JP2005323613A - コーヒー植物の成熟を制御するための、精製されたタンパク質、組換えdna配列、および手順 - Google Patents
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Abstract
エチレンを合成し得ないが、それらの代謝の他の局面には影響のない形質転換植物を提供すること。
【解決手段】
本発明は、精製されたタンパク質、その発現をコードするDNA配列、および組換えDNA分子を提供し、エチレンの合成に必要な酵素の発現を抑制するための形質転換コーヒー植物のためにそれらで形質転換された宿主を含む。DNA配列および組換えDNA分子は、コーヒー植物におけるエチレンの生合成経路の要素である酵素ACCシンターゼまたはACCオキシダーゼの発現をコードする点で特徴づけられている。コーヒー植物は、ACCシンターゼおよび/またはACCオキシダーゼのmRNAに対してアンチセンスであるそれぞれのmRNAの発現をコードする、ACCシンターゼDNA配列および/またはACCオキシダーゼDNA配列を含むベクターで形質転換される。
【選択図】 なし
Description
本発明は、精製されたタンパク質、その発現をコードするDNA配列、および組換えDNA分子を提供し、エチレンの合成に必要な酵素の発現を抑制するためのコーヒー植物の形質転換のためにそれらで形質転換された宿主を含む。DAN配列および組換えDNA分子は、それらがコーヒー植物におけるエチレンの生合成経路の要素である酵素ACCシンターゼまたはACCオキシダーゼの発現をコードする点で特徴づけられる。
形質転換された植物における成熟は、外因性エチレンによって調節され得る。全ての植物へのエチレンの適用によって、全ての植物は同時に成熟して、コーヒーの機械収穫をより生産的にする。
1.配列番号10のアミノ酸配列から本質的になる、Coffea arabica由来の実質的に純粋なACCシンターゼ。
2.発現の際にCoffea arabicaによって産生されるAACシンターゼをコードし、配列番号11に示されるヌクレオチド配列を含む、実質的に純粋な核酸配列。
3.項目2に記載の発現の際にCoffea arabicaによって産生されるACCシンターゼをコードする、実質的に純粋な核酸配列であって、上記核酸配列は、配列番号11のコード領域に限定される、実質的に純粋な核酸配列。
4.Coffea arabicaの成熟を制御するための方法であって、上記方法は以下の工程:
a)DNA配列である配列番号11に対してアンチセンスであるDNA配列を用いてコーヒー植物を形質転換する工程;
b)上記a)のDNA配列で形質転換された植物を生育する工程;および
c)コーヒー植物が成熟した後に、上記形質転換された植物に対して外的なエチレンを適用する工程、
を包含する、方法。
5.項目4に記載のCoffea arabicaの成熟を制御するための方法であって、形質転換に使用されるDNA配列は、配列番号11のコード領域に対してアンチセンスである配列に限定される、項目4に記載の方法。
6.項目4または5に記載の果実の成熟を制御するための方法であって、気体性エチレンは、上記植物の全体に適用されて、上記果実の実質的にすべての成熟を同時に成熟させる、方法。
7.アミノ酸配列である配列番号12から本質的になる、Coffea arabicaからの実質的に純粋なACCオキシダーゼ。
8.配列番号13を含み、発現の際にCoffea arabicaのACCオキシダーゼをコードする、実質的に純粋な核酸配列。
9.項目8に記載される発現の際にCoffea arabicaによって産生されるACCオキシダーゼをコードする、実質的に純粋な核酸配列であって、上記核酸配列は、配列番号13のコード領域に限定される、実質的に純粋な核酸配列。
10.Coffea arabicaの成熟を制御するための方法であって、上記方法は以下の工程:
a)DNA配列である配列番号13に対してアンチセンスであるDNA配列を用いてコーヒー植物を形質転換する工程;
b)上記a)のDNA配列で形質転換された植物を生育する工程;および
c)コーヒー植物が成熟した後に、上記形質転換された植物に対して外的なエチレンを適用する工程、
を包含する、方法。
11.項目10に記載のCoffea arabicaの成熟を制御するための方法であって、形質転換に使用されるDNA配列は、配列番号13のコード領域に対してアンチセンスである配列に限定される、方法。
12.項目9または10に記載の果実の成熟を制御するための方法であって、気体性エチレンは、上記植物の全体に適用されて、上記果実の実質的にすべての成熟を同時に成熟させる、方法。
13.ACCシンターゼの発現が抑制された、コーヒー植物。
14.ACCオキシダーゼの発現が抑制された、コーヒー植物。
15.ACCシンターゼの発現が抑制され、そしてACCオキシダーゼの発現が抑制された、コーヒー植物。
16.発現の際にACCシンターゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるmRNAを転写の際にコードするDNA配列を含む、コーヒー植物。
17.項目16に記載のコーヒー植物からのコーヒー果実。
18.項目16に記載のコーヒー植物からのコーヒー豆。
19.発現の際にACCオキシダーゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるmRNAを転写の際にコードするDNA配列を含む、コーヒー植物。
20.項目19に記載のコーヒー植物からのコーヒー果実。
21.項目19に記載のコーヒー植物からのコーヒー豆。
22.コーヒー植物であって、
i)発現の際にACCシンターゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるmRNAを転写の際にコードする第一のDNA配列;および
ii)発現の際にACCオキシダーゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるmRNAを転写の際にコードする第二のDNA配列、
を含む、コーヒー植物。
23.項目22に記載のコーヒー植物からのコーヒー果実。
24.項目22に記載のコーヒー植物からのコーヒー豆。
25.配列番号11において特定されるDNA配列の全部または一部に対してアンチセンスであるDNA配列を含む、コーヒー植物。
26.配列番号13において特定されるDNA配列の全部または一部に対してアンチセンスであるDNA配列を含む、コーヒー植物。
27.コーヒー植物であって、
i)配列番号11において特定されるDNA配列の全部または一部に対してアンチセンスである第一のDNA配列;および
ii)配列番号13において特定されるDNA配列の全部または一部に対してアンチセンスである第二のDNA配列、
を含む、コーヒー植物。
28.発現の際にACCシンターゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるmRNAを転写の際にコードするDNA配列を植物ゲノムに挿入するプロセスによって生産される、コーヒー植物。
29.発現の際にACCオキシダーゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるmRNAを転写の際にコードするDNA配列を植物ゲノムに挿入するプロセスによって生産される、コーヒー植物。
30.(i)発現の際にACCシンターゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるmRNAを転写の際にコードするDNA配列;および
(ii)発現の際にACCオキシダーゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるmRNAを転写の際にコードするDNA配列、
を、植物ゲノムに挿入するプロセスによって生産される、コーヒー植物。
31.発現の際にACCシンターゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるmRNAを転写の際にコードするDNA配列でコーヒー植物を形質転換する方法であって、以下の工程:
発現の際にACCシンターゼをコードするDNA配列を含む形質転換ベクターを提供する工程であって、上記DNA配列は、反転方向で上記形質転換ベクターに挿入されている、工程;および
上記コーヒー植物の組織に上記形質転換ベクターを挿入する工程であって、反転された上記DNA配列は、その後、上記コーヒー植物のゲノムに挿入されるようになる、工程、
を包含する、方法。
32.発現の際にACCオキシダーゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるmRNAを転写の際にコードするDNA配列でコーヒー植物を形質転換する方法であって、以下の工程:
発現の際にACCオキシダーゼをコードするDNA配列を含む形質転換ベクターを提供する工程であって、上記DNA配列は、反転方向で上記形質転換ベクターに挿入されている、工程;および
上記コーヒー植物の組織に上記形質転換ベクターを挿入する工程であって、反転された上記DNA配列は、その後、上記コーヒー植物のゲノムに挿入されるようになる、工程、
を包含する、方法。
33.(i)発現の際にACCシンターゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるmRNAを転写の際にコードするDNA配列;および(ii)発現の際にACCオキシダーゼをコードするmRNAに対してアンチセンスであるmRNAを転写の際にコードするDNA配列でコーヒー植物を形質転換する方法であって、以下の工程:
発現の際にACCシンターゼをコードするDNA配列を含む第一の形質転換ベクターを提供する工程であって、上記DNA配列は、反転方向で上記形質転換ベクターに挿入されている、工程;
発現の際にACCオキシダーゼをコードするDNA配列を含む第二の形質転換ベクターを提供する工程であって、上記DNA配列は、反転方向で上記形質転換ベクターに挿入されている、工程;
上記コーヒー植物の組織に上記第一の形質転換ベクターを挿入する工程であって、反転された上記DNA配列は、その後、上記コーヒー植物のゲノムに挿入されるようになる、工程;および
上記コーヒー植物の組織に上記第二の形質転換ベクターを挿入する工程であって、反転された上記DNA配列は、その後、上記コーヒー植物のゲノムに挿入されるようになる、工程、
を包含する、方法。
エチレンを合成し得ないが、それらの代謝の他の局面には影響のない、形質転換された植物が提供された。
本明細書中に記載される本発明がより十分に理解され得るために、以下の詳細な説明を示す。説明において、以下の用語が使用される:
ヌクレオチド:糖部分(ペントース)、リン酸、および窒素複素環塩基からなる、DNAまたはRNAのモノマー単位。塩基は、グリコシド炭素(ペントースの1’炭素)を介して糖部分に連結し、そして塩基および糖のその組合せが、ヌクレオシドと称される。塩基は、ヌクレオチドを特徴づける。4つのDNA塩基は、アデニン(「A」)、グアニン(「G」)、シトシン(「C」)、およびチミン(「T」)である。4つのRNA塩基は、A、G、C、およびウラシル(「U」)である。
コーヒー果実特異的ACCシンターゼcDNAの単離
コーヒーの成熟に関与するACCシンターゼ遺伝子配列を単離するために、cDNAライブラリーを、成熟度の異なる段階でのコーヒー果実の果皮および中果皮の組織の混合物から調製した。このライブラリーを、ライブラリーを構築するのに使用したのと同じmRNAから作製される第1鎖cDNAから合成されるPCR産物、および他の生物由来のACCシンターゼ遺伝子に由来するコンセンサス配列に対応する縮重オリゴヌクレオチドプライマーを使用してスクリーニングした。本実施例は主に、mRNAの単離、cDNAライブラリーの構築、および適切なcDNAのクローニングに関与するそれに続く工程を含む。
全RNAを、コーヒー植物(C. arabica L.cv Guatemalan)のいくつかの異なる発生段階からの66gの果皮および中果皮組織から、Leviら[HortScience27(12):1316−1318(1992)]の方法を用いて単離した。凍結コーヒー果実の果皮および中果皮の組織を、少量のドライアイスとともに家庭用コーヒーミル(SaltonModelGC−5;Salton Maxam Housewares Group, Mt. Prospect, IL)で約2分間粉砕することによって粉末化した。粉末化した果実組織を、200μLの200mMトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタンヒドロクロリド(Tris−HCl)(pH8.5)、1.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、300mMLiCl、10mMエチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム(Na2EDTA)、1.5%(w:v)デオキシコレートナトリウム、1.5%(v:v)NonidetP−40(SigmaChemical Co.)、0.5mMチオ尿素、1mM アウリントリカルボキシル酸(aurintricarboxylic acid)、10mMジチオトレイトール(DTT)、75mMB−メルカプトエタノール、2%ポリビニルピロリドン(PVP)、および2%ポリビニルポリピロリドン(PVPP)に添加し、そしてPolytron組織ホモジナイザー(Tekmar,Cincinnati,OH)を用いてホモジナイズした。2分間のホモジナイズの後、200μLのクロロホルムを添加し、そしてさらに3分間ホモジナイズを続けた。ホモジネートを、250μLの遠心分離ボトル(Nalgene)に移し、そして2,500×gで15分間遠心分離した。上部の水相を取り出し、そして12μLの5MNaClと混合し、2つの遠心分離ボトルに等しく分割し、そして150μLのエタノールを各ボトルに添加した。混合物を、−20℃で一晩保存した。RNAを、4,000×gで15分間4℃にて遠心分離することによって回収した。RNAを、50μLのTE1(50mMTris−HCL(pH8.0)、10mMNa2EDTA)に溶解し、そして12,000×gで10分間4℃にて遠心分離することによって、明澄化させた。上清を、新たな遠心分離ボトルに移し、そして3μLの5MNaClおよび30μLのイソプロパノールを添加した。内容物を混合し、そして−20℃で一晩保存した。RNAを、14,000×gで10分間遠心分離することによって回収した。RNAを、20μLの70%氷冷エタノールで洗浄し、そして上記のように遠心分離することによって回収した。真空下で10分間乾燥させた後、RNAを、50μLのTE1緩衝液に再懸濁し、そして10μLの12MLiClを添加した。溶液を、4℃にて48時間インキュベートし、そしてRNAを、14,000×gで10分間の遠心分離によって回収し、そして30μLのTE1緩衝液に再懸濁した。15μLの5M酢酸カリウムを添加した後、RNAを0℃にて一晩インキュベートし、14,000×gで10分間遠心分離することによって回収し、そして50μLのTE1緩衝液に再懸濁した。3μLの5MNaClおよび110μLの95%エタノールを添加し、RNAを、−20℃にて一晩インキュベートした。RNAを、14,000×gで10分間遠心分離することによって回収し、20μLの70%氷冷エタノールで洗浄し、上記のように遠心分離することによって回収し、真空下で10分間乾燥させ、そして600μLのTE1緩衝液に再懸濁した。RNAを微量遠心分離管に移し、そして14,000rpmで30分間、4℃で、遠心分離した後、300μLを2つの新たな微小遠心分離管の各々に取り出した。もとの遠心分離した管を、さらなる300μLのTE1緩衝液でリンスした。18μLの5MNaClおよび636μLの100%エタノールを、3つの遠心分離管の各々に添加した。反転することによって混合した後、管を−20℃にて一晩保存した。RNAを、14,000×gで30分間遠心分離することによって回収し、そして1μLの70%氷冷エタノールで洗浄した。上記のように遠心分離および乾燥させた後、RNAを400μLの滅菌水に再懸濁した。全部で1.04mgの全RNAを得た。
第一および第二鎖のcDNAを、ZAP-cDNA合成キット(Stratagene,La Jolla, CA)を用いて合成した。20μLの水中6マイクログラムのmRNAを、65℃にて5分間インキュベートした。2マイクロリットルのメチル水銀(100mM)を添加し、そして室温にて10分間、インキュベーションを続けた。4マイクロリットルのβ-メルカプトエタノール(700mM)を添加し、そしてさらに5分間、インキュベーションを続けた。変性したmRNAに、5μLの10×第一鎖の緩衝液(キット中に提供される)、5μLの100mMDTT、3μLのヌクレオチド混合物(それぞれ10mMのdATP、dGTP、dTTP、および5-メチル-dCTP)、2μLのリンカー-プライマー(1.4μg/μL):5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (配列番号1)1μLのRNaseブロック、および5μLの水を添加した。反応物を室温にて10分間インキュベートし、プライマーをmRNAにアニーリングし、次いで3μLのM-MuLV逆転写酵素(20U/μL)を添加した。5マイクロリットルのこの反応混合物を、0.5μL(0.625pmole)の800Ci/mmole[α-32P]dATPを含むチューブに移した。両方の反応物を、37℃にて1時間インキュベートした。放射活性標識した反応物を、その後のゲル分析のために-20℃にて凍結した。45μLの主要反応物に、40MLの第二鎖の緩衝液、15μLの100mMDTT、6μLのヌクレオチド混合物(10mMのdATP、dGTP、dTTP、および26mMのdCTP)、268.3μLの水、および2μL(2.5pmole)の800Ci/mmole[α-32P]dATPを添加した。混合後、4.5μLの1U/μLRNase Hおよび19.2μLの5.2U/μL E.coli DNAポリメラーゼIを添加し、そして反応物を16℃にて2.5時間インキュベートした。反応物を400μLのフェノール:クロロホルム(1:1)で抽出した。微量遠心分離における5分間の遠心分離によって相を分離し、そして水相を除去し、そしてクロロホルムで再抽出した。上記のような遠心分離によって水相を回収した。
5'-AATTCGGCACGAG-3' (配列番号2)
3'-GCCGTGCTC-5'
ボルテックスしてcDNAを再懸濁した後、1μLの10×連結緩衝液、1μLの10mMATP、および1μLのT4 DNAリガーゼ(4Weiss U/μL)を添加し、そして反応物を8℃にて一晩インキュベートした。70℃にて30分間加熱することによって、リガーゼを不活化した。この時点でcDNAに付着しているEcoRIリンカーの5'末端を、ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。1マイクロリットルのZAP-cDNA合成キット(Stratagene,LaJolla, CA)の10×緩衝液#3、2μLの10mM ATP、6μLの水、および1μLの10U/μL T4ポリヌクレオチドキナーゼを、連結反応物に添加した。37℃にて30分後、反応物を70℃にて30分間加熱することによって、キナーゼ反応を停止した。XhoI「付着末端」を、リンカー-プライマー中のXhoI部位の消化によって、mRNAの3'末端に対応するcDNAの末端にて生成した。28μLのXhoI緩衝液および3μLの40U/μLXhoIをcDNAに添加し、そして反応物を、37℃にて1.5時間インキュベートした。
(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を含む1mLシリンジの頂部(top)に適用した。500μLの微量遠心管をシリンジの底部に置き、そしてカラムを遠心分離管中に置き、そして約400×gにて2分間遠心分離した。60μLの1×STEをシリンジの頂部に添加し、新しい微量遠心管をカラムの底部上に置き、そしてカラムを再度上記のように遠心分離した。6画分が回収されるまで、このプロセスを繰り返した。約10%の各画分を1%アガロースゲル上で電気泳動し、各画分中のcDNAのサイズ分布を決定した。各画分の残りを等容量のフェノール:クロロホルム、次いで上記のようなクロロホルムで抽出し、そして2容量の100%エタノールの添加によって沈澱させた。-20℃にての一晩のインキュベーション後、cDNAを、微量遠心分離機中での、4℃にて60分間、14,000rpmにての遠心分離によって回収した。各cDNA画分を200NLの80%エタノールで洗浄し、そして上記のように乾燥した。cDNA画分1を3μLの滅菌水中に再懸濁し、そしてcDNA画分2を10.5μLの滅菌水中に再懸濁した。0.5μLの2つの画分の各々を使用して、エチジウムブロマイドプレート検出方法を用いてDNAの量を決定した。最も大きなcDNA分子を含む画分1および2を混合した。12.5mLの混合した画分は、約100ngのcDNAを含んだ。この画分をSpeed-Vac中で2.5μLに減少し、そして氷上に貯蔵した。cDNA画分3を10.5μLの滅菌水中に再懸濁し、そしてその後の使用のために-20℃にて保存した。
O.D.600にて0.5の密度にまで増殖した600μLのE.coliXL1-Blue MRF' (Stratagene, LaJolla, CA)、および32.5μLの一次ライブラリーストックを16のチューブの各々に添加した。37℃にて15分間のインキュベーション後、6.0mLの48℃の上層寒天(5g/LのNaCl、2g/LのMgSO4・7H2O、5g/Lの酵母抽出物、10g/LのNZアミン[pH7.5]、および0.7%アガロース)を各チューブに添加し、そして内容物を、150×15mmのNZYプレート(5g/LのNaCl、2g/LのMgSO4・7H2O、5g/Lの酵母抽出物、10g/LのNZアミン[pH7.5]、および15g/LのDifco寒天)上にプレートした。プレートを37℃にて一晩インキュベートし、次いで10mLのSM緩衝液で重層し、そして穏やかに振盪しながら4℃にてさらに8時間インキュベートした。SM緩衝液を滅菌ピペットで回収し、そして滅菌した250mLの遠心分離ボトル中に貯蔵した。各プレートを、回収したさらなる10mLのSM緩衝液でリンスし、そして先のSM緩衝液に添加した。5%の最終濃度までクロロホルムを添加し、そしてファージ溶液を、室温にて15分間インキュベートし、次いで2,000×gにて10分間遠心分離し、細胞細片を除去した。上清を滅菌したポリプロピレンボトルに回収し、そしてクロロホルムを0.3%の最終濃度まで添加した。増幅したライブラリーを4℃で保存した。
増幅したライブラリーを上記のように力価決定した。約50,000の組換えプラークを600μLの上記のように増殖したE.coliXL1-Blue MRF'に添加した。37℃にて15分後、6.5mLの48℃の上層寒天を添加し、そして細胞を150×15mmNZYプレート上にプレートした。合計200,000の組換えプラークを含む4つのプレートを調製し、そして37℃にて一晩インキュベートした。次いでプレートを4℃にて4時間冷却し、次いで以下に記載されるようにプラークリフト(plaquelift)を調製するために使用した。
米国特許出願第08/485,107号(その明細書は、本明細書中において参考として援用される)において記載される以前の研究において、本発明者らは、種々の植物において存在するACCシンターゼについて共通な塩基配列(本明細書中においてコンセンサス配列といわれる)を同定した。これらの研究に基づいて、本発明者らは、コンセンサス配列に対応するコーヒー第一鎖のcDNAの領域のPCR増幅のための、一連の3つ(3)の完全に変性したプライマーを開発した。使用されるプライマーの配列は以下である:
ACS167: 5'-GCCAAGCTTCCRTGRTARTCYTGRAA-3' (配列番号3)
ACS289: 5'-TTYCARGAYTAYCAYGGHYT-3' (配列番号4)
ACS885: 5'-CCHGGDARNCCYAWRTCTTT-3' (配列番号5)。
第一鎖のcDNAを得るための逆転写酵素反応を、20μLの最終容量中で、GeneAmpRNA PCR Core Kit (Perkin Elmer,Foster City, CA)を用いて実施した。最初、3μLの水中0.9μgのコーヒー果実のmRNAを、微量遠心分離管中1μLの50μMランダム六量体および6μLの滅菌水と混合し、そして65℃にて5分間インキュベートした。混合物を室温にて2分間放置し、そして液体を短時間の遠心分離によってチューブの底部に回収した。この混合物に、2μLのPCR緩衝液II(上記で言及したキットから)、4μLの25mMMgCl2、2μLの10mMdNTP、1μLのRNAsin(20u/μL)、および1μLの逆転写酵素(50u/μL)を添加した。反応物を42℃にて1時間インキュベートし、その後、逆転写酵素を95℃の水浴中で5分間、熱不活化した。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) (Saikiら, 1988)を、上記のGeneAmpKitを用いて、10μLの第一鎖のcDNA混合物、4μLのPCR緩衝液II、1μLの25mMMgCl2、2.5μLの20μMAC5167プライマー(配列番号3)、2.5μLの20μM AC5885プライマー(配列番号5)、29.5μLの滅菌H2O、および0.5μLのTagDNAポリメラーゼ(5u/μL)を含む50μLの反応物において実施した。PCR条件は、94℃(1分間)、44℃(1分間)、および72℃(2分間)の35サイクルであった。PCR反応の生成物を、1.5%SeaPlaqueアガロース(FMCBioProducts,Rockland, ME)およびサイズマーカーとしてHae III消化φX174 DNA (Promega Corporation,Madison, WI)を用いて、アガロースゲル電気泳動によって分析した。約650bpの単一のPCR生成物を得た。
上記で得られた650bpのフラグメントをゲルから切り取り、そして1.5mLの微量遠心管中に置いた。200μLの滅菌水の添加後、650bpのフラグメントを90℃まで5分間加熱し、室温まで冷却し、そして微量遠心分離機中で5分間、14,000rpmにて遠心分離した。増幅したDNAを含む上清を取り出し、そして新しい1.5mLの微量遠心管中に置いた。25μLのPCR反応を、鋳型として先に増幅した0.4μLのDNA、2.5μLの10×PCR緩衝液(10mMのTris-HCl(pH9.0)、0.1%のtriton X-100)、2μLの25mM MgCl2、5μLの1mM dNTP、1μLの20μMACS289プライマー(配列番号5)、1μLの20μMACS885プライマー(表2)、12.8μLのH2O、および0.3μLのTagDNAポリメラーゼ(5u/μL)(PromegaCorporation, Madison, WI)を用いて実施した。PCRを、94℃(1分間)、45℃(1分間)、および72℃(2分間)の35サイクルを用いて実施した。5μLのこの反応物を、上記のように1.5%アガロースゲル中で電気泳動した。約603bpの単一の生成物が観察された。8μLの滅菌水、10μLの3M酢酸ナトリウム(pH5.2)、および220μLの100%エタノールを、反応物の残りに添加した。-20℃にて一晩のインキュベーション後、4℃にて30分間、14,000rpmの遠心分離によってDNAを回収した。DNAを、400μLの氷冷75%エタノールで洗浄し、そして25μLの滅菌水中に再懸濁した。エチジウムブロマイドプレートアッセイを用いて、DNA濃度を10ng/μLであると決定した。
ランダムプライマー化プローブを、PCR生成ACCシンターゼDNAおよびPrime-a-GeneKit (Promega Corporation,Madison, WI)を用いて生成した。2および1.5μLの25ng DNAを27.5μLの滅菌水に添加し、そしてDNAを5分間煮沸することによって変性した。10μLの5×標識化緩衝液、2μLの非標識化dNTP[それぞれ20μM;dCTP,dGTP, dTTP]、2μLの1mg/mL アセチル化BSA、1μLの5u/μL E.coli
DNAポリメラーゼIKlenowフラグメント、および5μL(50μCi)の3,000Ci/mmole[α-32P]dATP(Dupont-NEN)を添加し、50μLの最終容量を与えた。室温にて1時間後、2μLの0.5M Na2EDTAの添加および2分間の煮沸によって反応を停止する。
それぞれ50,000の組換えクローンを含む4つの150×15mm NZYプレートのプラークリフトを調製した。4つの132mmMagnaナイロン転写メンブレン(MicronSeparations, Incorporated, Westborough, MA)を、それらを5×SSC緩衝液で飽和したクロマトグラフィー用紙上に約10秒間置くことによって湿らせた。メンブレンを、組換えプラークを含むプレート上に5分間置き、除去し、そしてファージ含有側を上向きにして、0.5MのNaOHおよび1.5MのNaClで飽和したクロマトグラフィー用紙上で2分間インキュベートした。次いで、メンブレンを、0.5Mのtris-HCl(pH8.0)および1.5MのNaClで飽和したクロマトグラフィー用紙上に5分間移すことによって中和した。0.2Mのtris-hcl (pH 7.5)を含む2×SCCで飽和したクロマトグラフィーシート上での短期の20秒の処置後、フィルターをブロット乾燥した。1時間の風乾の後、UVStratalinker1800 (Stratagene, La Jolla, CA)中で12,000μジュールの260nm UV光での処置によって、DNAをメンブレンに架橋した。
推定のコーヒーのACCシンターゼcDNAクローンのサイズを、クローニングベクター中に存在し、そしてcDNA挿入部位に隣接するT3およびT7プロモーターの一部に相同なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって決定した。プライマーの配列は以下である:
T3: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (配列番号6)
T7: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' (配列番号7)。
コーヒー果実特異的ACCオキシダーゼの単離
a)ACCオキシダーゼ特異的オリゴヌクレオチドプライマーの合成
全RNAの単離、mRNAの単離、およびコーヒー果実特異的cDNAの合成は、上記の通りであった。
Madison, WI)のPileupプログラムを用いて整列した。転写開始コドンからの約1000bpの領域は、保存的であることが見出され、そしてこの領域に対応する5'-TCATIGCKKCRAKIGGTTC-3'(配列番号8)を合成した。イノシン(I)を、配列保存性を示さない位置に置いた。なぜなら、この位置は、A,T,G, またはCの任意であり得るからである。2倍の多義性を示す位置を、混合した残基(T/GまたはA/G)で調製した。本発明者らはまた、本発明者らの研究室において以前にクローン化したパパイヤ果実発現ACCオキシダーゼcDNAの領域に対して相同な第2のプライマーを調製し、そして以下の転写開始コドンから約372bpに置いた:
5'-GACACTGTGGAGAGGCTGAC-3' (配列番号9)。
実施例1において記載される増幅したコーヒー果実cDNAを使用して、上記のような4つの150×10mmNZYプレートを調製した。クローンのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および回収は、PCRによって得たACCオキシダーゼ配列をプローブとして使用することを除いて、上記の通りであった。
コーヒーのACCオキシダーゼcDNAクローンのサイズを、実施例1において記載されるようなT3およびT7プロモーターに対して相同なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって決定した。
アンチセンスACCシンターゼおよびACCオキシダーゼ転写物の発現のためのベクターの構築
ACCシンターゼおよびACCオキシダーゼcDNAは、例えばアンチセンス発現または同時抑制によってコーヒー中のエチレン含量を改変するために使用され得る。ベクターpKR1を用いるその使用の一例を記載する。これは単なる一つの例に過ぎず、そして多くの他の植物形質転換ベクターが、ACCシンターゼおよびACCオキシダーゼcDNAとの組合せで使用され得る。pKR1を、以下のようにpBI121(ClontechLaboratories)の改変によって作製した。
loxA: 5'-AGCTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3'
loxB: 5'-AGCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3'、および
loxC: 5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGCT-3'。
センスおよびアンチセンス方向にACCシンターゼ(pKRCACS-SおよびpKRCACS-A)およびACCオキシダーゼ(pKRCACO-SおよびpKRCACO-A)cDNA遺伝子を含む、pKR1プラスミドでの、Agrobacteriaのエレクトロポレーション
Agrobacterium株LBA 4404を、単一のコロニーからOD600まで、100mLのYM液体培地(0.4g/LのYeast抽出物、10g/Lのマンニトール、0.1g/LのNaCl、0.2g/LのMgSO4・7H2O、0.5g/LのK2HPO4、pH7.5)中で、回転振盪機中29℃にて48時間増殖させた。4000×gでの遠心分離によって、6×1011細胞/mLまで濃縮した。エレクトロポレーションを「ElectroCellManipulator 600」(ECM 600, BTX Inc., CA)を用いて実施した。200ngのDNAを含むpKRCACS-A、pKRCACO-A、pKRCACS-S、またはpKRCACO-Sのいずれかのプラスミド溶液の3.5μLアリコートを、濃縮した50μLのAgrobacteria細胞と混合し、予め冷却した2mmギャップキュベット(BTXInc.,CA)に移し、そして2.35kVにての5msパルスを適用した。50μg/mLのカナマイシンを含む1mLのYM液体培地を、エレクトロポレートした細胞に添加し、そしてそれらを250RPMにての29℃振盪機中で1時間回収した。細胞を、4000×gにて遠心分離し、そして100μLの新しいYM液体培地中に再懸濁した。形質転換した細菌を、50μg/mLのカナマイシンを補充したYM寒天プレート(15g/LのBacto寒天を含むYM液体培地)上で選択した。
pKRCACS-S、pKRCACO-S、pKRCACS-A、およびpKRCACO-Aプラスミドを含むAgrobacteriaを用いたコーヒーの葉組織の感染
傾斜屈性の苗条からの成熟した若いコーヒーの葉を、30%のClorox中で30分間滅菌し、そして滅菌した蒸留水中で3回リンスした。主脈と縁との間の薄層から約7mm2の切片を、切り出し、そして109細胞/mLのAgrobacteriumスラリーとともにMS液体培地(MurashigeおよびSkoog,1962)中に置き、そして3時間同時培養した。葉組織を、滅菌した紙タオルで乾燥ブロッティングし、そして2.0g/LのPhytagelの添加によって凝固させたMS培地上で3日間、残りのAgrobacteriumとともに同時培養した。
pKRCACS-S、pKRCACO-S、pKRCACS-A、またはpKRCACO-Aプラスミドを含むコーヒーの葉のカルス組織の継代培養
抗菌耐性カルスを、300μg/mLのカルベニシリンおよび150〜200μg/mLのカナマイシンを含む胚誘導培地MII(基本の塩、半強度MS塩、10mgのチアミンHCl、40mgのシステインHCl、100mgのミヨ-イノシトール、40gのスクロース、2mgのBA、1mgのピリドキシン、1mgのニコチン酸、2.0gのフィタゲル、pH5.65;YasudaおよびFujii、1985)を用いて3ヶ月間、1ヶ月ごとに継代培養した。次いで、これらのカルスを、100μg/mLのカナマイシンを含むMII培地中で30日間、50μg/mLのカナマイシンを含むMII培地中でさらに30日間継代培養した。体細胞胚は、この最後の培地中で形成した。体細胞胚は、蛍光下で、増殖レギュレーターを欠いた発芽培地MIII(基本の塩、完全強度のMS塩、10mgのチアミンHCl、40mgのシステインHCl、100mgのミオ-イノシトール、40gのスクロース、2gのフィタゲル、pH5.65;SondahlおよびSharp,1977)上で小植物へと発達した。
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- 実施例に記載の核酸。
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