ES2451669T3

ES2451669T3 - Plantas que tienen características mejoradas y un procedimiento de fabricación de las mismas

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Publication number: ES2451669T3
Application number: ES07788181.1T
Authority: ES
Inventors: Valerie Frankard; Vladimir Mironov; Christophe Reuzeau; Ana Isabel Sanz Molinero
Original assignee: CropDesign NV
Current assignee: CropDesign NV
Priority date: 2006-08-02
Filing date: 2007-08-02
Publication date: 2014-03-28
Anticipated expiration: 2027-08-02
Also published as: ES2558133T3; EP2543733A1; CN104099368A; EP2546262A1

Abstract

Procedimiento para aumentar el rendimiento de semillas de plantas con respecto a plantas de tipo silvestrecorrespondientes, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico AZ o una variante delmismo, en el que dicho ácido nucleico AZ codifica un polipéptido AZ o un homólogo del mismo, en el que elhomólogo proporciona plantas que tienen un rendimiento aumentado y en el que dicho polipéptido AZ o el homólogodel mismo comprende dos repeticiones de anquirina y dos dominios C3H1 de dedo de Cinc, y en el que dichasrepeticiones de anquirina se localizan cadena arriba de los dominios C3H1 de dedo de Cinc.

Description

Plantas que tienen características mejoradas y un procedimiento de fabricación de las mismas

La presente invención se refiere, en general, al campo de la biología molecular y se refiere a un procedimiento para mejorar diversas características de las plantas modulando en una planta la expresión de un ácido nucleico que codifica una PRC (Proteína Relacionada con el Crecimiento). La presente invención también se refiere a plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de PRC cuyas plantas tienen características mejoradas con respecto a las plantas de tipo silvestre correspondientes u otras plantas de control. La invención también proporciona construcciones útiles en los procedimientos de la invención.

La constante cada vez mayor población mundial y la disminución de suministro de tierra cultivable disponible para la agricultura incentivan la investigación hacia el aumento de la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para mejoras de cultivo y hortícolas utilizan técnicas de siembra selectivas para identificar plantas que tienen características deseables. Sin embargo, dichas técnicas de siembra selectivas tienen diversos inconvenientes, concretamente que estas técnicas son típicamente laboriosas y producen plantas que a menudo contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre pueden producir el rasgo deseable que se transmite desde la planta progenitora. Los avances en biología molecular han permitido a la humanidad modificar el plasma germinal de animales y plantas. La ingeniería genética de las plantas implica el aislamiento y manipulación del material genético (típicamente en forma de ADN o ARN) y la introducción posterior de ese material genético en una planta. Dicha tecnología tiene la capacidad de producir cultivos o plantas que tienen diversos rasgos económicos, agronómicos u hortícolas mejorados.

Un rasgo de interés económico particular es el aumento del rendimiento. El rendimiento se define normalmente como el producto medible de valor económico de un cultivo. Esto puede definirse en términos de cantidad y/o calidad. El rendimiento depende directamente de diversos factores, por ejemplo, número y tamaño de los órganos, arquitectura de la planta (por ejemplo, del número de ramas), rendimiento de semillas, senescencia de las hojas y más factores. El desarrollo de raíces, la absorción de nutrientes, la tolerancia al estrés, y el vigor temprano también pueden ser factores importantes en la determinación del rendimiento. Por lo tanto, optimizar los factores mencionados anteriormente puede contribuir a aumentar el rendimiento del cultivo.

El rendimiento de las semillas es un rasgo particularmente importante, ya que las semillas de muchas plantas son importantes para la nutrición humana y animal. Cultivos tales como maíz, arroz, trigo, canola y soja representan más de la mitad de la ingesta calórica humana total, bien a través del consumo directo de las propias semillas o a través del consumo de productos cárnicos generados sobre semillas procesadas. También son una fuente de azúcares, aceites y muchos tipos de metabolitos utilizados en los procesos industriales. Las semillas contienen un embrión (la fuente de nuevos brotes y raíces) y un endospermo (la fuente de nutrientes para el crecimiento del embrión durante la germinación y durante el crecimiento temprano de las plántulas). El desarrollo de una semilla implica muchos genes y requiere la transferencia de los metabolitos desde las raíces, hojas y tallos al interior de la semilla en crecimiento. El endospermo, en particular, asimila los precursores metabólicos de los carbohidratos, aceites y proteínas y los sintetiza en macromoléculas de almacenamiento para llenar el grano.

Otro rasgo importante para muchos cultivos es el vigor temprano. Mejorar el vigor temprano es un objetivo importante de programas de siembra de arroz modernos en variedades de cultivo de arroz tanto de clima templado como tropical. Las raíces largas son importantes para el anclaje adecuado al suelo en arroz sembrado en agua. Cuando el arroz se siembra directamente en campos inundados, y cuando las plantas deben emerger rápidamente a través del agua, se asocian brotes con mayor vigor. Cuando se practica siembra con perforación, para la buena emergencia de las plántulas, son importantes mesocótilos y coleóptilos más grandes. La capacidad de modificar genéticamente el vigor temprano en plantas sería de gran importancia en la agricultura. Por ejemplo, el pobre vigor temprano ha sido una limitación para la introducción de híbridos de maíz (Zea mays L.) basados en plasma germinal del Cinturón de Maíz en el Atlántico Europeo.

Un rasgo importante adicional es el de tolerancia mejorada al estrés abiótico. El estrés abiótico es la causa principal de pérdidas de cultivo en todo el mundo, reduciendo las producciones promedio para la mayoría de las plantas de cultivo principales en más de un 50 % (Wang y col., Planta (2003) 218: 1-14). El estrés abiótico puede producirse por sequía, salinidad, temperaturas extremas, toxicidad química y estrés oxidativo. La capacidad de mejorar la tolerancia de la planta al estrés abiótico sería de gran ventaja económica para los granjeros de todo el mundo y permitiría la cosecha de cultivos durante condiciones adversas y en territorios cuando la cosecha de cultivos no pueda ser posible de otra forma.

Por lo tanto el rendimiento del cultivo puede aumentarse al optimizar uno de los factores mencionados anteriormente.

Dependiendo del uso final, la modificación de determinados rasgos de rendimiento puede estar favorecida sobre otros. Por ejemplo, para aplicaciones tales como forraje o producción de madera, o fuente de biocombustible, puede ser deseable un aumento en las partes vegetativas de una planta, y para aplicaciones tales como producción de harina, almidón o aceite, el aumento en los parámetros de semilla puede ser particularmente deseable. Incluso entre los parámetros de semilla, algunos pueden estar favorecidos sobre otros, dependiendo de la aplicación. Diversos mecanismos pueden contribuir a aumentar el rendimiento de semillas, ya sea que esté en la forma de tamaño de semilla aumentado o número de semilla aumentado.

Una estrategia para aumentar el rendimiento (rendimiento de semillas y/o biomasa) en plantas puede ser a través de 5 la modificación de los mecanismos de crecimiento intrínsecos de una planta, tal como el ciclo celular o diversas rutas de señalización implicados en el crecimiento de la planta o en los mecanismos de defensa.

Ahora se ha descubierto que en las plantas pueden mejorarse diversas características modulando, en una planta, la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido PRC (Proteína Relacionada con el Crecimiento) en una planta. El polipéptido PRC, como se describe en el presente documento, es un polipéptido de Anquirina con dedo de

10 Cinc (AZ). Las características mejoradas comprenden rasgos relacionados con el rendimiento, tales como rendimiento aumentado y/o crecimiento aumentado, o contenido de compuestos de almacenamiento modificados.

Antecedentes

Polipéptido de Anquirina con dedo de Cinc

La biomasa vegetal se produce para cultivos de forraje como alfalfa, ensilaje de maíz y heno. En los cultivos de

15 grano se han utilizado muchos indicadores para el rendimiento. El principal entre ellos son las estimaciones del tamaño de la planta. El tamaño de la planta puede medirse de diversas maneras dependiendo de la especie y de la fase de desarrollo, aunque incluye el peso seco total de la planta, el peso seco sobre la superficie, el peso fresco sobre la superficie, el área foliar, el volumen del tallo, la altura de la planta, el diámetro de roseta, la longitud foliar, la longitud radicular, la masa radicular, el número de retoños y número de hojas. Muchas especies mantienen una

20 proporción conservativa entre el tamaño de las diferentes partes de la planta en una fase de desarrollo determinada. Estas relaciones alométricas se usan para extrapolar desde una de estas medidas de tamaño a otras (por ejemplo, Tittonell y col. 2005 Agric Ecosys & Environ 105: 213). El tamaño de la planta en una fase de desarrollo temprana se correlacionará típicamente con el tamaño de la planta más tarde en el desarrollo. Una planta más grande con mayor área foliar típicamente puede absorber más luz y dióxido de carbono que una planta más pequeña y por tanto

25 probablemente obtendrá mayor peso durante el mismo período (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50: 39). Esto es por lo que, además de la posible continuación de la ventaja microambiental o genética, la planta ha de alcanzar inicialmente el tamaño más grande. Existe un fuerte componente genético con respecto al tamaño de la planta y la tasa de crecimiento (por ejemplo, ter Steege et al 2005 Plant Physiology 139: 1078) y por eso para un intervalo de tamaño de planta de genotipos diversos en una condición ambiental se correlaciona posiblemente con el tamaño en

30 otra (Hittalmani y col. 2003 Theoretical Applied Genetics 107: 679). De este modo se usa un entorno estándar como un indicador para los entornos diversos y dinámicos encontrados en diferentes localizaciones y tiempos por los cultivos en el campo.

El índice de cosecha, la proporción de rendimiento de semilla con respecto al peso seco sobre la superficie, es relativamente estable en muchas condiciones ambientales y por tanto a menudo puede obtenerse una fuerte 35 correlación entre el tamaño de la planta y el rendimiento de grano (por ejemplo Rebetzke y col. 2002 Crop Science

42: 739). Estos procesos están intrínsecamente relacionados porque la mayoría de la biomasa en grano es dependiente de la productividad fotosintética normal o almacenada por las hojas y los tallos de la planta (Gardener y col. 1985 Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, págs. 68-73) Por lo tanto, la selección del tamaño de la planta, incluso en fases tempranas del desarrollo, se ha usado como un indicador para futuras posibles 40 producciones (por ejemplo Tittonell y col. 2005 Agric Ecosys & Environ 105: 213). Cuando se analiza el impacto de las diferencias genéticas sobre la tolerancia al estrés, la capacidad de normalizar las propiedades del suelo, temperatura, disponibilidad de agua y nutrientes e intensidad de luz es una ventaja intrínseca de los entornos de invernaderos o cámaras de cultivo de plantas en comparación con el campo. Sin embargo, limitaciones artificiales sobre producciones debidas a una mala polinización por ausencia de viento o de insectos, o espacio insuficiente

45 para la maduración de las raíces o crecimiento del dosel arbóreo, pueden restringir el uso de estos entornos controlados para analizar diferencias de rendimiento. Por lo tanto, las mediciones del tamaño de las plantas en el desarrollo temprano, en condiciones normalizadas en una cámara de cultivo o en un invernadero, son prácticas convencionales para proporcionar indicaciones de las posibles ventajas de rendimiento genético.

La transcripción se realiza mediante ARN polimerasas. Estas polimerasas están normalmente asociadas con otras

50 proteínas (factores de transcripción) que determinan la especificidad de los procesos de transcripción. Los factores de transcripción se unen a elementos reguladores en cis del gen y también pueden mediar en la unión de otras proteínas reguladoras. Stegmaier y col. propusieron una clasificación de factores de transcripción basándose en sus dominios de unión a ADN. Se diferenciaron 5 superclases, basándose en la presencia de: 1) dominios básicos, 2) dominios de coordinación de cinc, 3) dominios hélice-giro-hélice, 4) dominios con estructura beta con contactos en

55 surco menor y 0) otros dominios (Stegmaier y col., Genome informatics 15, 276-286, 2004). El grupo de factores de transcripción que comprenden dominios de coordinación de cinc es muy diverso y adicionalmente puede clasificarse de acuerdo con sus restos de cisteína e histidina conservados, incluyendo los dominios WRKY, grupos de cinc C6, dominios DM y GCM.

Además de motivos de unión a ADN, los factores de transcripción también pueden comprender motivos de interacción proteína-proteína. Un motivo de este tipo es el motivo de anquirina. Este está presente en muchas familias de proteínas diversas, normalmente como una repetición de 2 a más de 20 unidades. Cada unidad contiene dos hélices antiparalelas y una horquilla beta.

Aunque muchas proteínas vegetales con dominios de dedo de cinc están bien caracterizadas, se sabe poco sobre

5 proteínas vegetales que comprendan el motivo de dedo de cinc C3H1. PEI1, un factor de transcripción que según se informa desempeña una función en el desarrollo embrionario, tiene un motivo de dedo de cinc que se asemeja al motivo C3H1 pero carece de un motivo de anquirina (Li y Thomas, Plant Cell 10, 383-398, 1998). El documento WO 02/44389 describe AtSIZ, un factor de transcripción aislado de Arabidopsis. Se descubrió que la expresión de AtSIZ bajo el control del promotor CaMV35S promovía la transcripción de genes inducidos por estrés y, según se informa,

10 plantas con expresión de AtSIZ aumentada tenían una tasa de supervivencia más alta bajo estrés salino en comparación con las plantas de control, pero no se proporcionó ningún análisis con respecto al rendimiento de semillas. Se postuló que AtSIZ podía usarse en plantas para aumentar la resistencia al estrés osmótico.

Sumario

Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que la modulación de la expresión de un ácido nucleico que codifica 15 un polipéptido PRC proporciona plantas que tienen características mejoradas con respecto a plantas de control.

La presente memoria descriptiva describe que la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica el polipéptido AZ de Arabidopsis (AtAZ) o un homólogo del mismo proporciona plantas que tienen rendimiento aumentado con respecto a plantas de control.

La memoria descriptiva describe un procedimiento para aumentar el rendimiento de las plantas, que comprende

20 modular en una planta la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido AZ o un homólogo del mismo. Ventajosamente, la realización de los procedimientos de acuerdo con la presente invención produce plantas con rendimiento aumentado, particularmente rendimiento de semillas, con respecto a plantas de tipo silvestre correspondientes. La presente memoria descriptiva también describe secuencias de ácido nucleico y construcciones útiles en la realización de dichos procedimientos.

25 La presente invención proporciona la materia objeto como se expone en uno cualquiera y en todos los puntos (1)

(22) indicados a continuación:

1. Un procedimiento para aumentar el rendimiento de semillas de plantas con respecto a plantas de tipo silvestre correspondientes, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico AZ o una variante del mismo, en el que dicho ácido nucleico AZ codifica un polipéptido AZ o un homólogo del mismo, en el que el

30 homólogo proporciona plantas que tienen rendimiento aumentado, y en el que dicho polipéptido AZ o el homólogo del mismo comprende dos repeticiones de anquirina y dos dominios C3H1 de dedo de cinc, y en el que dichas repeticiones de anquirina se localizan aguas arriba de los dominios C3H1 de dedo de cinc.

2. Un procedimiento de acuerdo con el punto 1, en el que polipéptido AZ comprende al menos uno de los siguientes motivos:

35 (P/A)CSRAY(S/T)HDWTEC (motivo 1, SEC ID Nº: 3) HPGENARRRDPR (motivo 2, SEC ID Nº: 4) HG(V/I)FE(C/S)WLHP(A/S)QY(R/K)TRLCK (motivo 3, SEC ID Nº: 5) CFFAH (motivo 4, SEC ID Nº: 6).

3. El procedimiento de acuerdo con el punto 1 o 2, en el dicho ácido nucleico AZ codifica un polipéptido AZ de 40 SEC ID Nº: 2: o un homólogo del mismo.

4. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 3, en el que dicha variante es una parte de un ácido nucleico AZ o una secuencia capaz de hibridarse con un ácido nucleico AZ, cuya parte o secuencia de hibridación codifica un polipéptido AZ que comprende dos repeticiones de anquirina y dos dominios de dedo de cinc C3H1, y en el que dichas repeticiones de anquirina se localizan aguas arriba de los dominios de dedo de

45 cinc C3H1.

5.: El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 4, en el que dicho ácido nucleico AZ o variante del mismo se sobreexpresa en una planta.

6.: El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 5, en el que dicho ácido nucleico AZ o

variante del mismo es de origen vegetal, preferentemente de una planta dicotiledónea, más preferentemente de 50 la familia Brassicaceae, más preferentemente el ácido nucleico es de Arabidopsis thaliana.

7.: El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 6, en el que dicho ácido nucleico AZ o variante del mismo está unido operativamente a un promotor específico de semilla.

8.: El procedimiento de acuerdo con el punto 7, en el que dicho promotor específico de semilla es un promotor WSI18.

: 55 9. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 8, en el que dicha rendimiento de semilla aumentada comprende peso de mil granos aumentado.

10. Una construcción que comprende:

(i): un ácido nucleico AZ o una variante del mismo como se define en cualquiera de los puntos 1 a 4 y 6;

(ii): un promotor WSI18 específico de semilla o un promotor GOS2 constitutivo unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico de (i).

11. Una construcción de acuerdo con el punto 10, en el que dicho promotor WSI18 es como se representa en la SEC ID Nº 55 o SEC ID Nº 9.

: 5 12. Una construcción de acuerdo con el punto 10, en el que dicho promotor GOS2 es como se representa en la SEC ID Nº 56 o SEC ID Nº 54.

13.: Una planta transformada con una construcción de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 10 a 12.

14.: Un procedimiento para la producción de una planta transgénica que tiene rendimiento de semilla aumentado en comparación con plantas de tipo silvestre correspondientes, cuyo procedimiento comprende:

10 (i) introducir y expresar en una planta o en una célula de planta un ácido nucleico AZ o variante del mismo como se define en cualquiera de los puntos 1 a 4 y 6; y

(ii) cultivar la célula de planta en condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta,

15. Una planta transgénica de acuerdo con el punto 13, en la que dicha planta es una planta monocotiledónea tal

como caña de azúcar o en la que la planta es un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, avena 15 o sorgo.

16.: Partes cosechables de una planta de acuerdo uno cualquiera de los puntos 13 o 15, en las que dichas partes cosechables comprenden una construcción de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 10 a 12.

17.: Partes cosechables de una planta de acuerdo con el punto 16 en las que dichas partes cosechables son semillas.

20 18. Productos directamente derivados de una planta de acuerdo con el punto 13 o 15 y/o de partes cosechables de una planta de acuerdo con los puntos 16 o 17, en los que dichos productos comprenden una construcción de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 10 a 12.

19. El uso de un ácido nucleico AZ o variante del mismo como se define en cualquiera de los puntos 1 a 4 y 6, o

el uso de un polipéptido AZ o un homólogo del mismo, en el rendimiento de semillas aumentado, con respecto a 25 plantas de tipo silvestre correspondientes.

20.: El uso de acuerdo con el punto 19, en el que dicha rendimiento de semillas aumentada comprende el peso de mil granos aumentado.

21.: El uso de un ácido nucleico AZ o variante del mismo como se define en cualquiera de los puntos 1 a 4 y 6, o el uso de un polipéptido AZ o un homólogo del mismo, como un marcador molecular.

30 22. El uso de una construcción de acuerdo con cualquiera de los puntos 10 a 12 en un procedimiento para fabricar plantas que tengan rendimiento de semillas aumentado con respecto a plantas de control.

Definiciones

Polipéptido(s)/Proteína(s)

Los términos “polipéptido” y “proteína” se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a 35 aminoácidos en una forma polimérica de cualquier longitud, unidos entre sí por enlaces peptídicos.

Polinucleótido(s)/Ácido(s) nucleico(s)/Secuencia(s) de ácidos nucleicos/Secuencia(s) de nucleótidos

Los términos “polinucleótido (polinucleótidos)”, “secuencia (secuencias) de ácidos nucleicos”, “secuencia (secuencias) de nucleótidos”, “ácido (ácidos) nucleico (nucleicos)” y “molécula de ácido nucleico” se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a nucleótidos, ya sean ribonucleótidos o

40 desoxirribonucleótidos o una combinación de ambos, en una forma no ramificada polimérica de cualquier longitud.

Planta (plantas) de control

La elección de plantas de control adecuadas es una parte rutinaria de un montaje experimental y puede incluir plantas de tipo silvestre correspondientes o plantas correspondientes sin el gen de interés. La planta de control es típicamente de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad que la planta que se va a evaluar. La

45 planta de control también puede ser un nulicigoto de la planta que se va a evaluar. Los nulizigotos son individuos que perdieron el transgén por segregación. Una “planta de control” como se usa en el presente documento no solo se refiere a plantas completas, sino también a partes de planta, que incluye semillas y partes de semilla.

Homólogo/ (homólogos)

Los “homólogos” de una proteína incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen

50 sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tienen actividad biológica y funcional similar como la proteína no modificada de la cual derivan.

Una deleción se refiere a la eliminación de uno o más aminoácidos de una proteína.

Una inserción se refiere a uno o más restos de aminoácido que se introducen en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones de N y/o C terminal así como inserciones intra-secuencia de

un solo aminoácido o múltiples aminoácidos. De manera general, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones de N o C terminal, del orden de aproximadamente 1 a 10 restos. Ejemplos de las proteínas de fusión de N o C terminal o péptidos incluyen el dominio de unión o dominio de activación de un activador transcripcional como se utiliza en el sistema de doble híbrido de levadura, proteínas de cubierta de fago, etiqueta de (histidina)-6, etiqueta de glutatión S-transferasa, proteína A, proteína de unión a maltosa, dihidrofolato reductasa, epítope Tag!100, epítope c-myc, epítope FLAG∀, lacZ, CMP (péptido de unión a calmodulina), epítope HA, epítope de proteína C y epítope VSV.

Una sustitución se refiere a un reemplazo de aminoácidos de la proteína con otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tales como hidrofobicidad similar, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión para formar o romper estructuras #-helicoidales o estructura ∃-laminares). Las sustituciones de aminoácido son típicamente de restos únicos, pero pueden agruparse dependiendo de las limitaciones funcionales puestas al polipéptido; las inserciones serán normalmente del orden de aproximadamente 1 a 10 restos de aminoácido. Las sustituciones de aminoácido son preferentemente sustituciones de aminoácido conservativas. En la técnica se conocen bien las tablas de sustitución conservativas (véase, por ejemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman y Company (Eds) y Tabla 1 más adelante).

Tabla 1: Ejemplos de sustituciones de aminoácido conservativas

Resto: Sustituciones conservativas Restos Sustituciones conservativas

Ala: Ser Leu Ile; Val

Arg: Lys Lys Arg; Gln

Asn: Gln; His Met Leu; Ile

Asp: Glu Phe Met; Leu; Tyr

Gln: Asn Ser Thr; Gly

Cys: Ser Thr Ser; Val

Glu: Asp Trp Tyr

Gly: Pro Tyr Trp; Phe

His: Asn; Gln Val Ile; Leu

Ile: Leu, Val

Las sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácido pueden realizarse fácilmente utilizando técnicas sintéticas de péptidos bien conocidas en la técnica, tal como síntesis peptídica de fase sólida y similares, o por manipulación de ADN recombinante. Se conocen bien en la técnica los procedimientos para la manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o deleción de una proteína. Por ejemplo, técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en ADN son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis in vitro T7-Gen (USB, Cleveland, OH), mutagénesis dirigida a sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida a sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida a sitio.

Derivados

Los “derivados” incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que pueden, en comparación con la secuencia de aminoácidos de forma natural de la proteína, tal como la proteína de interés, comprender sustituciones de aminoácidos con restos de aminoácido de origen no natural o adiciones de restos de aminoácido de origen no natural. Los “derivados” de una proteína también incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que comprenden restos de aminoácido modificados de origen natural (glucosilado, acilado, prenilado, fosforilado, miristoilado, sulfatado, etc.) o modificados no origen no natural en comparación con la secuencia de aminoácidos de forma no natural del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes o adiciones no aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácidos de la que deriva, por ejemplo, una molécula indicadora u otro ligando, unido covalente o no covalentemente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula indicadora que se une para facilitar su detección, y restos de aminoácido que no son de origen natural con respecto a la secuencia de aminoácidos de una proteína de origen natural. Además, los “derivados” también incluyen fusiones de la forma de origen natural de la proteína con péptidos etiquetadores tal como FLAG, HIS6 o tiorredoxina (para una revisión de péptidos etiquetadores, véase Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003).

Ortólogo(s)/Parálogo(s)

Los ortólogos y parálogos incluyen conceptos evolutivos utilizados para describir las relaciones antecesoras de los genes. Los parálogos son genes dentro de la misma especie que se han originado a través de la duplicación de un gen antecesor; los ortólogos son genes de diferentes organismos que se han originado a través de especiación y también derivan de un gen antecesor común.

Dominio

El término “dominio” se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones específicas a lo largo de un alineamiento de secuencias de las proteínas evolutivamente relacionadas. Aunque los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre los homólogos, los aminoácidos que son altamente conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que son probablemente esenciales en la estructura, estabilidad o función de una proteína. Identificado por su alto grado de conservación en las secuencias alienadas de una familia de homólogos de proteína, éstas pueden utilizarse como identificadores para determinar si cualquier polipéptido en cuestión pertenece a una familia polipeptídica previamente identificada.

Motivo/Secuencia consenso/Firma

La expresión “motivo” o “secuencia consenso” o “firma” se refiere a una región conservada corta en la secuencia de las proteínas evolutivamente relacionadas. Los motivos son partes de dominios frecuentemente muy conservadas, pero también pueden incluir solo parte del dominio, o se ubican fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo caen fuera de un dominio definido).

Hibridación

El término “hibridación” como se define en el presente documento es un proceso en el que la secuencia de nucleótidos complementaria sustancialmente homóloga hibrida entre sí. El proceso de hibridación puede producirse completamente en la solución, es decir, ambos ácidos nucleicos complementarios están en la solución. El proceso de hibridación también puede producirse con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizado en una matriz tal como perlas magnéticas, perlas de Sefarosa o cualquier otra resina. El proceso de hibridación puede producirse adicionalmente cuando uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en un soporte sólido, tal como una membrana de nitrocelulosa o de nailon o se inmoviliza mediante, por ejemplo, fotolitografía a, por ejemplo, un soporte vítreo silíceo (el último conocido como matrices o micromatrices de ácido nucleico o como microplacas de ácido nucleico). Con el fin de permitir que ocurra la hibridación, las moléculas de ácido nucleico de manera general se desnaturalizan térmica o químicamente para fundir una doble cadena en dos cadenas únicas y/o para retirar horquillas u otras estructuras secundarias de ácidos nucleicos de cadena sencilla.

El término “rigurosidad” se refiere a las condiciones bajo las cuales se produce la hibridación. La rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones tales como temperatura, concentración de sal, fuerza iónica y composición del tampón de hibridación. Generalmente se seleccionan condiciones de baja rigurosidad por ser aproximadamente 30 ºC menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica definida y pH. Las condiciones de rigurosidad media son cuando la temperatura es 20 ºC por debajo de la Tm y las condiciones de rigurosidad alta son cuando la temperatura es 10 ºC por debajo de la Tm. Las condiciones hibridación de rigurosidad alta se usan típicamente para aislar las secuencias de hibridación que tienen alta similitud de secuencia con la secuencia de ácido nucleico diana. Sin embargo, los ácidos nucleicos pueden desviarse en cuanto a la secuencia y aún codificar un polipéptido sustancialmente idéntico, debido a la degeneración del código genético. Por lo tanto, algunas veces pueden necesitarse condiciones de hibridación de rigurosidad media para identificar dichas moléculas de ácidos nucleicos.

La Tm es la temperatura bajo fuerza iónica definida y pH, en la que el 50 % de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente emparejada. La Tm depende de las condiciones de solución y de la composición base y longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más altas. El índice máximo de hibridación se obtiene de aproximadamente 16 ºC hasta 32 ºC por debajo de la Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electrostática entre las dos cadenas de ácido nucleico que promueven por lo tanto la formación del híbrido; este efecto es visible para concentraciones de sodio de hasta 0,4 M (para concentraciones más elevadas, este efecto puede ignorarse). La formamida reduce la temperatura de fusión de dúplex ADN-ADN y ADN-ARN con 0,6 a 0,7 ºC para cada porcentaje de formamida y la adición de formamida al 50 % permite que se realice la hibridación de 30 a 45 ºC, aunque se disminuirá el índice de hibridación. Los emparejamientos erróneos de los pares de bases reducen el índice de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. En promedio y para sondas grandes, la Tm disminuye aproximadamente 1 ºC por % de emparejamiento erróneo de bases. La Tm puede calcularse utilizando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de híbridos:

1) Híbridos de ADN-ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):

Tm = 81,5 ºC + 16,6 x log10 [Na+]a + 0,41 x % [G/Cb] – 500 x [Lc]-1 – 0,61 x % formamida

7 5

2) Híbridos de ADN-ARN o ARN-ARN:

Tm = 79,8 ºC + 18,5 (log10 [Na+]a) + 0,58 x (% G/Cb) – 11,8 (% G/Cb)2 – 820/Lc

3) Híbridos de oligo-ADN u oligo ARNd

Para <20 nucleótidos: Tm = 2 (ln) Para 20-25 nucleótidos: Tm = 22 + 1,46 (ln)

ao para otro catión monovalente, pero solo exacto en el intervalo 0,01-0,4 M. b solo exacto para % GC en el intervalo de 30 % a 75 %. c L = longitud de dúplex en pares de bases. d oligo, oligonucleótido; ln = longitud eficaz del cebador = 2% (nº de G/C) + (nº de A/T).

La unión no específica puede controlarse usando uno cualquiera de un número de técnicas conocidas tal como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contienen la proteína, adiciones del ARN heterólogo, ADN y SDS heterólogo al tampón de hibridación y tratamiento con Rnasa. Para sondas no homólogas, puede realizarse una serie de hibridaciones al variar uno de (i) disminuir progresivamente la temperatura de hibridación (por ejemplo de 68 º C a 42 ºC) o (ii) disminuir progresivamente la concentración de formamida (por ejemplo de 50 % al 0 %). El experto en la técnica es consciente de que durante la hibridación pueden alterarse diversos parámetros y que se mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Además de las condiciones de hibridación, la especificidad de hibridación también depende típicamente de la función de lavados post-hibridación. Para retirar el fondo resultante de la hibridación no específica, las muestras se lavan con soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de dichos lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final: la menor concentración de sal y la mayor temperatura de lavado, la mayor rigurosidad de lavado. Las condiciones de lavado se realizan típicamente a o por debajo de la rigurosidad de hibridación. Una hibridación positiva proporciona una señal que es al menos dos veces la del fondo. Generalmente, las condiciones de rigurosidad adecuadas para los ensayos de hibridación de ácido nucleico o los procedimientos de detección de amplificación de genes son como se establecieron anteriormente. También pueden seleccionarse condiciones más o menos rigurosas. El experto en la técnica es consciente de diversos parámetros que pueden alterarse durante el lavado y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Por ejemplo, las condiciones de hibridación de alta rigurosidad típicas para híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos incluyen hibridación a 65 º C en 1x SSC o a 42 ºC en 1x SSC y formamida al 50 %, seguido de lavado a 65 º C en 0,3 x SSC. Ejemplos de condiciones de hibridación de rigurosidad media para híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos incluyen hibridación a 50 ºC en 4x SSC o a 40 ºC en 6x SSC y formamida al 50 %, seguido de lavado a 50 ºC en 2x SSC. La longitud del híbrido es la longitud prevista para la hibridación del ácido nucleico. Cuando los ácidos nucleicos de la secuencia conocida se hibridan, la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias e identificando las regiones conservadas descritas en el presente documento. 1xSSC es NaCl 0,15M y citrato sódico 15 mM; la solución de hibridación y las soluciones de lavado pueden incluir adicionalmente reactivo de Denhard 5x, SDS 0,5-1,0 %, 100 &g/ml de ADN de espera de salmón fragmentado, desnaturalizado, pirofosfato sódico al 0,5 %.

Con objeto de definir el nivel de rigurosidad, puede hacerse referencia a Sambrook y col. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 y actualizaciones anuales).

Variante de corte y empalme

El término “variante de corte y empalme” como se usa en el presente documento incluye variantes de una secuencia de ácido nucleico en la que los intrones y/o exones seleccionados se han escindido, reemplazado, desplazado o añadido, o en la que los intrones se han acortado o alargado. Dichas variantes serán unas en las que la actividad biológica de la proteína se conserva sustancialmente; esto puede conseguirse conservando selectivamente los segmentos funcionales de la proteína. Dichas variantes de corte y empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden ser fabricadas por el hombre. Los procedimientos para predecir y aislar dichas variantes de corte y empalme son bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Foissac y Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).

Variante alélica

Los alelos o variantes alélicas son formas alternativas de un gen determinado, localizado en la misma posición cromosómica. Las variantes alélicas incluyen Polimorfismos Mononucleotídicos (SNP), así como Polimorfismos de Inserción/Deleción pequeños (INDEL). El tamaño de INDEL es normalmente menor de 100 pb. Los SNP e INDEL forman el grupo de variantes de secuencia más grande en las cepas polimórficas de origen natural de la mayoría de los organismos.

Combinación de genes/Evolución dirigida

La combinación de genes o evolución dirigida consta de iteraciones de combinación de ADN seguido de detección y/o selección apropiada para generar variantes de ácidos nucleicos o partes de las mismas que codifican proteínas que tienen una actividad biológica modificada (Castle y col., (2004) Science 304(5674): 1151-4; Patentes de Estados Unidos Nº 5.811.238 y 6.395.547).

Elemento regulador/Secuencia de control/Promotor

Las expresiones “elemento regulador”, “secuencia de control” y “promotor” se utilizan todas indistintamente en el presente documento y se toman en un contexto amplio para referirse a una secuencia de ácidos nucleicos reguladora capaz de efectuar la expresión de las secuencias a las que se unen. El término “promotor” típicamente se refiere a una secuencia de control de ácidos nucleicos localizada en dirección 5’ del inicio transcripcional de un gen y que está implicado en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo de este modo la transcripción de un ácido nucleico unido operativamente. Incluidas en los términos anteriormente mencionados se encuentran las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariota clásico (que incluye la caja TATA que es necesaria para el inicio de transcripción adecuado, con o sin secuencia de caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras en dirección 5’, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta al desarrollo y/o estímulo externo, o en una forma específica de tejido. También se incluye dentro del término una secuencia reguladora transcripcional de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras transcripcionales de caja -10. La expresión “elemento regulador” también incluye una molécula de fusión sintética o un derivado que confiere, activa o potencia la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano.

Un “promotor de planta” comprende elementos reguladores, que median la expresión de un segmento de secuencia codificante en células de plantas. Por consiguiente, un promotor de planta no necesita ser de origen vegetal, pero puede originarse a partir de virus o microorganismos, por ejemplo de virus que atacan a las células de planta. El “promotor de planta” también puede originarse de una célula de planta, por ejemplo, de la planta que se transforma con la secuencia de ácidos nucleicos a expresar en el proceso de la invención y que se describe en el presente documento. Esto también se aplica a las otras señales reguladoras de “planta”, tales como terminadores de “planta”. Los promotores en la dirección 5’ de la secuencia de nucleótidos útiles en los procedimientos de la presente invención pueden modificarse mediante una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de nucleótido sin interferir con la funcionalidad o actividad de cualquiera de los promotores, la fase de lectura abierta (ORF, Open Reading Frame) o la región reguladora e 3’ tal como terminadores u otras regiones reguladores 3’ que se ubican lejos de la ORF. Además es posible que la actividad de los promotores aumente por modificación de su secuencia o que se reemplacen completamente por más promotores activos, incluso promotores de organismos heterólogos. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico debe, como se ha descrito anteriormente, estar unida operativamente a o comprender un promotor adecuado que exprese el gen de manera adecuada en tiempo y con el patrón de expresión espacial requerido.

Para la identificación de promotores funcionalmente equivalentes, la fuerza del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato pueden analizarse, por ejemplo, uniendo operativamente el promotor a un gen indicador y evaluando el nivel de expresión y patrón del gen indicador en diversos tejidos de la planta. Los genes indicadores bien conocidos adecuados incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La actividad del promotor se evalúa midiendo la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. El patrón de expresión y/o la fuerza del promotor pueden después compararse con aquel de un promotor de referencia (tal como el utilizado en los procedimientos de la presente invención). Como alternativa, la fuerza del promotor puede evaluarse cuantificando los niveles de ARNm o comparando niveles de ARNm del ácido nucleico utilizado en el procedimientos de la presente invención, con niveles de ARNm de genes constitutivos tal como ARNr 18S, utilizando los procedimientos conocidos en la técnica, tal como transferencia de Northern con análisis densitométrico de autorradiogramas, PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR (Heid y col., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Generalmente por “promotor débil” se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. Por “nivel bajo” se entiende niveles de aproximadamente 1/10.000 transcriptos a aproximadamente 1/100.000 transcriptos, a aproximadamente 1/500.000 transcriptos por célula. Por el contrario, un “promotor fuerte” dirige la expresión de una secuencia codificante de alto nivel, o aproximadamente 1/10 transcriptos a aproximadamente 1/100 transcriptos a aproximadamente 1/1000 transcriptos por célula.

Unido operativamente

La expresión “unido operativamente” como se usa en el presente documento se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora es capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.

Promotor constitutivo

Un “promotor constitutivo” se refiere a un promotor que es transcripcionalmente activo durante la mayor parte, pero no necesariamente todas, las fases de crecimiento y desarrollo y en condiciones más ambientales, en al menos una célula, tejido u órgano. La siguiente Tabla 2a proporciona ejemplos de promotores constitutivos.

Tabla 2a: Ejemplos de promotores constitutivos

Fuente del gen: Referencia

Actina: McElroy y col, Plant Cell, 2: 163-171, 1990

HMGP: Documento WO 2004/070039

CAMV 35S: Odell y col, Nature, 313: 810-812, 1985

CaMV 19S: Nilsson y col., Physiol. Plant. 100: 456-462, 1997

GOS2: de Pater y col, Plant J Nov; 2(6): 837-44, 1992, documento WO 2004/065596

Ubiquitina: Christensen y col, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992

Ciclofilina de arroz: Buchholz y col, Plant Mol Biol. 25(5): 837-43, 1994

Histona H3 de maíz: Lepetit y col, Mol. Gen. Genet. 231:276-285, 1992

Histona H3 de alfalfa: Wu y col. Plant Mol. Biol. 11:641-649, 1988

Actina 2: An y col, Plant J. 10(1); 107-121, 1996

34S FMV: Sanger y col., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443

Subunidad pequeña Rubisco: Documento US 4.962.028

OCS: Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553

SAD1: Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

SAD2: Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

nos: Shaw y col. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20):7831-7846

V-ATPasa: Documento WO 01/14572

Súper promotor: Documento WO 95/14098

Proteínas de caja G: Documento WO 94/12015

Promotor ubicuo

Un promotor ubicuo es activo en sustancialmente todos los tejidos o células de un organismo.

Promotor regulado evolutivamente

Un promotor regulador evolutivamente es activo durante ciertas etapas de desarrollo o en partes de la planta que 10 experimentan cambios evolutivos.

Promotor inducible

Un promotor inducible ha inducido o aumentado el inicio de la transcripción en respuesta a un estímulo químico (para una revisión véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108), ambiental o físico, o puede ser “inducible por estrés”, es decir, activado cuando una planta se expone a diversas condiciones de estrés, o

15 un “patógeno inducible”, es decir, activado cuando una planta está expuesta a la exposición de diversos patógenos.

Promotor específico de órgano/Específico de tejido

Un promotor específico de órgano o específico de tejido es uno que puede iniciar preferentemente la transcripción en determinados órganos o tejidos, tales como hojas, raíces, tejido de semilla, etc. Por ejemplo, un “promotor específico de raíz” es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en las raíces de las 20 plantas, sustancialmente con la exclusión de cualesquiera otras partes de una planta, mientras que aún permite

cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta. En el presente documento a los promotores que pueden iniciar la transcripción solo en determinadas células se les denomina “específicos de célula”.

Un promotor específico de semilla es transcripcionalmente activo predominantemente en el tejido de semilla, pero no necesariamente exclusivamente en tejidos de semilla (en casos de expresión parcial). El promotor específico de 5 semilla puede ser activo durante el desarrollo y/o durante la germinación de las semillas. El promotor específico de semilla puede ser específico de endospermo/aleurona/embrión. Ejemplos de promotores específicos de semillas se muestran en las Tablas 2b a 2e a continuación. Otros ejemplos de promotores específicos de semilla se proporcionan en Qing Qu y Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113-125, 2004), cuya descripción se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad.

10 Tabla 2b: Ejemplos de promotores específicos de semilla

Fuente del gen: Referencia

Genes específicos de semilla: Simon y col., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;

Scofield y col., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.

Baszczynski y col., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

Albúmina de Nuez del Brasil: Pearson y col., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992.

Legumina: Ellis y col., Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988.

Glutelina (arroz): Takaiwa y col., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986;

Takaiwa y col., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987

Zeína: Matzke y col Plant Mol Biol, 14(3): 323-32 1990

napA: Stalberg y col, Planta 199: 515-519, 1996.

Gluteína-1 LMW y HMW de trigo: Mol Gen Genet 216: 81-90, 1989; NAR 17: 461-2, 1989

SPA de trigo: Albani y col, Plant Cell, 9: 171-184, 1997

#, ∃, ∋-gliadinas de trigo: EMBO J. 3: 1409-15, 1984

Promotor It1 de cebada: Diaz y col. (1995) Mol Gen Genet 248(5): 592-8

Hordeína B1, C, D de cebada: Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4: 343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:7 50-60, 1996

DOF de cebada: Mena y col, The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998

blz2: EP99106056.7

promotor sintético: Vicente-Carbajosa y col., Plant J. 13: 629-640, 1998.

Prolamina NRP33 de arroz: Wu y col, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998

a-globulina Glb-1 de arroz: Wu y col, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998

OSH1 de arroz: Sato y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996

#-globulina REB/OHP-1 de arroz: Nakase y col. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997

Pirofosforilasa ADP glucosa de arroz: Trans Res 6: 157-68, 1997

Familia del gen ESR de maíz: Plant J 12:235-46, 1997

#-kafirina de sorgo: DeRose y col., Plant Mol. Biol 32: 1029-35, 1996

KNOX: Postma-Haarsma y col, Plant Mol. Biol. 39: 257-71, 1999

Oleosina de arroz: Wu y col, J. Biochem. 123: 386, 1998

oleosina de girasol: Cummins y col., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992

(continuación)

Fuente del gen: Referencia

PRO0117, supuesta proteína ribosomal 40S de arroz: WO 2004/070039

PRO0136, alanina aminotransferasa de arroz: No publicado

PRO0147, inhibidor de tripsina ITR1 (cebada): No publicado

PRO0151, WSI18 de arroz: WO 2004/070039

PRO0175, RAB21 de arroz: WO 2004/070039

PRO005: WO 2004/070039

PRO0095: WO 2004/070039

#-amilasa (Amy32b): Lanahan y col, Plant Cell 4: 203-211, 1992; Skriver y col, Proc Natl Acad Sci USA 88: 7266-7270, 1991

Gen similar a ∃-catepsina: Cejudo y col, Plant Mol Biol 20: 849-856, 1992

Ltp2 de cebada: Kalla y col., Plant J. 6: 849-60, 1994

Chi26: Leah y col., Plant J. 4: 579-89, 1994

B-Peru de maíz: Selinger y col., Genetics 149;1125-38,1998

Tabla 2c: Ejemplos de promotores específicos de endospermo (continuación)

Fuente del gen: Referencia

Glutelina (arroz): Takaiwa y col. (1986) Mol Gen Genet 208: 15-22; Takaiwa y col. (1987) FEBS Letts. 221: 43-47

Zeína: Matzke y col., (1990) Plant Mol Biol 14(3): 323-32

Gluteína-1 LMW y HMW de trigo: Colot y col. (1989) Mol Gen Genet 216: 81-90, Anderson y col. (1989) NAR 17: 461-2

SPA de trigo: Albani y col. (1997) Plant Cell 9: 171-184

Gliadinas de trigo: Rafalski y col. (1984) EMBO 3: 1409-15

Promotor Itr1 de cebada: Diaz y col. (1995) Mol Gen Genet 248(5): 592-8

Hordeína B1, C, D de Cebada: Cho y col. (1999) Theor Appl Genet 98: 1253-62; Muller y col. (1993) Plant J 4: 34355; Sorenson y col. (1996) Mol Gen Genet 250: 750-60

DOF de cebada: Mena y col, (1998) Plant J 116(1): 53-62

blz2: Onate y col. (1999) J Biol Chem 274(14): 9175-82

Promotor sintético: Vicente-Carbajosa y col. (1998) Plant J 13: 629-640

Prolamina NRP33 de arroz: Wu y col, (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885-889

Globulina Glb-1 de arroz: Wu y col. (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885-889

Globulina REB/OHP-1 de arroz: Nakase y col. (1997) Plant Molec Biol 33: 513-522

Pirofosforilasa ADP glucosa de arroz: Russell y col. (1997) Trans Res 6: 157-68

Fuente del gen: Referencia

Familia del gen ESR de maíz: Opsahl-Ferstad y col. (1997) Plant J 12:235-46

Kafirina de sorgo: DeRose y col. (1996) Plant Mol Biol 32: 1029-35

Tabla 2d: Ejemplos de promotores específicos de embrión

Fuente del gen: Referencia

OSH1 de arroz: Sato y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996

KNOX: Postma-Haarsma y col, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999

PRO0151: WO 2004/070039

PRO0175: WO 2004/070039

PRO005: WO 2004/070039

PRO0095: WO 2004/070039

Tabla 2e: Ejemplos de promotores específicos de aleurona

Fuente del gen: Referencia

#-amilasa (Amy32b): Lanahan y col, Plant Cell 4:203-211, 1992; Skriver y col, Proc Natl Acad Sci USA 88: 7266-7270, 1991

Gen similar a ∃-catepsina: Cejudo y col, Plant Mol Biol 20: 849-856, 1992

Ltp2 de cebada: Kalla y col., Plant J. 6: 849-60, 1994

Chi26: Leah y col., Plant J. 4: 579-89, 1994

B-Perú de maíz: Selinger y col., Genetics 149; 1125-38, 1998

Un promotor específico de tejido verde como se define en el presente documento es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en tejido verde, sustancialmente con la exclusión de cualesquiera otras partes de una planta, mientras que aún permanece cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta.

10 Otro ejemplo de un promotor específico de tejido es un promotor específico de meristemo, que es transcripcionalmente activo predominantemente en tejido meristemático, sustancialmente con la exclusión de cualesquiera otras partes de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de las plantas.

Terminador

15 El término “terminador” incluye una secuencia de control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad que señaliza el procesamiento y la poliadenilación en 3’ de un transcripto primario y la terminación de la transcripción. El terminador puede derivar del gen natural, de una diversidad de otros genes de planta, o de ADN-T. El terminador a añadir puede derivar de, por ejemplo, los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o como alternativa, de otro gen de planta, o menos preferentemente de cualquier otro gen eucariota.

20 Modulación

El término “modulación” significa en relación a la expresión o expresión de gen, un proceso en el que el nivel de expresión se cambia mediante dicho gen de expresión en comparación con la planta de control, el nivel de expresión puede aumentarse o disminuirse. La expresión no modulada, original, puede ser de cualquier tipo de expresión de un ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con traducción posterior. La expresión “modulación de la actividad”

25 significará cualquier cambio de la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención o las proteínas codificadas, que conduce a la rendimiento aumentado y/o a crecimiento aumentado de las plantas.

Expresión

El término “expresión” o “expresión de gen” significa la transcripción de un gen específico o genes específicos o construcción genética específica. El término “expresión” o “expresión de gen” significa en particular la transcripción de un gen o genes o construcción genética en ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con o sin traducción posterior del último en una proteína. El proceso incluye la transcripción de ADN y el procesamiento del producto de ARNm resultante.

Expresión aumentada/sobreexpresión

La expresión “expresión aumentada” o “sobreexpresión” como se usa en el presente documento significa cualquier forma de expresión que se es adicional al nivel de expresión original de tipo silvestre.

Los procedimientos para aumentar la expresión de los genes o productos génicos se documentan bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión conducida mediante promotores adecuados, el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de la traducción. Los ácidos nucleicos aislados que sirven como promotor o elementos potenciadores pueden introducirse en una posición adecuada (típicamente en la dirección 5’) de una forma no heteróloga de un polinucleótido para regular por aumento la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos pueden alterarse in vivo por mutación, deleción y/o sustitución (véase, Kmiec, US 5.565.350; Zarling y col., WO9322443), o pueden introducirse promotores aislados en una célula de planta en la orientación y distancia apropiada de un gen como se describe en el presente documento de tal manera que se controle la expresión del gen.

Si se desea la expresión del polipéptido, es generalmente deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3’ de una región codificante de polinucleótido. La región de poliadenilación puede derivar del gen natural, de una diversidad de otros genes de planta, o de ADN-T. La secuencia de extremo 3’ a añadir puede derivar de, por ejemplo, los genes nopalina sintasa u octopina sintasa, o como alternativa de otro gen de planta, o menos preferentemente de cualquier otro gen eucariota.

También puede añadirse una secuencia intrónica a la región no traducida (UTR, untranslated region) 5’ o la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. Se ha observado que la inclusión de un intrón de corte y empalme en la unidad de transcripción en construcciones de expresión tanto de plantas como de animales aumenta la expresión génica tanto a nivel de proteína como de ARNm hasta 1000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis y col. (1987) Genes Dev 1: 1183-1200). Dicha potenciación intrónica de la expresión génica es típicamente mayor cuando se pone cerca del extremo 5’ de la unidad de transcripción. En la técnica se conoce el uso de los intrones de maíz, el intrón Adh1-S 1, 2 y 6, el intrón Bronze-1. Para información general véase: The Maize Handbook, capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Gen endógeno

La referencia en el presente documento a un gen “endógeno” no solo se refiere al gen en cuestión como se encuentra en una planta en su forma natural (es decir, sin existir ninguna intervención humana), sino también se refiere a aquel mismo gen (o un ácido nucleico/gen sustancialmente homólogo) en una forma aislada posteriormente (re)introducida en una planta (un transgén). Por ejemplo, una planta transgénica que contiene dicho transgén puede encontrar una reducción sustancial de la expresión transgénica y/o reducción sustancial de la expresión del gen endógeno. El gen aislado puede aislarse de un organismo o puede fabricarlo en hombre, por ejemplo, mediante síntesis química.

Expresión reducida

En el presente documento la referencia a “expresión reducida” o “reducción o eliminación sustancial” de expresión significa una reducción en la expresión del gen endógeno y/o los niveles de polipeptido y/o actividad de polipéptido con relación a las plantas de control. La reducción o eliminación sustancial está en orden aumentado de preferencia por lo menos de 20 %, 30 %, 40 % o 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más reducido en comparación con el de las plantas de control.

Para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno en una planta, se requiere una longitud suficiente de nucleótidos sustancialmente contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos. Para realizar el silenciamiento génico, este puede ser tan pequeño como 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos nucleótidos, como alternativa éste puede ser tanto como el gen completo (incluyendo la UTR 5’ y/o 3’, ya sea en parte o en su totalidad). El tramo de los nucleótidos sustancialmente contiguos puede derivar del ácido nucleico que codifica la proteína de interés (gen diana), o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés. Preferentemente, el tramo de los nucleótidos sustancialmente contiguos es capaz de formar enlaces de hidrógeno con el gen diana (cadena en sentido o antisentido), más preferentemente, el tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos tiene, en orden aumentado de preferencia, una identidad de secuencia de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % con el gen diana (cadena en sentido o antisentido). Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido (funcional) no es un

requerimiento para los diversos procedimientos analizados en el presente documento para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno.

Esta reducción o eliminación sustancial de la expresión puede realizarse usando herramientas y técnicas habituales. Un procedimiento para la reducción o eliminación sustancial de la expresión del gen endógeno es al introducir y expresar en una planta una construcción genética en la que el ácido nucleico (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o de cualquier nucleótido capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las proteínas de interés) se clona como una repetición invertida (en parte o completamente), separado por un espaciador (ADN no codificante).

En dicho procedimiento, la expresión del gen endógeno se reduce o se elimina sustancialmente a través del silenciamiento mediado por ARN utilizando una repetición invertida de un ácido nucleico o una parte del mismo (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), preferentemente capaz de formar una estructura en horquilla. La repetición invertida se clona en un vector de expresión que comprende las secuencias de control. Una secuencia de ácidos nucleicos de ADN no codificante (un espaciador, por ejemplo un fragmento de la región de unión de matriz (MAR), un intrón, un poliengarce, etc.) se localiza entre los dos ácidos nucleicos invertidos que forman la repetición invertida. Después de la transcripción de la repetición invertida, se forma un ARN quimérico con una estructura auto-complementaria (parcial o completa). Esta estructura de ARN bicatenario se denomina ARN en horquilla (ARNhp). El ARNhp se procesa en la planta en los ARNip que se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, RNA). El RISC escinde adicionalmente los transcriptos de ARNm, reduciendo por lo tanto sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que van a traducirse en los polipéptidos. Para detalles generales adicionales véase, por ejemplo, Grierson y col. (1998) WO 98/53083; Waterhouse y col. (1999) WO 99/53050).

La realización de los procedimientos como se describe en el presente documento no se basa en introducir y expresar en una planta una construcción genética en la que el ácido nucleico se clona como una repetición invertida, sino que pueden utilizarse cualquiera de uno o más de los diversos procedimientos de “silenciamiento génico” bien conocidos para lograr los mismos efectos.

Un procedimiento de este tipo para la reducción de la expresión del gen endógeno es el silenciamiento mediado por ARN de la expresión del gen (regulación por disminución). El silenciamiento en este caso se activa en una planta mediante una secuencia de ARN bicatenario (ARNbc) que es sustancialmente similar al gen endógeno diana. Este ARNbc se procesa adicionalmente por la planta de aproximadamente 20 a aproximadamente 26 nucleótidos denominado ARN de interferencia pequeño (ARNip). Los ARNip se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que escinde el transcrito de ARNm del gen endógeno diana, reduciendo por tanto sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que se traducen en un polipéptido. Preferentemente, la secuencia de ARN bicatenario corresponde a un gen diana.

Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica la introducción de secuencias de ácidos nucleicos o partes de las mismas (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o del cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés) en una orientación en sentido en una planta. “Orientación en sentido” se refiere a una secuencia de ADN que es homóloga a un transcripto de ARNm de la misma. Por lo tanto, en una planta se introduciría al menos una copia de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos adicional reduciría la expresión del gen endógeno, dando lugar a un fenómeno conocido como co-supresión. La reducción de la expresión del gen sería más pronunciada si en una planta se introducen diversas copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos, cuando hay una correlación positiva entre altos niveles de transcripto y la activación de la co-supresión.

Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica el uso de las secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Una secuencia de “ácidos nucleicos antisentido” comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos “en sentido” que codifica una proteína, es decir, complementaria a la cadena codificante de una molécula de ADNc bicatenario o complementario a una secuencia de transcripto de ARNm. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido es preferentemente complementaria al gen endógeno a silenciar. La complementariedad puede localizarse en la “región codificante” y/o en la “región no codificante” de un gen. La expresión “región codificante” se refiere a una región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en restos de aminoácido. La expresión “región no codificante” se refiere a las secuencias 5’ y 3’ que flanquean la región codificante que se transcriben pero no se traducen en aminoácidos (denominado también regiones no traducidas 5’ y 3’).

Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden diseñarse de acuerdo con las normas de emparejamiento de bases de Watson y Crick. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede ser complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos completa (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), pero también puede ser un oligonucleótido que es antisentido para solo a una parte de la secuencia de ácidos nucleicos (incluyendo la UTR 5’ y 3’ del ARNm). Por ejemplo, la secuencia de oligonucleótidos antisentido puede ser complementaria a la región que rodea el sitio de inicio de traducción de un transcripto de ARNm que codifica un

polipéptido. La longitud de una secuencia de oligonucleótidos antisentido adecuada se conoce en la técnica y puede iniciar de aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleótidos de longitud o menos. Una secuencia de ácidos nucleicos antisentido como se describe en el presente documento puede construirse usando síntesis química y las reacciones de ligamiento enzimático utilizando los procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos antisentido (por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos de origen natural o varios nucleótidos modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para el aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre las secuencias de ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, pueden utilizarse derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos por acridina. En la técnica se conocen bien ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar las secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Las modificaciones de nucleótido conocidos incluyen metilación, ciclación y “protecciones” y sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo tal como inosina. En la técnica se conocen bien otras modificaciones de nucleótidos.

La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede producirse biológicamente utilizando un vector de expresión en el que se ha subclonado una secuencia de ácidos nucleicos en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés). Preferentemente, la producción de las secuencias de ácidos nucleicos antisentido en plantas se produce mediante una construcción de ácido nucleico establemente integrada que comprende un promotor, un oligonucleótido antisentido unido operativamente y un terminador.

Las moléculas de ácido nucleico utilizadas para el silenciamiento en los procedimientos descritos en el presente documento (tanto si se introduce en una planta como se genera in situ) se hibridan con o se unen a los transcriptos de ARNm y/o ADN genómico que codifica un polipéptido para inhibir así la expresión de la proteína, por ejemplo, al inhibir la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser cualquier complementariedad convencional de nucleótidos para formar un dúplex estable o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de ácidos nucleicos antisentido que se une a los dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco principal de la doble hélice. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden introducirse en una planta mediante transformación o inyección directa en un sitio de tejido específico. Como alternativa, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse para dirigir las células seleccionadas y después administrarse por vía sistémica. Por ejemplo, para administración sistémica, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse de tal manera que se unan específicamente a los receptores o antígenos expresados sobre una superficie celular seleccionada, por ejemplo, al ligar la secuencia de ácidos nucleicos antisentido a los péptidos o anticuerpos que se unen a los receptores o antígenos de superficie celular. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido también pueden administrarse a células usando los vectores descritos en el presente documento.

Como se describe en el presente documento, la secuencia de ácidos nucleicos antisentido es una secuencia de ácidos nucleicos anomérica a. Una secuencia de ácidos nucleicos anomérica a forma híbridos bicatenarios específicos con ARN de complementariedad en el que, contrario a las unidades b habituales, las cadenas corren paralelas entre sí (Gaultier y col. (1987) Nucl Ac Res 15: 6625-6641). La secuencia de ácidos nucleicos antisentido también puede comprender un 2’-o-metilrribonucleótido (Inoue y col. (1987) Nucl Ac Res 15, 6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue y col. (1987) FEBS Lett. 215, 327-330).

La reducción o eliminación sustancial de la expresión del gen endógeno también puede realizarse usando ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa que pueden escindir una secuencia de ácidos nucleicos monocatenaria, tal como un ARNm, en el que tienen una región complementaria. Por tanto, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334, 585-591) pueden utilizarse para escindir catalíticamente los transcriptos de ARNm que codifican un polipéptido, reduciendo sustancialmente por tanto el número de transcriptos de ARNm que van a traducirse en un polipéptido. Se puede diseñar una ribozima que tenga especificidad para una secuencia de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo: Cech y col. Patente de Estados Unidos Nº 4.987.071; y Cech y col. Patente de Estados Unidos Nº 5.116.742). Como alternativa, los transcriptos de ARNm correspondientes a una secuencia de ácidos nucleicos pueden utlizarse para seleccionar un ARN catalítico que tenga una actividad específica de ribonucleasa de un conjunto de moléculas de ARN (Bartel y Szostak (1993) Science 261, 1411-1418). El uso de ribozimas para el silenciamiento génico en plantas es conocido en la técnica (por ejemplo, Atkins y col. (1994) WO 94/00012; Lenne y col. (1995) WO 95/03404; Lutziger y col. (2000) WO 00/00619; Prinsen y col. (1997) WO 97/13865 y Scott y col. (1997) WO 97/38116).

El silenciamiento génico también puede producirse por mutagénesis de inserción (por ejemplo, inserción de ADN-T o inserción de transposón) o mediante estrategias como describen, entre otros, Angell y Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357-62), (Amplicon VIGS WO 98/36083) o Baulcombe (documento WO 99/15682).

El silenciamiento génico también puede producirse si hay una mutación en un gen endógeno y/o una mutación en un gen aislado/ácido nucleico posteriormente introducido en una planta. La reducción o eliminación sustancial puede estar provocada por un polipéptido no funcional. Por ejemplo, el polipéptido puede unirse a diversas proteínas que interaccionan; por lo tanto pueden proporcionarse una o más mutaciones y/o truncamientos para un polipéptido que es aún capaz de unir las proteínas que interaccionan (tal como proteínas receptoras) pero que no pueden exhibir su función normal (tal como ligando de señalización).

Una estrategia adicional para el silenciamiento génico es dirigir la secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la región reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o los potenciadores) para formar estructuras helicoidales triples que impiden la transcripción del gen en células diana. Véase Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991; Helene y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36 1992; y Maher, L.J. Bioassays 14, 807-15, 1992.

5 Un experto conocerá otros procedimientos, tales como el uso de anticuerpos dirigidos a un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o la interferencia en la ruta de señalización en la que un polipéptido está implicado. En particular, se puede prever que las moléculas fabricadas por el hombre pueden ser útiles para inhibir la función biológica de un polipéptido diana o para interferir con la ruta de señalización en la que está implicado el polipéptido diana.

10 Como alternativa, puede establecerse un programa de detección hasta identificar en una población de plantas las variantes naturales de un gen, cuyas variantes codifican los polipéptidos con actividad reducida. Dichas variantes naturales también pueden utilizarse, por ejemplo, para realizar recombinación homóloga.

Para desactivar la expresión génica y/o traducción de ARNm pueden utilizarse microARN (miARN) artificiales y/o naturales. Los miARN endógenos son ARN pequeños monocatenarios típicamente con una longitud de 19-24 15 nucleótidos. Principalmente funcionan para regular la expresión génica y/o la traducción de ARNm. La mayor parte de los microARN (miARN) de planta tienen complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias diana. Sin embargo, hay dianas naturales con hasta cinco emparejamiento erróneos. Se procesan a partir de ARN no codificantes más largos con estructuras de plegamiento características mediante RNasas específicas bicatenarias de la familia Dicer. Después del procesamiento, se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN

20 (RISC) al unirse a su componente principal, una proteína Argonauta. Los miARN sirven como componentes de especificidad del RISC, debido al emparejamiento de bases con ácidos nucleicos diana, principalmente ARNm, en el citoplasma. Los acontecimientos reguladores posteriores incluyen la escisión de ARNm diana y la destrucción y/o inhibición traduccional. Por tanto, los efectos de la sobreexpresión de miARN se reflejan frecuentemente en niveles de ARNm reducidos de los genes diana.

25 Los microARN artificiales (amiARN), que típicamente tienen 21 nucleótidos de longitud, pueden modificarse por ingeniería genética específicamente para regular negativamente la expresión génica de un solo gen o de múltiples genes de interés. En la técnica se conocen bien los determinantes de la selección diana de microARN de planta. Se han definido los parámetros empíricos para el reconocimiento diana y pueden utilizarse para ayudar en el diseño de los amiARN específicos (Schwab y col., Dev. Cell 8, 517-527, 2005). Están disponibles para el público las

30 herramientas convenientes para el diseño y la generación de los amiARN y sus precursores (Schwab y col., Plant Cell 18, 1121-1133, 2006).

Para un rendimiento óptimo, las técnicas de silenciamiento génico utilizadas para reducir la expresión en una planta de un gen endógeno requieren el uso de secuencias de ácidos nucleicos de plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas, y de plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas

35 dicotiledóneas. Preferentemente, una secuencia de ácidos nucleicos de cualquier especie de planta dada se introduce dentro de esta misma especie. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requisito absoluto que la secuencia de ácidos nucleicos que se introduce se origine de la misma especie de planta como la planta en la que se introducirá. Basta con que exista una homología sustancial entre el gen diana endógeno y el ácido nucleico a introducir.

40 Anteriormente se han descrito ejemplos de diversos procedimientos para la reducción o eliminación sustancial de la expresión en una planta de un gen endógeno. Un experto en la técnica será capaz de adaptar fácilmente los procedimientos anteriormente mencionados para el silenciamiento para conseguir la reducción de la expresión de un gen endógeno en una planta completa o en partes de la misma a través del uso de un promotor apropiado, por ejemplo.

45 Marcador de selección (gen)/Gen indicador

Un “marcador de selección”, “gen marcador de selección” o “gen indicador” incluye cualquier gen que confiere un fenotipo a una célula en el que se expresa para facilitar la identificación y/o selección de las células que se transfectan o se transforman con una construcción de ácido nucleico como se describe en el presente documento. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia exitosa de las moléculas de ácido nucleico 50 mediante una serie de diferentes principios. Los marcadores adecuados pueden seleccionarse de marcadores que confieren resistencia herbicida o antibiótica, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten selección visual. Como ejemplos de genes marcadores de selección se incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptII que fosforila neomicina y canamicina, o hpt, que higromicina fosforilante, o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina 55 (G418), espectinomicina o blasticidina), a los herbicidas (por ejemplo bar que proporciona resistencia a Basta∀; aroA

: o gox que proporciona resistencia contra el glifosato, o los genes que confieren resistencia a, por ejemplo, imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea) o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tal como manA que permite a las plantas utilizar mannosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilización de xilosa,

: o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a 2-desoxiglucosa). La expresión de genes marcadores

visuales da como resultado la formación de color (por ejemplo ∃-glucuronidasa, GUS o ∃-galactosidasa con sus sustratos de color, por ejemplo X-Gal), luminiscencia (tal como el sistema luciferina/lucefarasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP, y derivados de los mismos). Esta lista solo representa una pequeña cantidad de marcadores posibles. El experto está familiarizado con dichos marcadores. Dependiendo del organismo y del procedimiento de selección se prefieren diferentes marcadores.

Se sabe que, tras la integración estable o transitoria de los ácidos nucleicos en las células de plantas, solo una minoría de las células capta el ADN exógeno y, si se desea, lo integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión utilizado y de la técnica de transfección utilizada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, normalmente se introduce un gen que codifica un marcador de selección (tal como los descritos anteriormente) en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden, por ejemplo, utilizarse en mutantes en los que estos genes no son funcionales mediante, por ejemplo, deleción por procedimientos convencionales. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador de selección pueden introducirse en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos como se describe en el presente documento o utilizarse en los procedimientos como se describe en el presente documento, o incluso en un vector distinto. Las células que se han transfectado de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse por ejemplo mediante selección (por ejemplo, células que tienen integrado el marcador de selección sobreviven mientras que las otras células mueren).

Dado que los genes marcadores, particularmente genes que confieren resistencia a antibióticos y herbicidas, ya no requieren o no se desean en la célula huésped transgénica, una vez que los ácidos nucleicos se han introducido satisfactoriamente, el proceso como se describe en el presente documento para introducir los ácidos nucleicos emplea ventajosamente técnicas que permiten la eliminación o escisión de estos genes marcadores. Un procedimiento de este tipo es el conocido como co-transformación. El procedimiento de co-transformación emplea dos vectores simultáneamente para la transformación, un vector que lleva el ácido nucleico como se describe en el presente documento y un segundo vector que lleva el gen (o genes) marcador. Una proporción grande de transformantes recibe o, en el caso de plantas, comprende (hasta 40 % o más de los transformantes), ambos vectores. En el caso de transformación con Agrobacteria, los transformantes normalmente reciben solo una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el ADN-T, que normalmente representa el casete de expresión. Los genes marcadores pueden retirarse posteriormente de la planta transformada realizando cruzamientos. En otro procedimiento, se utilizan genes marcadores integrados en un transposón para la transformación junto con ácido nucleico deseado (conocido como tecnología Ac/Ds). Los transformantes pueden cruzarse con una fuente transposasa o los transformantes se transforman con una construcción de ácido nucleico que confiere expresión de una transposasa, de manera transitoria o estable. En algunos casos (aprox. 10 %), el transposón salta del genoma de la célula huésped una vez se ha producido la transformación exitosamente y se pierde. En un número adicional de casos, el transposón salta a una localización diferente. En estos casos el gen marcador debe eliminarse realizando cruzamientos. En microbiología, se desarrollaron técnicas que hacen posible, o facilitan, la detección de dichos acontecimientos. Un procedimiento ventajoso adicional se basa en lo que se conoce como sistemas de recombinación; cuya ventaja es que la eliminación puede dispensarse por cruzamiento. El sistema mejor conocido de este tipo es lo que se conoce como el sistema Cre/lox. Cre1 es una recombinasa que elimina las secuencias localizadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias loxP, éste se elimina una vez se haya producido la transformación de manera satisfactoria, por expresión de la recombinasa. Otros sistemas de recombinación son el sistema HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble y col., J. Biol. Chem., 275, 2000: 2225522267; Velmurugan y col., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Como se describe en el presente documento es posible una integración específica de sitio en el genoma de la planta de la secuencia de ácidos nucleicos. Naturalmente, estos procedimientos también pueden aplicarse a microorganismos tales como levaduras, hongos o bacterias.

Transgénico/Transgén/Recombinante

Para el propósito de la invención, “transgénico”, “transgén” o “recombinante” significa con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos, un casete de expresión, una construcción génica o un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos o un organismo transformado con las secuencias de ácidos nucleicos, casetes o vectores de expresión, como se describe en el presente documento, todas estas construcciones llevadas a cabo por procedimientos recombinantes en los que

(a): las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas útiles en los procedimientos como se describe en el presente documento, o

(b): la secuencia (o secuencias) de control genético que se une operativamente con la secuencia de ácidos nucleicos como se describe en el presente documento, por ejemplo un promotor, o

(c): a) y b)

no se localizan en su ambiente genético natural o se han modificado por procedimientos recombinantes, siendo posible que se produzca la modificación de, por ejemplo, una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más restos de nucleótido. Se entiende que, ambiente genético natural, significa el locus genómico o cromosómico natural en la planta original o la presencia de una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácidos nucleicos se conserva preferentemente, al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácidos nucleicos al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, preferentemente al menos 500 pb, especialmente preferentemente al menos 1000 pb, más preferentemente al menos 5000 pb. Un casete de expresión de origen natural – por ejemplo la combinación de origen natural del promotor natural de las secuencias de ácidos nucleicos con la secuencia de ácidos nucleicos

5 correspondiente que codifica un polipéptido útil en los procedimientos como se describe en el presente documento, como se define anteriormente – llega a ser un casete de expresión transgénica cuando este casete de expresión se modifica mediante procedimientos sintéticos no naturales (“artificiales”) tal como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Se describen procedimientos adecuados, por ejemplo, en los documentos US 5.565.350 o WO 00/15815.

10 Por tanto, una planta transgénica, como se describe en el presente documento, se entiende que significa, como se ha indicado anteriormente, que los ácidos nucleicos utilizados en el procedimiento, como se describe en el presente documento, no están en su locus natural en el genoma de dicha planta, siendo posible que los ácidos nucleicos se expresen de manera homóloga o heteróloga. Sin embargo, como se ha mencionado, transgénico también significa que, aunque los ácidos nucleicos, como se describe en el presente documento o se usan en el procedimiento de la

15 invención, están en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia se ha modificado con respecto a la secuencia natural, y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales se han modificado. Por transgénico se entiende preferentemente que significa la expresión de los ácidos nucleicos, como se describe en el presente documento, en un locus no natural en el genoma, es decir, se produce la expresión homóloga o, preferentemente, heteróloga de los ácidos nucleicos. En el presente documento se mencionan las plantas

20 transgénicas preferidas.

Transformación

El término “introducción” o “transformación” como se denomina en el presente documento incluye la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del procedimiento utilizado para la transferencia. El tejido de planta capaz de propagación clonal posterior, mediante organogénesis o embriogénesis, 25 puede transformarse con una construcción genética, como se describe en el presente documento, y a partir del mismo regenerarse una planta completa. El tejido particular seleccionado variará dependiendo de los sistemas de propagación clonales disponibles para, y mejor adaptados a, la especie particular que se va a transformar. Las dianas tisulares ejemplares incluyen, discos foliares, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, megagametófitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, brotes axilares y

30 meristemos radiculares) e inducen tejido meristemático (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo de hipocotiledón). El polinucleótico puede introducirse transitoria o establemente en una célula huésped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Como alternativa, puede integrarse en el genoma huésped. La célula de planta transformada resultante puede después utilizarse para regenerar una planta transformada de una manera conocida por los expertos en la técnica.

35 La transferencia de genes externos dentro del genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de especies de plantas es actualmente una técnica bastante habitual. Ventajosamente, puede usarse cualquiera de los diversos procedimientos de transformación para introducir el gen de interés en una célula antecesora adecuada. Los procedimientos descritos para la transformación y regeneración de plantas de tejidos de plantas o células de plantas pueden utilizarse para la transformación transitoria o estable. Los procedimientos de

40 transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, pistola de bombardeo de partículas, transformación utilizando virus o polen y microproyección. Pueden seleccionarse procedimientos entre, el procedimiento de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. y col., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I y col. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. y col. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102);

45 microinyección en el material de planta (Crossway A y col., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo de partículas revestido con ADN o ARN (Klein TM y col., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrantes) y similares. Las plantas transgénicas, incluyendo plantas de cultivo transgénicas, se producen preferentemente mediante transformación mediada por Agrobacterium. Un procedimiento de transformación ventajoso es la transformación en la planta. Para esta finalidad, es posible, por ejemplo, permitir que las agrobacterias actúen en las

50 semillas de la planta o inocular las agrobacterias en el meristemo de la planta. Se ha demostrado de un modo particularmente conveniente, como se describe en el presente documento, permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe en la planta intacta o al menos en los primordios florales. Posteriormente la planta crece hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los procedimientos para la transformación mediada por Agrobacterium de arroz incluyen procedimientos bien conocidos

55 para la transformación del arroz, tales como los descritos en cualquiera de las siguientes referencias bibliográficas: la solicitud de Patente Europea EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan y col. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei y col. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), cuyas descripciones se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad. En el caso de la transformación de maíz, el procedimiento preferido es como se describe en Ishida y col. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o en Frame y col. (Plant Physiol

60 129(1): 13-22, 2002), cuyas descripciones se incorporan por referencia como si se expusieran en el presente documento. Dichos procedimientos se describen adicionalmente, a modo de ejemplo, en B. Jenes y col., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Los ácidos

nucleicos o la construcción a expresar se clona preferentemente en un vector, que es adecuado para la transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo, pBin19 (Bevan y col., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). La agrobacteria transformada por dicho vector puede después utilizarse de una manera conocida para la transformación de plantas, tales como las plantas utilizadas como un modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana no se considera como una planta de cultivo) o plantas de cultivo tales como, por ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo sumergiendo hojas magulladas u hojas picadas en una solución agrobacteriana y después cultivarlas en un medio adecuado. La transformación de plantas mediante Agrobacterium tumefaciens la describen, por ejemplo, Höfgen y Willmitzer en Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce, entre otros, de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, págs. 15

38.

Además de la transformación de células somáticas, que después deben regenerarse en plantas intactas, también es posible transformar las células de meristemos de planta y en particular aquellas células que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando lugar a plantas transgénicas. Por tanto, por ejemplo, semillas de Arabidopsis se tratan con agrobacterias y se obtienen semillas del desarrollo de plantas de las que se transforma una determinada proporción y por tanto transgénicas [Feldman, KA y Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208: 274-289; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chua y J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, págs. 274-289]. Los procedimientos alternativos se basan en la eliminación repetida de las influorescencias y la incubación del sitio de escisión en el centro de la roseta con agrobacterias transformadas, por lo que las semillas transformadas pueden obtenerse de modo similar en un punto final de tiempo (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Sin embargo, un procedimiento especialmente eficaz es el procedimiento de infiltración por vacío con sus modificaciones tal como el procedimiento de “inmersión floral”. En el caso de infiltración por vacío de Arabidopsis, las plantas intactas bajo presión reducida se tratan con una suspensión agrobacteriana [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194-1199], mientras que en el caso del procedimiento de “inmersión floral” el tejido floral en desarrollo se incuba brevemente con una suspensión agrobacteriana tratada con tensioactivo [Clough, SJ y Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. En ambos casos se recoge una determinada proporción de semillas transgénicas y estas semillas pueden diferenciarse de semillas no transgénicas al cultivar bajo las condiciones selectivas descritas anteriormente. Además, la transformación estable de los plástidos es ventajosa ya que estos se heredan por vía materna en la mayor parte de los cultivos reduciendo o eliminando el riesgo de flujo transgénico a través del polen. La transformación del genoma de cloroplasto se realiza generalmente mediante un proceso que han presentado esquemáticamente Klaus y col., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. En resumen las secuencias a transformar se clonan junto con un gen marcador de selección entre las secuencias flanqueantes homólogas al genoma de cloroplasto. Estas secuencias flanqueantes homólogas dirigen la integración específica de sitio en el plastoma. La transformación plastidial se ha descrito para muchas especies de plantas diferentes y se ofrece una revisión en Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3):v425-38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28. Recientemente se han descrito progresos biotecnológicos adicionales en forma de transformantes plastidiales sin marcador, que pueden producirse mediante un gen marcador co-integrado transitorio (Klaus y col., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).

Etiquetado en activación de ADN-T

El etiquetado en activación de ADN-T (Hayashi y col. Science (1992) 1350-1353), implica la inserción de ADN-T, que normalmente contiene un promotor (también puede ser un potenciador de traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 kb en la dirección 3’ o 5’ de la región codificante de un gen en una configuración de tal manera que el promotor dirige la expresión del gen diana. Típicamente, la regulación de la expresión del gen diana mediante su promotor natural se interrumpe y el gen cae bajo el control del promotor nuevamente inducido. El promotor se incorpora típicamente en un ADN-T. Este ADN-T se inserta al azar en el genoma de la planta, por ejemplo, a través de infección por Agrobacterium y conduce a expresión modificada de genes cerca al ADN-T insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a expresión modificada de los genes cerca al promotor introducido.

TILLING

El término “TILLING” es una abreviatura de “Targeted Induced Local Lesions In Genomes” (Inducción Dirigida de Lesiones Locales en el Genoma”) y se refiere a una tecnología de mutagénesis que es útil para generar y/o identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas con expresión y/o actividad modificada. El TILLING también permite la selección de plantas que llevan dichas variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden presentar expresión modificada, en fuerza o en localización o en tiempo (por ejemplo, si las mutaciones afectan al promotor). Estas variantes mutantes pueden presentar mayor actividad que la mostrada por el gen en su forma natural. El TILLING combina mutagénesis de alta densidad con procedimientos de detección de alto rendimiento. Las etapas que típicamente se siguen en el TILLING son: (a) mutagénesis EMS (Redei GP y Koncz C (1992) En Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, págs. 16-82; Feldmann y col., (1994) En Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J y Caspar T (1998) En J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, págs. 91-104); (b) preparación y agrupamiento de ADN

en individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización e hibridación para permitir la formación de heteroduplex; (e) DHPLC, donde la presencia de un heteroduplex en un grupo se detecta como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación del mutante individual; y (g) secuenciación del producto PCR mutante. En la técnica se conocen bien procedimientos de TILLING (McCallum y col., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

Recombinación homóloga

La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición definida seleccionada. La recombinación homóloga es una tecnología convencional utilizada rutinariamente en ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levaduras o el musgo Physcomitrella. Se han descrito procedimientos para realizar recombinación homóloga en plantas no solo para el modelo de plantas (Offringa y col. (1990) EMBO J 9(10): 3077-84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada y col. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; lida y Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8).

Rendimiento

El término “rendimiento” en general significa un producto medible de valor económico, típicamente relacionado con un cultivo, un área y un periodo de tiempo específicos. Las partes de planta individuales contribuyen directamente al rendimiento en base a su número, tamaño y/o peso, o al rendimiento real es el rendimiento por metro cuadrado de un cultivo y año, que se determina dividiendo el rendimiento total (incluyendo la producción cosechada y valorada) por metro cuadrado plantado. El término “rendimiento” de una planta puede relacionarse con biomasa vegetativa (biomasa de raíz y/o brote), con órganos reproductores y/o con propágulos (tal como semillas) de esta planta.

Vigor temprano

“Vigor temprano” se refiere a un crecimiento bien equilibrado saludable activo especialmente durante las etapas tempranas del crecimiento de la planta, y puede ser el resultado del aumento de la eficacia biológica de la planta debido a, por ejemplo, plantas que están mejor adaptadas a su ambiente (es decir, optimizando el uso de fuentes de energía y repartiendo entre brotes y raíces). Las plantas que tienen vigor temprano también muestran supervivencia aumentada de plántula y un mejor establecimiento del cultivo, que a menudo produce campos muy uniformes (con el crecimiento de cultivo de una manera uniforme, es decir, alcanzando la mayoría de las plantas las diversas etapas de desarrollo a sustancialmente el mismo tiempo) y a menudo mejor y mayor rendimiento. Por lo tanto, el vigor temprano puede determinarse midiendo diversos factores, tales como, peso de mil granos, porcentaje de germinación, porcentaje de emergencia, crecimiento de plántula, altura de la plántula, longitud de raíz, biomasa de brote y raíz y muchos más.

Aumento/Mejora/Potenciación

Los términos “aumento”, “mejora” o “potenciación” son intercambiables y significan en el sentido de la solicitud al menos un 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 %, preferentemente al menos 15 % o 20 %, más preferentemente 25 %, 30 %, 35 % o 40 % más rendimiento y/o crecimiento en comparación con plantas de control como se define en el presente documento.

Rendimiento de semilla

El rendimiento de semilla aumentado puede manifestarse por sí misma como uno o más de los siguientes: a) un aumento en biomasa de semilla (peso total de semilla) que puede establecerse sobre una semilla individual y/o por planta y/o por metro cuadrado; b) número de flores por planta aumentado; c) número de semillas (llenas) aumentado; d) índice de llenado de semilla aumentado (que se expresa como la proporción entre el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas); e) índice de cosecha aumentado, que se expresa como una proporción del rendimiento de partes cosechables, tales como semillas, dividido entre la biomasa total; y f) peso de mil granos (PMG) aumentado, que se extrapola a partir del número de semillas llenas contadas y su peso total. Un PMG aumentado puede ser el resultado de un tamaño y/o peso de semilla aumentado, y también puede ser el resultado de un aumento en el tamaño de embriones y/o endospermo.

También puede manifestarse un aumento en el rendimiento de semilla como un aumento del tamaño de la semilla y/o volumen de la semilla. Además, también puede manifestarse un aumento en el rendimiento de semilla en sí mismo como un aumento en el área de semilla y/o longitud de semilla y/o anchura de semilla y/o perímetro de semilla. El rendimiento aumentado puede ser también el resultado de arquitectura modificada o puede ocurrir debido a la arquitectura modificada.

Índice de verdor

El “índice de verdor” como se usa en el presente documento se calcula a partir de imágenes digitales de plantas. Para cada pixel que pertenece al objeto de la planta sobre la imagen, se calcula la proporción del valor verde frente al valor rojo (en el modelo RGB por el que se codifica el color). El índice de verdor se expresa como el porcentaje de pixeles para el que la proporción de verde con respecto a rojo supera un umbral determinado. En condiciones de

crecimiento normales, en condiciones de crecimiento de estrés salino, y en condiciones de crecimiento de disponibilidad de nutrientes reducida, el índice de verdor de las plantas se mide en la última imagen antes de la floración. Por otro lado, en condiciones de crecimiento de estrés por sequía, el índice de verdor de las plantas se mide en la primera imagen después de la sequía.

Planta

El término “planta” como se usa en el presente documento incluye plantas completas, antecesores y progenie de las plantas y partes de las plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluyendo tubérculos), flores y tejidos y órganos, donde cada uno de los elementos anteriormente mencionados comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término “planta” también incluye células de planta, cultivos en suspensión, tejido de callo, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, de nuevo donde cada uno de los elementos mencionados anteriormente comprende el gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en los procedimientos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo forraje

o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por ejemplo Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por ejemplo Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo Glycine max, Soja hispida o Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por ejemplo Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por ejemplo Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por ejemplo Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum o Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otras.

Descripción detallada

Descripción detalla para el polipéptido de Anquirina – dedo de Zn

Sorprendentemente, la memoria descriptiva describe que la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica el polipéptido AZ de Arabidopsis (AtAZ) o un homólogo del mismo proporciona plantas que tienen un rendimiento aumentado con respecto a plantas de control. De acuerdo con una realización de la presente invención, la memoria descriptiva describe un procedimiento para aumentar el rendimiento de plantas, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica el polipéptido AZ o un homólogo del mismo. Ventajosamente, la realización de los procedimientos de acuerdo con la presente memoria descriptiva da como resultado plantas que tienen rendimiento aumentado, particularmente rendimiento de semillas, con respecto a plantas de tipo silvestre correspondientes.

Una “referencia”, “planta de referencia”, “control”, “planta de control”, “tipo silvestre” o “planta de tipo silvestre” es en particular una célula, un tejido, un órgano, una planta, o una parte de la misma, que no se produjo de acuerdo con el procedimiento descrito en el presente documento. Por consiguiente, las expresiones “tipo silvestre”, “control” o “referencia” son intercambiables y pueden ser una célula o una parte de la planta tal como un orgánulo o tejido, o una planta, que no se ha modificado o tratado de acuerdo con el procedimiento descrito en el presente documento. Por consiguiente, la célula o una parte de la planta tal como un orgánulo o una planta utilizada como tipo silvestre,

control o referencia corresponde a la célula, planta o parte de la misma tanto como sea posible y es en cualquier otra propiedad aunque en el resultado del proceso como se describe en el presente documento sea idéntica a la materia objeto como se describe en el presente documento tanto como sea posible. Por lo tanto, el tipo silvestre, control o referencia se trata de modo idéntico o tan idéntico como sea posible, diciendo únicamente que las condiciones o propiedades deben ser diferentes, que no influyen en la calidad de la propiedad sometida a ensayo. Esto significa en otras palabras que el tipo silvestre indica (1) una planta, que lleva la forma no alterada o no modulada de un gen o alelo o (2) el material/planta de partida a partir del cual se producen las plantas mediante el proceso o procedimiento descrito en el presente documento.

Preferentemente, cualquier comparación entre las plantas de tipo silvestre y las plantas producidas por el procedimiento de la invención se realiza en condiciones análogas. La expresión “condiciones análogas” significa que todas las condiciones tales como, por ejemplo, cultivo o condiciones de cultivo, condiciones de ensayo (tal como composición del tampón, temperatura, sustratos, cepa patógena, concentración y similar) se mantienen idénticas entre los experimentos a comparar.

La “referencia”, “control” o “tipo silvestre” es preferentemente un sujeto, por ejemplo, un orgánulo, una célula, una tejido, una planta, que no se ha modulado, modificado o tratado de acuerdo con el procedimiento descrito en el presente documento como se describe en el presente documento y es en cualquier otra característica tan similar a la materia objeto como se describe en el presente documento como sea posible. La referencia, control o tipo silvestre es en su genoma, transcriptoma, proteoma o metaboloma tan similar como sea posible al sujeto como se describe en el presente documento. Preferentemente, la expresión orgánulo, célula, tejido o planta de “referencia”, “control” o “tipo silvestre” se refiere a un orgánulo, célula, tejido o planta, que es casi genéticamente idéntico al orgánulo, célula, tejido o planta, como se describe en el presente documento o una parte de la misma, preferentemente 95 %, más preferentemente 98 %, incluso más preferentemente 99,00 %, en particular 99,10 %, 99,30 %, 99,50 %, 99,70 %, 99,90 %, 99,99 %, 99,999 % o más. Más preferentemente, la “referencia”, “control” o “tipo silvestre” es un sujeto, por ejemplo, un orgánulo, una célula, un tejido, una planta, que es genéticamente idéntico a la planta, orgánulo, célula usado de acuerdo con el procedimiento como se describe en el presente documento, excepto que las moléculas de ácido nucleico o el producto génico codificado por las mismas se cambia, modula o modifica de acuerdo con el procedimiento de la invención.

El término “expresión” o “expresión génica” es como se define en el presente documento, preferentemente resulta en la aparición de un rasgo fenotípico como una consecuencia de la transcripción de un gen o genes específicos.

El aumento se refiere a la actividad de las cantidades del polipéptido en una célula, un tejido, un orgánulo, un órgano

o un organismo o una parte de los mismos, preferentemente a al menos 5 %, preferentemente al menos 10 % o al menos 15 %, especialmente preferentemente al menos 20 %, 25 %, 30 % o más, muy especialmente preferentemente es al menos 40 %, 50 % o 60 %, más preferentemente es al menos 70 % o más en comparación con el control, referencia o tipo silvestre.

La expresión “rendimiento aumentado” como se define en el presente documento se considera que significa un aumento en biomasa (peso) de una o más partes de una planta, que puede incluir las partes sobre la superficie (cosechables) y/o partes (cosechables) por debajo de la superficie. En una realización preferida, el rendimiento aumentado es rendimiento de semilla aumentado.

Por lo tanto, dichas partes cosechables son preferentemente semillas, y la realización de los procedimientos de la invención da como resultado plantas que tienen rendimiento de semilla aumentado con respecto al rendimiento de semilla de las plantas de control.

Un aumento en el rendimiento de semilla también puede manifestarse como un aumento del tamaño de la semilla y/o del volumen de la semilla, que también puede influir en la composición de las semillas (incluyendo contenido y composición total de aceite, proteína y carbohidrato).

Tomando el maíz como un ejemplo, un aumento en el rendimiento puede manifestarse como uno o más de los siguientes: aumento en el número de plantas por metro cuadrado, un aumento en el número de espigas por planta, un aumento en el número de filas, número de granos por fila, peso de grano, peso de mil granos, longitud/diámetro de espiga, aumento en el índice de llenado de semilla (que es el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas y multiplicado por 100), entre otros. Tomando el arroz como un ejemplo, un aumento en el rendimiento puede manifestarse como un aumento en uno o más de los siguientes: número de plantas por metro cuadrado, número de panículas por planta, número de espiguillas por panícula, número de flores (floretes) por panícula (que se expresa como una proporción del número de semillas llenas dividido entre el número de panículas primarias), aumento en el índice de llenado de semilla (que es el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas y multiplicado por 100), aumento en peso de mil granos, entre otros. Un aumento en el rendimiento también puede ser resultado de arquitectura modificada o puede ocurrir como un resultado de arquitectura modificada.

De acuerdo con la memoria descriptiva, la realización de los procedimientos de la invención puede dar como resultado plantas que tienen un rendimiento aumentado, particularmente producción de la semilla. Por lo tanto, de

acuerdo con la presente memoria descriptiva, se proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento de una planta, cuyo procedimiento comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica el polipéptido AZ o un homólogo del mismo.

Dado que las plantas transgénicas como se describe en el presente documento tienen rendimiento aumentado, es probable que estas plantas presenten una tasa de crecimiento aumentada (durante al menos parte de su ciclo de vida), con respecto a la tasa de crecimiento de plantas de control en una etapa correspondiente en su ciclo de vida. La tasa de crecimiento aumentada puede ser específica a una o más partes de una planta (incluyendo semillas), o puede ser sustancialmente en toda la planta. Las plantas que tienen una tasa de crecimiento aumentada pueden tener un ciclo de vida más corto. El ciclo de vida de una planta puede significar el tiempo necesario para crecer a partir de una semilla madura seca hasta la etapa en la que la planta ha producido semillas maduras secas, similar al material de partida. Este ciclo de vida puede estar influenciado por factores tales como vigor temprano, tasa de crecimiento, índice de verdor, tiempo de floración y velocidad de la maduración de semilla. El aumento en la tasa de crecimiento puede tener lugar en una o más etapas en el ciclo de vida de una planta o durante sustancialmente el ciclo de vida completo de la planta. Una tasa de crecimiento aumentada durante las etapas tempranas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar un vigor potenciado. El aumento en la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de la cosecha de una planta lo que permite que las plantas se siembren más tarde y/o se cosechen más pronto de lo que de otra manera sería posible (puede obtenerse un efecto similar con el tiempo de floración más temprano). Si la tasa de crecimiento se aumenta suficientemente, puede permitir la siembra adicional de semillas de la misma especie de la planta (por ejemplo siembra y cosecha de plantas de arroz seguido de siembra y cosecha de plantas de arroz adicionales todas dentro de un periodo de crecimiento convencional). De manera similar, si la tasa de crecimiento se aumenta suficientemente, puede permitir la siembra adicional de semillas de diferentes especies de plantas (por ejemplo, la siembra y cosecha de plantas de maíz seguido de, por ejemplo, la siembra y cosecha opcional de plantas de soja, patata o cualquier otra planta adecuada). Los tiempos de cosecha adicionales del mismo rizoma en el caso de algunas plantas de cultivo también pueden ser posible. Alterar el ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un aumento en producción de biomasa anual por metro cuadrado (debido a un aumento en el número de tiempos (dicho en un año) que se puede cultivar y cosechar cualquier planta particular). Un aumento en la tasa de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que sus homólogos de tipo silvestre, debido a las limitaciones territoriales para cosechar un cultivo a menudo se determinan por condiciones ambientales adversas en el momento de plantar (estación temprana) o en el momento de cosechar (estación tardía). Dichas condiciones adversas pueden evitarse si se acorta el ciclo de cosecha. La tasa de crecimiento puede determinarse derivando diversos parámetros de curvas de crecimiento, dichos parámetros pueden ser: T-Medio (el tiempo que tarda una planta en alcanzar el 50 % de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que tarda una planta en alcanzar el 90 % de su tamaño de máximo), entre otros.

De acuerdo con una característica preferida de la presente memoria descriptiva, la realización de los procedimientos de la invención proporciona plantas que tienen una tasa de crecimiento aumentada o rendimiento aumentado en comparación con plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente memoria descriptiva, se proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento y/o la tasa de crecimiento en plantas, cuyo procedimiento comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica el polipéptido AZ o un homólogo del mismo.

Un aumento en el rendimiento y/o tasa de crecimiento se produce cuando la planta está en condiciones de cero estrés o cuando la planta está expuesta a diversos tipos de estrés en comparación con las plantas de control. Típicamente las plantas responden a exposición frente al estrés creciendo más lentamente. En condiciones de estrés intenso, la planta puede incluso detener por completo el crecimiento. Por otro lado, estrés leve se define en el presente documento como cualquier estrés al que se expone una planta que no da como resultado el cese total del crecimiento de la planta sin la capacidad de reanudar el crecimiento. El estrés leve, como se describe en el presente documento, conduce a una reducción en el crecimiento de la planta estresada de menos de 40 %, 35 % o 30 %, preferentemente menos del 25 %, 20 % o 15 %, más preferentemente menos del 14 %, 13 %, 12 %, 11 % o 10% o menos en comparación con la planta de control en condiciones de cero estrés. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (riego, fertilización, tratamientos con pesticidas) las formas de estrés intenso no se encuentran frecuentemente en plantas cultivadas. Como una consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por estrés leve es a menudo una característica indeseable para la agricultura. El estrés leve es un estrés biótico y/o abiótico (ambiental) al cual está expuesta la planta. El estrés abiótico puede deberse a sequía o a exceso de agua, estrés anaeróbico, estrés salino, toxicidad química, estrés oxidativo y temperaturas altas, frías o heladas. El estrés abiótico puede ser un estrés osmótico provocado por estrés al agua (particularmente debido a sequía), estrés salino, estrés oxidativo y un estrés iónico. El estrés biótico es típicamente aquel estrés provocado por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos e insectos.

En particular, los procedimientos descritos en el presente documento pueden realizarse en condiciones de cero estrés o en condiciones de sequía leve para dar plantas con un rendimiento aumentado con relación a plantas de control. Como describen Wang y col. (Planta (2003) 218: 1-14), el estrés abiótico conduce a una serie de cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos o moleculares que afectan adversamente al crecimiento de las plantas y a su productividad. Se sabe que la sequía, salinidad, temperaturas extremas y el estrés oxidativo se interconectan y que pueden inducir daño celular y en el crecimiento a través de mecanismos similares. Rabbani y col. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) describen un grado particularmente alto de “interferencia” entre estrés por sequía y estrés por alta salinidad. Por ejemplo, la sequía y/o salinización se manifiestan principalmente como estrés osmótico, que produce la interrupción de homeostasis y distribución de iones en la célula. El estrés oxidativo, que frecuentemente acompañada alta o baja temperatura, estrés por salinidad o sequía, puede producir desnaturalización de las proteínas funcionales y estructurales. Como una consecuencia, este diverso estrés ambiental a menudo activa rutas de señalización celular y respuestas celulares similares, tales como la producción de proteínas de estrés, regulación

5 por aumento de antioxidantes, acumulación de solutos compatibles y paralización del crecimiento. La expresión condiciones de “no estrés”, como se usa en el presente documento, son aquellas condiciones ambientales que no imponen estrés a las plantas, tales como diversos tipos de estrés descritos anteriormente. Las condiciones de no estrés permiten el crecimiento óptimo de las plantas. Los expertos en la técnica son conscientes de las condiciones normales en el suelo y de las condiciones climáticas en una localización determinada.

10 La realización de los procedimientos como se describe en el presente documento da lugar a plantas cultivadas en condiciones de cero estrés o en condiciones de sequía leve de rendimiento aumentado con respecto a plantas de control que crecen en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente memoria descriptiva, se proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento en plantas que crecen en condiciones de cero estrés o en condiciones de sequía leve, cuyo procedimiento comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido

15 nucleico que codifica un polipéptido AZ.

Como se describe en el presente documento, el aumento del rendimiento y/o tasa de crecimiento se produce de acuerdo con los procedimientos de la presente memoria descriptiva en condiciones de cero estrés.

La realización de los procedimientos como se describe en el presente documento da lugar a plantas que crecen en condiciones de déficit de nutrientes, particularmente en condiciones de déficit de nitrógeno, rendimiento aumentado 20 con respecto a plantas de control que se cultivan en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente memoria descriptiva, se proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento en plantas que se cultivan en condiciones de déficit de nutrientes, cuyo procedimiento comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido AZ. El déficit de nutrientes puede resultar de una carencia de nutrientes, tales como nitrógeno, fosfatos y otros compuestos que contienen fósforo, potasio, calcio, cadmio,

25 magnesio, manganeso, hierro y boro, entre otros.

Los procedimientos como se describe en el presente documento son ventajosamente aplicables a cualquier planta. Las características de cultivo mencionadas anteriormente pueden modificarse ventajosamente en cualquier planta. Las plantas que son particularmente útiles en los procedimientos descritos en el presente documento incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas 30 que incluyen forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos. Como se describe en el presente documento, la planta es una planta de cultivo. Ejemplos de plantas de cultivo incluyen soja, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, patata y tabaco. Adicionalmente de modo preferente, la planta es una planta monocotiledónea. Ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen caña de azúcar. Más preferentemente la planta es un cereal. Ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno,

35 triticale, sorgo y avena.

Otras plantas ventajosas se seleccionan del grupo que consiste en Asteraceae, tal como los géneros Helianthus, Tagetes, por el ejemplo las especies Helianthus annuus [girasol], Tagetes lucida, Tagetes erecta o Tagetes tenuifolia [caléndula]; Brassicaceae tal como el género Brassica, por ejemplo las especies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza, nabo]; Fabaceae tal como el género Glycine por ejemplo las especies Glycine max, Soja hispida o 40 Soja max [soja]; Linaceae tal como el género Linum, por ejemplo las especies Linum usitatissimum, [lino, linaza]; Poaceae tal como los géneros Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Oryza, Zea, Triticum por ejemplo las especies Hordeum vulgare [cebada], Secale cereale [centeno], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [avena], Sorghum bicolour [sorgo, mijo], Oryza sativa, Oryza latifolia [arroz], Zea mays [mazorca, maíz] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum

45 sativum o Triticum vulgare [trigo, trigo harinero, trigo común]; Solanaceae tal como los géneros Solanum, Lycopersicon por ejemplo las especies Solanum tuberosum [patata], Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum [tomate].

La expresión “polipéptido AtAZ o un homólogo del mismo” como se define en el presente documento se refiere a proteínas que comprenden al menos una repetición de anquirina y al menos un dominio C3H1 de dedo de Cinc, 50 cuya repetición de anquirina se localiza cadena arriba del dominio C3H1. Preferentemente, la proteína AZ comprende dos repeticiones de anquirina y dos dominios C3H1 de dedo de Cinc, tal como en la proteína representada en la SEC ID Nº: 2. Además preferentemente, las dos repeticiones de anquirina se localizan próximas entre sí. Preferentemente de manera adicional, los dominios C3H1 de dedo de Cinc también se localizan próximos entre sí y en el extremo C de las repeticiones de anquirina. En la SEC ID Nº: 2, las repeticiones de anquirina se

55 localizan en las posiciones D90 a R120 y D125 a L157, los dos dominios de dedo de Cn se localizan en las posiciones H301 a V327 y Q336 a P359 (Figura 1).

También preferentemente, la proteína AtAZ comprende al menos una de las siguientes secuencias consenso:

(P/A)CSRAY(S/T)HDWTEC (motivo 1, SEC ID Nº: 3)

HPGENARRRDPR (motivo 2, SEC ID Nº: 4)

HG(V/I)FE(C/S)WLHP(A/S)QY(R/K)TRLCK (motivo 3, SEC ID Nº: 5)

CFFAH (motivo 4, SEC ID Nº: 6) Preferentemente el motivo 1 es PCSRAYSHDWTEC, y el motivo 3 es preferentemente HGVFECWLHPAQYRTRLCK.

Más preferentemente, la proteína AtAZ comprende dos de los motivos mencionados anteriormente, especialmente de modo preferente 3 de los motivos mencionados anteriormente, más preferentemente los cuatro motivos.

La repetición de anquirina (SMART SM00248, Interpro IPR002110), como se describe en la base de datos Interpro, es uno de los motivos de interacción proteína-proteína más habituales en la naturaleza. Las repeticiones de anquirina son moléculas repetidas (normalmente en tándem) normalmente de aproximadamente 33 aminoácidos. Se producen en una gran cantidad de proteínas funcionalmente diversas principalmente de eucariotas. Los pocos ejemplos conocidos de procariotas y virus pueden ser el resultado de transferencias génicas horizontales. La repetición se ha encontrado en proteínas de diversa función tales como iniciadores transcripcionales, reguladores del ciclo celular, transportadores citoesqueléticos, iónicos y transductores de señales. El pliegue de anquirina parece definirse por su estructura en lugar de por su función ya que no reconoce universalmente ninguna secuencia o estructura específica. El plegamiento conservado de la unidad de repetición de anquirina se conoce a partir de diversas estructuras cristalinas y en solución. Cada repetición se pliega en una estructura de hélice-bucle-hélice con una región beta-horquilla/bucle que se proyecta fuera de las hélices a un ángulo de 90º. Las repeticiones se apilan a la vez para formar una estructura en forma de L.

Se piensa que el dominio de dedo de Cinc ZnF_C3H1 (también conocido como Znf_CCCH, SMART SM00356; Interpro IPR000571), como se describe en la base de datos Interpro, está implicado en la unión a ADN. Los dedos de Cinc existen como tipos diferentes, dependiendo de las posiciones de los restos de cisteína. Las proteínas que contienen dominios de dedo de Cinc del tipo C-x8-C-x5-C-x3-H (representando x en el presente documento cualquier aminoácido y los dígitos 8, 5 y 3 el número de aminoácidos entre los restos C o H conservados) incluyen proteínas de dedo de cinc de eucariotas implicadas en el ciclo celular o regulación relacionada con la fase de crecimiento, por ejemplo TIS11B humano (factor 1 de respuesta a butirato), una probable proteína reguladora implicada en la regulación de la respuesta a factores de crecimiento, y la proteína nuclear inducible por el factor de crecimiento TTP de ratón, que tiene la misma función. La proteína TTP de ratón está inducida por factores de crecimiento. Otra proteína que contiene este dominio es la subunidad de 35 Kd del factor de corte y empalme humano U2AF, que desempeña una función crítica en el corte y empalme dependiente de potenciador y constitutivo mediando interacciones proteína-proteína esenciales e interacciones proteína-ARN necesarias para la selección en el sitio de corte y empalme 3’. Se ha observado que diferentes proteínas de dedo de Cinc CCCH interaccionan con la región no traducida 3’ de diversos ARNm. Es muy frecuente que este tipo de dedo cinc esté presente en dos copias.

La Figura 2 describe las secuencias consenso como se definen en la base de datos SMART para el dominio de anquirina y el dominio de dedo de cinc; sin embargo debe observarse que estas secuencias consenso podrían estar sesgadas hacia secuencias de proteínas animales.

Los términos “domino” y “motivo” se definen en la sección “definiciones” del presente documento. Existen bases de datos especialistas para la identificación de dominios. El dominio C3H1 o de anquirina en una proteína AZ puede identificarse usando, por ejemplo, SMART (Schultz y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic y col. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder y col., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher y Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., págs. 53-61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo y col., Nucl. Acids. Res. 32: D134-D137, (2004)) or Pfam (Bateman y col., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002)) o Pfam (Bateman y col., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002)). En el servidor proteómico ExPASY se encuentra disponible un conjunto de herramientas para análisis por ordenador de las secuencias de proteína (proporcionado por el Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger y col., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788(2003)). La secuencia de la proteína AZ se analizó con la herramienta SMART (versión 4.1; Schultz y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic y col. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244) y se usó para seleccionar la base de datos Pfam (Versión 17.0, marzo de 2005; Bateman y col. (2004) Nucl. Acids Res. 32, D138-141) e InterPro (Release 11.0, 26 de julio de 2005; Mulder y col. (2005) Nucl. Acids. Res. 33, D201-205).

Alineando otras secuencias de proteína con la SEC ID Nº: 2, las secuencias consenso correspondientes, el dominio C3H1, el dominio de anquirina u otros motivos de secuencia pueden identificarse fácilmente. De este modo, los polipéptidos AZ u homólogos de los mismos (que incluyen ortólogos y parálogos) pueden identificarse fácilmente, utilizando técnicas rutinarias bien conocidas en la técnica, tal como mediante alineamiento de secuencias. Los procedimientos para el alineamiento de las secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica, dichos procedimientos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar el alineamiento de las dos secuencias que maximizan el número de emparejamientos y minimiza el número de espacios. El algoritmo BLAST (Altschul y col. (1990) J Mol Biol

215: 403-10) calcula el porcentaje de identidad de secuencia y desarrolla un análisis estadístico de la similitud entre

las dos secuencias. El programa informático para realizar el análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Centre for Biotechnology Information. Los homólogos pueden identificarse fácilmente utilizando, por ejemplo, el algoritmo de alineamiento de secuencia múltiple ClustaIW (versión 1.83), con los parámetros de alineamiento por pares predeterminados, y un procedimiento de clasificación en porcentaje. Los porcentajes globales de similitud e identidad también pueden determinarse utilizando uno de los procedimientos disponibles en el paquete informático MatGAT (Campanella y col., BMC Bioinformatics. 10 de julio, 2003; 4: 29. MatGAT: una aplicación que genera matrices de similitud/identidad utilizando las secuencias de ADN o proteína.). Puede realizarse edición manual menor para optimizar el alineamiento entre los motivos conservados, como sería obvio para un experto en la técnica. Adicionalmente, en lugar de utilizar las secuencias de longitud completa para la identificación de homólogos, también pueden utilizarse dominios específicos (tal como el dominio C3H1 o de anquirina o uno de los motivos definidos anteriormente). Los valores de identidad de secuencia, que se indican adelante como un porcentaje, se determinaron sobre el dominio conservado o sobre la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos completa utilizando los programas mencionados anteriormente utilizando parámetros predeterminados.

En la Tabla 1 del Ejemplo 1 se proporcionan ejemplos de proteínas AZ u homólogos de los mismas.

Las secuencias que se encuentran bajo la definición de “polipéptido AZ u homólogo del mismo” como se define en la reivindicación 1 y preferentemente comprenden también al menos una de las secuencias consenso de las SEC ID Nos: 3, 4, 5 o 6 como se define anteriormente, pueden ser adecuadas para su uso en los procedimientos de la invención. Preferentemente, el polipéptido es un polipéptido de Arabidopsis thaliana.

En el término “homólogos” se incluyen las secuencias ortólogas y las secuencias parálogas. Ortólogos y parálogos pueden encontrarse realizando una búsqueda BLAST denominada recíproca. Esta puede realizarse mediante un primer BLAST que implica una secuencia de consulta BLASTing (por ejemplo, SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 2) contra cualquier base de datos de secuencia, tal como la base de datos NCBI públicamente disponible. BLASTN o TBLASTX (utilizando valores predeterminados convencionales) pueden utilizarse cuando se parte de una secuencia de nucleótidos, y BLASTP o TBLASTN (usando valores predeterminados convencionales) pueden usarse cuando se parte de una secuencia de proteína. Los resultados BLAST pueden filtrarse opcionalmente. Las secuencias de longitud completa de los resultados filtrados o no filtrados vuelven después a buscarse con BLAST (segundo BLAST) contra las secuencias del organismo del cual deriva la secuencia de consulta (donde la secuencia de consulta es la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 2, por lo que el segundo BLAST se realizaría contra las secuencias de Arabidopsis). Despues se comparan los resultados del primer y segundo BLAST. Se identifica un parálogo si un acierto de alta clasificación del segundo BLAST es de la misma especie de la que deriva la secuencia de consulta; un ortólogo se identifica si un acierto de alta clasificación no es de la misma especie del que deriva la de secuencia de consulta. Los ortólogos preferidos son los ortólogos de la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 2. Los aciertos de alta clasificación son aquellos que tienen un valor E bajo. Cuanto menor es el valor E, más significativa la clasificación (o en otras palabras menor es la probabilidad de que se encuentre el acierto casualmente). El cálculo del valor E es bien conocido en la técnica. Además de los valores E, las comparaciones también se clasifican mediante el porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere al número de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptido) sobre una longitud particular. Preferentemente, la puntuación es mayor de 50, más preferentemente mayor de 100; y preferentemente el valor E es menor de e-5, más preferentemente menor de e-6. En el caso de grandes familias, puede usarse ClustaIW, seguido de la generación de un árbol de unión del vecino más próximo para ayudar a visualizar el agrupamiento de los genes relacionados y para identificar los ortólogos y parálogos. Ejemplos de secuencias ortólogas a la SEC ID Nº: 2 incluyen la SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 15 y SEC ID Nº: 17. La SEC ID Nº: 19 es un ejemplo de un parálogo de la SEC ID Nº: 2.

La memoria descriptiva describe proteínas de AZ que tienen, además de al menos una repetición de anquirina y al menos un dominio C3H1, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 26 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la proteína de SEC ID Nº: 2. La matriz mostrada en la Figura 3 (Matriz A) muestra similitudes e identidades (en negrita) sobre la longitud completa de diversas proteínas AZ. En caso de comparar solo dominios específicos, la identidad o similitud puede ser mayor entre las proteínas diferentes (Matriz B: comparación de una secuencia con dominio de dedo de Cn).

Puede realizarse un ensayo para determinar la actividad AZ. La actividad de unión a ADN e interacciones proteínaproteína pueden determinarse fácilmente in vitro o in vivo usando técnicas bien conocidas en el campo. Ejemplos de ensayos in vitro para la actividad de unión a ADN incluyen: análisis de retraso en gel o análisis de un híbrido en levadura. Un ejemplo de un ensayo in vitro para interacciones proteína-proteína es el análisis de doble híbrido en levadura (Fields y Song (1989) Nature 340: 245-6).

Además, como se describe en el presente documento, la expresión en plantas de la proteína AZ o de un homólogo de la misma, y en particular en arroz, tiene el efecto de aumentar el rendimiento de la planta transgénica cuando se compara con plantas de tipo silvestre correspondientes, donde el rendimiento aumentado comprende al menos uno de: peso total de semillas, número total de semillas y número de semillas llenas.

Un polipéptido de AZ u homólogo del mismo, como se define en el presente documento, está codificado por un ácido nucleico/gen AZ. Por lo tanto, la expresión “ácido nucleico/gen AZ” como se define en el presente documento, es cualquier ácido nucleico/gen que codifica un polipéptido AZ o un homólogo del mismo como se define anteriormente. Los ejemplos de ácidos nucleicos AZ incluyen, pero sin limitación, los representados en la Tabla A del Ejemplo 1. Los ácidos nucleicos/genes AZ y variantes de los mismos pueden ser adecuados en la realización práctica de los

5 procedimientos descritos en el presente documento. Preferentemente, las variantes de un gen AZ originado de Arabidopsis thaliana. Los ácidos nucleicos/genes de AZ variantes incluyen partes de un ácido nucleico/gen AZ, variantes de cortes y empalme, variantes alélicas y/o ácidos nucleicos que pueden hibridarse con un ácido nucleico/gen AZ.

En el presente documento la referencia a una “secuencia de ácidos nucleicos” se considera que significa una forma

10 polimérica de un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido de cualquier longitud, mono o bicatenario o análogos del mismo, que tiene la característica esencial de un ribonucleótido natural en que puede hibridarse con secuencias de ácidos nucleicos de una manera similar a polinucleótidos de origen natural.

El término porción, como se describe en el presente documento, se refiere a un segmento de ADN que codifica un polipéptido que comprende al menos una repetición de anquirina y al menos un dominio de dedo Zn C3H1. Una 15 porción puede prepararse, por ejemplo, realizando una o más deleciones en un ácido nucleico AZ. Las porciones pueden usarse en forma aislada o pueden fusionarse con otras secuencias codificantes (o no codificantes) para, por ejemplo, producir una proteína que combine varias actividades. Cuando se fusiona con otras secuencias codificantes, el polipéptido resultante producido después de la traducción puede ser más grande que el esperado para el fragmento AZ. La porción tiene típicamente al menos 500, 700 o 900 nucleótidos de longitud, 20 preferentemente al menos 1100, 1300 o 1500 nucleótidos de longitud, más preferentemente al menos 1700, 1900 o 2100 nucleótidos de longitud y más preferentemente al menos 2300 o 2400 nucleótidos de longitud. Preferentemente, la porción es una porción de un ácido nucleico como se representa en la Tabla A del Ejemplo 1. Más preferentemente, la porción de un ácido nucleico AZ es como se representa en la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº:

53.

25 Las expresiones “fragmento”, “fragmento de una secuencia” o “parte de una secuencia”, “porción” o “porción de la misma” significa una secuencia truncada de la secuencia original a la que se hace referencia. La secuencia truncada (secuencia de ácidos nucleicos o proteínas) puede variar ampliamente en longitud; siendo el tamaño mínimo una secuencia de suficiente tamaño para proporcionar una secuencia con al menos una función y/o actividad comparable de la secuencia original a la que se hace referencia o que se hibrida, en condiciones rigurosas, con la molécula de

30 ácido nucleico como se describe en el presente documento o se usa en el procedimiento como se describe en el presente documento, aunque que el tamaño máximo no es crítico. En algunas aplicaciones, normalmente el tamaño máximo no es sustancialmente mayor que el necesario para proporcionar la actividad y/o función (o funciones) deseadas de la secuencia original. Una función comparable significa al menos 40 %, 45 % o 50 %, preferentemente al menos 60 %, 70 %, 80 % o 90 % o más de la función de la secuencia original.

35 Otra variante de un ácido nucleico/gen AZ como se define en el presente documento es un ácido nucleico que puede hibridarse en condiciones de rigurosidad reducida, preferentemente en condiciones rigurosas, con un ácido nucleico/gen AZ como se ha definido en el presente documento anteriormente o con una porción como se ha definido en el presente documento anteriormente. La secuencia de hibridación tiene típicamente al menos 300 nucleótidos de longitud, preferentemente al menos 400 nucleótidos de longitud, más preferentemente al menos 500

40 nucleótidos de longitud y más preferentemente al menos 600 nucleótidos de longitud.

Preferentemente, la secuencia de hibridación es una que puede hibridarse con un ácido nucleico como se representa por la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 32, SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 42 o SEC ID Nº: 53 o con una porción de cualquiera 45 de las secuencias mencionadas anteriormente, una porción como se ha definido anteriormente. Más preferentemente, la secuencia de hibridación puede hibridarse con la SEC ID Nº: 1, con la SEC ID Nº: 53 o con porciones (o sondas) de las mismas. En la técnica se conocen bien procedimientos para diseñar sondas. Las sondas tienen generalmente una longitud menor de 1000 pb, 900 pb, 800 pb, 700 pb, 600 pb, preferentemente menor de 500 pb, 400 pb, 300 pb 200 pb o 100 pb. Normalmente, las longitudes de sonda para hibridaciones de ADN-ADN, tal

50 como transferencia de Southern, varían entre 100 y 500 pb, mientras que la región de hibridación en sondas para hibridaciones de ADN-ADN, tales como en amplificación por PCR, generalmente son más cortas que 50 pero más largas que 10 nucleótidos, preferentemente tienen una longitud de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 pb.

Son también útiles en los procedimientos de la invención, ácidos nucleicos que codifican homólogos (incluyendo ortólogos o parálogos) de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 o derivados de la misma.

55 Otra variante de ácido nucleico útil en los procedimientos descritos en el presente documento es una variante de corte y empalme que codifica un polipéptido AZ como se define anteriormente. Como se describe en el presente documento las variantes de corte y empalme son variantes de corte y empalme del ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende al menos una repetición de anquirina y al menos un dominio C3H1. Preferentemente, el polipéptido AZ o el homólogo del mismo codificado por la variante de corte y empalme tiene una identidad de

60 secuencia al menos 26 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con la SEC ID Nº: 2. Adicionalmente, la memoria descriptiva describe variantes de corte y empalme representadas por los ácidos nucleicos representados en la Tabla A del Ejemplo 1. Por ejemplo, la SEC ID Nº: 25 y SEC ID Nº: 47 están codificadas por variantes de corte y empalme del mismo gen. Por ejemplo la variante de corte y empalme representada por la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 53.

5 Otra variante de ácido nucleico útil en los procedimientos descritos en el presente documento es una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido AZ como se define anteriormente. Preferentemente, el polipéptido codificado por la variante alélica está representado por las secuencias polipeptídicas indicadas en la Tabla A del Ejemplo 1. Más preferentemente, la variante alélica que codifica AZ se representa por la SEC ID Nº: 1.

Una variante de ácido nucleico adicional útil en los procedimientos descritos en el presente documento es una

10 variante de ácido nucleico obtenida por combinación de genes. Además, puede usarse mutagénesis dirigida a sitio para generar variantes de ácidos nucleicos AZ. Se dispone de diversos procedimientos para realizar mutagénesis dirigida a sitio; siendo los más habituales los procedimientos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).

Por lo tanto, la memoria descriptiva describe un procedimiento para aumentar el rendimiento y/o la tasa de

15 crecimiento de una planta, que comprende modular la expresión en una planta de una variante de un ácido nucleico AZ seleccionado entre:

(i): una porción de un ácido nucleico AZ;

(ii): un ácido nucleico que se hibrida con un ácido nucleico AZ;

(iii) una variante de corte y empalme de un ácido nucleico que codifica un polipéptido AZ; y 20 (iv) una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido AZ; y

(v) una variante de ácido nucleico que codifica un polipéptido AZ obtenida por combinación de genes o mutagénesis dirigida a sitio.

El ácido nucleico AZ o variante del mismo, como se define en el presente documento, puede derivar de cualquier fuente natural o artificial. Este ácido nucleico puede modificarse de su forma nativa en composición y/o en medio 25 genómico a través de manipulación humana deliberada. El ácido nucleico es preferentemente de origen vegetal, adicionalmente preferentemente de una especie dicotiledónea, más preferentemente de la familia Brassicaceae, más preferentemente de Arabidopsis thaliana. Más preferentemente, el ácido nucleico AZ es la secuencia de Arabidopsis thaliana representada por la SEC ID Nº: 1, y la secuencia de aminoácidos AZ es como se representa en la SEC ID Nº 47. Como alternativa, el ácido nucleico AZ representado por la SEC ID Nº: 53 o la secuencia de

30 aminoácidos AZ como se representa por la SEC ID Nº: 47 también puede ser útil en los procedimientos de la presente invención.

Por lo tanto, cualquier referencia en el presente documento a un polipéptido AZ se entiende que se refiere a una proteína AZ como se define anteriormente. Cualquier ácido nucleico que codifique dicha proteína AZ es adecuado para su uso en los procedimientos como se describe en el presente documento.

35 De acuerdo con la presente memoria descriptiva, se contempla la expresión modulada, preferentemente aumentada, del ácido nucleico AZ o variante del mismo. Procedimientos para aumentar la expresión de genes o productos génicos están bien documentados en la técnica. La expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de AZ puede modularse introduciendo una modificación genética, que puede introducirse, por ejemplo, mediante cualquiera de uno (o más) de los siguientes procedimientos: activación de ADN-T, TILLING, mutagénesis

40 dirigida a sitio, evolución dirigida y recombinación homóloga o introduciendo y expresando en una planta un ácido nucleico que codifique un polipéptido AZ o un homólogo del mismo. Después de la introducción de la modificación genética, viene una etapa de selección para la expresión modificada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido AZ o un homólogo del mismo, cuya modificación en la expresión da lugar a plantas con rendimiento aumentado. En la técnica también se conocen procedimientos para disminuir la expresión de genes o productos génicos.

45 La activación de ADN-T se describe anteriormente. En el locus de un gen AZ también puede introducirse una modificación genética usando la técnica de TILLING (Inducción Dirigida de Lesiones Locales en el Genoma). El locus de un gen, como se define en el presente documento, se entiende que se refiere a una región genómica, que incluye el gen de interés y 10 kb cadena arriba o cadena abajo de la región codificante. Puede usarse mutagénesis dirigida a sitio para generar variantes de ácidos nucleicos AZ. Se dispone de diversos procedimientos para realizar

50 mutagénesis dirigida a sitio; siendo los más comunes los procedimientos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.). De acuerdo con la presente memoria descriptiva puede aplicarse recombinación homóloga.

La memoria descriptiva describe un procedimiento para introducir una modificación genética que consiste en introducir y expresar, en una planta, un ácido nucleico que codifica un polipéptido AZ o un homólogo del mismo

55 como se define anteriormente. El ácido nucleico a introducir en una planta puede ser un ácido nucleico de longitud completa o puede ser una porción o una secuencia de hibridación como se ha definido anteriormente en el presente documento.

Adicionalmente, la memoria descriptiva describe construcciones genéticas y vectores para facilitar la introducción y/o

expresión de las secuencias de nucleótidos útiles en los procedimientos como se describe en el presente documento.

Por lo tanto, se describe una construcción génica que comprende:

(i): un ácido nucleico AZ o variante del mismo como se define anteriormente en el presente documento;

(ii): una o más secuencias de control unidas operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos de (i);

En los procedimientos, como se describe en el presente documento, pueden crearse construcciones útiles utilizando tecnología de ADN recombinante bien conocida por los expertos en la técnica. Las construcciones génicas pueden insertarse en vectores, que pueden adquirirse en el comercio, adecuados para la transformación en plantas y adecuados para la expresión del gen de interés en las células transformadas. Por lo tanto, la memoria descriptiva describe el uso de una construcción génica, como se ha definido anteriormente en el presente documento, en los procedimientos como se describe en el presente documento.

Las plantas se transforman con un vector que comprende la secuencia de interés (es decir, un ácido nucleico que codifica un polipéptido AZ u homólogo del mismo). El experto es consciente de los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector para realizar satisfactoriamente la transformación, selección y propagación de células hospedadoras que contienen la secuencia de interés. La secuencia de interés está unida operativamente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor). Las expresiones “elemento regulador”, “secuencia de control” y “promotor” se han definido anteriormente. Ventajosamente, puede utilizarse cualquier tipo de promotor para dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos.

Generalmente se conocen promotores adecuados, que son funcionales en plantas. Estos pueden tener forma de promotores constitutivos o inducibles. Promotores adecuados pueden permitir la expresión específica de desarrollo y/o tejido en eucariotas multicelulares; por tanto, promotores específicos de hoja, raíz, flor, semilla, estroma, tubérculo o fruta pueden usarse ventajosamente en plantas.

Diferentes promotores de plantas que pueden usarse en plantas son promotores tales como, por ejemplo, el promotor USP, LegB4, CD3 o el promotor de ubiquitina de perejil.

Un promotor “de planta” comprende elementos reguladores, que median la expresión de un segmento de secuencia codificante en células de plantas. Por consiguiente, un promotor de planta no necesariamente es de origen vegetal, sino que puede originarse de virus o microorganismos, en particular, por ejemplo, de virus que atacan a células de plantas.

El promotor “de planta” también puede originarse una célula de planta, por ejemplo, de la planta que se transforma con la secuencia de ácido nucleico a expresar en el proceso de la invención y como se describe en el presente documento. Esto también se aplica a las otras señales reguladores “de plantas”, por ejemplo en terminadores “de plantas”.

Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico debe, como se ha descrito anteriormente, estar unida operativamente a o comprender un promotor adecuado que exprese el gen en el momento temporal correcto y de una manera específica de célula o de tejido. Son promotores útiles los promotores constitutivos (Benfey y col., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), tales como los que se originan de virus de plantas, tal como 35S CAMV (Franck y col., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (véanse también los documentos US 5352605 y WO 84/02913), 34S FMV (Sanger y col., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443), el promotor de ubiquitina de perejil, o promotores de plantas tales como el promotor de la subunidad pequeña de Rubisco descrito en el documento US 4.962.028 o los promotores PRP1 de plantas [Ward y col., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, PGEL1, OCS [Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553-2557], lib4, usp, mas [Comai (1990) Plant Mol Biol 15 (3): 373-381], STLS1, ScBV (Schenk (1999) Plant Mol Biol 39(6): 1221-1230), B33, SAD1 o SAD2 (promotores de lino, Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696-1701) o nos [Shaw y col. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831-7846]. Ejemplos adicionales de promotores constitutivos de plantas son los promotores ATPasa-V de la remolacha azucarera (documento WO 01/14572). Ejemplos de promotores constitutivos sintéticos son el promotor Super (documento WO 95/14098) y promotores derivados de cajas G (documento WO 94/12015). Si fuera apropiado, adicionalmente también se usan promotores químicamente inducibles, compárense los documentos EP-A 388186, EP-A 335528, WO 97/06268. La expresión estable, constitutiva de las proteínas como se describe en el presente documento de una planta puede ser ventajosa. Sin embargo, la expresión inducible del polipéptido como se describe en el presente documento es ventajosa, si, por ejemplo, la expresión tardía antes de la cosecha es de ventaja, ya que la manipulación metabólica puede conducir a retrasar el crecimiento de la planta.

La expresión de genes de plantas también puede facilitarse mediante un promotor químicamente inducible. Los promotores químicamente inducibles son particularmente adecuados cuando se desea expresar el gen de una manera específica del tiempo. Son ejemplos de dichos promotores un promotor inducible por ácido salicílico (documento WO 95/19443) y un promotor inducible por ácido abscísico (documento EP 335 528), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz y col. (1992) Plant J. 2, 397-404), un promotor inducible por ciclohexanol o etanol (documento WO 93/21334) u otros como se describe en el presente documento.

Otros promotores adecuados son aquellos que reaccionan frente a condiciones de estrés biótico o abiótico, por ejemplo el promotor del gen PRP1 inducido por patógenos (Ward y col., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), el promotor hsp80 termoinducible del tomate (documento US 5.187.267), el promotor alfa-amilasa inducible por frio de la patata (documento WO 96/12814) o el promotor pinll inducible por daños (documento EP-A-0 375 091) u otros

5 como se describe en el presente documento.

En el presente documento se describen promotores en particular aquellos que efectúan expresión de genes en tejidos y órganos, en células de semilla, tales como células de endospermo y células del embrión en desarrollo. Son promotores adecuados el promotor del gen napina de colza (documento US 5.608.152), el promotor USP de Vicia faba (Baeumlein y col., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), el promotor de olesina de Arabidopsis (documento 10 WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (documento US 5.504.200), el promotor Bce4 de Brassica (documento WO 91/13980), el promotor arc5 de alubia, el promotor DcG3 de zanahoria, o el promotor B4 de Legumina (LeB4; Baeumlein y col., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9) y promotores que efectúan la expresión específica de semilla en plantas monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz y similares. Promotores específicos de semilla ventajosos son el promotor de proteína de unión a sacarosa (documento WO 15 00/26388), el promotor de faseolina y el promotor de napina. Promotores adecuados que deben tenerse en cuenta son el promotor del gen Ipt2 o Ipt1 de cebada (documentos WO 95/15389 y WO 95/23230) y los promotores descritos en el documento WO 99/16890 (promotores del gen de hordeína de cebada, del gen de glutelina de arroz, del gen de orizina de arroz, del gen de prolamina de arroz, del gen de gliadina de trigo, del gen de glutelina de trigo, del gen de zeína de maíz, del gen de glutelina de cebada, del gen de kasirina de sorgo y del gen de secalina de 20 centeno). Otros promotores adecuados son Amy32b, Amy 6-6 y Aleuraína [documento US 5.677.474], Bce4 (colza) [documento US 5.530.149], glicinina (soja) [documento EP 571 741], fosfoenolpiruvato carboxilasa (soja) [documento JP 06/62870], ADR12-2 (soja) [documento WO 98/08962], isocitrato liasa (colza) [documento US 5.689.040] o #amilasa (cebada) [documento EP 781 849]. Otros promotores que estás disponibles para la expresión de genes en plantas son los promotores específicos de hoja tales como los descritos en el documento DE-A 19644478 o

25 promotores regulados por luz tales como, por ejemplo, el promotor petE del guisante.

Otros promotores de plantas adecuados son el promotor de FBPasa citosólico o el promotor de ST-LSI de la patata Stockhaus y col., EMBO J. 8, 1989, 2445), el promotor de fosforribosil pirofosfato aminotransferasa de Glycine max (Nº de entrada GenBank U87999) o el promotor específico de nodo descrito en el documento EP-A-0 249 676.

De acuerdo con una característica preferida de la invención, el ácido nucleico AZ o variante del mismo como se

30 define en el presente documento está unido operativamente a un promotor específico de semilla. El promotor específico de semilla puede ser activo durante el desarrollo de la semilla y/o durante la germinación. Los promotores específicos de semilla son bien conocidos en la técnica. Preferentemente, el promotor específico de semilla es un promotor específico de embrión/específico de endospermo/específico de aleurona. Preferentemente además, el promotor específico de semilla conduce la expresión en al menos uno de: embrión, endospermo y aleurona. Más

35 preferentemente, el promotor es un promotor WSI18 o un promotor funcionalmente equivalente. Más preferentemente, la secuencia promotora es como se representa en la SEC ID Nº: 9 o SEC ID Nº: 55. Anteriormente se han proporcionado ejemplos de otros promotores específicos de semilla (promotores específicos de embrión/específicos de endospermo/específicos de aleurona) que también pueden usarse para dirigir la expresión de un ácido nucleico AZ.

40 De acuerdo con la memoria descriptiva, el ácido nucleico AZ o variante del mismo como se define en el presente documento está unido operativamente a un promotor constitutivo. Un promotor constitutivo es un promotor constitutivo que también se expresa sustancialmente de manera ubicua. Adicionalmente se prefiere que el promotor derive de una planta, más preferentemente de una planta monocotiledónea. Un ejemplo de dicho promotor es el promotor GOS2 del arroz (SEC ID Nº: 54 o SEC ID Nº: 56). Anteriormente se han ofrecido ejemplos de otros

45 promotores constitutivos que también pueden usarse para dirigir la expresión de un ácido nucleico AZ como se define anteriormente.

Opcionalmente, en la construcción introducida en una planta pueden usarse una o más secuencias terminadoras. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales así como traduccionales. Los expertos en la técnica serán conscientes de que pueden ser adecuadas secuencias terminadoras y potenciadoras.

50 También puede añadirse una secuencia intrónica en la región no traducida (UTR) 5’ o en la secuencia codificante para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol como se describe en la sección de definiciones. Otras secuencias de control (además de las secuencias promotoras, potenciadoras, silenciadoras, intrónicas, regiones UTR 3’ y/o UTR 5’) pueden ser elementos estabilizadores de proteína y/o ARN. Un experto en la materia conocería dichas secuencias o podría obtenerlas fácilmente.

55 Las construcciones genéticas, como se describe en el presente documento, pueden incluir adicionalmente un origen de secuencia de replicación que es necesario para la conservación y/o replicación en un tipo de célula específico.

Un ejemplo es cuando en una célula bacteriana se requiere conservar una construcción genética como un elemento genético episomal (por ejemplo, una molécula de plásmido o de cósmido). Como orígenes de replicación preferidos se incluyen, pero sin limitación, f1-ori y coIE1.

Para la detección de la transferencia satisfactoria de las secuencias de ácidos nucleicos, como se usa en los procedimientos como se describe en el presente documento y/o para la selección de plantas transgénicas que comprenden estos ácidos nucleicos, es ventajoso usar genes marcadores (o genes indicadores). Por lo tanto, la construcción genética puede comprender opcionalmente un gen marcador de selección. Los marcadores de

5 selección se describen con más detalle en la sección de “definiciones” del presente documento. Los genes marcadores pueden retirarse o escindirse de la célula transgénica cuando ya no se necesiten. En la técnica se conocen técnicas para retirar marcadores, técnicas útiles como las descritas anteriormente en la sección de definiciones.

La presente memoria descriptiva también describe plantas, partes de planta o células de planta que pueden

10 obtenerse mediante los procedimientos descritos en el presente documento. Por lo tanto, la presente memoria descriptiva describe plantas que pueden obtenerse mediante el procedimiento como se describe en el presente documento, cuyas plantas tienen en su interior un ácido nucleico AZ o una variante del mismo introducido, como se ha definido anteriormente.

La memoria descriptiva también describe un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que tienen

15 rendimiento aumentado, que comprende la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico AZ o una variante del mismo, como se ha definido anteriormente.

Las plantas huésped para los ácidos nucleicos o para el vector utilizado en el procedimiento como se describe en el presente documento, el casete de expresión o construcción o vector son, en principio, ventajosamente todas las plantas, que son capaces de sintetizar los polipéptidos utilizados en el procedimiento como se describe en el

20 presente documento.

Más específicamente, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que tienen rendimiento aumentado, cuyo procedimiento comprende:

(i): introducir y expresar en una planta o en una célula de planta un ácido nucleico AZ o una variante del mismo; y

(ii): cultivar la célula de planta en condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.

25 El ácido nucleico puede introducirse directamente en una célula de planta o en la propia planta (incluyendo la introducción en un tejido, órgano o en cualquier otra parte de una planta). De acuerdo con una característica de la presente memoria descriptiva, el ácido nucleico se introduce en una planta por transformación. Los términos “introducción” o “transformación” se describen con más detalle en la sección definiciones.

30 Generalmente después de la transformación, las células o grupos de células de planta se seleccionan para detectar la presencia de uno o más marcadores que están codificados por genes que pueden expresarse en plantas cotransferidos con el gen de interés, después de lo cual el material transformado se regenera en una planta completa.

Como se ha mencionado, también puede utilizarse Agrobacteria transformada con un vector de expresión como se describe en el presente documento, de una manera de por sí conocida, para la transformación de plantas tales como 35 plantas utilizadas como un modelo, como Arabidopsis, o plantas de cultivo, tales como cereales, maíz, avena, centeno, cebada, trigo, soja, arroz, algodón, remolacha azucarera, canola, girasol, lino, cáñamo, patata, tabaco, tomate, zanahoria, pimientos dulce, colza, tapioca, yuca, arruruz, tagetes, alfalfa, lechuga y las diversas especies de árboles, nueces y vid, en particular plantas de cultivo que contienen aceite, tales como soja, cacahuete, ricino, girasol, maíz, algodón, lino, colza, coco, palma de aceite, cártamo (Carthamus tinctorius) o grano de cacao, por

40 ejemplo introduciendo hojas laceradas o segmentos foliares en una solución agrobacteriana y posteriormente cultivándolos en medios adecuados.

Las células de planta modificadas genéticamente pueden regenerarse mediante cualquiera de los procedimientos que son familiares para el experto en la técnica. Procedimientos adecuados pueden encontrarse en las publicaciones anteriormente mencionadas de S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o Höfgen y Willmitzer.

45 Generalmente, después de la transformación, las células o los grupos de células de planta se seleccionan para detectar la presencia de uno o más marcadores que están codificados por genes que pueden expresarse en plantas co-transfectados con el gen de interés, después de lo cual el material transformado se regenera en una planta completa. Para seleccionar plantas transformadas, el material de planta obtenido en la transformación, como norma, se somete a condiciones selectivas de tal manera que las plantas transformadas pueden diferenciarse de las plantas

50 no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas de la manera descrita anteriormente pueden plantarse y, después de un periodo de crecimiento inicial, someterse a una selección adecuada por pulverización. Una posibilidad adicional consiste en cultivar las semillas, si fuera apropiado, después de esterilización, en placas de agar usando un agente de selección adecuado de tal manera que solamente las semillas transformadas puedan desarrollarse en plantas. Como alternativa, las plantas transformadas se exploran para determinar la presencia de

55 un marcador de selección tal como el descrito anteriormente.

Después de la transferencia y regeneración de ADN, las plantas supuestamente transformadas pueden evaluarse utilizando, por ejemplo, análisis de Southern, para determinar la presencia del gen de interés, número de copias y/u organización genómica. Como alternativa o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN recién introducido pueden supervisarse usando análisis de Northern y/o Western, ambas técnicas bien conocidas por los expertos habituales en la materia.

Las plantas transformadas generadas pueden propagarse mediante diversos medios, tales como mediante técnicas clásicas de propagación clonal o de reproducción. Por ejemplo, una primera generación (o T1) de planta 5 transformada puede reproducirse asexualmente y puede seleccionarse una segunda generación homocigota (o T2) y después las plantas T2 pueden propagarse adicionalmente a través de técnicas de reproducción clásicas.

Los organismos transformados generados pueden adoptar diversas formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y de células no transformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas que contengan el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por

10 ejemplo, en plantas, una planta madre transformada injertada a un vástago no transformado).

La presente memoria descriptiva se describe para cualquier célula de planta o planta producida mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, y todas las partes de plantas y propágulos de las mismas. La presente memoria descriptiva se describe adicionalmente para incluir la progenie de una célula, tejido u órgano primario transformado o transfectado o la planta completa que se ha producido mediante cualquiera de los 15 procedimientos anteriormente mencionados, siendo el único requisito que la progenie presente las mismas características genotípicas y/o fenotípicas que las producidas por el precursor en los procedimientos descritos en el presente documento. Se describen células huésped que contienen un ácido nucleico AZ aislado o variante del mismo. Las células huésped preferidas son células de plantas. También se describen partes cosechables de una planta, tales como, pero sin limitación, semillas, hojas, frutos, flores, tallos, raíces, rizomas, tubérculos y bulbos.

20 Adicionalmente se describen productos directamente derivados de una parte cosechable de dicha planta, tales como gránulos deshidratados o polvos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas.

La presente memoria descriptiva describe el uso de ácidos nucleicos AZ o variantes de los mismos y el uso de polipéptidos AZ u homólogos de los mismos.

Un uso de este tipo se refiere a mejorar las características de cultivo de las plantas en particular la mejora del

25 rendimiento, especialmente el rendimiento de semillas. El aumento de rendimiento de semillas comprende preferentemente el aumento del peso de mil granos.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos AZ como se define en el presente documento pueden encontrar uso en programas de reproducción en los que se identifica un marcador de ADN que puede estar unido genéticamente a un gen AZ. Los ácidos nucleicos/genes pueden usarse para definir un marcador molecular. Este marcador de ADN o

30 de proteína puede después usarse en programas de reproducción para seleccionar plantas con mayor rendimiento.

Las variantes alélicas de un ácido nucleico/gen de AZ como se define en el presente documento también pueden encontrar uso en programas de reproducción asistida mediante marcador. Dichos programas de reproducción a veces requieren la introducción de variación alélica por tratamiento mutagénico de las plantas, usando, por ejemplo, mutagénesis con EMS; como alternativa, el programa puede comenzar con una colección de variantes alélicas de 35 origen denominado “natural” producida involuntariamente. Después, la identificación de variantes alélicas se realiza, por ejemplo, por PCR. A esto le sigue una etapa de selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y que dará un rendimiento aumentado. La selección se realiza típicamente supervisando el rendimiento del crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión, por ejemplo, diferentes variantes alélicas de uno cualquiera de los ácidos nucleicos indicados en la Tabla A del Ejemplo 1. El

40 rendimiento del crecimiento puede supervisarse en un invernadero o en el campo. Etapas opcionales adicionales incluyen cruzamiento de plantas, en el que se identifica la variante alélica superior, con otra planta. Esto podría usarse, por ejemplo, para realizar una combinación de características fenotípicas interesantes.

Un ácido nucleico AZ como se define en el presente documento también puede usarse como una sonda para mapear, genética y físicamente, genes que forman parte de, y como marcadores para rasgos ligados a estos genes. 45 Dicha información puede ser útil en reproducción de plantas para desarrollar líneas con fenotipos deseados. Dicho uso de ácidos nucleicos AZ o variantes de los mismos requiere solo una secuencia de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos AZ o variantes de los mismos pueden usarse como marcadores de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (PLFR). Con los ácidos nucleicos AZ pueden explorarse transferencias de Southern (Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) de 50 ADN genómico de planta digerido por enzimas de restricción. Los patrones de banda resultantes pueden después someterse a análisis genético usando programas informáticos tales como MapMaker (Lander y col. (1987) Genomics

1: 174-181) para construir un mapa genético. Además, los ácidos nucleicos pueden usarse para explorar transferencias de Southern que contienen ADN genómicos tratados con endonucleasas de restricción de un conjunto de individuos que representan a los padres y a la progenie de un cruce genético definido. La segregación de

55 polimorfismos de ADN se observa y se usa para calcular la posición del ácido nucleico AZ en el mapa genético previamente obtenido usando esta población (Botstein y col. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331).

La producción y la utilización de sondas derivadas de genes de plantas para su uso en mapeo genético se describe en Bernatzky y Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37-41. Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clones de ADNc específicos utilizando la metodología indicada anteriormente o variaciones de la misma. Por ejemplo, para el mapeo pueden utilizarse poblaciones de intercruzamiento F2, poblaciones de retrocruzamiento, poblaciones apareadas al azar, líneas isogénicas cercanas y otros grupos de individuos. Dichas metodologías son bien conocidas por los expertos en la técnica.

5 Las sondas de ácido nucleico también pueden usarse para mapeo físico (es decir, colocación de secuencias en mapas físicos; véase Hoheisel y col. En: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, págs. 319-346, y referencias citadas en su interior).

De acuerdo con la memoria descriptiva pueden utilizarse sondas de ácidos nucleicos en mapeo directo de hibridación in situ con fluorescencia (HISF) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149-154). Aunque los procedimientos

10 actuales de mapeo HISF favorecen el uso de clones grandes (de varias kb a varios cientos de kb; véase Laan y col. (1995) Genome Res. 5:13-20), mejoras en sensibilidad pueden permitir la realización de mapeo HISF usando sondas más cortas.

Usando los ácidos nucleicos pueden realizarse diversos procedimientos basados en amplificación de ácidos nucleicos para el mapeo genético y físico. Como ejemplos se incluyen amplificación específica de alelo (Kazazian 15 (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield y col. (1993) Genomics 16: 325-332), ligamiento específico de alelo (Landegren y col. (1988) Science 241: 1077-1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Mapeo Híbrido por Radiación (Walter y col. (1997) Nat. Genet. 7: 22-28) y Mapeo Happy (Dear y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795-6807). Para estos procedimientos, se utiliza la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores

20 para su uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión con cebador. El diseño de dichos cebadores es bien conocido por los expertos en la técnica. En los procedimientos que emplean mapeo genético basado en PCR, puede ser necesario identificar diferencias de secuencias de ADN entre los padres del cruce del mapeo en la región correspondiente a la secuencia de ácido nucleico instantánea. Sin embargo, generalmente esto no es necesario para procedimientos de mapeo.

25 Los procedimientos de acuerdo con la presente memoria descriptiva dan como resultado plantas que tienen rendimiento aumentado, como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Estas características de cultivo ventajosas también pueden combinarse con otros rasgos económicamente ventajosos, tales como rasgos que potencian adicionalmente el rendimiento, tolerancia a diversos estreses, rasgos que modifican diversas características arquitectónicas y/o características bioquímicas y/o fisiológicas.

30 Descripción de las figuras

La presente invención se describirá ahora con referencia a las siguientes figuras en las que:

La Figura 1 muestra un ejemplo de la estructura del dominio de un polipéptido AZ. La proteína codificada por la SEC ID Nº: 2 comprende dos repeticiones de anquirina (en negrita, subrayadas) y dos dominios C3H1 (en cursiva, subrayados).

35 La Figura 2 muestra las secuencias consenso de dedo de Cinc de C3H1 (C3H1) y Anquirina (ANQ) de acuerdo con la base datos SMART, los símbolos de los diversos grupos de aminoácidos se indican en la leyenda.

La Figura 3 representa una matriz de identidad/similitud de secuencia preparada por MATGAT (BLOSUM62,

40 penalización por apertura de hueco 11, penalización por extensión de hueco 1). Por encima de la diagonal, en negrita, se muestran las identidades de secuencia, por debajo de la diagonal se muestran las similitudes de secuencia para: A) secuencias de proteína de longitud completa, B) secuencias de proteína parcial que comprenden el supuesto dominio de dedo de Cinc que está más en el extremo C.

La Figura 4 muestra el vector binario p056, para la expresión en Oryza sativa de una secuencia codificante AZ de 45 Arabidopsis thaliana bajo el control de un promotor WSI18 (referencia interna PRO0151).

Ejemplos

La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos.

Manipulación de ADN: a menos que se indique otra cosa, se realizaron técnicas de ADN recombinante de acuerdo con los protocolos convencionales descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª edición

50 Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel y col. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Materiales y procedimientos convencionales de trabajos moleculares en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU).

Ejemplo 1: Identificación de secuencias relacionadas con la secuencia de ácidos nucleicos usado en los procedimientos descritos en el presente documento

Las secuencias (ADNc de longitud completa, EST o genómicas) relacionadas con la secuencia de ácidos nucleicos utilizadas en los procedimientos como se describe en el presente documento se identificaron entre las conservadas 5 en la base de datos de Nucleótidos Entrez en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) utilizando las herramientas de búsqueda de secuencia de bases de datos, tal como la Herramienta de Alineamiento Local Básica (BLAST) (Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; y Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). El programa se utiliza para encontrar regiones de similitud local entre las secuencias comparando las secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos con las bases de datos de secuencia y calculando el significado estadístico de los 10 emparejamientos. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el ácido nucleico como se define en el presente documento se utilizó para el algoritmo TBLASTN, con configuraciones predeterminadas y el filtro para ignorar las secuencias de baja complejidad desencadenadas. El resultado de los análisis se observó por comparación en forma de pares, y se clasificó de acuerdo con la clasificación de probabilidad (valor E), en el que la clasificación refleja la probabilidad de que se produzca un alineamiento particular por casualidad (cuanto menor sea el valor E, más 15 significativo el acierto). Además de valores E, también se clasificaron comparaciones por porcentaje de entidad. Porcentaje de identidad se refiere al número de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptido) comparadas sobre una longitud particular. En algunos casos, los parámetros predeterminados pueden ajustarse para modificar la exigencia de la búsqueda. Por ejemplo, el valor E puede aumentarse para mostrar menos emparejamientos exigentes. De esta manera, pueden identificarse

20 emparejamientos cortos casi exactos.

La Tabla A proporciona una lista de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con la secuencia de ácidos nucleicos utilizada en los procedimientos como se describe en el presente documento.

Tabla A: Ejemplos de polipéptidos AZ: 5

Fuente de planta: Ácido nucleico SEC ID Nº: Proteína SEC ID Nº: Proteína

Arabidopsis thaliana: 1 2

Eucalyptus grandis: 10 11

Oryza sativa: 12 13

Medicago truncatula: 14 15

Oryza sativa: 16 17

Arabidopsis thaliana: 18 9

Oryza sativa: 20 21

Arabidopsis thaliana: 22 23

Arabidopsis thaliana: 24 25

Eucalyptus grandis: 26 27

Eucalyptus grandis: 28 29

Glycine max: 30 31

Eucalyptus grandis: 32 33

Arabidopsis thaliana: 34 35

Oryza sativa: 36 37

Hordeum_vulgare: 38 39

Pinus radiata: 40 41

Pinus radiata: 42 43

Glycine max: 44

Glycine max: 45

40 (continuación)

Glycine max: 46

Arabidopsis thaliana: 47

Arabidopsis thaliana: 48

Arabidopsis thaliana: 49

Arabidopsis thaliana: 50

Arabidopsis thaliana: 51

Arabidopsis thaliana: 52

Arabidopsis thaliana: 53

En algunos casos, las secuencias relacionadas se han ensamblado provisionalmente y descrito públicamente por instituciones de investigación, tal como el Instituto para la Investigación Genómica (TIGR). La base de datos de Ortólogos de Gen Eucariota (EGO) puede utilizarse para identificar dichas secuencias relacionadas, mediante búsqueda de palabra clave o utilizando el algoritmo BLAST con la secuencia de ácidos nucleicos o polipéptidos de interés.

Ejemplo 2: Clonación de genes AZ

El gen que codifica AZ de Arabidopsis (CDS3104) se amplificó por PCR usando como molde una biblioteca de ADNc de plántulas de Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, RU). Después de transcripción inversa de ARN extraído de las plántulas, los ADNc se clonaron en pCMV Sport 6.0. El tamaño medio del inserto del banco fue de 1,5 kb, y el número original de clones fue de 1,59x107 ufc. El título original se determinó que era de 9,6x105 ufc/ml, después de una primera amplificación de 6x1011 ufc/ml. Después de la extracción del plásmido, se utilizaron 200 ng de molde en una mezcla PCR de 50 &l. Se utilizaron los cebadores ceb06717 (sitio AttB1, directo, en cursiva, codón de inicio en negrita: 5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgtgctgtggatcagacc-3’) (SEC ID Nº: 7) y ceb06718 (sitio AttB2, inverso, complementario, en cursiva: 5’-185 ggggaccactttgtacaagaaagctgggtggttaggtctctcaattctgc-3’) (SEC ID Nº: 8), que incluían los sitios AttB para la recombinación Gateway, para la amplificación por PCR. La PCR se realizó usando Taq ADN polimerasa Hifi en condiciones convencionales. Se amplificó un fragmento de PCR del tamaño esperado y se purificó también utilizando procedimientos convencionales. Después, se realizó la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento de PCR se combina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un “clon de entrada”, p07. El plásmido pDONR201 se adquirió en Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway∀ .

Ejemplo 3: Construcción de vectores

El clon de entrada p07 se usó posteriormente en una reacción LR con p02417, un vector destinatario utilizado para transformación de plantas (Oryza sativa). Este vector contiene, como elementos funcionales dentro de los límites de ADN-T: un marcador de selección de plantas; un casete de expresión marcador detectable; y un casete Gateway diseñado para recombinación LR in vivo con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor WSI18 de arroz (SEC ID Nº: 9) para expresión específica de semilla (PRO0151) se localizaba cadena arriba de este casete Gateway (p056, Figura 4).

Se han descrito muchos sistemas vectoriales binarios diferentes (y súper binarios) para la transformación de plantas (por ejemplo, An, G. en Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology vol 44, págs. 47-62, Gartland KMA y MR Davey eds. Humana Press, Totowa, New Jersey). Muchos se basan en el vector pBIN19 descrito por Bevan (Nucleic Acid Research. 1984. 12: 8711-8721) que incluye un casete de expresión de genes de plantas flanqueado por las secuencias límite izquierda y derecha del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. Un casete de expresión de genes de plantas consiste en al menos dos genes – un gen marcador de selección y un promotor de planta que regula la transcripción del ADNc o ADN genómico del gen atributo. Pueden utilizarse diversos genes marcadores de selección incluyendo el gen de Arabidopsis que codifica una enzima ácido acetohidroxisintasa (AHAS) (Patentes de Estados Unidos 57673666 y 6225105). De manera similar, pueden utilizarse varios promotores para regular el gen atributo para proporcionar regulación constitutiva, evolutiva, tisular o ambiental de la transcripción génica.

Después de la etapa de recombinación LR, el vector de expresión resultante, p056 (Figura 4) se transformó en la cepa de Agrobacterium LBA4044 usando protocolos de choque térmico o electroporación. Las colonias transformadas se cultivaron en medio YEP y se seleccionaron mediante antibióticos respectivos durante dos días a 28 ºC. Estos cultivos de Agrobacterium se utilizaron para la transformación de plantas.

Pueden usarse otras cepas de Agrobacterium tumefaciens para la transformación de plantas y son bien conocidas en la técnica. Son ejemplos de dichas cepas C58C1 o EHA105.

Ejemplo 4. Transformación de plantas

Transformación de arroz

El Agrobacterium que contenía el vector de expresión se usó para transformar plantas de Oryza sativa. Semillas secas maduras de la variedad de cultivo japonesa de arroz Nipponbare se descascarillaron. La esterilización se realizó incubando durante un minuto en etanol al 70 %, seguido de 30 minutos en HgCl2 al 0,2 %, seguido de un lavado de 6 veces durante 15 minutos con agua destilada estéril. Las semillas estériles germinaron después en un medio que contenía 2,4-D (medio de inducción de callo). Después de la incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, los callos embriogénicos derivados de escutelo se cortaron y se propagaron en el mismo medio. Después de dos semanas, los callos se multiplicaron o se propagaron mediante subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. Piezas de callos embriogénico se subcultivaron en medio reciente 3 días antes de co-cultivo (para reforzar la actividad de la división celular).

La cepa LBA4404 de Agrobacterium que contenía el vector de expresión se utilizó para el co-cultivo. Se inoculó Agrobacterium en medio AB con los antibióticos apropiados y se cultivó durante 3 días a 28 ºC. Después las bacterias se recogieron y se suspendieron en medio de co-cultivo líquido a una densidad (DO600) de aproximadamente 1. Después, la suspensión se transfirió a una placa de Petri y los callos se sumergieron en la suspensión durante 15 minutos. Después los tejidos de callo se secaron por transferencia a un papel de filtro y se transfirieron a medio co-cultivo solidificado y se incubaron durante 3 días en la oscuridad a 25 ºC. Los callos cocultivados crecieron sobre un medio que contenía 2,4-D durante 4 semanas en la oscuridad a 28 ºC en presencia de un agente de selección. Durante este periodo, rápidamente se desarrollaron islas de callos resistentes a crecimiento. Después de la transferencia de este material a un medio de regeneración e incubación a la luz, el potencial embriogénico se liberó y se desarrollaron brotes las siguientes cuatro a cinco semanas. Los brotes se extirparon de los callos y se incubaron durante 2 a 3 semanas en un medio que contenía auxina desde el cual se transfirieron al suelo. Los brotes endurecidos se cultivaron a alta humedad y días cortos en un invernadero.

Se generaron aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes para una construcción. Los transformantes primarios se transfirieron desde una cámara de cultivo tisular a un invernadero. Después de un análisis PCR cuantitativo para verificar el número de copias del inserto de ADN-T, solo una única copia de plantas transgénicas que presentaban tolerancia al agente de selección se mantuvieron para cosecha de la semilla T1. Después las semillas se cosecharon de tres a cinco meses después del trasplante. El procedimiento produjo transformantes de sitio único a una tasa de alrededor de 50 % (Aldemita y Hodges 1996, Chan y col. 1993, Hiei y col. 1994).

Transformación de maíz

La transformación de maíz (Zea mays) se realizó con una modificación del procedimiento descrito por Ishida y col. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. La transformación es dependiente del genotipo en maíz y solo son genotipos específicos susceptibles a transformación y regeneración. Como progenitores, la línea endogámica A188 (Universidad de Minnesota) o híbridos con A188, son buenas fuentes de material donante para la transformación, pero también pueden usarse otros genotipos satisfactoriamente. Se cosecharon espigas de plantas de maíz aproximadamente 11 días después de la polinización (DDP) cuando la longitud del embrión inmaduro era de aproximadamente 1 a 1,2 mm. Los embriones inmaduros se co-cultivaron con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión y las plantas transgénicas se recuperaron a través organogénesis. Los embriones cortados se cultivaron en medio de inducción de callo y después en medio de regeneración de maíz que contenía el agente de selección (por ejemplo imidazolinona, pero pueden usarse diversos marcadores de selección). Las placas de Petri se incubaron a la luz a 25 ºC durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollasen los brotes. Los brotes verdes se transfirieron desde cada embrión al medio de enraizamiento de maíz y se incubaron a 25 ºC durante 2-3 semanas, hasta el desarrollo de las raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de trigo

La transformación de trigo se realizó con el procedimiento descrito por Ishida y col. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. La variedad de cultivo Bobwhite (disponible de CIMMYT, México) se utiliza normalmente para transformación. Embriones inmaduros se co-cultivaron con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión y las plantas transgénicas se recuperaron a través de organogénesis. Después de la incubación con Agrobacterium, los embriones se cultivaron in vitro en medio de inducción de callo, después el medio de regeneración que contenía el agente de selección (por ejemplo imidazolinona, aunque pueden utilizarse diversos marcadores de selección). Las placas de Petri se incubaron a la luz a 25 ºC durante 2-3 semanas o hasta que se desarrollasen los brotes. Los brotes verdes se transfirieron desde cada embrión al medio de enraizamiento y se incubaron a 25 ºC durante 2-3 semanas, hasta el desarrollo de las raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron al

suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de las plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de soja

La transformación de soja se realizó de acuerdo con una modificación del procedimiento descrito en el Texas A&M patente de Estados Unidos 5.164.310. Diversas variedades comerciales de soja se encuentran son susceptibles a transformación mediante este procedimiento. La variedad de cultivo Jack (disponible de la fundación Illinois Seed) se utiliza normalmente para transformación. Semillas de soja se esterilizaron para siembra in vitro. El hipocotiledóneo, el radículo y un cotiledón se extirparon de plántulas jóvenes de siete días de vida. El epicótilo y el cotiledón restante se cultivaron adicionalmente para desarrollar nodos axilares. Estos nodos axilares se extirparon y se incubaron con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión. Después de tratamiento de co-cultivo, los explantes se lavaron y se transfirieron al medio de selección. Los brotes regenerados se extirparon y se colocaron en un medio de elongación de brote. Los brotes no mayores de 1 cm se colocaron se colocaron en medio de enraizamiento hasta que se desarrollaron raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación colza/canola

Peciolos cotiledonarios e hipocotiledóneos de plántulas jóvenes de 5-6 días de vida se utilizaron como explantes para el cultivo tisular y transformaron de acuerdo con Babic y col. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). La variedad de cultivo comercial Westar (Agriculture Canada) es la variedad convencional usada para la transformación, pero también pueden usarse otras variedades. Semillas de canola se esterilizaron en la superficie para la siembra in vitro. Explantes de peciolos cotiledonarios con el cotiledón unido se extirparon de plántulas in vitro y se inocularon con Agrobacterium (que contenía el vector de expresión) sumergiendo el extremo cortado del explante del peciolo en la suspensión bacteriana. Después los explantes se cultivaron durante 2 días en medio MSBAP-3 que contenía BAP 3 mg/l, sacarosa al 3 %, Fitagar al 0,7 % a 23 ºC, 16 h de luz. Después de dos días de co-cultivo con Agrobacterium, los explantes de peciolo se transfirieron a medio MSBAP-3 que contenía BAP 3 mg/l, cefotaxima, carbenicilina o timentina (300 mg/l) durante 7 días y después se cultivaron en medio MSBAP-3 con cefotaxime, carbenicilina o timentina y agente de selección hasta la regeneración del brote. Cuando los brotes tenían una longitud de 5-10 mm, se cortaron y se transfirieron al medio de elongación de brote (MSBAP-0,5 que contenía BAP 0,5 mg/l). Los brotes de aproximadamente 2 cm de longitud se transfirieron al medio de enraizamiento (MS0) para la inducción de raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia de inserto de ADN-T.

Transformación de alfalfa

Utilizando el procedimiento de (McKersie y col., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) se transformó un clon de regeneración de alfalfa (Medicago sativa). La regeneración y transformación de la alfalfa es dependiente del genotipo y por lo tanto se requiere una planta regenerada. Se han descrito procedimientos para obtener plantas regeneradas. Por ejemplo, éstas pueden seleccionarse de variedades de cultivo Rangelander (Agriculture Canada) o de cualquier otra variedad comercial de alfalfa como describen Brown DCW y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112). Como alternativa, la variedad RA3 (Universidad de Wisconsin) se ha seleccionado para su uso en cultivo tisular (Walker y col., 1978 Am J Bot 65: 654-659). Explantes de peciolo se co-cultivaron con un cultivo durante una noche de Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie y col., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) o LBA4404 que contiene el vector de expresión. Los explantes se co-cultivaron durante 3 d en la oscuridad en un medio de inducción SH que contenía Pro 288 mg/l, tioprolina 53 mg/l, K2SO4 4,35 g/l y acetosiringinona 100 &m. Los explantes se lavaron en medio Murashige-Skoog de fuerza media (Murashige y Skoog, 1962) y se sembraron en placas en el mismo medio de inducción SH con acetosiringinona pero con un agente de selección adecuado y un antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Después de varias semanas, los embriones somáticos se transfirieron al medio de desarrollo BOi2Y que no contenía reguladores de crecimiento, sin antibióticos, y sacarosa 50 g/l. Posteriormente, los embriones somáticos germinaron en medio Murashige-Skoog de fuerza media. Las plántulas enraizadas se trasplantaron en macetas y se cultivaron en un invernadero. Se produjeron semillas T1 las plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia de inserto de ADN-T.

Ejemplo 5: Configuración de evaluación de expresión de AZ en arroz bajo el control del promotor de arroz WSI18

Se generaron aproximadamente de 15 a 20 transformantes de arroz T0 independientes. Los transformantes primarios se transfirieron desde una cámara de cultivo tisular a un invernadero para siembra y cosecha de la semilla T1. Se conservaron siete acontecimientos, de los que la progenie T1 segregó 3:1 para la presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos acontecimientos, aproximadamente 10 plántulas T1 que contenían el transgén (hetero-y homo-zigotos) y aproximadamente 10 plántulas T1 que carecían del transgén (nulicigotos) se seleccionaron supervisando la expresión visual del marcador. Las plantas T1 seleccionadas se transfirieron a un invernadero. Cada planta recibió una sola etiqueta de código de barras para relacionar con claridad los datos de

fenotipado con la planta correspondiente. Las plantas T1 seleccionadas se cultivaron en suelo en macetas especialmente diseñadas de un diámetro de 10 cm con fondo transparente para permitir la visualización de las raíces, con la siguiente configuración ambiental: fotoperiodo = 11,5 h, intensidad de luz diurna = 30.000 lux o más, temperatura diurna = 28 ºC, temperatura nocturna = 22 ºC, humedad relativa = 60-70 %. Las plantas transgénicas y los correspondientes nulicigotos se cultivaron a cada lado en posiciones aleatorias. Se tomaron medidas para que las plantas no tuviesen ningún estrés. Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez las plantas pasaron varias veces a través de una cabina de formación de imágenes digital. En cada punto de tiempo se tomaron imágenes digitales (2048x1536 pixeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes. Una cámara digital también registró imágenes desde el fondo de la maceta durante el crecimiento de la planta.

Detección de sequía

Se cultivaron plantas de semillas T2 en suelo de maceta en condiciones normales hasta que alcanzaron la etapa de partida. Después se transfirieron a una sección “seca” donde se mantiene el riego. Sondas de humedad se insertaron en macetas seleccionadas al azar para supervisar el contenido de agua en el suelo (CAS). Cuando el CAS está por debajo de determinados umbrales, las plantas vuelven a regarse automáticamente de manera continua hasta que de nuevo se alcanza un nivel normal. Después, las plantas se vuelven a transferir a condiciones normales. El resto del cultivo (maduración de planta, cosecha de semilla) es igual para las plantas que no se cultivan en condiciones de estrés abiótico. Los parámetros de cultivo y rendimiento se registraron como se detalla para el cultivo en condiciones normales.

Detección de la eficiencia del uso de nitrógeno

Se cultivaron plantas de arroz de semillas T2 en suelo de maceta en condiciones normales excepto para la solución nutrientes. Las macetas se regaron desde el trasplante hasta la maduración con una solución de nutrientes específica que contenía un contenido de nitrógeno N reducido (N), normalmente entre 7 a 8 veces menos. El resto del cultivo (maduración de planta, cosecha de semilla) es igual para las plantas que no se cultivan bajo estrés abiótico. Los parámetros de cultivo y rendimiento se registraron como se detalla para el cultivo en condiciones normales.

El área por encima de la superficie de la planta (o biomasa foliar) se determinó contando el número total de pixeles en las imágenes digitales a partir de las partes de la planta por encima de la superficie discriminadas del fondo. Este valor se promedió para las imágenes tomadas en el mismo momento de los diferentes ángulos y se convirtió a un valor de superficie físico expresado en mm al cuadrado por calibración. Los experimentos mostraron que el área de la planta por encima de la superficie medida de esta forma se correlacionaba con la biomasa de las partes de la planta por encima de la superficie. El área por encima de la superficie es el momento en el que la planta ha alcanzado su máxima biomasa foliar. Las características radiculares tales como el área total proyectada (que puede correlacionarse con volumen radicular total), diámetro promedio y longitud de las raíces por encima de un determinado umbral de espesor (longitud de raíces gruesas, o longitud de raíces finas) se dedujo a partir de la imagen generada usando un programa informático apropiado.

Las panículas primarias maduras se cosecharon, se embolsaron, se etiquetaron con códigos de barra y después se secaron durante tres días en el horno a 37 ºC. Después las panículas se trillaron y se recogieron todas las semillas. Las cáscaras llenas se separaron de las vacías usando un dispositivo de soplado con aire. Después de la separación, ambos lotes de semillas se contaron usando una contadora disponible en el comercio. Las cáscaras vacías se descartaron. Las cáscaras llenas se pesaron en una balanza analítica y el área transversal de las semillas se midió usando formación de imágenes digitales. Este procedimiento da lugar al conjunto de los siguientes parámetros relacionados con las semillas:

El número de semillas llenas se determinó contando el número de cáscaras llenas que quedó después de la etapa de separación. El rendimiento de semilla total (peso de semilla total) se midió pesando todas las cáscaras llenas cosechadas de una planta. El número total de semillas por planta se midió contando el número de cáscaras cosechadas de una planta. El índice de cosecha (IC) en la presente invención se define como la proporción entre el rendimiento de semilla total y el área por encima de la superficie (mm2), multiplicado por un factor de 106. El Peso de Mil Granos (PMG) se extrapoló a partir del número de semillas llenas contadas y su peso total. El índice de carga de semilla, como se define en la presente invención, es la proporción (expresada como un %) del número de semillas llenas sobre el número total de semillas (o flósculos). Estos parámetros derivaron de una forma automática de las imágenes digitales usando un programa informático de análisis de formación de imágenes y se analizaron estadísticamente. Los parámetros de semilla individuales (incluyendo anchura, longitud, área, peso) se midieron usando un dispositivo fabricado a medida que consistía en dos componentes principales, un dispositivo de pesaje y de formación de imágenes, acoplado a un programa informático para análisis de imágenes.

Se utilizó un ANOVA (análisis de varianza) de dos factores corregido para el diseño desequilibrado como un modelo estadístico para la evaluación global de las características fenotípicas de la planta. Se realizó un ensayo F en todos los parámetros medidos de todas las plantas en todos los acontecimientos transformados con ese gen. El ensayo F se realizó para verificar un efecto del gen sobre todos acontecimientos de transformación y para verificar un efecto

global del gen, denominado también en el presente documento “efecto génico global”. Si el valor del ensayo F muestra que los datos son significativos, es decir se llega a la conclusión de que es un efecto “génico”, significa que no solo la presencia o la posición del gen ocasionan el efecto. El umbral de significado de un efecto génico global verdadero se establece al 5 % del nivel de probabilidad para el ensayo F.

Para verificar un efecto sobre los genes dentro de un acontecimiento, es decir, un efecto específico de línea, se realizó un ensayo T dentro de cada acontecimiento utilizando conjuntos de datos de las plantas transgénicas y de plantas nulas correspondientes. “Plantas nulas” o “segregantes nulos” o “nulicigotos” son las plantas tratadas de la misma manera que la planta transgénica, pero a partir de las cuales se ha segregado el transgén. Las plantas nulas también pueden describirse como plantas transformadas negativas homocigotas. El umbral de significado del ensayo T se establece a un nivel de probabilidad del 10 %. Los resultados de algunos acontecimientos pueden estar por encima o por debajo de este umbral. Esto se basa en la hipótesis de que un gen podría tener solo un efecto en determinadas posiciones en el genoma y de que la aparición de este efecto dependiente de posición no es atípico. Este tipo de efecto génico también se denomina en el presente documento un “efecto de línea del gen”. El valor p se obtiene comparando el valor t con la distribución t o como alternativa, comparando el valor F con la distribución F. El valor p entonces proporciona la probabilidad de que la hipótesis nula (es decir, que no haya efecto del transgén) sea correcta.

Los datos obtenidos para AZ en el primer experimento se confirmaron en un segundo experimento con plantas T2. Se seleccionaron cuatro líneas que tenían el patrón de expresión correcto para análisis posterior. Se exploraron lotes de semillas de las plantas positivas (tanto hetero como homocigotas) en T1, verificando la expresión de marcadores. Para cada acontecimiento seleccionado, los lotes de semillas heterocigotas se conservaron después para evaluación T2. Dentro de cada lote de semillas se cultivó el mismo número de plantas positivas y negativas en el invernadero para la evaluación.

Se evaluó un número total de 120 plantas AZ transformadas en la generación T2, es decir 30 plantas por acontecimiento de las cuales 15 fueron positivas del transgén y 15 negativas.

Dado que se habían realizado dos experimentos con acontecimientos solapantes, se realizó un análisis combinado. Esto es útil para verificar la coherencia de los efectos sobre los dos experimentos, y si fuera éste el caso, acumular pruebas de ambos experimentos para aumentar la confianza en la conclusión. El procedimiento utilizado fue una estrategia de modelo mixta que considera la estructura multinivel de los datos (es decir, experimento – acontecimiento – segregantes). Los valores P se obtuvieron comparando el ensayo de relación de probabilidad con distribuciones de chi cuadrado.

Ejemplo 6: Evaluación de transformantes AZ: medición de parámetros relacionados con el rendimiento

Después del análisis de las semillas, como se ha descrito anteriormente, los autores de la invención descubrieron que las plantas transformadas con la construcción génica AZ tenían una mayor rendimiento de semillas, expresada como peso de mil granos, en comparación con plantas que carecían del transgén AZ. Además, se observó vigor de emergencia aumentado e índice de verdor aumentado en plantas que llevaban el transgén en comparación con las plantas de control.

En una de las construcciones, en la generación T1 aumentó el peso de mil granos 2,7 %. Estos resultados positivos se obtuvieron de nuevo en la generación T2 (aumento del 2,1 %). Los datos T2 volvieron a evaluarse en un análisis combinado con los resultados de la generación T1, y los valores de p obtenidos mostraron que los efectos observados eran muy significativos.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CropDesign N.V.

<120> Plantas que tienen rendimiento aumentado y procedimiento para producirlas

<130> PF58401-prio

<160> 347

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 2151

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

5 <210> 2

<211> 716

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

10 <400> 2

210> 3

<211> 13

5: <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> motivo 1

10

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1) .. (1)

<223> \reemplazo= "Ala"

15

<220>

<221> VARIANTE

<222> (7) .. (7)

<223> \reemplazo= "Thr"

20

<400> 3

25 <210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> motivo 2

<400> 4

<210> 5

<211> 19

10: <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> motivo 3

15

<220>

<221> VARIANTE

<222> (3) .. (3)

<223> \reemplazo= "Ile"

20

<220>

<221> VARIANTE

<222> (6)..(6)

<223> \reemplazo= "Ser"

25

<220>

<221> VARIANTE

<222> (11)..(11)

<223> \reemplazo= "Ser"

30

<220>

<221> VARIANTE

<222> (14)..(14)

<223> \reemplazo= "Lys"

35

<400> 5

40 <210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<223> motivo 4

<400> 6

<210> 7

<211> 54

<212> ADN 55 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador: prm06717

60 <400> 7 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aaacaatgtg ctgtggatca gacc 54

<210> 8

<211> 50 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador: prm06718 10

<400> 8 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg gttaggtctc tcaattctgc 50

<210> 9 15 <211> 981

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 9 20

<210> 10

<211> 3372

<212> ADN

<213> Eucalyptus grandis

<400> 10

<210> 11

<211> 704

<212> PRT

<213> Eucalyptus grandis

<400> 11

<210> 12

<211> 1860

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 12 <210> 13

<211> 619

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 13

<210> 14

<211> 2106

<212> ADN

<213> Medicago truncatula

<400> 14

<210> 15

<211> 701

<212> PRT

<213> Medicago truncatula

<400> 15

<210> 16

<211> 2841

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 16 <210> 17

<211> 749

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 17

<210> 18

<211> 2769

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 18

<210> 19

<211> 706

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 19

<210> 20

<211> 2674

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 20

<210> 21

<211> 657

<212> PRT

<213> Oryza sativa 15

<400> 21

<210> 22

<211> 2223

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 22

<210> 23

<211> 597

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 23

<210> 24

<211> 1761

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 24

<210> 25

<211> 586

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 25

<210> 26

<211> 2709

<212> ADN

<213> Eucalyptus grandis

<400> 26

<210> 27

<211> 659

<212> PRT

<213> Eucalyptus grandis

<400> 27

<210> 28

<211> 2518

<212> ADN

<213> Eucalyptus grandis

<400> 28

<210> 29

<211> 663

<212> PRT 15 <213> Eucalyptus grandis

<400> 29

<210> 30

<211> 2001 5 <212> ADN

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (481)..(530)

<223> n is a, c, g o t

<400> 30 <210> 31

<211> 667 5 <212> PRT

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> UNSURE 10 <222> (161)..(177)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 31

<210> 32

<211> 2683

<212> ADN

<213> Eucalyptus grandis

<400> 32

<210> 33

<211> 694

<212> PRT

<213> Eucalyptus grandis

<400> 33

<210> 34

<211> 2499

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 34

<210> 35

<211> 607

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 35

<210> 36

<211> 1806

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 36 <210> 37

<211> 601

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 37

<210> 38

<211> 1692

<212> ADN

<213> Hordeum vulgare

<400> 38 <210> 39

<211> 564

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare

<400> 39

<210> 40

<211> 3610

<212> ADN

<213> Pinus radiata

<400> 40 <210> 41

<211> 779

<212> PRT

<213> Pinus radiata

<400> 41

<210> 42

<211> 3610

<212> ADN

<213> Pinus radiata

<400> 42 <210> 43

<211> 749

<212> PRT

<213> Pinus radiata

<400> 43

<210> 44

<211> 711

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 44

<210> 45

<211> 643

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 45

<210> 46

<211> 669

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 46

<210> 47

<211> 580

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 47

<210> 48

<211> 719

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 48

<210> 49

<211> 686

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 49

<210> 50

<211> 633

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 50

<210> 51

<211> 678

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 51

<210> 52

<211> 640

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 52

<210> 53

<211> 2158

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 53

<210> 54

<211> 2193

<212> ADN 15 <213> Oryza sativa

<400> 54

<210> 55

<211> 1827

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 55 <210> 56

<211> 2194

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 56

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Procedimiento para aumentar el rendimiento de semillas de plantas con respecto a plantas de tipo silvestre correspondientes, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico AZ o una variante del mismo, en el que dicho ácido nucleico AZ codifica un polipéptido AZ o un homólogo del mismo, en el que el homólogo proporciona plantas que tienen un rendimiento aumentado y en el que dicho polipéptido AZ o el homólogo del mismo comprende dos repeticiones de anquirina y dos dominios C3H1 de dedo de Cinc, y en el que dichas repeticiones de anquirina se localizan cadena arriba de los dominios C3H1 de dedo de Cinc.
2.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que polipéptido AZ comprende al menos uno de los siguientes motivos:

(P/A)CSRAY(S/T)HDWTEC (motivo 1, SEC ID Nº: 3) HPGENARRRDPR (motivo 2, SEC ID Nº: 4) HG(V/I)FE(C/S)WLHP(A/S)QY(R/K)TRLCK (motivo 3, SEC ID Nº: 5) CFFAH (motivo 4, SEC ID Nº: 6)
3.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicho ácido nucleico AZ codifica un polipéptido AZ de SEC ID Nº: 2 o un homólogo del mismo.
4.

El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha variante es una porción de un ácido nucleico AZ o una secuencia capaz de hibridarse con un ácido nucleico AZ, cuya porción o secuencia de hibridación codifica un polipéptido AZ que comprende dos repeticiones de anquirina y dos dominios C3H1 de dedo de Cinc, y en el que dichas repeticiones de anquirina se localizan cadena arriba de los dominios C3H1 de dedo de Cinc.
5.

El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho ácido nucleico AZ o variante del mismo se sobreexpresa en una planta.
6.

El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho ácido nucleico AZ o variante del mismo es de origen vegetal, preferentemente de una planta dicotiledónea, más preferentemente de la familia Brassicaceae, más preferentemente el ácido nucleico es de Arabidopsis thaliana.
7.

El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho ácido nucleico AZ o variante del mismo está unido operativamente a un promotor específico de semilla.
8.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho promotor específico de semilla es un promotor WSI18.
9.

El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho rendimiento de semilla aumentado comprende un peso de mil granos aumentado.
10.

Construcción que comprende:

(i)

un ácido nucleico AZ o una variante del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 6;

(ii)

un promotor WSI18 específico de semilla o un promotor GOS2 constitutivo unido operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos de (i)
11.

La construcción de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicho promotor WSI18 es como se representa por la SEC ID Nº: 55 o SEC ID Nº: 9.
12.

La construcción de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicho promotor GOS2 es como se representa por la SEC ID Nº: 56 o SEC ID Nº: 54.
13.

Planta transformada con una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
14.

Procedimiento para la producción de una planta transgénica que tiene rendimiento de semilla aumentado en comparación con plantas de tipo silvestre correspondientes, cuyo procedimiento comprende:

(i)

introducir y expresar en una planta o célula de planta un ácido nucleico AZ o variante del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 6; y

(ii)

cultivar la célula de planta en condiciones que promuevan el crecimiento y el desarrollo de las plantas.
15.

Planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 13, en la que dicha planta es una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar o en la que la planta es un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, avena

o sorgo.
16.

Partes cosechables de una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 15, en la que dichas partes cosechables comprenden una construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
17.

Partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 16 en la que dichas partes cosechables son semillas.
18.

Productos directamente derivados de una planta de acuerdo con la reivindicación 13 o 15 y/o de partes

cosechables de una planta de acuerdo con las reivindicaciones 16 o 17, en la que dichos productos comprenden una 5 construcción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
19. El uso de un ácido nucleico AZ o de una variante del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 6, o el uso de un polipéptido AZ o de un homólogo del mismo, en el aumento de rendimiento de semilla, con respecto a plantas de tipo silvestre correspondientes.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho aumento de rendimiento de semilla comprende un 10 peso de mil granos aumentado.
21.

El uso de un ácido nucleico AZ o de una variante del mismo, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 6, o el uso de un polipéptido AZ o de un homólogo del mismo como un marcador molecular.
22.

El uso de una construcción, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en un procedimiento para producir plantas que tienen un rendimiento de semilla aumentado con respecto a plantas de control.

Organización de dominios en la SEC ID Nº: 2

FIGURA 1

Leyenda:

Clase

Clave Restos

alcohol

o S,T

alifático

1 I,L,V

ninguna

. A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

aromático

a F,H,W,Y

cargado

c D,E,H,K,R

hidrófobo

h A,C,F,G,H, I,K, L#M,R, T,V,W, Y

negativo

- D,E

polar

p C,D,E,H,K,N,Q,R,S,T

positivo

+ H,K,R

pequeño

s A,C,D,G,N,P,S,T,V

diminuto

u A,G,S

de tipo giro

t A,C,D,E,G,H,K,N,Q,R,S,T

FIGURA 2