、その正確なコンフォメーションにNADPHを配置することにおける中心的役割を果たすと考えられる。これに関して、(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼのＮ末端領域と、Drosophila melanogasterアルコールデヒドロゲナーゼ（Branden,C.,およびTooze,J．Introduction to Protein Structure,141-159頁、Garland Publis hing，Inc.，New York and London（1991））、Pinus taeda桂皮アルコールデヒドロゲナーゼ（MacKay J.J．ら、Mol.Gen.Genet．247:537-545（1995））、ドッグフィッシュ（dogfish）筋乳酸デヒドロゲナーゼ（Branden,C.,およびTooze,J. 、Introduction to Protein Structure,141-159頁、Garland Publishing，Inc., New York and London（1991））、およびヒト赤血球グルタチオンレダクターゼ（Branden,C.,およびTooze,J.、Introduction to Protein Structure,141-159頁、Garland Publishing，Inc.，New York and London（1991））の保存されたNAD PH結合領域のＮ末端領域との比較は、いくつかの興味深い相似物を明らかにした。不変グリシン残基は、ドメインの形成における正確なパッケージングに必要な６つの疎水性残基のうちの４つであるように、全ての場合にアラインメントされる。従って、(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼアイソフォームのNADPH結合部位は、N-末端に近接して局在する。相同性分析：イソフラボンレダクターゼに対する比較。BLAST検索（Altschul, S.F.,ら、J.Mol.Biol．215:403-410（1990））を、National Center for Biotec hnology Informationでの非重複性ペプチドデータベースに対して、(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターセの翻訳されたアミノ酸配列（配列番号48）で行った。有意な相同性は、(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼについて、マメ科植物Cicer arietinum（Tiemann,K.,ら、Eur.J. Biochem．200:751-757（1991））（63.5％類似性、44.4％同一性）、Medicago s ativa（Paiva,N.L.ら、Plant Mol.Biol．17:653-667（1991））（62.6％類似性、42.0％同一性）、およびPisum sativum(Paiva,N.L.,ら、Arch.Biochem.Biophy s．312:501-510（1994））（61.6％類似性、41.3％同一性）からの種々のイソフラボンレダクターゼと示された。この観察は、かなり興味深いものである。なぜなら、イソフラボノイドは、フェニルプロパノイド-アセテート経路代謝の関連分岐を介して形成されるからである。詳細には、イソフラボンレダクターゼは、イソフラボノイド形成の間、α,β-不飽和ケトンの還元を触媒する。例えば、Medi cago sativa L.イソフラボンレダクターゼは、フィトアレキシン（(-)-メディカルピン（medicarpin））の生合成において、2'-ヒドロキシ-ホルモノネチン（2' -hydroxy-formononen）の(3R)-ベスチトン（(3R)-vestitone）への立体特異的変換を触媒する（Paiva,N.L.ら、Plant Mol.Biol．17:653-667（1991））。この配列類似性は、リグナンおよびイソフラボノイドの両方が、同程度の植物防御機能および薬理学的役割(例えば、「植物性発情ホルモン様物質」)とともに、一般的なフェニルプロパノイド代謝の派生物であることが、有意に与えられ得る。結果として、両レダクターゼは、非常に類似の反応を触媒するので、イソフラボンレダクターゼは、(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼから進化したかもしれないと推測する気にさせる。これは、リグナンが、シダ植物、マツモ、裸子植物、および被子植物に存在するので、ありそうなことと考えられる；それゆえ、それらの経路は、明らかにイソフラボノイドの前に進化した（Gang ら、Phytochemicals for Pest Control，Hedinら編、ACS Symposium Series,Was hington D.C.，658:58-59(1997)）。同程度の相同性もまた、Arabidopsis thaliana（Babiychuk,E.ら、EMBL/GenBa nk/DDBJデータベース（1995）への直接提出（1995年5月25日））（65.9％類似性、50.8％同一性）、Nicotiana tabacum（Hibi,N.ら、Plant Cell 6:723-735(199 4)）（64.6％類似性、47.2％同一性）、Solanum tuberosum（van Eldik,G.J.ら、（1995）EMBL/GenBank/DDBJデータベースへの直接提出（1995年10月06日））（65.5％類似性、47.7％同一性）、Zea mays（Petrucco,S.ら、Plant Cell 8:69 -80(1996)（61.6％類似性、44.9％同一性）、および特にLupinus albus（Attuci ,S.ら、私信およびEMBL/GenBank/DDBJデータベース(1996)への直接提出（06/6/9 6））（85.9％類似性、66.2％同一性）からの推定イソフラボンレダクターゼ「ホモログ」で観察された。対照的に、他のNADPH依存性レダクターゼとの相同性は、有意に低かった：例えば、Petunia hybrida（Beld,M.ら、Plant Mol.Blol．13:491-502（1989））(4 3.2％類似性、21.5％同一性)およびHordeum vulgare(Kristiansen,K.N.およびRo hde,W.，Mol.Gen.Genet.230:49-59(1991)（46.2％類似性、21.l％同一性）からのジヒドロフラボノールレダクターゼ、Medicago sativa(Ballance,G.M.およびD ixon,R.A.,Plant Physlol．107:1027-1028(1995)（39.5％類似性、15.8％同一性）からのカルコンレダクターゼ、Sesbania rostrata(Goormachtig,S.ら、（1995 ）EMBL/GenBank/DDBJデータベースへの直接提出（1995年3月13日)）（47.6％類似性、24.1％同一性）からのカルコンレダクターゼ「ホモログ」、Nocardia sP ．(Horinouchi,S.ら、Appl.Environ.Microbiol．57:1386-1393(1991))（46.6％類似性、21.0％同一性）からのコレステロールデヒドロゲナーゼ、ならびにRatt us norvegicus(Zhao,H.-F.ら、Journal Endocrlnology 127:3237-3239(1990)（4 3.5％類似性、20.6％同一性）からの3-β-ヒドロキシ-5-エンステロイドデヒドロゲナーゼ。従って、配列分析は、(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼ、イソフラボンレダクターゼ、および推定イソフラボンレダクターゼ「ホモログ」（これは、イソフラボンレダクターゼ活性を有さない）の間の有意な相同性を確証する。実施例14 Thuja plicata(-)- ピノレシノール／(-)-ラリシレシノールレダクターゼの cDNA クローニング植物材料。西洋赤スギ植物（Thuja plicata）を、ワシントン州立大学温室施設において維持した。材料。使用したすべての溶媒および化学物質は、試薬またはHPLCグレードであった。Taq熱安定性DNAポリメラーゼおよび制限酵素（SacIおよびXbaI）を、Prom egaから入手した。pT7BlueＴベクターおよびコンピテントなNovaBlue細胞をNova genから購入し、そして放射性標識化ヌクレオチド（[α-³²P]dCTP）をDuPont NE Nから購入した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および配列決定のためのオリゴヌクレオチドプット（BIO 101 Inc.）を、PCRフラグメントの精製のために使用し、ゲル精製したDNAの濃度は、1.3％アガロースゲルにおける低DNA質量ラダー（Gibco BRL）と比較することによって決定した。機器。UV（OD₂₆₀でのRNAおよびDNA決定を含む）スペクトルを、λ６UV/VIS分光光度計にて記録した。Temptronic IIサーモサイクラー（Thermolyne）を、すべてのPCR増幅のために使用した。配列決定のためのプラスミドDNAの精製は、QI Awell Plusプラスミド精製システム（Qiagen）を使用し、続いてPEG沈澱（Sambr ook,J.ら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第３巻、第３版、Cold Sp ri SV Minipreps DNA Purification System（Promega）を行い、DNA配列は、Applie d Biosystems Model 373A自動シークエンサーを用いて決定した。 Thuja plicata cDNAライブラリー合成-全RNA(6.7μg/g新鮮重量)を、Lewinsoh nらの方法に従って、温室生長西洋赤スギ植物（Thuja plicata）の若緑葉（葉柄 (stem)を含む）から得た（Lewinsohn,E.ら、Plant Mol.Biol.Rep．12:20-25(199 4)）。T.plicata cDNAライブラリーを、３μｇの精製ポリ(Ａ)+mRNA(Oligote 築し、一次ライブラリーとして1.2×10⁵pfuの力価を得た。増幅したライブラリー（7.1×10⁸pfu/ml、全量28ml）を、スクリーニングのために使用した（Sambro ok,J.ら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第３巻、第３版、Cold Spr ing Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY（1994））。 T.plicata(-)-ピノレシノール／(-)-ラリシレシノールレダクターゼcDNA合成。T.plicata(-)-ピノレシノール／(-)-ラリシレシノールレダクターゼcDNAを、逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）ストラテジーによってmRNAから得た（S ambrook,J.ら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第３巻、第３版、Col d Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY（1994））。第１鎖cDNA を、T.plicata cDNAライブラリーの合成のために以前に使用した精製mRNA(上記) からンカープライマー（1.4μg）と混合し、10分間70℃に加熱し、そして氷上で素早く冷却した。次いで、変性mRNAテンプレートおよびリンカープライマーの混合物を、First Strand Buffer（Life Technologies）、10mM DTT、0.5mM各dNTP、および200ユニットのSuper Script^TMII（Life Technologies）と混合し、20μlの最終容量にした。反応を、42℃にて50分間行い、次いで加熱（70℃、15分）によって停止した。E.coli RNaseH（1.5ユニット、１μl）を溶液に添加し、37℃にて20分間インキュベートした。次に、第１鎖反応（２μl）を、100μl PCR反応（10mM Tris-HCl（pH9.0）、5 0mM KCl、0.1％TritonX-100、1.5mM MgCl₂、0.2mM各dNTP、および５ユニットのT aq DNAポリメラーゼ）におけるテンプレートとして、プライマーCR6−NT（5'GCA CATAAGAGTATGGATAAG3'）(配列番号60)（10pmol）およびプライマーXhoI-Poly（d T）(5'GTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3')(配列番号59)(10pmol)とともに使用した。PCR増幅を、52℃でのアニーリング温度を除いて、（Dinkova-Kostova,A.T.ら、J.Biol.Chem．271:29473-29482(1996)）に記載のようにサーモサイクラーで行った。PCR産物を、1.3％アガロースゲルに溶解し、ここで、予測長（約1,200bp ）を有する少なくとも２つのバンドが観察された。バンドをゲルから抽出した。次いで、ゲル精製したPCR産物（56ng）を、pT7BlueＴベクター（50ng）に連結し、そしてNovagenの説明書に従ってコンピテントなNovaBlue細胞に形質転換した。挿入したcDNAのサイズおよび方向を、急速煮沸溶解およびPCR技術を用いて、製造業者（Novagen）の説明書に従って、以下のプライマーの組み合わせで決定した：R20マー（配列番号74）とU19マー(配列番号75)；R20マー（配列番号74）とCR6−NT(配列番号60)；U19マー(配列番号75)とCR6−NT(配列番号60)。挿入したDNAのCR６−NTプライマー末端を、ＴベクターのU19マープライマー部位 s DNA Purification Systemで精製した。５つの挿入cDNAを、重複配列決定プライマーを用いて完全に配列決定し、そしてポリアデニル化部位が異なることを除いて同一であることを示した。それゆえ、最長のcDNA（plr-Tp1と命名した）（配列番号61）を、pBluescript発現系を用いて、酵素活性の検出のために使用した。配列分析-DNAおよびアミノ酸配列分析を、UnixベースのGCG Wisconsin Packag e（Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8、1994年9月、Genet ics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(199 6)；Rice,P．Program Manual for the EGCG Package，Peter Rice，The Sanger Centre，Hinxton Hall，Cambridge，CB10 １Rq，England）およびthe ExPASyWor ld Wide Web molecular biology server（Geneva University Hospital and Uni versity of Geneva，Geneva，Switzerland）を用いて行った。実施例15 Thuja plicata(+)- ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼの cDNA クローニングおよび発現 T.plicata(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼのcDNAクローニング。plr-Tp1をクローン化し、そして配列決定した後、全長クローンを使用して、plr-Tp1全cDNAインサートをプローブとして使用したことを除いて、実施例11に記載のように、T.plicata cDNAライブラリーをスクリーニングした。いくつかのポジティブクローンを配列決定し、１つは新規の唯一のcDNAであることが明らかになり、これをplr-Tp2と命名した。このcDNAは、plr-Tp1に対する高度な配列類似性（アミノ酸レベルで約81％類似性）を有するが、以下に記載のように、本来のForsythia intermediaレダクターゼに同一の基質特異性特性を有するレダクターゼをコードする。酵素アッセイ。ピノレシノールおよびラリシレシノールレダクターゼ活性を、実施例８に記載のように、以下の改変とともに、[³H]ラリシレシノールおよび[³ H]セコイソラリシレシノールの形成をモニターすることによってアッセイした。簡単には、ピノレシノールレダクターゼ活性についての各アッセイは、(±)-ピノレシノール（MeOH中５mM、20μl）および酵素調製物（すなわち、E.coliからの全タンパク質抽出物、210μl）からなった。酵素反応を、[4R-³H]NADPH（10mM ,蒸留H₂O中6.79kBq/mmoL20μl）の添加によって開始した。振盪しながら30℃にて３時間のインキュベーションの後、アッセイ混合物を、放射性化学キャリアとして(±)-ラリシレシノール（20μg）および(±)-セコイソラリシレシノール（20μg）を含むEtOAc（500μl）で抽出した。遠心分離後（13,800×g、５分）、EtOAc可溶物を取り出し、そして抽出手順を反復した。各アッセイについて、E tOAc可溶物を、液体シンチレーションカウントを用いるその放射活性の決定のために、取り出したアリコート（100μl）と合わせた。合わせたEtOAc可溶物の残りを吸引して真空中で乾燥し、MeOH/H₂O(30:70、100μl)に再構成し、そして逆相およびキラルカラムHPLCに供した。ラリシレシノールレダクターゼ活性を、(+)-[³H]セコイソラリシレシノールの形成をモニターすることによってアッセイした。これらのアッセイを、上記のように正確に、但し(±)-ラリシレシノール（MeOH中５mM、20μl）を基質として使用したことを除いて、放射性化学キャリアとして(±)-セコイソラリシレシノール（20μg）を添加して行った。 E.coliにおけるplr-Tp1の発現−plr-Tp1のオープンリーディングフレーム（OR F）がpBluescript SK(-)におけるβガラクトシダーゼ遺伝子α相補性粒子とインフレームであるために、plr-Tp1を、SacIおよびXbaIでpT7BlueＴベクターから切り出し、ゲル精製し、次いでこれらの同じ酵素で消化した発現ベクターに連結した。このプラスミドpPCR-Tp1を、Novagenの説明書にしたがって、NovaBlue細胞に形質転換した。形質転換細胞（５ml培養物）を、37℃にて、50μg ml^-1カルベニシリンを補充したLB培地（Sambrook,J.ら、Molecular Cloning;A Laboratory Manual,第３巻、第３版、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor ，NY（1994））中で、振盪しながら（225rpm）、中期対数期（Ａ₆₀₀＝0.5〜0.7 ）まで増殖させた。次に、細胞を、遠心分離（1000×g、10分）によって回収し、そして10mM IPTG（イソプロピルβ-D-チオグルコピラノシド）および50μg ml^-1 カルベニシリンを補充した新鮮なLB培地に、吸光度0.6（600nmにおける）まで再懸濁した。細胞（一晩増殖させた）を遠心分離によって回収し、そして500〜7 00μl(5ml培養管あたり)の緩衝液（50mM Tris-HCl，pH7.5、２mM EDTA、5mM DTT ）に再懸濁した。次に、細胞を超音波処理によって溶解し（５×45秒）、そして遠心分離（17500×g、４℃、10分）の後、上清を取り出し、そして(-)-ピノレシノール／(-)-ラリシレシノールレダクターゼ活性について、上記のようにアッセイした。コントロールは、インサートDNAを含まないか（ネガティブコントロールとして）または立体特異的コントロールとしてpPLR-Fi1（インフレームで真正のF.intermedia(+)-ピノレシノール／(+)-ラリシレシノールレダクターゼのcD NA）を含むpBluescript（SK(-)）、ならびに(4R)-³HNADPHを除く基質を含まない pPLR-Tp1のアッセイを含んだ。結果は、(-)-ラリシレシノールおよび(+)-セコイソラリシレシノールの両方が放射性標識され、そして放射性活性の取り込みが(-)-セコイソラリシレシノールでは見いだされないことを示した。しかし、(-)-ラリシレシノールについて観察されたよりもずっと遅い速度ではあるが、(+)-ラリシレシノールへの放射性標識の蓄積もまた観察された。これらの結果は、plr-Tp1は、基質として(-)-ピノレシノールおよび(+)-ピノレシノールの両方を使用し得、前者は(-)-ラリシレシノールを介して(+)-セコイソラリシレシノールに完全に変換され、そして後者は、ずっとより遅くに(+)-ラリシレシノールに変換されるが、さらに(-)-セコイソラリシレシノールへは変換されない。 E.coliにおけるplr-Tp2の発現。plr-Tp2 cDNAは、pBluescript SK(-)における β-ガラクトシダーゼ遺伝子α相補性粒子とインフレームであることが見いだされた。上記のように、活性および基質特異性について上昇した場合、plr-Tp2は、少量の(-)-ラリシレシノールもまた検出されたことを除いて、本来のForsythi aintermediaレダクターゼ（Dinkova-Kostova,A.T.,ら、J.Biol.Chem．271:29473 -29482(1996)）と同じ基質特異性および産物形成を有することが見いだされた。これは興味深い、なぜなら、plr-Tp2は、Forsythiaレダクターゼに対するよりも、plr-Tp1に対して、より高度な配列類似性を有するからである。全ての上記の観察を、重水素標識化基質(±)-[9,9'-²H₂,OC²H₃]ピノレシノールを用いて、対応するリグナンの単離とともに確認した；次いで、各々を、キラルカラムクロマトグラフィーおよび有PLC質量分析に供して、これらの知見を確認した。実施例16 Thuja plicata およびTsuga heterophyllaからのさらなるピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼのクローニング２つのさらなるピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼを、Thuja pl icata若い茎のcDNAライブラリーから、実施例15に記載のように、plr-Tp2のクローニングのために、クローン化した。２つのさらなるピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼを、plr-Tp3（配列番号65）およびplr-Tp4（配列番号67）と命名した。２つのさらなるピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼを、Tsuga he terophylla若い茎のcDNAライブラリーから、実施例15に記載のように、plr-Tp2 のクローニングのために、クローン化した。Tsuga heterophyllaからの２つのさらなるピノレシノール／ラリシレシノールレダクターセを、plr-Tp3（配列番号6 9）およびplr-Tp4（配列番号71）と命名した。本発明の好ましい実施態様が、例示および記載されているが、種々の変更が、本発明の精神および範囲から逸脱せずに本明細書中においてなされ得ることは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者デイビン，ローレンスビー. アメリカ合衆国ワシントン 99163，プルマン，エヌ．イー．アパードライブ 1710 (72)発明者ディンコバ―コストバ，アルベナティー. アメリカ合衆国メリーランド 21210, ボルチモア，ダブリュー．ユニバーシティパークウェイ 116，ブロードビューアパートメンツナンバー1025 (72)発明者藤田政之アメリカ合衆国ワシントン 99163，プルマン，エヌ．ダブリュー．アンソニーナンバー３ 215 (72)発明者ガン，デイビッドアール. アメリカ合衆国ワシントン 99163，プルマン，ビー―４，エス．イー．クレムガードアベニュー 921 (72)発明者サルカネン，シモアメリカ合衆国ミネソタ 55406，ミネアポリス，39ティーエイチアベニューエス．4051 【要約の続き】ノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの組換え発現のための系および方法が提供される。

Claims

【特許請求の範囲】１．ディリジェントタンパク質およびピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼからなる群より選択されるリグナン生合成経路から単離されたタンパク質であって、ここで、該単離されたタンパク質がピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼである場合、該単離されたタンパク質が少なくとも51nmolh^-1mg^- ¹ の酵素活性を有する、単離されたタンパク質。２．ディリジェントタンパク質の生物学的活性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質。３．Forsythiaからのディリジエントタンパク質の生物学的活性を有する、請求項２に記載の単離されたタンパク質。４．Forsythia intermediaからのディリジエントタンパク質の生物学的活性を有する、請求項３に記載の単離されたタンパク質。５．Tsugaからのディリジェントタンパク質の生物学的活性を有する、請求項２に記載の単離されたタンパク質。６．Tsuga heterophyllaからのディリジェントタンパク質の生物学的活性を有する、請求項５に記載の単離されたタンパク質。７．Thujaからのディリジェントタンパク質の生物学的活性を有する、請求項２に記載の単離されたタンパク質。８．Thuja plicataからのディリジェントタンパク質の生物学的活性を有する、請求項７に記載の単離されたタンパク質。９．配列番号13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、および35からなる群より選択されるディリジェントタンパク質の生物学的活性を有する、請求１に記載の単離されたタンパク質。１０．ピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの生物学的活性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質。１１．Forsythiaからのピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの生物学的活性を有する、請求項１０に記載の単離されたタンパク質。１２．Forsythia intermediaからのピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの生物学的活性を有する、請求項１１に記載の単離されたタンパク質。１３．Tsugaからのピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの生物学的活性を有する、請求項１０に記載の単離されたタンパク質。１４．Tsuga heterophyllaからのピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの生物学的活性を有する、請求項１３に記載の単離されたタンパク質。１５．Thujaからのピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの生物学的活性を有する、請求項１０に記載の単離されたタンパク質。１６．Thuja plicataからのピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの生物学的活性を有する、請求項１５に記載の単離されたタンパク質。１７．配列番号48、50、52、54、56、58、62、64、66、68、70、および72からなる群より選択されるピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの生物学的活性を有する、請求項１に記載の単離されたタンパク質。１８．ディリジェントタンパク質をコードする、単離されたヌクレオチド配列。１９．Forsythia種からのディリジェントタンパク質をコードする、単離されたヌクレオチド配列。２０．Forsythia intermediaからのディリジェントタンパク質をコードする、請求項１９に記載のヌクレオチド配列。２１．配列番号13または配列番号15の生物学的活性を有するタンパク質をコードする、単離されたヌクレオチド配列。２２．配列番号13または配列番号15のアミノ酸配列をコードする、請求項１９に記載の単離されたヌクレオチド配列。２３．配列番号１２または配列番号１４の配列を有する、請求項１９に記載の単離されたヌクレオチド配列。２４．Tsuga種からのディリジェントタンパク質をコードする、単離されたヌクレオチド配列。２５．Tsuga heterophyllaからのディリジェントタンパク質をコードする、請求項２４に記載のヌクレオチド配列。２６．配列番号17または配列番号19の生物学的活性を有するタンパク質をコードする、単離されたヌクレオチド配列。２７．配列番号17または配列番号19のアミノ酸配列コードする、請求項２４に記載の単離されたヌクレオチド配列。２８．配列番号16または18の配列を有する、請求項２４に記載の単離されたヌクレオチド配列。２９．Thuja種からのディリジェントタンパク質をコードする、単離されたヌクレオチド配列。３０．Thuja plicataからのディリジェントタンパク質をコードする、請求項２９に記載のヌクレオチド配列。３１．配列番号21、23、25、27、29、31、33、または35のいずれか１項に記載の生物学的活性を有するタンパク質をコードする、単離されたヌクレオチド配列。３２．配列番号21、23、25、27、29、31、33、または35のいずれか１項に記載のアミノ酸配列をコードする、請求項２９に記載の単離されたヌクレオチド配列。３３．配列番号20、22、24、26、28、30、32、または34のいずれか１項に記載の配列を有する、請求項２９に記載の単離されたヌクレオチド配列。３４．Forsythia種からのピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードする、単離されたヌクレオチド配列。３５．Forsythia intermediaからのピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードする、請求項３４に記載のヌクレオチド配列。３６．配列番号48、50、52、54、56、または58のいずれか１項に記載の生物学的活性を有するタンパク質をコードする、単離されたヌクレオチド配列。３７．配列番号48、50、52、54、56、または58のいずれか１項に記載のアミノ酸配列コードする、請求項３４に記載の単離されたヌクレオチド配列。３８．配列番号47、49、51、53、55、または57のいずれか１項に記載の配列を有する、請求項３４に記載の単離されたヌクレオチド配列。３９．Thuja種からのピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードする、単離されたヌクレオチド配列。４０．Thuja plicataからのピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードする、請求項３９に記載のヌクレオチド配列。４１．配列番号62、64、66、または68のいずれか１項に記載の生物学的活性を有するタンパク質をコードする、単離されたヌクレオチド配列。４２．配列番号62、64、66、または68のいずれか１項に記載のアミノ酸配列をコードする、請求項３９に記載の単離されたヌクレオチド配列。４３．配列番号61、63、65、または67のいずれか１項に記載の配列を有する、請求項３９に記載の単離されたヌクレオチド配列。４４．Tsuga種からのピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードする、単離されたヌクレオチド配列。４５．Tsuga heterophyllaからのピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼをコードする、請求項４４に記載のヌクレオチド配列。４６．配列番号70または配列番号72の生物学的活性を有するタンパク質をコードする、単離されたヌクレオチド配列。４７．配列番号70または配列番号72のアミノ酸配列をコードする、請求項４４に記載の単離されたヌクレオチド配列。４８．配列番号６９または配列番号７１の配列を有する、請求項４４に記載の単離されたヌクレオチド配列。４９．配列番号13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、および35からなる群より選択されるディリジェントタンパク質の生物学的活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能発現ベクター。５０．配列番号48、50、52、54、56、58、62、64、66、68、70、および72からなる群より選択されるピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの生物学的活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能発現ベクター。５１．請求項４９に記載のベクターを含む、宿主細胞。５２．請求項５０に記載のベクターを含む、宿主細胞。５３．適切な宿主細胞においてピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの発現を増強する方法であって、該宿主細胞に、配列番号48、50、52、54、56、 58、62、64、66、68、70、および72からなる群より選択されるタンパク質の生物学的活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する工程を包含する、方法。５４．適切な宿主細胞においてピノレシノール／ラリシレシノールレダクターゼの発現を改変する方法であって、該宿主細胞に、配列番号47、49、51、53、55、 57、61、63、65、67、69、および71からなる群より選択される核酸分子の全てまたは一部に相補的であるRNAを発現するヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する工程を包含する、方法。５５．適切な宿主細胞においてディリジェントタンパク質の発現を増強する方法であって、該宿主細胞に、配列番号13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、 33、および35からなる群より選択されるタンパク質の生物学的活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する工程を包含する、方法。５６．適切な宿主細胞においてディリジェントタンパク質の発現を改変する方法であって、該宿主細胞に、配列番号12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、 32、および34からなる群より選択される核酸分子の全てまたは一部に相補的であるRNAを発現するヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する工程を包含する、方法。５７．光学的に純粋なリグナンを産生する方法であって、光学的に純粋なリグナンを産生するために、二分子フェノキシカップリング反応を指向し得るディリジェントタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、および該光学的に純粋なリグナンを該宿主細胞から精製する工程を包含する、方法。５８．前記ヌクレオチド配列が、配列番号12、14、16、18、20、22、24、26、28 、30、32、および34からなる群より選択される、請求項５７に記載の方法。