KR20060035579A - 정제된 단백질, 재조합 ｄｎａ 서열 및 커피 식물의 원숙을조절하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 에틸렌 합성에 필요한 효소의 발현을 억제시키기 위하여 커피 식물을 형질전환시키 위한 정제된 단백질, 따라서 발현시 암호화되는 DNA 서열, 재조합 DNA 분자 및 이로써 형질전환된 숙주를 제공한다. DNA 서열 및 재조합 DNA 분자는 커피 식물에서 에틸렌 생합성 경로의 요소인 효소 ACC 신타아제 및 ACC 산화효소를 발현시 암호화한다는 것을 특징으로 한다. 커피 식물은 ACC 신타아제 및/또는 ACC 산화효소에 대한 mRNA에 대하여 안티센스인 각 mRNA를 발현시 암호화하는 ACC 신타아제 및/또는 ACC 산화효소 DNA 서열을 함유하는 벡터로 형질전환된다. 얻어지는 안티센스 mRNA는 각 ACC 신타아제 및/또는 ACC 산화효소 mRNA에 결합되어 에틸렌 합성 경로에서 하나 이상의 효소를 암호화하는 mRNA를 불활성화시킨다. 기술된 DNA 서열은 또한 동시-억제법을 사용하여 ACC 신타아제 또는 ACC 산화효소의 합성을 블록킹하는데 사용될 수 있다. 어느쪽이든 결과는 형질전환된 식물은 다른 대사는 영향받지 않을지라도 에틸렌을 합성시킬 수 없다는 것이다.

Description

정제된 단백질, 재조합 ＤＮＡ 서열 및 커피 식물의 원숙을 조절하는 방법{Purified proteins, recombinant DNA sequences and processes for controlling the ripening of coffee plants}
도1은 커피 열매 발현 ACC 신타아제를 암호화하는 cDNA의 완전한 서열이다.
도2는 도1에 도시된 cDNA 서열로부터 추론한 커피 열매 ACC 신타아제의 아미노산 서열이다.
도3은 커피 열매 발현 ACC 산화효소를 암호화하는 cDNA의 완전한 서열이다.
도4는 도3에 도시된 cDNA 서열로부터 추론한 커피 열매 ACC 산화효소의 아미노산 서열이다.
본 출원은 정제된 단백질, 재조합 DNA 서열, 이로써 형질전환된 숙주 및 커피 식물의 원숙을 조절하는 방법에 관한다. 더 구체적으로, 본 출원은 정제된 단백질 및 커피 열매-특이적인 1-아미노싸이클로프로판-1-카복실산 신타아제 및 ACC 산화효소 유전자의 발현을 억제하는데 사용할 수 있는 재조합 DNA 서열에 관한다. 본 출원은 또한 이러한 서열로 형질전환되어 원숙에 필요한 에틸렌을 합성할 수 없 게 되는 커피 식물에 관한다. 본 발명에 따라 형질전환된 식물에 외인성 에틸렌을 도입함으로써 커피 식물의 열매 원숙을 동시 발생시키거나 조절할 수 있다.
커피는 Coffea속의 식물, 일반적으로 C. arabica 종으로부터 얻은 원두를 구워 제조한다. 원두는 커피 식물의 종자로서 열매, 가장 이상적으로는 그 우수한 품질로 인하여 가장 고가의 가격이 되는 원숙한 열매를 가공하여 얻는다. 과거에는 고품질 "고급" 커피는 손으로 채취하였다. 이것은 커피 나무의 열매가 똑같이 성숙하지 않으므로 같은 나무에 성숙한 열매와 미성숙한 열매가 있기 때문에 필요하다. 과거에는 대부분의 커피가 노동력이 풍부하고 비싸지 않은 지역에서 재배되었으므로 이것이 대단한 문제가 아니었다. 그러나, 최근에는 풍부하고 값싼 노동력의 부족으로 커피 생산의 생산성이 저하되었다. 최대 커피 생산 국가인 브라질과 같은 몇몇 지역은 생산성을 증가시키기 위하여 노동자들로 하여금 원숙하거나 원숙하지 않거나 간에 한 가지에서 모든 열매를 재빨리 채취하게 하는 스트립 수확법에 의존해왔다. 이것은 수확 속도를 증가시키나 다수의 열매가 미성숙하여(그린) 최고 품질 원두의 수율을 감소시킨다.
게다가, 똑같이 원숙하지 않다는 것은 기계적인 수확의 효과를 심각하게 제한하였다. 나무에서 성숙한 열매(체리)를 채취하는데 필요한 힘은 그린 열매를 채취하는데 필요한 힘과 같다. 따라서, 기계적 수확으로써는 그린 및 체리 사이의 구별이 잘 되지 않아 다량의 미성숙 열매가 성숙한 열매와 함께 수확된다. 이것은 성숙 열매의 수율을 매우 감소시키고 생산성을 제한한다. 모든 열매가 동시에 원숙할 수 있도록 커피 열매 원숙을 조절할 수 있다면 손으로 수확하는 스트립 법 및 기계적 수확 모두 훨씬 더 효과적이 되어 더 많은 퍼센트의 수확 열매가 더 고품질 등급내에 속하게 될 것이다. 이것은 커피 생산의 적합성을 증가시킬 것이다.
많은 다른 열매의 경우[Yang 및 Hoffman, Ann. Rev. Plant Physiol. 35:155(1984)], 식물이 생성시키는 에틸렌은 커피 열매 원숙의 최종 단계에서 중요한 역할을 한다. 일단 커피 열매가 혹종의 성숙 단계에 도달하면 에틸렌의 외부 공급으로 원숙을 유도할 수 있다[Crisosto, C.H., P.C. Tausend, M.A. Nagao, L.H. Fuchigami 및 T.H.H. Chen, J. Haw. Pac. Agri. 3:13-17(1991)]. 이것은 커피에서 열매 원숙 최종 단계에서의 에틸렌의 중요성을 증명한다.
에틸렌은 S-아데노실메티오닌(SAM)으로부터 2-단계 반응으로 합성된다. 첫 단계는 ACC 신타아제에 의하여 SAM으로부터 1-아미노싸이클로프로판-1-카복실산 (ACC)을 합성하는 것이다. 대부분의 식물에서 이것은 속도 억제 단계이다. 최종 단계는 ACC 산화효소에 의하여 촉매되는 ACC의 에틸렌으로의 전환 단계이다(Yang 및 Hoffman, supra). 화학물질(예를들어, 은 이온 또는 이산화탄소) 또는 생명공학적 방법[Oeller등, Science 254:437(1991)]에 의하여 에틸렌 생합성을 억제하게 되면 원숙 최종 단계를 억제하게 된다. 이러한 억제는 에틸렌의 공급으로 가역적이 된다.
따라서, 커피 식물의 원숙을 조절하는 방법은 에틸렌 생합성 경로에서 특정 효소의 합성을 방해하는 것이다. 본 발명의 한 구체예는 커피 식물을 유전적으로 변형시켜 ACC 신타아제의 합성을 제거하는 것에 관하며; 또 다르게는 ACC 산화효소 합성을 억제시키는 것이다. 현재 바람직한 구체예에서는 합성을 억제시킬 효소의 발현시 암호화되는 mRNA에 대하여 안티센스인 메신저 RNA(mRNA)의 전사시 암호화되는 DNA 서열로 커피 식물을 형질전환시킴으로써 이들 효소 중 하나 또는 둘다의 합성을 제한한다. 비슷한 방법을 사용하여 토마토의 원숙을 조절하는 것을 보고한 Oeller등의 Science 254:437(1991)을 참조하시오.
재조합 DNA 기법은 다수의 ACC 신타아제 및 ACC 산화효소 유전자를 분리하는데 사용되어 왔다. 그러나 커피의 ACC 신타아제 및 ACC 산화효소의 유전자는 확인되지 않았거나 서열화되지 않았다.
따라서, 본 발명은 커피의 ACC 신타아제 및 ACC 산화효소의 유전자를 규명하고, 이러한 유전자를 이용하여 커피식물을 형질전환시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 ACC 신타아제 또는 ACC 산화효소의 유전자로 형질전환된 커피 식물 세포 및 그 세포로부터 커피 식물을 재생하는 방법을 제공하는 것을 포함한다.
발명의 요약
본 발명은 에틸렌 생합성에 필요한 효소 발현을 억제시키기 위하여 커피 식물을 형질전환시키기 위한 정제된 단백질, 발현시 암호화되는 DNA 서열, 재조합 DNA 분자 및 이로 형질전환된 숙주를 제공한다. 정제된 단백질, 발현시 암호화되 는 DNA 서열 및 이로써 형질전환되는 숙주를 포함하는 재조합 DNA 분자 DNA 서열 및 재조합 DNA 분자는 이들이 커피 식물의 에틸렌 생합성 경로의 원소들인 ACC 신타아제 및 ACC 산화효소들을 발현시 암호화하는 것을 특징으로 한다.
커피 식물은 ACC 신타아제를 함유하는 벡터 및/또는 형질전환 서열이 ACC 신타아제 및/또는 ACC 산화효소의 mRNA에 대하여 안티센스인 각각의 RNA를 발현시 암호화할 수 있도록 삽입된 ACC 산화효소 DNA 서열로 형질전환된다. 이렇게 얻어지는 안티센스 RNA는 mRNA들에 결합하여 mRNA가 에틸렌 합성 경로의 하나 이상의 효소를 암호화하는 것을 비활성화시킨다. 상기한 DNA 서열은 또한 동시-억제법을 사용하여 ACC 신타아제 또는 ACC 산화효소의 합성을 블록킹시키는데 사용할 수 있다. 어떤 경우라도 결과는 형질전환된 식물은 다른 대사는 영향을 받지 않을지라도 에틸렌을 합성할 수 없다는 것이다.
형질전환된 식물에서의 원숙은 외부의 에틸렌으로 조절할 수 있다. 에틸렌을 식물 전체에 공급함으로써 식물 전체가 한법에 원숙하여 커피의 기계적 수확은 더 생산적이 될 것이다.
발명의 상세한 설명
여기 기술된 본 발명을 보다 완전히 이해할 수 있도록 다음의 상세한 설명을 기술한다. 본 명세서에서 다음 용어가 사용된다:
뉴클레오티드 -- 슈거 성분(펜토오즈), 포스페이트 및 질소를 함유하는 복소환식 염기를 이루는 DNA 또는 RNA의 단량체 단위. 상기 염기는 글리코시드 탄소(펜토오즈의 1' 탄소)를 통하여 슈거 성분에 연결되며 염기와 슈거의 조합을 뉴클레 오시드라 부른다. 염기는 뉴클레오티드를 특징화한다. 4개의 DNA 염기는 아데닌("A"), 구아닌("G"), 씨토신("C") 및 티민("T")이다. 4개의 RNA 염기는 A, G, C 및 우라실("U")이다.
DNA 서열 -- 이웃하는 펜토오즈의 3' 및 5' 사이에 포스포디에스테르 결합에 의하여 서로 연결된 뉴클레오티드의 선형 배열.
코돈 -- mRNA를 통하여 아미노산, 번역 개시 신호 또는 번역 종결 신호를 암호화하는 3개의 뉴클레오티드(삼중자)의 DNA 서열. 예를들어 뉴클레오티드 삼중자 TTA, TTG, CTT, CTC, CTA 및 CTG는 아미노산 류신("Leu")을 암호화하고 TAG, TAA 및 TGA는 암호 중단 신호이며, ATG는 번역 개시 신호인데 이것은 또한 아미노산 메티오닌("MET")을 암호화한다.
폴리펩티드 -- 이웃하는 아미노산의 아미노 및 카복실 그룹 사이의 펩티드 결합에 의하여 서로 결합된 아미노산의 선형 배열.
게놈 -- 세포 또는 바이러스의 전체 DNA. 이것은 특히 촉진유전자, 전사 및 번역 개시 및 종결 부위 뿐만 아니라 물질의 폴리펩티드를 암호화하는 구조적인 유전자를 포함한다.
유전자 -- 주형 또는 메신저 RNA("mRNA")를 통하여 특정 폴리펩티드의 특징적인 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열.
전사 -- 유전자 또는 DNA 서열로부터 mRNA를 생성시키는 과정.
번역 -- mRNA로부터 폴리펩티드를 생성시키는 과정.
발현 -- 폴리펩티드를 생성시키기 위하여 유전자 또는 DNA 서열이 거치는 과 정. 이것은 전사와 번역의 조합이다.
플라스미드 -- 플라스미드가 숙주 세포내에서 복제될 수 있도록 "레플리콘"을 포함하는 이중가닥 DNA 서열. 플라스미드가 비세포 유기체내에 위치될 경우 그 유기체의 특성은 플라스미드 DNA의 결과로서 형질전환되거나 바뀔 수 있을 것이다. 예를들어 테트라싸이클린 저항성(TETR)을 위한 유전자를 함유하는 플라스미드는 전에는 테트라싸이클린에 민감하던 세포를 이에 내성인 세포로 형질전한시킨다. 형질전환된 세포는 "형질전환체"라고 불린다.
파지 또는 박테리오파지 -- 단백질 피복물("Capsid")에 싸인 DNA 서열로 이루어지는 다수의 박테리아성 바이러스.
클로닝 담체 -- DNA의 필수 생물 작용(예를들어 복제, 피복 단백질 생성) 또는 촉진유전자 또는 결합부위를 손상시키지 않고 측정가능한 방식으로 DNA 서열이 잘릴 수 있고 형질전환된 세포의 확인에 사용하기 적당한 표지(예를들어 테트라싸이클린 저항성 또는 암피실린 저항성)를 함유하는 1이하의 엔도뉴클레아제 인식 부위를 특징으로 하는, 플라스미드, 파지 DNA, 코스미드 또는 숙주 세포내에서 복제될 수 있는 기타 DNA 서열. 클로닝 담체는 종종 벡터로 불린다.
클로닝 -- 유기체 또는 이러한 유기체로부터 유도된 DNA 서열 또는 무성생식 복제에 의한 서열을 얻는 방법.
재조합 DNA 분자 또는 하이브리드 DNA -- 살아있는 세포내에서 유지될 수 있으며 살아있는 세포의 외부에서 연달아 결합된 상이한 게놈들로부터 얻은 DNA 단편으로 이루어지는 분자.
cDNA -- 특정 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA에 대하여 상보적인 DNA 가닥.
본 발명에 따른 커피 식물의 에틸렌 생합성을 조절하는 방법은 발현시 에틸렌 경로에서 두 효소, ACC 신타아제 및 ACC 산화효소를 암호화하는 유전자들을 즉시 측정하는 것에 관한다. 보통 유전자에 대하여 안티센스인 방향의 유전자를 함유하는 구축물을 갖는 야생형 커피 식물의 형질전환은 각 효소의 합성을 저해할 것으로 기대된다. 형질전환 서열 지시하에 전사된 메신저 RNA는 보통 서열 지시하에 전사된 mRNA에 결합하여 정상적인 메세지를 불활성화시키고 효소 합성을 방해할 것이다.
발현시 커피에서 ACC 신타아제 및 ACC 산화효소를 암호화하는 DNA 서열을 분리하기 위하여 우리는 발생할 것으로 예상되는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 합성 DNA 탐침을 가지고 커피 식물 조직으로부터 생성된 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 이들 예상 서열은 각각의 효소, 기타 수명이 다한 식물 및 다른 식물들을 암호화하는 유전자에서 일어나는 뉴클레오티드 서열의 연구를 기초를 하였다.
본 발명에서, ACC 신타아제 또는 ACC 산화효소를 암호화하는 유전자에 해당하는 cDNA는 미발달 커피 식물을 형질전환시키는데 사용한다. 플라스미드 pBI-121은 형질전환 벡터로 사용된다. 발현시 ACC 신타아제 또는 ACC 산화효소를 암호화하는 DNA에 해당하는 서열은 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 촉진유전자에 인접한 역방향으로 플라스미드에 삽입된다. 이로부터 전사된 RNA는 각 효소의 아미노산 서열을 암호화하는 mRNA에 대하여 상보적일 것이다. 완전한 구축물은 박테리아 숙주내에서 증폭된다. 숙주는 파괴하고 증폭된 벡터는 콜로이드성 금 입 자에 부착시킨다. 점착성 벡터들을 함유하는 금 입자들은 미국 특허 제5,107,065호에 기술된 바와 같이 세포에서 고속으로 입자들을 추진시킴으로써 커피 식물 조직에 삽입된다. 성공적으로 형질전환된 어린 식물들은 항생성으로 확인한다. 형질전환된 식물들은 식물을 형질전환시키기 위하여 사용된 유전자에 따라 ACC 신타아제 또는 ACC 산화효소를 생성시키지 못한다. 형질전환된 식물의 원숙은 외인성 에틸렌을 가함으로써 개시된다.
실시예 1
커피 열매-특이적 ACC 신타아제 cDNA의 분리
커피의 성숙에 관여하는 ACC 신타아제 유전자 서열을 분리하기 위하여 상이한 성숙 단계의 커피 열매 괴피 및 중과피 조직의 혼합물로부터 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 라이브러리를 구축하고 다른 유기체로부터 얻은 ACC 신타아제 유전자로부터 유도된 교감 서열에 해당하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 퇴화시키는데 사용하는 동일한 mRNA로부터 제조한 제1-사슬 cDNA로부터 합성한 PCR 생성물을 사용하여 이 라이브러리를 스크리닝하였다. 이 실시예는 원칙적으로 mRNA의 분리, cDNA 라이브러리의 구축 및 적절한 cDNA를 클로닝하는데 관여하는 차후의 단계를 포함하였다.
a) mRNA의 분리
Levi등[Hort Science 27(12):1316-1318(1992)]의 방법을 사용하여 몇몇 상이한 발전 단계의 커피 열매(C. arabica L. cv Guatemalan)로부터 얻은 66g의 과피 및 중과피 조직으로부터 RNA를 모두 분리하였다. 냉동한 커피 열매 과피 및 중과 피 조직을 가정용 커피 밀(Salton Model GC-5; Salton Maxam Housewares Group, Mt. Prospect, IL)내에서 작은 조각의 무수 얼음과 함께 약 2분간 분쇄하여 가루로 만들었다. 분말화된 열매 조직을 200μL의 200mM의 트리스[하이드록시메틸]아미노메탄 하이드로클로라이드(트리스-HCl)(pH 8.5), 1.5%의 소듐 도데실 설페이트(SDS), 300mM의 LiCl, 10mM의 디소듐 에틸렌디아민테트라아세트산(Na2EDTA), 1.5%의 소듐 데옥시클로레이트(w:v), 1.5%의 Nonidet P-40(Sigma Chemical Co.)(v:v), 0.5mM의 티오우레아, 1mM의 아우린트리카복실산, 10mM의 디티오트레이톨(DTT), 75mM의 B-머캅토에탄올, 2%의 폴리비닐피롤리돈(PVP) 및 2%의 폴리비닐폴리-피롤리돈(PVPP)에 가하고 Polytron 조직 균질기(Tekmar, Cincinnati, OH)를 사용하여 균질하게 하였다. 2분 동안 균질화한 후 200μL의 클로로포름을 가하고 다시 3분 동안 계속 균질화하였다. 균질물을 250μL의 원심분리 명(Nalgene)에 옮기고 2,500 x g에서 15분간 원심분리하였다. 상부의 수성 상을 분리하여 두 개의 원심분리 병에 똑같이 나눈 12μL의 5M NaCl과 함께 혼합하고 150μL의 에탄올을 각 병에 가하였다. 혼합물을 20℃에서 밤새 저장하였다. 4℃에서 15분간 4,000 x g에서 원심분리하여 RNA를 수거하였다. RNA를 50μL의 TE1(50mM의 트리스-HCL[pH 8.0], 10mM의 Na2EDTA)에 용해시키고 4℃에서 10분간 12,000 x g에서 원심분리하여 맑게 하였다. 상청액을 새로운 원심분리 병에 옮기고 3μL의 5M NaCl 및 30μL의 이소프로판올을 가하였다. 내용물을 혼합하고 20℃에서 밤새 저장하였다. RNA를 14,000 x g에서 10분간 원심분리하여 수거하였다. RNA를 20μL의 70% 얼음-냉각된 에탄올로 세척하고 전과 같이 원심분리하여 수거하였다. 진공하에 10분간 건조한 후 RNA를 50μL의 TE1 완충액에 재현탁시키고 10μL의 12M LiCl을 가하였다. 용액을 4℃에서 48시간동안 항온시키고 14,000 x g에서 10분간 원심분리하여 RNA를 수거한 다음 30μL의 TE1 완충액에 재현탁시켰다. 15μL의 5M 포타슘 아세테이트를 가한 다음 RNA를 0℃에서 밤새 항온하고 14,000 x g에서 10분간 원심분리하여 회수한 다음 50μL의 TE1 완충액에 현탁시켰다. 3μL의 5M NaCl 및 110μL의 95% 에탄올을 가하고 RNA를 -20℃에서 밤새 항온하였다. RNA를 14,000 x g에서 10분간 원심분리하여 회수하고 20μL의 70% 얼음-냉각된 에탄올로 세척하고 전과 같이 원심분리로 회수한 다음 진공 하에서 10분간 건조시키고 600μL의 TE1 완충액에 재현탁하였다. RNA를 마이크로원심분리 관에 옮기고 4℃, 14,000rpm에서 30분간 원심분리한 다음 300μL를 분리하여 두개의 새 마이크로원심분리관으로 옮겼다. 본래의 원심분리된 관을 추가의 300μL TE1 완충액으로 헹구었다. 18μL의 5M NaCl 및 636μL의 100% 에탄올을 세개의 관 각각에 가하였다. 인버팅 방식으로 혼합한 후 관들을 -20℃에서 밤새 저장하였다. 14,000rpm에서 30분간 원심분리하여 RNA를 수거하고 1μLdml 70% 의 얼음-냉각된 에탄올로 세척하였다. 전과 같이 원심분리 및 건조 후 RNA를 400μL의 살균 H2O에 재현탁시켰다. 총 1.04mg의 RNA를 얻었다.
PolyATtract™ mRNA Isolation System IV(Promega Corporation, Madison, WI)를 사용하여 메신저 RNA(polyA+RNA)를 분리하였다. 다음과 같이 총 2회의 분 리를 행하였다. 각 분리에 대하여 800μL의 RNase-없는 물에 총 0.48mg의 RNA를 용해시켰다. 65℃에서 10분간 가열한 다음 3μL의 50pmole/mL의 비오티닐화된 올리고(dT) 및 20.7μL의 20 X SSC(1 X SSC는 150mM의 NaCl 및 15mM의 소듐 시트레이트를 함유함)를 가하고 혼합물을 약 30분에 걸쳐 실온으로 서서히 냉각하였다. 연쇄구균 상자성 입자 알리코트(PolyATtract™ mRNA Isolation System IV 제공)를 0.5 X SSC에서 3번 세척하고 0.1 mL의 0.5 X SSC내에 재현탁하였다. 비오티닐화된 올리고(dT)를 함유하는 RNA 용액을 세척된 연쇄구균 상자성 입자에 가하였다. 실온에서 10분간 항온시킨 후 갇힌 mRNA를 함유하는 상자성 입자들을 자석을 사용하여 관의 측부에서 붙잡았다.
상청액을 제거하고 입자들을 0.3mL의 0.1 X SSC로 4번 세척하였다. 200μL의 RNase 없는 물에 현탁시킴으로써 비오티닐화된 올리고(dT) 입자들로부터 mRNA를 제거하였다. 2개의 관 각각에 순차적으로 150μL의 물을 가하여 추가로 융출시켰다. 용출 분급물(550μL)을 풀링시키고 4℃에서 30분간 마이크로원심분리기에서 14,000rpm의 속도로 원심분리시켰다. 상청액을 2개의 마이크로원심분리 관에 나누고 10분의 1 부피의 3M NaCl 및 600μL의 에탄올을 가한 다음 -20℃에서 밤새 관을 항온시켜 mRNA를 회수하고 상기와 같이 원심분리시켰다. mRNA를 1mL의 얼음-냉각된 70%의 에탄올로 한번 세척하고 건조시킨 다음 20μL의 살균 H2O에 재현탁시켰다. 1mL의 물에 1μL를 가하고 Shimadzu UV 160U 분광광도계에서 230-330nm에서 스펙트럼을 얻었다. 1.04mg의 총 RNA로부터 약 6μg의 mRNA를 회수하였다.
b) cDNA 라이브러리의 구축
ZAP-cDNA 합성 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 제1 및 제2 가닥 cDNA를 합성하였다. 20μL의 수중 6μg의 mRNA를 65℃에서 5분간 항온시켰다. 2μL의 100mM 메틸 수은을 가하고 실온에서 10분간 계속 항온시켰다. 4μL의 700mM β-머캅토에탄올을 가하고 다시 5분동안 계속 항온시켰다. 변성된 mRNA에 5μL의 10X 제1 가닥 완충액(키트에서 제공됨), 5μL의 100mM DTT, 3μL의 뉴클레오티드 혼합물(10mM 각각 dATP, dGTP, dTTP 및 5-메틸-dCTP), 2μL의 1.4μg/μL 링커-프라이머:
5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
(서열번호 1)
1μL의 RNase 블록 및 5μL의 물을 가하였다. 반응물을 실온에서 10분간 항온시켜 프라이머를 mRNA에 어닐링시킨 다음 3μL의 20U/μL M-MuLV 가역 전사효소를 가하였다. 이 반응 혼합물 5μL를 0.5μL(0.625pmole)의 800 Ci/mmole[α-32P]dATP를 함유하는 관에 분리시켰다. 두 반응물을 37℃에서 1시간동안 항온시켰다. 방사선 표지된 반응물을 차후의 겔 분석을 위하여 -20℃에서 동결시켰다. 45μL의 주요 반응물에 40ML의 제2 가닥 완충액, 15μL의 100mM DTT, 6μL의 뉴클레오티드 혼합물(10mM dATP, dGTP, dTTP 및 26mM dCTP), 268.3μL의 물 및 2μL(2.5pmole)의 800 Ci/mmol [α-32P]dATP를 가하였다. 혼합후 4.5μL의 1U/μL RNase H 및 19.2μL의 5.2U/μL E. Coli DNA 중합효소 I을 가하고 반응 물을 16℃에서 2.5시간동안 항온시켰다. 반응물을 400μL의 페놀:클로로포름(1:1)으로 추출하였다. 마이크로원심분리기에서 5분간 원심분리하여 상분리하고 수성 상을 분리하여 클로로포름으로 재추출하였다. 수성 상을 전과 같이 원심분리로 회수하였다.
33.3μL의 3M 아세트산나트륨(pH 5.2) 및 867μL의 100% 에탄올을 가하고 -20℃에서 밤새 항온시켜 이중-가닥 cDNA를 침전시켰다. 60분간 4℃의 마이크로원심분리기내에서 14,000x g에서 원심분리하여 cDNA를 회수하였다. cDNA를 1mL의 80% 에탄올로 세척하고 14,000 X g의 마이크로원심분리기내에서 상온에서 원심분리하여 회수한 다음 진공하에 건조시키고 45μL의 물에 용해시켰다. 3μL의 재현탁된 이중-가닥 cDNA를 분리하여 차후의 겔 전기영동 분석을 위하여 -20℃에서 저장하였다.
남아있는 42ML의 이중-가닥 cDNA에 5μL의 10X Klenow 완충액(완충액 3번; Stratagene사 제품), 2.5μL의 2.5mM 뉴클레오티드(dCTP, dGTP, dATP 및 dTTP) 및 0.5μL의 5U/μL E. Coli DNA 중합효소 I Klenow 단편을 가하였다. 30분후 37℃에서, 50μL의 물을 가하고 반응물을 동부피의 페놀:클로로포름(1:1)으로 추출한 다음 상기 기술한 바와 같이 클로로포름으로 추출하였다. 7μL의 3M 아세트산 나트륨(pH 5.2) 및 226μL의 100% 에탄올을 가한 다음 블런트(blunt)말단의 이중-가닥 cDNA를 얼음 상에서 30분간 항온하고 마이크로원심분리기에서 60분동안 4℃, 14,000rpm에서 원심분리로 회수하였다. cDNA를 300μL의 70% 에탄올로 세척하고 원심분리한 다음 전과 같이 건조시켰다. 7μL의 0.4μg/μL EcoRI 링커를 건조시 킨 cDNA에 가하였다. EcoRI 링커의 구조는 다음과 같다:
5'-AATTCGGCACGAG-3' (서열번호 2)
3'-GCCGTGCTC-5'
재현탁된 cDNA에 보텍싱한 후 1μL의 10X 배위자 결합 완충액, 1μL의 10 mM ATP 및 1μL의 4 Weiss U/μL T4 DNA 라가제를 가하고 반응물을 8℃에서 밤새 항온시켰다. 70℃에서 30분간 가열함으로써 리가제를 비활성화시켰다. 이제 cDNA에 부착되어 있는 EcoRI 링커의 5' 말단을 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 포스포릴화하였다. ZAP-cDNA 신타아제 키트(Stratagene, La Jolla, CA)의 1μL의 10X 완충액 3번, 2μL의 10mM ATP, 6μL의 물 및 1μL의 10U/μL T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 배위자 결합 반응에 가하였다. 70℃에서 30분간 반응물을 가열함으로써 30분후 37℃에서 키나제 반응을 중단하였다. 링커-프라이머에서 XhoI 부위의 이화에 의하여 mRNA의 3' 말단에 해당하는 cDNA의 말단에 XhoI "점착성(sticky) 말단"을 생성시켰다. 28μL의 XhoI 완충액 및 3μL의 40U/μL XhoI를 cDNA에 가하고 반응물을 37℃에서 1.5시간동안 항온시켰다.
5' 말단에 EcoRI 점착성 말단 및 3' 말단(원래의 mRNA에 대하여)에 XhoI 점착성 말단을 가지는 cDNA를 다음과 같이 제조한 Sephacryl S-400 스핀 칼럼에 통과시켜 크기를 선별하였다. 5μL의 10 X STE[100mM 트리스(pH 7.0), 5mM EDTA 및 100mM NaCl]를 cDNA에 가하고 cDNA를 Sephacryl S-400(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)를 함유하는 1mL의 주사기 상부에 가하였다. 500μL의 마이크로원심분리관을 주사기 바닥에 놓고 칼럼을 원심분리관에 놓고 약 400 X g에서 2분간 원심분리시켰다. 60μL의 1 X STE를 주사기 상부에 가하고 새로운 마이크로원심분리관을 칼럼의 바닥에 놓고 칼럼을 다시 전과 같이 원심분리하였다. 6개의 분급물을 수거할때까지 이 과정을 반복하였다. 약 10%의 각 분급물을 1%의 아가로즈 겔 상에서 전기영동하여 각 분급물내 cDNA의 크기 분포를 측정하였다. 각 분급물의 나머지는 동부피의 페놀:클로로포름으로 추출한 다음 상기 기술한 바와 같이 클로로포름으로 추출하고 2부피의 100% 에탄올을 가하여 침전시켰다. -20℃에서 밤새 항온시킨 다음 4℃에서 60분간 14,000rpm의 마이크로원심분리기에서 원심분리하여 cDNA를 회수하였다. 각 cDNA 분급물을 200NL의 80% 에탄올로 세척하고 상기 기술한 바와 같이 건조하였다. cDNA 분급물(1)을 3μL의 살균수에 재현탁시키고 cDNA 분급물(2)를 10.5μL의 살균수에 재현탁시켰다. 두 분급물 각각을 1과 2분의 1 μL 사용하여 에티듐 브로마이드 플레이트 검출 방법을 이용, DNA의 양을 측정하였다. 가장 큰 cDNA 분자를 함유하는 분급물 1 및 2를 조합하였다. 12.5mL의 조합된 분급물은 약 100ng의 cDNA를 함유하였다. 이 분급물은 Speed-Vac에서 2.5μL로 감소하였고 얼음 상에 저장되었다. cDNA 분급물(3)은 10.5μL의 살균수에 재현탁하고 차후의 사용을 위하여 -20℃에서 저장하였다.
분급물 1 및 2로부터 100ng의 cDNA를 1μg의 Uni-ZAP™(Stratagene, La Jolla, CA), EcoRI 및 XhoI로 이화된 람다 ZAP 벡터내로 배위자 결합시켰다. 분급물 1 및 2 cDNA(2.5μL)를 0.5μL의 10 X 배위자 결합 완충액, 0.5μL의 10mM ATP, 1μL의 1μg/μL Uni-ZAP XR 벡터 및 0.5μL의 4 Weiss U/μL T4 DNA 리가제에 가하였다. 반응물을 약 44시간동안 8℃에서 항온하였다. 배위자 결합 반응 물 1μL 알리코트를 Gigapack II Gold 박테리오파지 λ 패키징 키트(Stratagene, La Jolla, CA)로부터의 '동결-해동' 추출물 알리코트에 가하였다. 15μL의 Sonic 추출물을 가하고 내용물을 온건하게 혼합하였다. 실온에서 포장하였다. 2시간후 500μL의 SM 완충액 및 200μL의 클로로포름을 각 포장 반응물에 가하고 마이크로원심분리기에서 짧게 원심분리하여 부스러기를 분리하였다. 포장된 파지를 새로운 마이크로원심분리관에 옮겼다. 10μL의 클로로포름을 가하고 포장 파지를 사용시까지 4℃에서 저장하였다. 이러한 1차 라이브러리의 적정량은 0.7 X 106 의 재조합 플레이그의 존재를 나타내었다.
c) 1차 라이브러리의 증폭
O.D.600에서 0.5의 밀도로 생장하는 600μL의 대장균 XL1-Blue MRF'(Stratagene, La Jolla, CA) 및 32.5μL의 1차 라이브러리 스톡을 16개의 시험관에 각각에 가하였다. 37℃에서 15분간 항온시킨 후 48℃의 6.0mL 상부 한천(5g/L NaCl, 2g/L MgSO4·7H2O, 5g/L 이스트 추출물, 10g/L NZ 아민[pH 7.5] 및 0.7% 아가로즈)을 각각의 시험관에 가하고 내용물을 150 X 15mm NZY 플레이트(5g/L NaCl, 2g/L MgSO4·7H2O, 5g/L 이스트 추출물, 10g/L NZ 아민[pH 7.5] 및 15 g/L Difco 한천) 상에 평판배양하였다. 평판을 37℃에서 밤새 항온시킨 다음 10mL의 SM 완충액으로 덮어씌우고 가볍게 흔들어주면서 4℃에서 다시 8시간동안 항온하였다. SM 완충액을 살균 피펫으로 수거하여 살균 250mL 원심분리 병에 저장하였다. 각 평판을 수거한 추가의 10mL SM 완충액으로 헹구고 이전 SM 완충액에 가하였다. 최종 농도 5%로 클로로포름을 가하고 파지 용액을 실온에서 15분간 항온시킨 다음 2,000 X g에서 10분간 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하였다. 상청액을 살균 폴리프로필렌 병에 회수하고 클로로포름을 최종 농도 0.3%로 가하였다. 증폭된 라이브러리를 4℃에서 저장하였다.
d) 특이 유전자를 스크리닝하기 위한 증폭된 라이브러리 평판배양
증폭된 라이브러리를 상기 기술한 바와 같이 적정하였다. 상기 기술한 바와 같이 생장시킨 600μL의 대장균 XL1-Blue MRF'에 약 50,000의 재조합 플레이그를 가하였다. 37℃에서 15분 후 48℃의 6.5mL의 상부 한천을 가하고 세포를 150 X 15mm NZY 플레이트 상에서 평판배양하였다. 총 200,000 의 재조합 플레이크를 함유하는 4개의 평판을 제조하고 37℃에서 밤새 항온하였다. 이후 평판을 4℃에서 4시간동안 냉각시킨 다음 하기 기술한 바와 같이 플레이크 리프트를 제조하기 위하여 사용하였다.
e) 커피 ACC 신타아제 유전자에 상응하는 올리고뉴클레오티드의 확인 및 구축
미국 특허 출원 제08/485,107호(이 명세서는 본원에 참고문헌으로 합체되어 있음)에 기술된 이전 연구에서, 우리는 본원에서 교감 서열이라 일컫는 여러 식물에서 발생하는 ACC 신타아제에 공통인 염기 서열을 확인하였다. 이들 연구에 기초하여 우리는 교감 서열에 해당하는 커피 제1 가닥 cDNA 부분의 PCR 증폭에 대하여 3개의 완전 퇴화한 프라이머를 개발하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같다:
ACS167: 5'-GCCAAGCTTCCRTGRTARTCYTGRAA-3' (서열번호 3)
ACS289: 5'-TTYCARGAYTAYCAYGGHYT-3' (서열번호 4)
ACS885: 5'-CCHGGDARNCCYAWRTCTTT-3' (서열번호 5)
f) 제1 가닥 커피 cDNA를 얻기 위한 가역 전사효소 반응
GeneAmp RNA PCR Core Kit(Perkin Elmer, Foster City, CA)를 사용하여 최종 부피 20μL에서 제1-가닥 cDNA를 얻기 위한 가역 전사효소 반응을 수행하였다. 먼저 마이크로원심분리관내에서 3μL의 수중 0.9μg의 커피 원두 mRNA를 50μM의 랜덤 헥사머 및 6μL의 살균수와 혼합하고 65℃에서 5분간 항온하였다. 혼합물을 실온에서 2분간 정치하고 간단하게 원심분리하여 액체를 관의 바닥으로 회수하였다. 이 혼합물에 2μL의 PCR 완충액 II(상기 언급한 키트로부터 얻음), 4μL의 25mM MgCl2, 2μL의 10mM dNTP, 1μL의 RNAsin(20u/μL) 및 1μL의 가역 전사효소(50u/μL)를 가하였다. 반응물을 42℃에서 1시간동안 항온시킨 다음 가역 전사효소를 95℃의 수조에서 5분간 열 불활성화시켰다.
g) 커피 ACC-신타아제 유전자를 증폭시키기 위한 중합효소 사슬 반응
10μL의 제1-가닥 cDNA 혼합물, 4μL의 PCR 완충액 II, 1μL의 25mM MgCl2, 2.5μL의 20μM AC5167 프라이머(서열 제3번), 2.5μL의 20μM의 AC5885 프라이머(서열 제5번), 29.5μL의 살균 H2O 및 0.5μL의 Tag DNA 중합효소(5u/μL)를 함유하는 50μL의 반응에 상기 기술한 GeneAmp Kit를 사용하여 중합효소 사슬 반응(PCR)(Saiki등, 1988)을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 1분간, 44℃에서 1분간 및 72℃에서 2분간 25회였다. PCR 반응 생성물은 1.5%의 SeaPlaque 아가로즈(FMC BioProducts, Rockland, ME) 및 사이즈 마커로서 Hae III-이화된 øX174 DNA(Promega Corporation, Madison, WI)를 사용하여 아가로즈 겔 전기영동에 의하여 분석하였다.약 650bp의 단일한 PCR 생성물이 얻어졌다.
h) 상이한 프라이머를 이용한 PCR 생성물의 증폭
상기에서 얻은 650bp 단편을 겔로부터 잘라내어 1.5mL의 마이크로원심분리관에 놓았다. 200μL의 살균수를 가한 다음 650bp 단편을 5분간 90℃로 가열하고 실온으로 냉각한 다음 마이크로원심분리로 5분간 14,000rpm에서 원심분리시켰다. 증폭된 DNA를 함유하는 상청액을 분리하여 새로운 살균 1.5mL 마이크로원심분리관에 두었다. 주형으로서 0.4μL의 먼저 증폭시킨 DNA, 2.5μL의 10 X PCR 완충액(10mM 트리스-HCl pH 9.0, 0.1% 트리튼 X-100), 2μL의 25mM MgCl2, 5μL의 1mM dNTP, 1μL의 20μM ACS289 프라이머(서열번호 5), 1μL의 20μM ACS885 프라이머(표2), 12.8μL의 H2O 및 0.3μL의 Tag DNA 중합효소(5u/μL)(Promega Corporation, Madison, WI)를 사용하여 25μL의 PCR 반응을 수행하였다. PCR은 94℃에서 1분간, 45℃에서 1분간 및 72℃에서 2분간 35 싸이클로 수행하였다. 이 반응물 5μL를 상기 기술한 바와 같이 1.5%의 아가로즈 겔에서 전기영동시켰다. 약 603bp의 단일 생성물이 관찰되었다. 반응물 나머지에 8μL의 살균수, 10μL의 3M 아세트산나트륨(pH 5.2) 및 220μL의 100% 에탄올을 가하였다. 20℃에서 밤새 항온시킨 후 4℃에서 30분간 14,000rpm으로 원심분리하여 DNA를 회수하였다. DNA를 400μL의 얼음-냉각된 75% 에탄올로 세척하고 25μL의 살균수에 재현탁시켰다. 에티듐 브로마이드 플레이트 분석을 통하여 DNA 농도는 10ng/μL인 것으로 측정되었다.
i) 커피 원두-특이적 ACC 신타아제 DNA 라벨링
PCR-생성된 ACC 신타아제 DNA 및 Prime-a-Gene Kit(Promega Corporation, Madison, WI)를 사용하여 랜덤 프라임된 탐침을 얻었다. 2 및 1과 2분의 1μL의 DNA(25ng)를 27.5μL의 살균수에 가하고 5분간 끓여 DNA를 변성시켰다. 10μL의 5 X 라벨링 완충액, 2μL의 라벨링되지 않은 dNTP[각각 20μM; dCTP, dGTP, dTTP], 2μL의 1mg/mL 아세틸화된 BSA, 1μL의 5u/μL 대장균 DNA 중합효소 I Klenow 단편 및 5μL(50μCi)의 [α-32P]dATP(3,000Ci/mmole)(Dupont-NEN)를 가하여 최종 부피 50μL를 얻었다. 2μL의 0.5M Na2EDTA를 가하고 2분간 끓여 실온에서 1시간후 반응을 종결시켰다.
j) ACC 신타아제-특이 탐침을 이용한 증폭된 라이브러리 스크리닝
각각 50,000의 재조합 복제물을 함유하는 4개의 150x15 mm NZY 플레이트의 플레이크 리프트를 제조하였다. 이들을 약 10초동안 5 X SSC 완충액으로 포화시킨 크로마토그래피지에 놓아 4개의 132 mm Magma 나일론 전달 멤브레인(Micron Separations, Incorporated, Westborough, MA)을 습윤시켰다. 멤브레인을 재조합 플레이크를 함유하는 평판 상에 5분간 놓고 분리하여 0.5M NaOH 및 1.5 M NaCl로 포화시킨 크로마토그래피지 상에서 2분간 항온시켰다. 이후 멤브레인을 0.5M 트리스-HCl(pH 8.0) 및 1.5M NaCl로 포화시킨 크로마토그래피지 상에 옮겨 5분간 중화시켰다. 0.2M 트리스-HCl(pH 7.5)을 함유하는 2 X SSC로 포화시킨 크로마토그래피 시트상에서 20초간 짧게 처리한 다음 충전재를 건조 상태로 블롯팅시켰다. 1 시간동안 자연건조한 다음 UV Stratalinker 1800(Stratagene, La Jolla, CA)에서 12,000μJ의 260nm UV선으로 처리하여 멤브레인에 DNA를 교차결합시켰다.
HB-OV-BL 병을 사용하여 Hybaid Mark II 잡종형성 오븐(National Labnet Company, Woodbridge, NJ)에서 100mL 6 X SSPE(52.2 g/L NaCl, 8.3 g/L NaH2PO4.H2O, 2.2 g/L Na2EDTA[pH 7.4]), 5 X Denhardt 용액(1 g/L Ficoll, 1 g/L 폴리비닐피롤리돈, 1 g/L BSA[펜탁스 분급물 V]), 0.5% SDS 및 100μg/mL의 변성된 청어 정자 DNA내에서 4개의 멤브레인을 65℃에서 2시간동안 예비잡종형성하였다.
0.5%의 SDS, 100μg/mL의 변성된 청어 정자 DNA 및 상기 기술한 바와 같은 52μL의 랜덤 프라임된 탐침을 함유하는 10mL의 6 X SSPE에서 12시간동안 65℃에서 잡종형성시켰다. 잡종형성 끝에 잡종형성 용액을 제거하고 65℃에서 0.5%의 SDS를 함유하는 100mL의 2 X SSC로 멤브레인을 간단하게 세척하였다. 이후 이것을 다시 30분간 65℃에서 동량의 신선한 완충액으로 다시 세척하였다. 멤브레인을 65℃에서 30분간 0.5%의 SDS를 함유하는 100mL의 0.2 X SSC를 사용하여 2번 더 세척하고 셀로판으로 포장한 다음 -70℃에서 24시간동안 미리 플래쉬한 Fuji RXGCU X-선 필름에 노출시켰다. 확인된 플레이크에 해당하는 원래의 플레이트 부분을 분리하여 20μL의 클로로포름을 함유하는 1mL의 SM 완충액에 놓았다. 10개 중에서 5개를 더 낮은 농도에서 다시 플레이팅하고 상기와 같이 재스크리닝하여 개개의 플레이크를 얻었다.
k) 커피-원두 ACC 신타아제 cDNA의 특화
cDNA 삽입 부위를 측면공격하고 클로닝 벡터내 존재하는 T3 및 T7부와 상동인 프라이머를 사용하여 중합효소 사슬 반응으로 추정 커피 ACC 신타아제 cDNA의 크기를 측정하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같다:
T3 : 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (서열번호 6)
T7 : 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' (서열번호 7)
PCR 조건은 온도 싸이클이 95℃에서 1분간, 50℃에서 1분간 및 72℃에서 2분간이라는 것을 제외하고 상기 기술한 바와 같았다. 전과 같이 아가로즈 겔 전기영동에 의하여 분석하였다.
3개의 가장 큰 클론을 생체내에서 잘라 파지미드로서 수거하였다. 단일 플레이크로부터 얻은 200μL의 파지 스톡을 1.0의 O.D.600의 밀도로 생장시킨 200μL의 대장균 XL1-Blue MRF'와 혼합하였다. 1μL의 ExAssist(Stratagene, La Jolla, CA) 헬퍼 파지(1 X 106 pfu/μL 초과)를 가하고 37℃에서 15분간 관을 배양하였다. 3mL의 살균 LB 배양액을 가하고 흔들어주면서 37℃에서 3시간동안 배양하였다. 70℃에서 20분간 가열하고 1,000 X g에서 15분간 원심분리한 후 필라멘트 파지 입자로서 포장된 잘라낸 pBluescript 파지미드를 함유하는 1mL의 상청액을 살균 1.5mL 마이크로원심분리관에 옮기고 4℃에서 저장하였다. O.D.600에서 측정할때 1의 밀도로 생장시킨 200μL의 대장균 Solar 세포들(Stratagene, La Jolla, CA)에 25μL의 스톡 용액을 가하여 파지미드를 회수하였다. 37℃에서 15분간 항온시킨 다음 200μL의 세포 혼합물을 50μg/mL의 암피실린을 함유하는 100 X 15mm NZY 한 천 플레이트 상에서 평판배양하였다. 이 평판들을 37℃에서 밤새 항온시켰다. 개개의 클론들을 50μg/mL의 암피실린을 함유하는 10mL의 LB 배양액내로 집어넣고 37℃의 항온기내에서 흔들어주면서 밤새 생장시켰다. 원심분리를 반복하여 1.5mL 살균 마이크로원심분리관에 세포들을 농축하고 QIAGEN에서 얻은 플라스미드 미니 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정제하였다. 박테리아 펠릿을 물로 세척하고 0.3mL의 완충액 P1내에 재현탁시켰다. 이후, 0.3mL의 알카리성 용균 완충액 P2를 가하고 부드럽게 혼합한 다음 실온에서 5분 미만동안 항온시켰다. 0.3mL의 차가운 완충액 P3을 가한 다음 관을 6번 바꿔 혼합하면서 추출물을 얼음 위에서 10분간 항온하고 마이크로원심분리로 15분간 14,000rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 분리하여 미리 1mL의 QDT 완충액으로 평형을 맞춘 QIAGEN-팁 20 칼럼에 가하였다. 중력낙하에 의하여 추출물이 칼럼의 수지로 들어가게 하였다. 일단 흐름이 멈추자 칼럼을 1mL의 완충액 QC로 4번 세척하였다. 1.5mL의 마이크로원심분리관에 수거한 0.8mL의 완충액 QF로 QIAGEN-팁 20 칼럼을 세척하여 DNA를 용출시켰다. 0.7 부피(560μL)의 이소프로판올을 가하여 DNA를 침전시켰다. 14,000rpm에서 30분간 관들을 즉시 원심분리하고 상청액을 조심스럽게 분리하였다. DNA를 함유하는 펠릿을 1mL의 얼음-냉각된 70% 에탄올로 20회 세척하고 상기와 같이 원심분리시킨 다음 5분간 자연건조시켰다. 50μL의 살균 H2O에 DNA를 재현탁시켰다. 한 플라스미드 분리로부터의 DNA 농도는 형광분석에 의하여 0.1μg/μL였다.
4μL의 T3 또는 T7 시퀀싱 프라이머(0.8 pmol/μL)와 8μL의 파지미드 DNA(0.8μL)를 혼합하여 시퀀싱 반응을 수행하였다. 하와이 대학 바이오테크놀로지 서비스 센터에서 이들 시료에 대한 자동 DNA 시퀀싱을 수행하였다. cDNA의 5' 및 3' 말단으로부터 약 350bp의 서열을 얻었다. 이전 서열의 말단 근처의 서열을 기초로 하여 새로운 시퀀싱 프라이머를 합성하여 cDNA의 양가닥의 서열을 완성하는 동일한 방식으로 사용하였다. 커피 원두-발현된 ACC 신타아제 cDNA의 완전한 서열은 도1에 주어져 있다. 커피 원두-발현된 ACC 신타아제의 추론 아미노산 서열은 도2에 주어져 있다.
커피 ACC 신타아제 cDNA 클론의 서열 및 추론된 단백질을 GenBank에 존재하는 다른 ACC 신타아제 유전자와 비교하였다. 커피 원두로부터 분리된 cDNA는 GenBank에 존재하는 다른 ACC 신타아제와 68.3-58.1% 동일한 것으로 보인다. 이러한 cDNA로부터 추론된 단백질 서열은 다른 ACC 신타아제와 67.9-50.5% 동일한 것으로 보인다. 그러나 이러한 cDNA는 1500bP보다 큰 서열은 이것과 68.3% 이상 동일하지 않다는 점에서 특이하다.
실시예 2
커피 원두-특이 ACC 산화효소의 분리
a) ACC 산화효소 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머의 합성
RNA, mRNA의 분리 및 커피 원두-특이 cDNA의 합성은 앞서 기술한 바와 같다.
GCG(Genetics Computer Group, Madison, WI)의 파일업 프로그램을 이용하여 GenBank로부터 얻은 12개의 ACC 산화효소 서열을 배열하였다. 번역 출발 코돈으로부터 약 1000bp부가 보존된 것으로 밝혀졌으며 이 부분에 해당하는 퇴화 올리고 뉴클레오티드 프라이머
5'-TCATIGCKKCRAKIGGTTC-3' (서열번호 8)
를 제조하였다. 이노신(I)을 서열 보존이 보이지 않는 위치에 위치시켰는데 위치는 혹종의 A, T, G 및 C일 수 있을 것이기 때문이다. 잔기를 혼합하여(T/G 또는 A/G) 2배로 불명료한 위치를 만들었다. 또한 실험실에서 미리 클로닝하고 아래의 번역 출발 코돈으로부터 약 372bp에 위치한 파파야 열매-발현된 ACC 산화효소 cDNA 부분과 상동인 제2의 프라이머를 제조하였다.
5'-GACACTGTGGAGAGGCTGAC-3' (서열번호 9).
두 프라이머를 PCR 반응에 사용하여 커피 원두-발현된 ACC 산화효소의 일부를 증폭시켰다. PCR은 0.2μL(10ng) cDNA 분급물(3)(실시예1에 기술함), 5μL의 10 X PCR 완충액, 3μL의 25mM MgCl2, 4개의 10mM dNTP 각 1μL, 1μL의 20μM 각 프라이머 용액, 0.3μL의 Taq DNA 중합효소(Promega Corporation, Madison, WI) 및 38.5μL의 물을 함유하였다. PCR 조건은 94℃에서 1분간, 50℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간의 35 싸이클이었다. 마지막 싸이클 후 72℃에서 5분간 항온시켰다. 20μL의 생성물 알리코트를 앞서 기술한 바와 같이 1.5%의 아가로즈 겔에서 전기영동시키고 약 800bp 생성물을 밝혔다. 겔로부터 DNA를 잘라내고 1.5mL의 마이크로원심분리관에서 200μL의 살균수와 혼합하였다. 5분간 끓인 후 동일한 프라이머를 사용하여 상기와 같은 50μL의 PCR 반응에서 주형으로서 2μL를 사용하였다. 20μL의 PCR 반응을 이용하여 상기 기술한 바와 같이 수행한 겔 전기영동은 단일한 800bp 생성물의 존재를 나타내었다. 남아있는 30μL의 PCR 반응에 20μL의 클로로포름 및 100μL의 물을 가하였다. 내용물을 혼합하고 마이크로원심분리에서 2분간 14,000rpm으로 원심분리하였다. DNA를 함유하는 상부 수성 상을 분리하여 깨끗한 마이크로원심분리관으로 옮겼다. 이 DNA 일부를 상기 기술한 바와 같이 랜덤 프라임된 합성으로 방사선 라벨링하였다.
b) 랜덤 프라임된 탐침을 이용한 증폭된 라이브러리 스크리닝
실시예1에 기술한 증폭된 커피-원두 cDNA를 사용하여 앞서 기술한 바와 같은 4개의 150 X 10mm NZY 평판를 제조하였다. 예비잡종형성, 잡종형성 및 클론 회수는 PCR로 얻은 ACC 산화효소 서열을 탐침으로서 사용한 것을 제외하고 앞서 기술한 바와 같았다.
c) 커피-원두 ACC-산화효소 cDNA 클론의 특화
실시예1에 기술한 바와 같은 T3 및 T7 촉진유전자에 상동인 프라이머를 사용하여 중합효소 사슬 반응으로 커피 ACC-산화효소 cDNA 클론의 크기를 측정하였다.
가장 큰 커피 ACC 산화효소 cDNA 클론의 서열은 실시예1에 기술한 바와 같이 얻었고 GenBank에 존재하는 ACC 산화효소 유전자들과 비교하였다. 도3은 커피 원두-특이 ACC 산화효소의 서열을 준다. 도4는 이러한 단백질의 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. cDNA를 측정하여 ACC 산화효소를 암호화하였는데 이것은 GenBank에 존재하는 다른 ACC 신타아제 핵산 서열과 50.4-82.5% 동일하기 때문이다. 또한 추론된 단백질 서열은 다른 ACC 산화효소와 32.5-86.5% 동일하다.
증거 A
a) 안티센스 ACC 신타아제 및 ACC 산화효소 전사물 발현을 위한 벡터의 제조.
예를 들어, 안티센스 발현 또는 동시-억제에 의하여 ACC 신타아제 및 ACC 산화효소의 cDNA 를 이용하여 커피 내의 에틸렌 함량을 줄일 수 있다. 벡터 pKR1 로 상기 물질의 이용을 예시하겠다. 이것은 단지 예시일 뿐이고 다양한 기타 식물 형질전환 벡터를 ACC 신타아제 및 ACC 산화효소 cDNAs와 접합시켜 사용할 수 있다. pKR1을 pBI-121(Clontech Laboratories)를 하기와 같이 변환하여 제조하였다.
cre 부위-특이 재조합 효소에 대한 lox 인식 부위를 함유하는 두 개의 38-염기 쌍 합성 서열을 pBI-121의 니오마이신 포스포트랜스페라제 Ⅱ(NPT Ⅱ)선택성 표지 유전자 주위로 삽입하였다. 상기 lox 부위는 벡터 구축물이 식물 게놈에 합체된 후, 구축물로부터 NPT Ⅱ 유전자가 제거되게 하나, [Dale and Ow, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 88:10558(1991)] 안티센스 ACC 신타아제 및 ACC 산화효소 cDNAs의 작동과는 관계가 없다.
세 개의 합성 올리고뉴클레오티드를 Dale 및 Ow(supra)에 의하여 밝혀진 loxP 서열을 기초로 하여 합성하였다.
loxA : 5`-AGCTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3`
loxB : 5`-AGCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3`, 및
loxC : 5`-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGCT-3`
loxB 는 loxA 및 loxC 양쪽에 상보적인 가닥이다. loxA 및 loxB를 어닐링할 때, 이들은 이중-가닥 분자를 형성하는데, 상기 이중-가닥 분자에는 HindⅢ 돌출부 분(overhang)에 대하여 상보적이고, pBI-121 내의 NPTⅡ 유전자 옆의 NOS 전사 종결 서열 다음에 발견되는 서열과 같은 HindⅢ 부위로 상기 이중-가닥 서열이 삽입되게 하는, 4-염기 돌출부분이 있다. loxC 와 loxB 를 어닐링하여 lox 인식 부위를 함유하는 블런트(blunt)말단을 가진 이중-가닥 DNA 를 제조한다.
합성 lox 부위를 pBI-121 의 NPTⅡ 유전자 주위에 하기와 같이 삽입하였다. 37℃에서 2시간동안, 제조자에 의하여 공급된 반응 완충제 내에서 pBI-121 을 PmeI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 절단(digested)하였다. pBI-121은 NPTⅡ 유전자의 발현을 촉진시키는 NOS 프로모터 바로 가까이에 단일 PmeI 부위를 갖는다. 동일한 몰량의 loxB 및 loxC 를 95℃에서 가열함으로써 어닐링시켜 합성 lox 부위를 제조하고, 상온에서 서서히 냉각시킨 후 PmeI 로 절단된 pBI-121 내로 리게이팅(ligating)하였다. 30㎕ 의 리게이팅 반응제는 리게이팅 완충액 (New England Biolabs, Beverly, MA), 60 nmol의 PmeI 로 절단된 pBI-121, 3㎕ 의 어닐링된 loxB/loxC 의 1μM 스톡(stock) 용액 , 4 단위의 PmeI 및 4,000 단위의 고농도 T4 DNA 리가아제 (New England Biolabs, Beverly, MA)를 포함하였다. 16℃에서 밤새도록 리게이팅하였다. 1 내지 4㎕ 의 리게이팅 반응제를 대장균(E. coli) XL1-Blue 세포(Stratagene)내로 전기 천공(electroporating)시키고 50㎍/㎖ 의 카나마이신, 50㎕ 의 20㎎/㎖ X-겔 및 10㎕의 100mM IPTG 을 포함하는 LB 평판 위에서 평판배양(plating)하였다. 흰색 콜로니(colonies)를 새 LB-카나마이신 마스터(master) 평판으로 분리해 놓았다.
lox 부위를 포함하는 콜로니를 콜로니 혼성화로 동정하였다. 마스터 평판을 4 시간동안 37℃에서 성장하게 하고 나일론 막(MSI)으로 블롯팅하였다. 상기 막을 37℃ 로 밤새도록 새 LB-카나마이신 평판에서 평판배양하였다. 막을 0.5 M NaOH 에 10분 정도 띄운 다음, 0.5M 을 함유한 0.5M Tris-HCl(pH 8.0)에 2분간 띄워 중화시킨후, 2 X SSC 로 헹구었다.
상기 막을 20㎖의 6 X SSPE, 5 X Denhardt`s 용액, 0.5% SDS 및 100㎍/㎖의 herring sperm DNA 내에서 55℃로 3 시간동안 전-혼성화하였다. 전-혼성화 용액을 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 [32P]로 5`말단이 표지된 8.4 X 106cpm의 lox C 가 포함된 새 용액 10㎖ 으로 교체하였다. 50㎕의 표지 반응제는 50 pmole의 loxC, 폴리뉴클레오티드 키나제 반응 완충제(Promega), 15㎕의 3,000 Ci/mmol [-32P] ATP (DuPont-NEM) 및 20 단위의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Promega)를 포함하였다. 반응제를 37℃에서 10분동안 항온시키고 생성물을 Sephadex G-25 회전(spin) 컬럼을 사용하여 결합되지 않은 ATP로부터 분리하였다. 55℃에서 밤새도록 혼성화시켰다. 필터를 55℃에서 0.5% SDS 를 함유한 2 X SSC 100㎖ 으로 두 번, 0.5% SDS 를 함유한 1 X SSC 100㎖ 으로 한 번 세척하고, 이전에 기술한 바와 같이 자동방사선 사진을 찍었다(autoradiographing). 일부 콜로니가 강하게 혼성화된 것을 알 수 있었으며 그 중 더욱 혼성화된 것을 선택하였다. 플라스미드 DNA 를 Magic Minipreps DNA Purification System
Figure 112005046165113-PAT00001
(Promega)를 사용하여 추출하고 상기 기술한 바와 같이 PmeⅠ로 절단하였다. lox 부위를 함유하는 플라스미드는 더 이상 PmeⅠ부위를 갖지 않을 것이다. PmeⅠ에 의하여 절단되지 않은 플라스미드를 추가로 하와이 대학의 생명공학 센터에서 자동 DNA 서열 결정 기법으로 분석하여, lox 부위의 삽입 여부를 확인하였다.
원하는 방향으로 lox 부위를 포함하는 플라스미드를, 완전한 HindⅢ 제한 부위가 아닌 HindⅢ 스티키(sticky)말단을 포함하며 상기 기술된 바와 같이 어닐링되고 리게이팅된, loxA/loxB 두 가닥 분자(heteroduplex)와 혼합되어 있는 HindⅢ로 절단하였다. 연결(ligation) 반응제는 2.5㎍의 HindⅢ 로 절단된 플라스미드, 1.25 pmole 의 loxA/loxB, 연결 완충제(Promega), 6단위의 T4 DNA 리가제 (Promega), 1.25 단위의 HindⅢ(Promega)를 최종 부피가 30㎕가 되도록 포함하였다. 반응제를 상온에서 1 시간동안 항온하였고, 80℃에서 10분동안 가열한 후, 대장균 XL1-Blue 세포 내로 전기 천공(electroporation)(Stratagene)에 의하여 도입하였다. 임의의 플라스미드가 상기와 같이 HindⅢ로 절단됨으로써 HindⅢ 부위가 손실된 것을 분리하였다(screening). pKR1을 가리키는, 상기 플라스미드 구조를 DNA 서열 결정 기법에 의하여 상기 기재한 바와 같이 확인하였다.
pKR1을 SacI.으로 절단하였다. 173㎕ 의 반응제는 10㎍ 의 pKR1, 다핵(mulicore) 완충액(Promega), 및 20 단위의 SacI.(Promega)를 함유하였다. 37℃에서 1 시간이 지난 후, 0.7㎕ 의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 25mM 집합제 및 10단위의 T4 DNA 중합효소(Promega)를 가하였다. 블런트-말단이 있는 SacI 절단 생성물을 제조할 이 반응제를 15℃에서 30분간 항온시켰다. 75℃에서 15분간 항온시켜 T4 DNA 중합효소를 불활성화한 후, 24 단위의 SmaI를 가하고 반응물을 상온에서 2 시간동안 항온시켰다. 80℃에서 15분 간 가열하여 반응을 종결시켰다. 17㎕ 의 3M 아 세트산나트륨 및 375㎕ 의 100% 에탄올을 첨가하여 DNA 를 침전시켰다. -70℃에서 1시간이 지난 후, DNA 를 4℃에서 20분 동안 최대 속도로 마이크로원심분리기 내에서 원심분리하여 수거하였다. DNA를 70% 에탄올로 세척하고, 진공에서 건조시킨 후, 88㎕ 의 물에 용해시켰다. 10㎕의 10 X 칼프 인테스티날(calf intestinal) 알칼리성 포스파타제 완충액 (Promega) 및 20 단위의 칼프 인테스티날 알칼리성 포스파타제를 가하고 반응물을 37℃에서 2 시간동안 항온시켰다. 4㎕ 의 0.5 M EDTA 를 가하고 75℃에서 10 분 동안 가열함으로써 반응을 종결시켰다. 시료를 페놀 포화 수용액을 추출한 다음 동일한 부피의 페놀:클로로포름(1:1) 및 마지막으로 클로로포름으로 추출하였다. 0.1 volume의 3M 아세트산나트륨 및 2.5 volume 100% 에탄올을 가한 후 DNA 를 침전시켜 수거하였다.
커피 ACC 신타아제 및 ACC 산화효소 cDNA 삽입물을 원래의 플라스미드인 pACS 및 pACO로부터 하기와 같은 제한 효소를 사용하여 잘라내었다. 10 ㎍의 pACS 플라스미드를 10㎕의 10 X 다핵 완충액 (Promega), 40 단위의 SmaI를 함유하는 100㎕로 절단하였다. 25℃에서 밤새도록 항온시킨 다음, 40 단위의 BsrSI를 가하고 67℃에서 반응을 계속하였다. 67℃에서 2 시간이 지난 후, 반응 시험관을 얼음으로 10 분 동안 냉각시킨 다음 37℃에서 항온시켰다. 반응 혼합물을 1㎕의 10mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 1㎕의 1㎎/㎖ 아세틸레이팅된(acetylated) BSA 및 15 단위의 T4 DNA 중합효소(Promega)로 보충하였다. 반응물을 37℃에서 5 분 동안 항온시켜 DNA가 블런트-말단이 되도록 하였다. 75℃에서 30분 동안 항온시켜 T4 DNA 중합효소를 불활성화시킨 다음, 부피를 Speed-Vac
Figure 112005046165113-PAT00002
에서 50㎕로 감축시켰다. 전기영동을 이용하여 1% SeaPlaque 아가로스 겔 상에서 절단 생성물을 분리하였다. 1.6 kb 의 커피 ACC 신타아제 cDNA 를 아가로스 겔에서 잘라내고 1.12 단위의 아가 에이스(Agar ace) (Promega)로 아가로스를 절단하여 cDNA 삽입물을 수거하였다. 45℃에서 30 분 동안 항온한 후, 24㎕의 3M 아세트산나트륨(pH 5.2) 및 600㎕의 95% 에탄올을 가하여 cDNA 를 침전시켰다. 에탄올-침전된 cDNA 를 30 분 동안 상온에서 원심분리하여, 윗 부분을 버리고, 얼음으로 차갑게 한 70% 에탄올로 펠릿을 세척한 후 상기와 같이 원심분리하였다. 펠릿을 100㎕의 물에 용해시킨 다음 pKR1 벡터 내로 블런트-말단 연결에 사용하였다.
ACC 산화효소 cDNA 삽입물을 pACS cDNA 에 대하여 상기 기술한 바와 유사한 방법으로 제조하였다. 10 ㎍의 pACO 플라스미드를 10 ㎕ 의 10 X 완충액 C (Promega), 1 ㎕의 1㎎/㎖ 아세틸레이팅된(acetilated) BSA, 30 단위의 Bali 및 30 단위의 bamboo를 함유하는 100㎕ 내에서 절단하였다. 37℃에서 2 시간 동안 항온시킨 후, 반응 혼합물을 1㎕의 10mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 15 단위의 T4 DNA 중합효소(Promega)로 보충하였다. 반응물을 37℃에서 5 분 동안 항온시켜 블런트-말단을 생성시켰다. 75℃에서 30분 동안 항온하여 T4 DNA 중합효소를 불활성화시킨 다음, 부피를 Speed-Vac
Figure 112005046165113-PAT00003
에서 50㎕로 감축시켰다. 절단 생성물을 1% SeaPlaque 아가로스 겔 상에서 전기영동에 의하여 분리하였다. 1 kb 의 커피 ACC 산화효소 cDNA 를 아가로스 겔에서 잘라내고 1.12 단위의 Agar ace (Promega)로 아가로스를 절단하여 cDNA 삽입물을 수거하였다. 아가로스로에서 얻은 cDNA 삽입물의 정제는 ACC 신타아제 삽입 물에 대하여 기술된 것과 같다. 펠릿을 50㎕의 물에 용해시킨 다음 pKR1 벡터 내에서 블런트-말단 리게이션에 사용되었다.
500ng 의 pKR1벡터[블런트 말단을 가지며 포스파타제된(phosphatased) SmaI/SacI 단편] 및 150 ng 의 ACC 신타아제 또는 ACC 산화효소 삽입물을 분리 시험관내에서 혼합하여 정제된 ACC 신타아제 및 ACC 산화효소 삽입물을 pKR1 벡터 내에서 결합시켰다. 각 벡터/삽입물 혼합물의 부피를 Speed-Vac
Figure 112005046165113-PAT00004
를 사용하여 8㎕로 감축시켰다. 각각의 벡터/삽입물 시험관에, 1㎕의 10 X 리가제 완충액(Promega) 및 1㎕의 T4 DNA 리가제(10단위)를 가하였다. 내용물을 8℃에서 48 시간동안 항온하였다.
각 연결 생성물의 1 ㎕를 40㎕의 XL-1Blue 세포[이미 전기 천공(electroporation)용으로 제조되었고 -70℃에서 저장하였음]와 혼합하고 "Electro Cell Manipulator 600"(ECM 600, BTX Inc., CA)을 2.35 KV 에서 5 msec 동안 사용하여 전기 천공시켰다. 전기 천공 후 즉시, 1㎖의 LB 완충액을 각 시험관에 가하고 회전 진동기에서 250 RPM 으로 1 시간 동안 항온시켰다. 항온 후, 박테리아를 1400 RPM 으로 2 분 동안 원심분리시켜 침전시키고 부피를 100㎕로 감축시켰다. 50㎕ 의 혼합물을 40㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 평판 내에서 평판배양하여 밤새도록 37℃로 항온하였다. 카나마이신 평판에서 자란 콜로니를 분리하여 ACC 신타아제 또는 ACC 산화효소 삽입물을 포함하는 클론을 동정하였다. 각 콜로니를 살균된 집게(tooth picks)를 사용하여 분리하여 그리드 형(grid pattern) 내의 새 LB-카나마이신 평판 상에 놓았다. 각 cDNA 삽입물(ACC 신타아제 및 ACC 산화효소)에 대하여 3 개의 평판이 있었다. 그리드에서 밤새도록 배양시킨 후, 박테리아를 Magna 나일론 막(MSI, MA)에서 반복 블로팅하였다. 막을 10%의 SDS 에서 5 분간, 0.5M NaOH 및 1.5 M NaCl 에서 15 분간, 0.5 M Tris-HCl 및 1.5 M NaCl에서 15 분간, 및 2 X SSC 및 0.2 M Tris-HCl 에서 5 분간 연속적으로 처리하였다. 막을 공기 건조 시키고 80℃에서 20 분간 건조시킨 후 120,000 μJoule 의 UV 조도(Strata Linker UV crosslinker 1800, Stratagene, CA)로 가교-결합시켰다.
막을 6 X SSPE, 5X Denhardt`s 용액, 0.5% SDS 및 100㎍/㎖ herring sperm DNA 내에서 65℃로 전-혼성화시켰다. ACC 신타아제 및 ACC 산화효소에 대한 프로브(probe)를 Ready-to-Go DNA 표지 구슬(Pharmacia)를 사용하여 합성하였다. 50 ng 의 각 cDNA 삽입물을 45 ㎕ 의 물에서 끓여 변성시키고 얼음으로 변성을 종결시켰다. 45㎕의 변성 DNA 를 Ready-to-Go DNA 표지 구슬 및 5㎕ 의 [32-P] dCTP (3000 Ci/mmol)과 혼합하고 37℃에서 30분 동안 항온시켰다. 프로브 합성 후, 시험관을 물에서 4 분동안 끓이고 얼음으로 종결시켰다. 전-혼성화 완충액을 버리고 변성 된 프로브를 가한 다음, 10 ㎖의 전열된 혼성화 완충액(6 X SSPE, 0.5% SDS 및 100㎍/㎖ 허링 스펌 DNA)을 각각의 혼성화 용기에 부었다. 65℃에서 밤새도록 혼성화하였다.
막을 2 X SSC 및 0.5% SDS 로 간단히 세척하였다. 30분 간 동일한 완충액으로 2번째 세척하였다. 막을 0.2 X SSC 및 0.5 X SDS 로 두 번 세척하였다. 각 세척마다 30 분 걸렸다. 그 후, 막에 대하여 자동방사선 사진을 찍었다 (autoradiography). ACC 신타아제가 있는 5개의 pKR1 클론 및 ACC 산화효소가 있는 24개의 클론이 자동방사선 사진을 현상한 결과 확인되었다. 각 클론에서 유전자의 방향을 PCR, 제한 절단 및 벡터/삽입물 접합 서열 결정 기법을 이용하여 확인하였다. 각 29 개의 클론(5 개의 ACC 신타아제 및 24 개의 ACC 산화효소)의 박테리아 콜로니 중 일부를 집어내어 20㎕의 살균된 Milli-Q 물(세포 희석)내에 현탁시켰다. 25㎕의 PCR 반응물은 2㎕의 상기 세포 희석물, 0.5㎕ 의 각 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 10mM 집합물, 1.5㎕의 25mM MgCl2, 2.5㎕의 10 X 완충액(Promega), 1㎕의 하기와 같이 주어진 각각의 20 μM 세 가지 프라이머, 0.3㎕의 5 단위/㎕ Taq DNA 중합효소(Promega) 및 16.2 ㎕의 살균된 Milli-Q 물을 함유하였다. ACC 신타아제 클론에 사용되는 프라이머는 35S 프라이머 (5`-CCACTATCCTTCGCAAGACC-3`) ; ACSR7 (5`-TTGCCATCTTCGACAAGACT-3`) ; 및 ACSL4 (5`-CTGTTGTCAGCTGTGCTA-3`)이였다. ACC 산화효소 클론에 사용되는 프라이머 또한 35S 프라이머, ACOR4 (5`-GGACTTCTGAGATGTTGGAA-3`) ; 및 ACOL1 (5`-TGGTGGAGAGCAAGGAATTG-3`)이였다. 열 주기 조건은 94℃에서 10분, 94℃에서 1 분의 35 싸이클, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분, 및 72℃에서 5분이었다. pKR1/ACC 신타아제 구축물에 대한 PCR 생성물의 바람직한 크기는 센스 방향용으로는 320bp(35S 및 ACSR7)이고 안티센스 방향용으로서는 850bp(35S 및 ACSL4)이었다. 이와 유사하게, pKR1/ACC 산화효소 구축물에 대한 바람직한 생성물은 센스 방향용으로는 400bp(35S 및 ACOR4)이고 안티센스 방향용으로는 800bp(35S 및 ACOL1)이었다. ACC 신타아제 및 ACC 산화효소 모두에 있어서, 센스 및 안티센스 방향으로 cDNA 를 포함하는 플라스미드를 플라스미드 및 cDNA 사이의 접합을 DNA 서열 결정 기법으로 추가로 분석하여 그 방향을 확인하였다. 이전에 기술한 바와 같이 DNA 서열 결정 기법을 수행하였다. 안티센스 방향인 ACC 신타아제 유전자 (pKRCACS-A로 명시됨), 센스 방향의 ACC 신타아제 (pKRCACS-S로 명시됨), 안티센스 방향인 ACC 산화효소 (pKRCACO-A로 명시됨) 및 센스 방향의 ACC 산화효소 (pKRCACO-S로 명시됨)가 있는 이원 벡터가 그림 1 내지 4에 각각 나타나 있다.
그림 1. pKR1 내의 커피 ACC 신타아제 안티센스 cDNA
Figure 112005046165113-PAT00005
그림 2. pKR1 내의 커피 ACC 신타아제 센스 cDNA
Figure 112005046165113-PAT00006
그림 3. pKR1 내의 커피 ACC 산화효소 안티센스 cDNA
Figure 112005046165113-PAT00007
그림 4. pKR1 내의 커피 ACC 산화효소 센스 cDNA
Figure 112005046165113-PAT00008
b)센스 및 안티센스 방향인 ACC 신타아제 cDNA 유전자 ( pKRCACS -S 및 pKRCACS-A) 및 ACC 산화효소 ( pKRCACO -S 및 pKRCACO -A) cDNA 유전자를 함유하는 pKR1 플라스미드가 있는 아그로박테리아 ( Agrobacteria ) 의 전기 천공 ( Electroporation )
YM 액체 배지(0.4g/L 효모 추출물, 10g/L의 만니톨, 0.1g/L의 NaCl, 0.2 g/L MgSO4.7H2O, 0.5g/L K2HPO4, pH 7.5) 100㎖에서 OD600로 아그로박테리아 균주 LBA 4404 를 회전 진동기에서 29℃로 48 시간 동안 단일 콜로니로부터 배양하였다. 세포를 4000 Xg 에서 6 X 1011 세포/㎖로 원심분리하여 농축하였다. "Electro Cell Manipulator 600" (ECM 600, BTX Inc., CA)를 이용하여 전기 천공시켰다(electroporation). 200 ng 의 DNA 를 함유하고 있는 pKRCACS-A, pKRCACO-A, pKRCACS-S 또는 pKRCACO-S 플라스미드 용액을 3.5 ㎕ 씩 나눈 것을 50㎕의 농축 아그로박테리아 세포와 혼합하고 미리 냉각시켜두었던 2mm 갭 큐벳(BTX Inc., CA)로 옮겨 5ms 간격으로 2.35 kV 를 걸어주었다. 50㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 YM 액체 배지의 1 ㎖를 전기 천공된 세포에 가하고 이들을 29℃의 진동기에서 250 RPM 으로 1 시간 동안 재생되게하였다. 세포를 4000 X g 에서 원심분리하고 새 YM 액체 배지 100㎕에 재현탁시켰다. 옮겨진 박테리아를 50㎕/㎖의 카나마이신이 보충된 YM-아가 평판(15g/L Bacto-agar를 함유하는 YM 액체 배지)상에서 선택하였다.
29℃에서 48 시간동안 항온 후 아그로박테리움의 형질전환 여부를 각 형질전환체로부터 10 개의 콜로니를 표지된 그리드 상의 새 YM-아가/카나마이신 평판으로 분리하여 확인하였다. ACC 신타아제 및 ACC 산화효소 유전자 삽입물의 존재 및 방향을 내부 유전자-특이 프라이머 중 하나로 유도되는 35S 프라이머를 사용하여 PCR에 의하여 확인하였다. 각 콜로니 중 소량을 살균된 집게를 사용하여 20㎕의 살균된 Milli-Q 물로 옮겼다. 2㎕의 상기 세포 현탁액을 주형 DNA로서 사용하여 상기 기술한 바와 같이 PCR 반응을 수행하였다. ACC 신타아제에 대하여 센스 방향의 35S 및 ACSR7 프라이머가 사용되였고, 320bp로 원하는 크기의 생성물을 생산하였다. ACC 신타아제 안티센스 프라이머 35S 및 ACSR4은 850bp의 원하는 크기의 생성물을 만들었다. 유사하게, ACC 산화효소에 대하여 센스 방향 35S 및 ACOR4 프라이머가 사용되어 400bp로 원하는 크기의 생성물을 생산하였다. ACC 산화효소 안티센스 프라이머 35S 및 ACOL1은 800bp의 원하는 크기의 생성물을 주었다. 우리는 커피 잎 조직의 형질전환을 위하여 각 방향의 콜로니를 하나씩 선택하였다.
c) pKRCACS -A, pKRCACO -A, pKRCACS -S 또는 pKRCACO -S 플라스미드를 함유하는 아그로박테리아를 통한 커피 잎 조직의 감염.
비스듬하게 자란(plagiotrophic) 줄기로부터 채취한 성장한 어린 커피 잎을 30% Clorox 에서 30 분 동안 살균하고 살균된 증류수로 세 번 헹구었다. 주맥과 가장자리 사이의 엽편 약 7mm2 정도의 조각을 잘라서 MS 액체 배지(Murashige 및 Skoog, 1962)에 109 세포/㎖의 아그로박테리움 슬러리(slurry)와 함께 놓고 3 시간 동안 공동-배양하였다. 잎 조직을 살균된 종이 수건으로 건조 블로팅하고 2.0 g/L 피타겔(Phytagel)을 가하여 고형화시킨 MS 배지에서 3일 동안 나머지 아그로박테리움과 공동-배양하였다.
잎 조직을 살균된 종이 수건으로 다시 건조 블로팅하여 잔류 아그로박테리아를 제거한 후 500 ㎍/㎖의 카베니실린, 및 100 내지 300 ㎍/㎖의 카나마이신 모노설페이트 또는 10 내지 20 ㎍/㎖의 제네티신 (G418)을 함유하는 유합 조직 유도 배지(2,4-D 및 키네틴을 함유하는 MS 배지 : Sondahl 및 Sharp, 1977)로 옮겼다. 25℃ 암실에서 13일 동안 배양한 후, 최초의 유합조직이 나타나기 시작하였다.
d) pKRCACS -A, pKRCACO -A, pKRCACS -S 또는 pKRCACO -S 플라스미드를 함유하는 커피 잎 유합 조직의 계대배양
항생제 저항성 칼리(calli)를 300 ㎍/㎖ 카베니실린, 및 150-200 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 씨눈 유도 배지 MⅡ(바살 염, 중강력 MS 염, 10㎎의 티아민 HCl, 40 ㎎ 의 시스테인 HCl, 100 ㎎ 미오-이노시톨, 40g 수크로스, 2 ㎎의 BA, 1㎎ 의 피리독신, 1㎎ 의 니코틴산, 2.0 g의 피타겔, pH 5.65 : Yasuda 및 Fujii, 1985)에서 3 개월간 한 달씩 계대배양하였다. 상기 칼리를 30일 동안 100㎍/㎖ 카나마이신이 함유된 MⅡ 배지에서 배양하고, 추가로 30일동안 더 50㎍/㎖ 카나마이신이 함유된 MⅡ 배지에서 계대배양하였다. 상기 마지막 배지에서 체세포 씨눈이 형성되었다. 상기 체세포 씨눈은 형광 하에서 성장 조절자가 없는 발아 배지 MⅢ (바살 염, 초강력 MS 염, 10㎎의 티아민 HCl, 40 ㎎ 의 시스테인 HCl, 100 ㎎ 미오-이노시톨, 40g 수크로스, 2.0 g의 피타겔, pH 5.65 : Sondahl 및 Sharp, 1977) 에서 모종으로 발생되었다.
전술한 실시예는 단지 예시의 목적을 위함이며 청구범위에 기술된 본 출원인들의 발명 영역을 한정하려는 것은 아니다.
서열목록
(1) 일반적인 정보:
(i)출원인: 스틸스, 존 아이.
모이스야디, 이스테포
뉴페인, 카비 알.
(ii) 발명의 명칭: 정제된 단백질, 재조합 DNA 서열 및 커피의 성숙을 조절하는 방법.
(iii) 서열수: 13
(iv) 서신왕래 주소
(A)수신: 존, 데이, 리바이스 앤 포그
(B)거리: 노스 포인트, 901 레이크사이드 애버뉴
(C)도시: 클리블랜드
(D)주: 오하이오
(E)국가: 미국
(F)우편번호:44114
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A)매체 형태: 디스켓, 3.5인치, 1.44Mb 저장
(B)컴퓨터: IBM PC 호환용
(C)작동 시스템:MS-DOS v. 5.1
(D)소프트웨어:워드퍼팩 v 6.1
(vi) 현 출원 데이타:
(A)출원번호: 08/695,412추루언
(B)출원일:1996.08.12
(C)분류:435
(vii) 전 출원 데이타:
(A)출원번호:US08/485,107
(B)출원일:1995.06.07
(viii) 대리인 정보:
(A)성명: 그리피스, 캘빈 피.
(B)등록번호: 34,831
(C)참조번호: 265036600002
(ix) 통신 정보:
(A)전화: (216) 586-7050
(B)텔레팩스: (216) 579-0212
(2) 서열번호 1 에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A)길이: 15 아미노산 잔기
(B)타입: 아미노산
(C)사슬성: N/A
(D)토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
*(ix) 특징:
(A)명칭/키: Fragment A
(B)위치: 17..1480
(xi) 서열 기술: 서열번호 1
Figure 112005046165113-PAT00009
(2) 서열번호 2에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A)길이: 14 아미노산 잔기
(B)타입: 아미노산
(D)토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(xi) 서열 기술: 서열번호 2
Figure 112005046165113-PAT00010
(2) 서열번호 3에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A)길이: 20 염기쌍
(B)타입: 핵산
(C)사슬성: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: 기타 핵산
(A)기술: 프라이머
(v) 단편 형태: 내부형
(ix) 특징:
(A)기타 정보: N IS INOSINE
(xi) 서열 기술: 서열번호 3
Figure 112005046165113-PAT00011
(2) 서열번호 4에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A)길이: 20 염기쌍
(B)타입: 핵산
(C)사슬성: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: 기타 핵산
(A)기술: 프라이머
(v)단편 형태: 내부형
(ix) 특징:
(A)기타 정보: N IS INOSINE
(xi) 서열 기술: 서열번호 4
Figure 112005046165113-PAT00012
(2) 서열번호 5에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A)길이: 20 염기쌍
(B)타입: 핵산
(C)사슬성: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: 기타 핵산
(A)기술: 프라이머
(v)단편 형태: 내부형
(ix) 특징:
(A)기타 정보: N IS INOSINE
(xi) 서열 기술: 서열번호 5
Figure 112005046165113-PAT00013
(2) 서열번호 6에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A)길이: 20 염기쌍
(B)타입: 핵산
(C)사슬성: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: 기타 핵산
(A)기술: 프라이머
(v)단편 형태: 내부형
(ix) 특징:
(A)기타 정보: N IS INOSINE
(xi) 서열 기술: 서열번호 6
Figure 112005046165113-PAT00014
(2) 서열번호 7에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A)길이: 14 아미노산 잔기
(B)타입: 아미노산
(C)사슬성: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: 펩티드
(A)기술: 프라이머
(v)단편 형태: 내부형
(ix) 특징:
(A)기타 정보: Xaa Thr 또는 Asp임
(xi) 서열 기술: 서열번호 7
Figure 112005046165113-PAT00015
(2) 서열번호 8에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A)길이: 20 염기쌍
(B)타입: 핵산
(C)사슬성: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: 기타 핵산
(A)기술: 프라이머
(v)단편 형태: 내부형
(ix) 특징:
(A)기타 정보: N IS INOSINE
(xi) 서열 기술: 서열번호 8
Figure 112005046165113-PAT00016
(2) 서열번호 9에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A)길이: 20 염기쌍
(B)타입: 핵산
(C)사슬성: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: 기타 핵산
(A)기술: 프라이머
(v)단편 형태: 내부형
(ix) 특징:
(A)기타 정보: N IS INOSINE
(xi) 서열 기술: 서열번호 9
Figure 112005046165113-PAT00017
(2) 서열번호 10에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A)길이: 488 아미노산 잔기
(B)타입: 아미노산
(C)사슬성: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: 단백질
(ix) 특징:
(A)명칭/키: CDS
(B)위치: 178..1653
(xi) 서열 기술: 서열번호 10
Figure 112005046165113-PAT00018
Figure 112005046165113-PAT00019
Figure 112005046165113-PAT00020
(2) 서열번호 11에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A)길이: 2040 염기쌍
(B)타입: 핵산
(C)사슬성: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: cDNA - mRNA
(ix) 특징:
(A)명칭/키: CDS
(B)위치: 178..1653
(xi) 서열 기술: 서열번호 11
Figure 112005046165113-PAT00021
Figure 112005046165113-PAT00022
Figure 112005046165113-PAT00023
(2) 서열번호 12에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A)길이: 318 아미노산 잔기
(B)타입: 아미노산
(C)사슬성: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: 단백질
(ix) 특징:
(A)명칭/키: CDS
(B)위치: 46..1003
(xi) 서열 기술: 서열번호 12
Figure 112005046165113-PAT00024
Figure 112005046165113-PAT00025
(2) 서열번호 13에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A)길이: 1320 염기쌍
(B)타입: 핵산
(C)사슬성: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: cDNA - mRNA
(ix) 특징:
(A)명칭/키: CDS
(B)위치: 46..1003
(xi) 서열 기술: 서열번호 13
Figure 112005046165113-PAT00026
상기한 바와 같이 본 발명에 따르면, 커피 열매로부터 ACC 신타아제 또는 ACC 산화효소의 mRNA를 실질적으로 순수하게 분리하여, ACC 신타아제 또는 ACC 산화효소를 암호화하는 cDNA의 완전한 서열을 규명하고, 그러한 핵산을 이용하여 커피의 원숙을 조절할 수 있는 커피식물의 형질전환 방법을 제공할 수 있다.

Claims (24)

  1. 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성되는, 커피 식물의 ACC(1-아미노싸이클로프로판-1-카복실산) 산화효소.
  2. 제 1 항에 있어서, 커피 식물이 코페아 아라비카(Coffea arabica)인 ACC 산화효소.
  3. 커피 식물이 생산하는 ACC 산화효소의 발현을 암호화하고 서열번호 13에 기재되어 있는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 핵산 서열.
  4. 커피 식물이 생산하는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 ACC 산화효소의 발현을 암호화하는 핵산 서열.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 커피 식물이 코페아 아리비카(Coffea arabica)인 핵산 서열.
  6. 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 ACC 산화효소의 발현을 암호화하는 mRNA에 대하여 안티센스이고, ACC 산화효소의 발현을 억제하기에 충분한 길이를 갖는 RNA의 전사를 암호화하는, 커피 식물로부터 분리된 핵산 서열에 의하여 커피식 물을 형질전환시키는 방법.
  7. (i)제 3 항의 핵산 서열 및 (ⅱ)제 4 항의 핵산 서열에 의하여 커피식물을 형질전환시키는 방법.
  8. 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 ACC 산화효소의 발현을 암호화하는 mRNA 에 대하여 센스이고, ACC 산화효소의 발현을 억제하기에 충분한 길이를 갖는 RNA의 전사를 암호화하는, 커피 식물로부터 분리된 핵산 서열에 의하여 커피식물을 형질전환시키는 방법.
  9. 서열번호 12의 아미노산 서열의 발현을 암호화하는 분리된 핵산 서열에 의하여 커피 식물을 형질전환시키는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 핵산 서열이 전사 프로모터에 안티센스 방향으로 작동 가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 52 항에 있어서, 핵산 서열이 전사 프로모터에 센스 방향으로 작동 가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 ACC 산화효소의 발현을 암호화하는 mRNA 에 대하여 안티센스인 RNA 의 전사를 암호화하는, 커피 식물로부터 분리한 핵산 서열을 식물 게놈에 삽입하는 방법으로 형질전환된 커피 식물을 생산하는 방법.
  13. 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 ACC 산화효소의 발현을 암호화하는 mRNA 에 대하여 센스인 RNA 로의 전사를 암호화하는, 커피 식물로부터 분리한 핵산 서열을 식물 게놈에 삽입하는 방법으로 형질전환된 커피 식물을 생산하는 방법.
  14. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 방법으로 얻어지는 커피 식물의 커피 원두.
  15. (a)서열번호 13의 핵산 서열;또는
    (b)서열번호 12의 아미노산 서열의 발현을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 결합된 전사 프로모터를 포함하는 형질전환 벡터.
  16. 제 15 항에 있어서, 핵산 서열이 전사 프로모터에 센스 방향으로 작동 가능하게 결합된 형질전환 벡터.
  17. 제 15 항에 있어서, 핵산 서열이 전사 프로모터에 안티센스 방향으로 작동 가능하게 결합된 형질전환 벡터.
  18. 서열번호 12의 아미노산 서열의 발현을 암호화하는 분리된 핵산 서열로 형질전환된 커피 식물 세포.
  19. 제 18 항에 있어서, 핵산 서열이 전사 프로모터에 안티센스 방향으로 작동 가능하게 결합된 커피 식물 세포.
  20. 제 18 항에 있어서, 핵산 서열이 전사 프로모터에 센스 방향으로 작동 가능하게 결합된 커피 식물 세포.
  21. 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항의 형질전환된 커피 식물 세포로부터 커피 식물을 재생하는 방법.
  22. 제 21 항의 방법으로 재생된 커피 식물 중 어느 하나로부터 얻은 커피 원두.
  23. 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 ACC 산화효소의 발현을 억제하기에 충분한 길이를 갖는 RNA 로의 전사를 암호화하고, 전사 프로모터에 안티센스 방향으로 작동 가능하게 결합된, 커피 식물로부터 분리한 핵산 서열을 포함하는 형질전환 벡터를 제공하는 단계; 및
    커피 식물 세포 내로 형질전환된 벡터를 삽입하여, 이후 상기 핵산 서열이 커피 식물 세포의 게놈 내로 삽입되는 단계를 포함하는, 커피 식물의 ACC 산화효소 를 암호화하는 mRNA 에 대하여 안티센스인 RNA 로의 전사를 암호화하는 핵산 서열로 커피 식물 세포를 형질전환하는 방법.
  24. 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 ACC 산화효소의 발현을 억제하기에 충분한 길이를 갖는 RNA 를 암호화하고, 전사 프로모터에 센스 방향으로 작동 가능하게 결합되어 있는, 커피 식물로부터 분리한 핵산 서열에 작동 가능하게 결합된 전사 프로모터를 포함하는 형질전환 벡터를 제공하는 단계; 및
    커피 식물 세포 내로 형질전환 벡터를 삽입하여, 이후 상기의 핵산 서열이 커피 식물 세포의 게놈 내로 삽입되는 단계를 포함하는 커피 식물의 ACC 산화효소를 암호화하는 mRNA 에 대하여 센스 방향인 RNA 로의 전사를 암호화하는 핵산 서열로 커피 식물 세포를 형질전환하는 방법.
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