MXPA01000843A - Eter bencilico reductasa recombinante para alcohol dehidrodiconiferilico y su metodo de uso. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan secuencias de ADN aisladas que codifican para la expresion de la eter bencilico reductasa para alcohol de dehidrodiconiferilico. En otros aspectos, se proporcionan vehiculos de clonacion recombinantes, replicables, que codifican para la eter bencilico reductasa para alcohol dehidrodiconiferilico o para la secuencia de bases suficientemente complementaria con por lo menos una porcion del ADN o ARN de la eter bencilico reductasa para alcohol dehidrodiconiferilico para habilitar la hibridizacion con la mismo. Todavia en otros aspectos, se proporcionan celulas hospederas modificadas que han sido transformadas, transfectadas, infectadas y/o inyectadas con un vehiculo de clonacion recombinante y/o la secuencia de ADN que codifica para la eter bencilico reductasa para acido dehidrodiconiferilico. Por lo tanto, se proporcionan metodos para la expresion recombinante de la eter bencilico reductasa para alcohol dehidrodiconiferilico en celulas hospederas, por ejemplo celulas vegetales.

Description

TER BENCÍLICO REDUCTASA RECOMBINANTE PARA ALCOHOL DEHIDRODICONIFERÍLICO Y SU MÉTODO DE USO SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica los beneficios de prioridad de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos número de serie 60/094,012, presentada el 24 de julio de 1998.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con proteínas aisladas de la éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico, se relaciona con secuencias de aminoácidos que codifican para las proteínas de éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico, y se relaciona con vectores que contienen las secuencias de las células hospederas que contienen a las secuencias y a los métodos para producir las proteínas recombinantes de la éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico, y sus mutantes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El alcohol dehidrodiconiferílico (DDC) es un lignano 8,5-ligado y uno de los tres productos principales del acoplamiento in vi tro del radical del alcohol E- Error I Unkno n switch argument . "Si u^ ! V;.h -o-.. i . /-. ( > •• - • conif rílico, que es facilitado por las peroxidasas y lacasas, por ejemplo las que se proponen para la lignificación (Freudenberg, K. Bull. Soc. Chim. France, 1748, 1753 (1959); Freudenberg, K. & Neish, A.C. Consti tution and Biosynthesis of Lignin 1-123 (Springer-Verlag, New York, NY, 1968)). El DDC es ubicuo en el reino vegetal y se encuentra en vegetales tan diversos como el pino de incienso (Pinus taeda) (Nose, M., et al . Phytochemistry 39:71-79 (1995)) y el tabaco (Nicotiana tabacum) (Binns, A., N. , Chem., R. , H. , Wood, H., N. & Lynn, D., G. Proc . Nati . Acad. Sci . USA 84:980-984 (1987)). Las células del cultivo en suspensión de pino de incienso han demostrado contener DDC y su derivado reducido en el enlace alílico 7 ',8', el alcohol dihidrodehidrodiconiferílico (DDD) (Nose, M., et al. Phytochemistry 39:71-79 (1995)). Sin embargo, las enzimas implicadas en su formación y el subsecuente metabolismo no se han descrito previamente.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con lo siguiente, los ADNc que codifican para la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico provenientes de Pinus taeda y Cryptomeria japónica se han asilado y secuenciado y la correspondiente secuencia de aminoácidos se ha deducido.

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En consecuencia, esta invención se relaciona con secuencias de ADN aisladas que codifican para la expresión de la éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico . Por ejemplo la secuencia designada SEQ ID N0:1 que codifica para una éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico (SEQ ID NO: 2) proveniente de Pinus tarda, y las secuencias designadas SEQ ID NO : 3 y SEQ ID NO : 5 , que codifican para la éter bencílico reductasa para el al-cohol dehidrodiconiferílico (SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6, respectivamente) de Cryptomeria japónica . En otros aspectos, la invención está dirigida a vehículos de clonación recombinantes, replicables, que comprenden una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo una secuencia de ADN que codifica para la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico, o para una secuencia de bases suficientemente complementaria para por lo menos una porci n del ADN o del ARN que codifica para la éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico, para permitir la hibridización con el mismo (por ejemplo ARN antisentido o fragmentos de ADN complementarios a una porción de las moléculas de ADN o ARN que codifican para la éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico, que son útiles como cebadores de reacción en cadena de polimerasa o como sondas para cualquiera de las reductasas anteriores o de los genes Error! Unknown switch argument. relacionados) . En otros aspectos de la invención, se proporcionan células hospederas modificadas que han sido transformadas, transfectadas, infectadas y/o inyectadas con un vehículo de clonación recombinante y/o una secuencia de ADN de la invención. Por lo tanto, esta invención proporciona la expresión recombinante de éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico, y los conceptos inventivos pueden utilizarse para facilitar la producción, aislamiento y purificación de cantidades significativas de éter bencílico reductasa recombinante para el alcohol dehidrodiconiferílico o de su producto de enzima primaria, para un uso subsecuente en la obtención de expresión o reforzamiento de la expresión de la éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico en vegetales, microorganismos o animales, o bien puede emplearse en un ambiente en donde se desea la regulación o expresión de la éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico para la producción de esta reductasa o de sus productos enzimáticos o derivados de los mismos. En otro aspecto, la invención se relaciona con métodos para reforzar o bien modificar la expresión de la proteína de la éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico en una célula hospedera adecuada, por ejemplo una célula vegetal.

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BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los anteriores aspectos y muchas otras de las ventajas esperadas de esta invención se apreciarán más fácilmente a medida que la misma se comprende mejor con relación a la descripción detallada siguiente, al tomarse en conjunto con los dibujos que se acompañan, en donde: La figura 1A muestra separaciones HPLC de los siguientes patrones: Pico 1: alcohol tetrahidrodehidrodiconiferílico (TDDC) , Pico 2 : alcohol isodihidrodehidrodiconiferílico (IDDDC) , Pico 3 : alcohol dihidrodehidrodiconiferílico (DDDC) , Pico 4: alcohol dehidrodiconiferílico (DDC) . La figura IB muestra un cromatograma HPLC de la reducción de DDC a IDDDC. La figura 1C muestra un cromatograma HPLC de la reducción de DDDC a TDDC mediante la éter bencílico reductasa (SEQ ID NO: 2) . La figura ID muestra el espectro de masas de DDC (substrato) . La figura 1E muestra el espectro de masas de IDDDC (producto de la reducción de DDC por la éter bencílico reductasa (SEQ ID NO:2)). La figura 1F muestra el espectro de masas de TDDC (producto de la reducción de DDDC por la éter bencílico reductasa (SEQ ID NO : 2 ) .

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DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERIDA Como se utiliza aquí los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a los L-a-aminoácidos que se presentan en forma natural o a sus residuos . Los aminoácidos se identifican por las designaciones de una sola letra o de tres letras: Asp D ácido aspártico He I isoleucina Thr T treonina Leu L leucina Ser S serina Tyr Y tirosina Glu E ácido glutámico Phe F fenilalanina Pro P prolina His H histidina Gly G glicina Lys K glicina Ala A alanina Arg R arginina Cys C cisteina Trp W tritofano Val V valina Gln Q glutamina Met M metionina Asn N asparagina En el sentido en que se utiliza aquí, el término "nucleótido" se refiere a una unidad monomérica de ADN o ARN que contiene una entidad de azúcar (pentosa) , un fosfato y una base heterocíclica nitrogenada. La base está unida a la porción de azúcar mediante un carbón glucosídico (carbón 1' de la pentosa) y esa combinación de base y azúcar se denomina nucleósido. La base se caracteriza al Error! Unknown switch argument. nucleósido con las cuatro bases del ADN que son: adenina ("A"), guanina ("G"), citosina ("C") y timina ("T"). Inosiaa ("I") es una base sintética que puede utilizarse para sustituir cualquiera de las cuatro, bases naturales (A, C, G o T) . Las cuatro bases del ARN son A, G, C y uracilo ("U") . Las secuencias del nucleótido que se describen aquí comprenden un arreglo lineal de nucleótidos conectados por enlaces fosfodiéster entre los carbonos 3 ' y 5' de las pentosas adyacentes. "Oligonucleótido" se refiere a secuencias de longitud corta y de una o dos cadenas de desoxirribonucleótidos unidos mediante enlaces fosfodiéster. Los oligonucleótidos se sintetizan químicamente por métodos conocidos y se purifican, por ejemplo, en geles de poliacrilamida. El término "éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico" tal como se utiliza aquí se refiere a una enzima que es capaz de convertir al alcohol dehidrodiconiferilo en alcohol 7-0-4'-isodihidrodehidrodiconiferílico, según se determina, por ejemplo, en el ensayo descrito para el ejemplo 3. El término "alteración", "alteración de la secuencia de aminoácidos", "variante" y "variante de la secuencia de aminoácidos" se refiere a las moléculas de éter bencílico reductasa para el alcohol Error! Unknown switch argument. dehidrodiconiferílico con algunas diferencias en sus secuencias de aminoácidos en comparación con la éter bencílico reductasa nativa correspondiente para el alcohol dehidrodiconiferílico. Normalmente, las variantes tendrán por lo menos alrededor de 70% de homología con la correspondiente éter bencílico reductasa nativa para alcohol dehidrodiconiferílico, y de preferencia tendrán por lo menos aproximadamente 80% de homología con la correspondiente éter bencílico reductasa nativa para alcohol dehidrodiconiferílico. Las variantes de las secuencias de aminoácidos de las éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico que queden dentro de esta invención poseen sustituciones, deleciones y/o inserciones en ciertas porciones. Las variantes de secuencia de la éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico pueden utilizarse para lograr la actividad enzimática deseada, ya sea reforzada o reducida, la región química modificada o la estereoquímica modificada o una utilización de substrato alterada o una distribución de producto alterada. Las variantes de sustitución de la éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico son aquéllas que tienen por lo menos un residuo de aminoácido retiradoen la correspondiente secuencia nativa de la éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico Error! Unknown switch argument. y un aminoácido insertado en su lugar, en la misma posición. La sustitución puede ser de tipo simple, en donde un solo un aminoácido de la molécula ha sido substituido, o bien puede ser múltiple, en donde dos o más aminoácidos se han substituido en la misma molécula. Los cambios substanciales en la actividad de la molécula de la éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico pueden obtenerse substituyendo un aminoácido con una cadena lateral que es significativamente diferente en carga y/o estructura con respecto al aminoácido nativo. Este tipo de sustitución se espera afecte la estructura del polipéptido y/o la carga o hidrofobicidad de la molécula en el área de la sustitución. Se esperarían cambios moderados en la actividad de la molécula de éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico al sustituir un aminoácido con una cadena lateral que es similar en carga y/o estructura a la molécula nativa. Este tipo de substitución, a la que se denomina substitución conservadora, no se espera que altere substancialmente la estructura del polipéptido o la carga o hidrofobicidad de la molécula en el área de substitución. Los variantes de inserción de la éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico son aquéllas que tienen uno o más aminoácidos insertados inmediatamente en forma adyacente al aminoácido en una Error! Unknown switch argument. posición particular de la molécula nativa de éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico. Inmediatamente adyacente al aminoácido se refiere a que está conectado a cualquiera de los grupos funcionales a-carboxi o a-amino del aminoácido. La inserción puede hacerse con uno o más aminoácidos. Típicamente, la inserción consistirá de uno o más aminoácidos conservadores. Los aminoácidos similares en carga y/o estructura del aminoácido adyacente al sitio de inserción se definen como conservadores. Alternativamente, esta invención incluye la inserción de un aminoácido con una carga y/o estructura que es esencialmente diferente a la de los aminoácidos adyacentes al sitio de inserción. Las variantes de variantes de deleción son aquéllas en donde se han retirado uno o más aminoácidos de la éter bencílico reductasa nativa para alcohol dehidrodiconiferílico. Normalmente, las variantes delecionales tendrán cancelados uno o más aminoácidos en una región particular de la molécula de éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico. El término "antisentido" o "ARN antisentido" o "ácido nucleico antisentido" se utiliza aquí para referirse a una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la totalidad o parte de la molécula de ARN mensajero. Las moléculas de ácido nucleico antisentido se utilizan Error ! Lnknown switch argument . típicamente para inhibir la expresión in vivo de las moléculas de ARN mensajero, expresadas, complementarias. Las variantes de las secuencias de aminoácidos de la éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico pueden tener una actividad biológica deseablemente alterada, entre lo que se incluye cinética de reacción, utilización de substrato, distribución de producto u otras características alteradas, por ejemplo regioquímica y estereoquímica. Los términos "secuencia de ADN que codifica para", "ADN que codifica para" y "ácido nucleico que codifica para" se refieren al orden o secuencia de desoxirribonucleótidos a lo largo de una cadena de ácido desoxirribonucleótido . El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos junto con la cadena de polipéptido traducida. La secuencia de ADN por lo tanto codifica para la secuencia de aminoácidos. El término "vector", "vector de expresión replicable" y "vector de expresión" se refiere a una porción de ADN, normalmente de doble cadena, que puede insertarse dentro de una porción de ADN (ADN inserto) . El vector se utiliza para transportar el ADN inserto en una célula hospedera adecuada. Una vez dentro de la célula hospedera, el vector puede replicarse independientemente o Error! Unknown switch argument. coincidentalmente con el ADN cromosomal del hospedero, y varias copias del vector y su ADN insertado podrán generarse. Además, los vectores de expresión (que incluyen vectores de expresión replicables) contienen los elementos necesarios que permiten la traducción del ADN inserto dentro de un polipéptido. Muchas moléculas de polipéptido codificadas por el ADN inserto pueden por lo tanto sintetizarse rápidamente. Los términos "célula hospedera transformada", "transformada" y "transformación" se refieren a la introducción de ADN dentro de la célula. La célula se denomina "célula hospedera" y puede ser una célula procariótica o eucariótica. Las células hospederas procarióticas incluyen varias cepas de E. coli . Las células hospederas eucarióticas típicas son células vegetales, por ejemplo células de maíz, células de levadura, células de insectos o células de animales. El ADN introducido normalmente está en forma de un vector que contiene una porción insertada de ADN. La secuencia de ADN introducida puede provenir de la misma especie que la célula hospedera o de una especie diferente al de la célula hospedera, o puede ser una secuencia de ADN híbrida que contiene algo de ADN extraño y algo de ADN derivado de las especies hospederas. De acuerdo con la presente invención, una Error! Unknown switch argument. molécula de ADNc que codifica para una éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico (SEQ ID N0:1) se aisló a partir de una biblioteca de ADNc con base en el fago ?, elaborada a partir del ARN extraído de un cultivo de suspensión celular de Pinus taeda, que se cultivó en el medio 2,4-D. Esta biblioteca de ADNc se clasificó utilizando un fragmento de extremo 5' (SEQ ID NO: 7) proveniente del ADNc (PLR-Fil) que codifica para la pinoresinol-lariciresinol reductasa de Forsythia intermedia . Veinte placas de fagos positivas se purificaron y los insectos de ADNc secuenciados revelaron una clona de reductasa putativa. La proteína de fusión ß-galactosidasa codificada por esta clona careció de la actividad pinoresinol-lariciresinol. El ADNc (SEQ ID NO:l) que codifica para la reductasa putativa se clonó en el plásmido de expresión pSBETa, expresado en E. coli y la proteína nativa resultante (SEQ ID NO:2), es decir, que carece de un dominio ß-galactosidasa, purificada del extracto crudo de E. coli y se analizada respecto a la actividad pinoresinol-lariciresinol y a su capacidad de reducir el alcohol dehidrodiconiferílico. La reductasa purificada de P. taeda (SEQ ID NO: 2) efectuó la reducción del enlace de éter bencílico del alcohol dehidrodiconiferílico para convertirlo en alcohol 7-0-4 ' - (iso) dihidrodehidrodiconiferílico. Adicionalmente, las dos Error ! l'nknown switch argument . moléculas de ADNc que codifican para la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico se aislaron a partir de una biblioteca de ADNc de Cryptomeria japónica en la siguiente forma. La biblioteca de ADNc de C. japónica se clasificó utilizando 5 ng de ADNc (SEQ ID N0:1) de la éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico de Pinus taeda, amplificado por PCR. Aproximadamente 300,000 ufp de la biblioteca de ADNc amplificada de C. japónica se clasificaron y dieron veinte placas positivas, dos de las cuales, pCj-PCBERl (SEQ ID NO:3) y pCj:PCBER2 (SEQ ID NO:5), resultaron codificar una éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico (SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO : 6 , respectivamente). El aislamiento de los ADNc que codifican para la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico permite el desarrollo de un sistema de expresión eficiente para esta enzima funcional, proporciona herramientas útiles para examinar la regulación del desarrollo de la biosíntesis de lignano y permite el aislamiento de otras reductasas de éter bencílico del alcohol dehidrodiconiferílico. El aislamiento de las ADNc de la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico también permite la transformación de una amplia gama de organismos con objeto de reforzar o modificar la biosíntesis de lignano.

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Como ejemplo, las proteínas y ácidos nucleicos de esta invención pueden utilizarse para elevar o bien alterar los niveles de lignano en especies vegetales y en productos alimenticios que incorporan material derivado de estos vegetales genéticamente alterados. Una secuencia de ácido nucleico que codifica para la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico o un fragmento de ácido antinucleico antisentido complementario para la totalidad o parte de una secuencia de ácido nucleico que codifica para la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico puede introducirse, en la forma adecuada, en una especie vegetal con una variedad de fines, entre los que se incluyen, de manera enunciativa: alterar o mejorar el color, la textura, la durabilidad y la resistencia a plagas en tejidos leñosos, en especial tejidos de madera de corazón; reducir o alterar la formación de lignanos y/o ligninas en especies vegetales; reducir o alterar el contenido de lignano/lignina de especies vegetales utilizadas para la producción de papel y pulpa, haciendo así que la producción de papel y pulpa sea más fácil y más barata; mejorar la capacidad de defensa de un vegetal contra depredadores y patógenos al reforzar la producción de lignanos y ligninas de defensa; alterar otras interacciones ecológicas mediadas por los lignanos o ligninas; introducir, reforzar o inhibir la producción de Error! Unknown switch argument. reductasas de éter bencílico del alcohol dehidrodiconiferílico, o sus productos. La secuencia de ácido nucleico que codifica para la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico puede introducirse en cualquier organismo para una variedad de fines, entre los que se incluyen, de manera enunciativa: introducir, reforzar o inhibir la producción de la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico o la producción de su producto enzimático o derivados de los mismos. Las secuencias de transporte N-terminal conocidas en este campo (ver, por ejemplo, von Heijne, G. et al., Eur. J. Biochem. 180:535-545 (1989); Stryer, Biochemistry W.H. Freeman y Company, New York, NY. p. 769 (1988)) pueden emplearse para dirigir la proteína éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico hacia una variedad de ubicaciones celulares o extracelulares. Las variantes de secuencia de las clonas de éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico del tipo silvestre pueden producirse por deleciones, substituciones, mutaciones y/o inserciones y se pretende queden dentro del alcance de esta invención, excepto en lo que respecta a lo limitado de la técnica anterior. Las secuencias de aminoácidos de la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico como variantes, pueden Error! Unknown switch argument. construirse mutando una secuencia de ADN que codifica para éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico tipo silvestre, por ejemplo utilizando técnicas a las que comúnmente se conocen como mutagénesis sitio-dirigida. Varios métodos de reacción en cadena de polimerasa (PCR) bien conocidos en este campo, por ejemplo, el sistema de dos cebadores como por ejemplo el estuche de Mutagénesis Sitio-Dirigida de Transformador proveniente de Clontech, podrán emplearse para este fin. Después de la desnaturalización del plásmido blanco en este sistema, se reasocian simultáneamente al plásmido, uno de estos cebadores contiene la mutación sitio-dirigida deseada, los otros contienen una mutación en otro punto del plásmido dando por resultado la eliminación de un sitio de restricción. La síntesis de la segunda cadena se lleva a cabo entonces, enlazando fuertemente estas dos mutaciones y los plásmidos resultantes se transforman en una cepa mutS de E. coli . El ADN del plásmido se aisla de la bacteria transformada, se restringe con la enzima de restricción relevante (linearizando de esta manera a los plásmidos no mutados) y después se retransforma dentro de E. coli . Este sistema permite la generación de mutaciones directamente en un plásmido de expresión, sin la necesidad de la subclonación o generación de fagómidos de una sola cadena. El fuerte enlace de las Error ! tnknovm switch argument . dos mutaciones y la linearización subsecuente de los plásmidos no mutados da por resultado una alta eficiencia de mutación y permite mínima clasificación. Después de la síntesis del cebador inicial del sitio de restricción, este método requiere utilizar solamente un nuevo tipo de cebador por cada sitio de mutación. En lugar de preparar cada mutante posicional en forma separada, puede sintetizarse un conjunto de cebadores de oligonucléotido "degenerados, diseñados" a fin de introducir todas las mutaciones deseadas en un sitio específico de manera simultánea. Los transformantes pueden clasificarse por secuenciación del ADN plásmido a través de la región mutagenizada para identificar y clasificar las clonas mutantes. Cada ADN mutante puede entonces restringirse y analizarse por electroforesis sobre gel reforzado de detección de mutación (J.T. Baker) para confirmar que ninguna otra alteración de la secuencia ha ocurrido (por comparación de desplazamiento de bandas respecto al control no mutagenizado) . Los dúplex mutantes verificados pueden clonarse en un vector de expresión replicable, si no están ya clonados en un vector de este tipo y la construcción de expresión resultante utilizada para transformar E. coli , por ejemplo, la cepa E. coli , BL21 (DE3) pLysS, para alto nivel de producción de la proteína mutante y la purificación subsecuente de la misma. El método de mapeo Error! inknown switch argument.

FAB-MS puede emplearse para verificar rápidamente la fidelidad de la expresión del mutante. Esta técnica proporciona los segmentos de secuenciación a través de toda la proteína y proporciona la confianza necesaria en la asignación de la secuencia. En un experimento de mapeo de este tipo, la proteína se digiere con una proteasa (la elección de la proteasa depende de la región específica que se vaya a modificar, ya que el segmento es de principal interés y el mapa restante debe ser idéntico al mapa de la proteína no mutagenizada) . El conjunto de fragmentos escindidos se fracciona por HPLC microboro (intercambio iónico o fase inversa, dependiendo otra vez de la región específica que se vaya a modificar) para proporcionar varios péptidos en cada fracción y los pesos moleculares de los péptidos se determinan por FAB-MS. Las masas después se comparan con los pesos moleculares de los péptidos esperados de la digestión de la secuencia predicha, y la corrección de la secuencia se valora rápidamente. Como esta mutagénesis se enfoca en la modificación de la proteína y está dirigida, la secuenciación del péptido alterado no debe ser necesario si MS concuerda con la predicción. Si es necesario, para verificar un residuo cambiado, MS/MS en tándem CAD puede emplearse para secuenciar los péptidos de la mezcla en cuestión o el péptido blanco purificado para la degradación Edman Error ! Unknown switch argument . sustractiva o la digestión Y de carboxipeptidasa, dependiendo de la ubicación de la modificación. En el diseño de un mutante sitio-dirigido particular, en general se desea primero hacer una substitución no conservadora (por ejemplo Ala por Cys, his o Glu) y se determina si la actividad está impedida en gran medida, como consecuencia de ello. Las propiedades de la proteína mutagenizada se examinan entonces con atención particular a los parámetros cinéticos de Km y kcat como indicadores sensibles de la función alterada, para lo cual los cambios en la unión y/o catálisis per se pueden deducirse en comparación con la enzima nativa. Si el residuo demuestra ser importante por este medio, por disminución de la actividad o efecto atenuante, las substituciones conservadores podrán elaborarse, por ejemplo Asp por Glu, para alterar la longitud de la cadena lateral, Ser por Cys o Arg por His. Para segmentos hidrofóbicos se altearán en un gran tamaño, aunque los aromáticos también pueden substituirse por cadenas laterales de alquilo. Los cambios en la distribución normal del producto pueden indicarse, para los cuales los pasos de la secuencia de reacción se han alterado por la mutación. Otras técnicas de mutagénesis sitio-dirigida también pueden emplearse con las secuencias de nucleótido de la invención. Por ejemplo, la digestión de la Error! Unknown switch argument. endonucleasa de restricción de ADN seguida por el ligado, podrá utilizarse para generar los variantes de deleción de la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico, como se describe en la Sección 15.3 de Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY (1989)). Una estrategia similar podrá utilizarse para construir variantes de inserción, como se describe en la Sección 15.3 de Sambrook et al., supra . También puede emplearse mutagénesis oligonucleótido-dirigida para preparar variantes de substitución de esta invención. También pueden utilizarse para preparar convenientemente las variantes de deleción y de inserción de esta invención. Esta técnica es bien conocida en el campo como se describe por Adelman et al .

(ADN 2:18) (1983)). En general, los oligonucleótidos de por lo menos 25 nucleótidos de longitud se utilizan para insertar, cancelar o sustituir dos o más nucleótidos en un gen de la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico. Un oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos perfectamente coincidentes en ambos lados de los nucleótidos que codifican para la mutación. Para mutagenizar una éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico de tipo silvestre, el oligonucleótido se reasocia a la molécula molde de ADN de una sola cadena Error! Unknown switch argument. bajo condiciones de hibridización adecuadas. Una enzima de polimerización de ADN, normalmente, el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli , se añade entonces. Esta enzima utiliza al oligonucleótido como un cebador para completar la síntesis de la hebra de ADN que lleva la mutación, por lo tanto, se forma una molécula heterodúplex de manera que una cadena de ADN codifica para la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico tipo silvestre insertada en el vector y la segunda cadena de ADN codifica para la forma mutada de la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico insertada en el mismo vector. Esta molécula heterodúplex se transforma posteriormente dentro de una célula hospedera adecuada. Los mutantes con más de un aminoácido sustituido podrá generarse en una de diferentes formas. Si los aminoácidos están ubicados cercanos en la cadena de polipéptido, podrán mutarse simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifica para todas las substituciones de aminoácido deseadas. Sin embargo, si los aminoácidos están ubicados a cierta distancia uno de otro (separados en más de diez aminoácidos, por ejemplo) es más difícil generar un solo oligonucleótido que codifique para todos los cambios deseados. En lugar de esto, pueden emplearse uno de dos métodos alternativos. En el primer método, se genera un oligonucleótido separado para cada aminoácido que se va a Error! Unknown switch argument. sustituir. Los oligonucleótidos después se reasocian al ADN molde de una sola hebra, en forma simultánea, y la segunda hebra del ADN sintetizada a partir del molde codificará para todas las substituciones de aminoácido deseadas. Un método alternativo implica dos o más rondas de matagénesis para producir la mutante deseada. La primera ronda es como se describe para las mutantes simples: se utiliza ADN éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico, tipo silvestre, para el molde, un oligonucleótido que codifica para la primera substitución de aminoácidos deseada se reasocia a este molde y la molécula de ADN heterodúplex se genera entonces. La segunda ronda de mutagénesis utiliza el ADN mutado producido en la primera ronda de mutagénesis, como molde. Por lo tanto, este molde contiene ya una o más mutaciones. El oligonucleótido que codifica para las substituciones adicionales deseadas de aminoácidos se reasocia entonces a este molde y la cadena resultante de ADN ahora codifica para mutaciones tanto de la primera y de la segunda rondas de le mutagénesis. Este ADN resultante puede utilizarse como molde en una tercera ronda de mutagénesis, y así sucesivamente . Los sistemas de expresión eucarióticos pueden utilizarse para la producción de éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico, ya que son capaces de Error! Unknown switch argument. llevar a cabo modificaciones post-transduccionales requeridas y de dirigir la enzima hacia la ubicación adecuada en la membrana. Un sistema de expresión eucariótico representativo para este propósito utiliza al baculovirus recombinante, Autographa californica virus de polihedrosis nuclear (AcNPV; M.D. Summers and G. E. Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Cul ture Procedures (1986); Luckow et al., Bio - technology 6:47-55 (1987)) para la expresión de las reductasas de éter bencílico del alcohol dehidrodiconiferílico de esta invención. La infección de las células de insectos (por ejemplo células de la especie Spodoptera frugiperda) con los baculovirus recombinantes, permite la producción de grandes cantidades de proteína éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico. Además, el sistema de baculovirus no tiene ventajas importantes para la producción de la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico recombinante. Por ejemplo, los baculovirus no infectan humanos y pueden por lo tanto manejarse de manera segura en grandes cantidades. En el sistetia de baculovirus, una construcción de ADN se prepara incluyendo un segmento de ADN que codifica para éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico, y un vector. El vector puede comprender a la región promotora del gen polihedron del baculovirus, las Error! Unknown switch argument. secuencias de flanqueo del baculovirus necesarias para el cruce adecuado durante la recombinación (las secuencias del flanqueo comprenden aproximadamente 200 a 300 pares de bases adyacentes a la secuencia promotora) y un origen bacteriano de replicación que permite que la construcción se replique en la material. El vector se construye de manera que: (i) el segmento de ADN se coloque adyacente (o se ligue operativamente o "hacia el extremo 3'" o "bajo el control de") al promotor del gen polihedron y (ii) la combinación promotor/éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico está flanqueada en ambos lados por 200-300 pares de bases del ADN del baculovirus (las secuencias de flanqueo) . Para producir una construcción de ADN de éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico, una clona de ADNc que codifica para una reductasa de longitud completa del éter bencílico del alcohol dehidrodiconiferílico se obtienen utilizando métodos como los que se describen aquí . La construcción de ADN se pone en contacto en una célula hospedera con el ADN de baculovirus de un baculovirus adecuado (es decir, de la misma especie del baculovirus como promotor codificado en la construcción) bajo condiciones tales que se efectúe la recombinación. Los baculovirus recombinantes resultantes codifican para la éter bencílico reductasa para alcohol Error! Unknown switch argument. dehidrodiconiferílico, completa. Por ejemplo una célula hospedera de insecto puede cotransfectarse o transfectarse de manera separada con una construcción de ADN y un baculovirus funcional. Los baculovirus recombinantes resultantes pueden entonces aislarse y utilizarse para infectar células para efectuar la producción de la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico. Las células de insecto hospederas, incluyen, por ejemplo células de Spodoptera frugiperda . Las células hospederas de insecto infectadas con un baculovirus combinante de la presente invención se cultivan bajo condiciones que permiten la expresión de la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico, codificada por baculovirus. La proteína recombinante producida en esta forma se extrae a partir de células utilizando los métodos conocidos en la técnica . Otros microbios eucarióticos, por ejemplo levaduras, podrán utilizarse para practicar esta invención. La levadura de panaderos Saccharomyces cerevisiae, se utiliza comúnmente como levadura aunque otras distintas cepas están disponibles. El plásmido YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980)) se utiliza comúnmente como el vector de expresión en Saccharomyces . Este plásmido contiene al gen trpl que proporciona un Error! Unknown switch argument. marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la habilidad de crecer en triptofano, por ejemplo la cepas ATCC No. 44,076 y PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977) ) . La presencia de la lesión trpl como una característica del genoma de la célula hospedera de levadura proporciona entonces un entorno efectivo para detectar la transformación por crecimiento, en ausencia de triptofano. Las células hospederas de levadura en general se transforman utilizando el método de polietilenglicol, como se describe por Hinnen ( Proc . Nati . Acad . Sci . USA 75:1929 (1978)). Otros protocolos de transformación de levaduras se establecen en Gietz et al., N.A . R 20(17): 1425 (1992); Reeves et al., FEMS 99:193-197 (1992). Las secuencia promotoras adecuadas en los vectores de levadura incluyen a los promotores de 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J". Biol . Chem . 255:2073 (1980)) u otras enzimas glucolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968); Holland et al., Biochemistry 17:4900 (1978)), por ejemplo enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. En la construcción de los plásmidos de expresión adecuados, las secuencias de terminación Error! Unknown switch argument. asociados con estos genes también se ligan en el vector de expresión 3 ' de la secuencia deseada que se va a expresar a fin de proporcionar la poliadenilación del ARNm y la terminación. Otros promotores que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son la región promotora de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, ácido fosfatasa, enzimas degradativas asociadas con metabolismo de nitrógeno y la antes mencionada gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Cualquier vector plásmido que contenga al promotor compatible con levadura, al origen de replicación y a las secuencias de terminación resulta adecuado. Los cultivos celulares derivados de los organismos multicelulares, como vegetales, pueden utilizarse como hospederos para práctica esta invención. Las plantas transgénicas podrán obtenerse, por ejemplo, trasfiriendo los plásmidos que codifican para la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico y un gen marcador seleccionable, por ejemplo, el gen kan que codifica para la resistencia a la kanamicina en Agrobacterium tumifaciens que contiene un plásmido auxiliar Ti como se describe en Hoeckema et al., Nature 303:179-181 (1983) y el cultivo de las células Agrobacterium con secciones de hoja del vegetal que se va a transformar, como Error! Unknown switch argument. se describe en An et al., Plant Physiology 81:301-305 (1986) . La transformación de las células hospederas vegetales normalmente se logra a través de Agrobacterium tumifaciens, como ya se describió. El cultivo de células hospederas mamíferas y de otras células hospederas que no tienen barreras rígidas de membrana celular normalmente se transforma utilizando métodos de fosfato de calcio, como originalmente lo describió Graham y Van der Eb ( Virology 52:546 (1978)) y modificado como se describe en la sección 16.32-16.37 de Sambrook et al., supra . Sin embargo, también podrán utilizarse otros métodos para la introducción de ADN dentro de las células, por ejemplo Polybrene (Kawai y Nishizawa, Mol . Cell . Biol . 4:1172 (1984)), fusión de protoplasto (Schaffner, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 77:163 (1980)), electroporación (Neumann et al., EMBO J. 1:841 (1982)) y microinyección directa hacia el núcleo (Capecchi, Cell 22:479 (1980)). Adicionalmente, las estrategias de transformación animal se revisan en Monastersky G.M. y Robl , J.M., Strategies in Transgenic Animal Science, ASM Press, Washington, D.C. (1995). Los tejidos leñosos vegetales transformados pueden seleccionarse a través del marcador seleccionable cultivando células sobre un medio que contiene, por ejemplo, kanamicina y cantidades adecuadas de fitohormona, por ejemplo, ácido naftalenacético y benciladenina para la Error! Unknown switch argument. inducción de tejido leñoso y brotes. Las células vegetales pueden entonces regenerarse y las plantas resultantes transferirse al suelo utilizando técnicas bien conocidas para los expertos en este campo. Además, una secuencia de ácido nucleico que codifica para la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico puede incorporarse en un vegetal junto con un promotor necesario que es inducible. En la práctica de esta modalidad de la invención, un promotor que solamente responde a un estímulo específico, externo o interno, está fusionado al ADNc blanco. Por lo tanto, el gen no se transcribirá excepto en respuesta al estímulo específico. Siempre y cuando el gen no sea transcrito, su producto génico no se produce. Un ejemplo ilustrativo de un sistema promotor productor de respuesta puede utilizarse en la práctica de esta invención si el sistema de glutation-S-transferasa (GST) es maíz. Los sistemas GST son una familia de enzimas que pueden destoxificar varios compuestos electrofílicos hidrofóbicos que normalmente se utilizan como herbicidas pre-emergentes (Weigand et al., Plant Molecular Biology 7:235-243 (1986)). Algunos estudios han mostrados que los sistemas GST están implicados directamente en provocar el refuerzo de la tolerancia a herbicidas. Esta acción está mediada principalmente por un producto de transcripción Error! Unknown switch argument. específico de ARNm de 1.1 kb. En resumen, el maíz tiene un gen quiescente que se presenta en forma natural, ya presente, que puede responder a los estímulos externos y puede inducirse para producir el producto génico. Este gen previamente se ha identificado y clonado. Por lo tanto, en una modalidad de la invención, el promotor es retirado del gen c;ue responde al sistema GST y es anexado a un gen de éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico al que previamente se le había retirado el promotor nativo. Este gen manipulado genéticamente es la combinación de un promotor que responde a un estímulo químico externo y un gen responsable de la producción exitosa de la proteína de éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico . Además de los métodos antes descritos, se conocen varios métodos para transferir el ADN clonado hacia una amplia variedad de especies vegetales, entre las que se incluyen gimnospermas, angiospermas, monocotelidonias y dicotiledonias (ver, por ejemplo, Glick y Thompson eds., Methods in Plant Molecular Biology, CRC Press, Boca Ratón, Florida (1993)). Los ejemplos representativos incluyen la absorción de ADN facilitada por electroporación mediante protoplastos (Rhodes et al., Science 240 (4849) : 204-207 (1988) ) ; el tratamiento de protoplastos con polietilenglicol (Lyznik et al., Plant Molecular Biology Error! Unknown switch argument. 13:151-161 (1989)); y el bombardeo de las células con microproyectiles cargados con ADN (Klein et al., Plant Physiol . 91:440-444 (1989) y Boynton et al., Science 240 (4858) : 1534-1538 (1988)). Varios métodos existen hoy día, por ejemplo, para la transformación de cosechas de cereal (ver, por ejemplo, McKinnon, G.E. y Henry, R.J., J. Cereal Science 22 (3) : 203-210 (1995); Mendel, R.R. y Teeri, T.H., Plant and Microbial Biotechnology Research Series, 3:81-98, Cambridge University Press (1995); McElroy, D. y Brettell, R.I.S., Trends in Biotechnolog, 12(2):62-68 (1994); Christou et al., Trends in Biotechnology 10(7) :239-246 (1992); Christou, P. y Ford, T.L., Annals of Botan, 75 (5) :449-454 (1995); Park et al., Plant Molecular Biolog, 32 (6) : 1135-1148 (1996); Altpeter et al., Plant Cell Report, 16:12-17 (1996) . Adicionalmente, las estrategias y técnicas de transformación vegetal se revisan en Birch, R. G., Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol 48:297 (1997; Forester et al., Exp . Agrie . 33:15-33 (1997). Con variaciones menores estas tecnologías son aplicables a una amplia gama de especies vegetales. Cada una de estas técnicas tiene ventajas y desventajas. En cada una de las técnicas, el ADN de un plásmido se manipula genéticamente de manera que contenga no solamente el gen de interés, sino también otros genes marcadores clasificados y seleccionables. Un gen marcador seleccionable se utiliza Error! Unknown switch argument. para seleccionar solamente aquellas células que tienen copias integradas del plásmido (la construcción es de tal manera que el gen de interés y los genes seleccionables y clasificables se transfieren como una unidad) . El gen seleccionable proporciona otra verificación de los cultivos exitosos de solamente aquellas células que llevan a los genes de interés . Un gen marcador seleccionable que se utiliza comúnmente es la neomicina fosfotransferasa II (NTP II) este gen transfiere resistencia a kanamicina, un compuesto que puede adicionarse directamente al medio de crecimiento o sobre el cual crecen las células . Las células vegetales normalmente son susceptibles a la kanamicina y, como resultado, mueren. La presencia del gen NTP II supera los efectos de la kanamicina y cada célula con este gen permanece viable. Otro gen marcador seleccionable que puede emplearse en la práctica de esta invención es el gen que confiere resistencia a glufosinato herbicida (Basta) . Un gen clasificable que se utiliza comúnmente es el gen ß-glucuronidasa (GUS) . La presencia de este gen se caracteriza utilizando una reacción histoquímica en donde una muestra de las células transformadas putativamente se trata con una solución del ensayo GUS. Después de una incubación adecuada, las células que contienen el gen GUS toman un color azul. De preferencia, el plásmido contendrá genes marcadores tanto Error! Unknown switch argument. seleccionables como clasificables . El plásmido que contiene uno o más de estos genes se introduce dentro de protoplastos vegetales o de células de tejido leñoso mediante cualquiera de las técnicas previamente mencionadas. Si el gen marcador es un gen seleccionable, sólo las células que se han incorporado en el pa.quete de ADN sobreviven a la selección con el agente fitotóxico adecuado. Una vez que las células adecuadas se han identificado y propagado, se regeneran los vegetales. La progenia de los vegetales transformados debe probarse para asegurar que el paquete de ADN se haya integrado exitosamente al genoma vegetal . Las células hospederas mamíferas también pueden utilizarse en la práctica de esta invención. Los ejemplos de las líneas de células mamíferas adecuadas incluyen la línea CVI de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; línea 293S de riñon embriónico humano (Graham et al., J. Gen . Virol . 36:56 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino (Urlab y Chasin, Proc . Nati . Acad . Sci . USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. 23:243 (1980)); células de riñon de mono (CVI-76, ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino Error! Unknown switch argument.

(MDCK, ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75) células de hígado humano (Hep G2 , HB 8065); células de tumor mamario en ratón (MMT 060562, ATCC CCL 51); células de hepatoma de rata (HTC, MI. 54, Baumann et al., J". Cell Biol . 85:1 (1980)); y células TR1 (Mather et al., Annals N. Y. Acad . Sci . 83:44 (1982)). Los vectores de expresión para estas células incluyen ordinariamente (en caso necesario) secuencias de ADN para un origen de replicación, un promotor localizado frente al gen que se va a expresar, un sitio de unión de ribosoma, un sitio de empalme de ARN, un sitio de poliadenilación y un sitio de terminador de transcripción. Los promotores utilizados en los vectores de expresión mamíferos normalmente son de origen viral . Estos promotores virales comúnmente se derivan del virus polioma, Adenovirus 2, y más frecuente del Virus Simian 40 (SV40) . El virus SV40 contiene dos promotores que se denominan promotores temprano y tardío. Estos promotores particularmente son útiles porque los dos se obtienen fácilmente del virus como un fragmento de ADN, que también contiene el origen viral de replicación (Fiers et al., Nature 273:114 (1978)). Los fragmentos de ADN SV40 más grandes y más pequeños también pueden utilizarse, siempre y cuando contengan aproximadamente una secuencia de 250 pares Error! Unknown switch argument. de bases que se extienda desde el sitio HindIII hacia el sitio Bgll ubicado en el origen de replicación viral. Alternativamente, los promotores que están naturalmente asociados con el gen extraño (promotores homólogos, pueden utilizarse siempre y cuando sean compatibles con la línea celular del hospedero que se seleccionó para la transformación. Un origen de replicación puede obtenerse a partir de una fuente exógena, por ejemplo, el virus SV40 o cualquier otro virus (por ejemplo, Plyoma, Adeno, VSV, BPV) y se inserta dentro del vector de clonación. Alternativamente, el origen de replicación puede proporcionarse por el mecanismo de replicación cromosonal de la célula hospedera. Si el vector que contiene el gen extraño está integrado en el cromosoma de la célula hospedera, éste último normalmente es suficiente. El uso del ADN secundario que codifica para una secuencia puede mejorar los niveles de producción de la proteína éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico en la línea celulares transformadas. La secuencia de codificación secundaria típicamente comprende la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) . La forma silvestre de la DHFR normalmente es inhibida por el metotrexato químico (MTX) . El nivel de expresión de DHFR en ura célula variará dependiendo de la cantidad de MTX Error! Unknown switch argument. añadido a las células hospederas cultivadas. Una característica adicional DHFR que lo hace particularmente útil como secuencia secundaria es que puede utilizarse como un marcador de selección para identificar células transformadas. Están disponibles dos formas de DHFR para utilizarse como secuencias secundarias, DHFR tipo silvestre y DHFR resistente a MTX. El tipo de DHFR que se utilice en una célula hospedera particular depende de si la célula hospedera es deficiente en DHFR (de manera que produzca ya sea niveles muy bajos de DHFR en forma endógena o no produzca DHFR funcional en ningún momento) . Las líneas celulares deficientes en DHFR, por ejemplo la línea celular CHO descrita por Urlaub y Chasin, supra , se transforman con la secuencias codificadoras de DHFR de tipo silvestre. Después de la transformación, estas líneas celulares deficientes en DHFR expresan DHFR funcional y son capaces de crecer en un medio de cultivo que carece de nutrientes como hipoxantina, glicina y timidina. Las células no transformadas no sobrevivirán en este medio. La forma resistente a MTX del DHFR puede utilizarse como un medio para seleccionar las células hospederas transformadas en aquellas células hospederas que proporcionan endógenamente cantidades normales de DHFR funcional que es sensible a MTX. La línea celular CHO-K1 (ATCC No. CL 61) posee estas características y por lo tanto Error! Unknown switch argument. es una línea celular útil para este fin. La adición de MTX al medio de cultivo celular permitirá que solamente aquellas células transformadas con ADN que codifica para DHFR resistente a MTX puedan cultivarse. Las células no transformadas serán incapaces de sobrevivir en este medio. Los procariotes también pueden utilizarse como células hospederas para los pasos de clonación inicial de esta invención. También son particularmente útiles para la rápida producción de grandes cantidades de ADN, para producir moldes de ADN de una sola cadena que se utilizan para la mutagénesis sitio-dirigida para clasificar muchos mutantes en forma simultánea y para secuenciar ADN de los mutantes generados. Las células hospederas procarióticas adecuadas incluyen E. coli K12 cepa 294 (ATCC No. 31, 446), E. coli cepa W3110 (ATCC No. 27, 325), E. coli X1776 (ATCC No. 31, 537), y E. coli B; sin embargo, muchas otras cepas de E. coli , por ejemplo HB101, JM101, NM522, NM538, NM539 y muchas otras especies y géneros de procariotes, incluyendo bacilos como Bacillus subtilis, otras enterobacterias como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans, y varias especies de Pseudomonas también pueden utilizarse como hospederos. Las células hospederas procarióticas u otro tipo de células hospederas con paredes celulares rígidas de preferencia se transforman utilizando el método de cloruro de calcio como se describe en la sección 1.82 de Sambrook Error! Unknown switch argument. et al., supra, Dower, W.J. Alternativamente, puede utilizarse electroporación para la transformación de estas células. Las técnicas de transformación de procariotes se establecen en Genetic Engineering, Principies and Methods, 12:275-296, Plenum Publishing Corpo. (1990); Hanahan et al., Meth, Enximol . , 204:63 (1991). Como un ejemplo representativo, las secuencias de ADNc que codifican para éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico pueden transformarse al vector (His)6*Tag pET, comercialmente disponible (de Novagen) para la sobre-expresión en E. coli como hospederos heterólogos. Este plásmido de expresión pET tiene varias ventajas en los sistemas de expresión heterólogos de alto nivel. El inserto de ADNc deseado se liga en cuadro a las secuencias del vector plásmido que codifican 6 histidinas, seguido por un sitio de reconocimiento de proteasa altamente específico (trombina) que se une al codón de la amino terminal de la proteína blanco. El "bloque" de histidina de la proteína de fusión expresada promueve una unión muy estrecha a los iones metálicos inmovilizados y permite la rápida purificación de la proteína recombinante mediante cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados. La secuencia líder de histidina después se escinde en el sitio de proteólisis específica por el tratamiento de la proteína purificada con trombina y la Error! Unknown switch argument. proteína de éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico se eluye. Este sistema de sobre expresión-purificación tiene alta capacidad, excelente poder de resolución y es rápido, y la oportunidad de una proteína contaminante de E. coli que exhiba un comportamiento de unión similar (antes y después de la proteólisis de trombina) es extremadamente pequeña. Como será evidente para los expertos en este campo, cualquier vector plásmido que contenga secuencias de replicón y control que se deriven de especies compatibles con --a célula hospedera también puede utilizarse en la práctica de esta invención. El vector normalmente tiene un sitio de replicación, genes marcadores que proporcionan la selección fenotípica en células transformadas, uno o más promotores y una región poliligante que contienen varios sitios de restricción para la inserción del ADN extraño. Los plásmidos utilizados típicamente para la transformación de E. coli incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pUCllß, pUC119 y Bluescript M13, todos los cuales se describen en las Secciones 1.12-1.20 de Sambrook et al., supra . Sin embargo, muchos otros vectores adecuados están también dispo ibles . Estos vectores contienen genes que codifican para resistencia a ampicilina y/o tetraciclina que permiten que las células transformadas con estos vectores crezcan en presencia de estos antibióticos.

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Los promotores más comúnmente utilizados en los vectores procarióticos incluyen los sistemas promotores de ß-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang et al. Nature 375:615 (1978); Itakura et al., Science 198-1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281:544 (1979)) y un sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucí . Acids Res . 8:4057 (1980); Solicitud EPO con número de publicación 36,776), y los sistemas de fosfatasa alcalina. Mientras que estos son los más comúnmente utilizados, otros promotores microbianos se han utilizado y los detalles respecto a sus secuencias de nucleótidos se han publicado, permitiendo que un trabajador experto los ligue funcionalmente en vectores plásmidos (ver Siebenlist et al. , Cell 20:269 (1980) ) . Muchas proteínas eucarióticas normalmente secretadas por las células contienen una secuencia de señal de secreción endógena como parte de la secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, las proteínas normalmente encontradas en el citoplasma pueden seleccionarse para la secreción por unión de una secuencia de señal a la proteína. Esto se logra fácilmente ligando al ADN que codifica para una secuencia de señal con el extremo 5' del ADN que codifica para la proteína y después expresando esta proteína de fusión en una célula hospedera adecuada. El ADN que codifica para la secuencia de señal puede obtenerse Error! Unknown switch argument . como un fragmento de restricción a partir de cualquier gen que codifica para una proteína con una secuencia de señal. Por I-o tanto, las secuencias de señal procarióticas, de levaduras y eucarióticas pueden utilizarse aquí, dependiendo del tipo de célula hospedera utilizada para practicar la invención. El ADN y la secuencia de aminoácidos que codifican para la porción de la secuencia de señal de varios genes eucarióticos incluyen, por ejemplo, hormona de crecimiento humano, proinsulina y proalbúmina, y ya son conocidos (ver Stryer, Biochemistry W.H. Freeman y Company, New York, N.Y. p 769 (1988)) y pueden utilizarse como secuencias de señal en células hospederas eucarióticas adecuadas. Las secuencias de señal de levadura, por ejemplo fosfatasa alcalina (Arima et al., Nucleic Acids Res . 11:1657 (1983)), factor alfa, fosfatasa alcalina e invertasa, pueden utilizarse para dirigir la secreción desde las células hospederas de levadura. Las secuencias de señal procarióticas provenientes de los genes que codifican para, por ejemplo, LamB o OmpF (Wong et al., Gene 68:193 (1988)), MalE, PhoA o beta-lactamasa, así como otros genes, pueden utilizarse para dirigirse a proteínas desde células procarióticas dentro del medio de cultivo. Las secuencias traficantes provenientes de vegetales, animales y microbios pueden emplearse en la práctica de la invención, para dirigir el producto génico Error! Unknown switch argument. hacia el citoplasma, el retículo endoplásmico, la mitocondria u otros componentes de la célula o para dirigir la proteína para exportarla al medio. Estas consideraciones se aplican a la sobre expresión de éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico y a la reducción o expresión dentro de células u organismos intactos para permitir la función del producto génico en una ubicación deseada. La construcción de los vectores adecuados que contienen ADN que codifica para las secuencias de replicación, secuencias regulatorias, genes de selección fenotípicos y ADN de éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico de interés se preparan utilizando procedimientos estándares de ADN recombinante. Los plásmidos aislados y los fragmentos de ADN aislados se escinden, se diseñan y se ligan juntos en un orden específico para generar los vectores deseados, como es bien conocido en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra) . Como ya se analizó, las variantes de la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico se producen de preferencia por medio de mutación o mutaciones que se generan utilizando el método de mutagénesis sitio-específica. Este método requiere la síntesis y uso de oligonucleótidos específicos que codifican para la Error! Unknown switch argument. secuencia de la mutación deseada y un número suficiente de nucleótidos adyacentes para permitir que los oligonucleótidos hibridicen establemente al molde de ADN. Lo anterior puede comprenderse más fácilmente en relación con los siguientes ejemplos representativos, donde los "plásmidos" se designan por la letra minúscula p seguida de una designación alfanumérica. Los plásmidos de partida utilizados en esta invención se obtienen generalmente de manera comercial, están públicamente disponibles en una base no restringida o pueden construirse de plásmidos disponibles utilizando los procedimientos publicados. Además, se conocen otros plásmidos equivalentes y estos serán evidentes para los expertos. "Digestión", "corte" o "escisión" del ADN se refiere a la escisión catalítica del ADN con una enzima que actúa solamente en ubicaciones particulares del ADN. Estas enzimas se llaman endonucleasas de restricción y el sitio a lo largo de la secuencia de ADN donde esta enzima actúa se llama sitio de restricción. Las enzimas de restricción utilizadas en la invención se obtienen comercialmente y se utilizan de acuerdo a las instrucciones suministradas por los fabricantes. (Ver también las Secciones 1.60-1.61 y 3.38-3.39 de Sambrook et al., supra) . "Recuperación" o "aislamiento" de un fragmento específico de ADN a partir de una digestión de restricción Error! Unknown switch argument. significa la separación del fragmento de ADN resultante sobre una poliacrilamida o un gel de agarosa mediante electroforesis, la identificación del fragmento de interés por comparación con su movilidad respecto a aquella de los fragmentos de ADN marcadores de peso molecular conocido, el retiro de la sección de gel que contiene al fragmento deseado y la separación del ADN a partir del gel . Este procedimiento es conocido en general. Por ejemplo, ver Lawn et al. (Nucleic Acids Res . 9 : 6103 -6114 (1982) ) y Goeddel et al. (Nucleic Acids Res . , supra) .

EJEMPLO 1 Clonación de la proteína de éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico a partir de Pinus taeda A menos que se indique otra cosa, los siguientes materiales, métodos e instrumentos se utilizaron en el Ejemplo 1 y en todos los ejemplos subsiguientes. Materiales vegetales - cultivos de suspensión celular de P. taeda que se mantuvieron como ya se describió previamente (van Heerden, P.S., Towers, G.H.N. & Lewis, N.G. J". Biol . Chem. 271, 12350-12355 (1996)) en un medio que contiene ácido 2 , 4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Las células se cosecharon por filtración siete días después de transferirse al medio fresco, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C.

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Métodos generales - se desarrollaron todas las técnicas de biología molecular, a menos que se describa expresamente a continuación, de acuerdo a métodos estándares (Sambrook, J. , Fritsch, E.F. & Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 3 volúmenes, 3ra . Edición (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1994); Ausubel , F.M., et al . Current Protocols in Molecular Biology, 2 volúmenes (Greene Publishing Associates and Wiley- Interscience, John Wiley & Sons, NY, 1991) ) . Materiales - todos los solventes y agentes químicos utilizados fueron reactivos grado HPLC. La ADN polimerasa termoestable Taq se obtuvo de Promega. Las células NovaBlue componentes se adquirieron de Novagen y el nucleótido radiomarcado ( [a"32P] dCTP) se adquirió de DuPont NEN. El estuche de clonación pCRII TA se adquirió de Invitrogen. La endonucleasa de restricción Ndel se obtuvo de New England Biolabs. Los cebadores de oligonucleótido para la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y la secuenciación se sintetizaron por Gibco BRL Life Technologies. Se utilizaron los estuches GENECLEAN II® (BIO 101 Inc.) para la purificación de los fragmentos PCR con las concentraciones de ADN purificado en gel que se determinaron por comparación con una escalera de masa de Error! Unknown switch argument. poco ADN (Gibco BRL) en geles de agarosa 1.5%. Instrumentos - Los espectros UV (incluyendo las determinaciones de ARN y ADN a una OD260) se registraron en un espectrofotómetro Lambda 6 UV/VIS. Un termociclizador Temptronic II (Thermolyne) se utilizó para todas las amplificaciones PCR. La purificación del ADN plásmido para el eecuenciamiento empleó un sistema de purificación plásmido QIAwell Plus (Qiagen) seguido por precipitación PEG o Sistemas de Purificación de ADN Wizard® Plus SV Minipreps (Promega) , con secuencias de ADN determinadas utilizando un secuenciador automatizado Modelo 373A de Applied Biosystems. Todas las separaciones por cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) se realizaron en el instrumento Millenium (Waters, Inc.) o en Alliance (Waters, Inc) , con monitoreo de eluyente a 280 nm. Síntesis de Biblioteca de ADNc de Pinus taeda -todo el ARN (100 µg/g peso fresco) se obtuvo utilizando el método de Dong y Dunsten (Dong, J.Z. & Dunstan, D.I. Plant Cell Reports 15 (1996) a partir de células de pino de incienso congeladas (Pinus taeda) cultivadas como ya se describió. La biblioteca de ADNc de P. taeda se construyó utilizando 5 µg de poli (A) + ARNm purificado (01igotex-dTMR Suspensión, Qiagen) con el estuche de síntesis ZAP-cDNA®, el vector Uni ZAPMR XR y el extracto de paquete Gigapack® II Gold (Stratagene) , con un título de 1 x 106 ufp para la Error! Unknown switch argument. biblioteca primaria. La biblioteca amplificada (1 x 109 ufp/ml ; 120 ml total) se utilizó para la clasificación (Dinkova-Kostova, A.T., et al . J. Biol . Chem . 271 , 29473-29482 (1996) ) . Síntesis de la sonda de ADN - El extremo 5' de un ADNc aislado para reductasa de pinorresinol-laricirresinol (PLR-Fil) (Dinkova-Kostova, A.T., et. al . J. Biol . Chem. 271:29473-29482 (1996)), que tiene la secuencia de ácido nucleico establecida en (SEQ ID NO: 7) se utilizó como una sonda para clasificar la biblioteca de ADNc de P. taeda para enzimas similares/homologas. La sonda se construyó en la siguiente forma: 10 ng de plásmido pBSPLR-Fil purificado (PLR-Fil) contenido en el plásmido de clonación pBluescript SK[-]) se utilizó como el molde o plantilla en cinco reacciones PCR de 100 µl (10 mM Tris-HCl [pH 9.0], 50 mM KC1, 0.1% Tritón X-100, 2.5 mM MgCl2, 0.2 mM cada dNTP y 2.5 unidades Taq ADN polimerasa con cebadores PLRNT1 (AT(A/T/C) AT(A/T/C) GGI GG1 ACI GGI TA) (SEQ ID NO: 8) (lOOpmol) y PLRI5R (TC (T/C) TCI A(A/G)I GTI AC (T/C) TTI CC) (SEQ ID NO:9) (100 pmol ) . Las amplificaciones PCR se llevaron a cabo en un termociclizador como sigue: 35 ciclos de 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 50°C y 3 minutos a 72°C, con 5 minutos a 72 °C y un tiempo de residencia indefinido a 4°C después del ciclo final. Las 5 reacciones se concentraron (Microcon 30, Amicon Inc.) y se lavaron con Error! Unknown switch argument. solución amortiguadora TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA; 2 x 200 µl) , y el producto PCR se recuperó subsecuentemente en solución amortiguadora TE (2 x 50 µl) . El producto de reacción del extremo 5' PLR-Fil (banda de aproximadamente 400 pares de base) se resolvió en un gel de agarosa preparativo al 1.5% y se purificó a partir de agarosa utilizando el estuche GENECLEAN II® kit (BIO 101 Inc.) . El fragmento del extremo 5' PLR-Fil purificado en gel (SEQ ID NO: 7) (50 ng) se utilizó con el estuche T7Quic:kPrime® de Pharmacia y [a-32P]dCTP, de acuerdo a las instrucciones del estuche, para producir una sonda radiomarcada (en 0.1 ml) que se purificó en 6 columnas BioSpin (Bio-Rad) y se adicionó a un ADN portador (0.9 ml de ADN de esperma del salmón cortado [Sigma] ) . Clasificación de la biblioteca - 600,000 ufp de la biblioteca de ADNc amplificada de P. taeda se sembraron en placa para la clasificación primaria, de acuerdo a las instrucciones de Stratagene. Las placas se transfirieron a círculos de membrana Magna Nylon (Micron Separations Inc.) que después se dejaron secar al aire. Las membranas se colocaron entre dos capas de papel Whatman® 3MM Chr. El ADN del fago de la biblioteca de ADNc se fijó a las membranas y se desnaturalizó en un paso mediante procedimiento de autoclave por 2 minutos a 100°C con escape rápido. Las membranas se lavaron por 30 minutos a 37°C en Error! Unknown switch argument. un citrato salino estándar 6X (SSC) y 0.1% de SDS y se prehibridizaron por 5 horas con suave agitación a 45 °C en SSC ßX precalentado, 0.5% SDS y reactivo de Denhardt 5X (solución de hibridización, 300 ml) en un plato de cristalización (190 x 75 mm) . La sonda radiomarcada [32P] (SEQ ID NO: 7) se desnaturalizó (por ebullición, 10 minutos) , se enfrió rápidamente (hielo 15 minutos) y se añadió a una solución de hibridización nueva (60 ml , 45°C) en un plato de cristalización (150 x 75 mm) . Las membranas prehibridizadas se añadieron después a este plato, que después se cubrió con envoltura plástica. La hibridización se realizó por 18 horas a 45°C con suave agitación. Las membranas se lavaron 4X SSC y en 0.5% SDS por 5 minutos a temperatura ambiente, se transfirieron a 2X SSC y 0.5% SDS (a temperatura ambiente) y se incubaron a 45°C por 20 minutos con agitación suave, se envolvieron con envoltura plástica para evitar el secado y finalmente se expuso a la película Kodak X-OMAT AR por 24 horas a -80°C, con pantallas de intensificación. Se purificaron veinte placas positivas a través de dos rondas más de clasificación con condiciones de hibridización como las anteriores. Escisión in vivo y secuenciación de fagómidos que conti enen ADNc para proteína de reductasa putativa - las clonas de ADNc purificadas se rescataron del fago siguiendo el protocolo de escisión in vivo de Stratagene. Las dos Error! Unknown switch argument. cadenas de las diferentes ADNc que codificaron para los genes homólogos a PLR-Fil se secuenciaron totalmente utilizando cebadores de secuenciación traslapantes. Dos ADNc se identificaron, pero solo uno de ellos difirió en las regiones 5 ' y 3 ' no traducidas en el sitio de inserción hacia el plásmido de clonación pBluescript SK[-] . Las diferencias entre estos dos ADNc fueron artefactos de clonación, por lo tanto, sólo un gen homólogo a la reductasa pinorresinol-laricirresinol de F. intermedia se clonó a partir de la biblioteca de ADNc del cultivo de suspensión celular P. taeda. La secuencia de nucleótidos de este gen de reductasa se muestra en (SEQ ID N0:1) que establece la secuencia que es común a los dos ADNc de reductasa, anteriores. Análisis de secuencia - los análisis de secuencia de aminoácidos y de ADN se efectuaron utilizando el Paquete Unix-oased GCG Wisconsin (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, E.U.A., 1994); Rice, P.

(The Sanger Centre, Hinston Hall, Cambridge, Inglaterra (1996)) y el servidor de biología molecular en la World Wide Web ExPASy (Geneva University Hospital and University of Geneva, Geneva, Switzerland) .

Error! Unknown switch argument.

EJEMPLO 2 Expresión de la proteína de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico como proteína de fusión en E. coli Expresión de la proteína de éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico en Escherichia coli como proteína de fusión - El cuadro de lectura abierto de la reductasa putativa de P. taeda estuvo dentro del cuadro respecto a la partícula de a-complementación del ß-galactosidasa en pBluescript . Por lo tanto, su ADN plásmido purificado se transformó dentro de las células NovaBlue de acuerdo a las instrucciones Novagen. Las células transformadas (cultivos de 5 ml) se cultivaron a 37°C con agitación (225 rpm) hasta fase logarítmica media (OD6oo=0.5) en medio LB suplementado con 12.5 µg ml de tetraciclina y 50 µg ml de ampicilina. Posteriormente se añadió IPTG (isopropil ß-D-tioglucopiranósido) a una concentración final de 10 mM y las células se dejaron crecer por 2 horas. Las células se recolectaron por centrifugación y se resuspendieron en 500 µl (por 5 ml de tubo de cultivo) como solución amortiguadora (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM ditiotreitol) . Después se añadió lisozima (5 µl de 0.1 mg ml"1, Research Organics, Inc.) y se después se incubó por 10 minutos, las células se usaron por sonicación (3 x 15 segundos) . Después de la Error! Unknown switch argument. centrifugación a 14,000 x g a 4°C por 10 minutos, el sobrenadante se retiró y se valoró respecto a las actividades de pinorresinol-laricirresinol reductasa y alcohol dehidrodiconiferílico reductasa (210 µl de sobrenadante por ensayo) como se describe aquí y en el Ejemplo 3. No se observó actividad de pinorresinol-laricirresinol reductasa en los extractos de E. coli que expresan la proteína como una fusión con las partículas de a-complementación del gen de ß-galactosidasa, incluso cuando se dejo incubar los ensayos por 24 horas, aunque se utilizó un sistema idéntico para producir (+) -pinorresinol/ (+) -laricirresinol reductasa catalíticamente activa a partir de F. intermedia (Dinkova-Kostova, A.T., et al . J. Biol . Chem . 271:29473-29482 (1996)). Ensayos radioquímicos de actividad de pinorresinol -laricirresinol reductasa - Se evaluó la actividad de pinorresinol reductasa supervisando la formación de [3H] laricirresinol y [3H] secoisolaricirresinol . Cada ensayo de la actividad de pinorresinol reductasa se consideró de 20 mM Bis-Tris Propano, pH 7.0, 0.4 mM (±) -pinorresinoles (añadidos) en 20 µl MeOH) y la preparación de enzima (es decir, extracto total de proteína de E. coli , 210 µl) . La reacción enzimática se inició por adición de 0.8 mM [4R-3H]NADPH (6.79 MBq/mmol). Después de 3 horas de incubación a 30°C con agitación, la mezcla del ensayo se Error! Unknown switch argument. extrajo con EtOAc (500 µl) , que contiene (±) -laricirresinol (20 µg) y (±) -secoisolaricirresinoles (20 µg) como portadores radioquímicos . Después de la centrifugación (17,00 x g, 5 min), los solubles en EtOAc se retiraron y el procedimiento de extracción continuó con 500 µl de EtOAc.

Para cada ensayo, los solubles de EtOAc se combinaron con una alícuota (100 µl) retirada para la determinación de su radioactividad, utilizando conteo por escintilación en líquido. El resto de los solubles en EtOAc combinados se evaporaron a sequedad, al vacío, se reconstituyeron con MeOH/H20 (3:7, 100 µl) y se sometieron al HPLC de fase inversa. Se evaluó la actividad de la laricirresinol reductasa supervisando la formación de [3H] secoisolaricirresinol . Los ensayos se llevaron a cabo exactamente como se describió antes, excepto que se utilizaron como substrato 0.4 mM (+) -laricirresinoles, y se añadieron (±) -secoisolaricirresinoles (20 µg) como portadores radioquímicos. El HPLC se llevó a cabo como ya se describió (Dinkova-Kostova, A.T., et al. J". Biol . Chem . 271:29473-29482 (1996)) para separar los substratos de lignano y los productos. En resumen, se amplió cromatografía de columna en fase inversa en columna Nova-pak C18 (3.5 mm x 150 mm, Waters) con un sistema de solventes isocrático que consiste de MeOH:ácido acético al 3% (en H20) (30:70) a una velocidad de flujo de 0.5 ml min" Error! Unknown switch argument. 1, se recolectaron fracciones de 0.5 ml para el conteo de escintilación a fin de determinar el nivel de incorporación de 3H dentro de los productos del ensayo. Ensayos de no radioactividad para la actividad de reductasa de pinorresinol -laricirresinol - la actividad de reductasa de pinorresinol se evalúa además en ensayos realizados como antes con las siguientes excepciones: el volumen total fue de 150 µl ; 4 mM NADPH (no radiactivo); 2mM (±) -pinorresinoles o (±) -laricirresinoles que se utilizaron como substratos, no se añadieron (±) -laricirresinoles o (±) -secoisolaricirresinoles como portadores radioquímicos, las reacciones se detuvieron con ebullición por 3 minutos, se añadieron 50 µl de MeOH para llevar la concentración a 30% y las mezclas de ensayo se centrifugaron (17,000 x g, 3 min) ; 150 µl de la mezcla resultante se inyectó directamente sobre el HPLC para determinar si se formaba algo de laricirresinol o de secoisolaricirresinol . Se encontró que los ensayos se dejaron continuar por 24 horas (es decir bajo condiciones que agotarían todo el substrato disponible con la reductasa de F. intermedia [PLR-Fil] y no se redujeron ni pinorresinol ni laricirresinol para dar respectivamente el laricirresinol o secoisolaricirresinol .

Error! Unknown switch argument.

EJEMPLO 3 Expresión de proteína nativa de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico (SEO ID NO: 2) en E. coli Transferencia de reductasa putativa hacia pSBETa El plásmido de sobre-expresión, pSBETa, contiene el cassette de expresión pET3a, con dos sitios de restricción disponibles para la subclonación (Ndel para expresión nativa y BamHI para expresión con una fusión pequeña) así como el gen argU (para la producción de ARNtarg4 de AGA-Arg raro) y resistencia a canamicina (para alta estabilidad de plásmido en cultivos líquidos) . Como la reductasa putativa de P. taeda no tiene sitios internos Ndel, se designaron dos cebadores para introducir los sitios Ndel en la metionina de inicio (cebador PT-ATG-Ndel :TTC AGG GCC CAT ATG GGA AGC AGG AGC AGG ATA CTC) (SEQ ID NO: 10) y la región no traducida del extremo 3' (cebador PT-Rev-Ndel : TGT CGA ATA CAT ATG AAA GGC GAT AAC CAÁ CAÁ TTT) (SEQ ID NO: 11) .

Estos dos cebadores (SEQ ID NO: 10) y (SEQ ID NO: 11) (5 pmol cada uno) se utilizaron en cinco reacciones PCR con 10 ng del ADNc (SEQ ID NO:l) que codifica para la reductasa putativa de P. taeda (SEQ ID NO: 2) como se describió antes y se subclonó en el plásmido pCRII de acuerdo a las instrucciones de Invitrogen. El pCRII resultante que contenía la reductasa putativa se purificó y digirió con Error! Unknown switch argument.

Ndel, con el gel purificado del fragmento resultante de aproximadamente 1 kb y se ligó al pSBETa previamente digerido con Ndel y se transformó en las células NovaBlue competentes. La construcción pSBET resultante que contiene a la reductasa putativa se purificó y la región de expresión, que contiene al ADNc deseado, se secuenció completamente en las dos cadenas para verificar que no se había introducido mutación durante el PCR. Procedimiento general de purificación de la enzima - los procedimientos de purificación de proteínas se llevaron a cabo a 4°C, monitoreando los eluyentes cromatográficos a 280 mm. Las concentraciones de proteína se determinaron con el estuche de determinación de proteínas de BioRad. La electroforesis en gel de poliacrilamida utilizó geles gradiente (4-15%, gradiente lineal, BioRad) bajo condiciones de desnaturalización y reducción en el sistema de amortiguamiento Laemmli, seguido por la visualización de las proteínas con tinción de plata. Sobre -expresión de enzima nativa (SEQ ID NO : 2) en E. coli - el plásmido pSBETa resultante que contiene la reductasa putativa de P. taeda (SEQ ID NO: 2) se transformó en células B834(DE3) de E. coli para su expresión. La expresión de alto nivel de la reductasa putativa (SEQ ID NO: 2) se logró inoculando 1 litro de caldo LB suplementado con 50 µg • ml de canamicina, con 2 a 4 ml de un cultivo de Error! Unknown switch argument. 10 ml , que se dejo cultivar por toda la noche, en el mismo medio. Las células después se dejaron crecer a 37°C con agitación a 250 rpm hasta una densidad de OD6oo=0.65, punto en el cual las condiciones de crecimiento cambiaron a 20°C con agitación a 265 rpm. La producción de la reductasa (SEQ ID NO: 2) se indujo por adición de IPTG a una concentración final de 1 mM, una vez que las células habían llegado a una temperatura de aproximadamente 22 °C (aproximadamente 30 minutos después de que se apagó la temperatura del incubador) . Después las células se dejaron crecer por 21 horas antes de cosecharlas por centrifugación por 25 minutos a 3000 xg en 4 botellas de centrífuga de 250 ml , después de lo cual los granulos se congelaron por lo menos 2 horas a -80°C, para ayudar a la lisis celular. Preparación de la proteína cruda - los cuatro granulos de células E. coli obtenidos en los pasos previos se descongelaron a temperatura ambiente y se resuspendieron en 2x 10 ml cada uno, de Amortiguador A (20 mM Tris-HCl, pH 8.0; 2 mM ácido etilendiamino tetra-acético [EDTA]; 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF]; (Paré, P.W., Wang, H. B., Davin, L.B. & Lewis, N.G. Tetrahedron Lett, 35:4731-4734 (1994)) 5 mM ditiotreitol [DTT], después se combinaron y sonicaron por 3 x 30 s. Los sonicados se centrifugaron por 30 minutos a 20,000 xg para aglomerar los restos celulares y se filtraron a través de un filtro jeringa de Error! Unknown switch argument. 0.2 µm. El filtrado resultante (290 ml) se sometió a una precipitación con sulfato de amonio, con un corte de saturación con sulfato de amonio al 40-70%, después se centrifugaron por 30 minutos a 20,000 xg, se precipitaron por desalificación en Amortiguador A sobre columnas de desalificación PD-10 (Pharmacia) . Purificación en columna de afinidad (gel Affi -Blue) - se pre-equilibró una columna de gel azul Affi-Gel (BioRad) de 1.6 cm de diámetro y 11.5 cm de largo (volumen del lecho 23 ml) en Amortiguador A. El corte de desalificación fue a 40-70% (15 ml , 513 mg) que se aplicó en la columna. Después del lavado con 300 ml de Amortiguador A (1 ml-min"1), la reductasa (SEQ ID NO:2) se eluyó haciendo correr un gradiente lineal de 0 a 100% de Amortiguador B (Amortiguador A + 5 M NaCl) en 500 mL, contenida en 100% de Amortiguador B para 60 mL y regresando de 100% de Amortiguador B a 100% de Amortiguador A en 30 ml . Se recolectaron fracciones de 4 ml , en donde la reductasa putativa (SEQ ID NO: 2) se eluyó en fracciones 33-43. Estas fracciones después se reunieron, se concentraron a aproximadamente 5mg/ml en un microconcentrador Centricon 10 (Amicon, Inc.), se desalificaron sobre columnas PD10 y se valoró su actividad. Cromatografía de intercambio aniónico - La solución enzimática resultante (118 mg) se aplicó después a Error! Unknown switch argument. una columna de intercambio aniónico de Perfusión POROS 20 QE, pre-equilibrada en Amortiguador C (50 mM Bis-Tris Propano, pH 6.8 , 5 mM DTT) y se eluyó en la carga (es decir no se unió a la columna) , mientras que la mayoría de las proteínas de E. coli contaminantes quedaron unidas a la columna de intercambio aniónico bajo estas condiciones. Cromatografía de intercambio catiónico - la solución enzimática resultante (59 mg) se aplicó después a una columna de intercambio catiónico POROS 20 SP Perfusión, pre-equilibrada en Amortiguador C (50 mM Bis-Tris Propano, pH 6.8, 5 mM DTT) y se eluyó en la carga (es decir no se unió a la columna) mientras que la mayoría del resto de las proteínas E. coli contaminantes quedaron no ligadas a la columna de intercambio catiónico bajo estas condiciones, se obtuvieron 36 mg de la proteína reductasa putativa purificada (SEQ ID NO: 2) . Caracterización enzimática - se determinó la temperatura óptima y el pH utilizando condiciones de ensayo estándares (no radioactivas) como se describe aquí, excepto que la concentración de amortiguador se cambió a 19 mM y la proteína después del paso cromatográfico en la columna Affi-Blue fue la que se utilizó (30 µl) . El análisis de formación de producto se investigó por análisis HPLC de fase inversa, con las siguientes excepciones: para temperatura óptima, se realizaron incubaciones a pH Error! Unknown switch argument. constante (7.0) variando la temperatura (6 - 58°C) , para pH óptimo, se desarrollaron incubaciones a temperatura constante (30°C) variando el pH (5.5 - 9.5) . La cinética de velocidad inicial se analizó valorando la actividad proteica bajo condiciones estándares (no radioactiva) a pH 7.0, pero con once concentraciones diferentes de substrato de lignano (0.167 - 2.5 mM) y a 22 °C por 6 horas, mientras que se mantenía constante la concentración NADPH a 5 mM. Para determinar si se utilizó el 4P ó 4S-hidruro del cofactor NADPH en la reducción catalizada por la enzima, se desarrollaron análisis radioquímicos con etiquetas específicas ( 4R- [3H] NADPH o 4S-[3H] NADPH y se analizó la incorporación radioquímica en el producto del alcohol 7-0-4 ' - (iso) dihidrodehidrodiconiferílico . Valoración radioquímica de la actividad de alochol dehidrodiconiferílico reductasa - El ensayo de 150 µl consistió de 19 mM MES:Bis-Tris Propano, pH 6.5, 20 µl de la solución proteica a la correspondiente etapa de pureza, 5 mM DTT, 2.5 mM de alcoholes (±) -dehidrodiconiferílico y 5 M 4R- [3H] NADPH (14.2 x 103 kBq-mmol"1) . Después de 6 horas de incubación a 22 °C, la mezcla del ensayo se extrajo con EtOAc (2 x 500 µl) . La fracción soluble en EtOAc se evaporó a sequedad, al vacío, se reconstituyó en 100 µl de CH3CN:3 % ácido acético (1:9) y se sometió a HPLC de fase inversa como se describe aquí, Error! Unknown switch argument. con detección radioquímica y UV. Las fracciones de un ml se recolectaron y una alícuota (100 µl) de cada una se retiró por conteo de escintilación para determinar el nivel de incorporación de 3H en los productos de ensayo. También se desarrollaron controles utilizando enzima desnaturalizada (5 min, 100°C) o sin substrato de alcohol (±) -dehidrodiconiferílico, . Ensayos no radioactivos para actividad de alcohol dehidrodiconiferílico reductasa - Cada ensayo de 150 µl consistió de 22 mM MES:Bis-Tris Propano, pH 6.5, 20 µl de solución de proteína en la etapa correspondiente de pureza, 5 mM DTT, 2 mM de alcoholes (+) -dehidrodiconiferílicos y 4 mM NADPH. Después de 3 horas de incubación a 30°C, la mezcla de ensayo se sometió a ebullición por 3 minutos y se centrifugó (17,000 xg, 3 min) con una alícuota (125 µl) sometida a HPLC de fase inversa, después 16.6 µl de CH3CN se añadieron. La cuantificación de la formación del alcohol 7-0-4 ' -dihidrodehidrodiconiferílico se midió utilizando una curva estándar, previamente preparada. También se realizaron controles utilizando enzima desnaturalizada (5 min, 100°C) y sin alcoholes (±) -dehidrodiconiferílicos, como substrato. HPLC separación de alcoholes dehidrodiconif erílicos y sus productos reducidos - la separación del alcohol dehidrodiconiferílico, del alcohol Error! Unknown switch argument. dihidrodehidrodiconiferílico (enlaces 7 ', 8 ' -alílicos reducidos), alcohol 7-0-4 ' - (iso) dihidrodehidrodiconiferílico y alcohol 7 ' , 8 ' , 7-0-4 "-tetrahidrodehidrodiconiferílico se logró en una columna de fase inversa (Symmetry Shield RP8, 3.9 mm x 150 mm, Waters, Inc.) utilizando un acetonitrilo: ácido acético al 3% (en H20) , como sistema solvente, en la siguiente forma. La columna se pre-equilibró en CH3CN:3% ácido acético (A:B, 1:9) . Después de la inyección de la muestra que se va a analizar, se logró la elución de los tres compuestos utilizando el siguiente perfil de elución: A:B (1:9) por 5 minutos, después un gradiente lineal en un término de 30 minutos a A:B (25:75) y finalmente un gradiente lineal a 100% A sobre 25 minutos, con una velocidad de flujo de 1 ml-min"1. Valoración de la actividad de alcohol 7 ' , 8 ' -dihidrodehidrodiconif erílico reductasa - Se desarrollaron ensayos utilizando substratos marcados y no marcados como se describe antes para el alcohol (±) -dehidrodiconiferílico, pero como substrato se añadió alcohol 7 ' , 8 ' -dihidrodehidrodiconiferílico . Como la reductasa (SEQ ID NO: 2) no mostró habilidad para reducir pinorresinol o laricirresinol, al expresarse como una proteína de fusión de ß-galactosidasa, se intentó la expresión nativa. El plásmido de sobre- Error ! Unknown switch argument . expresión, pSBETa, contiene al cassette de expresión pET3a, sin sitios de restricción disponibles para la subclonación (Ndel para expresión nativa y Ba HI para expresión con una pequeña fusión) , así como un gen argU (para la producción de AR?targ4 AGA-Arg raro) y resistencia a canamicina (para estabilidad alta de plásmidos en cultivos líquidos) . Como la reductasa putativa de P. taeda no tenía sitios internos Ndel , la subclonación en el pSBETa fue relativamente directa. Dos cebadores se utilizaron en las reacciones PCR para introducir los sitios Ndel en la metionina de inicio (cebador PT-ATG-?del) (SEQ ID ?O:10) y la región del extremo 3' no traducida (cebador PT-Rev-?del) (SEQ ID ?O:ll) de la reductasa putativa (SEQ ID ?O:2). El fragmento PCR resultante se subclonó en un plásmido de clonación PCR (pCRII, Invitrogen) y se separó por escisión con ZVdel . El fragmento de aproximadamente 1 kb que contiene la reductasa putativa (SEQ ID ?O:2) se purificó en gel y se ligó dentro del pSBETa, que se había digerido previamente con Ndel . La construcción pSBET resultante que contiene a la reductasa putativa (SEQ ID ?0:2) se transformó en las células E. coli competentes, se purificó y la región de expresión que contenía al AD?c deseado, se secuenció completamente en las dos cadenas para verificar que no se hubieran introducido mutaciones durante la PCR. Inducción de la reductasa putativa (SEQ ID ?O:2) Error! L'nknown switch argument. en el sistema de sobre-expresión pSBET se logró transformando las células de expresión B834(DE3) con la construcción pSBET y después cultivando cuatro cultivos de 1 litro en caldo LB suplementado con 50 µg-ml"1 de canamicina hasta que se llevó a una densidad de OD6oo=0.6 , tiempo en el cual se enfriaron a aproximadamente 22 °C y se inocularon con IPTG a una concentración final de 1 mM. Después de crecer por 21 horas a aproximadamente 20-22°C, las células se recolectaron por centrifugación. La purificación de la enzima nativa expresada heterólogamente (SEQ ID NO: 2) hasta una homogeneidad aparente se logró en cuatro pasos cromatográficos después de la lisis celular (como se establece aquí) y los restos celulares se retiraron por centrifugación. El primer paso empleó precipitación con sulfato de amonio, y la proteína deseada formó granulos a un corte de saturación de 40-70%. Esta fracción de la proteína (513 mg) se desalificó en Amortiguador A y se aplicó a una columna de afinidad (gel Affi Blue) y se eluyó con un gradiente salino lineal. La proteína resultante (118 mg) se desalificó de nuevo en el Amortiguador A y después se sometió a intercambio aniónico consecutivo (POROS 20 QE) y a intercambio catiónico (POROS 20 SP) . Estas dos cromatografías se llevaron a cabo bajo condiciones (pH 6.8) en donde la proteína deseada no se unía, mientras que las proteínas contaminantes de E. coli Error! Unknown switch argument. si se unían y de esta manera se retiraban. Adicionalmente, después de cada paso, la reductasa (SEQ ID NO: 2) se valoró para determinar actividad de reductasa en pinorresinol-laricirresinol, pero ninguna de estas actividades se detectó. Además, incluso después de que la reductasa (SEQ ID NO: 2) se purificó casi a la homogeneidad, fue todavía incapaz de reducir pinorresinol o laricirresinol . Ya que esta reductasa putativa de Pinus taeda estaba alineada estrechamente a los "homólogos" de reductasa isoflavona/pinorresinol-laricirresinol , con base en la similitud de la secuencia de aminoácidos deducida, se consideró entonces una función alternativa. En este aspecto, como el alcohol dehidrodiconiferílico contiene una estructura capaz de formar una enona conjugada y como P. taeda puede contener niveles significativos del alcohol dehidrodiconiferílico y los metabolitos del mismo, a continuación evaluamos la reductasa (SEQ ID NO: 2) respecto a su capacidad para reducir el alcohol dehidrodiconiferílico, ya sea en la posición alílica o en la posición del éter bencílico, ésta última fue análoga a lo catalizado por la pinorresinol-laricirresinol reductasa (Gang, D.R., Fujita, M., Davin, L.B. & Lewis, N.G. ACS Symp . Ser. 697:389-421 (1998). Antes de que pudieran analizarse estas Error! Unknown switch argument. reacciones, las condiciones de separación HPLC del alcohol dehidrodiconiferílico, el alcohol 7 ' , 8 ' -dihidrodehidrodiconiferílico (enlace alílico reducido) , el alcohol 7-0-4 " (iso) dihidrodehidrodiconiferílico (éter bencílico reducido) y el alcohol 7 ' , 8 ' , 7-0- 4 "tetrahidrodehidrodiconiferílico (se redujeron el enlace alílico y el enlace bencílico) tuvo que desarrollarse. Esto se logró utilizando un sistema solvente de gradiente de acetonitrilo : 3% ácido acético (en H20) como se establece arriba. Este sistema solvente proporcionó una separación cercana a la línea basal de los cuatro lignanos, como se muestra en la Figura 1A. La valoración de la reductasa putativa (SEQ ID NO: 2) respecto a la actividad de alcohol dehidrodiconiferílico reductasa (ya sea éter alílico o bencílico) se desarrolló como ya se describió. Como se muestra en la Figura IB, los efectos de la reductasa purificada de P. taeda son la reducción del enlace éter bencílico del alcohol dehidrodiconiferílico para convertirlo en el alcohol 7-0-4 ' - (iso) ihidrodehidrodiconiferílico . La actividad de la reduc:asa putativa de P. taeda (SEQ ID NO: 2) hacia el alcohol dehidrodiconiferílico en todos los pasos del esquema de purificación se menciona en el Cuadro 1.

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Cuadro 1 Esquema de purificación de la éter bencílico reductasa a partir de Pinus taeda (SEQ ID NO: 2) La autenticidad del substrato y el producto se determinaron utilizando LC-MS (ver Figura ID y 1E) . Por lo tanto, los "homólogos" de isoflavona/pinorresinol- laricirresinol reductasa parecen ser, en la actualidad, una éter bencílico reductasa de fenilcumarina (PCBER) capaz de reducir el alcohol dehidrodiconiferílico en la posición 7- 0-4 ' . Como se muestra en el Cuadro 2, la caracterización inicial de la enzima (SEQ ID NO: 2) reveló una meseta a pH óptimo de 6.5 a 7.0 y una temperatura óptima a 49°C. Además, ésta es una reductasa Tipo A, con transferencia del Error! Unknown switch argument. híbrido del cofactor NADPH que se presenta casi exclusivamente a partir de la posición 4.R- en el anillo de nicotinamida (Cuadro 2) .

Cuadro 2 Propiedades de la éter bencílico reductasa (SEQ ID NO: 2) a partir de Pinus taeda Cuando se probó el alcohol 7',8'- dihidrodehidrodiconiferílico como el substrato, la reducción del éter bencílico también se logró, como se prueba por la formación del alcohol tetranidrodehidrodiconiferílico (ver Figuras 1C y 1F) . Se llevaron a cabo estudios de velocidad inicial con objeto de determinar si la éter bencílico reductasa de P. taeda (SEQ ID NO : 2 ) prefería a uno de estos substratos Error! Unknown switch argument. sobre el otro. Estos resultados se mencionan en el Cuadro 2. Como puede observarse, la actividad específica (Vmax) es 2 veces superior para el alcohol dehidrodiconiferílico como substrato que para el alcohol 7 ' , 8 ' -dihidrodehidrodiconiferílico . Además, la KM para la reducción del alcohol dehidrodiconiferílico es 3 veces menor que la KM para la reducción del alcohol 7 ' , 8 ' -dihidrodehidrodiconiferílico . Es interesante observar el efecto cinético del isótopo (V1H/V3H) (que indica que el paso de transferencia de híbrido de la reacción contribuye al paso de límite de velocidad de la reacción) es significativamente superior para la reducción del alcohol dehidrodiconiferílico. Cuando el alcohol dehidrodiconiferílico es el substrato, la transferencia del híbrido contribuye significativamente (como se indica en el efecto de isótopo cinético alto V1H/V3H=14.4) al paso limitante de velocidad de la reacción catalizada con enzima. Cuando el alcohol 7 ',8'-dihidrodehidrodiconiferílico se proporciona como substrato, el efecto de isótopo cinético se reduce a V1H/V3 =4.0, indicando que la transferencia del híbrido ya no contribuye significativamente al paso de limitación de velocidad de la reacción. Esto también tiene el propósito de aumentar significativamente el valor KM para la reducción del alcohol 7 ', 8 ' -dihidrodehidrodiconiferílico, indicando que Error! Unknown switch argument. la unión del substrato es mucho menos eficiente para este lignano que para el alcohol dehidrodiconiferílico. Estos resultados indican que la éter bencílico reductasa de P. taeda (SEQ ID NO: 2) tiene una afinidad significativamente superior para el alcohol dehidrodiconiferílico, como substrato.

EJEMPLO 4 Clonación de las ADNc reductasas para alcohol dehidrodiconiferílico (SEO ID NO : 3 ) v (SEO ID NO:5). a partir de Cryp tornería japónica Síntesis de biblioteca de ADNc de Cryptomeria japónica - el ARN total (200 µg/g en fresco) se obtuvo utilizando el método de Dong y Dunsten (Dong, J.Z. & Dunstan, D.I. Plant Cell Reports 15 (1996)) a partir de hojas del árbol C. japónica cultivadas en un invernadero.

La biblioteca de ADNc de C. japónica se construyó utilizando 5 µg de poli (A) + ARNm (Oligotex-dT™ Suspensión, Qiagen) con el estuche de síntesis ZAP-cDNA®, el vector Uni ZAPMR XR y el extracto de paquete Gigapack® II Gold (Stratagene), con un título de 2.2 X 106 ufp para la biblioteca primaria. La biblioteca amplificada (8.3 X 109 ufp/ml; 175 ml total) se utilizó para la clasificación (Dinkova-Kostova, A.T., et al . J. Biol . Chem . 271, 29473-29482 (1996) ) .

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Síntesis de la sonda de ADN - el plásmido pSBETa que contiene la ADNc de la reductasa para el alochol dehidrodiconiferílico de P. taeda (5 ng) (SEQ ID N0:1) se utilizó como el molde en cinco de las reacciones de 100 µl de PCR (10 mM Tris-HCl [pH 9.0], 50 mM KC1 , 0.1% Tritón X-100, 2.5 mM MgCl2, 0.2 mM de cada unidades dNTP y 2.5 unidades de Taq ADN polimerasa) con cebadores Cj-PCBERNT (100 pmol) (SEQ ID NO: 12) y Cj-PCBERCT (100 pmol) (SEQ ID NO: 13) . Las amplificaciones PCR se llevaron a cabo en un termociclizador en la siguiente forma: 35 ciclos en 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 50°C y 3 minutos a 72°C, con 5 minutos a 72 °C y una retención indefinida a 4°C después del ciclo final . Como controles se llevaron a cabo reacciones de un solo cebador, solamente el molde y solamente el cebador. Las 5 reacciones se concentraron (Microcon 30, Amicon Inc.) y se lavaron con amortiguador TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA; 2 x 200 µl) , con el producto PCR que se recuperó subsecuentemente en el amortiguador TE (2 x 50 µl) . El producto PCR (banda de aproximadamente 980 pares de bases) se resolvió en un gel preparativo de agarosa al 1.0% y se purificó a partir de agarosa utilizando el estuche GENECLEAN II® (BIO 101 Inc.). El producto PCR purificado en gel (40 ng) se utilizó con el estuche T7QuickPrime® de Pharmacia y [a-32P]dCTP, de acuerdo Error! Unknown switch argument. a las instrucciones del estuche, para producir una sonda radiomarcada (en 0.1 ml) , que se purificó sobre columnas BioSpin 6 (Bio-Rad) y se añadió a un ADN portador (0.5 mg/ml de ADN de esperma de salmón dividido [Sigma], 0.9 ml) . Clasificación de biblioteca - 300,000 ufp de la biblioteca de ADNc amplificada de C. japónica se cultivaron en placa para una clasificación primaria, de acuerdo a las instrucciones de Stratagene. Las placas se transfirieron sobre círculos de membrana Magna Nylon (Micron Separations Inc.), que después se dejaron secar al aire. Las membranas se colocaron entre dos capas de papel Whatman® 3MM Chr. El ADN del fago de la Biblioteca de ADNc se fijó a las membranas y se desnaturalizó en un paso mediante tratamiento con autoclave por 2 minutos a 100°C con escape rápido. Las membranas se lavaron por 30 minutos a 37°C en citrato salino estándar 6X (SSC) y SDS al 0.1% y se prehibridizaron por 5 horas con agitación suave a 49°C en 6X SSC precalentado, SDS al 0.5% y 5X reactivo de Denhardt (solución de hibridización, 300 ml) en un plato de cristalización (190 x 75 mm) . La sonda radiomarcada con [32P] se desnaturalizó (ebullición, 10 minutos) , se enfrió rápidamente (hielo, 15 minutos) y se añadió una solución precalentada de hibridización reciente (60 ml , 49°C) en un plato de cristalización (150 x 75 mm) . Las membranas Error! Unknown switch argument. prehibridizadas se añadieron después a este plato, que después se cubrió con envoltura plástica. La hibridización se efectuó por 18 horas a 49°C con agitación suave. Las membranas se lavaron en 4X SSC y SDS al 0.5% por 5 minutos a temperatura ambiente, se transfirieron a 2X SSC y 0.5% SDS (a temperatura ambiente) y se incubaron a 49°C por 20 minutos con suave agitación, envolviéndose con envoltura plástica para evitar el secado y finalmente se expusieron a la película Kodak X-OMAT AR por 24 horas a -80°C con pantallas intensificadoras . Se purificaron veinte placas positivas a través de dos rondas de clasificación con condiciones de hibridización como las anteriores y se encontró que dos codificaban la enzima esperada. La excisión y secuenciación in vivo de las clonas de ADNc purificadas de los fagómidos pCj-PCBERl y pCj -PCBER2 - se rescataron del fago siguiendo el protocolo de escisión in vivo de Stratagene. Las dos cadenas de las 2 diferentes ADNc (pCj-PCBERl (SEQ ID NO: 3) y pCj-PCBER2 (SEQ ID NO:5)) se secuenciaron completamente utilizando los cebadores de secuenciación traslapantes.

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EJEMPLO 5 Propiedades de las proteínas de la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico, actualmente preferidas de la presente invención Las proteínas de la éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico preferidas de esta invención son reductasas dependientes de NADPH que tienen un peso molecular (según se determina por SDS PAGE) de desde aproximadamente 33 kDa hasta aproximadamente 34 kDa, a un pH óptimo en el intervalo de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 7.0 y un valor pl (generado en computadora) de entre aproximadamente 6.0 y 7.0. Adicionalmente, las proteínas de éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico que más se prefieren de esta invención tienen un Vmax de 104.2 ± 10.8 nmol/h/mg y un Km de 0.61 ± 0.03 mM. Las proteínas de éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico actualmente preferidas de esta invención (y los ácidos nucleicos que las codifican) provienen de especies vegetales de gimnoespermas o angioespermas . Mientras que se han ilustrado y descrito las modalidades preferidas de la invención, será evidente que pueden hacerse varios cambios sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

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Listado de Secuencias I. Características de la Secuencia SEQ ID NO: 1 (A) Longitud: 926 pares de bases (B) Tipo: nucleótidos II. Tipo de molécula: ADN III. Organismo: Pinus taeda atg gga age agg age agg ata etc cta att ggc gca acá gga tac att 48 Met Gly Ser Arg Ser Arg lie Leu Leu lie Gly Ala Thr Gly Tyr lie 1 5 10 15 ggt cgc cat gtt gcc aag gct age ctt gat etc ggc cat ccc acc ttc 96 Gly Arg His Val Ala Lys Ala Ser Leu A=p Leu Gly His Pro Thr Phe 20 25 30 ctt ctg gtt aga gag tec act gct tet tet aat tet gag aaa gcc cag 144 Leu Leu Val Arg Glu Ser Thr Ala Ser Ser Asn Ser Glu Lys Ala Gln 35 40 45 etc ctg gaa tec ttc aag gcc tet ggt gct aat ata gtc cat gga tec 192 Leu Leu Glu Ser Phe Lys Ala Ser Gly Ala Asn lie Val His Gly Ser 50 55 60 ata gat gat cat gca age ctt gtg gag gca gtg aag aat gtg gat gta 240 lie Asp Asp His Ala Ser Leu Val Glu Ala Val Lys Asn Val A=p Val 65 70 75 80 gta atc tec acá gtt gga tca cta cag ata gag age cag gtc aat att 288 Val lie Ser Thr Val Gly Ser Leu Gln lie Glu Ser Gln Val Asn He 85 90 95 atc aag gct att aaa gaa att gga acc gtc aag agg ttt ttt cea tet 336 lie Lys Ala He Lys Glu He Gly Thr Val Lys Arg Phe Phe Pro Ser 100 " "" 105 110 gag ttc ggg aat gat gtt gat aac gtc cat gca gtg gag cct gca aag 384 Glu Phe Gly Asn Asp Val Asp Asn Val His Ala Val Glu Pro Ala Lys 115 120 125 aat gtg ttt ?iag gtg aaa gcc aaa gtc cgt agg gca atc gaa gca gag 432 Asn Val Phe Glu Val Lys Ala Lys Val Arg Arg Ala He Glu Ala Glu 130 135 140 ggt att cct t.at acá tac gtc tet age aac tgt ttt gca ggg tat ttc 480 Gly He Pro Tyr Thr Tyr Val Ser Ser Asn Cys Phe Ala Gly Tyr Phe 145 150 155 160 ctg cga age etc gca cag gct ggc cta acá gct cct cea aga gat aaa 528 Leu Arg Ser Leu Ala Gln Ala Gly Leu Thr Ala Pro Pro Arg Asp Lys 165 170 175 gtt gtc att ctt gga gat gga aat gcc aga gtt gtc ttt gta aaa gag 576 Val Val He Leu Gly Asp Gly Asn Ala Arg Val Val Phe Val Lys Glu 180 185 190 gaa gac att gga acá ttt acá atc aag gca gtg gac gac ccc aga acg 624 Glu Asp He Gly Thr Phe Thr He Lys Ala Val Asp Asp Pro Arg Thr 195 200 205 ttg aac aag acc tta tac ttg agg ctt cct gcc aat act ctg tet tta 672 Leu Asn Lys Thr Leu Tyr Leu Arg Leu Pro Ala Asn Thr Leu Ser Leu aat gag ctt gtg gct etc tgg gag aag aag att gat aag act ctg gag 720 Asn Glu Leu Val Ala Leu Trp Glu Lys Lys He Asp Lys Thr Leu Glu 225 230 235 240 aag gcc tac gtg ccc gag gag gag gtt ctt aaa tta atc gca gat acá 768 Lys Ala Tyr Val Pro Glu Glu Glu Val Leu Lys Leu He Ala Asp Thr 245 250 255 cea ttc cea gct aat att age ata gca att agt cat tet atc ttc gtg 816 Pro Phe Pro Ma Asn He Ser He Ala He Ser His Ser He Phe Val 260 265 270 aaa gga gat caá acá aat ttt gaa att gga cct gct ggt gta gag gct 864 Lys Gly Asp Gln Thr Asn Phe Glu He Gly Pro Ala Gly Val Glu Ala 275 280 285 agt cag ctg tac cct gat gtg aaa tac acc acc gtc gac gag tac ctg 912 Ser Gln Leu Tyr Pro A=p Val Lys Tyr Thr Thr Val Asp Glu Tyr Leu 290 295 300 age aat ttt cftg tg 926 Ser Asn Phe Val 305 I. Características de la Secuencia SEQ ID NO: 2 (A) Longitud: 308 residuos de aminoácidos (B) Tipo: aminoácidos II. Tipo de molécula: Proteína III. Organismo: Pinus taeda Met Gly Ser Arg Ser Arg He Leu Leu He Gly Ala Thr Gly Tyr He 1 5 10 15 Gly Arg His Val Ala Lys Ala Ser Leu Asp Leu Gly His Pro Thr Phe 20 25 30 Leu Leu Val Arg Glu Ser Thr Ala Ser Ser Asn Ser Glu Lys Ala Gln 35 40 45 Leu Leu Glu Ser Phe Lys Ala Ser Gly Ala Asn He Val His Gly Ser 50 55 60 He A=p Asp His Ala Ser Leu Val Glu Ala Val Lys Asn Val Asp Val 65 70 75 80 Val He Ser Thr Val Gly Ser Leu Gln He Glu Ser Gln Val Asn He 85 90 95 He Lys Ala He Lys Glu He Gly Thr Val Lys Arg Phe Phe Pro Ser 100 105 110 Glu Phe Gly Asn Asp Val Asp Asn Val His Ala Val Glu Pro Ala Lys 115 120 125 Asn Val Phe Glu Val Lys Ala Lys Val Arg Arg Ala He Glu Ala Glu 130 135 140 Gly He Pro Tyr Thr Tyr Val Ser Ser Asn Cys Phe Ala Gly Tyr Phe 145 150 155 160 Leu Arg Ser Leu Ala Gln Ala Gly Leu Thr Ala Pro Pro Arg Asp Lys 165 170 175 Val Val He Leu Gly Asp Gly Asn Ala Arg Val Val Phe Val Lys Glu 180 185 190 Glu Asp He Gly Thr Phe Thr He Lys Ala Val Asp Asp Pro Arg Thr 195 200 205 Leu Asn Lys Thr Leu Tyr Leu Arg Leu Pro Ala Asn Thr Leu Ser Leu 210 215 220 Asn Glu Leu Val Ala Leu Trp Glu Lys Lys He Asp Lys Thr Leu Glu 225 230 235 240 Lys Ala Tyr Val Pro Glu Glu Glu Val Leu Lys Leu He Ala Asp Thr 245 250 255 Pro Phe Pro Ala Asn He Ser He Ala He Ser His Ser He Phe Val 260 265 270 Lys Gly Asp Gln Thr Asn Phe Glu He Gly Pro Ala Gly Val Glu Ala 275 280 285 Ser Gln Leu Tyr Pro Asp Val Lvs Tyr Thr Thr Val Asp Glu Tyr Leu 290 295 300 Ser Asn Phe Val 305 I. Características de la Secuencia SEQ ID NO: 3 (A) Longitud: 918 pares de bases (B) Tipo: nucleótidos II. Tipo de molécula: ADN III. Organismo: Cryptomeria japónica atg gga gga agt agg gtt ttg ata ata gga gga act ggt tac att ggt 48 Met Gly Gly Ser Arg Val Leu He He Gly Gly Thr Gly Tyr He Gly 1 5 10 15 aga cat gtg acc aat gca age ctt gcc caá ggt cae ccc act ttc etc 96 Arg His Val Thr Asn Ala Ser Leu Ala Gln Gly His Pro Thr Phe Leu 20 25 30 ctt gtt agéi gaa atc acá cct tec aac cct gaa aag gcc cag ctg cta 144 Leu Val Ar?r Glu He Thr Pro Ser Asn Pro Glu Lys Ala Gln Leu Leu 35 40 45 gag tec ttc acá tec aaa gga gca act ctg gtt caá ggg tec ata gat 192 Glu Ser Phe Thr Ser Lys Gly Ala Thr Leu Val Gln Gly Ser He Asp 50 55 60 gat cat gca age ctt gta gca gca ctg aag aag gtg gat gta gtc att 240 Asp His Ala Ser Leu Val Ala Ala Leu Lys Lys Val Asp Val Val He 65 70 75 80 tca acá ttg ggt gca cea cag ata gca gat cag ttc aat cta atc aag 288 Ser Thr Leu Gly Ala Pro Gln He Ala Asp Gln Phe Asn Leu He Lys 85 90 95 gct atc aaa gaa gtt gga act att aag agg ttt ttc cea tca gag ttt 336 Ala He Lys Glu Val Gly Thr He Lys Arg Phe Phe Pro Ser Glu Phe 100 105 110 ggg aat gat gtt gat aag cae cat gca gtg gag cct atg aag agt atg 384 Gly Asn Asp Val Asp Lys His His Ala Val Glu Pro Met Lys Ser Met 115 120 125 ttt gac ttg aaa atc aaa ctt cgc cgg act att gag gca gaa ggc att 432 Phe Asp Leu Lys He Lys Leu Arg Arg Thr He Glu Ala Glu Gly He 130 135 140 cea cat acá tat gtt gtt cea cat tgt ttt gca ggc tac ttt ctt act 480 Pro His Thr Tyr Val Val Pro His Cys Phe Ala Gly Tyr Phe Leu Thr 145 150 155 160 aat ctt gca cag ctt ggg cta gct gcc ccg cea agg gat aaa att gtt 528 Asn Leu Ala Gln Leu Gly Leu Ala Ala Pro Pro Arg Asp Lys He Val 165 170 175 att tat gga gat gga act acc aaa gct gta tat atg aag gaa gaa gat 576 He Tyr Gly Asp Gly Thr Thr Lys Ala Val Tyr Met Lys Glu Glu Asp 180 185 190 att ggg acá ttc acá atc aag gca gtg gat gat cea agg acc ttg aac 624 He Gly Thr Phe Thr He Lys Ala Val A=p A=p Pro Arg Thr Leu Asn 195 200 205 aag acc etc tac ttg aag cct cct gcc aat act atc tec acc aat gat 672 Lys Thr Leu Tyr Leu Lys Pro Pro Ala Asn Thr He Ser Thr Asn Asp 210 • 215 220 etc gta gcc ctt tgg gag gca aag ata ggg aag act ttg gag aag gtc 720 Leu Val Ala Leu Trp Glu Ala Lys He Gly Lys Thr Leu Glu Lys Val 225 230 235 240 tat cta tet gag gag cag gtt ctt aaa cta etc caá gat acá cea ttt 768 Tyr Leu Ser Glu Glu Gln Val Leu Lys Leu Leu Gln Asp Thr Pro Phe 245 250 255 cea ggg act ttt atg gta tec att ttt cae acc att tat gtg aaa gga 816 Pro Gly Thr Phe Met Val Ser He Phe His Thr He Tyr Val Lys Gly 260 265 270 gat caá acc aat ttt cag att gga cct gat ggg gtt gag gcc agt gcg 864 Asp Gln Thr Asn Phe Gln He Gly Pro Asp Gly Val Glu Ala Ser Ala 275 280 285 ctg tac cea gat gtg aaa tat acá act gtt gaa gag tac atc agt gca 912 Leu Tyr Pro Asp Val Lys Tyr Thr Thr Val Glu Glu Tyr He Ser Ala 290 295 300 ttt gta 918 Phe Val 305 I. Características de la Secuencia SEQ ID NO: 4 (A) Longitud: 30(3 residuos de aminoácidos (B) Tipo: aminoácidos II. Tipo de molécila: Proteína III. Organismo: Cryptomeria japónica Met Gly Gly Ser Arg Val Leu He He Gly Gly Thr Gly Tyr He Gly 1 5 10 15 Arg His Val Thr Asn Ala Ser Leu Ala Gln Gly His Pro Thr Phe Leu 20 25 30 Leu Val Arg Glu He Thr Pro Ser Asn Pro Glu Lys Ala Gln Leu Leu 35 40 " 45 Glu Ser Phe Thr Ser Lys Gly Ala Thr Leu Val Gln Gly Ser He Asp 50 55 60 Asp His Ala S sr Leu Val Ala Ala Leu Lys Lys Val A=p Val Val He 65 70 75 * 80 Ser Thr Leu G.Ly Ala Pro Gln He Ala Asp Gln Phe Asn Leu He Lys 85 90 95 Ala He Lys Glu Val Gly Thr He Lys Arg Phe Phe Pro Ser Glu Phe 100 105 110 Gly Asn Asp V.il Asp Lys His His Ala Val Glu Pro Met Lys Ser Met 115 120 125 Phe Asp Leu Lys He Lys Leu Arg Arg Thr He Glu Ala Glu Gly He 130. 135 140 Pro His Thr Tyr Val Val Pro His Cys Phe Ala Gly Tyr Phe Leu Thr 145 150 155 160 A=n Leu Ala Gln Leu Gly Leu Ala Ala Pro Pro Arg Asp Lys He Val 165 170 175 He Tyr Gly Asp Gly Thr Thr Lys Ala Val Tyr Met Lys Glu Glu A=p 180 185 190 He Gly Thr Phe Thr He Lys Ala Val Asp Asp Pro Arg Thr Leu Asn 195 200 205 Lys Thr Leu Tyr Leu Lys Pro Pro Ala Asn Thr He Ser Thr Asn Asp 210 215 220 Leu Val Ala Leu Trp Glu Ala Lys He Gly Lys Thr Leu Glu Lys Val 225 230 235 240 Tyr Leu Ser Glu Glu Gln Val Leu Lys Leu Leu Gln Asp Thr Pro Phe 245 250 255 Pro Gly Thr Phe Met Val Ser He Phe His Thr He Tyr Val Lys Gly 260 265 270 Asp Gln Thr Asn Phe Gln He Gly Pro A=p Gly Val Glu Ala Ser Ala 275 280 285 Leu Tyr Pro A=p Val Lys Tyr Thr Thr Val Glu Glu Tyr He Ser Ala 290 295 300 Phe Val 305 I. Características de la Secuencia SEQ ID NO: 5 (A) Longitud: 963 pares de bases (B) Tipo: nucleótidos II. Tipo de molécula: ADN III. Organismo: Cryptomeria japónica atg gga ggc age aga att ctg ttg att gga gga act gga tac att ggt 48 Met Gly Gly Ser Arg He Leu Leu He Gly Gly Thr Gly Tyr He Gly 1 5 10 15 cga cat gtg crea aaa gcc age att gct ctt ggc cat ccc act tac ctt 96 Arg His Val Ua Lys Ala Ser He Ala Leu Gly His Pro Thr Tyr Leu 20 25 30 ctg gtc aga gag tec acg gct tca aat cct gtt aaa gct gag ctt ctg 144 Leu Val Arg Glu Ser Thr Ala Ser Asn Pro Val Lys Ala Glu Leu Leu 35 40 45 gag tcc.ttc aag gca tca ggt ggt caá ata gtg cat gga tet ctg ggt 192 Glu Ser Phe Lys Ala Ser Gly Gly Gln He Val His Gly Ser Leu Gly 50 55 60 gat cat acá agt ctt gtg gag gca atc aag aag gtt gat gtg gtt ata 240 Asp His Thr Ser Leu Val Glu Ala He Lys Lys Val A=p Val Val He 65 70 75 80 tec acá gtg gga ggg gcg cag ata atg gat cag tta aac att atc aag 288 Ser Thr Val Gly Gly Ala Gln He Met Asp Gln Leu Asn He He Lys 85 90 95 5 E s *: s; SÍ s; s # % s s; s Í? S? E 105 110 »« s; "„' J UK5 SÍ ?;pc ^ ^™ A <El V «al gGlu. 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JKJ L%" V 2» « «« 200 205 aag acc ctg tat ttq ass ctt er-t- i-r-r- = ,*. 0 *, T 2h1j0 ^ Leí ^ 21í5 £ « £ JS £ SS Sí "2 • 720 " 2J E E a 5 ¿JU S £ s ??; 23-5 £ 2 K "1 S24 5 tat gtc cct gag gaa gct gtc etc aaa aaa att gaa gag acá cea ttc 768 Tyr Val Pro Glu Glu Ala Val Leu Lys Lys He Glu Glu Thr Pro Phe 245 250 255 cea gcc agt att ggt att tca att ggt tac tet act ttt gtg aaa ggg 816 Pro Ala Ser He Gly He Ser He Gly Tyr Ser Thr Phe Val Lys Gly 0 260 265 270 gac caá acc aat ttt gaa att gga cct gat ggt gtg gag ggc age caá 864 Asp Gln Thr Asn Phe Glu He Gly Pro Asp Gly Val Glu Gly Ser Gln 275 280 285 5 etc tac cea gat gtg aag tac acc act gtt gaa gag tat ctt gac cag 912 Leu Tyr Pro Asp Val Lys Tyr Thr Thr Val Glu Glu Tyr Leu Asp Gln 90 295 300 ttt gtt tgactaagaa ttgaaggtga caatatacta atatagtggg atqta Phe Val y yyy y 963 0 305 I. Características de la Secuencia SEQ ID NO: 6 (A) Longitud: 306 residuos de aminoácidos (B) Tipo: aminoácidos II. Tipo de molécula: Proteína III. Organismo: Cryptomeria japónica Met Gly Gly Ser Arg He Leu Leu He Gly Gly Thr Gly Tyr He Gly 1 5 10 15 Arg His Val Ala Lys Ala Ser He Ala Leu Gly His Pro Thr Tyr Leu 20 25 30 Leu Val Arg Glu Ser Thr Ala Ser Asn Pro Val Lys Ala Glu Leu Leu 35 40 45 Glu Ser Pifie Lys Ala Ser Gly Gly Gln He Val His Gly Ser Leu Gly 50 55 60 Asp His Thr Ser Leu Val Glu Ala He Lys Lys Val Asp Val Val He 65 70 75 80 Ser Thr Val Gly Gly Ala Gln He Met Asp Gln Leu A=n He He Lys 85 90 95 Ala He Lys Glu Val Gly Thr He Lys Arg Phe Val Pro Ser Glu Phe 100 105 110 Gly A=n Aíp Val Asp Lys Val His Ala Val Glu Pro Ala Lys Thr Met 115 120 125 Phe Gly Asn Lys Ala Lys He Arg Arg Ala He Glu Ala Glu Gly He 130 135 140 Pro Tyr Thr Tyr Val Ser Ser Asn Leu Phe Ala Gly Tyr Phe Leu Pro 145 150 155 160 Asn Leu Gly Gln Pro Gly Leu Ser Ala Pro Pro Arg Asp Lys Leu Val 165 170 175 He Leu Gly Asp Gly Asn Ala Lys Val Val Tyr Val Lys Glu Glu Asp 180 185 190 He Gly Th Phe Thr He Lys Ala Val A=p Asp Pro Arg Thr Leu A=n 195 200 205 Lys Thr Leu Tyr Leu Arg Leu Pro Ser Asn Thr Tyr Ser Phe A=n Glu 210 215 220 Leu Ala Ais. Leu Trp Glu Thr Lys He Gly Lys Thr Leu Glu Lys Val 225 230 235 240 Tyr Val Prc Glu Glu Ala Val Leu Lys Lys He Glu Glu Thr Pro Phe 245 250 255 Pro Ala Ser He Gly He Ser He Gly Tyr Ser Thr Phe Val Lys Gly 260 265 270 Asp Gln Thr Asn Phe Glu He Gly Pro Asp Gly Val Glu Gly Ser Gln 275 280 285 Leu Tyr Pro Asp Val Lys Tyr Thr Thr Val Glu Glu Tyr Leu Asp Gln 290 295 300 Phe Val 305 I. Características de la Secuencia SEQ ID NO: 7 (A) Longitud: 392 pares de bases (B) Tipo: nucleótidos II. Tipo de molécula: ADN III. Organismo: Forsythia intermedia atcattgggg g :acagggta cttagggagg agattggtta aggcaagttt agctcaaggc 60 catgaaacat acattctgca taggcctgaa attggtgttg atattgataa agttgaaarg 120 ctaatatcat ttaaaatgca aggagctcat cttgtatctg gttctttcaa ggatttcaac 180 agtctggtcg aggctgtcaa gctcgtagac gtagtaatca gcgccatttc tggtgttca 240 attcgaagcc atcaaattct tcttcaactc aagcttgttg aagctattaa agaggctgga 300 aatgtcaaga gcitttttacc atctgagttt ggaatggatc ctgcaaaatt tatggatacg 360 gccatggaac ccggaaaggt aacacttgat ga 392 I. Características de la Secuencia SEQ ID NO: 8 (A) Longitud: 20 pares de bases (B) Tipo: nucleótidos II. Tipo de molécula: ADN (A) Características: Secuencia artificial (B) Descripción de la Secuencia artificial: (i) Oligonucleotido (ii) PCR primer PLRNT1 donde n en las posiciones 9, 12, 15 y 18 representa a, c, g o t. athathggng gnacnggnta I. Características de la Secuencia SEQ ID NO: 9 (A) Longitud: 20 pares de bases (B) Tipo: nucleótidos II. Tipo de molécula: ADN (A) Características: Secuencia artificial (B) Descripción de la Secuencia artificial: (iii) Oligonucleotido (iv) PCR primer PLRI5R donde n en las posiciones 6, 9, 12 y 18 representa a, c, g o t. tcytcnarng t.nacyttncc 10 I. Características de la Secuencia SEQ ID NO: 10 (A) Longitud: 36 pares de bases (B) Tipo: nucleótidos II. Tipo de molécula: ADN (A) Características: Secuencia artificial (B) Descppción de la Secuencia artificial: (v) Ohgonuc eotido (vi) PCR ppmer PT-ATG-Ndel ttcagggccc atatgggaag caggagcagg atactc I. Características de la Secuencia SEQ ID NO: 11 (A) Longitud: 36 pares de bases (B) Tipo: nucleótidos II. Tipo de molécula: ADN (A) Características: Secuencia artificial (B) Descppción de la Secuencia artificial: (vn) Ohgonucleotido (vin) PCR pprrer PT-Rev-Ndel tgtcgaatac a atgaaagg cgataaccaa caattt I. Características de la Secuencia SEQ ID NO: 12 (A) Longitud: 20 Dares de bases (B) Tipo: nucleótidos II. Tipo de molécula: ADN (A) Características: Secuencia artificial (B) Descppción de la Secuencia artificial: (íx) Ohgonucleotido (x) PCR primer Cj-PCBERNT en donde n en las posiciones 8 y 15 representa a, c, g o t atwggmgnaa c ggntacat I. Características de la Secuencia SEQ ID NO: 13 (A) Longitud: 20 pares de bases (B) Tipo: nucleótidos II. Tipo de molécula: ADN (A) Características' Secuencia artificial (B) Descripción de la Secuencia artificial- (\?) Ohgonucleotido (xn) PCR primer Cj-PCBER-CT donde n en las posiciones 12 y 15 representa a, c, g o t. tayacmacyg tngangagta

Claims (33)

1. 76
2. REIVINDICACIONES ; 1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para una proteína de éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico. 2. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, que codifica para una proteína de éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico de una gimnoesperma .
3. 3. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, que codifica para una proteína de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico proveniente del género Pinus .
4. 4. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 3, que codifica para una proteína de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrociconiferílico proveniente de Pinus taeda .
5. 5. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 4, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:l.
6. 6. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, que codifica para una proteína que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 2.
7. 7. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, que codifica para una proteína de éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico Error! Ln nown switch argument. 77 proveniente del género Cryptomeria .
8. 8. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 7, que codifica para una proteína de éter bencílico reductasa para alcohol dehidrodiconiferílico proveniente de Cryptomeria japónica .
9. 9. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 8, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO : 3.
10. 10. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 8, que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO : 5.
11. 11. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, que codifica para una proteína que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 4.
12. 12. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, que codifica para una proteína que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
13. 13. La proteína aislada de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico.
14. 14. Una proteína aislada de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico de angioesperma de la reivindicación 13.
15. 15. Una proteína aislada de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico de gimnoesperma de la reivindicación 13. Error! Unknown switch argument. 78
16. 16. Una proteína aislada de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico de Pinus de la reivindicación 13.
17. 17. Una proteína aislada de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico de Pinus taeda de la reivindicación 13.
18. 18. Una proteína aislada de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico de la reivindicación 13, en donde la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 2.
19. 19. Una proteína aislada de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico de Cryptomeria de la reivindicación 13.
20. 20. Una proteína aislada de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico de Cryptomeria japónica de la reivindicación 13.
21. 21. Una proteína aislada de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico de la reivindicación 13, donde la proteína comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO : 4.
22. 22. Una proteína aislada de éter bencílico reduc-asa del alcohol dehidrodiconiferílico de la reivindicación 13, donde la proteína comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO : 6.
23. 23. Un vector de expresión replicable que Error! Unknown switch argument. 79 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico .
24. 24. Un vector de expresión replicable de la reivindicación 23, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico de gimnoesperma .
25. 25. Un vector de expresión replicable de la reivindicación 23, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico de angioesperma .
26. 26. Un vector de expresión replicable de la reivindicación 23, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico de Pinus .
27. 27. Un vector de expresión replicable de la reivindicación 23, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico de Cryptomeria .
28. 28. Un método para reforzar la expresión de la proteína de éter bencílico reductasa del alcohol Error! Unknown switch argument. 80 dehidrodiconiferílico en una célula hospedera adecuada, que comprende introducir a la célula hospedera un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de éter bencílico reductasa para el alcohol dehidrodiconiferílico.
29. 29. El método según la reivindicación 28, en donde la célula hospedera es una célula vegetal .
30. 30. Un método para modificar la expresión de proteína de éter bencílico reductasa del el alcohol dehidrodiconiferílico en una célula hospedera adecuada, que comprende introducir dentro de la célula hospedera un vector que comprende una secuencia de nucleótido que expresa una ARN que es capaz de hibridizar a la molécula de ADNc establecida en la SEQ ID NO : 1.
31. 31. El método según la reivindicación 30, en donde la célula hospedera es una célula vegetal .
32. 32. Un método para modificar la expresión de la proteína de éter bencílico reductasa del alcohol dehidrodiconiferílico en una célula hospedera adecuada, que comprende introducir a la célula hospedera un vector que comprende una secuencia de nucleótido que expresa un ARN que es capaz de hibridizar a la molécula de ADNc establecida en la SEQ ID NO : 3.
33. 33. El método según la reivindicación 32, en donde la célula hospedera es una célula vegetal. Error! Unknown switch argument.