JP2001525680A - 遺伝子のサイレンシング - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物体中の標的遺伝子の阻害を増強するための構築物および方法は、遺伝子のサイレンシングベクター中への、ベクター中のポリヌクレオチド領域の全てまたは一部の逆反復配列の挿入に関する。逆反復配列は、合成のポリヌクレオチド配列であり得るか、または改変された天然のポリヌクレオチド配列を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子のサイレンシング 本発明は、遺伝子発現の制御に関し、より詳細には、一般的に「遺伝子のサイ レンシング」と呼ばれる、発現の阻害に関する。 遺伝子発現の調節のための２つの重要な方法が公知である。これらは、当該分 野で、「アンチセンスダウンレギュレーション」および「センスダウンレギュレ ーション」（「共抑制(cosuppression)」とも呼ばれる）と呼ばれる。これらの 両方の方法によって、標的遺伝子の発現の阻害を導く。 アンチセンスダウンレギュレーションにおいては、内因性の標的遺伝子の全て または一部に相補的なDNAが、逆方向でゲノムに挿入される。機構は完全には明 らかになっていないが、１つの理論は、このようなアンチセンス遺伝子の転写物 が、内因性の遺伝子から転写されるmRNA産物に対して配列において相補的なmRNA を生じるということである：次いで、このアンチセンスmRNAは天然に産生される 「センス」mRNAと結合して、天然のmRNAからタンパク質への翻訳を阻害する二重 鎖を形成する。挿入されるアンチセンス遺伝子が、内因性の遺伝子配列に対して 長さが等しいことは必要ではない：フラグメントで十分である。フラグメントの 大きさは、特に重要ではないようである。42ヌクレオチドまたはその程度のヌク レオチドのフラグメントが有効であると報告されている。一般に、50ヌクレオチ ドの領域のどこかが阻害効果を得るために十分であると認識されている。しかし 、より短いヌクレオチドが非常に十分に作用し得る：全長に等しい長さまでのよ り大きいヌクレオチド数が、確かに作用しなければならない。50ヌクレオチド下 流のどこかの便利な制限酵素切断部位が存在するフラグメント長を使用すること が、通常簡単である。遺伝子のフラグメントのみが必要とされるという事実は、 遺伝子の全てが配列決定される必要はないことを意味する。一般的に、cDNAが十 分であることもまた意味し、完全なゲノム配列を単離することは不要である。 アンチセンスフラグメントは、標的遺伝子の内因性相補鎖と正確に同じである 必要はない。単に、標的遺伝子の阻害を達成するために十分に配列類似性である 必要がある。このことは、アンチセンス技術の重要な特徴である。なぜなら、こ れによって、別の種で有効である１つの植物種に由来する配列の使用が可能であ り、そして目的の各個々の種についてアンチセンスベクターを構築する必要がな くなるからである。１つの種から単離された配列は、別の種において有効であり 得るが、１つの種と別の種との間の配列類似性の程度が効果を得るために不十分 である場合を除いて、検出することは稀ではない。このような場合においては、 種特異的ホモログを単離することが必要であり得る。 アンチセンスダウンレギュレーション技術は、当該分野で十分に確立されてい る。これは、いくつかのテキストおよび多くの定期刊行物の主題である。重要な 特許参考文献は、Calgene Inc.の名のもとの欧州特許第240,208号である。アン チセンス技術の実施可能性を疑う理由は存在しない。これは十分に確立されてお り、世界中の研究室で日常的に使用されており、そしてこれが使用される産物が 市場にある。 過剰発現およびダウンレギュレーションの両方が、「センス」技術によって達 成される。標的遺伝子の完全長のコピーがゲノムに挿入される場合、表現型の範 囲が得られ、いくつかは標的遺伝子を過剰発現し、いくつかは過小発現する。つ いで、この方法によって産生された植物の集団はスクリーニングされ、そして個 々の表現系が単離され得る。アンチセンスとの類似性は、挿入された配列が完全 長のコピーである必要はないことである。共抑制についての重要な特許参考文献 は、DNA Plant Technologies Inc．の名のもとの欧州特許第465,572号である。 センス／共抑制技術の実施可能性を疑う理由は存在しない。これは十分に確立さ れており、世界中の研究室で日常的に使用されており、そしてそれが使用される 産物は市場にある。 センスおよびアンチセンス遺伝子調節は、Biotechnologi and Genetic Engine ering Reviews 9：207-227（1991）にBirdおよびRayによって概説されている。 トマトにおいて選択された遺伝子を制御するためのこれらの技術の使用は、Gray ら、Plant Molecular Biology，19：69-87（1992）によって記載されている。 従って、遺伝子のサイレンシングは、全部もしくは一部、または短縮型の配列 のいずれかを含み、そしてセンスまたはアンチセンス方向であり得る標的遺伝子 のコード配列の余分なコピーを標的生物体のゲノムに挿入することによって達成 され得る。さらに、ゲノム遺伝子配列から入手可能なイントロン配列は、抑制ベ クターの構築において使用され得る。配列同一性のみがプロモーター領域内に存 在する場合、トランスジーンおよび内因性遺伝子の両方の、生物体中で達成され る遺伝子のサイレンシングの報告もまた、存在する。 記載される任意の方法による遺伝子の制御は、適切なプロモーターおよびポリ アデニル化シグナルを含む終結配列の制御下での、形質転換による標的植物種の ゲノムへのセンスまたはアンチセンス配列の挿入、続く、完全な植物への形質転 換体の再生を必要とする。形質転換方法がほとんどの植物種について存在するか 、または入手可能な方法の適用によって得ることができると言われることがおそ らく順当である。 最も広範に使用されている方法は、Agrobacterium媒介形質転換であり、主に 、双子葉植物種に対してである。これが最も公知であり、最も広範に研究されて おり、従って全ての形質転換方法の中で最良に理解される。根粒菌Agrobacteriu m tumefaciensまたは関連するAgrobacterium rhizogenesは、天然における疾患 の症状であるクラウンゴールまたは網状根肺瘍の形成（これは、植物中のバクテ リアによる感染である）を生じる特定のプラスミドを含む。病原体におけるAgro bacteriumによって使用される機構の一部は、ライトボーダーおよびレフトボー ダー領域に結合されたプラスミドDNA切片が、感染した植物のゲノム中に安定に 移入されることである。従って、外来DNAが、そこに通常存在する遺伝子の代わ りに、いわゆる「移入」領域（Ｔ領域）に挿入される場合、その外来遺伝子は、 植物ゲノムに移入される。定期刊行物、テキスト、および特許に多くの参考文献 が存在し、そして方法論は十分に確立されている。 単子葉植物細胞の核にDNAを直接挿入するための種々の方法は、公知である。 弾道法において、高密度材料（通常、金またはタングステン）のマイクロ粒子 が、高速で、それらが細胞へ進入する標的細胞に発射され、その結果、DNAが入 り得る細胞壁に開口部をあける。DNAは、マイクロ粒子上にコーティングされ得 るか、または培養培地に添加され得る。 マイクロインジェクションにおいて、DNAは、超微細孔針を通じて個々の細胞 に注射によって挿入される。 単子葉植物および双子葉植物の両方に適用可能である、別の方法は、液体中に 標的細胞の懸濁物を生成する工程、微視的な針様材料（例えば、シリコンカーバ イド、またはシリコン窒化物「ウィスカー（whisker）」）を加える工程、およ び細胞とウィスカーがコロイド状になり、そして液体中に存在するDNAが細胞に 進入するように攪拌する工程を包含する。 次いで、まとめると、センスおよびアンチセンス技術の両方を使用する遺伝子 のサイレンシングのための要件は公知であり、そして必要とされる配列が移入さ れ得る方法は公知である。 本発明は、とりわけ、遺伝子の発現の制御を増強する方法の提供を目的とする 。 本発明に従って、生物体中の選択された標的遺伝子の阻害を増強するためのベ クターが提供される。これは、上記の遺伝子のサイレンシングベクターがベクタ ー中のポリヌクレオチド領域の全てまたは一部の逆反復を含む点で特徴付けられ る、遺伝子のサイレンシングベクターを含む。 逆反復配列は、合成のポリヌクレオチド配列であり得、そしてその逆反復配列 または上記の遺伝子のサイレンシングベクターの全てまたは一部の逆反復、また は遺伝子のサイレンシングベクターの5'-非翻訳領域の逆反復であり得る。 逆反復は、ヌクレオチドの配列によってポリヌクレオチド領域とは分離され得 る。 本発明はまた、標的生物体中でDNA配列の発現を制御する方法を提供する。こ の方法は、上記の生物体のゲノム中に、上記で規定されるような増強された遺伝 子のサイレンシングベクターを挿入する工程を包含する。 好ましい実施態様において、配列中にプロモーター領域、5'-非翻訳領域、転 写可能なDNA配列、およびポリアデニル化シグナルを含む3'-非翻訳領域を含む、 増強された遺伝子のサイレンシングのためのベクターは、上記の構築物が、上記 のベクターの領域の逆反復を含むという点で特徴付けられる。 逆反復は、上記のベクターの5'-非翻訳領域のフラグメントであることが好ま しい。ベクターは、逆反復の２つのタンデムなコピーを有し得る。 簡単に言いかえると、本発明者らは、遺伝子のサイレンシングベクターの阻害 効果がベクターの配列の一部の逆反復をベクター中に生成することによって増強 され得ることを見出した。あるいは、逆反復は、ベクター自体の独立して作製さ れ得る合成配列であり得、次いで、ベクター配列中に挿入され得る。増強が達成 される機構は十分には理解されていないが、本発明者らは、このようなベクター について必要とされる最低限は、サイレンシングのために標的とされる遺伝子を 同定する領域（単数または複数）、およびその領域の一部の逆反復、または上記 に説明されるような、挿入配列およびその逆反復であると理解している。サイレ ンシングのために標的される遺伝子を同定するベクターの領域は、それを特徴付 けるその内因性の遺伝子の任意の一部（例えば、そのプロモーター、その5'-非 翻訳領域、そのコード配列、またはその3'-非翻訳領域）であり得る。本発明者 らはまた、本発明で使用されるベクターが標的遺伝子の発現をサイレンシングし 、そして標的遺伝子が属する遺伝子のファミリーの任意のメンバーをもまたサイ レンシングすることを見出した。 本発明が作動する機構は完全には理解されていないが、本発明者らは、特定の 逆反復の作製が、選択された配列とその逆配列との間の二重鎖DNAの形成を促進 すると考えている。 逆反復は、ベクター中の任意の位置（例えば、プロモーター領域、5'-非翻訳 領域、コード配列、または3'-非翻訳領域中に配置され得る。逆反復がプロモー ター領域内の連続する配列に基づく場合、プロモーター領域中に逆反復が配置さ れることが好ましい。逆反復が5'-非翻訳領域中の連続する配列に基づく場合、 逆反復が5'-非翻訳領域中に配置されることが好ましい。逆反復がコード領域内 の連続する配列に基づく場合、逆反復がコード領域内に配置されることが好まし い。逆反復が3'-非翻訳領域内の連続する配列に基づく場合、逆反復が3'-非翻訳 領域内に配置されることが好ましい。 選択されるポリヌクレオチド配列およびその逆反復は、5'-非翻訳領域と逆反 復がDNA二重鎖を形成した場合に、対にならないままであるポリヌクレオチド配 列によって分けられても良く、そうでなくても良い。しかし、選択される連続す る配列およびその逆反復は、5'-非翻訳領域と逆反復がDNA二重鎖を形成した場合 に、対にならないままであるポリヌクレオチド配列によって分けられる。 逆反復は、5'-非翻訳配列に基づくことがさらに好ましい。逆反復がコード配 列の上流に配置されることがまた好ましい。逆反復が5'-非翻訳領域とコード配 列との間に配置されることが、さらに好ましい。5'-非翻訳領域と逆反復が、5'- 非翻訳領域と逆反復がDNA二重鎖を形成した場合に、対にならないままであるポ リヌクレオチド配列によって分けられることがさらに好ましい。 抑制はまた、標的遺伝子のプロモーター領域内に二重鎖DNAを形成し得る逆反 復配列を含むベクターを作製することによって達成され得る。これによって、抑 制されるべき遺伝子についての任意の特異的なコード配列情報を含む必要性を不 要にする。なぜなら、ベクターは、生物体中のプロモーターの抑制を可能にし、 これによって標的遺伝子の発現の抑制を可能にするからである。あるいは、プロ モーター配列を欠いているが、5'-非翻訳領域、コード領域、または3'-非翻訳領 域内の配列の逆反復を含むベクターが作製され得る。 遺伝子抑制ベクターの5'または3'-非翻訳領域はまた、ポリヌクレオチド部分 と逆反復とがDNA二重鎖を形成する場合に対にならないままであるポリヌクレオ チド配列によって分けられる、ポリヌクレオチド部分および逆反復を含む、合成 の5'または3'-非翻訳領域で置きかえられ得る。合成の5'-非翻訳領域を構築する ことが好ましい。12塩基のポリヌクレオチドで分けられる33塩基のポリヌクレオ チド部分と33塩基のポリヌクレオチド逆反復とを結果として含む、合成の5'-非 翻訳領域を構築することが、さらに好ましい。 5'-非翻訳領域、コード配列、または3'-非翻訳領域内の逆反復配列を使用する ことが所望される場合、これらの任意の領域内に逆反復を有して構築された遺伝 子のサイレンシングベクターが、サイレンシングベクター中に存在するコード配 列に相同である遺伝子のサイレンシングがさらに可能であり得る。従って、生物 体中の遺伝子相同物をサイレンシングすることが所望される場合、5'-非翻訳領 域、コード配列、または3'-非翻訳領域内に逆反復を含むサイレンシングベクタ ーの構築によって、構築物内のコード配列に対して配列相同性を示す全ての遺伝 子のサイレンシングが可能であり得る。相同性／相同なは、通常、それらの配列 が、いくらか共通する先祖の構造であり、そして高い程度の活性な領域の配列類 似性を示すことを示す。相同遺伝子の例として、ACO1およびACO2を含む、ACC-オ キシダーゼ酵素遺伝子ファミリーが挙げられる。 本発明の任意の配列は、標準的な分子生物学的技術を使用して産生され、そし て操作され得る。配列は、所望の生物体供給源（例えば、植物供給源）から入手 され得、そして必要とされる場合は改変されるか、または標準的なオリゴ合成技 術を使用して最初から合成される。 それが作用し得る任意の特定の理論に束縛されることを望むことなく、以下が 本発明の考察である。その5'-非翻訳領域の２つのさらなる上流の逆コピーを含 むACC-オキシダーゼセンス遺伝子で形質転換したトマト植物の96％が、野生型植 物と比較して実質的に低下したACC-オキシダーゼ活性を示した。逆反復を有さな い類似の構築物で形質転換した植物のわずかに15％が、低下したACC-オキシダー ゼ活性を有した。両方の集団は、植物あたりのトランスジーンの類似の平均数を 有した。シクロヘキシジンでのトマトの葉の処理によって、ACC-オキシダーゼ転 写物の量における、顕著な再現可能な増大を生じ、そして以前の研究で使用した 創傷の誘導に優先して、ACC-オキシダーゼセンストランスジーンによる抑制の研 究において使用した。抑制されたおよび抑制されていない植物における、プロセ シングされていないおよびプロセシングされたACC-オキシダーゼ転写物の相対的 な量を、リボヌクレアーゼ保護アッセイによってアッセイし、これによって単離 された核をアッセイする際にには依存しない、転写物およびmRNAの蓄積の間接的 な測定を提供する。この分析は、ACO1遺伝子の発現の抑制が、主に転写後であっ たことを示した。同じ型のRPAアッセイを使用して、類似の結果を、抑制ポリガ ラクトナーゼセンスまたはACO-アンチセンストランスジーンを含む植物から得た 。 植物における相同配列の不活性化の多数の例が現在存在する。用語「相同性依 存性遺伝子のサイレンシング」(HDGS)は、これらの全てを最良に記載するが、ほ とんどの実施例において、「サイレンシング」が完全ではなく、そして遺伝子発 現の低いレベルはそのままであることに注目すべきである。本明細書を通じて、 本発明者らは、MatzkeおよびMatzke、Plant Physiol．107：679-685（1995）（ ここでは、HDGSの別の例が３つの主要な群；シス-不活化、トランス不活化、お よびセンス-抑制に分けられた）によって最も最近概説された分類を使用する。 アンチセンス遺伝子によるダウンレギュレーションは、これらの最後に多くの類 似性を有し、そして同じ機構によって操作されると示唆される（Griersonら、Tr ends Biotechnol．9：122-123（1991））。センスおよびアンチセンスの両方の トランスジーンが、植物中の相同な内因性遺伝子の発現を低下させるために広範 に使用されている。HDGSの基礎となる機構ははっきりしないままであるが、この 技術は、基礎研究だけではなく、商業的なバイオテクノロジーベンチャー企業に おいて多数の適用が見出されており、そして新規の食品製品がすでに市場に出て いる。 現在、多数の顕著に抑制されたトランスジェニック株を得ることは、判断力よ りも運のものである。反復トランスジーン配列の存在とHDGSの出現率との間のポ ジティブな関係が、注目されている。しかし、HDGSに関連する単一の遺伝子座− トランスジーン挿入もまた、報告されている。 HDGSの異なる例が、標的遺伝子の転写物に影響を与えるかどうかに基づいて分 類され得るという、明らかな同意が存在する。転写抑制の例もまた、記載されて いる。相互作用する遺伝子残基の相同性が転写される配列内に残る場合、HDGSは 転写後効果であることが示されている。この明らかに正確な区分にもかかわらず いくつかの類似性が、２つの異なるカテゴリー中のいくつかのサンプル間に存在 する。これらは、サイレンシングの変化に富むパターン、サイレンシングに関与 する遺伝子の増大したメチル化、およびサイレンシング遺伝子座が反復配列を含 むという頻繁な観察を含む。 転写のサイレンシングは、核内で最も頻繁に生じるが、転写後サイレンシング は、核または細胞質のいずれかまたは両方で生じ得る。プロセシングされた、サ イレンシングされた遺伝子の核RNAの量は影響されないことの証拠が存在し、そ してこれは、細胞質内への輸送または細胞質内での分解の際の影響を示唆する。 転写後HDGSが核の外側で生じるというより強力な証拠は、核のトランスジーンに 関連する遺伝子のサイレンシングと、細胞質性の複製性RNAウイルスに対する耐 性との間の関係である。他のトランスジーン（例えば、GUS）または内因性遺伝 子（例えば、PG）の活性を抑制するトランスジーンを含むトランスジェニック植 物はまた、これらの遺伝子に由来する配列を含むように操作されているRNAウイ ルスに対しても耐性である。それにもかかわらず、核の特性（たとえば、トラン スジーンのメチル化）およびトランスジーン遺伝子座の複雑度が、ウイルス耐性 とのポジティブな相関関係が見出されている。ほとんど全てのHDGSの例において 、サイレンシングの供給源は核（発現が細胞質である場合でも）である。しかし 、細胞質エレメントによる各遺伝子のサイレンシングは、その遺伝子に由来する 配列を含む組換えウイルスによって感染した植物中のフィトエンデサチュラーゼ の抑制によって実証されている。 HDGSによる植物遺伝子の転写後抑制の多数の例が現在存在するが、なお、プレ -mRNAの増大した代謝が、他の細胞性RNAの代謝プロセスに関連するか、またはそ れと区別されるかどうかという情報は存在しない。植物中のRNAの分解は、ほと んど理解されていないが、翻訳が関係するという証拠が存在する。例えば、少量 のオーキシン取りこみRNA（small auxin up RNA、SAURS）の非常に短い半減期（ およそ10分）が、シクロヘキシミドでの処理によって顕著に延長され得る。 本発明は、HDGSの頻度において著しい増大を生じ、続いて、トランスジーン内 の短い反復領域の包含を生じる。トマトにおける末端のエチレン生合成酵素ACC- オキシダーゼをコードする標的遺伝子の発現は、このような構築物によって主に 転写後に抑制された。これは、トマトにおいてセンスおよびアンチセンス抑制の 他の例について真であったことが示された。シクロヘキシミドは、ACO遺伝子の 発現の強力な可能性のあり、そして確実なインデューサーであるが、サイレンシ ングを改良しないことを見出した。 本発明は、説明の方法によって、以下の実施例において、そして以下の図面を 参照してここで記載されている： 図１．（Ａ）ACO1遺伝子のサイレンシングベクター。 （Ｂ）5'-非翻訳領域のタンデムな逆反復を含む、ACO1遺伝子のサイレ ンシングベクター。 図２．Ｃ＝構築物Ｃ（図１Ａ）を含むトランスジェニック植物およびＶ＝構築 物Ｖを含むトランスジェニック植物（図１Ｂ）である場合の、野生型値と比較し た両方の型のトランスジェニック植物における相対的なACC-オキシダーゼ活性を 示す。 図３．pHIR-ACO（配列番号10に示される）を含むトランスジェニック形質転 換体のトマト植物ACCオキシダーゼ活性。グラフは、Cl2ACO（過剰発現制御）非 形質転換野生型、およびTOM13強力なアンチセンス遺伝子でサイレンシングした コントロールをまた含む。 実施例1.0 構築物Ｖ（図１）を、以下の様式で作製した：トマトACO1 cDNAの79塩基対の5 '-非翻訳領域をPCRによって増幅し、そして２つのコピーを、逆方向でタンデム に、その3'-非翻訳領域内にそれ自体のポリアデニル化シグナルを含む（構築物 Ｃ）ACO1 cDNAのすぐ上流に連結した。両方を、CaMV 35Sプロモーターの下流に 連結し、次いで、バイナリーベクターBin19に移した。図１は、構築物「Ｃ」お よび「Ｖ」の基本的な詳細を示す。これらは、Agrobacterium媒介性DNA転位によ ってトマト植物(Ailsa Craig)を形質転換するために使用した。13個および28個 の個々のカナマイシン耐性カルスを、構築物「Ｃ」および「Ｖ」を用いてそれぞ れ得、そしてこれらを植物中で再生させた。 ACO1遺伝子のプロモーターおよび5'-非翻訳領域のヌクレオチド配列を、本明 細書中で配列番号１に示す。79bpは、塩基番号1874で開始し、そして翻訳開始コ ドン（ATG）のすぐ前の塩基である番号1952で停止するに当てはまる。 実施例1.1 ACO遺伝子の発現に対する任意の効果について集団をスクリーニングするため に、相対的なACO活性を、形質転換していない植物および形質転換植物から測定 した。エチレン前駆体である、1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸を補充し たリーフディスクからのエチレンの産生を、各植物から少なくとも３回測定した 。コルクボーラーでのディスクのカットによって葉を傷つけ、そしてACO1遺伝子 の発現を刺激した。野生型値と比較した両方の型のトランスジェニック植物中の ACC-オキシダーゼ活性を、図２に示す。２つの集団の間には、ACO活性において 劇的な差異が存在し、逆反復を含む植物（Ｖ株）は非常に強力な抑制を示す。Ｃ 株の植物の大部分（13個のうちの11個）は、予想されたようにACO活性の抑制を 示さなかったが、野生型植物と比較して過剰発現を示した。なぜならこの構築物 は 翻訳可能なACO1コード配列を含むからである。 トランスジェニックACO配列の存在を試験するために、植物に由来するDNAを、 ACO1コード配列の開始および終結のそれぞれに相同であり、そして相補的な２つ のオリゴを使用してPCRによって分析した。この組み合わせによって、内因性のA CO1遺伝子の1500bp（これは、内部ポジティブコントロールとして作用する）お よび1000bpのフラグメントとしてACO1センストランスジーンを同時増幅する（な ぜなら、これはcDNAに由来し、従ってイントロン有さないからである）。増幅し た領域は、Ｖ型トランスジーンの反復領域を含まない。２つのフラグメントをゲ ル電気泳動によって分離し、そしてエチジウムブロマイドでの染色によって検出 した。これによって、Ｃ株の全ての植物、および１つ（Ｖ２）（これはまた、低 下したACC-オキシダーゼ活性を有さない）を除くＶ株の全ての植物におけるトラ ンスジーンの存在を示した（図２）。 実施例1.2 トランスジーン中の反復領域がゲノムへ組み込まれたトランスジーンの数に影 響を与え得ること、およびこのことが高頻度のサイレンシングの実際の供給源で あることの可能性を考えた。上記に記載したPCRアッセイは、以下の仮説が立て られる場合に、トランスジーンのコピー数を概算するために使用され得る： １）任意のトランスジェニック植物において、ゲノムあたりの内因性ACO1遺伝子 の数に変化がないこと； ２）増幅効率比（内因性のACO1 DNA：トランスジェニックACO1 DNA）が一定であ ること； ３）反応物を、生成物の再アニーリングを最小にするために低いDNA濃度でサン プリングすること。本発明者らは、互いの２つの株におけるトランスジーンの 数の見積もりのみに関心をもち、そしてトランスジーンのコピー数には関心が ないので、本発明者らは、標準として「トランスジーン」および「内因性遺伝 子」DNAの合成の組み合わせを使用しない。 20サイクルの増幅、ゲル電気泳動、サザンブロッティング、および放射性標識 したACO1 cDNAでのハイブリダイゼーション後、内因性およびトランスジェニッ クACO1 DNAに由来するシグナルを可視化し、そしてホスホロイメージングによっ て定量した。Ｃ株についての平均のトランスジーン：内因性遺伝子比は、0.96で あり、Ｖ株については1.08であった。これは、Ｖ構築物中の反復領域が形質転換 の間により多いT-DNAの組み込みを生じなかったことを示す。 実施例1.3 シクロヘキシミドでの葉の損傷および／または処理後の量において増大したが 、蓄積しないACO1 mRNAは、刺激をして本発明者らが以前に使用した物理的損傷 後よりも、シクロヘキシミドでの処理後に約５倍を超えた。シクロヘキシミド処 理した葉の損傷は、ACO1 mRNA量におけるさらなる増大を誘発することには失敗 した。本発明者らは、シクロヘキシミドが、物理損傷よりもACO1 mRNA蓄積のよ り再現性のあるインデューサーであることを見出し、その結果、本研究において 物理的損傷よりもシクロヘキシミドを優先して使用した。ACO1 mRNAの量におけ るさらなる増大は、シクロヘキシミドの濃度を50から250μg/mlまで増大させた 場合でも観察されなかった（データは示さない）。 実施例1.4 植物から抽出したACO1 mRNAの5'末端は不均質であるが、２塩基によって異な る２つの主要な種から構成される。２つの構築物（ＣおよびＶ）の両方における 5'-非翻訳領域（両方とも、センスおよび二重鎖のアンチセンス配列）は、内因 性の遺伝子のものよりも約10塩基対短かった。これによって、内因性遺伝子と、 トランスジーン由来転写物との識別が、5'-非翻訳領域の3'末端の開始からACO1 のプロモーター中の222塩基上流のAcc1部位まで伸びるゲノムACO1配列から転写 されたプローブを使用するリボヌクレアーゼ保護アッセイによって可能である。 野生型の葉に由来するRNAにおいて、異なるRNA種から生じ得るか、または消化の 間にRNA二重鎖の破壊によって生じ得るいくつかのバンドが存在する。バンドの いくつかは、他よりもアンチセンス抑制の効果に対してより敏感であるようであ る（一般的な傾向はなお抑制であるが）。 株Ｖ４、Ｖ11、およびＶ28（全て＜10％のACO活性）に由来する葉において、 内因性転写物（野生型と比較して）およびトランスジーン転写物（コントロール トランスジーンに由来するものと比較して（Ｃ１株））の多大な同時抑制が存在 した。Ｖ４、Ｖ11、およびＶ28は全て、ホモ接合性ACO-アンチセンス株よりも大 きい抑制を示した(Hamiltonら、Nature 346，284-287（1990））。 ACO1 RNAの蓄積の刺激剤としてのタンパク質合成インヒビターシクロヘキシミ ドの使用は、株Ｖ４、Ｖ11、またはＶ28においてセンストランスジーンによるこ のRNAの抑制を明らかには緩和しなかった。 内因性の遺伝子の転写物は確かに抑制されるが、Ｖトランスジーン転写物中の 5'末端中の逆反復がプローブを排除し、そしてトランスジェニックRNAに由来す るシグナルを生じる可能性が存在する。このことは、以下の理由のためでないよ うであると考えられる。逆反復によって排除されなかったプローブが、Ｖ株に由 来するRNAを分析するために使用される場合、mRNAシグナル（このプローブを使 用すると、これは、実際に内因性のRNAとトランスジェニックRNAとの和である） は、野生型よりもなおはるかに少なかった。データは、サイレンシングの非存在 下における、内因性およびトランスジェニックRNAの量の比較を示す。 実施例1.5 本発明者らは、プロセシングされたmRNAの量を測定すると同時に、転写物の間 接的な測定として全RNA抽出物中のプロセシングされていない転写物の量を測定 することを選択した。これを、リボヌクレアーゼ保護アッセイにおいてゲノム配 列介在イントロンから転写されるRNAプローブを使用して達成した。分析したRNA は液体窒素中で凍結した葉に由来するものであり、次いで強力なタンパク質変性 条件（フェノールおよび界面活性剤）下で抽出したので、プロセシングの間に転 写物のいくらかを修復する機会はほとんどなかったはずである。シクロヘキシミ ドでの処理後に非常に豊富なmRNAが存在したが、ACO-AS植物中のmRNAの全量は、 減少した。ACO-センス株Ｖ11において、mRNAシグナルにおいてはほとんど増大し ないか、または全く増大しなかった。このmRNAシグナルは主に、シクロヘキシミ ド誘導性ではない35Sプロモーターによって転写されるトランスジーンに由来す るようである。対照的に、ずべてのRNAサンプルにおける一次転写物の量は、シ クロヘキシミド処理後に増大した。このRNA種は、内因性のACO1遺伝子にのみ由 来する。なぜなら、トランスジーンは、イントロンを有さないからである。全て の場合において、抑制されているトランスジーンは、一次転写物の量に置いてほ とんど影響を有さないか、または全く影響を有さなかった。 実施例1.6 シクロヘキシミドは、ACO1一次転写物および成熟mRNAの両方の蓄積を顕著に刺 激した。シクロヘキシミドでの処理前および処理後の野生型の葉における、一次 転写物および成熟ACO1 RNAに由来するシグナルの定量は、プロセシングされてい ないACO1 RNAの量において６倍の増大が存在したが、プロセシングされたACO1 R NAの量においては13倍の増大が存在したことを示した。Ｃ株中のトランスジェニ ックACO1 RNA（35Sプロモーターから転写された）はまた、シクロヘキシミドで の処理の際にも失われた。 実施例1.7 ２つのタンデムに連結された5'UTRのコピー（各ユニット＝79bp；74.7％（A+T ））を、CaMV 35Sプロモーターとほとんど全長のACO1 cDNAとの間に逆方向で連 結した（litigate）。この直接的な反復のいずれかのユニットが、5'-非翻訳領 域とすぐ下流で大きな十字型構造を形成する能力を有する。この構築物でのAgro bacterium媒介性形質転換後、組織培地から回収した28個の植物のうちの26個が 、抑制されたACO活性を示した。はるかに低い頻度（2/15）の抑制を、二重鎖の5 'UTRを欠いているが、それ以外は同じコントロール構築物を用いて観察した。 さらなるトランスジェニック植物を、コントロール構築物よりもＶ構築物を用 いて得た（同様の高HDGS頻度を示す）。これはおそらく、ACO遺伝子抑制の結果 としての減少したエチレン合成の直接的な結果である。以前の結果は、顕著に改 良されたカルスの再生が、ACO-アンチセンス遺伝子に含まれる構築物での形質転 換後に達成され得ることを示した。 抑制を示さなかった反復構築物で形質転換した２つの植物のうち、１つ（Ｖ２ ）は、短縮型のT-DNAを有し得たか、または形質転換されていない回避されたも のであり得る。なぜなら、トランスジェニックACO1配列が増幅され得ないからで ある。反復は、遺伝子中にすでにDNA配列を含むので、おそらく、この配列自体 が、遺伝子のサイレンシングの際の影響を誘発するようである。おそらく、高頻 度のサイレンシングの供給源である反復DNAの構造が観察されるようである。Ｖ 構築物中の反復は、コントロール構築物のものと類似であった。 HDGSのほとんどの例は、単純に１つの挿入よりも反復または全部または一部の T-DNAを含む複雑なトランスジェニック遺伝子座に関連するが、これが、抑制の 主な決定因子であるかどうか、または間接的な影響であるかどうかは知られてい ない。明らかに単一のトランスジーンが遺伝子のサイレンシングに関連する場合 の実施例が存在するが、これらは、少数派であり、そしてこれらの実施例の少な くともいくつかにおいては、T-DNAは内部反復を含む。本明細書中で示されるデ ータは、トランスジーンにおける小さい反復の意図的な移入が、相同遺伝子がほ ぼ100％まで抑制されているトランスジェニック株の数を増大させ得ることを示 唆する。センス抑制は、コントロール構築物を用いて得られ得たが、はるかに低 い頻度であった。トランスジーンへの反復DNAの意図的な移入は、サイレンシン グを生じるために、反復T-DNAユニットの挿入の要件を置き換え得る。本実施例 で使用されるPCRアッセイは絶対的に定量的ではないが、これは、平均的なトラ ンスジーンの投与量が約２であることを示唆し、このことは、抑制を示す株のい くつかが単一の挿入を有することを暗に意味する。いくつかの本発明者らの株に おいて、得られた抑制は重要であり（図２）これは、このストラテジーを、遺伝 子発現を特異的にオフにすることにおける関心に対して、よりいっそう魅力的な 物にする。増大したHDGSに影響を与えるレポーター遺伝子を有する反復DNAの意 図的な組み合わせの以前の報告が１つ存在する：Lohuisら、Plant Journal，8,9 19-932（1995）は、GUSレポーター遺伝子の上流にランダムに単離した反復ゲノ ム配列（RPS）のコピーを挿入し、そしてこのエレメントがトランスジーン発現 のまだらの頻度を増大させたことを見出した。これは、シス-不活化の１つの例 であり、おそらく、転写レベルで作用し、そして編者は、これが同時抑制／セン ス-抑制表現型とは区別されると考えた。興味深いことに、RPSエレメントは、ト ランスジーンの完全なサイレンシングの頻度を増大させなかった。本発明者らの 実施例において、抑制のレベルは多くの株において激しいが、抑制の程度が標的 遺伝子を発現する全ての細胞において等しいかどうか、または反復が、抑制を経 験しているの細胞集団において単に増大したかどうかという可能性はない。 実施例1.8 構築物および形質転換 トマトのACO1 cDNA、pTOM13を、そのもとのクローニングベクターであるpAT15 3（Promega）から遊離させ、pG31を作製した。pG31をEcoRIで消化し、そしてベ クターを再連結してpTRDを作製した。これによって、pTOM13 cDNAの最初のクロ ーニングの間に人為的に移入され得る、その5'末端にアンチセンス方向での3'- 非翻訳領域の約90塩基対を含むcDNAの5'末端を除去した。残っているACO1配列を 、EcoRIおよびHindIIIを用いてpTRDから切り出し、そしてEcoRIで消化し、そし てKlenow酵素で末端をファイルイン(filled in)したpT_7-T_{3 α}18（BRL）に連結し た。ACO1転写物の5'-非翻訳領域（マイナス5'末端の約10塩基）を、プライマー5 'CATTCATCTCTCAATCTTTTG 3'（配列番号２）および5'CTTAATTTCTTGGTAAAGTGTTTTC C 3'（配列番号３）を用いて、損傷したトマトの葉のオリゴdT-プライムしたcDN AからTaqポリメラーゼを用いて増幅した。このDNAを、T4DNAポリメラーゼで平滑 末端にし、そしてファイルインしたpTRFと連結してpMI1を作製した。これによっ て5'末端にEcoRI部位を再構築し、そして野生型ACO1 mRNAよりもわずかに短い翻 訳可能なACO1 cDNAを得た。増幅したACO1配列が変異していないことを、配列決 定によって確認した。pMI1をHindIIIで消化し、そしてEcoRIで部分的に消化し、 そしてACO1 cDNA配列を含むフラグメントを、Klenow酵素でファイルイン、そし てSmaI消化したpDH51と連結したpDHC1を作製した。これをXbalおよびHindIIIで 消化し、フィルインし、そしてベクター、35Sプロモーター、およびACO1 cDNAを 含有するフラグメントを再連結してpMI5を作製した。PMI7は、タンデムに連結さ れ、そしてpMI5中のACO1の5'UTRの上流にアンチセンス方向で挿入された、ACOI の5'UTRの２つのコピーを含む。これを、オリゴ5'CATTCATCTCTTCAATCTTTTG 3'（ 配 列番号２）および5' CTTAATTTCTTGGTAAAGTGTTTTCC 3'（配列番号３）を用いて、 トマトの葉のcDNA（上記を参照のこと）に由来する5'UTRを増幅することによっ て作製し、T4 DNA polで仕上げ、そしてACO1配列Acc651（Kpn1のイソ酵素である が、5'突出部を生じる）の5'UTRの上流の、pMI中のフィルインしたAcc651部位に 連結した。構築物を配列決定によって確認した。 pDHC1およびpMI7を、BamHI、BgIII、およびPvuII、で消化し、そしてCamV35S- AC01 cDNA配列を含むBamHI-PvuIIフラグメントを、HindIIIで切断し、フィルイ ンし、次いでBamHIで切断したBin19にクローニングした。得られた組換え体を、 それぞれpBC1およびpBM17と呼ぶ。これらのプラスミドをA．tumefaciens LBA440 4に形質転換し：そしてこれをトマトの子葉を形質転換するために使用した（Lyc opersicon esculentum var Alisa Craig）。植物を、50μg／mlのカナマイシン 上で増殖させたカルスから再生した。 実施例1.9 ACC-オキシダーゼアッセイ ACCオキシダーゼ活性を、外因性の1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸（AC C）をエチレンに転換する植物組織の能力として測定した。ディスクを葉の薄膜 からとがったコルクボーラーを使用して切除し、そして0.5mlの10mMのNaH₂PO₄／ Na₂HPO₄（pH7）および10mMのACC（Sigma）と接触させて5mlのガラスボトル中に 置き、次いでこれを「Subaseal」ワクチンキャップ（Fisons）でシールした。室 温で１時間後、上部の空間中のエチレンを、Smithら、1986に記載されているよ うにガスクロマトグラフィーによって測定した。エチレンをまた、溶液を含むが 、葉組織を含まないボトルから測定した。これらの値を、リーフディスクを含む ボトルから得た値から引き算した。 実施例1.10 トランスジェニック植物のPCR分析 DNAを、野生型植物である、ACO-アンチセンス遺伝子についてホモ接合性であ る植物の単一の葉から抽出し、そしてこれらをpBC1およびpMB17の構築物で形質 転換した。葉を液体窒素中で凍結させ、使い捨てピペットチップを用いてエッペ ンドルフチューブ中で簡単に挽いて粉にし、挽いたものをさらに200μlのDNA抽 出緩衝液（１％のラウリルサルコシン、0.8％のCTAB、0.8MのNaCl、0.02MのEDTA 、0.2MのTris/HCl（pH8））の添加後に、15分間65℃に加熱し、フェノール／ク ロロホルムで１回抽出し、そして0.6容量のイソプロパノールの添加によって水 層からDNAを沈殿させた。DNAを遠心分離によって回収し、ペレットを70％エタノ ールで洗浄し、乾燥させ、そして200μlのTE緩衝液中に再度溶解した。１μlの この溶液を、プライマーACO1.1（ATGGAGAACTTCCCAATTATTAACTTGGAAAAG、配列番 号４）およびACO1.2（CTAAGCACTTGCAATTGGATCACTTTCCAT、配列番号５）を使用し て、21サイクルの30秒間95℃、30秒間65℃、および１分間72℃の、内因性のACO1 遺伝子およびトランスジーンの同時PCR増幅のための鋳型として使用した。増幅 したDNAを、0.8％アガロース／１×TBEゲル中での電気泳動によって分離し、そ して0.4MのNaOH中で６時間の、HybondN+ヘブロットした。増幅されたACO配列を 検出するために、フィルター上のDNAを、ランダムプライムした標識したACO1 cD NAとハイブリダイズさせた。フィルターを、0.2×SSPE/１％のSDS中で65℃にて 洗浄し、続いて放射活性シグナルのホスホロイメージングを行った。 実施例1.11 シクロヘキシミドおよび機械損傷での葉の処理 混ぜ合わせた葉を、鋭いメスで切除し、そして直ちに50μl/mlのシクロヘキシ ミド（Sigma）の水溶液中に置いた。別の3cmの茎を溶液下で枝から切除し、次い で薄層気流中に６時間放置してシクロヘキシミドを葉に浸透させた。 葉組織を傷つけるために、個々の葉を硬い表面上におき、そして鋭いメスで約 10回横断し、そして５回縦に、さいの目に切った。 実施例1.12 シクロヘキシミドで処理した葉中のACO mRNAのノーザン分析 RNAを、以下のように、シクロヘキシミド処理した葉から抽出した。組織を液 体窒素中で凍結し、そしてコーヒーグラインダー（果皮について、以下を参照の こと）中または乳鉢（葉について）中のいずれかで粉にした（pulverise）。５m l／gfwtのRNA抽出緩衝液（Kirby）を添加し、そして凍結したスラリーを使い捨 てのポリエチレン遠心分離チューブ中でガラス棒でさらに粉状にした。一旦融解 させると、混合物をフェノール／クロロホルムで２回抽出し、2.5容量のエタノ ール、1/10容量の３M酢酸ナトリウム（pH5）の添加によって核酸を沈殿させ、そ して20℃で１時間の遠心分離を行った。3000×ｇで10分間（果実の抽出について は40分間）の遠心分離後、ペレットを直ちに水（組織１グラムあたり約1ml）お よび等量の2×DNA抽出緩衝液（1.4MのNaCl、２％のCTAB、100mMのTris/HCl（pH8 ））中に再度溶解させた。２容量の沈殿緩衝液（１％のCTAB、50mMのTris/HCl（ pH8））を添加して核酸を沈殿させ（室温にて30分間で十分である）、そして沈 殿物を遠心分離（3000×g／15分間）によって回収した。この工程を、ペレット を１×DNA抽出緩衝液中に溶解した事を除いて繰り返した。第２回目の沈殿の回 収後、ペレットを、0.5mlの1MのNaClに再溶解し、そして直ちに2.5容量のエタノ ール（-20℃／30分間）で再度沈殿させた。遠心分離（1000×g／10分間）後、ペ レットを400μlの水中に再溶解し、そしてフェノール／クロロホルムで２回抽出 した。核酸を沈殿させ、400μlの水に上記で再溶解したように回収した。46μl の10×One-Phor-All-Buffer（Pharmacia）を、50ユニットのRNAase非含有DNAase （Promega）とともに添加し、そして溶液を30分間37℃にてインキュベートした 。これらを、フェノール／クロロホルムで２回抽出し、RNAを沈殿させ、そして 上記のように回収し、最後に100〜500μlの水に再度溶解させた。本発明者らは 、この比較的詳細な精製が、稀な転写物がRPAによって検出される場合に必要で あることを見出した。また、RNAは容易に再溶解し、これによって、放射活性プ ローブRNAと混合したこのRNAを操作する場合に、大幅に作業時間を短縮する。 50μgの葉のRNAを、等量の変性／ロード溶液（50％のホルムアミド；25mMのリ ン酸ナトリウム（pH6.5）；10mMのEDTA；6.2％のホルムアルデヒド；200μg/ml のエチジウムブロマイド）と混合し、そして25mMのリン酸ナトリウム（pH6.5） ／3.7％のホルムアルデヒド／1.5％のアガロースゲル上で、10mMの燐酸ナトリウ ム（pH6.5）／3.7％のホルムアルデヒド中で連続的な緩衝液再循環を用いて電気 泳動によって分離した。分離したRNAを、10mMのリン酸ナトリウム（pH6.5）中で Genescreen（Dupont）ハイブリダイゼーションメンブレン上にブロットした。St ratalinker（Stratagene）上での自動架橋設定を、フィルターへのRNAの共有的 結合のために使用した。フィルターをプレハイブリダイズし、次いで32Pでラン ダムプライムした標識したACO1 cDNAプローブでハイブリダイズさせた。フィル ターを0.2×SSPE／１％のSDS中で65℃にて洗浄し、そして-70℃で24時間、２枚 の増感スクリーンの間でKodak X-omatフィルムに曝した。続いて、各バンド中の 放射活性を、ホスホロイメージングによって測定した。 実施例1.13 リボヌクレアーゼ保護分析 RNAを、上記のシクロヘキシミド処理した葉および果実から抽出した。 RNAプローブを、UTPの単独の供給源としてα-³²P UTP（400Ci.mmol^-1）を用い て、20℃でT7 RNAポリメラーゼを用いて転写させた。１時間のインキュベーショ ン後、RNAase非含有DNAaseを、鋳型を除去するために使用し、そしてプローブを 、６％のポリアクリルアミド／8Mの尿素／１×TBEゲル上でさらに精製した。全 長のプローブを含有するバンドを、オートラジオグラフィーによって可視化した 。このRNAを含有するゲルのスライスを切り出し、そして1mlのプローブ溶出緩衝 液（0.5Mの酢酸アンモニウム；１mMのEDTA；0.2％のSDS）中、６〜14時間37℃に て置いた。代表的には、20mと100μlの間のこの溶液を、試験されるべき20〜100 μgの間のRNAおよび２つの酵母RNAコントロールを用いて同時に沈殿させた。沈 殿させたRNAを30μlのハイブリダイゼーション溶液（80％ホルムアミド；40mMの PIPES/NaOH；0.4Mの酢酸ナトリウム；1mMのEDTA、pHは6.4であるべきである）中 に再度溶解させ、65℃にて10分間加熱し、そして42℃にて２から14時間の間ハイ ブリダイズさせた。より長いハイブリダイゼーション時間は、純粋に便宜のため である。なぜなら、本発明者らは、わずかに２時間のハイブリダイゼーション後 、稀な転写物でさえ容易に検出するからである。RNAaseONE（Promega）またはRN Aase T1（Ambion）のいずれかを含有する300μlのRNAase消化緩衝液（５mMのEDT A；200mMの酢酸ナトリウム；10mMのTris/HCl、溶液の最終pHは7.5であるべきで ある）を、全くリボヌクレアーゼを含まないRNAase消化緩衝液を受容させた酵 母RNAを含有する１つを除いて、各チューブに添加した。RNAのインキュベーショ ンを、25℃（RNAaseONE）または37℃（RNAaseT1）のいずれかにて２〜４時間行 った。RNAaseONEを、0.5％までのSDSの添加によって不活化し、そして保護され た二重鎖RNAを、エタノールおよび酢酸ナトリウムを用いて沈殿させた。RNAaseT 1を不活化し、そして二重鎖RNAを、AmbionによるRNAase保護キットと共に提供さ れる不活化／沈殿容液の添加によって沈殿させた。保護されたRNAを、5〜10μl の変性／ロード溶液（80％のホルムアミド；10mMのEDTA；0.1％のブロモフェノ ールブルー；0.1％のキシレンシアノール；0.1％のSDS）中に溶解し、95℃で５ 分間加熱し、次いで、６〜８％のポリアクリルアミド／８Mの尿素／１×TBEゲル （分離されるフラグメントの大きさに依存するポリアクリルアミドの濃度）上で の電気泳動によって分離した。電気泳動後、ゲルを乾燥させ、そして-70℃にて 示された時間、２枚の増感スクリーンの間でKodak x-omatフィルムに曝した。放 射活性を、ホスホロイメージングによって測定した。 実施例2.0 合成異種DNA逆反復の構築 合成の異種DNA逆反復（配列番号11）を、２つのセットの合成オリゴ（HIRl、 配列番号12およびHIR2、配列番号13、およびHIR3、配列番号14、およびHIR4、配 列番号15）をアニーリングさせること、および各セットをpSK-（bluescript、St ratagene）に別々に連結することによって構築し、pHIRAおよびpHIRBをそれぞれ 作製した。逆反復構造を、両方のpHIRA/Bベクターを、XhoIおよびNcoIで消化し 、そしてpHIRAにpHIRBに由来する42bpのフラグメントを連結することによって作 製した。逆反復構造を、KpnIを使用してpSK-ベクターから単離し、そして植物発 現カセットpSIN中のCaMV35Sプロモーターのすぐ下流のKpnI部位にクローニング してpHIR-SINを作製した。 トマトのACOI cDNA（pTOM13）コード配列を、２つのオリゴヌクレオチドプラ イマー5'CTTTACCAAGAAGTGCACATGGAGAACTTCCC 3'（配列番号６）および5'GAATTGG GCCCTAAGCACTTGCAATTGG 3'（配列番号７）（これは、TOM13コード配列のいずれ かの側をプライムし、ApaLIおよびApaI部位をそれぞれ移入する）を使用して、 その元のクローニングベクターpAT153（promega）から増幅した。PCR産物を、Ap aLIおよびApaIで消化し、そしてPfuポリメラーゼ（Stratagene）を使用して末端 を平滑にした。平滑のPCRフラグメントを、pHIR-SINの逆反復構造の下流のSmaI 部位に連結して、pSIN-HIR-ACOを作製した。 pHIR-ACOに由来する植物発現カセットを、AgeIを使用して単離し、そしてバイ ナリ-ベクターpVB6のAgeI部位に連結してpHIR-ACO（配列番号10）を作製した。 挿入物を、制限分析を使用して方向付けして、植物中で活性であるORFの全てが 一方向性であることを確実にした。pHIR-ACOを、A．tumefaciens LBA4404に形質 転換し：そしてこれを、トマトの子葉（Lycopersicum esculentum var Ailsa Cr aig）を形質転換するために使用した。植物を、カルスから再生させた。 実施例2.1 トランスジェニック植物の同定 DNAを、単一の葉から抽出し、そして以前に記載したように抽出した。HIR-ACO T-DNA挿入物を含む植物を、内部TOM13センスプライマー（5'GCTGGACTCAAGTTTCAA GCCAAAG 3'、配列番号８）およびNOS 3'UTR（-非翻訳領域）特異的アンチセンス プライマー（5'CCATCTCATAAATAACGTCATGC 3'、配列番号９）を使用して、PCRに よって同定した。 実施例2.2 ACC-オキシダーゼアッセイ ACC-オキシダーゼ活性を、外因性の1-アミノシクロプロパン−1-カルボン酸（ ACC）をエチレンに転換する植物組織の能力として測定した。小さい葉をシュー トから取り、そしてメスで傷つけ、その後、２mlの密閉可能なバイアル中に置き 、そして30分間放置した。次いで、バイアルをシールし、そして室温で１時間放 置し、その後、上部の空間中のエチレンを、Smithら、1986に記載されているよ うにガスクロマトグラフィーによって測定した。エチレンをまた、野生型、過剰 発現（C-12）およびアンチセンスダウンレギュレートした植物材料からも測定し た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ローウェ，アレクサンドラ ルイーズ イギリス国 エルイー12 ５アールディー ラフボロー，サットン ボニントン キ ャンパス（番地なし），ユニバーシティ オブ ノッティンガム内 (72)発明者 ハミルトン，アンドリュー ジョン イギリス国 エルイー12 ５アールディー ラフボロー，サットン ボニントン キ ャンパス（番地なし），ユニバーシティ オブ ノッティンガム内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物体中の選択された標的遺伝子の阻害を増強するためのベクターであって 、遺伝子のサイレンシングベクターが、該ベクター中のポリヌクレオチド領 域の全てまたは一部の逆反復を含むこと点で特徴付けられる該遺伝子のサイ レンシングベクターを含む、ベクター。 ２．前記逆反復配列が、合成のポリヌクレオチド配列およびその逆反復配列であ る、請求項１に記載のベクター。 ３．前記逆反復配列が、前記遺伝子のサイレンシングベクターの全てまたは一部 の逆反復である、請求項１に記載のベクター。 ４．前記逆反復配列が、前記遺伝子のサイレンシングベクターの5'-非翻訳領域 の逆反復である、請求項３に記載のベクター。 ５．前記逆反復が、ヌクレオチドの配列によってポリヌクレオチド領域と分離さ れる、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。 ６．標的生物体中のDNA配列の発現を制御する方法であって、該生物体のゲノム に、請求項１から４のいずれか１項に記載の増強された遺伝子のサイレンシ ングベクターを挿入する工程を包含する、方法。 ７．増強された遺伝子のサイレンシングのためのベクターであって、プロモータ ー領域、5'-非翻訳領域、転写可能なDNA配列、およびポリアデニル化シグナ ルを含む3'-非翻訳領域を配列中に含み、該構築物が該構築物の領域の逆反 復を含む点で特徴付けられる、ベクター。 ８．前記逆反復が、前記構築物の5'-非翻訳領域のフラグメントである、請求項 ７に記載のベクター。 ９．前記逆反復が、スペーサーとして作用するヌクレオチド配列によって選択さ れたフラグメントと分離される、請求項７または請求項８に記載のベクター 。 １０．前記構築物が、前記逆反復の二重のコピーを含む、請求項７または８また は９に記載のベクター。 １１．前記ベクターが、前記逆反復の２つのタンデムなコピーを含む、請求項７ から１０のいずれか１項に記載のベクター。 １２．遺伝子の発現の阻害のためのDNA構築物であって、プロモーター領域、5'- 非翻訳領域、転写可能なDNA配列、およびポリアデニル化シグナルを含む3'- 非翻訳領域を配列中に含み、該5'-非翻訳領域が、該5'-非翻訳領域のタンデ ムな逆反復の対を連続して有する点で特徴付けられる、DNA構築物。