JP2003070368A - コーヒー植物の成熟を制御するための、精製されたタンパク質、組換えｄｎａ配列、および手順 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】エチレンを合成し得ないが、それらの代謝の他
の局面には影響のない形質転換植物を提供すること。 【解決手段】本発明は、精製されたタンパク質、その発
現をコードするDNA配列、および組換えDNA分子を提供
し、エチレンの合成に必要な酵素の発現を抑制するため
の形質転換コーヒー植物のためにそれらで形質転換され
た宿主を含む。DNA配列および組換えDNA分子は、コーヒ
ー植物におけるエチレンの生合成経路の要素である酵素
ACCシンターゼまたはACCオキシダーゼの発現をコードす
る点で特徴づけられている。コーヒー植物は、ACCシン
ターゼおよび／またはACCオキシダーゼのmRNAに対して
アンチセンスであるそれぞれのmRNAの発現をコードす
る、ACCシンターゼDNA配列および／またはACCオキシダ
ーゼDNA配列を含むベクターで形質転換される。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明が属する技術分野】本出願は、精製されたタンパ
ク質、組換えDNA配列、それらで形質転換した宿主、お
よびコーヒー植物の成熟を制御するためのプロセスに関
する。より詳細には、本出願は、精製されたタンパク
質、ならびにコーヒー果実特異的１-アミノシクロプロ
パン-1−カルボン酸（ACC）シンターゼおよびACCオキシ
ダーゼ遺伝子の発現を抑制するために使用され得る組換
えDNA配列に関する。本出願はさらに、このような配列
で形質転換され、それにより成熟に必要なエチレンを合
成し得ないようにされたコーヒー植物に関する。本発明
によって形質転換された植物への外来性エチレンの適用
は、コーヒー植物における果実の成熟の同時発生および
制御を可能にする。 【０００２】 【従来の技術】コーヒーは、Coffea属の植物、一般的に
は、C.arabica種の焙煎した豆から調製される。豆はコ
ーヒー植物の種子であり、そして果実（その優れた品質
に起因して最高の価格で売られている最も理想的な成熟
果実）を処理することによって得られる。従来、高品質
の「グルメな（gourmet）」コーヒーは手で摘まれた。
このことは、コーヒーの木の果実が均一に成熟せず、従
って同じ木に成熟した果実と未成熟の果実との両方が存
在するので必須であった。従来、ほとんどのコーヒー
が、労働力が豊富でありそして高価ではない世界中の地
域で栽培されているので、このことは深刻な問題ではな
かった。しかしより最近では、豊富で安価な労働力の不
足が、コーヒー産業での減少した生産性の主要な原因と
なっている。生産性を増大させるために、世界中のいく
つかの地域（例えば、最大のコーヒー生産国である、ブ
ラジル）では、労働者が、成熟しているかまたは未成熟
であるかにかかわらず、枝から全ての果実を迅速に採集
するというもぎ取り収穫（stripharvesting）に頼って
いた。これは、収穫の速度を増大するが、果実のほとん
どが未成熟（緑色）である場合に、最高品質の豆の収量
を減少させる。 【０００３】さらに、均一に成熟しないために、機械収
穫の効率は非常に制限されている。木から成熟した果実
（桜色 (cherry)）を採集するために必要な力は、緑色
の果実を採集するために必要な力と同様である。従っ
て、機械収穫は、緑色と桜色とを十分に区別せず、そし
て大量の未成熟の果実が、成熟した果実とともに収穫さ
れる。このことは、成熟した果実の収量を大きく減少さ
せ、そして生産性を制限する。コーヒー果実の成熟が全
ての果実が同時に成熟するように制御され得れば、手摘
みのもぎ取り法および機械収穫の両方ともがよりかなり
効率的で、そして収穫された果実のより高い割合がより
高い品質グレードとなる。このことは、コーヒー産業の
収益性を増大させる。 【０００４】多くの他の果実の場合のように（Yangおよ
びHoffman, Ann. Rev.Plant Physiol. 35:155 (198
4)）、植物が産生したエチレンは、コーヒーの果実の成
熟の最終段階で重要な役割を果たす。一旦、コーヒーの
果実が成熟の特定の段階に達すると、それらはエチレン
の外因的な適用によって成熟に誘導され得る（Crisost
o,C.H., P.C. Tausend, M.A. Nagao, L.H. Fuchigamiお
よびT.H.H. Chen, J. Haw.Pac.Agri. 3:13-17(199
1)）。このことは、コーヒーの果実の成熟の最終段階に
ついてのエチレンの重要性を示す。 【０００５】エチレンは、S-アデノシルメチオニン（SA
M）から二段階の反応で合成される。第１段階は、ACCシ
ンターゼによる、SAMからの1-アミノシクロプロパン-1-
カルボン酸（ACC）の合成である。ほとんどの植物にお
いて、この段階が律速段階である。最終段階はACCのエ
チレンへの変換であり、これはACCオキシダーゼによっ
て触媒される（YangおよびHoffman、前出）。化学的手
段（例えば、銀イオンまたは二酸化炭素）またはバイオ
テクノロジーの手段（Oellerら、Science254:437(199
1)）によるエチレンの生合成の阻害は、成熟の最終段階
を阻害する。この阻害は、エチレンの適用によって可逆
的である。 【０００６】従って、コーヒー植物の成熟を制御するス
トラテジーは、エチレンの生合成経路で特異的な酵素の
合成を妨げることである。１つの実施態様において、本
発明は、ACCシンターゼの合成を排除するためのコーヒ
ー植物の遺伝的変更に関する；別の実施態様において、
ACCオキシダーゼ合成が抑制される。本明細書中で好ま
しい実施態様において、これらの酵素の１つまたは両方
の合成は、その合成が抑制される酵素の発現をコードす
るメッセンジャーRNA(mRNA) に対してアンチセンスであ
るmRNAの転写をコードするDNA配列で、コーヒー植物を
形質転換することによって抑制される。同様のストラテ
ジーを使用してトマトの成熟を制御することを報告し
た、Oellerら、Science254:437 (1991) を参照のこと。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】組換えDNA技術は、多
数のACCシンターゼおよびACCオキシダーゼ遺伝子を単離
するために使用されている。しかし、コーヒーのACCシ
ンターゼおよびACCオキシダーゼの遺伝子は、今日まで
同定されていないか、または配列決定されていない。 【０００８】 【課題を解決するための手段】発明の要旨本発明は、精
製されたタンパク質、その発現をコードするDNA配列、
および組換えDNA分子を提供し、エチレンの合成に必要
な酵素の発現を抑制するためのコーヒー植物の形質転換
のためにそれらで形質転換された宿主を含む。DAN配列
および組換えDNA分子は、それらがコーヒー植物におけ
るエチレンの生合成経路の要素である酵素ACCシンター
ゼまたはACCオキシダーゼの発現をコードする点で特徴
づけられる。 【０００９】コーヒー植物は、形質転換配列がACCシン
ターゼおよび/またはACCオキシダーゼのmRMAに対してア
ンチセンスであるそれぞれのRNAの発現をコードするよ
うに挿入された、ACCシンターゼDNA配列および/またはA
CCオキシダーゼDNA配列を含むベクターで形質転換され
る。得られるアンチセンスRNAはmRNA（単数または複
数）に結合し、それによりエチレンの合成経路の１つ以
上の酵素をコードするmRNAを不活化する。記載されるDN
A配列はまた、同時抑制を使用してACCシンターゼまたは
ACCオキシダーゼの合成をブロックするために使用され
得る。いずれかの事象における結果は、形質転換された
植物はエチレンを合成し得ないが、それらの代謝の他の
局面は影響されないことである。形質転換された植物に
おける成熟は、外因性エチレンによって調節され得る。
全ての植物へのエチレンの適用によって、全ての植物は
同時に成熟して、コーヒーの機械収穫をより生産的にす
る。 【００１０】したがって、本発明は以下を提供する。 １．配列番号10のアミノ酸配列から本質的になる、Ｃｏ
ｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ由来の実質的に純粋なACCシ
ンターゼ。 【００１１】２．発現の際にＣｏｆｆｅａ ａｒａｂｉ
ｃａによって産生されるAACシンターゼをコードし、配
列番号11に示されるヌクレオチド配列を含む、実質的に
純粋な核酸配列。 【００１２】３．項目２に記載の発現の際にＣｏｆｆｅ
ａ ａｒａｂｉｃａによって産生されるACCシンターゼ
をコードする、実質的に純粋な核酸配列であって、上記
核酸配列は、配列番号11のコード領域に限定される、実
質的に純粋な核酸配列。 【００１３】４．Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａの成熟
を制御するための方法であって、上記方法は以下の工
程： ａ）ＤＮＡ配列である配列番号１１に対してアンチセン
スであるＤＮＡ配列を用いてコーヒー植物を形質転換す
る工程； ｂ）上記ａ）のＤＮＡ配列で形質転換された植物を生育
する工程；および ｃ）コーヒー植物が成熟した後に、上記形質転換された
植物に対して外的なエチレンを適用する工程、を包含す
る、方法。 【００１４】５．項目４に記載のＣｏｆｆｅａ ａｒａ
ｂｉｃａの成熟を制御するための方法であって、形質転
換に使用されるＤＮＡ配列は、配列番号１１のコード領
域に対してアンチセンスである配列に限定される、項目
４に記載の方法。 【００１５】６．項目４または５に記載の果実の成熟を
制御するための方法であって、気体性エチレンは、上記
植物の全体に適用されて、上記果実の実質的にすべての
成熟を同時に成熟させる、方法。 【００１６】７．アミノ酸配列である配列番号１２から
本質的になる、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａからの実
質的に純粋なＡＣＣオキシダーゼ。 【００１７】８．配列番号１３を含み、発現の際にＣｏ
ｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａのＡＣＣオキシダーゼをコー
ドする、実質的に純粋な核酸配列。 【００１８】９．項目８に記載される発現の際にＣｏｆ
ｆｅａ ａｒａｂｉｃａによって産生されるＡＣＣオキ
シダーゼをコードする、実質的に純粋な核酸配列であっ
て、上記核酸配列は、配列番号１３のコード領域に限定
される、実質的に純粋な核酸配列。 【００１９】１０．Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａの成
熟を制御するための方法であって、上記方法は以下の工
程： ａ）ＤＮＡ配列である配列番号１３に対してアンチセン
スであるＤＮＡ配列を用いてコーヒー植物を形質転換す
る工程； ｂ）上記ａ）のＤＮＡ配列で形質転換された植物を生育
する工程；および ｃ）コーヒー植物が成熟した後に、上記形質転換された
植物に対して外的なエチレンを適用する工程、を包含す
る、方法。 【００２０】１１．項目１０に記載のＣｏｆｆｅａ ａ
ｒａｂｉｃａの成熟を制御するための方法であって、形
質転換に使用されるＤＮＡ配列は、配列番号１３のコー
ド領域に対してアンチセンスである配列に限定される、
方法。 【００２１】１２．項目９または１０に記載の果実の成
熟を制御するための方法であって、気体性エチレンは、
上記植物の全体に適用されて、上記果実の実質的にすべ
ての成熟を同時に成熟させる、方法。 【００２２】１３．ＡＣＣシンターゼの発現が抑制され
た、コーヒー植物。 【００２３】１４．ＡＣＣオキシダーゼの発現が抑制さ
れた、コーヒー植物。 【００２４】１５．ＡＣＣシンターゼの発現が抑制さ
れ、そしてＡＣＣオキシダーゼの発現が抑制された、コ
ーヒー植物。 【００２５】１６．発現の際にＡＣＣシンターゼをコー
ドするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡを
転写の際にコードするＤＮＡ配列を含む、コーヒー植
物。 【００２６】１７．項目１６に記載のコーヒー植物から
のコーヒー果実。 【００２７】１８．項目１６に記載のコーヒー植物から
のコーヒー豆。 【００２８】１９．発現の際にＡＣＣオキシダーゼをコ
ードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡ
を転写の際にコードするＤＮＡ配列を含む、コーヒー植
物。 【００２９】２０．項目１９に記載のコーヒー植物から
のコーヒー果実。 【００３０】２１．項目１９に記載のコーヒー植物から
のコーヒー豆。 【００３１】２２．コーヒー植物であって、 ｉ）発現の際にＡＣＣシンターゼをコードするｍＲＮＡ
に対してアンチセンスであるｍＲＮＡを転写の際にコー
ドする第一のＤＮＡ配列；および ｉｉ）発現の際にＡＣＣオキシダーゼをコードするｍＲ
ＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡを転写の際に
コードする第二のＤＮＡ配列、を含む、コーヒー植物。 【００３２】２３．項目２２に記載のコーヒー植物から
のコーヒー果実。 【００３３】２４．項目２２に記載のコーヒー植物から
のコーヒー豆。 【００３４】２５．配列番号１１において特定されるＤ
ＮＡ配列の全部または一部に対してアンチセンスである
ＤＮＡ配列を含む、コーヒー植物。 【００３５】２６．配列番号１３において特定されるＤ
ＮＡ配列の全部または一部に対してアンチセンスである
ＤＮＡ配列を含む、コーヒー植物。 【００３６】２７．コーヒー植物であって、 ｉ）配列番号１１において特定されるＤＮＡ配列の全部
または一部に対してアンチセンスである第一のＤＮＡ配
列；および ｉｉ）配列番号１３において特定されるＤＮＡ配列の全
部または一部に対してアンチセンスである第二のＤＮＡ
配列、を含む、コーヒー植物。 【００３７】２８．発現の際にＡＣＣシンターゼをコー
ドするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡを
転写の際にコードするＤＮＡ配列を植物ゲノムに挿入す
るプロセスによって生産される、コーヒー植物。 【００３８】２９．発現の際にＡＣＣオキシダーゼをコ
ードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲＮＡ
を転写の際にコードするＤＮＡ配列を植物ゲノムに挿入
するプロセスによって生産される、コーヒー植物。 【００３９】３０．（ｉ）発現の際にＡＣＣシンターゼ
をコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるｍＲ
ＮＡを転写の際にコードするＤＮＡ配列；および（ｉ
ｉ）発現の際にＡＣＣオキシダーゼをコードするｍＲＮ
Ａに対してアンチセンスであるｍＲＮＡを転写の際にコ
ードするＤＮＡ配列、を、植物ゲノムに挿入するプロセ
スによって生産される、コーヒー植物。 【００４０】３１．発現の際にACCシンターゼをコード
するmRNAに対してアンチセンスであるｍRNAを転写の際
にコードするＤＮＡ配列でコーヒー植物を形質転換する
方法であって、以下の工程：発現の際にＡＣＣシンター
ゼをコードするＤＮＡ配列を含む形質転換ベクターを提
供する工程であって、上記ＤＮＡ配列は、反転方向で上
記形質転換ベクターに挿入されている、工程；および上
記コーヒー植物の組織に上記形質転換ベクターを挿入す
る工程であって、反転された上記ＤＮＡ配列は、その
後、上記コーヒー植物のゲノムに挿入されるようにな
る、工程、を包含する、方法。 【００４１】３２．発現の際にACCオキシダーゼをコー
ドするmRNAに対してアンチセンスであるｍRNAを転写の
際にコードするＤＮＡ配列でコーヒー植物を形質転換す
る方法であって、以下の工程：発現の際にＡＣＣオキシ
ダーゼをコードするＤＮＡ配列を含む形質転換ベクター
を提供する工程であって、上記ＤＮＡ配列は、反転方向
で上記形質転換ベクターに挿入されている、工程；およ
び上記コーヒー植物の組織に上記形質転換ベクターを挿
入する工程であって、反転された上記ＤＮＡ配列は、そ
の後、上記コーヒー植物のゲノムに挿入されるようにな
る、工程、を包含する、方法。 【００４２】３３．（ｉ）発現の際にACCシンターゼを
コードするmRNAに対してアンチセンスであるｍRNAを転
写の際にコードするＤＮＡ配列；および（ｉｉ）発現の
際にACCオキシダーゼをコードするmRNAに対してアンチ
センスであるｍRNAを転写の際にコードするＤＮＡ配列
でコーヒー植物を形質転換する方法であって、以下の工
程：発現の際にＡＣＣシンターゼをコードするＤＮＡ配
列を含む第一の形質転換ベクターを提供する工程であっ
て、上記ＤＮＡ配列は、反転方向で上記形質転換ベクタ
ーに挿入されている、工程；発現の際にＡＣＣオキシダ
ーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第二の形質転換ベク
ターを提供する工程であって、上記ＤＮＡ配列は、反転
方向で上記形質転換ベクターに挿入されている、工程；
上記コーヒー植物の組織に上記第一の形質転換ベクター
を挿入する工程であって、反転された上記ＤＮＡ配列
は、その後、上記コーヒー植物のゲノムに挿入されるよ
うになる、工程；および上記コーヒー植物の組織に上記
第二の形質転換ベクターを挿入する工程であって、反転
された上記ＤＮＡ配列は、その後、上記コーヒー植物の
ゲノムに挿入されるようになる、工程、を包含する、方
法。 【００４３】 【発明の実施の形態】発明の詳細な説明 本明細書中に記載される本発明がより十分に理解され得
るために、以下の詳細な説明を示す。説明において、以
下の用語が使用される：ヌクレオチド：糖部分（ペント
ース）、リン酸、および窒素複素環塩基からなる、DNA
またはRNAのモノマー単位。塩基は、グリコシド炭素
（ペントースの1’炭素）を介して糖部分に連結し、そ
して塩基および糖のその組合せが、ヌクレオシドと称さ
れる。塩基は、ヌクレオチドを特徴づける。4つのDNA塩
基は、アデニン（「A」）、グアニン（「G」）、シトシ
ン（「C」）、およびチミン（「T」）である。4つのRNA
塩基は、A、G、C、およびウラシル（「U」）である。 【００４４】DNA配列：隣接したペントースの3’炭素と
5’炭素との間のホスホジエステル結合によって、ある
ヌクレオチドから他のヌクレオチドへと結合したヌクレ
オチドの直線状配列。 【００４５】コドン：mRNAを通じて、アミノ酸、転写開
始シグナル、または転写終結シグナルをコードする、３
つのヌクレオチドのDNA配列（トリプレット）。例え
ば、ヌクレオチドのトリプレットTTA、TTG、CTT、CTC、
CTA、およびCTGは、アミノ酸ロイシン（「Leu」）をコ
ードし、TAG、TAA、およびTGAは、転写終止シグナルで
あり、そしてATGは転写開始シグナルであり、また、ア
ミノ酸メチオニン（「MET」）をコードする。 【００４６】ポリペプチド：隣接したアミノ酸のアミノ
基とカルボキシ基との間のペプチド結合によってあるア
ミノ酸から他のアミノ酸へと結合したアミノ酸の直線状
配列。 【００４７】ゲノム：細胞またはウイルスの全体のDN
A。これは、特に、物質のポリペプチドをコードする構
造遺伝子、ならびにプロモーター、転写および翻訳の開
始部位ならびに終結部位を含む。 【００４８】遺伝子：その鋳型RNAまたはメッセンジャ
ーRNA（「mRNA」）を通じて、特定のポリペプチドに特
徴的なアミノ酸の配列をコードする、DNA配列。 【００４９】転写：遺伝子またはDNA配列からmRNAを産
生するプロセス。 【００５０】翻訳：mRNAからポリペプチドを産生するプ
ロセス。 【００５１】発現：遺伝子配列またはDNA配列によって
おこる、ポリペプチドを産生するプロセス。これは、転
写と翻訳とが合わされる。 【００５２】プラスミド：プラスミド自身が宿主細胞中
で複製されるためのインタクトな「レプリコン」を含
む、非染色体二本鎖DNA配列。プラスミドが単細胞生物
内に配置される場合、その生物の特徴はプラスミドのDN
Aの結果として、変化または形質転換され得る。例え
ば、テトラサイクリン耐性についての遺伝子（TETR）を
有するプラスミドは、以前にテトラサイクリンに感受性
の細胞を、テトラサイクリンに耐性である細胞へと形質
転換する。プラスミドによって形質転換された細胞は、
「形質転換体」と称される。 【００５３】ファージまたはバクテリオファージ：タン
パク質エンベロープまたはコート（「キャプシド」）中
にキャプシド化されたDNA配列からなる多くの細菌ウイ
ルス。 【００５４】クローニングビヒクル：宿主細胞中で複製
され得、１つまたは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位
によって特徴づけられる、プラスミド、ファージDNA、
コスミド、または他のDNA配列。その認識部位で、この
ようなDNA配列は、DNAの本質的な生物学的機能（例え
ば、複製）の付帯する欠失、コートタンパク質の産生、
またはプロモーターもしくは結合部位の欠失を伴わずに
決定可能な様式において切除され得、そしてこれは、形
質転換された細胞の同定に使用するのに適切なマーカー
（例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐
性）を含む。クローニングビヒクルは、しばしばベクタ
ーと称される。 【００５５】クローニング：生物またはこのような生物
に由来あするDNA配列もしくは無性生殖による配列の集
団を得るプロセス。 【００５６】組換えDNA分子またはハイブリッドDNA−生
きている細胞の外側の端と端に結合されており、生きて
いる細胞において維持され得る、異なるゲノム由来のDN
Aのセグメントからなる分子。 【００５７】cDNA−特定のポリペプチドをコードするmR
NAに相補的なDNA鎖。 【００５８】本発明によるコーヒー植物におけるエチレ
ン生合成を制御するための戦略は、まず、エチレン経路
における２つの酵素（ACCシンターゼおよびACCオキシダ
ーゼ）についての発現をコードする遺伝子の決定に関す
る。野生型コーヒー植物の、正常遺伝子に対してアンチ
センスである方向に、一方または両方の遺伝子を含む構
築物での形質転換は、それぞれの酵素の合成をブロック
することが予想される。形質転換配列からの指示のもと
で転写されたメッセンジャーRNAは、正常配列からの指
示のもとで転写されたmRNAに結合し、それによって、正
常な伝達を不活化し、そして酵素合成を不可能にする。 【００５９】コーヒーにおけるACCシンターゼおよびACC
オキシダーゼについての発現をコードするDNA配列を単
離するために、本発明者らは、生じることが予想される
ヌクレオチド配列を含む合成DNAプローブを有するコー
ヒー植物から産生されたcDNAライブラリーをスクリーニ
ングした。これらの予想された配列は、それぞれの酵素
をコードする遺伝子において生じるヌクレオチド配列、
他のクライマクテリック植物、および他の植物の研究に
基づいた。 【００６０】本発明において、ACCシンターゼまたはACC
オキシダーゼをコードする遺伝子に対応するcDNAは、コ
ーヒー植物胚を形質転換するのに使用される。プラスミ
ドpBI−121は、形質転換ベクターとして使用される。AC
CシンターゼおよびACCオキシダーゼについての発現をコ
ードするDNAに対応する配列は、カリフラワーモザイク
ウイルス35Sプロモーターに結合するプラスミドに逆方
向に挿入される。それらから転写されたRNAは、それぞ
れの酵素のアミノ酸配列をコードするmRNAに相補的であ
る。完全な構造は、細菌宿主中で増幅される。宿主は破
壊され、そして増幅ベクターはコロイド状の金粒子に付
着される。付着性のベクターを有する金粒子は、米国特
許第5,107,065号に記載されるような細胞において、高
速で粒を推進することによって、コーヒー植物組織に挿
入される。首尾良く形質転換した若い植物は、抗生物質
耐性によって同定される。形質転換植物は、植物を形質
転換するのに使用した遺伝子に依存して、ACCシンター
ゼまたはACCオキシダーゼを産生しない。形質転換植物
の成熟は、外因性エチレンの適用によって開始される。 【００６１】 【実施例】実施例１ コーヒー果実特異的ACCシンターゼcDNAの単離 コーヒーの成熟に関与するACCシンターゼ遺伝子配列を
単離するために、cDNAライブラリーを、成熟度の異なる
段階でのコーヒー果実の果皮および中果皮の組織の混合
物から調製した。このライブラリーを、ライブラリーを
構築するのに使用したのと同じmRNAから作製される第１
鎖cDNAから合成されるPCR産物、および他の生物由来のA
CCシンターゼ遺伝子に由来するコンセンサス配列に対応
する縮重オリゴヌクレオチドプライマーを使用してスク
リーニングした。本実施例は主に、mRNAの単離、cDNAラ
イブラリーの構築、および適切なcDNAのクローニングに
関与するそれに続く工程を含む。 【００６２】ａ）mRNAの単離 全RNAを、コーヒー植物（C. arabica L.cv Guatemala
n）のいくつかの異なる発生段階からの66gの果皮および
中果皮組織から、Leviら[HortScience 27(12):1316−13
18(1992)]の方法を用いて単離した。凍結コーヒー果実
の果皮および中果皮の組織を、少量のドライアイスとと
もに家庭用コーヒーミル（SaltonModel GC−5；Salton
Maxam Housewares Group, Mt. Prospect, IL）で約2分
間粉砕することによって粉末化した。粉末化した果実組
織を、200μLの200mMトリス[ヒドロキシメチル]アミノ
メタンヒドロクロリド（Tris−HCl）（pH8.5）、1.5％
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、300mMLiCl、10mMエチ
レンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム（Na₂EDTA）、1.5
％（w:v）デオキシコレートナトリウム、1.5％（v:v）N
onidetP−40（Sigma Chemical Co.）、0.5mMチオ尿素、
1mM アウリントリカルボキシル酸（aurintricarboxylic
acid）、10mMジチオトレイトール（DTT）、75mMＢ−メ
ルカプトエタノール、２％ポリビニルピロリドン（PV
P）、および２％ポリビニルポリピロリドン（PVPP）に
添加し、そしてPolytron組織ホモジナイザー（Tekmar,C
incinnati, OH）を用いてホモジナイズした。2分間のホ
モジナイズの後、200μLのクロロホルムを添加し、そし
てさらに3分間ホモジナイズを続けた。ホモジネート
を、250μLの遠心分離ボトル（Nalgene）に移し、そし
て2,500×gで15分間遠心分離した。上部の水相を取り出
し、そして12μLの５MNaClと混合し、2つの遠心分離ボ
トルに等しく分割し、そして150μLのエタノールを各ボ
トルに添加した。混合物を、−20℃で一晩保存した。RN
Aを、4,000×gで15分間4℃にて遠心分離することによっ
て回収した。RNAを、50μLのTE1（50mMTris−HCL（pH8.
0）、10mM Na₂EDTA）に溶解し、そして12,000×gで10分
間4℃にて遠心分離することによって、明澄化させた。
上清を、新たな遠心分離ボトルに移し、そして３μLの
５MNaClおよび30μLのイソプロパノールを添加した。内
容物を混合し、そして−20℃で一晩保存した。RNAを、1
4,000×gで10分間遠心分離することによって回収した。
RNAを、20μLの70％氷冷エタノールで洗浄し、そして上
記のように遠心分離することによって回収した。真空下
で10分間乾燥させた後、RNAを、50μLのTE1緩衝液に再
懸濁し、そして10μLの12MLiClを添加した。溶液を、4
℃にて48時間インキュベートし、そしてRNAを、14,000
×gで10分間の遠心分離によって回収し、そして30μLの
TE1緩衝液に再懸濁した。15μLの５M酢酸カリウムを添
加した後、RNAを0℃にて一晩インキュベートし、14,000
×gで10分間遠心分離することによって回収し、そして5
0μLのTE1緩衝液に再懸濁した。３μLの５MNaClおよび1
10μLの95％エタノールを添加し、RNAを、−20℃にて一
晩インキュベートした。RNAを、14,000×gで10分間遠心
分離することによって回収し、20μLの70％氷冷エタノ
ールで洗浄し、上記のように遠心分離することによって
回収し、真空下で10分間乾燥させ、そして600μLのTE1
緩衝液に再懸濁した。RNAを微量遠心分離管に移し、そ
して14,000rpmで30分間、４℃で、遠心分離した後、300
μLを２つの新たな微小遠心分離管の各々に取り出し
た。もとの遠心分離した管を、さらなる300μLのTE1緩
衝液でリンスした。18μLの５MNaClおよび636μLの100
％エタノールを、３つの遠心分離管の各々に添加した。
反転することによって混合した後、管を−20℃にて一晩
保存した。RNAを、14,000×gで30分間遠心分離すること
によって回収し、そして１μLの70％氷冷エタノールで
洗浄した。上記のように遠心分離および乾燥させた後、
RNAを400μLの滅菌水に再懸濁した。全部で1.04mgの全R
NAを得た。 【００６３】メッセンジャーRNA（ポリA＋RNA）を、Pol
yATtract（登録商標）mRNAIsolation System IV（Prome
ga Corporation, Madison, WI）を用いて単離した。2つ
の単離のすべてを、以下のように行った。各単離につい
て、0.48mgの全RNAを、800μLのRNaseを含有しない水に
溶解した。65℃にて10分間加熱した後、３μLの50pmol/
mLビオチン化オリゴ（dT）および20.7μLの20×SSC（１
×SSCは150mMNaClおよび15mM クエン酸ナトリウムを含
む）を添加し、そして混合物を、約30分間にわたってゆ
っくりと室温まで冷却した。ストレプトアビジン常磁性
粒子（PolyATtract（登録商標）mRNAIsolation System
IV中に提供されている）のアリコートを、0.5×SSC中で
3回洗浄し、そして0.1mLの0.5×SSCに再懸濁した。ビオ
チン化オリゴ（dT）を含むmRNA溶液を、洗浄したストレ
プトアビジン常磁性粒子に添加した。室温にて10分間の
インキュベーションの後、捕捉したRNAを含む常磁性粒
子を、磁石を用いて管の側面に捕捉した。 【００６４】上清を除去し、そして粒子を0.3mLの0.1×
SSCで４回洗浄した。mRNAを、200μLのRNaseを含まない
水中に懸濁することによって、ビオチン化したオリゴ(d
T)粒子から除去した。150μLの水を２つのチューブの各
々に連続的に添加することによって、さらなる溶出を実
施した。溶出画分(550μL)をプールし、そして微量遠心
分離機中で４℃にて30分間、14,000rpmにて遠心分離し
た。上清を２つの微量遠心管中に分け、そして３MのNaC
lの10分の１の容量および600μLのエタノールの添加
後、-20℃にて一晩チューブをインキュベートすること
によって、その後上記のような遠心分離によってmRNAを
回収した。mRNAを、１mLの氷冷の70％エタノールで１回
洗浄し、乾燥し、そして20μLの滅菌H₂O中に再懸濁し
た。１μLを１mLの水に添加し、そしてShimadzuUV 160U
分光光度計において230nm〜330nmのスペクトルを得た。
約６μgのmRNAを1.04mgの全RNAから回収した。 【００６５】ｂ）cDNAライブラリーの構築 第一および第二鎖のcDNAを、ZAP-cDNA合成キット(Strat
agene,La Jolla, CA)を用いて合成した。20μLの水中６
マイクログラムのmRNAを、65℃にて５分間インキュベー
トした。２マイクロリットルのメチル水銀(100mM)を添
加し、そして室温にて10分間、インキュベーションを続
けた。４マイクロリットルのβ-メルカプトエタノール
(700mM)を添加し、そしてさらに５分間、インキュベー
ションを続けた。変性したmRNAに、５μLの10×第一鎖
の緩衝液（キット中に提供される）、５μLの100mMDT
T、３μLのヌクレオチド混合物（それぞれ10mMのdATP、
dGTP、dTTP、および5-メチル-dCTP）、２μLのリンカー
-プライマー(1.4μg/μL):5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACT
AGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' （配列番号１）１μ
LのRNaseブロック、および５μLの水を添加した。反応
物を室温にて10分間インキュベートし、プライマーをmR
NAにアニーリングし、次いで３μLのM-MuLV逆転写酵素
(20U/μL）を添加した。５マイクロリットルのこの反応
混合物を、0.5μL（0.625pmole)の800Ci/mmole[α^-32P]
dATPを含むチューブに移した。両方の反応物を、37℃に
て１時間インキュベートした。放射活性標識した反応物
を、その後のゲル分析のために-20℃にて凍結した。45
μLの主要反応物に、40MLの第二鎖の緩衝液、15μLの10
0mMDTT、６μLのヌクレオチド混合物(10mMのdATP、dGT
P、dTTP、および26mMのdCTP)、268.3μLの水、および２
μL（2.5pmole)の800Ci/mmole[α^-32P]dATPを添加し
た。混合後、4.5μLの１U/μL RNase Hおよび19.2μLの
5.2U/μL E.coli DNAポリメラーゼＩを添加し、そして
反応物を16℃にて2.5時間インキュベートした。反応物
を400μLのフェノール：クロロホルム(１:１)で抽出し
た。微量遠心分離における５分間の遠心分離によって相
を分離し、そして水相を除去し、そしてクロロホルムで
再抽出した。上記のような遠心分離によって水相を回収
した。 【００６６】二本鎖cDNAを、33.3μLの３M 酢酸ナトリ
ウム(pH 5.2)および867μLの100％エタノールの添加、
ならびに-20℃にて一晩のインキュベーションによって
沈澱させた。cDNAを、微量遠心分離機中で、４℃にて60
分間、14,000×gにての遠心分離によって回収した。cDN
Aを、１mLの80％エタノールで洗浄し、微量遠心分離機
中での室温、14,000×gにての遠心分離によって回収
し、真空下で乾燥し、そして45μLの水中に溶解した。
３マイクロリットルの再懸濁した二本鎖cDNAを除去し、
そしてゲル電気泳動によるその後の分析のために-20℃
にて貯蔵した。 【００６７】残存する42MLの二本鎖cDNAに、５μLの10
×Klenow緩衝液（緩衝液#3；Stratageneによって供給さ
れる）、2.5μLの2.5mMヌクレオチド（dCTP、dGTP、dAT
P、およびdTTP)、および0.5μLの５U/μL E.coli DNAポ
リメラーゼＩKlenowフラグメントを添加した。37℃にて
30分後、50μLの水を添加し、そして反応物を等量のフ
ェノール：クロロホルム(１:１）、次いで上記のような
クロロホルムで抽出した。７μLの３M酢酸ナトリウム(p
H 5.2)および226μLの100％エタノールの添加後、平滑
末端二本鎖cDNAを30分間氷上でインキュベートし、そし
て微量遠心分離機中で４℃にて60分間、14,000rpmにて
遠心分離することによって回収した。cDNAを300μLの70
％エタノールで洗浄し、上記のように遠心分離し、そし
て乾燥した。７マイクロリットルの0.4μg/μLEcoRIリ
ンカーを、乾燥したcDNAに添加した。EcoRIリンカーの
構造は以下である： 5'-AATTCGGCACGAG-3' （配列番号２） 3'-GCCGTGCTC-5' ボルテックスしてcDNAを再懸濁した後、１μLの10×連
結緩衝液、１μLの10mMATP、および１μLのT4 DNAリガ
ーゼ（４Weiss U/μL）を添加し、そして反応物を８℃
にて一晩インキュベートした。70℃にて30分間加熱する
ことによって、リガーゼを不活化した。この時点でcDNA
に付着しているEcoRIリンカーの5'末端を、ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いてリン酸化した。１マイクロリッ
トルのZAP-cDNA合成キット(Stratagene,La Jolla, CA)
の10×緩衝液#3、２μLの10mM ATP、６μLの水、および
１μLの10U/μL T4ポリヌクレオチドキナーゼを、連結
反応物に添加した。37℃にて30分後、反応物を70℃にて
30分間加熱することによって、キナーゼ反応を停止し
た。XhoI「付着末端」を、リンカー-プライマー中のXho
I部位の消化によって、mRNAの3'末端に対応するcDNAの
末端にて生成した。28μLのXhoI緩衝液および３μLの40
U/μLXhoIをcDNAに添加し、そして反応物を、37℃にて
1.5時間インキュベートした。 【００６８】5'末端でのEcoRI付着末端および3'末端で
のXhoI付着末端（元々のmRNAと比較して）を有するcDNA
を、以下のように調製されるSephacrylS-400スピンカラ
ムを通る通過によってサイズ分画した。５μLの10×STE
[100mMのTris (pH 7.0)、５mMのEDTA、および100mMのN
aCl]をcDNAに添加し、そしてcDNAを、SephacrylS-400(P
harmacia Biotech, Piscataway, NJ)を含む１mLシリン
ジの頂部(top)に適用した。500μLの微量遠心管をシリ
ンジの底部に置き、そしてカラムを遠心分離管中に置
き、そして約400×gにて２分間遠心分離した。60μLの
１×STEをシリンジの頂部に添加し、新しい微量遠心管
をカラムの底部上に置き、そしてカラムを再度上記のよ
うに遠心分離した。６画分が回収されるまで、このプロ
セスを繰り返した。約10％の各画分を１％アガロースゲ
ル上で電気泳動し、各画分中のcDNAのサイズ分布を決定
した。各画分の残りを等容量のフェノール：クロロホル
ム、次いで上記のようなクロロホルムで抽出し、そして
２容量の100％エタノールの添加によって沈澱させた。-
20℃にての一晩のインキュベーション後、cDNAを、微量
遠心分離機中での、４℃にて60分間、14,000rpmにての
遠心分離によって回収した。各cDNA画分を200NLの80％
エタノールで洗浄し、そして上記のように乾燥した。cD
NA画分１を３μLの滅菌水中に再懸濁し、そしてcDNA画
分２を10.5μLの滅菌水中に再懸濁した。0.5μLの２つ
の画分の各々を使用して、エチジウムブロマイドプレー
ト検出方法を用いてDNAの量を決定した。最も大きなcDN
A分子を含む画分１および２を混合した。12.5mLの混合
した画分は、約100ngのcDNAを含んだ。この画分をSpeed
-Vac中で2.5μLに減少し、そして氷上に貯蔵した。cDNA
画分３を10.5μLの滅菌水中に再懸濁し、そしてその後
の使用のために-20℃にて保存した。 【００６９】画分１および２からの100ngのcDNAを、１
μgのUni-ZAP^TM(Strategene, La Jolla, CA)（EcoRIお
よびXhoIで消化したλZAPベクター）中に連結した。画
分１および２のcDNA(2.5μL)を、0.5μLの10×連結緩衝
液、0.5μLの10mMATP、１μLの１μg/μL Uni-Zap XRベ
クター、および0.5μLの４Weiss U/μL T4 DNAリガーゼ
に添加した。反応物を８℃にて約44時間インキュベート
した。連結反応物の１μLのアリコートを、GigapackII
Goldバクテリオファージλパッケージングキット（Stra
tagene, La Jolla, CA)からの「Freeze-Thaw」抽出物の
１アリコートに添加した。15マイクロリットルのSonic
抽出物を添加し、そして内容物を穏やかに混合した。室
温にてパッケージングを実施した。２時間後、500μLの
SM緩衝液および20μLのクロロホルムを各パッケージン
グ反応物に添加し、そして微量遠心分離機中での短い遠
心分離によって細片を除去した。パッケージしたファー
ジを新しい微量遠心管に移動させた。10μLのクロロホ
ルムを添加し、パッケージしたファージを使用するまで
４℃にて貯蔵した。この一次ライブラリーの力価は、0.
7×10⁶組換えプラークの存在を示した。 【００７０】ｃ）一次ライブラリーの増幅 O.D.₆₀₀にて0.5の密度にまで増殖した600μLのE.coliXL
1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, CA)、および32.5
μLの一次ライブラリーストックを16のチューブの各々
に添加した。37℃にて15分間のインキュベーション後、
6.0mLの48℃の上層寒天（５g/LのNaCl、２g/LのMgSO₄・
7H₂O、５g/Lの酵母抽出物、10g/LのNZアミン[pH7.5]、
および0.7％アガロース）を各チューブに添加し、そし
て内容物を、150×15mmのNZYプレート（５g/LのNaCl、
２g/LのMgSO₄・7H₂O、５g/Lの酵母抽出物、10g/LのNZア
ミン[pH7.5]、および15g/LのDifco寒天）上にプレート
した。プレートを37℃にて一晩インキュベートし、次い
で10mLのSM緩衝液で重層し、そして穏やかに振盪しなが
ら４℃にてさらに８時間インキュベートした。SM緩衝液
を滅菌ピペットで回収し、そして滅菌した250mLの遠心
分離ボトル中に貯蔵した。各プレートを、回収したさら
なる10mLのSM緩衝液でリンスし、そして先のSM緩衝液に
添加した。５％の最終濃度までクロロホルムを添加し、
そしてファージ溶液を、室温にて15分間インキュベート
し、次いで2,000×gにて10分間遠心分離し、細胞細片を
除去した。上清を滅菌したポリプロピレンボトルに回収
し、そしてクロロホルムを0.3％の最終濃度まで添加し
た。増幅したライブラリーを４℃で保存した。 【００７１】ｄ）特定の遺伝子についてのスクリーニン
グのための増幅したライブラリーのプレーティング 増幅したライブラリーを上記のように力価決定した。約
50,000の組換えプラークを600μLの上記のように増殖し
たE.coliXL1-Blue MRF'に添加した。37℃にて15分後、
6.5mLの48℃の上層寒天を添加し、そして細胞を150×15
mm NZYプレート上にプレートした。合計200,000の組換
えプラークを含む４つのプレートを調製し、そして37℃
にて一晩インキュベートした。次いでプレートを４℃に
て４時間冷却し、次いで以下に記載されるようにプラー
クリフト(plaquelift)を調製するために使用した。 【００７２】ｅ）コーヒーのACCシンターゼ遺伝子に相
同なオリゴヌクレオチドの同定および構築 米国特許出願第08/485,107号（その明細書は、本明細書
中において参考として援用される）において記載される
以前の研究において、本発明者らは、種々の植物におい
て存在するACCシンターゼについて共通な塩基配列（本
明細書中においてコンセンサス配列といわれる）を同定
した。これらの研究に基づいて、本発明者らは、コンセ
ンサス配列に対応するコーヒー第一鎖のcDNAの領域のPC
R増幅のための、一連の３つ(３)の完全に変性したプラ
イマーを開発した。使用されるプライマーの配列は以下
である： ACS167: 5'-GCCAAGCTTCCRTGRTARTCYTGRAA-3' （配列
番号３） ACS289: 5'-TTYCARGAYTAYCAYGGHYT-3' （配列
番号４） ACS885: 5'-CCHGGDARNCCYAWRTCTTT-3' （配列
番号５）。 【００７３】ｆ）第一鎖のコーヒーcDNAを得るための逆
転写酵素反応 第一鎖のcDNAを得るための逆転写酵素反応を、20μLの
最終容量中で、GeneAmpRNA PCR Core Kit (Perkin Elme
r, Foster City, CA)を用いて実施した。最初、３μLの
水中0.9μgのコーヒー果実のmRNAを、微量遠心分離管中
１μLの50μMランダム六量体および６μLの滅菌水と混
合し、そして65℃にて５分間インキュベートした。混合
物を室温にて２分間放置し、そして液体を短時間の遠心
分離によってチューブの底部に回収した。この混合物
に、２μLのPCR緩衝液II（上記で言及したキットか
ら）、４μLの25mMMgCl₂、２μLの10mM dNTP、１μLのR
NAsin（20u/μL）、および１μLの逆転写酵素（50u/μ
L）を添加した。反応物を42℃にて１時間インキュベー
トし、その後、逆転写酵素を95℃の水浴中で５分間、熱
不活化した。 【００７４】ｇ）コーヒーのACCシンターゼ遺伝子を増
幅するためのポリメラーゼ連鎖反応 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) (Saikiら, 1988)を、上記
のGeneAmpKitを用いて、10μLの第一鎖のcDNA混合物、
４μLのPCR緩衝液II、１μLの25mM MgCl₂、2.5μLの20
μMAC5167プライマー（配列番号３）、2.5μLの20μM A
C5885プライマー（配列番号５）、29.5μLの滅菌H₂O、
および0.5μLのTagDNAポリメラーゼ（５u/μL)を含む50
μLの反応物において実施した。PCR条件は、94℃（１分
間）、44℃（１分間）、および72℃（２分間）の35サイ
クルであった。PCR反応の生成物を、1.5％SeaPlaqueア
ガロース(FMCBioProducts, Rockland, ME)およびサイズ
マーカーとしてHae III消化φX174 DNA (Promega Corpo
ration,Madison, WI)を用いて、アガロースゲル電気泳
動によって分析した。約650bpの単一のPCR生成物を得
た。 【００７５】ｈ）異なるプライマーを用いたPCR生成物
の増幅 上記で得られた650bpのフラグメントをゲルから切り取
り、そして1.5mLの微量遠心管中に置いた。200μLの滅
菌水の添加後、650bpのフラグメントを90℃まで５分間
加熱し、室温まで冷却し、そして微量遠心分離機中で５
分間、14,000rpmにて遠心分離した。増幅したDNAを含む
上清を取り出し、そして新しい1.5mLの微量遠心管中に
置いた。25μLのPCR反応を、鋳型として先に増幅した0.
4μLのDNA、2.5μLの10×PCR緩衝液（10mMのTris-HCl(p
H 9.0)、0.1％のtriton X-100)、２μLの25mM MgCl₂、
５μLの１mM dNTP、１μLの20μMACS289プライマー（配
列番号５）、１μLの20μM ACS885プライマー（表
２）、12.8μLのH₂O、および0.3μLのTagDNAポリメラー
ゼ（５u/μL）（Promega Corporation, Madison, WI)を
用いて実施した。PCRを、94℃（１分間）、45℃（１分
間）、および72℃（２分間）の35サイクルを用いて実施
した。５μLのこの反応物を、上記のように1.5％アガロ
ースゲル中で電気泳動した。約603bpの単一の生成物が
観察された。８μLの滅菌水、10μLの３M酢酸ナトリウ
ム(pH 5.2)、および220μLの100％エタノールを、反応
物の残りに添加した。-20℃にて一晩のインキュベーシ
ョン後、４℃にて30分間、14,000rpmの遠心分離によっ
てDNAを回収した。DNAを、400μLの氷冷75％エタノール
で洗浄し、そして25μLの滅菌水中に再懸濁した。エチ
ジウムブロマイドプレートアッセイを用いて、DNA濃度
を10ng/μLであると決定した。 【００７６】ｉ）コーヒー果実特異的ACCシンターゼDNA
を標識すること ランダムプライマー化プローブを、PCR生成ACCシンター
ゼDNAおよびPrime-a-GeneKit (Promega Corporation, M
adison, WI)を用いて生成した。２および1.5μLの25ng
DNAを27.5μLの滅菌水に添加し、そしてDNAを５分間煮
沸することによって変性した。10μLの５×標識化緩衝
液、２μLの非標識化dNTP[それぞれ20μM；dCTP, dGTP,
dTTP]、２μLの１mg/mL アセチル化BSA、１μLの５u/
μL E.coliDNAポリメラーゼＩKlenowフラグメント、お
よび５μL(50μCi)の3,000Ci/mmole[α-³²P]dATP (Dupo
nt-NEN)を添加し、50μLの最終容量を与えた。室温にて
１時間後、２μLの0.5M Na₂EDTAの添加および２分間の
煮沸によって反応を停止する。 【００７７】ｊ）ACCシンターゼ特異的プローブでの増
幅したライブラリーのスクリーニング それぞれ50,000の組換えクローンを含む４つの150×15m
m NZYプレートのプラークリフトを調製した。４つの132
mmMagnaナイロン転写メンブレン(Micron Separations,
Incorporated, Westborough, MA)を、それらを５×SSC
緩衝液で飽和したクロマトグラフィー用紙上に約10秒間
置くことによって湿らせた。メンブレンを、組換えプラ
ークを含むプレート上に５分間置き、除去し、そしてフ
ァージ含有側を上向きにして、0.5MのNaOHおよび1.5Mの
NaClで飽和したクロマトグラフィー用紙上で２分間イン
キュベートした。次いで、メンブレンを、0.5Mのtris-H
Cl(pH 8.0)および1.5MのNaClで飽和したクロマトグラフ
ィー用紙上に５分間移すことによって中和した。0.2Mの
tris-hcl (pH 7.5)を含む２×SCCで飽和したクロマトグ
ラフィーシート上での短期の20秒の処置後、フィルター
をブロット乾燥した。１時間の風乾の後、UVStratalink
er 1800 (Stratagene, La Jolla, CA)中で12,000μジュ
ールの260nm UV光での処置によって、DNAをメンブレン
に架橋した。 【００７８】４つのメンブレンを、100mLの６×SSPE（5
2.2g/LのNaCl、8.3g/LのNaH₂PO₄・H ₂O、2.2g/LのNa₂EDT
A[pH 7.4]）、５×Denhardt溶液（１g/LのFicoll、１g/
Lのポリビニルピロリドン、１g/LのBSA [ペンタックス
画分Ｖ])、0.5％SDS、および100μg/mLの変性したニシ
ン精子DNAで、65℃にて２時間、Hybaid Mark IIハイブ
リダイゼーションオーブン(NationalLabnet Company, W
oodbridge, NJ)中で、HB-OV-BLビンを用いてプレハイブ
リダイズした。 【００７９】ハイブリダイゼーションを、10mLの６×SS
PE（0.5％ SDS、100μg/mLの変性したニシン精子DNA、
および52μLの上記のランダムプライム化プローブを含
む）中で、65℃にて12時間実施した。ハイブリダイゼー
ション時間の終わりにて、ハイブリダイゼーション溶液
を除去し、そして65℃にて、0.5％SDSを含む100mLの２
×SSCでメンブレンを手短に洗浄した。次いで、再度、6
5℃の等量の新しい緩衝液でそれらをさらに30分間洗浄
した。メンブレンを、さらに２回、65℃にて30分間、0.
5％SDSを含む100mLの0.2×SSCで洗浄し、セロファン包
み中に包み、そして-70℃にて24時間、予め感光したFuj
iRX_GCU Ｘ線フィルムに曝露した。10個の陽性クローン
を得た。同定したプラークに対応するもとのプレートの
領域を取り出し、そして20μLのクロロホルムを含む１m
LのSM緩衝液中に置いた。これらの10個のうち、５個を
より低い密度で再プレートし、そして上記のように再ス
クリーニングして独立したプラークを得た。 【００８０】ｋ）コーヒー-果実のACCシンターゼcDNAク
ローンの特徴づけ 推定のコーヒーのACCシンターゼcDNAクローンのサイズ
を、クローニングベクター中に存在し、そしてcDNA挿入
部位に隣接するT3およびT7プロモーターの一部に相同な
プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって決定
した。プライマーの配列は以下である： T3: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' （配列番号６） T7: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' （配列番号７）。 【００８１】PCRのための条件は、温度サイクルが95℃
（１分間）、50℃（１分間）、および72℃（２分間）で
あったことを除いて、上記の通りであった。分析は、上
記のようにアガロースゲル電気泳動によった。 【００８２】３つの最も大きいクローンを、インビボ切
り出しによってファージミドとして回収した。単一のプ
ラークからの200μLのファージストックを、1.0のO.D.
₆₀₀での密度まで増殖させた200μLのE.coliXL1-Blue MR
F'と混合した。１μLのExAssist (Stratagene, La Joll
a, CA)ヘルパーファージ（＞１×10⁶pfu/μL)を添加
し、そしてチューブを37℃にて15分間インキュベートし
た。３mLの滅菌LBブロスを添加し、そしてそれらを37℃
にて３時間、振盪しながらインキュベートした。70℃に
て20分間の加熱および1000×gにて15分間の遠心分離
後、繊維状ファージ粒子としてパッケージされた切り出
されたpBluescriptファージミドを含む１mLの上清を、
滅菌した1.5mLの微量遠心管に移し、そして４℃にて貯
蔵した。ファージミドを、O.D.₆₀₀にて測定した場合、
１の密度に増殖させた200μLのE.coliSolar細胞（Strat
agene, La Jolla, CA)に、25μLのストック溶液を添加
することによって回収した。37℃にて15分間のインキュ
ベーション後、200μLの細胞混合物を、50μg/mLのアン
ピシリンを含む100×15mmNZY寒天プレート上にプレート
した。プレートを37℃にて一晩インキュベートした。個
々のコロニーを50μg/mLのアンピシリンを含む10mLのLB
ブロス中に採取し、そして37℃の振盪インキュベーター
中で一晩増殖させた。細胞を、1.5mLの滅菌微量遠心管
中で繰り返しの遠心分離によって濃縮し、そしてプラス
ミドDNAを、QIAGENからのプラスミドミニキットを用い
て精製した。細菌性ペレットを水で洗浄し、そして0.3m
Lの緩衝液P1中に再懸濁した。次に、0.3mLのアルカリ溶
解緩衝液P2を添加し、穏やかに混合し、そして室温にて
５分未満の間インキュベートした。0.3mLの冷却した緩
衝液P3の添加、およびチューブを６回反転することによ
る混合後、抽出物を氷上で10分間インキュベートし、そ
して微量遠心分離機中で、14,000rpmにて15分間遠心分
離した。上清を除去し、そして予め１mLのQDT緩衝液で
平衡化したQIAGEN-チップ20カラムに適用した。抽出物
を、重力フローによってカラムの樹脂に入らせた。一旦
フローを停止し、カラムを１mLの緩衝液QCで４回洗浄し
た。QIAGEN-チップ20カラムを0.8mLの緩衝液QFで洗浄す
ることにより、DNAを溶出し、これを1.5mLの微量遠心管
中に収集した。0.7容量（560μL）のイソプロパノール
の添加によって、DNAを沈澱させた。チューブを、すぐ
に14,000rpmにて30分間遠心分離し、そして上清を注意
深く除去した。DNAを含むペレットを、１mLの氷冷70％
エタノールで20回洗浄し、上記のように遠心分離し、そ
して５分間風乾した。DNAを50μLの滅菌H₂O中に再懸濁
した。１つのプラスミド単離体からのDNAの濃度は、蛍
光定量的分析によって0.1μg/μLであった。 【００８３】反応物の配列決定を、８μLのファージミ
ドDNA（0.8μg)を、４μLのT3またはT7のいずれかの配
列決定プライマー（0.8pmol/μL)と混合することにより
実施した。自動化DNA配列決定を、Universityof Hawaii
Biotechnology Service Centerにて、これらのサンプ
ルに対して実施した。cDNAの5'および3'の両方の末端由
来の約350bpの配列を得た。新しい配列決定プライマー
を、以前の配列の末端近くの配列に基づいて合成し、そ
して同じ様式で用いてcDNAの両方の鎖の配列を完成し
た。コーヒー果実発現ACCシンターゼcDNAの完全な配列
を図１に与える。コーヒー果実発現ACCシンターゼの推
定アミノ酸配列を図２に与える。 【００８４】コーヒーのACCシンターゼcDNAクローンお
よび推定タンパク質の配列を、GenBankに存在する他のA
CCシンターゼ遺伝子と比較した。コーヒー果実から単離
したcDNAは、GenBankに存在する他のACCシンターゼに対
して、68.3％〜58.1％の同一性を示す。そして、このcD
NAから推定したタンパク質配列は、他のACCシンターゼ
に対して、67.9％〜50.5％の同一性を示す。しかし、こ
のcDNAは、1500bpより大きな他の配列が、それに対して
68.3％より大きな同一性を示さなかったという点におい
て独特である。 【００８５】実施例２ コーヒー果実特異的ACCオキシダーゼの単離 ａ）ACCオキシダーゼ特異的オリゴヌクレオチドプライ
マーの合成 全RNAの単離、mRNAの単離、およびコーヒー果実特異的c
DNAの合成は、上記の通りであった。 【００８６】GenBankから得た12のACCオキシダーゼ配列
を、GCG (GeneticsComputer Group,Madison, WI)のPile
upプログラムを用いて整列した。転写開始コドンからの
約1000bpの領域は、保存的であることが見出され、そし
てこの領域に対応する5'-TCATIGCKKCRAKIGGTTC-3'（配
列番号８）を合成した。イノシン（I）を、配列保存性
を示さない位置に置いた。なぜなら、この位置は、A,T,
G, またはCの任意であり得るからである。２倍の多義
性を示す位置を、混合した残基（T/GまたはA/G）で調製
した。本発明者らはまた、本発明者らの研究室において
以前にクローン化したパパイヤ果実発現ACCオキシダー
ゼcDNAの領域に対して相同な第２のプライマーを調製
し、そして以下の転写開始コドンから約372bpに置い
た：5'-GACACTGTGGAGAGGCTGAC-3' （配列番号９）。 【００８７】２つのプライマーをPCR反応において使用
し、コーヒー果実発現ACCオキシダーゼの一部を増幅し
た。PCRは、0.2μL（10ng)のcDNA画分３（実施例１にお
いて記載される）、５μLの10×PCR緩衝液、３μLのMgC
l₂(25mM)、１μLの４つのdNTPの各々 (10mM)、１μLの
各プライマーの20μM溶液、0.3μLのTaq DNAポリメラー
ゼ (promegaCorporation, Madison, WI)、および38.5μ
Lの水を含んだ。PCR条件は、94℃（１分間）、50℃（１
分間）、および72℃（１分間）の35サイクルであった。
最後のサイクル後、72℃にて５分のインキュベーション
を実施した。生成物の20μLアリコートを、以前に記載
のような1.5％アガロースゲル中で電気泳動し、それは
約800bp生成物を示した。DNAをゲルから切り出し、そし
て1.5mLの微量遠心管中で200μLの滅菌水と混合した。
５分間の煮沸後、２μLを、同じプライマーを使用する
上記のような50μLのPCR反応における鋳型として使用し
た。20μLのPCR反応を使用する上記のように実施したゲ
ル電気泳動は、単一の800bpの生成物の存在を示した。
残りの30μLのPCR反応物に、20μLのクロロホルムおよ
び100μLの水を添加した。内容物を混合し、そして微量
遠心分離機中で、14,000rpmにて２分間遠心分離した。D
NAを含む上方の水相を、きれいな微量遠心管に移した。
このDNAの一部を、上記のようなランダムプライム化合
成によって放射能で標識した。 【００８８】ｂ）ランダムプライム化プローブでの増幅
したライブラリーのスクリーニング 実施例１において記載される増幅したコーヒー果実cDNA
を使用して、上記のような４つの150×10mmNZYプレート
を調製した。クローンのプレハイブリダイゼーション、
ハイブリダイゼーション、および回収は、PCRによって
得たACCオキシダーゼ配列をプローブとして使用するこ
とを除いて、上記の通りであった。 【００８９】ｃ）コーヒー果実のACCオキシダーゼcDNA
クローンの特徴づけ コーヒーのACCオキシダーゼcDNAクローンのサイズを、
実施例１において記載されるようなT3およびT7プロモー
ターに対して相同なプライマーを使用するポリメラーゼ
連鎖反応によって決定した。 【００９０】最も大きなコーヒーのACCオキシダーゼcDN
Aクローンの配列を、実施例１に記載されるように得、
そしてGenBankにおいて存在するAccオキシダーゼ遺伝子
と比較した。図３は、コーヒー果実特異的ACCオキシダ
ーゼの配列を与える。図４は、このタンパク質の推定ア
ミノ酸配列を与える。cDNAは、ACCオキシダーゼをコー
ドすると決定した。なぜなら、それは、GenBankにおい
て存在する他のACCシンターゼ核酸配列に対して50.4％
〜82.5％の同一性であるからである。また、推定タンパ
ク質配列は、他のACCオキシダーゼに対して32.5％〜86.
5％同一性である。 【００９１】上記の実施例は、説明の目的のみのためで
あり、そして本明細書に添付される請求の範囲において
示される本出願の発明の範囲を限定するとしてみなされ
るべきではない。 【００９２】実施例３ アンチセンスACCシンターゼおよびACCオキシダーゼ転写
物の発現のためのベクターの構築 ACCシンターゼおよびACCオキシダーゼcDNAは、例えばア
ンチセンス発現または同時抑制によってコーヒー中のエ
チレン含量を改変するために使用され得る。ベクターpK
R1を用いるその使用の一例を記載する。これは単なる一
つの例に過ぎず、そして多くの他の植物形質転換ベクタ
ーが、ACCシンターゼおよびACCオキシダーゼcDNAとの組
合せで使用され得る。pKR1を、以下のようにpBI121（Cl
ontechLaboratories)の改変によって作製した。 【００９３】cre部位特異的リコンビナーゼについてlox
認識部位を含む２つの38塩基対の合成配列を、pBI-121
のネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（NPTII)選
択マーカー遺伝子の周りに挿入した。これらのlox部位
は、それが植物ゲノム中に組み込まれた後、構築物から
のNPT II遺伝子の除去を可能にするが[DaleおよびOw,Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10558 (1991)]、アンチ
センス中のACCシンターゼおよびACCオキシダーゼcDNAの
機能に関係はない。 【００９４】これらの合成オリゴヌクレオチドを、Dale
およびOw（前出）によって定義されるloxP配列に基づい
て合成した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は以下
である： loxA: 5'-AGCTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-
3' loxB: 5'-AGCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-
3'、および loxC: 5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGCT-
3'。 【００９５】loxBは、loxAおよびloxCの両方に相補的な
鎖である。loxAおよびloxBがアニーリングした場合、そ
れらは、HindIII突出に相補的な4-塩基突出を有する二
本鎖分子を形成し、これによって、pBI-121中のNPTII遺
伝子に隣接するNOS転写末端配列の後ろに見出されるも
ののような、HindIII部位への二本鎖配列の挿入を可能
にする。loxBとloxCのアニーリングは、lox認識部位を
含む平滑末端化二本鎖DNAを生成する。 【００９６】合成lox部位を、以下のようにpBI-121のNP
T II遺伝子の周りに挿入した。pBI-121を、製造業者に
よって提供された反応緩衝液中で、37℃にて２時間、Pm
eI(New England Biolabs, Beverly, MA)で消化した。pB
I-121は、NPT II遺伝子の発現を駆動するNOSプロモータ
ーのすぐ近くに、単一のPmeI部位を有する。合成lox部
位を、等モル量のloxBとloxCを、95℃にて加熱し、室温
までゆっくりと冷却することによってアニーリングさ
せ、そしてPmeI消化したpBI-121中に連結することによ
って生成した。30μLの連結反応は、連結緩衝液(NewEng
land Biolabs, Beverly, MA)、60nmoleのPmeI-消化した
pBI-121、３μLのアニーリングしたloxB/loxCの１μMス
トック溶液、４単位のPmeI、および4,000単位の高濃度T
4DNAリガーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)を含
んだ。連結は16℃にて一晩であった。１〜４μLの連結
反応物を、E.coli XL1-Blue細胞（Stratagene)中で電気
穿孔し、そして50μg-mLのカナマイシン、50μLの20mg/
mLのX-gal、および10μLの100mMIPTGを含むLBプレート
上にプレートした。白色コロニーを、新しいLB-カナマ
イシンマスタープレートに採取した。 【００９７】lox部位を含むコロニーを、コロニーハイ
ブリダイゼーションによって同定した。マスタープレー
トを、37℃にて４時間増殖し、そしてナイロンメンブレ
ン(MSI)にブロッティングした。メンブレンを、新しいL
B-カナマイシンプレート上に置き、そして37℃にて一晩
増殖させた。メンブレンを、0.5MのNaOH上に10分間浮遊
させ、0.5MのNaClを含む0.5MのTris-HCl(pH8.0)上に２
分間浮遊させることにより中和し、そして２×SSC中で
リンスした。 【００９８】メンブレンを、20mLの６×SSPE、５×Denh
ardt溶液、0.5％ SDS、および100μg/mLの断片化したニ
シン精子DNA中で、55℃にて３時間プレハイブリダイズ
した。プレハイブリダイゼーション溶液を、T4ポリヌク
レオチドキナーゼを用いて、5'末端にて[³²P]で標識し
た8.4×10⁶cpmのloxCを含む10mLの新しい溶液と置き換
えた。50μLの標識化反応物は、50pmoleのloxC、ポリヌ
クレオチドキナーゼ反応緩衝液（Promega)、15μLの3,0
00Ci/mmolの[-³²P]ATP (DuPont-NEN)、および20単位のT
4ポリヌクレオチドキナーゼ(Promega)を含んだ。反応物
を、37℃にて10分間インキュベートし、そして生成物を
SephadexG-25スピンカラムを用いて、取り込まれていな
いATPから分離した。ハイブリダイゼーションは、55℃
にて一晩であった。フィルターを、0.5％ SDSを含む100
mLの２×SSC中で55℃で２回、0.5％SDSを含む100mLの１
×SSCで55℃で一回洗浄し、そして上記のようにオート
ラジオグラフにかけた。いくつかのコロニーが激しくハ
イブリダイズすることを見出し、そしてさらなる特徴付
けのために選択した。プラスミドDNAを、MagicMiniprep
s DNA Purification System（登録商標）(Promega)を用
いて抽出し、そして上記のようにPmeIで消化した。lox
部位を含むプラスミドは、もはやPmeI部位を有さない。
PmeIによる消化に耐性であったプラスミドを、Universi
tyof HawaiiBiotechnology Service Centerにて自動化D
NA配列決定によってさらに分析し、lox部位の挿入を確
認した。 【００９９】所望の方向にlox部位を含むプラスミドをH
indIIIで消化し、HindIII付着末端を含むが、完全なHin
dIII制限部位を含まないloxA/loxBヘテロ二重鎖と混合
し、上記のようにアニーリングし、そして連結した。連
結反応物は、最終容量30μL中に、2.5μgのHindIII消化
したプラスミド、1.25pmoleのloxA/loxB、連結緩衝液(P
romega)、６単位のT4DNAリガーゼ(Promega)、1.25単位
のHindIII(Promega)を含んだ。反応物を、室温にて１時
間インキュベートし、80℃にて10分間加熱し、そしてエ
レクトロポレーション(Stratagene)によってE.coliXL1-
Blue細胞中に導入した。ランダムなプラスミドを、上記
のようなHindIIIでの消化によるHindIII部位の損失につ
いてスクリーニングした。このプラスミド構造（pKR1と
命名する）の最終確認を、上記のようなDNA配列決定に
よって得た。 【０１００】pKR1をSacIで消化した。173μLの反応物
は、10μgのpKR1、マルチコア(multicore)緩衝液(Prome
ga)、および20単位のSacI(Promega)を含んだ。37℃にて
１時間後、0.7μLのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTPの25
mMストック、ならびに10単位のT4 DNAポリメラーゼ(Pro
mega)を添加した。SacI消化生成物を平滑末端化するこ
の反応物を、15℃にて30分間インキュベートした。75℃
にて15分間のインキュベーションによるT4DNAポリメラ
ーゼの不活化後、24単位のSmaIを添加し、そして反応物
を、室温にて２時間インキュベートした。反応を、80℃
にて15分間の加熱によって停止した。DNAを、17μLの３
M酢酸ナトリウムおよび375μLの100％エタノールの添加
によって沈澱させた。-70℃にて１時間後、DNAを、微量
遠心分離機中でフルスピードにて、４℃にて20分間の遠
心分離によって回収した。DNAを、70％エタノールで洗
浄し、減圧下で乾燥し、そして88μLの水中に溶解し
た。10μLの10×子ウシ腸アルカリホスファターゼ緩衝
液(Promega)および20単位の子ウシ腸アルカリホスファ
ターゼを添加し、そして反応物を、37℃にて２時間イン
キュベートした。反応を、４μLの0.5MEDTAの添加およ
び75℃にて10分間の加熱によって停止した。サンプル
を、等量の水飽和フェノールで、次いで等量のフェノー
ル：クロロホルム(１:１）、および最後にクロロホルム
で抽出した。DNAを、0.1容量の３M酢酸ナトリウムおよ
び2.5容量の100％エタノールの添加後に、沈澱によって
回収した。 【０１０１】コーヒーACCシンターゼおよびACCオキシダ
ーゼcDNA挿入物を、以下のような制限酵素を用いて本来
のプラスミド、pACS、およびpACOから放出した。10μg
のpACSプラスミドを、10μLの10×Multicore緩衝液(Pro
mega)、40単位のSmaIを含む100μL中で消化した。25℃
にて一晩のインキュベーション後、40単位のBsrSIを添
加し、そして反応を67℃にて継続した。67℃にて２時間
後、反応管を氷中で10分間冷却し、続いて37℃にてイン
キュベーションした。反応混合物を、１μLの10mMdNTP
(dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP)、１μLの１mg/mLのア
セチル化BSA、および15単位のT4 DNAポリメラーゼ(Prom
ega)で補充した。反応物を、37℃にて５分間インキュベ
ートし、DNAを平滑末端化した。75℃にて30分間のイン
キュベーションによるT4DNAポリメラーゼの不活化後、
容量を、Speed-Vac（登録商標）において50μLに減少し
た。消化生成物を、１％のSeaPlaqueアガロースゲル上
での電気泳動によって分離した。1.6kbのコーヒーACCシ
ンターゼcDNAを、アガロースゲルから切り出し、そして
cDNA挿入物を、1.12単位のAgarace(Promega)でのアガロ
ースの消化によって回収した。45℃にて30分間のインキ
ュベーション後、cDNAを、24μLの３M酢酸ナトリウム(p
H 5.2)および600μLの95％エタノールを添加することに
よって沈澱させた。エタノール沈澱したcDNAを、室温に
て30分間遠心分離し、上清を廃棄し、そしてペレットを
氷冷の70％エタノールで洗浄し、そして上記のように遠
心分離した。ペレットを、100μLの水中に溶解し、そし
て引き続いてpKR1ベクター中の平滑末端連結において使
用した。 【０１０２】ACCオキシダーゼcDNA挿入物を、pACS cDNA
についての上記の同様の様式で調製した。10μgのpACO
プラスミドを、10μLの10×緩衝液Ｃ(Promega)、１μL
の１mg/mLのアセチル化BSA、30単位のBali、および30単
位のbambooを含む100μL中で消化した。37℃にて２時間
のインキュベーション後、反応混合物に、１μLの10mMd
NTP (dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP)および15単位のT4
DNAポリメラーゼ(Promega)を補充した。反応物を、37
℃にて５分間インキュベートし、平滑末端を生成した。
75℃にて30分間のインキュベーションによるT4DNAポリ
メラーゼの不活化後、容量を、Speed-Vac（登録商標）
において50μLに減少させた。消化反応物を、１％のSea
Plaqueアガロースゲル上での電気泳動によって分離し
た。１kbのコーヒーACCオキシダーゼcDNAを、アガロー
スゲルから切り出し、そしてcDNA挿入物を、1.12単位の
Agarace (Promega)でのアガロースの消化によって回収
した。アガロースからのcDNA挿入物の精製は、ACCシン
ターゼ挿入物について記載される通りであった。ペレッ
トを、50μLの水中に溶解し、そして引き続いてpKR1ベ
クター中の平滑末端連結において使用した。 【０１０３】精製したACCシンターゼおよびACCオキシダ
ーゼ挿入物を、500ngのpKR1ベクター（平滑末端化およ
びホスファターゼ化したSamI/SacIフラグメント）およ
び150ngのACCシンターゼまたはACCオキシダーゼのいず
れかの挿入物を、別々の管中で混合することにより、pK
R1ベクター中に連結した。各ベクター／挿入物混合物の
容量を、Speed-Vac（登録商標）を用いて８μLに減少さ
せた。ベクター／挿入物管の各々に、１μLの10×リガ
ーゼ緩衝液（Promega)および１μLのT4DNAリガーゼ（10
単位）を添加した。内容物を、８℃にて48時間インキュ
ベートした。 【０１０４】１μLの各連結生成物を、40μLのXL-1 Blu
e細胞（上記で、エレクトロポレーションのために調製
し、そして-70℃にて貯蔵した）と混合し、そして「Ele
ctroCell Manipulator 600」(ECM 600, BTX Inc., CA)
を用いて2.35KVにて５m秒間エレクトロポレートした。
エレクトロポレーションの直後、１mLのLB緩衝液を各チ
ューブに添加し、そして回転振盪機中で、250RPMにて１
時間インキュベートした。インキュベーション後、細菌
を、1400RPMにて２分間の遠心分離によって沈澱させ、
そして容量を100μLに減少させた。50μLの混合物を、4
0μg/mLのカナマイシンを含むLBプレート中にプレート
し、そして37℃にて一晩インキュベートした。カナマイ
シンプレートにおいて増殖するコロニーを、ACCシンタ
ーゼまたはACCオキシダーゼ挿入物を含むコロニーを同
定するためにさらにスクリーニングした。個々のクロー
ンを滅菌の爪楊枝(toothpick)を用いて収集し、そして
新しいLB-カナマイシンプレート上に格子パターンで置
いた。各cDNA挿入物（ACCシンターゼおよびACCオキシダ
ーゼ）について３つのプレートが存在した。格子で一晩
の増殖後、細菌を、Magnaナイロンメンブレン(MSI,MA)
中にレプリカブロッティングした。メンブレンを、10％
SDS中で５分間、0.5MのNaOHおよび1.5MのNaClで15分
間、0.5MのTris-HClおよび1.5MのNaClで15分間、ならび
に２×SSCおよび0.2MのTris-HClで５分間、連続的に処
置した。メンブレンを、風乾し、そして80℃にて20分間
焼き、そして120,000μジュールのUV照射（StrataLinke
r UV crosslinker 1800, Stratagene, CA)によって架橋
した。 【０１０５】メンブレンを、６×SSPE、５×Denhardt溶
液、0.5％ SDS、および100μg/mLのニシン精子DNA中
で、65℃にて２時間、プレハイブリダイズした。ACCシ
ンターゼおよびACCオキシダーゼのためのプローブを、R
eady-to-GoDNA標識ビーズ(Pharmacia)を用いて合成し
た。50ngの各cDNA挿入物を、45μLの水中での煮沸およ
び氷中でのクエンチによって変性させた。45μLの変性
したDNAを、Ready-to-GoDNA標識ビーズおよび５μLの[
³²-P] dCTP (3000Ci/mmol)と混合し、そして37℃にて30
分間インキュベートした。プローブ合成後、チューブ
を、水中で４分間煮沸し、そして氷中でクエンチした。
プレハイブリダイゼーション緩衝液を廃棄し、そして10
mLの予め加熱したハイブリダイゼーション緩衝液（６×
SSPE、0.5％SDS、および100μg/mLのニシン精子DNA）
を、各ハイブリダイゼーションボトル中に置き、次いで
変性したプローブを添加した。ハイブリダイゼーション
を65℃にて一晩実施した。 【０１０６】メンブレンを、２×SSCおよび0.5％ SDSで
手短に洗浄した。同じ緩衝液での２回目の洗浄を30分間
実施した。メンブレンを、0.2×SSCおよび0.5×SDSで２
回洗浄した。各洗浄は30分間であった。次いで、メンブ
レンをオートラジオグラフした。ACCシンターゼを有す
る５つのpKR1クローンおよびACCオキシダーゼを有する2
4のクローンを、オートラジオグラムの展開の際に同定
した。各クローンにおける遺伝子の方向を、PCR、制限
消化、およびベクター／挿入物結合部の配列決定を使用
して同定した。29のクローン（５つのACCシンターゼお
よび24のACCオキシダーゼ）の各々からの細菌性コロニ
ーのピンチ(pinch)を、爪楊枝を用いて採取し、そして2
0μLの滅菌Milli-Q水中に懸濁した（細胞希釈液）。25
μLのPCR反応物は、２μLの上記の細胞希釈液、0.5μL
の各dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPの10mMストック、1.
5μLの25mMMgCl₂、2.5μLの10×緩衝液(Promega)、各１
μLの以下で与えられる３つの20μMプライマー、0.3μL
の５単位／μLTaq DNAポリメラーゼ(Promega)、ならび
に16.2μLの滅菌Milli-Q水を含んだ。ACCシンターゼク
ローンのために使用されるプライマーは、以下であっ
た：35Sプライマー（5'-CCACTA TCC TTC GCA AGA CC-
3')；ACSR₇ (5'-TTG CCA TCT TCG ACA AGA CT-3')；お
よびACSL₄(5'-CTG TTG TCA GCT GTG CTA-3')。同様に、
ACCオキシダーゼクローンのために使用されるプライマ
ーは、以下であった：35Sプライマー；ACOR₄(5'-GGA CT
T CTG AGA TGT TGG AA-3')；およびACOL₁ (5'-TGG TGG
AGA GCA AGGAAT TG-3')。熱サイクル条件は、94℃にて1
0分；94℃にて１分、50℃にて１分、72℃にて１分の35
サイクル、および72℃にて５分であった。pKR1/ACCシン
ターゼ構築物についてPCR生成物の予想されるサイズ
は、センス方向について320bp(35SおよびACSR₇)、そし
てアンチセンス方向について850bp(35SおよびACSL₄)で
あった。同様に、pKR1/ACCオキシダーゼ構築物について
予想される生成物は、センス方向について400bp(35Sお
よびACOR₄)、そしてアンチセンス方向について800bp(35
SおよびACOL₁)であった。ACCシンターゼおよびACCオキ
シダーゼの両方について、センスおよびアンチセンス方
向でcDNAをそれぞれ有する１つのプラスミドを、プラス
ミドとcDNA間の結合部のDNA配列決定によってさらに分
析し、方向を確認した。DNA配列決定を上記のように実
施した。アンチセンス方向にACCシンターゼ遺伝子(pKRC
ACS-Aと示される)、センス方向にACCシンターゼ(pKRCAC
S-S)、アンチセンス方向にACCオキシダーゼ(pKRCACO-
A)、およびセンス方向にACCオキシダーゼ(pKRCACO-S)を
有するバイナリーベクターを、図１〜４にそれぞれ示
し、本明細書に添付する。 【０１０７】実施例４ センスおよびアンチセンス方向にACCシンターゼ(pKRCAC
S-SおよびpKRCACS-A)およびACCオキシダーゼ(pKRCACO-S
およびpKRCACO-A)cDNA遺伝子を含む、pKR1プラスミドで
の、Agrobacteriaのエレクトロポレーション Agrobacterium株LBA 4404を、単一のコロニーからOD₆₀₀
まで、100mLのYM液体培地（0.4g/LのYeast抽出物、10g/
Lのマンニトール、0.1g/LのNaCl、0.2g/LのMgSO₄・7H
₂O、0.5g/LのK₂HPO₄、pH7.5）中で、回転振盪機中29℃
にて48時間増殖させた。4000×gでの遠心分離によっ
て、６×10¹¹細胞／mLまで濃縮した。エレクトロポレー
ションを「ElectroCell Manipulator 600」(ECM 600, B
TX Inc., CA)を用いて実施した。200ngのDNAを含むpKRC
ACS-A、pKRCACO-A、pKRCACS-S、またはpKRCACO-Sのいず
れかのプラスミド溶液の3.5μLアリコートを、濃縮した
50μLのAgrobacteria細胞と混合し、予め冷却した２mm
ギャップキュベット(BTXInc.,CA)に移し、そして2.35kV
にての５msパルスを適用した。50μg/mLのカナマイシン
を含む１mLのYM液体培地を、エレクトロポレートした細
胞に添加し、そしてそれらを250RPMにての29℃振盪機中
で１時間回収した。細胞を、4000×gにて遠心分離し、
そして100μLの新しいYM液体培地中に再懸濁した。形質
転換した細菌を、50μg/mLのカナマイシンを補充したYM
寒天プレート（15g/LのBacto寒天を含むYM液体培地）上
で選択した。 【０１０８】29℃にて48時間のインキュベーションの
後、Agarobacterium形質転換の確認を、各形質転換から
マークした格子上の新しいYM寒天／カナマイシンプレー
トに10個のコロニーを採取することによって得た。ACC
シンターゼおよびACCオキシダーゼ遺伝子挿入物の存在
および方向を、内部遺伝子特異的プライマーのうちの１
つを導く35Sプライマーを用いてPCRによって決定した。
少量の各コロニーを、滅菌した爪楊枝を用いて、20μL
の滅菌Milli-Q水に移した。PCR反応を、上記のように、
２μLのこれらの細胞懸濁液を鋳型DNAとして使用して実
施した。ACCシンターゼセンス方向については、35Sおよ
びACSR₇プライマーを使用し、そして予想されるサイズ
（320bp)の生成物を生成した。ACCシンターゼアンチセ
ンスプライマー35SおよびACSL₄は、850bpの予想される
生成物を生じた。同様に、ACCオキシダーゼセンス方向
については、35SおよびACOR₄プライマーを使用し、そし
て予想されるサイズ（400bp)の生成物を生成した。ACC
オキシダーゼアンチセンスプライマー35SおよびACOL
₁は、800bpの予想される生成物を生じた。本発明者ら
は、コーヒーの葉組織の形質転換のために、各方向の１
つのコロニーを選択した。 【０１０９】実施例５ pKRCACS-S、pKRCACO-S、pKRCACS-A、およびpKRCACO-Aプ
ラスミドを含むAgrobacteriaを用いたコーヒーの葉組織
の感染 傾斜屈性の苗条からの成熟した若いコーヒーの葉を、30
％のClorox中で30分間滅菌し、そして滅菌した蒸留水中
で３回リンスした。主脈と縁との間の薄層から約７mm²
の切片を、切り出し、そして10⁹細胞/mLのAgrobacteriu
mスラリーとともにMS液体培地（MurashigeおよびSkoog,
1962)中に置き、そして３時間同時培養した。葉組織
を、滅菌した紙タオルで乾燥ブロッティングし、そして
2.0g/LのPhytagelの添加によって凝固させたMS培地上で
３日間、残りのAgrobacteriumとともに同時培養した。 【０１１０】葉組織を、滅菌紙タオルで再度ブロッティ
ングし、残りのAgrobacteriaを除去し、次いで500μg/m
Lのカルベニシリン、および100〜300μg/mLのカナマイ
シン一硫酸または10〜20μg/mLのジェネティシン(G418)
のいずれかを含むカルス誘導培地（2,4-Dおよびカイネ
チンを含むMS培地；SondahlおよびSharp,1977)中に移し
た。暗所中で25℃にて13日間の培養後、初期のカルスが
現れ始めた。 【０１１１】実施例６ pKRCACS-S、pKRCACO-S、pKRCACS-A、またはpKRCACO-Aプ
ラスミドを含むコーヒーの葉のカルス組織の継代培養 抗菌耐性カルスを、300μg/mLのカルベニシリンおよび1
50〜200μg/mLのカナマイシンを含む胚誘導培地MII（基
本の塩、半強度MS塩、10mgのチアミンHCl、40mgのシス
テインHCl、100mgのミヨ-イノシトール、40gのスクロー
ス、２mgのBA、１mgのピリドキシン、１mgのニコチン
酸、2.0gのフィタゲル、pH5.65；YasudaおよびFujii、1
985）を用いて３ヶ月間、１ヶ月ごとに継代培養した。
次いで、これらのカルスを、100μg/mLのカナマイシン
を含むMII培地中で30日間、50μg/mLのカナマイシンを
含むMII培地中でさらに30日間継代培養した。体細胞胚
は、この最後の培地中で形成した。体細胞胚は、蛍光下
で、増殖レギュレーターを欠いた発芽培地MIII（基本の
塩、完全強度のMS塩、10mgのチアミンHCl、40mgのシス
テインHCl、100mgのミオ-イノシトール、40gのスクロー
ス、２gのフィタゲル、pH5.65；SondahlおよびSharp, 1
977）上で小植物へと発達した。 【０１１２】（配列表） 【０１１３】 【表１】【０１１４】 【表２】【０１１５】 【表３】【０１１６】 【表４】【０１１７】 【表５】【０１１８】 【表６】【０１１９】 【表７】【０１２０】 【表８】【０１２１】 【表９】【０１２２】 【表１０】【０１２３】 【表１１】【０１２４】 【表１２】【０１２５】 【表１３】【０１２６】 【表１４】【０１２７】 【表１５】【０１２８】 【表１６】 【０１２９】 【発明の効果】エチレンを合成し得ないが、それらの代
謝の他の局面には影響のない、形質転換された植物が提
供された。

【図面の簡単な説明】 【図１ａ】図１（図１ａ〜図１ｄ）は、コーヒー果実が
発現するACCシンターゼをコードするcDNAの完全な配列
である。 【図１ｂ】図１（図１ａ〜図１ｄ）は、コーヒー果実が
発現するACCシンターゼをコードするcDNAの完全な配列
である。 【図１ｃ】図１（図１ａ〜図１ｄ）は、コーヒー果実が
発現するACCシンターゼをコードするcDNAの完全な配列
である。 【図１ｄ】図１（図１ａ〜図１ｄ）は、コーヒー果実が
発現するACCシンターゼをコードするcDNAの完全な配列
である。 【図２ａ】図２（図２ａ〜図２ｃ）は、図１（図１ａ〜
図１ｄ）に示されるcDNA配列から推定される、コーヒー
果実のACCシンターゼのアミノ酸配列である。 【図２ｂ】図２（図２ａ〜図２ｃ）は、図１（図１ａ〜
図１ｄ）に示されるcDNA配列から推定される、コーヒー
果実のACCシンターゼのアミノ酸配列である。 【図２ｃ】図２（図２ａ〜図２ｃ）は、図１（図１ａ〜
図１ｄ）に示されるcDNA配列から推定される、コーヒー
果実のACCシンターゼのアミノ酸配列である。 【図３ａ】図３（図３ａ〜図３ｃ）は、コーヒー果実が
発現するACCオキシダーゼをコードするcDNAの配列であ
る。 【図３ｂ】図３（図３ａ〜図３ｃ）は、コーヒー果実が
発現するACCオキシダーゼをコードするcDNAの配列であ
る。 【図３ｃ】図３（図３ａ〜図３ｃ）は、コーヒー果実が
発現するACCオキシダーゼをコードするcDNAの配列であ
る。 【図４ａ】図４（図４ａ〜図４ｂ）は、図３（図３ａ〜
図３ｃ）に示されるcDNA配列から推定される、コーヒー
果実のACCオキシダーゼのアミノ酸配列である。 【図４ｂ】図４（図４ａ〜図４ｂ）は、図３（図３ａ〜
図３ｃ）に示されるcDNA配列から推定される、コーヒー
果実のACCオキシダーゼのアミノ酸配列である。 【図５】図５は、pKR1ベクター中にアンチセンス方向で
コーヒー果実が発現するACCシンターゼをコードするcDN
Aの一部を含む、pKRCACS-Aベクターを示す。 【図６】図６は、pKR1ベクター中にセンス方向でコーヒ
ー果実が発現するACCシンターゼをコードするcDNAの一
部を含む、pKRCACS-Sベクターを示す。 【図７】図７は、pKR1ベクター中にアンチセンス方向で
コーヒー果実が発現するACCオキシターゼをコードするc
DNAの一部を含む、pKRCACO-Aベクターを示す。 【図８】図８は、pKR1ベクター中にセンス方向でコーヒ
ー果実が発現するACCオキシターゼをコードするcDNAの
一部を含む、pKRCACO-Sベクターを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イステフォ モイスヤディ アメリカ合衆国 ハワイ 96822， ホノ ルル， モット−スミス ドライブ 1717， アパートメント 3213 (72)発明者 カビ ラー ニューペイン アメリカ合衆国 ハワイ 96826， ホノ ルル， コロ プレイス 2724 Ｆターム(参考） 2B030 AB02 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 CA04 DA01 EA04 GA14 HA01 HA14 4B065 AA11X AA89X AA89Y AB01 BA03 BB12 BB14 BB16 BB37 CA53

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 配列番号10のアミノ酸配列をコードする
   単離された核酸配列で形質転換された、コーヒー植物。