ES2440265T3

ES2440265T3 - Plantas que tienen un aumento de características relacionadas con el rendimiento y un método para elaboración de las mismas

Info

Publication number: ES2440265T3
Application number: ES08775243.2T
Authority: ES
Inventors: Yves Hatzfeld; Valerie Frankard
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2007-07-20
Filing date: 2008-07-21
Publication date: 2014-01-28
Anticipated expiration: 2028-07-21
Also published as: CN101849009A; EP2173884B1; AR067633A1; CA2692777A1; EP2173884A2; AU2008280152B2; EP2535417A1; WO2009013263A2; CN102827865A; EP2987861A1; US20100325753A1; CN104404078A; DE112008001879T5; AU2008280152A1; WO2009013263A3; US8697947B2; US20140165230A1

Abstract

Un método para incrementar las características relacionadas con el rendimiento de semillas bajo condiciones decultivo normales, condiciones de cultivo reducidas en nitrógeno y/o condiciones de cultivo con disponibilidadreducida de nutrientes en plantas de arroz con relación a las plantas que sirven como control, que comprende incrementar la expresión en una planta de arroz de una secuencia de ácido nucleico que codifica elpolipéptido que incrementa el rendimiento 19/20 localizado en el núcleo con el motivo AT-hook (AHL 19/20),en donde se logra el incremento de la expresión por medio de la introducción y expresión en una planta de un ácidonucleico que codifica un polipéptido AHL 19/20, y en donde dicho polipéptido AHL 19/20 comprende un dominio que tiene al menos 80% o más identidad de secuenciade aminoácidos con un Dominio Conservado (DC) como el representado por la SEQ IS NO: 36, y opcionalmente seleccionar plantas de arroz que tienen más características relacionadas con el rendimiento desemillas, dicha característica relacionada con el rendimiento de semillas es una o más de: (i) aumento del número de florespor panícula; (ii) aumento del peso total de las semillas por planta; (iii) aumento del número de semillas llenas; o (iv)aumento de índice de cosecha.

Description

Plantas que tienen un aumento de caracteristicas relacionadas con el rendimiento y un metodo para elaboraci6n de las mismas.

La presente invenci6n se refere en general al campo de la biologia molecular y se relaciona con un metodo para incrementar diferentes caracteristicas de la planta relacionadas con el rendimiento, mediante el incremento de la expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifca un polipeptido que incrementa el rendimiento, por lo cual el polipeptido que incrementa el rendimiento es uno 19/20 localizado en el nucleo con el motivo AT-hook (AHL 19/20). La presente invenci6n tambien se relaciona con plantas que tienen una mayor expresi6n de una secuencia de acido nucleico que codifica dicho polipeptido que incrementa el rendimiento, en donde dichas plantas tienen mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento con respecto a las plantas que sirven de control. La invenci6n tambien provee construcciones utiles en los metodos de la invenci6n.

La poblaci6n mundial siempre en crecimiento y la oferta cada vez mas escasa de tierras cultivables disponibles para la agricultura impulsan la investigaci6n para lograr una mayor eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para la mejora horticola y de los cultivos utilizan tecnicas selectivas de fitomejoramiento para identificar las plantas que tienen rasgos deseables. Sin embargo, dichas tecnicas selectivas de fitomejoramiento tiene varias desventajas, a saber, que estas tecnicas son tipicamente de trabajo intensivo y traen como resultado plantas que contienen a menudo componentes geneticos heterogeneos que no siempre resultan en la transmisi6n de la caracteristica deseable a partir de las plantas progenitoras. Los avances en biologia molecular le han permitido a la humanidad modificar el germoplasma de animales y de plantas. La modificaci6n por ingenieria genetica de las plantas supone el aislamiento y manipulaci6n de material genetico (tipicamente en la forma de ADN o ARN) y la posterior introducci6n de ese material genetico en una planta. Dicha tecnologia tiene la capacidad de proporcionar cultivos o plantas que tienen diferentes caracteristicas econ6micas, agron6micas u horticolas mejoradas.

Una caracteristica de particular interes econ6mico es un mayor rendimiento. El rendimiento normalmente se define como la producci6n medible de valor econ6mico de un cultivo. Esto puede ser definido en terminos de cantidad y/o de calidad. El rendimiento depende directamente de varios factores, por ejemplo, de la cantidad y tamafo de los 6rganos, de la arquitectura de la planta (por ejemplo, la cantidad de ramas), de la producci6n de semillas, de la senectud de la hoja y mas. El desarrollo de la raiz, la captaci6n de nutrientes, la tolerancia al estres y el vigor inicial tambien pueden ser factores importantes para determinar el rendimiento. Por lo tanto, la optimizaci6n de uno o mas de los factores mencionados anteriormente puede contribuir al incremento del rendimiento de los cultivos.

El rendimiento de semillas es una caracteristica particularmente importante, ya que las semillas de muchas plantas son importantes para la nutrici6n humana y animal. Cultivos tales como maiz, arroz, trigo, canola y soja dan cuenta de mas de la mitad de la ingesta total de calorias por parte de la humanidad, ya sea a traves del consumo directo de las semillas en si mismas o a traves del consumo de productos alimenticios producidos con semillas procesadas. Son ademas una fuente de azucares, aceites y muchas clases de metabolitos utilizados en procesos industriales. Las semillas contienen un embri6n (la fuente de nuevos brotes y raices) y un endospermo (la fuente de nutrientes para el desarrollo del embri6n durante la germinaci6n y durante el desarrollo temprano de las plantulas). El desarrollo de una semilla involucra muchos genes, y requiere de la transferencia de metabolitos a partir de las raices, hojas y tallos dentro de la semilla en desarrollo. El endospermo, en particular, asimila los precursores metab6licos de carbohidratos, aceites y proteinas y los sintetiza en macromoleculas de almacenamiento para llenar el grano.

El indice de cosecha, la relaci6n del rendimiento de semillas con respecto al peso seco por encima del suelo, es relativamente estable bajo muchas condiciones ambientales y de este modo se puede obtener una muy buena correlaci6n entre el tamafo de la planta y el rendimiento de granos (por ejemplo, Rebetzke et al., 2002, Crop Science 42: 739). Estos procesos estan intrinsecamente enlazados porque la mayor parte de la biomasa del grano depende de la productividad fotosintetica presente o almacenada por parte de las hojas y el tallo de la planta (Gardener et al., 1985, Physiology of Crop Plants. lowa State University Press, paginas 68 - 73). Por lo tanto, la selecci6n del tamafo de la planta, incluso en etapas tempranas de desarrollo, ha sido utilizada como un indicador del rendimiento potencial futuro (por ejemplo, Tittonell et al., 2005, Agric Ecosys & Environ 105: 213). Cuando se analiza el impacto de las diferencias geneticas sobre tolerancia al estres, la capacidad de estandarizar las propiedades del suelo, la temperatura, la disponibilidad de agua y de nutrientes y la intensidad de la luz es una ventaja intrinseca del invernadero o de los ambientes con camaras de crecimiento de plantas en comparaci6n con el campo. Sin embargo, las limitaciones artificiales en el rendimiento debido a una pobre polinizaci6n provocada por la ausencia de viento o de insectos, o insuficiente espacio para la maduraci6n de la raiz o el desarrollo del dosel, pueden restringir el uso de estos ambientes controlados para analizar las diferencias de rendimiento. Por lo tanto, las mediciones del tamafo de la planta en el desarrollo temprano, bajo condiciones estandar en una camara de crecimiento o invernadero, son practicas estandar para proporcionar una indicaci6n de las ventajas potenciales de rendimiento genetico.

Otra caracteristica importante es aquella de la tolerancia mejorada al estres abi6tico. El estres abi6tico esa una de las causas principales de perdida de cultivos en el mundo, reduciendo los rendimientos promedio para la mayoria de las plantas de cultivo en mas del 50% ((ang et al. (2003) Planta 218: 1 -14). Los estreses abi6ticos pueden ser provocados por sequia, salinidad, extremos de temperaturas, toxicidad quimica, exceso o deficiencia de nutrientes (macroelementos y/o microelementos), radiaci6n y estres oxidativo. La capacidad de incrementar la tolerancia de una planta al estres abi6tico seria una ventaja econ6mica importante para los granjeros a nivel mundial y permitiria el cultivo de granos en condiciones adversas y en territorios donde el cultivo no puede ser posible de otro modo.

Otra caracteristica importante para muchos cultivos es el vigor inicial. La mejora del vigor inicial es un objetivo importante de los programas modernos de fitomejoramiento de arroz tanto en zonas de cultivo templadas como tropicales de arroz. Raices largas son importantes para el anclaje apropiado del suelo en arroz sembrado en agua. Cuando el arroz se siembra directamente en campos inundados, y donde las plantas deben emerger rapidamente a traves del agua, los brotes mas largos estan asociados con el vigor. Donde se practica el cultivo por medio de sembradoras, mesocotilos y coleoptilos mas largos son importantes para una buena aparici6n de las plantulas. La capacidad para modificar por ingenieria genetica el vigor inicial en las plantas seria de gran importancia en la agricultura. Por ejemplo, un pobre vigor inicial ha sido una limitaci6n para la introducci6n de hibridos de maiz (Zea mays L.) con base en el germoplasma del Cintur6n de Maiz en el Atlantico Europeo.

Otra caracteristica importante adicional es aquella de las caracteristicas mejoradas relacionadas con el rendimiento de plantas cultivadas bajo condiciones de estres abi6tico. El estres abi6tico esa una de las causas principales de perdida de cultivos en el mundo, reduciendo los rendimientos promedio para la mayoria de las plantas de cultivo en mas del 50% ((ang et al. (2003) Planta 218: 1 -14). Los estreses abi6ticos pueden ser provocados por sequia, salinidad, extremos de temperaturas, toxicidad quimica, exceso o carencia de nutrientes (macroelementos y/o microelementos), radiaci6n y estres oxidativo. La capacidad para mejorar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de plantas cultivadas bajo condiciones de estres abi6tico seria una ventaja econ6mica importante para los granjeros a nivel mundial y permitiria la siembra de cultivos en condiciones adversas y en territorios donde el cultivo no puede ser posible de otro modo.

Se puede incrementar por lo tanto el rendimiento de un cultivo por medio de la optimizaci6n de uno de los factores anteriormente mencionados.

Dependiendo del uso final, se puede favorecer a modificaci6n de ciertas caracteristicas de rendimiento con respecto a otras. Por ejemplo para aplicaciones tales como la producci6n de forraje o madera, o recursos de biocombustibles, puede ser deseable un incremento en las partes vegetativas de una planta, y para aplicaciones tales como la producci6n de harina, almid6n, o de aceite, puede ser particularmente deseable un incremento en los parametros de la semilla. lncluso entre los parametros de la semilla, algunos pueden verse favorecidos sobre otros, dependiendo de la aplicaci6n. Diferentes mecanismos pueden contribuir para incrementar el rendimiento de semilla, ya sea en la forma de mayor tamafo de la semilla o el incremento en el numero de semillas.

Un enfoque para incrementar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento (rendimiento de semilla y/o de biomasa) en plantas puede ser a traves de la modificaci6n de los mecanismos inherentes al crecimiento de una planta, tal como el ciclo celular o diferentes rutas de sefalizaci6n involucradas en el desarrollo de la planta o en mecanismos de defensa.

Ahora se ha encontrado que se pueden incrementar diferentes caracteristicas relacionadas con el rendimiento en las plantas con respecto a plantas que sirven de control, sin retraso de la floraci6n, por medio del aumento de la expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido 19/20 localizado en el nucleo con el motivo AT-hook (AHL 19/20). El aumento de caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas comprende uno o mas de: aumento del numero de flores por panicula, aumento del rendimiento total de semillas por planta, aumento de la cantidad de semillas llenas, y aumento del indice de cosecha.

Antecedentes

Las proteinas que se enlazan al ADN son proteinas que contienen cualquiera entre muchos dominios de enlazamiento al ADN y por lo tanto tienen una especificidad o afinidad general por el ADN. Las proteinas que se enlazan al ADN incluyen por ejemplo factores de transcripci6n que modulan el proceso de transcripci6n, nucleasas que rompen las moleculas de ADN, e histonas que estan involucradas en el empaquetamiento del ADN en el nucleo de la celula.

El motivo AT-hook es un motivo corto de proteina que se enlaza al ADN que fue descrito primero en las proteinas cromos6micas diferentes a la histona del grupo de alta movilidad, HMG- l/I (Reeves y Nissen (1990) J Biol Chem

265: 8573 -8582). Se sabe que AT-hook interactua con la ranura menor de las secuencias de acido nucleico ricas en AT (Huth et al. (1997) Nat Struc Biol 4: 657 - 665). Los motivos AT-hook han sido identificados en una gran variedad de proteinas que se enlazan al ADN de animales, plantas y microorganismos. A diferencia de varios

motivos de enlazamiento al ADN bien caracterizados, el motivo AT-hook es corto, hasta de 13 residuos de aminoacidos, y tiene una secuencia tripeptidica tipica con una glicina- arginina- prolina (Gly- Arg- Pro o GRP) en su centro.

En Arabidopsis thaliana, aproximadamente 30 polipeptidos, que contienen al menos un motivo AT-hook, contienen ademas un dominio conservado de una planta y de procariotas (PPC), que se describe como DUF296 (dominio de funci6n desconocida 296) en la base de datos de dominios lnterPro del European Bioinformatics lnstitute (EBl) (Fujimoto et al. (2004) Plant Molec Biol 56: 225 -239). Se encontr6 que una de estas proteinas estaba localizada en el nucleoplasma, y por lo tanto llamada proteina 1 localizada en el nucleo con el motivo At-hook (AHL1; Fujimoto et al., ver mas arriba). Se designaron en forma similar los polipeptidos paralogos, es decir, AHL, y se numeraron consecutivamente.

En la patente de los Estados Unidos No. 7.193.129, y en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2005/0097638, se transform6 un polipeptido AHL de Arabidopsis thaliana, AHL19 (de acuerdo con Fujimoto et al., ver mas arriba) (identificado como G2153) en Arabidopsis, y expres6 utilizando el promotor 35S del CaMV. Las plantas transgenicas mostraron caracteristicas modificadas, tales como mayor resistencia al estres por salinidad, mayor resistencia al estres osm6tico, mayor resistencia a la sequia, mayor tolerancia a la congelaci6n y mayor respuesta de la planta a los azucares. En la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2005/0097638, la sobreexpresi6n (bajo el control de un promotor 35S del CaMV) del polipeptido AHL19, asi como de varios polipeptidos AHL paralogos, retras6 significativamente la floraci6n en las plantas transgenicas comparado con las plantas de control, incrementando por lo tanto el rendimiento. La publicaci6n internacional (O2007/028165A2 se refiere al analisis de diferentes polipeptidos por la capacidad para conferir resistencia a una enfermedad o tolerancia al estres abi6tico.

Resumen

De acuerdo con una forma de realizaci6n, se provee un metodo para incrementar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas en plantas con relaci6n a las plantas de control, que comprende incrementar la expresi6n de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL19/20 en una planta. El incremento de caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas, comprende uno o mas de: aumento del numero de flores por panicula, aumento del rendimiento total de semillas por planta, aumento de la cantidad de semillas llenas, y aumento del indice de cosecha.

Definiciones

Polipeptido(s) / Proteina(s)

Los terminos "polipeptido" y "proteina" se utilizan indistintamente aqui y se refieren a aminoacidos en una forma polimerica de cualquier longitud, unidos por medio de enlaces peptidicos.

Polinucle6tido(s) / Acido(s) nucleico(s) / Secuencia(s) de acido nucleico / Secuencia(s) de nucle6tidos

Los terminos "polinucle6tido(s)", "secuencia(s) de acido nucleico", "secuencia(s) de nucle6tidos", "acido(s) nucleico(s)" se utilizan indistintamente aqui y se refieren a nucle6tidos, ya sea ribonucle6tidos o desoxirribonucle6tidos o una combinaci6n de ambos, en una forma polimerica no ramificada de cualquier longitud.

Planta(s) de control

La elecci6n de plantas control adecuadas es una parte rutinaria de la programaci6n de un experimento y puede incluir las plantas correspondientes de tipo silvestre o las plantas correspondientes sin el gen de interes. La planta control es tipicamente de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad que la planta que va a ser evaluada. La planta control puede ser tambien un nulicigoto de la planta que va a ser evaluada. Una "planta de control" tal como se utiliza aqui se refere no s6lo a plantas enteras, sino tambien a partes de plantas, incluyendo semillas y partes de la semilla.

Hom6logo(s)

Los "hom6logos" de una proteina abarcan peptidos, oligopeptidos, polipeptidos, proteinas y enzimas que tienen sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoacidos con relaci6n a la proteina no modificada en cuesti6n y que tienen actividad biol6gica y funcional similar a la de la proteina no modificada de la cual se derivan.

Una supresi6n se refere a la remoci6n de uno o mas aminoacidos de una proteina.

Una inserci6n se refiere a uno o mas residuos de aminoacidos que se introducen en un sitio predeterminado en una proteina. Las inserciones pueden incluir fusiones en el terminal N y/o en el terminal C asi como inserciones dentro de la secuencia de uno solo o de multiples aminoacidos. En general, las inserciones dentro de la secuencia de aminoacidos seran mas pequefas que las fusiones en el terminal N o en el terminal C, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Los ejemplos de proteinas o peptidos de fusi6n del terminal N o C incluyen el dominio de enlazamiento o el dominio de activaci6n de un activador transcripcional tal como el que se utiliza en el sistema de doble hibrido de levadura, las proteinas de recubrimiento de fago, la etiqueta de (histidina)6, la etiqueta de glutationa S transferasa, la proteina A, la proteina de enlazamiento de maltosa, la dihidrofolato reductasa, el epitopo Tag·100, el epitopo c-myc, el epitopo FLAG®, lacZ, CMP (peptido de enlazamiento de calmodulina), el epitopo HA, el epitopo de proteina C y el epitopo VSV.

Una sustituci6n se refiere al reemplazo de aminoacidos de la proteina por otros aminoacidos que tienen propiedades similares (tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensi6n a formar o romper estructuras helicoidales a o estructuras de laminas � similares). Las sustituciones de aminoacidos son tipicamente de residuos individuales, pero pueden agruparse dependiendo de las restricciones funcionales colocadas sobre el polipeptido; las inserciones usualmente seran del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoacidos. Las sustituciones de aminoacidos son preferiblemente sustituciones conservadoras de aminoacidos. Las tablas de sustituci6n conservadora son bien conocidas en la tecnica (vease por ejemplo Creighton (1984) Proteins. (. H. Freeman and Company (Eds.) y la Tabla 1 siguiente).

Tabla 1: Ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoacidos

Residuo: Sustituciones conservadoras Residuo Sustituciones conservadoras

Ala: Ser Leu lle; Val

Arg: Lys Lys Arg; Gln

Asn: Gln; His Met Leu; lle

Asp: Glu Phe Met; Leu; Tyr

Gln: Asn Ser Thr, Gly

Cys: Ser Thr Ser, Val

Glu: Asp Trp Tyr

Gly: Pro Tyr Trp; Phe

His: Asn; Gln Val lle; Leu

lle: Leu, Val

Las sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoacidos se pueden realizar facilmente utilizando tecnicas de sintesis de peptidos bien conocidas en la tecnica, tales como la sintesis de peptidos en fase s6lida y similares, o por medio de manipulaci6n de ADN recombinante. Los metodos para la manipulaci6n de las secuencias de ADN para producir las variantes de sustituci6n, inserci6n o supresi6n de una proteina son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, las tecnicas para realizar mutaciones de sustituci6n en sitios predeterminados en el ADN son bien conocidas por aquellos ordinariamente capacitados en la tecnica e incluyen la mutagenesis M13, mutagenesis in vitro del Gen T7 (USB, Cleveland, OH), mutagenesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagenesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagenesis dirigida al sitio.

Derivados

Los "derivados" incluyen peptidos, oligopeptidos, polipeptidos los cuales pueden, en comparaci6n con la secuencia de aminoacidos de la forma de la proteina de origen natural, tal como la proteina de interes, incluir sustituciones de aminoacidos con residuos de aminoacidos que no son de origen natural, o adiciones de residuos de aminoacidos que no son de origen natural. Los "derivados" de una proteina tambien abarcan peptidos, oligopeptidos, polipeptidos los cuales incluyen residuos de aminoacidos de origen natural alterados (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados, etc.) o alterados de origen no natural comparado con la secuencia de aminoacidos de una forma de origen natural del polipeptido. Un derivado puede incluir tambien uno o mas sustituyentes o adiciones que no son de aminoacidos comparado con la secuencia de aminoacidos de la cual se deriva, por ejemplo una molecula reportera u otro ligando, enlazado en forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoacidos, tal como una molecula reportera que se enlaza para facilitar su detecci6n, y residuos de aminoacidos de origen no natural con relaci6n a la secuencia de aminoacidos de una proteina de origen natural.

Ademas, "derivados" tambien incluye fusiones de la forma de origen natural de la proteina con peptidos marcadores tales como FLAG, HlS6 o tiorredoxina (para una revisi6n de los peptidos marcadores, vease Terpe, App. Microbiol. Biotechnol. 60, 523 - 533, 2003).

Ort6logo(s) / Paralogo(s)

Los ort6logos y los paralogos abarcan conceptos evolucionarios utilizados para describir las relaciones ancestrales de los genes. Los paralogos son genes dentro de la misma especie que se han originado a traves de la duplicaci6n de un gen ancestral; los ort6logos son genes de diferentes organismos que se han originado a traves de especiaci6n, y se derivan tambien de un gen ancestral comun.

Dominio

El termino "dominio" se refiere a un conjunto de aminoacidos conservados en posiciones especificas a lo largo de una alineaci6n de secuencias de proteinas relacionadas por evoluci6n. Mientras que los aminoacidos en otras posiciones pueden variar entre hom6logos, los aminoacidos que son altamente conservados en posiciones especificas indican aminoacidos que son probablemente esenciales en la estructura, estabilidad o funci6n de una proteina. ldentificados por su alto grado de conservaci6n en secuencias alineadas de una familia de hom6logos de proteina, se pueden utilizar como identificadores para determinar si cualquier polipeptido en cuesti6n pertenece a una familia de polipeptidos previamente identificada.

Motivo / Secuencia de consenso / Firma

El termino "motivo" o "secuencia de consenso" o "firma" se refieren a una regi6n conservada corta en la secuencia de proteinas relacionadas por evoluci6n. Los motivos son frecuentemente partes de dominios altamente conservados, pero pueden incluir tambien solamente parte del dominio, o estar localizados fuera del dominio conservado (si todos los aminoacidos del motivo caen fuera de un dominio definido).

Hibridaci6n

El termino "hibridaci6n" como se define aqui es un proceso en donde las secuencias nucleotidicas complementarias sustancialmente hom6logas se aparean entre si. El proceso de hibridaci6n puede ocurrir completamente en soluci6n, es decir ambas moleculas de acido nucleico complementarias estan en soluci6n. El proceso de hibridaci6n puede ocurrir tambien con una de las moleculas complementarias de acido nucleico inmovilizadas a una matriz tal como perlas magneticas, perlas de Sefarosa o cualquier otra resina. El proceso de hibridaci6n puede ocurrir ademas con una de las moleculas complementarias de acido nucleico inmovilizadas a un soporte s6lido tal como una membrana de nitrocelulosa o de nailon o inmovilizada, por ejemplo, por medio de fotolitografia, por ejemplo a un soporte de vidrio siliceo (este ultimo conocido como arreglos de secuencias de acido nucleico o microarreglos o como chips de secuencias de acido nucleico). Con el prop6sito de permitir que se produzca la hibridaci6n, las moleculas de acido nucleico son generalmente desnaturalizadas termica o quimicamente para fundir una hebra bicatenaria en dos hebras individuales y/o para remover horquillas u otras estructuras secundarias de las moleculas de acido nucleico monocatenario.

El termino "rigurosidad" se refiere a las condiciones bajo las cuales tiene lugar una hibridaci6n. La rigurosidad de la hibridaci6n esta influenciada por condiciones tales como la temperatura, la concentraci6n salina, la fuerza i6nica y la composici6n del amortiguador de hibridaci6n. En general, las condiciones de baja rigurosidad se seleccionan para que sean aproximadamente 30°C menores al punto de fusi6n termico (Tm) para la secuencia especifica a una fuerza i6nica y pH definidos. Las condiciones de rigurosidad media se dan en los casos donde la temperatura esta 20°C por debajo de la Tm, y las condiciones de alta rigurosidad se dan en los casos cuando la temperatura esta 10°C por debajo de la Tm. Las condiciones de hibridaci6n de alta rigurosidad se utilizan tipicamente para aislar las secuencias de hibridaci6n que tienen una gran similitud de secuencia con la secuencia de acido nucleico objetivo. Sin embargo, las secuencias de acido nucleico pueden desviarse en secuencia e incluso codificar un polipeptido sustancialmente identico, debido a la degeneraci6n del c6digo genetico. Por lo tanto, algunas veces pueden ser necesarias condiciones de hibridaci6n de rigurosidad media, para identificar tales moleculas de secuencia de acido nucleico.

La Tm es la temperatura en condiciones de una fuerza i6nica y pH defnidos, a la cual 50% de la secuencia objetivo hibrida a una sonda perfectamente emparejada. La Tm depende de las condiciones de la soluci6n y de la composici6n base y la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias mas largas hibridan especifcamente a temperaturas mas elevadas. La velocidad maxima de hibridaci6n se obtiene aproximadamente desde 16°C hasta 32°C por debajo de la Tm. La presencia de cationes monovalentes en la soluci6n de hibridaci6n reduce la repulsi6n electrostatica entre las dos hebras de la secuencia de acido nucleico promoviendo de este modo la formaci6n del hibrido; este efecto es visible para concentraciones de sodio de hasta 0,4 M (para concentraciones mas elevadas, este efecto puede ignorarse). La formamida reduce la temperatura de fusi6n de los duplex ADN-ADN y ADN-ARN con 0,6 hasta 0,7°C para cada por ciento de formamida, y la adici6n de 50% de formamida permite que la hibridaci6n se lleve a cabo entre 30 a 45°C, si bien la velocidad de la hibridaci6n se disminuira. La falta de emparejamiento de los pares de bases reduce la velocidad de hibridaci6n y la estabilidad termica de los duplex. En promedio y para sondas largas, la Tm disminuye aproximadamente 1°C por % de falta de emparejamiento de las bases. La Tm puede calcularse utilizando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de hibridos:

1) hibridos de ADN - ADN (Meinkoth y(ahl, Anal. Biochem, 138: 267 - 284, 1984):

Tm = 81,5°C + 16,6 x log10 [Na+]a + 0,41 x % [G/Cb] - 500 x [Lc]-1 - 0,61 x % de formamida

2) hibridos de ADN - ARN o ARN - ARN:

Tm = 79,8 + 18,5 (log10 [Na+]a) + 0,58 (% de G/Cb) + 11,8 (% de G/Cb)2 - 820/Lc

3) hibridos de oligo - ADN u oligo - ARNd:

Para <20 nucle6tidos: Tm = 2 (ln)

Para 20 -35 nucle6tidos: Tm = 22 + 1,46 (ln)

a o para otro cati6n monovalente, pero s6lo preciso en el rango de 0,01 - 0,4 M.

b s6lo preciso para % de GC en el rango de 30% a 75%.

c L = longitud del duplex en pares de bases.

d oligo, oligonucle6tido; ln, = longitud efectiva del cebador = 2 x (no. de G/C) + (no. de A/T).

El enlazamiento no especifico se puede controlar utilizando cualquiera entre una cantidad de tecnicas conocidas tales como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contienen proteina, adiciones de ARN heter6logo, ADN, y SDS al amortiguador de hibridaci6n, y tratamiento con ARNasa. Para las sondas no hom6logas, se puede llevar a cabo una serie de hibridaciones variando uno de (i) disminuci6n progresiva de la temperatura de apareamiento (por ejemplo de 68°C hasta 42°C) o (ii) disminuci6n progresiva de la concentraci6n de formamida (por ejemplo desde 50% hasta 0%). La persona ordinariamente capacitada conoce diferentes parametros que pueden ser alterados durante la hibridaci6n y los cuales o bien mantendran o cambiaran las condiciones de rigurosidad.

Ademas de las condiciones de hibridaci6n, la especifcidad de la hibridaci6n tipicamente tambien depende de la funci6n de los lavados posteriores a la hibridaci6n. Para eliminar el medio resultante de la hibridaci6n no especifca, se lavan las muestras con soluciones salinas diluidas. Los factores criticos de tales lavados incluyen la fuerza i6nica y la temperatura de la soluci6n final de lavado: cuanto mas baja la concentraci6n de sal y mas alta la temperatura de lavado, mayor la rigurosidad del lavado. Las condiciones de lavado se llevan a cabo tipicamente en o por debajo de la rigurosidad de la hibridaci6n. Una hibridaci6n positiva produce una sefal que es al menos dos veces aquella de la sefal de fondo. En general, las condiciones rigurosas adecuadas para los ensayos de hibridaci6n de la secuencia de acido nucleico o los procedimientos de detecci6n por amplificaci6n genica son como se expusieron anteriormente. Las condiciones mas o menos rigurosas tambien se pueden seleccionar. Una persona normalmente capacitada en la tecnica conoce diferentes parametros que pueden ser alterados durante el lavado y que o bien mantendran o cambiaran las condiciones de rigurosidad.

Por ejemplo, las condiciones tipicas de hibridaci6n de alta rigurosidad para los hibridos de ADN de longitud superior a 50 nucle6tidos abarcan la hibridaci6n a 65°C en 1x SSC o a 42°C en 1x SSC y 50% de formamida, seguido por un lavado a 65°C en 0,3x SSC. Los ejemplos de condiciones de hibridaci6n de rigurosidad media para los hibridos de ADN de longitud superior a 50 nucle6tidos abarcan la hibridaci6n a 50°C en 4x SSC o a 40°C en 6x SSC y 50% de formamida, seguido por un lavado a 50°C en 2x SSC. La longitud del hibrido es de la longitud anticipada para la hibridaci6n del acido nucleico. Cuando se hibridan moleculas de acido nucleico de secuencia conocida, se puede determinar la longitud del hibrido por medio de la alineaci6n de las secuencias y la identificaci6n de las regiones conservadas descritas aqui. 1x SSC es NaCl 0,15 M y citrato s6dico 15 mM; la soluci6n de hibridaci6n y las soluciones de lavado pueden incluir ademas 5 x del reactivo de Denhardt, 0,5 -1,0% de SDS, 100 !g/ml de ADN de esperma de salm6n fragmentado y desnaturalizado, 0,5% de pirofosfato de sodio.

Para los prop6sitos de defnir el nivel de rigurosidad, puede hacerse referencia a Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a Edici6n, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New Iork o a Current Protocols in Molecular Biology, John (iley & Sons, N.I. (1989 y sus actualizaciones anuales).

Variante de Empalme

El termino "variante de empalme" tal como se utiliza aqui abarca las variantes de una secuencia de acido nucleico en las cuales se han suprimido, reemplazado, desplazado o agregado los intrones y/o exones seleccionados, o en las cuales se han acortado o alargado los intrones. Tales variantes seran aquellas en las cuales se retiene sustancialmente la actividad biol6gica de la proteina; esto se puede lograr reteniendo selectivamente segmentos funcionales de la proteina. Tales variantes de empalme pueden hallarse en la naturaleza o pueden ser artificiales. Los metodos para predecir y aislar tales variantes de empalme son bien conocidos en la tecnica (ver por ejemplo

Foissac y Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).

Variante alelica

Los alelos o las variantes alelicas son formas alternativas de un gen dado, localizados en la misma posici6n cromos6mica. Las variantes alelicas abarcan los Polimorfismos de un Solo Nucle6tido (SNP por sus siglas en ingles), asi como tambien los Polimorfismos de lnserci6n/Supresi6n pequefa (lNDEL por sus siglas en ingles). El tamafo de los lNDEL es usualmente inferior a 100 pb. Los SNP y los lNDEL forman el conjunto mas grande de variantes de secuencia en las cadenas polim6rficas de origen natural de la mayoria de los organismos.

Transposici6n de genes / Evoluci6n dirigida

La transposici6n de genes o la evoluci6n dirigida consiste de iteraciones de la transposici6n del ADN seguida por la detecci6n y/o selecci6n apropiada para generar variantes de secuencias de acido nucleico o porciones de las mismas que codifcan las proteinas que tienen una actividad biol6gica modificada (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151 - 4; patentes estadounidenses Nos. 5.811.238 y 6.395.547).

Elemento regulador / Secuencia de control / Promotor

Los terminos "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" se utilizan todos en forma intercambiable en la presente descripci6n y se deben tomar en un contexto amplio para referirse a secuencias reguladoras de acido nucleico capaces de efectuar la expresi6n de las secuencias a las cuales estan ligadas. El termino 'promotor' tipicamente se refiere a una secuencia control de la secuencia de acido nucleico localizada secuencia arriba del inicio de la transcripci6n de un gen y la cual esta involucrada en el reconocimiento y enlazamiento de la ARN polimerasa y otras proteinas, dirigiendo de este modo la transcripci6n de un de acido nucleico operativamente enlazado. Abarcados por los terminos antes mencionados, se hallan las secuencias reguladoras de la transcripci6n que se derivan de un gen gen6mico eucariota clasico (que incluye la caja TATA la cual es necesaria para la iniciaci6n precisa de la transcripci6n, con o sin una secuencia de la caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras secuencia arriba, reforzadoras y silenciadoras) los cuales alteran la expresi6n genica en respuesta a estimulos de desarrollo y/o externos, o en una forma especifica del tejido. Tambien se incluyen dentro del termino una secuencia reguladora de la transcripci6n de un gen procariota clasico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras de la transcripci6n de caja -10. El termino "elemento regulador" tambien abarca una molecula sintetica de fusi6n o un derivado que confiere, activa o mejora la expresi6n de una molecula de la secuencia de acido nucleico en una celula, tejido u 6rgano.

Un "promotor de una planta" incluye elementos reguladores, los cuales median la expresi6n de un segmento de una secuencia de codificaci6n en celulas de plantas. El "promotor de la planta" preferiblemente se origina a partir de una celula de la planta, por ejemplo, a partir de la planta la cual es transformada con la secuencia de acido nucleico que va a ser expresada en el proceso de la invenci6n y descrita aqui. Esto tambien aplica a otras sefales reguladoras de la "planta", tales como terminadores de la "planta". Los promotores secuencia arriba de las secuencias nucleotidicas utiles en los metodos de la presente invenci6n pueden ser modificados mediante una o mas sustituciones, inserciones y/o supresiones de nucle6tidos sin interferir con la funcionalidad o actividad ya sea de los promotores, el marco de lectura abierto (ORF por sus siglas en ingles) o la regi6n reguladora 3' tal como terminadores u otras regiones reguladoras 3' las cuales se localizan lejos del ORF. Ademas es posible que la actividad de los promotores se incremente por la modificaci6n de su secuencia, o que sean completamente reemplazados por promotores mas activos, incluso promotores de organismos heter6logos. Para la expresi6n en plantas, la molecula de la secuencia de acido nucleico debe, como se describi6 anteriormente, estar operativamente enlazada a un promotor adecuado, o contener un promotor adecuado, el cual expresa al gen en el momento adecuado y con el patr6n de expresi6n espacial requerido.

Para la identificaci6n de promotores funcionalmente equivalentes, se pueden analizar la fuerza del promotor y/o el patr6n de expresi6n de un promotor candidato por ejemplo enlazando operativamente el promotor a un gen reportero y ensayando el nivel de expresi6n y el patr6n del gen reportero en diferentes tejidos de la planta. Los genes reporteros adecuados bien conocidos incluyen por ejemplo a la beta-glucuronidasa o a la beta-galactosidasa. La actividad del promotor se ensaya mediante la medici6n de la actividad enzimatica de la beta-glucuronidasa o la betagalactosidasa. La fuerza del promotor y/o el patr6n de expresi6n pueden ser comparados luego con la de un promotor de referencia (tal como el utilizado en los metodos de la presente invenci6n). En forma alternativa, la fuerza del promotor se puede ensayar cuantificando los niveles de ARNm o comparando los niveles de ARNm de la secuencia de acido nucleico utilizada en los metodos de la presente invenci6n, con niveles de ARNm de los genes de mantenimiento tales como el ARNr 18S, utilizando metodos conocidos en la tecnica, tal como las transferencias tipo Northern con analisis densitometrico de autorradiogramas, PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR (Heid et al, 1996, Genome Methods 6: 986 - 994). En general, por "promotor debil" se entiende un promotor que dirige la expresi6n de una secuencia de codificaci6n a un nivel bajo. Por "nivel bajo" se entiende a niveles de aproximadamente 1/10.000 de transcriptos hasta aproximadamente 1/100.000 de transcriptos, hasta

aproximadamente 1/500.0000 de transcriptos por celula. Por el contrario, un "promotor fuerte" dirige la expresi6n de una secuencia de codificaci6n a nivel alto, o aproximadamente a 1/10 de transcriptos hasta aproximadamente 1/100 de transcriptos hasta aproximadamente 1/1.000 de transcriptos por celula. En general, por "promotor de fuerza media" se entiende un promotor que dirige la expresi6n de una secuencia de codificaci6n a un nivel que esta en todos los casos por debajo de aquel obtenido bajo el control de un promotor 35S del CaMV.

Operativamente enlazado

El termino "operativamente enlazado" tal como se utiliza aqui, se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interes, de modo que la secuencia promotora pueda iniciar la transcripci6n del gen de interes.

Promotor constitutivo

Un "promotor constitutivo" se refere a un promotor que es transcripcionalmente activo durante la mayoria de las fases, pero no necesariamente todas, de crecimiento y desarrollo y bajo la mayoria de las condiciones ambientales, en al menos una celula, tejido u 6rgano. La Tabla 2a a continuaci6n muestra ejemplos de promotores constitutivos.

Tabla 2a: Ejemplos de promotores constitutivos de la planta

Fuente de Genes: Referencia

Actina: McElroy et al, Plant Cell, 2: 163 - 171, 1990

HMGB: (O 2004/070039

GOS2: de Pater et al, Plant J Nov; 2(6): 837 -44, 1992, (O 2004/065596

Ubiquitina: Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675 - 689, 1992

Ciclofilina de arroz: Buchholz et al, Plant Mol Biol. 25(5): 837 - 43, 1994

Histona H3 de maiz: Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276 - 285, 1992

Histona H3 de alfalfa: (u et al. Plant Mol. Biol. 11: 641 - 649, 1988

Actina 2: An et al, Plant J. 10(1); 107 - 121, 1996

Subunidad pequefa de Rubisco: Patente de los Estados Unidos No. 4.962.028

Ocs: Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553

SAD1: Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

SAD2: Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

V-ATPasa: (O 01/14572

Proteinas de caja G: (O 94/12015

Promotor ubicuo

Un promotor ubicuo es activo sustancialmente en todos los tejidos o celulas de un organismo.

Promotor regulado por desarrollo

Un promotor regulado por desarrollo es activo durante ciertas etapas del desarrollo o en partes de la planta que experimentan cambios en el desarrollo.

Promotor inducible

Un promotor inducible ha inducido o incrementado la iniciaci6n de la transcripci6n en respuesta a un estimulo quimico (para una revisi6n vease Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89 -108), ambiental o fisico, o puede ser "inducible por estres", es decir activado cuando una planta es expuesta a diferentes condiciones de estres, o un promotor "inducible por pat6genos", es decir activado cuando una planta es expuesta a diferentes pat6genos.

Promotor especifco de un 6rgano / Especifco de un tejido

Un promotor especifco de un 6rgano o especifico de un tejido es uno que es capaz de iniciar Preferiblemente la transcripci6n en ciertos 6rganos o tejidos, tales como las hojas, las raices, el tejido de la semilla, etc. Por ejemplo, un "promotor especifco de la raiz" es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en las raices de la planta, sustancialmente con la exclusi6n de cualquier otra parte de una planta, mientras que aun permite cualquier expresi6n defectuosa en estas otras partes de la planta. Los promotores capaces de iniciar la transcripci6n en ciertas celulas unicamente se denominan aqui como "especificos de la celula".

Ejemplos de promotores especificos de la raiz se enumeran en la Tabla 2b a continuaci6n:

Tabla 2b: Ejemplos de promotores especificos de la raiz

Fuente del gen: Referencia

RCc3: Plant Mol Biol. 1995 Jan; 27(2): 237 -48

PHT1 de Arabidopsis: Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)

Transportador de fosfato de Medicago: Xiao et al., 2006

Pyk10 de Arabidopsis: Nitz et al. (2001) Plant Sci 161(2): 337 - 346

Genes expresable en la raiz: Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987.

Gen inducible por la auxina del tabaco: Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.

-tubulina: Oppenheimer, et al., Gene 63: 87, 1988.

Genes especificos de la raiz del tabaco: Conkling, et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.

Gen G1-3b de B. napus: United States Patent No. 5, 401, 836

SbPRP1: Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109 - 119, 1993.

LRX1: Baumberger et al. 2001, Genes & Dev. 15: 1128

BTG-26 Brassica napus: US 20050044585

Lede AHL 19/201 (tomate): Lauter et al. (1996, PNAS 3:8139)

El LeNRT1-1 (tomate): Lauter et al. (1996, PNAS 3:8139)

Gen de la patatina clase l (patata): Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386 - 395, 1991.

KDC1 (Daucus carota): Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)

Gen TobRB7: ( Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC, EUA

OsRAB5a (arroz): (ang et al. 2002, Plant Sci. 163: 273

ALF5 (Arabidopsis): Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)

NRT2;1 Np (N. plumbaginifolia) Lectina especifica de la raiz de la cebada: Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34:265) Lerner & Raikhel (1989) Plant Phys 91: 124 -129

Proteina rica en hidroxiprolina especifica de la raiz: Keller & Lamb (1989) Genes & Dev 3: 1639 - 1646

CDC27B/hobbit de Arabidopsis: Blilou et al. (2002) Genes & Dev 16: 2566 - 2575

Un promotor especifco de semilla es transcripcionalmente activo predominantemente en el tejido de la semilla, pero

5 no necesariamente exclusivamente en el tejido de la semilla (en casos de expresi6n defectuosa). El promotor especifico de la semilla puede estar activo durante el desarrollo de la semilla y/o durante la germinaci6n. Ejemplos de promotores especificos de semilla se muestran en la Tabla 2c a continuaci6n. Otros ejemplos de promotores especifcos de semilla se presentan en Qing Qu y Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113 - 125, 2004), cuya divulgaci6n se incorpora aqui por referencia como si se la hubiera expuesto en su totalidad.

10 Tabla 2c: Ejemplos de promotores especificos de la semillas

Fuente de Genes: Referencia

Gene especificos de la semilla: Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985.

Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.

Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

Albumina de la nuez del Brasil: Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235 - 245, 1992.

Legumina: Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203 - 214, 1988.

glutelina (arroz): Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15 - 22, 1986;

Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43 -47, 1987.

Zeina: Matzke et al Plant Mol Biol, 14(3): 323 - 32 1990

NapA: Stalberg et al, Planta 199: 515 - 519, 1996.

Glutenina-1 LM( y HM( de trigo: Mol Gen Genet 216: 81 - 90, 1989; NAR 17: 461 - 2, 1989

SPA de trigo: Albani et al, Plant Cell, 9: 171-184, 1997

a, �, -gliadinas de trigo: EMBO J. 3: 1409 - 15, 1984

Promotor ltr1 de cebada: Diaz et al. (1995) Mol Gen Genet 248(5): 592 -8

Hordeina B1, C, D de cebada: Theor Appl Gen 98: 1253 - 62, 1999; Plant J 4: 343 - 55, 1993; Mol Gen Genet 250: 750 - 60, 1996

DOF de cebada: Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53 - 62, 1998

blz2: EP99106056.7

Promotor sintetico: Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629 - 640, 1998.

Prolamina NRP33 de arroz: (u et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885 - 889, 1998

a-globulina Glb-1 de arroz: (u et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885 - 889, 1998

(continuaci6n)

Fuente de Genes: Referencia

OSH1 de arroz: Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117 -8122, 1996

a-globulina REB/OHP-1 de arroz: Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513 - 522, 1997

ADP-glucosa pirofosforilasa de arroz: Trans Res 6: 157 - 68, 1997

Familia de genes ESR del maiz: Plant J 12: 235 - 46, 1997

a-kafirina del sorgo: DeRose et al., Plant Mol. Biol 32: 1029 - 35, 1996

KNOX: Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39: 257 - 71, 1999

Oleosina del arroz: (u et al, J. Biochem. 123: 386, 1998

Oleosina de girasol: Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873 - 876, 1992

Proteina ribosomal 40S putativa del arroz, PR00117: (O 2004/070039

Alanina aminotransferasa del arroz, PRO0136: No publicada

lnhibidor lTR1 de tripsina (cebada), PRO0147: No publicada

(Sl18 de arroz, PRO0151: (O 2004/070039

RAB21 de arroz, PRO0175: (O 2004/070039

PRO005: (O 2004/070039

PRO0095: (O 2004/070039

a-amilasa (Amy32b): Lanahan et al, Plant Cell 4: 203 - 211, 1992; Skriver et al, Proc Natl Acad Sci USA 88: 7266 - 7270, 1991

Gen tipo catepsina: Cejudo et al, Plant Mol Biol 20: 849 -856, 1992

Cebada Ltp2: Kalla et al., Plant J. 6: 849 - 60, 1994

Chi26: Leah et al., Plant J. 4: 579 - 89, 1994

Maiz B-Peru: Selinger et al., Genetics 149; 1125 - 38, 1998

Un "promotor activo en partes aereas" se refiere a un promotor que es capaz de iniciar preferencialmente la

5 transcripci6n en partes aereas de una planta sustancialmente con la exclusi6n de cualquier otra de las partes de la planta (especificamente las partes por debajo de las partes aereas), mientras que todavia permite cualquier expresi6n defectuosa en esas otras partes de la planta. La Tabla 2d a continuaci6n muestra ejemplos de tales promotores, que son transcripcionalmente activos predominantemente en tejido verde.

Un promotor especifico del tejido verde como se define aqui, es un promotor que es transcripcionalmente activo

10 predominantemente en tejido verde, sustancialmente con la exclusi6n de cualquier otra de las partes de una planta, mientras que aun permite cualquier expresi6n defectuosa en estas otras partes de la planta.

Ejemplos de promotores especificos del tejido verde que pueden ser utilizados para llevar a cabo los metodos de la invenci6n son presentados en la Tabla 2d a continuaci6n.

Tabla 2d: Ejemplos de promotores especificos del tejido verde

Gen: Expresi6n Referencia

Ortofosfato diquinasa del maiz: Especifica de la hoja Fukavama et al., 2001

Fosfoenolpiruvato carboxilasa del maiz: Especifica de la hoja Kausch et al., 2001

Fosfoenolpiruvato carboxilasa del arroz: Especifica de la hoja Liu et al., 2003

Pequefa subunidad de Rubisco del arroz: Especifica de la hoja Nomura et al., 2000

Beta expansina EXBP9 del arroz: Especifica del brote (O 2004/070039

Pequefa subunidad de Rubisco del guandu: Especifica de la hoja Panguluri et al., 2005

RBCS3A del guisante: Especifica de la hoja

15 Otro ejemplo de un promotor especifico del tejido es un promotor especifico del meristema, el cual es transcripcionalmente activo predominantemente en el tejido meristematico, sustancialmente con la exclusi6n de cualquier otra de las partes de una planta, mientras que aun permite cualquier expresi6n defectuosa en estas otras partes de la planta. Ejemplos de promotores especificos del meristema que pueden ser utilizados para llevar a cabo

20 los metodos de la invenci6n se presentan en la Tabla 2e a continuaci6n.

Tabla 2e: Ejemplos de promotores especifcos del meristema

Fuente del gen: Patr6n de expresi6n Referencia

OSH1 del arroz: Meristema apical del brote, desde la etapa globular embrionaria hasta la etapa de plantula Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117 -8122

Metalotioneina del arroz: Especifico del meristema BAD87835.1

(AK1 & (AK 2: Meristemas apicales de raiz y de brote, y en hojas y sepalos en expansi6n (agner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303 - 318

Tabla 2f: Ejemplos de promotores especificos del endospermo

Fuente del gen: Referencia

glutelina (arroz): Takaiwa et al. (1986) Mol Gen Genet 208: 15 - 22; Takaiwa et al. (1987) FEBS Letts. 221: 43 - 47

zeina: Matzke et al., (1990) Plant Mol Biol 14(3): 323 - 32

glutenina-1 de alto y de bajo peso molecular del trigo: Colot et al. (1989) Mol Gen Genet 216: 81 - 90, Anderson et al. (1989) NAR 17: 461 - 2

SPA de trigo: Albani et al. (1997) Plant Cell 9: 171 - 184

gliadinas del trigo: Rafalski et al. (1984) EMBO 3: 1409 -15

Promotor ltr1 de cebada: Diaz et al. (1995) Mol Gen Genet 248(5): 592 -8

Hordeina de cebada B1, C, D: Cho et al. (1999) Theor Appl Genet 98: 1253 - 62; Muller et al. (1993) Plant J 4: 343 -55; Sorenson et al. (1996) Mol Gen Genet 250: 750 - 60

DOF de cebada: Mena et al, (1998) Plant J 116(1): 53 -62

blz2: Onate et al. (1999) J Biol Chem 274(14): 9175 - 82

(continuaci6n)

Fuente del gen: Referencia

Promotor sintetico: Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J 13: 629 - 640

Prolamina NRP33 de arroz: (u et al, (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885 - 889

Globulina Glb-1 de arroz: (u et al. (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885 - 889

Globulina REB/OHP-1 de arroz: Nakase et al. (1997) Plant Molec Biol 33: 513 - 522

ADP-glucosa pirofosforilasa de arroz: Russell et al. (1997) Trans Res 6: 157 - 68

Familia del gen ESR de maiz: Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J 12: 235 - 46

Kafirina de sorgo: DeRose et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 1029 - 35

Tabla 2g: Ejemplos de promotores especificos del embri6n

Fuente del gen: Referencia

OSH1 de arroz: Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117 -8122, 1996

KNOX: Postma - Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39: 257 - 71, 1999

PRO0151: (O 2004/070039

PRO0175: (O 2004/070039

PRO005: (O 2004/070039

PRO0095: (O 2004/070039

Tabla 2h: Ejemplos de promotores especificos de la aleurona

Fuente del gen: Referencia

Gen del tipo catepsina �: Cejudo et al, Plant Mol Biol 20: 849 -856, 1992

Ltp2 de cebada: Kalla et al., Plant J. 6: 849 - 60, 1994

Chi26: Leah et al., Plant J. 4: 579 - 89, 1994

B-Peru de maiz: Selinger et al., Genetics 149; 1125 - 38,1998

Terminador

El termino "terminador" abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN al extremo de una unidad de 15 transcripci6n la cual sefala el procesamiento 3' y la poliadenilaci6n de un transcripto primario y la terminaci6n de la 12

transcripci6n. El terminador puede derivarse del gen natural, a partir de una variedad de otros genes de planta, o del ADN-T. El terminador que va a ser afadido puede derivarse de, por ejemplo, los genes de la nopalina sintasa o de la octopina sintasa, o en forma alternativa de otro gen de la planta, o con menor preferencia a partir de cualquier otro gen eucariota.

Modulaci6n

El termino "modulaci6n" significa en relaci6n con expresi6n o con expresi6n genica, un proceso en el cual el nivel de expresi6n es cambiado por dicha expresi6n genica en comparaci6n con la planta de control, Preferiblemente el nivel de expresi6n se incrementa. La expresi6n original, no modulada puede ser de cualquier tipo de expresi6n de un ARN estructural (ARNr, ARNt) o de ARNm con posterior traducci6n. El termino "que modula la actividad" significa cualquier cambio de la expresi6n de las secuencias de acido nucleico de la invenci6n o las proteinas codificadas, lo cual conduce a un mayor rendimiento y/o a un mayor crecimiento de las plantas.

Expresi6n

El termino "expresi6n" o "expresi6n genica" significa la transcripci6n de un gen especifico o genes especificos o constructo genetico especifico. El termino "expresi6n" o "expresi6n genica" significa en particular la transcripci6n de un gen o genes o un constructo genetico en un ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con o sin traducci6n posterior de este ultimo en una proteina. El proceso incluye la transcripci6n de ADN y el procesamiento del producto de ARNm resultante.

Expresi6n incrementada / sobreexpresi6n

El termino "expresi6n incrementada" o "sobreexpresi6n" tal como se utiliza aqui signifca cualquier forma de expresi6n que sea adicional al nivel original de expresi6n de tipo silvestre.

Los metodos para incrementar la expresi6n de los genes o de los productos genicos estan bien documentados en la tecnica e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresi6n conducida por promotores apropiados, el uso de incrementadores de la transcripci6n o incrementadores de la traducci6n. Las secuencias de acido nucleico aisladas que sirven como elementos promotores o incrementadores pueden ser introducidas en una posici6n apropiada (tipicamente secuencia arriba) de una forma no heter6loga de un polinucle6tido para favorecer la expresi6n de una secuencia de acido nucleico que codifica al polipeptido de interes. Por ejemplo, los promotores end6genos pueden ser alterados in vivo por medio de mutaci6n, supresi6n, y/o sustituci6n (vease, Kmiec, patente de los Estados Unidos No. 5.565.350; Zarling et al., (O9322443), o se pueden introducir los promotores aislados en una celula de una planta en la orientaci6n y distancia apropiados de un gen de la presente invenci6n para controlar la expresi6n del gen.

Si se desea una expresi6n polipeptidica, en general es deseable incluir una regi6n de poliadenilaci6n en el extremo 3' de un regi6n de codificaci6n del polinucle6tido. La regi6n de poliadenilaci6n puede derivarse del gen natural, a partir de una variedad de otros genes de la planta, o a partir del ADN-T. La secuencia del extremo de 3' que va a ser afadida puede derivarse, por ejemplo, de los genes de la nopalina sintasa o de la octopina sintasa, o en forma alternativa a partir de otro gen de la planta, o menos preferiblemente a partir de cualquier otro gen eucariota.

Tambien se puede afadir una secuencia del intr6n a la regi6n no traducida (UTR) 5' o en la secuencia codificadora de la secuencia de codificaci6n parcial para incrementar la cantidad del mensaje de maduraci6n que se acumula en el citosol. La inclusi6n de un intr6n que puede empalmarse en la unidad de transcripci6n tanto en los constructos de expresi6n de plantas como de animales ha demostrado que incrementa la expresi6n genica tanto en los niveles de ARNm como de proteina hasta 1000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395 -4405; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183 -1200). Tal incremento del intr6n de la expresi6n genica es tipicamente mayor cuando se localiza cerca del extremo 5' de la unidad de transcripci6n. El uso de los intrones del maiz, intr6n Adh1-S 1, 2 y 6 y el intr6n de Bronce-1 es conocido en la tecnica. Para informaci6n general, vease: The Maize Handbook, Capitulo 116, Freeling and (albot, Eds., Springer, N.I. (1994).

Gen end6geno

La referencia aqui a un gen "end6geno" no s6lo se refiere al gen en cuesti6n tal como se encuentra en una planta en su forma natural (es decir, sin que exista intervenci6n humana alguna), sino que tambien se refiere al mismo gen (o un acido nucleico/gen sustancialmente hom6logo) en un forma aislada posteriormente (re)introducido en una planta (un transgen). Por ejemplo, una planta transgenica que contiene dicho transgen puede encontrar una reducci6n sustancial de la expresi6n del transgen y/o una reducci6n sustancial de la expresi6n del gen end6geno.

El gen aislado se puede aislar de un organismo o ser elaborado por el hombre, por ejemplo por medio de sintesis quimica.

Expresi6n disminuida

La referencia que se hace aqui a una "expresi6n disminuida" o a una "reducci6n o eliminaci6n sustancial" de la expresi6n se pretende que signifique una disminuci6n en la expresi6n del gen end6geno y/o de los niveles de polipeptido y/o de la actividad del polipeptido con relaci6n a las plantas de control. La reducci6n o la eliminaci6n sustancial es en orden creciente de preferencia una reducci6n de al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas en comparaci6n con las de las plantas de control.

Para la reducci6n o la eliminaci6n sustancial de la expresi6n de un gen end6geno en una planta, se requiere de una longitud suficiente de nucle6tidos sustancialmente contiguos de una secuencia de acido nucleico. Con el fin de llevar a cabo el silenciamiento genico, este puede ser tan pequefo como de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos nucle6tidos, alternativamente este puede ser tanto como el gen completo (incluyendo la UTR de 5' y/o 3', ya sea en parte o completa). El alargamiento de nucle6tidos sustancialmente contiguos puede derivarse de la secuencia de acido nucleico que codifica la proteina de interes (gen objetivo), o de cualquier secuencia de acido nucleico capaz de codificar un ort6logo, un paralogo o un hom6logo de la proteina de interes. Preferiblemente, el alargamiento de los nucle6tidos sustancialmente contiguos es capaz de formar enlaces de hidr6geno con el gen objetivo (ya sea una cadena sentido o antisentido), mas preferiblemente, el alargamiento de los nucle6tidos sustancialmente contiguos tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia del 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% con respecto al gen objetivo (ya sea una cadena sentido o antisentido). Una secuencia de acido nucleico que codifca un polipeptido (funcional) no es un requerimiento para los diferentes metodos discutidos aqui para la reducci6n o eliminaci6n sustancial de la expresi6n de un gen end6geno.

Esta reducci6n o eliminaci6n sustancial de la expresi6n puede lograrse mediante el uso de herramientas y tecnicas de rutina. Un metodo para la reducci6n o eliminaci6n sustancial de la expresi6n del gen end6geno es mediante el silenciamiento mediado por ARN utilizando una repetici6n invertida de una secuencia de acido nucleico o una parte de la misma (en este caso un alargamiento de nucle6tidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interes, o de cualquier secuencia de acido nucleico capaz de codifcar un ort6logo, paralogo u hom6logo de la proteina de interes), preferiblemente capaz de formar una estructura de horquilla. Otro ejemplo de un metodo de silenciamiento del ARN involucra la introducci6n de secuencias de acido nucleico o de partes de las mismas (en este caso un alargamiento de nucle6tidos sustancialmente contiguos que derivan del gen de interes, o de cualquier secuencia de acido nucleico capaz de codifcar un ort6logo, paralogo u hom6logo de la proteina de interes), en una orientaci6n sentido en una planta. Otro ejemplo de un metodo de silenciamiento de ARN involucra el uso de secuencias de acido nucleico antisentido. El silenciamiento genico tambien puede lograrse mediante mutagenesis de inserci6n (por ejemplo, inserci6n de ADN-T o inserci6n de un transpos6n) o mediante estrategias como las descritas, entre otros, por Angeli y Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357 -62), (Amplic6n VlGS (O 98/36083), o Baulcombe ((O 99/15682). Otros metodos, tal como el uso de anticuerpos dirigidos a un polipeptido end6geno para inhibir su funci6n en la planta, o la interferencia en la ruta de sefalizaci6n en la cual esta involucrado un polipeptido, seran bien conocidos por aquellos normalmente capacitados en el arte. Se pueden utilizar microARN artificiales (miARNa) y/o naturales para desactivar la expresi6n genica y/o la traducci6n del ARNm. Los miARN end6genos son los ARN monocatenarios pequefos tipicamente de 19 - 24 nucle6tidos de largo. Los microARN artificiales (miARNa), que tienen tipicamente 21 nucle6tidos de longitud, pueden ser modificados por ingenieria genetica especificamente para regular en forma negativa la expresi6n genica de genes individuales o multiples de interes. Los determinantes de la selecci6n objetivo del ARN micro de una planta son bien conocidos en la tecnica. Los parametros empiricos para el reconocimiento del objetivo han sido definidos y pueden ser utilizados para ayudar en el disefo de los ARNmia especifcos (Schwab et at., (2005) Dev Cell 8(4): 517 - 27). Las herramientas convenientes para el disefo y generaci6n de los miARNa y sus precursores tambien se encuentran disponibles al publico (Schwab et al., (2006) Plant Cell 18(5): 1121 - 33).

En forma mas detallada:

Esta reducci6n o eliminaci6n sustancial de la expresi6n puede ser alcanzada utilizando herramientas y tecnicas de rutina. Un metodo preferido para la reducci6n o eliminaci6n sustancial de la expresi6n genica end6gena es mediante la introducci6n y expresi6n en una planta de una construcci6n genetica en la que el acido nucleico (en este caso un tramo de nucle6tidos sustancialmente contiguo derivado del gen de interes, o de cualquier acido nucleico capaz de codificar un ort6logo, paralogo o un hom6logo de una cualquiera de la proteinas de interes) se clona como una repetici6n invertida (en parte o completamente), separada por un espaciador (ADN no codificador).

En un metodo preferido tal, la expresi6n del gen end6geno se reduce o elimina sustancialmente a traves silenciamiento mediado por ARN usando una repetici6n invertida de un acido nucleico o una parte del mismo (en este caso un tramo de nucle6tidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interes, o de cualquier acido nucleico capaz de codificar un ort6logo, paralogo u hom6logo de la proteina de interes), preferiblemente capaz de formar una estructura de horquilla. La repetici6n invertida se clona en un vector de expresi6n que comprende secuencias de control. Una secuencia de acido nucleico no codificante de ADN (un espaciador, por ejemplo, un fragmento de la regi6n de uni6n de la matriz (MAR), un intr6n, un polienlazador, etc.) se encuentra entre los dos

acidos nucleicos invertidos que forman la repetici6n invertida. Despues de la transcripci6n de la repetici6n invertida, se forma un ARN quimerico con una estructura auto-complementaria (parcial o completa). Esta estructura de ARN bicatenaria se denomina como el ARN de horquilla (ARNh). El ARNh es procesado por la planta en los ARNi cortos que se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RlSC). El RlSC escinde aun mas los transcritos de ARNm, lo que reduce sustancialmente el numero de transcritos de ARNm que se traducen en polipeptidos. Para mas detalles generales vease, por ejemplo, Grierson et al. (1998) publicaci6n internacional (O 98/53083; (aterhouse et al. (1999) publicaci6n internacional (O 99/53050).

El funcionamiento de los metodos de la invenci6n no se basa unicamente en introducir y expresar en una planta una construcci6n genetica en la cual se clona el acido nucleico como una repetici6n invertida, sino en uno cualquiera o mas de los diferentes metodos de "silenciamiento de genes" bien conocidos que pueden ser utilizados para conseguir los mismos efectos.

Uno de tales metodos para la reducci6n de la expresi6n de genes end6genos es el silenciamiento mediado por ARN de la expresi6n genica (subregulaci6n). El silenciamiento en este caso se activa en una planta por medio de una secuencia de ARN bicatenario (ARNbc) que es sustancialmente similar a la del gen end6geno objetivo. Este ARNbc es procesado adicionalmente por la planta en aproximadamente 20 hasta aproximadamente 26 nucle6tidos llamados ARN cortos de interferencia (ARNi cortos). Los ARNi cortos se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RlSC) que escinde el transcrito de ARNm del gen end6geno objetivo, lo que reduce sustancialmente el numero de transcripciones de ARNm que se traducen en un polipeptido. Preferiblemente, la secuencia de ARN bicatenario corresponde a un gen objetivo.

Otro ejemplo de un metodo de silenciamiento de ARN implica la introducci6n de secuencias de acido nucleico o partes de las mismas (en este caso un tramo de nucle6tidos sustancialmente contiguos derivado del gen de interes,

o de cualquier acido nucleico capaz de codificar un ort6logo, paralogo u hom6logo de la proteina de interes) en una orientaci6n sentido en una planta. "Orientaci6n sentido" se refiere a una secuencia de ADN que es hom6loga a un transcrito de ARNm del mismo.

lntroducido en una planta seria por lo tanto al menos una copia de la secuencia de acido nucleico. La secuencia de acido nucleico adicional reducira la expresi6n del gen end6geno, dando lugar a un fen6meno conocido como cosupresi6n. La reducci6n de la expresi6n genica sera mas pronunciada si se introducen varias copias adicionales de una secuencia de acido nucleico en la planta, ya que existe una correlaci6n positiva entre altos niveles de transcripci6n y la activaci6n de la co-supresi6n.

Otro ejemplo de un metodo de silenciamiento de ARN implica el uso de secuencias de acido nucleico antisentido. Una secuencia de acido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucle6tidos que es complementaria a una secuencia de acido nucleico "sentido" que codifica una proteina, es decir, complementaria a la cadena codificadora de una molecula de ADNc bicatenario o complementaria a una secuencia de transcripci6n de ARNm. La secuencia de acido nucleico antisentido es preferentemente complementaria a la del gen end6geno que va a ser silenciado. La complementariedad se puede localizar en la "regi6n codificadora" y / o en la "regi6n no codificadora" de un gen. El termino "regi6n codificadora" se refiere a una regi6n de la secuencia de nucle6tidos que comprende codones que son traducidos en residuos de aminoacidos. El termino "regi6n no codificadora" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean la regi6n codificadora que se transcribe pero no se traduce en aminoacidos (tambien conocidas como regiones no traducidas 5' y 3').

Las secuencias de acido nucleico antisentido se pueden disefar de acuerdo con las reglas de (atson y Crick de apareamiento de bases. La secuencia de acido nucleico antisentido puede ser complementaria a toda la secuencia de acido nucleico (en este caso un tramo de nucle6tidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interes, o de cualquier acido nucleico capaz de codificar un ort6logo, paralogo u hom6logo de la proteina de interes), pero tambien pueden ser un oligonucle6tido que es antisentido a s6lo una parte de la secuencia de acido nucleico (incluyendo las UTR 5' y 3' del ARNm). Por ejemplo, la secuencia antisentido del oligonucle6tido puede ser complementaria a la regi6n que rodea el sitio de inicio de la traducci6n de un transcrito de ARNm que codifica una polipeptido. La longitud de una secuencia de oligonucle6tidos antisentido adecuada es conocida en la tecnica y puede comenzar desde aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 nucle6tidos de longitud o menos. Una secuencia de acido nucleico antisentido de acuerdo con la invenci6n puede ser construida usando sintesis quimica y reacciones de ligaci6n enzimatica utilizando metodos conocidos en la arte. Por ejemplo, una secuencia de acido nucleico antisentido (por ejemplo, una secuencia de oligonucle6tido antisentido) puede ser quimicamente sintetizada utilizando nucle6tidos de origen natural o nucle6tidos modificados en diferentes formas disefados para aumentar la estabilidad biol6gica de las moleculas o para aumentar la estabilidad fisica del duplex formado entre las secuencias de acido nucleico antisentido y sentido, por ejemplo, se pueden utilizar derivados de fosforotioato y nucle6tidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucle6tidos modificados que pueden utilizarse para generar las secuencias de acido nucleico antisentido son bien conocidos en la tecnica. Modificaciones de nucle6tidos conocidos incluyen metilaci6n, ciclizaci6n y 'tapas' y sustituci6n de uno o mas nucle6tidos de origen natural que ocurren con un analogo tal como inosina. Otras modificaciones de nucle6tidos son bien conocidas en la tecnica.

La secuencia de acido nucleico antisentido puede producirse biol6gicamente usando un vector de expresi6n en el que un secuencia de acido nucleico ha sido subclonado en una orientaci6n antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del acido nucleico insertado sera de una orientaci6n antisentido con un acido nucleico objetivo de interes). Preferiblemente, la producci6n de secuencias de acido nucleico antisentido en las plantas se produce por medio de una construcci6n de acido nucleico integrada de forma estable que comprende un promotor, un oligonucle6tido antisentido enlazado de forma operativa, y un terminador.

Las moleculas de acido nucleico utilizadas para silenciamiento en los metodos de la invenci6n (ya sea introducidas en una planta o generadas in situ) hibridan con o se enlazan con transcripciones de ARNm y/o ADN gen6mico que codifica un polipeptido para inhibir de este modo la expresi6n de la proteina, por ejemplo, mediante la inhibici6n de la transcripci6n y/o la traducci6n. La hibridaci6n puede ser por medio de complementariedad convencional de nucle6tidos para formar un duplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de acido nucleico antisentido que se enlaza con duplex de ADN, a traves de interacciones especificas en el surco mayor de la doble helice. Se pueden introducir secuencias de acido nucleico antisentido en una planta por medio de transformaci6n o inyecci6n directa en un sitio especifico del tejido. Alternativamente, las secuencias de acido nucleico antisentido se pueden modificar con celulas objetivo seleccionadas y despues administrarse sistemicamente. Por ejemplo, para administraci6n sistemica, se pueden modificar las secuencias de acido nucleico antisentido de tal manera que se unan especificamente a receptores o antigenos expresados en una superficie celular seleccionada, por ejemplo, por enlazamiento de una secuencia de acido nucleico antisentido con peptidos o anticuerpos que se enlazan con receptores de superficie celular o antigenos. Las secuencias de acido nucleico antisentido tambien se pueden suministrar a las celulas utilizando los vectores descritos en este documento.

De acuerdo con un aspecto adicional, la secuencia de acido nucleico antisentido es una secuencia de acido nucleico a-anomerico. Una secuencia de acido nucleico a-anomerico forma hibridos bicatenarios especificos con ARN complementario en el que, contrariamente a las unidades b usuales, las cadenas corren paralelas entre si (Gaultier et al. (1987) Nucl Ac Res 15: 6625 -6641). La secuencia de acido nucleico antisentido tambien puede comprender un 2'-o-metilribonucle6tido (lnoue et al. Nucl Ac Res 15, (1987) 6131 -6148) o un analogo quimerico de ARN -ADN (lnoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327 -330).

La reducci6n o eliminaci6n sustancial de la expresi6n genica end6gena tambien se pueden llevar a cabo usando ribozimas. Las ribozimas son moleculas cataliticas de ARN con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir una secuencia monocatenaria de acido nucleico, tal como un ARNm, con la que tienen una regi6n complementaria. Por lo tanto, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334, 585 -591) se puede utilizar para escindir cataliticamente transcritos de ARNm que codifican un polipeptido, reduciendo asi sustancialmente el numero de transcritos de ARNm que son traducidos en un polipeptido. Se puede disefar una ribozima que tiene especificidad por una secuencia de acido nucleico (vease, por ejemplo: Cech et al., patente de los Estados Unidos No. 4.987.071, y Cech et al., patente de los Estados Unidos No. 5.116.742). Alternativamente, se pueden utilizar los transcritos de ARNm correspondientes a una secuencia de acido nucleico para seleccionar un ARN catalitico que tiene una actividad especifica de ribonucleasa de una reserva de moleculas de RNA (Bartel y Szostak (1993) Science 261, 1411 -1418). El uso de ribozimas para silenciamiento genico en plantas es conocido en la tecnica (por ejemplo, Atkins et al. (1994) publicaci6n internacional (O 94/00012; Lenne et al. (1995) publicaci6n internacional (O 95/03404; Lutziger et al. (2000) publicaci6n internacional (O 00/00619; Prinsen et al. (1997) publicaci6n internacional (O 97/13865 y Scott et al. (1997) publicaci6n internacional (O 97/38116).

El silenciamiento genico se puede lograr tambien por medio de mutagenesis de inserci6n (por ejemplo, inserci6n de ADN-T o inserci6n de transpos6n) o por medio de estrategias como las descritas, entre otros, por Angell y Baulcombe ((1999) Plant J 20 (3): 357 -62), (Amplic6n VlGS publicaci6n internacional (O 98/36083), o Baulcombe (publicaci6n internacional (O 99/15682).

El silenciamiento genico tambien puede producirse si hay una mutaci6n en un gen end6geno y / o una mutaci6n en un gen / acido nucleico aislado introducido posteriormente en una planta. La reducci6n o eliminaci6n sustancial pueden ser causadas por un polipeptido no funcional. Por ejemplo, un polipeptido puede enlazarse con varias proteinas que interactuan; una o mas mutaciones y / o truncamientos puede por lo tanto proporcionar un polipeptido que sea todavia capaz de enlazarse con proteinas que interactuan (tales como proteinas receptoras) pero que no puede exhibir su funci6n normal (tales como un ligando de sefalizaci6n).

Otro enfoque para el silenciamiento de genes es por direccionamiento de secuencias de acido nucleico complementarias a la regi6n reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o potenciadores) para formar estructuras de triple helice que evitan la transcripci6n del gen en las celulas objetivo. Vease Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569 - 84, 1991; Helene et al, Ann. N.I. Acad. Sci. 660, 27 -36 1992 ; y Maher, L. J. Bioassays 14, 807 -15, 1992.

Otros metodos, tales como el uso de anticuerpos dirigidos a un polipeptido end6geno para la inhibici6n de su funci6n

in planta, o la interferencia en la ruta de sefalizaci6n en la que esta involucrado un polipeptido, seran bien conocidos por una persona capacitada. En particular, se puede prever que las moleculas artificiales pueden ser utiles para la inhibici6n de la funci6n biol6gica de un polipeptido objetivo, o para interferir con la ruta de sefalizaci6n en la esta involucrado el polipeptido objetivo.

Por otra parte, se puede configurar un programa de cribado para identificar en una poblaci6n de plantas variantes naturales de un gen, variantes que codifican polipeptidos con actividad reducida. Tales variantes naturales tambien se pueden utilizar, por ejemplo, para llevar a cabo la recombinaci6n hom6loga.

Se pueden utilizar microARN artificiales y/o naturales (miARN) para desactivar la expresi6n genica y/o la traducci6n del ARNm. Los miARN end6genos son pequefos ARN monocatenarios de tipicamente 19 a 24 nucle6tidos de longitud. Ellos funcionan principalmente para regular la expresi6n genica y/o la traducci6n del ARNm. La mayoria de los microARN (los miARN) tienen una complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias objetivo. Sin embargo, existen objetivos naturales con hasta cinco faltas de correspondencia. Se procesan a partir de los ARN no codificadores mas largos con estructuras plegadas caracteristicas por medio de ARNasas especificas bicatenarias de la familia Dicer. Tras el procesamiento, se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RlSC) mediante el enlazamiento con su componente principal, una proteina Argonauta. Los miARN sirven como los componentes de especificidad de RlSC, ya que aparean las bases con acidos nucleicos objetivo, en su mayoria ARNm, en el citoplasma. Eventos reguladores posteriores incluyen escisi6n y destrucci6n de ARNm objetivo y/o inhibici6n translacional. Los efectos de la sobreexpresi6n de miARN se reflejan a menudo por lo tanto en disminuci6n de los niveles de ARNm de los genes objetivo.

Los microARN artificiales (miARNa), que son tipicamente de 21 nucle6tidos de longitud, pueden ser geneticamente modificados especificamente para regular negativamente la expresi6n genica de genes individuales o multiples de interes. Los determinantes de la selecci6n objetivo de microARN de la planta son bien conocidos en la tecnica. Los parametros empiricos para el reconocimiento objetivo han sido definidos y pueden ser utilizados para ayudar en el disefo de los miARNa especificos, (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517 - 527, 2005). Tambien se encuentran disponibles al publico herramientas convenientes para el disefo y la generaci6n de los miARNa y sus precursores (Schwab et al. Plant Cell 18, 1121 - 1133, 2006).

Para un desempafo 6ptimo, las tecnicas de silenciamiento genico utilizadas para reducir la expresi6n en una planta de un gen end6geno requieren del uso de secuencias de acido nucleico de plantas monocotiled6neas para la transformaci6n de plantas monocotiled6neas, y de plantas dicotiled6neas para la transformaci6n de plantas dicotiled6neas. Preferiblemente, se introduce una secuencia de acido nucleico de cualquier especie de planta dada en esa misma especie. Por ejemplo, una secuencia de acido nucleico de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requerimiento absoluto que la secuencia de acido nucleico que va a ser introducida se origine a partir de la misma especie de planta que la planta en la cual sera introducida. Es sufciente que exista homologia sustancial entre el gen objetivo end6geno y la secuencia de acido nucleico que va a ser introducida.

Se describieron anteriormente ejemplos de diferentes metodos para la reducci6n o eliminaci6n sustancial de la expresi6n en una planta de un gen end6geno. Un persona normalmente capacitada en la tecnica podria adaptar facilmente los metodos anteriormente mencionados para el silenciamiento a fin de lograr la reducci6n de la expresi6n de un gen end6geno en una planta completa o en partes de la misma a traves, por ejemplo, del uso de un promotor apropiado.

Marcador seleccionable (gen) / Gen reportero

Los terminos "marcador seleccionable", "gen marcador seleccionable" o "gen reportero" incluyen a cualquier gen que confiera un fenotipo a una celula en la cual se exprese para facilitar la identificaci6n y/o la selecci6n de las celulas que son transfectadas o transformadas con un constructo de una secuencia de acido nucleico de la invenci6n. Estos genes marcadores permiten la identificaci6n de una transferencia exitosa de las moleculas de la secuencia de acido nucleico mediante una serie de principios diferentes. Los marcadores adecuados se pueden seleccionar de los marcadores que conferen resistencia antibi6tica o herbicida, que introducen una nueva caracteristica metab6lica o que permiten una selecci6n visual. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen a los genes que confieren resistencia a los antibi6ticos (tales como nptll que fosforilan la neomicina y la kanamicina, o hpt, que fosforila higromicina, o genes que confieran resistencia, por ejemplo, a la bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloramfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicima o blasticidina), a los herbicidas (por ejemplo bar el cual proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que proporcionan resistencia contra el glifosato, o los genes que conferen resistencia, por ejemplo, a la imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea), o genes que proporcionen una caracteristica metab6lica (tal como manA que le permite a las plantas utilizar manosa como unica fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilizaci6n de xilosa, o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a la 2-desoxiglucosa). La expresi6n de los genes marcadores visuales resulta en la formaci6n de color (por ejemplo -glucuronidasa, GUS o -galactosidasa con sus sustratos coloreados, por ejemplo X-Gal), luminiscencia (tal como el sistema de luciferina / luciferasa) o fluorescencia (Proteina Fluorescente Verde, GFP, y

sus derivados). Esta lista representa s6lo una pequefa cantidad de posibles marcadores. La persona ordinariamente capacitada en la tecnica esta familiarizada con tales marcadores. Se prefieren marcadores diferentes, dependiendo del organismo y del metodo de selecci6n.

Se sabe que despues de una integraci6n estable o transitoria de secuencias de acido nucleico en las celulas de una planta, s6lo una minoria de las celulas incorpora el ADN foraneo y, si se desea, lo integra en su genoma, dependiendo del vector de expresi6n utilizado y de la tecnica de transfecci6n utilizada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce usualmente un gen que codifca un marcador seleccionable (tal como aquellos descritos anteriormente) en las celulas huesped junto con el gen de interes. Estos marcadores pueden ser utilizados, por ejemplo, en mutantes en los cuales estos genes no son funcionales, por ejemplo, por medio de la supresi6n mediante metodos convencionales. Ademas, se pueden introducir las moleculas de la secuencia de acido nucleico que codifican un marcador seleccionable en una celula huesped en el mismo vector que contiene la secuencia que codifica los polipeptidos de la invenci6n o que se utilizan en los metodos de la invenci6n, o tambien en un vector separado. Las celulas que han sido transfectadas en forma estable con la secuencia de acido nucleico introducida pueden ser identificadas por ejemplo mediante selecci6n (por ejemplo, las celulas que han integrado el marcador seleccionable sobreviven mientras que las otras celulas mueren).

Ia que los genes marcadores, particularmente los genes para resistencia a los antibi6ticos y herbicidas, no se requieren mas o no son deseables en la celula huesped transgenica una vez que se han sido introducidos con exito las secuencias de acido nucleico, el proceso de acuerdo con la invenci6n para introducir las secuencias de acido nucleico emplea en forma conveniente tecnicas que permiten la remoci6n o escisi6n de estos genes marcadores. Un de tales metodos es el que se conoce como cotransformaci6n. El metodo de cotransformaci6n emplea dos vectores en forma simultanea para la transformaci6n, un vector que porta la secuencia de acido nucleico de acuerdo con la invenci6n y un segundo vector que porta el gen o los genes marcadores. Una gran proporci6n de transformantes recibe, o, en el caso de las plantas, incluye (hasta 40% o mas de los transformantes), ambos vectores. En el caso de la transformaci6n con Agrobacterias, los transformantes usualmente reciben solamente una parte del vector, es decir la secuencia flanqueada por el ADN-T, la cual usualmente representa el casete de expresi6n. Los genes marcadores pueden ser removidos posteriormente de la planta transformada por medio de cruzamientos. En otro metodo, los genes marcadores integrados en un transpos6n se utilizan para la transformaci6n junto con la secuencia de acido nucleico deseada (conocida como la tecnologia Ac/Ds). Los transformantes se pueden cruzar con una fuente de transposasa o se transforman los transformantes con un constructo de la secuencia de acido nucleico que confiere la expresi6n de una transposasa, en forma transitoria o estable. En algunos casos (aproximadamente el 10%), el transpos6n salta fuera del genoma de la celula huesped una vez a tenido lugar la transformaci6n en forma exitosa y se pierde. En otro numero de casos, el transpos6n salta a una ubicaci6n diferente. En estos casos el gen marcador debe ser eliminado mediante la realizaci6n de cruzamientos. En microbiologia, se desarrollaron tecnicas que hacen posible, o facilitan, la detecci6n de tales eventos. Un metodo ventajoso adicional se fundamenta en lo que se conoce como sistemas de recombinaci6n, cuya ventaja es que se puede prescindir de la eliminaci6n por cruzamiento. El sistema mas conocido de este tipo es el que se conoce como sistema Cre/lox. Cre1 es una recombinasa que remueve las secuencias localizadas entre la secuencias de loxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias de loxP, es eliminado una vez que ha tenido lugar con exito la transformaci6n, por medio de la expresi6n de la recombinasa. Otros sistemas de recombinaci6n son los sistemas HlN/HlX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255 - 22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553 - 566). Es posible una integraci6n especifica del sitio en el genoma de la planta de las secuencias de acido nucleico de acuerdo con la invenci6n. Naturalmente, estos metodos se pueden aplicar tambien a microorganismos tales como levaduras, hongos o bacterias.

Transgenico / Transgen / Recombinante

Para los prop6sitos de la invenci6n, "transgenico", "transgen" o "recombinante" significan con respecto, por ejemplo, a una secuencia de acido nucleico, un casete de expresi6n, una construcci6n genica o un vector que comprende la secuencia de acido nucleico o un organismo transformado con las secuencias de acido nucleico, los casetes de expresi6n o los vectores de acuerdo con la invenci6n, todos aquellos constructos logrados por metodos recombinantes en los cuales o bien

(a): las secuencias de acido nucleico que codifcan las proteina utiles en los metodos de la invenci6n, o

(b): la(s) secuencia(s) genetica(s) de control que esta(n) operativamente enlazada(s) con la secuencia de acido nucleico de acuerdo con la invenci6n, por ejemplo un promotor, o

(c): a ) y b)

no estan localizadas en su ambiente genetico natural o han sido modificadas por metodos recombinantes, siendo posible que la modifcaci6n tomara la forma, por ejemplo, de una sustituci6n, adici6n, supresi6n, inversi6n o inserci6n de uno o mas residuos nucle6tidos. Se entiende que el ambiente genetico natural signifca el locus

gen6mico o cromos6mico natural en la planta original o la presencia en una biblioteca gen6mica. En el caso de una biblioteca gen6mica, el ambiente genetico natural de la secuencia de acido nucleico es preferiblemente retenida, al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de acido nucleico al menos en un costado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, Preferiblemente de al menos 500 pb, especialmente preferiblemente de al menos 100 pb, lo mas preferible al menos 5000 pb. Un casete de expresi6n de origen natural -por ejemplo la combinaci6n de origen natural del promotor natural de las secuencias de acido nucleico con la correspondiente secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido util en los metodos de la presente invenci6n, como se defini6 anteriormente -convierte un casete de expresi6n transgenica cuando este casete de expresi6n es modificado por metodos sinteticos no naturales ("artificiales") tales como, por ejemplo, tratamiento mutagenico. Los metodos adecuados son descritos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5.565.350 o en la publicaci6n internacional (O 00/15815.

Una planta transgenica para los prop6sitos de la invenci6n se entiende entonces que significa, como se indic6 anteriormente, que las secuencias de acido nucleico utilizadas en el metodo de la invenci6n no estan en su locus natural en el genoma de dicha planta, siendo posible para las secuencias de acido nucleico que sean expresadas en forma hom6loga o heter6loga. Sin embargo, como se mencion6 anteriormente, transgenico tambien signifca que, mientras las secuencias de acidos nucleicos de acuerdo con la invenci6n o utilizadas en el metodo de la invenci6n, esten en su posici6n natural en el genoma de una planta, la secuencia ha sido modificada y con respecto a la secuencia natural, y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales han sido modificadas. Transgenico Preferiblemente signifca que la expresi6n de las secuencias de acidos nucleicos de acuerdo con la invenci6n en un locus no natural en el genoma, es decir, que tiene lugar una expresi6n hom6loga o, Preferiblemente heter6loga de las secuencias de acido nucleico. Las plantas transgenicas preferidas se mencionan en la presente invenci6n.

Transformaci6n

El termino "introducci6n" o "transformaci6n" a los cuales se hace referencia aqui, abarcan la transferencia de un polinucle6tido ex6geno dentro de una celula huesped, independientemente del metodo utilizado para la transferencia. El tejido de la planta capaz de propagaci6n clonal posterior, ya sea por medio de organogenesis o de embriogenesis, puede ser transformado con una construcci6n genetica de la presente invenci6n y se puede regenerar una planta entera a partir del mismo. El tejido particular escogido variara dependiendo de los sistemas de propagaci6n clonal disponibles y mas adecuados, para la especie particular que va a ser transformada. Los ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hoja, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, mega gametofitos, tejido del callo, tejido meristematico existente (por ejemplo, meristema apical, yemas axilares, y meristemas de la raiz), y tejido meristematico inducido (por ejemplo, meristema del cotiled6n y meristema del hipocotiled6n). El polinucle6tido puede ser introducido en forma transitoria o estable en una celula huesped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plasmido. En forma alternativa, puede integrarse al genoma huesped. La celula de la planta transformada resultante puede ser luego utilizada para regenerar una planta transformada en una forma conocida por las personas ordinariamente capacitadas en la tecnica.

La transferencia de genes foraneos dentro del genoma de una planta se denomina transformaci6n. La transformaci6n de una especie de planta es hoy en dia una tecnica bastante rutinaria. En forma conveniente, se puede utilizar cualquiera de los diferentes metodos de transformaci6n para introducir el gen de interes en una celula ancestral adecuada. Los metodos descritos para la transformaci6n y regeneraci6n de plantas a partir de tejidos de la planta o de celulas de la planta pueden ser utilizados para una transformaci6n transitoria o estable. Los metodos de transformaci6n incluyen el uso de liposomas, electroporaci6n, productos quimicos que aumentan la incorporaci6n de ADN libre, inyecci6n del ADN directamente a la planta, bombardeo de particulas, transformaci6n que utiliza virus o polen y microproyecci6n. Los metodos pueden ser seleccionados a partir del metodo de calcio/polietilen glicol para protoplastos (Krens, F. A. et al., (1982) Nature 296, 72 - 74; Negrutiu l et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363 -373); electroporaci6n de protoplastos (Shillito R. D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099 -1102); microinyecci6n en material de la planta (Crossway A et al, (1986) Mol. Gen Genet 202: 179 -185); bombardeo con particulas recubiertas con ADN o ARN (Klein T. M. et al, (1987) Nature 327: 70) infecci6n con virus (que no se integran) y similares. Las plantas transgenicas, que incluyen plantas de cultivo transgenicas, son producidas Preferiblemente mediante transformaci6n mediada por Agrobacterium. Un metodo de transformaci6n conveniente es la transformaci6n in planta. Para este prop6sito, es posible, por ejemplo, permitir que las agrobacterias actuen en las semillas de la planta o inocular el meristema de la planta con las agrobacterias. Ha probado ser particularmente conveniente de acuerdo con la invenci6n, permitir que una suspensi6n de agrobacterias transformadas actuen sobre la planta intacta

o al menos sobre los primordios de la flor. Posteriormente se deja que se desarrolle la planta hasta obtener las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735 -743). Los metodos para transformaci6n del arroz mediados por Agrobacterium incluyen metodos bien conocidos para la transformaci6n del arroz, tales como los descritos en cualquiera de las siguientes documentos: solicitud de patente europea EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612 -617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491 -506, 1993), Hiei el al. (Plant J 6 (2): 271 -282, 1994). En el caso de la transformaci6n del maiz, el metodo preferido es el descrito ya sea en lshida el al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745 -50, 1996) o en Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13 -22, 2002). Dichos metodos son

descritos ademas a modo de ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung y R. (u, Academic Press (1993) 128 -143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205 -225). Las secuencias de acido nucleico o el constructo que va a ser expresado es clonado preferiblemente en un vector, el cual es adecuado para la transformaci6n de Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Las agrobacterias transformadas por dicho vector pueden ser luego utilizadas en una forma conocida para la transformaci6n de plantas, tales como las plantas utilizadas como modelo, del tipo Arabidopsis (Arabidopsis thaliana no es considerada dentro del alcance de la presente invenci6n como una planta de cultivo), o plantas de cultivo tales como, por ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo, mediante la inmersi6n de las hojas magulladas o picadas en una soluci6n de agrobacterias y luego se cultivan en medios adecuados. La transformaci6n de las plantas por medio del Agrobacterium tumefaciens es descrita, por ejemplo, en H6fgen y (illmitzer en Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce, entre otros, a partir de F. F. (hite, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung y R. (u, Academic Press, 1993, paginas 15 - 38.

Ademas de la transformaci6n de celulas somaticas, las cuales tienen que ser luego regeneradas en plantas intactas, tambien es posible transformar las celulas de meristemas de la planta y en particular aquellas celulas que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando lugar a plantas transgenicas. De este modo, por ejemplo, se tratan las semillas de Arabidopsis con agrobacterias y se obtienen las semillas de las planta en desarrollo de las cuales una cierta proporci6n se transforma y de este modo se vuelven transgenicas. [Feldman, K. A. y Marks M. D. (1987). Mol Gen Genet 208: 274 -289; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chua y J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. (ord Scientific, Singapur, paginas 274 289]. Los metodos alternativos se basan en la remoci6n repetida de las inflorescencias y la incubaci6n del sitio de escisi6n en el centro de la roseta con las agrobacterias transformadas, por lo que pueden obtenerse igualmente semillas transformadas en un momento posterior en el tiempo (Chang (1994). Plant J. 5: 551 -558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363 - 370). Sin embargo, un metodo especialmente efectivo es el metodo de infiltraci6n al vacio con sus modificaciones tales como el metodo de "inmersi6n floral". En el caso de infiltraci6n al vacio de Arabidopsis, se tratan plantas intactas bajo presi6n reducida con una suspensi6n de agrobacterias [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194 - 1199], mientras que en el caso del metodo de la "inmersi6n floral" se incuba el tejido floral en desarrollo brevemente con una suspensi6n de agrobacterias tratada con un tensoactivo [Clough, S. J. y Bent A. F. (1998). The Plant J. 16, 735 -743]. Se recolecta una cierta proporci6n de semillas transgenicas en ambos casos, y estas semillas pueden distinguirse de las semillas no transgenicas mediante el cultivo bajo las condiciones selectivas anteriormente descritas. Ademas, la transformaci6n estable de los plastidos es ventajosa porque los plastidos se heredan del progenitor en la mayoria de los cultivos reduciendo o eliminando el riesgo de flujo transgenico a traves del polen. La transformaci6n del genoma del cloroplasto se logra generalmente mediante un proceso que ha sido presentado esquematicamente en Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225 - 229]. En resumen, las secuencias que van a ser transformadas se clonan junto con un gen marcador seleccionable entre secuencias de flanqueo hom6logas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias de flanqueo hom6logas dirigen la integraci6n especifica del sitio en el plastoma. La transformaci6n plastidial ha sido descrita para muchas especies de plantas diferentes y se presenta una visi6n de conjunto en Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3): 425 -38 o en Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20 -28. Otro avance biotecnol6gico ha sido informado recientemente en la forma de transformantes del plastido libres de marcadores, que pueden producidos mediante un gen marcador cointegrado en forma transitoria (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225 - 229).

Marcaci6n de la activaci6n del ADN-T

La marcaci6n de la activaci6n del ADN-T (Hayashi et al. Science (1992) 1350 - 1353), involucra la inserci6n del ADN-T, que contiene usualmente un promotor (puede ser tambien un mejorador de la traducci6n o un intr6n), en la regi6n gen6mica del gen de interes o 10 kb secuencia arriba o secuencia abajo de la regi6n de codificaci6n de un gen en una configuraci6n tal que el promotor dirige la expresi6n del gen objetivo. Tipicamente, la regulaci6n de la expresi6n del gen objetivo por su promotor natural se interrumpe y el gen cae bajo el control del promotor recientemente introducido. El promotor esta tipicamente embebido en un ADN-T. Este ADN-T se inserta al azar en el genoma de la planta, por ejemplo, a traves de la infecci6n con Agrobacterium y conduce a la expresi6n modificada de los genes cerca del ADN-T insertado. Las plantas transgenicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la expresi6n modificada de los genes pr6ximos al promotor introducido.

TlLLlNG

El termino "TlLLlNG" (por sus siglas en ingles) es una abreviatura de "detecci6n de lesiones locales inducidas en genomas" y se refiere a una tecnologia de mutagenesis util para generar y/o identificar secuencias de acido nucleico que codifican proteinas con expresi6n y/o actividad modificada. TlLLlNG tambien permite la selecci6n de plantas que transportan tales variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden exhibir expresi6n modificada, ya sea en intensidad o en localizaci6n o en sincronizaci6n (si las mutaciones afectan al promotor por ejemplo). Estas variantes

mutantes pueden exhibir mayor actividad que la exhibida por el gen en su forma natural. TlLLlNG combina mutagenesis de alta densidad con metodos de selecci6n de alto rendimiento. Las etapas tipicamente seguidas en TlLLlNG son: (a) mutagenesis EMS (Redei G. P. y Koncz C (1992) en Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapur, (orld Scientifc Publishing Co, paginas 16 - 82; Feldmann et al., (1994) en Meyerowitz E. M., Somerville C. R., eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI, paginas 137 - 172; Lightner J y Caspar T (1998) en J Martinez-Zapater, J Salinas, eds. Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, paginas 91 -104); (b) preparaci6n y reuni6n del ADN de individuos; (c) amplificaci6n por PCR de una regi6n de interes; (d) desnaturalizaci6n y apareamiento para permitir la formaci6n de heteroduplex; (e) DHPLC, donde la presencia de un heteroduplex en un consolidado se detecta como un pico extra en el cromatograma; (f) identificaci6n del individuo mutante; y (g) secuenciaci6n del producto de PCR mutante. Los metodos para TlLLlNG son bien conocidos en el arte (McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455 -457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145 - 50).

Recombinaci6n hom6loga

La recombinaci6n hom6loga permite la introducci6n en un genoma de una secuencia de acido nucleico seleccionada en una posici6n seleccionada definida. La recombinaci6n hom6loga es una tecnologia estandar utilizada en forma rutinaria en ciencias biol6gicas para organismos inferiores tales como levadura o el musgo Physcomitrella. Los metodos para llevar a cabo la recombinaci6n hom6loga en plantas han sido descritos no s6lo para las plantas modelo (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077 - 84) sino tambien para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada et al. (2002) Nat Biotech 2000): 1030 - 4; Lida y Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132 - 8).

Rendimiento

El termino "rendimiento" en general significa una producci6n medible de valor econ6mico, tipicamente relacionado con un cultivo especifco, con un area, y con un periodo de tiempo. Las partes de plantas individuales contribuyen en forma directa al rendimiento con base en su cantidad, tamafo y/o peso, o el rendimiento real es el rendimiento por acre para un cultivo y el afo, que se determina mediante la divisi6n de la producci6n total (incluye tanto producci6n cosechada como tasada) por los acres plantados. El termino 'rendimiento' de una planta puede referirse a la biomasa vegetal, a 6rganos reproductivos, y/o a propagalos (tales como semillas) de esa planta.

El termino "rendimiento" de una planta puede relacionarse con biomasa vegetativa (biomasa de raiz y/o de brotes), con 6rganos reproductivos, y/o con propagulos (tales como semilla) de esa planta.

Vigor temprano

El termino "vigor temprano" se refere a un crecimiento bien balanceado, activo y saludable, especialmente durante las etapas tempranas del desarrollo de la planta, y puede resultar de una mayor aptitud de la planta, debido, por ejemplo, a que las plantas se adaptan mejor a su ambiente (es decir, la optimizaci6n del uso de los recursos energeticos y la repartici6n entre brote y raiz). Las plantas que tiene vigor temprano tambien muestran una mayor supervivencia de las plantulas y un mejor establecimiento del cultivo, lo qua a menudo resulta en campos muy uniformes (con el desarrollo del cultivo en forma uniforme, es decir, donde la mayoria de las plantas alcanzan las diferentes etapas del desarrollo sustancialmente al mismo tiempo), y a menudo con un rendimiento mejor y superior. Por lo tanto, el vigor temprano puede ser determinado midiendo diferentes factores, tales como el peso de mil granos, el porcentaje de germinaci6n, el porcentaje de emergencia, el desarrollo de las plantulas, la altura de las plantulas, la longitud de la raiz, la biomasa de la raiz y de los brotes y muchos mas.

lncremento / Mejoramiento / lntensificaci6n

Los terminos "incremento", "mejoramiento" o "intensificaci6n" son intercambiables y se entienden en el sentido de la aplicaci6n de al menos 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10%, Preferiblemente de al menos 15% o 20%, mas preferiblemente 25%, 30%, 35% o 40% de mas rendimiento y/o desarrollo en comparaci6n con las plantas de control segun se define aqui.

Rendimiento de semillas

El incremento en el rendimiento de semillas puede manifestarse en si mismo en una o mas de las formas: a) un incremento en la biomasa de la semilla (peso total de la semilla) el cual puede ser con base en una semilla individual y/o por planta y/o por hectarea o acre, b) mayor numero de flores por panicula y/o por planta; c) mayor numero de semillas (llenas); d) mayor proporci6n de llenado de las semillas (la cual se expresa como la relaci6n entre la cantidad de semilla llenas dividido por la cantidad total de semillas); e) mayor indice de cosecha, el cual se expresa como una relaci6n del rendimiento de las partes cosechables, tal como las semillas, dividido por la biomasa total; y f) mayor numero de paniculas primarias, (g) mayor peso de mil granos (PMG), el cual se extrapola a partir del recuento

de la cantidad de semillas llenas y su peso total. Un mayor PMG puede ser el resultado de un mayor tamafo de la semilla y/o del peso de la semilla, y tambien puede ser el resultado de un incremento en el tamafo del embri6n y/o del endospermo.

Un incremento en el rendimiento de semillas puede manifestarse tambien como un incremento en el tamafo y/o el volumen de la semilla. Ademas, un incremento en el rendimiento puede manifestarse tambien como un incremento en el area de la semilla y/o de la longitud de la semilla y/o del ancho de la semilla y/o del perimetro de la semilla. Un mayor rendimiento puede dar como resultado tambien una arquitectura modificada, o puede ocurrir debido a una arquitectura modificada.

indice de Verdor

El "indice de verdor" tal como se utiliza aqui descripci6n se calcula a partir de las imagenes digitales de las plantas. Para cada pixel perteneciente a la planta objetivo sobre la imagen, se calcula la relaci6n del valor verde versus el valor rojo (en el modelo RGB para codificaci6n del color). El indice de verdor se expresa como el porcentaje de pixeles para los cuales la relaci6n verde con respecto a rojo excede un umbral dado. Bajo condiciones normales de desarrollo, bajo condiciones de desarrollo con estres por salinidad, y bajo condiciones de desarrollo con una disponibilidad reducida de nutrientes, el indice de verdor de las planta se mide en la ultima imagen antes del florecimiento. Por el contrario, bajo condiciones de desarrollo con estres por sequia, el indice de verdor de las plantas se mide en la primera imagen despues de la sequia.

Planta

El termino "planta" tal como se utiliza aqui, abarca plantas enteras, ancestros y progenie de las plantas y partes de la planta, que incluyen semillas, brotes, tallos, hojas, raices (incluyendo tuberculos), flores, y tejidos y 6rganos, en donde cada uno de los anteriormente mencionados incluye la secuencia del gen/acido nucleico de interes. El termino "planta" abarca ademas celulas de la planta, cultivos en suspensi6n, tejido del callo, embriones, regiones meristematicas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, nuevamente en donde cada uno de los mencionados anteriormente incluye la secuencia del gen/acido nucleico de interes.

Las plantas que son particularmente utiles en los metodos de la invenci6n incluyen a todas las plantas que pertenezcan a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiled6neas y dicotiled6neas incluyendo forraje y leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, arboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stoionifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Anfocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por ejemplo, Brassica napus, y Brassica rapa spp. [canola, colza, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por ejemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia unifora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus Carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo, Giycine max, Soja hispida o Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare), lpomoea baratas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinans, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutanguia, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Matus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por ejemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp.. Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por ejemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum), Sorgo bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybemum, Triticum macha, Triticum sativum o Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania paiustris, Ziziphus spp., entre otras.

Descripci6n detallada de la invenci6n

Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que al incrementar la expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20, produce plantas que tienen mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas, sin retrasar la floraci6n, con relaci6n a plantas que sirven de control. De acuerdo con una primera forma de realizaci6n, la presente invenci6n provee un metodo para incrementar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas en plantas con relaci6n a las plantas que sirven como control, que comprende incrementar la expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifca un polipeptido AHL 19/20.

Un metodo preferido para incrementar la expresi6n de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20 es mediante la introducci6n y expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifca un polipeptido AHL 19/20.

En una forma de realizaci6n cualquier referencia en adelante a una "proteina util en los metodos de la invenci6n" se entiende que significa un polipeptido AHL 19/20 como se define aqui. Cualquier referencia que se haga en adelante a una "secuencia de acido nucleico util en los metodos de la invenci6n" se entiende que significa una secuencia de acido nucleico capaz de codifcar dicho polipeptido AHL 19/20. La secuencia de acido nucleico que va a ser introducida en una planta (y por lo tanto util para la realizaci6n de los metodos de la invenci6n) es cualquier secuencia de acido nucleico que codifca el tipo de polipeptido, que sera descrito ahora, en adelante tambien denominado "secuencia de acido nucleico para AHL 19/20" o "gen AHL 19120".

Un "polipeptido AHL 19/20" como se define aqui se refiere a cualquier polipeptido que contiene un dominio que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o mas identidad de secuencia de aminoacidos con un Dominio Conservado (DC) como se representa mediante la SEQ lD NO: 36 (comprendida en la SEQ lD NO: 2).

Alternativa o adicionalmente, un "polipeptido AHL 19/20" como se define aqui se refiere a cualquier polipeptido que comprende: (i) un motivo que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o mas identidad de secuencia de aminoacidos con un motivo AT-hook como el representado por medio de la SEQ lD NO: 37; y (ii) un dominio que tiene al menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o mas identidad de secuencia de aminoacidos con un dominio conservado de planta y de procariota (PPC) como el representado mediante la SEQ lD NO: 38.

Alternativa o adicionalmente, un "polipeptido AHL 19/20" como se describe aqui se refiere a cualquier polipeptido que comprende: (i) una sefal de localizaci6n nuclear; (ii) un motivo de enlazamiento del ADN de AT-hook con una entrada lnterPro lPR014476; y (iii) un dominio conservado de planta y de procariota (PPC) con una entrada lnterPro lPR005175.

Alternativa o adicionalmente, un "polipeptido AHL 19/20" como se define aqui se refiere a cualquier secuencia de polipeptidos que cuando se utiliza en la construcci6n de un arbol filogenetico de AHL, tal como aquel descrito en la Figura 1 y en la Figura 2, se agrupa con el grupo de polipeptidos AHL 19/20 que comprende la secuencia de polipeptidos como la reportada por la SEQ lD NO: 2, en vez de con cualquier otro grupo de AHL 19/20.

Alternativa o adicionalmente, un "polipeptido AHL 19/20" como se define aqui se refiere a cualquier polipeptido que tenga en orden creciente de preferencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o mas identidad de secuencia de aminoacidos con el polipeptido AHL 19/20 como el representado por la SEQ lD NO: 2 o con cualquiera de las secuencias de polipeptidos de longitud completa dadas aqui en la Tabla A.

Un "polipeptido AHL 19/20" como se describe aqui es capaz de complementar una cepa de levadura MLI131 que carece de todos los tres transportadores de amonio de levadura nativa (Hildebrand (2005) J Phycol 41: 105 - 113).

Los terminos "dominio" y "motivo" se definen aqui en la secci6n de "definiciones". Existen bases de datos especializadas para la identificaci6n de dominios, por ejemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 95, 5857 -5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242 -244), lnterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315 -318), Prosite (Bucher y Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (ln) lSMB-94; Proceedings 2nd lnternational Conference on lntelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., paginas 53 -61, AAAlPress, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134 -D137, (2004)), o Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276 - 280 (2002). Un conjunto de herramientas para el analisis in silico de secuencias de proteina esta disponible en el servidor de prote6micos ExPASI (lnstituto Suizo de Bioinformatica (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784 - 3788 (2003)). El analisis de la secuencias de polipeptidos de la SEQ lD NO: 2 se presenta mas abajo aqui en los Ejemplos 2 y 4. Por ejemplo, un polipeptido AHL 19/20 como se representa mediante la SEQ lD NO: 2 comprende un motivo de enlazamiento del ADN de AT-hook con una entrada lnterPro, lPR014476 y un dominio

conservado de planta y de procariotas (PPC), descrito como DUF296 (dominio de funci6n desconocida 296) con una entrada lnterPro lPR005175, en la base de datos de dominios lnterPro. Los dominios se pueden identificar tambien utilizando tecnicas de rutina, tales como mediante la alineaci6n de secuencias. Uno de tales dominios es el Dominio Conservado (DC) de la SEQ lD NO: 2, como el representado por medio de la SEQ lD NO: 36. El CD comprende un NLS predicho, un motivo de enlazamiento del ADN de AT-hook, y un dominio de PPC, como el representado esquematicamente en la Figura 3, mostrado en la Figura 4.

Los metodos para el alineamiento de secuencias para comparaci6n son bien conocidos en la tecnica; tales metodos incluyen GAP, BESTFlT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP utiliza el algoritmo de Needleman & (unsch ((1970) J Mol Biol 48: 443 -453) para hallar el alineamiento global (es decir, expansi6n de las secuencias completas) de dos secuencias que maximizan la cantidad de coincidencias y minimizan el numero de brechas. El algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403 -10) calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un analisis estadistico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar el analisis con BLAST esta disponible al publico a traves del Centro Nacional para la lnformaci6n Biotecnol6gica (NCBl por sus siglas en ingles). Los hom6logos se pueden identificar facilmente utilizando, por ejemplo, el algoritmo de alineaci6n de secuencias multiples Clustal( (versi6n 1.83), con los parametros predeterminados de alineamiento por pares, y un metodo de asignaci6n de puntajes en porcentaje. Los porcentajes globales de similitud y de identidad tambien se pueden determinar utilizando uno de los metodos disponibles en el paquete de software MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics, 10: 29. MatGAT: una aplicaci6n que genera matrices de similitud/identidad utilizando secuencias de proteinas o de ADN). Se puede realizar una edici6n manual menor para optimizar el alineamiento entre los motivos conservados, como seria evidente para una persona normalmente capacitada en la tecnica. Ademas, en lugar de utilizar secuencias de longitud completa para la identificaci6n de hom6logos, se pueden utilizar tambien dominios especifcos. Los valores de identidad de secuencia se pueden determinar sobre la secuencia completa del acido nucleico o la secuencia del polipeptido o sobre dominios seleccionados o el(los) motivo(s) conservado(s), utilizando los programas mencionados anteriormente que utilizan los parametros predeterminados. El Ejemplo 3 describe aqui en la Tabla B el porcentaje de identidad entre el polipeptido AHL 19/20 como el representado mediante la SEQ lD NO: 2 y los polipeptidos AHL 19/20 enumerados en la Tabla A, que esta en el intervalo entre 50 y 99% de identidad de secuencia de aminoacidos. En la Tabla B1, se muestra el porcentaje de identidad entre el CD como el representado por la SEQ lD NO: 36 (comprendida en la SEQ lD NO: 2) y el CD de los polipeptidos AHL 19/20 enlistados en la Tabla A del Ejemplo 1, en el intervalo de 70 a 99% de identidad de secuencia de aminoacidos.

La tarea de la predicci6n de la localizaci6n de la proteina subcelular es importante y bien estudiada. Conocer la localizaci6n de la proteina ayuda a elucidar su funci6n. Los metodos experimentales para la localizaci6n de la proteina varian desde inmunolocalizaci6n hasta marcaci6n de proteinas utilizando proteina fuorescente verde (GFP). Tales metodos son precisos si bien son muy laboriosos en comparaci6n con los metodos computacionales. Recientemente se ha realizado un avance importante en la predicci6n computacional de la localizaci6n de la proteina a partir de los datos de la secuencia. Entre los algoritmos bien conocidos por una persona normalmente capacitada en la tecnica se encuentran disponibles en las herramientas ExPASy Proteomics de propiedad del Swiss lnstitute for Bioinformatics, por ejemplo, PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MlTOPROT, PATS, PTS1, SignalP, TMHMM y otras. La identificaci6n de la localizaci6n subcelular del polipeptido de la invenci6n se muestra en el Ejemplo 6. Una sefal de localizaci6n nuclear predicha (NLS) se encuentra en el polipeptido AHL 19/20 de la SEQ lD NO: 2. Una NLS es una o mas secuencias cortas de lisinas o argininas positivamente cargadas. En particular, se predice que la SEQ lD NO: 2 de la presente invenci6n se localiza en el compartimiento nuclear de celulas eucariotas.

Ademas, los polipeptidos AHL 19/20 utiles en los metodos de la presente invenci6n (al menos en su forma nativa) tipicamente, pero no necesariamente, tienen actividad reguladora transcripcional y capacidad para interactuar con otras proteinas. Por lo tanto, los peptidos de AHL 19/20 con actividad reguladora transcripcional reducida, sin actividad reguladora transcripcional, con capacidad de interacci6n reducida proteina -proteina, o sin capacidad de interacci6n proteina -proteina, pueden igualmente ser utiles en los metodos de la presente invenci6n. La actividad de enlazamiento del ADN y las interacciones proteina -proteina se pueden determinar facilmente in vitro o in vivo usando tecnicas bien conocidas en el arte (por ejemplo en Current Protocols in Molecular Biology, Volumenes 1 y 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols). Para determinar la actividad de enlazamiento del ADN de los polipeptidos AHL 19/20, se encuentran disponibles varios ensayos, tales como ensayos de desplazamiento en gel del enlazamiento del ADN (o ensayos de retardo en gel; Korfhage et al. (1994) Plant C 6: 695 - 708), ensayos de enlazamiento del ADN in vitro (Schindler et al. (1993) Plant J 4 (1) : 137 -150), o activaci6n transcripcional de polipeptidos AHL 19/20 en celulas de levadura, animal y planta (Halbach et al. (2000) Nucleic Acid Res 28 (18): 3542

-: 3550). Las secuencias especificas de enlazamiento del ADN se pueden determinar utilizando la tecnica de selecci6n aleatoria de nucle6tidos (Viola & Gonzalez (Mayo 26, 2007) Biochemistry) .

En una forma de realizaci6n, la presente invenci6n se ilustra por medio de la transformaci6n de plantas con la secuencia de acido nucleico representada por la SEQ lD NO: 1, que codifica la secuencia del polipeptido AHL 19/20 de la SEQ lD NO: 2. Sin embargo, la realizaci6n de la invenci6n no esta restringida a estas secuencias; los metodos de la invenci6n pueden ser llevados a cabo convenientemente utilizando cualquier secuencia de acido nucleico que

codifica un polipeptido AHL 19/20 como se define en la presente invenci6n.

Ejemplos de secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos AHL 19/20 se exponen en la Tabla A del Ejemplo 1 aqui. Tales secuencias de acido nucleico son utiles para llevar a cabo los metodos de la invenci6n. Las secuencias de polipeptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1 son ejemplos de secuencias de ort6logos y paralogos del polipeptido AHL 19/20 representadas por la SEQ lD NO: 2, siendo los terminos "ort6logos" y "paralogos" como se los define aqui. Otros ort6logos y paralogos pueden ser facilmente identificados llevando a cabo una busqueda denominada blast reciproco. Tipicamente, esto implica un primer BLAST que involucra el someter una secuencia de consulta a BLAST (por ejemplo utilizando cualquiera de las secuencias enlistadas en la Tabla A del Ejemplo 1) contra cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos del NCBl disponible al publico. BLASTN o TBLASTX (que utilizan valores estandar predeterminados) se utilizan generalmente cuando se parte de una secuencia nucleotidica, y BLASTP o TBLASTN (que utilizan valores estandar predeterminados) cuando se parte de una secuencia de proteina. Los resultados de BLAST opcionalmente se pueden filtrar. Las secuencias de longitud completa ya sea de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados, se someten luego nuevamente a BLAST (segundo BLAST) contra las secuencias del organismo a partir del cual se deriva la secuencia de consulta (donde la secuencia de consulta es la SEQ lD NO: 1 o la SEQ lD NO: 2, el segundo BLAST seria por lo tanto contra las secuencias de Arabidopsis thaliana). Se comparan luego los resultados del primero y el segundo BLAST. Se identifica un paralogo si una respuesta pertinente de alto rango del primer blast es de la misma especie que aquella de la cual se deriva la secuencia de consulta, un BLAST posterior resulta idealmente luego en la secuencia de consulta como una respuesta pertinente mas alta; se identifica un ort6logo si una respuesta pertinente de alto rango en el primer BLAST no proviene de la misma especie que aquella de la cual se deriva la secuencia de consulta, y preferiblemente resulta del BLAST posterior estando la secuencia de consulta entre las respuestas pertinentes mas altas.

Las respuestas pertinentes de alto rango son aquellas que tienen un valor E bajo. Cuanto mas bajo es el valor E, mas significativo es el puntaje (o en otras palabras, es mas baja la posibilidad de que la respuesta pertinente sea hallada por casualidad). La computaci6n del valor E es bien conocida en la tecnica. Ademas de los valores E, las comparaciones tambien se les da puntaje por identidad porcentual. La identidad porcentual se refiere a la cantidad de nucle6tidos identicos (o aminoacidos) entre las dos secuencias de acidos nucleicos (o polipeptidos) comparadas sobre una longitud particular. En el caso de grandes familias, se puede utilizar Clustal(, seguido de un arbol filogenetico (neighbour joining tree), para ayudar a visualizar el agrupamiento de genes relacionados y para identificar ort6logos y paralogos. Cualquier agrupamiento de la secuencia dentro del grupo que comprende la SEQ lD NO: 2 (polipeptido AHL 19; encerrado en un circulo en las Figuras 1 y 2) se consideraria que cae dentro de la definici6n anteriormente mencionada de un polipeptido AHL 19/20, y se consideraria adecuado para uso en los metodos de la invenci6n.

Las variantes de acido nucleico tambien pueden ser utiles para llevar a la practica los metodos de la invenci6n. Los ejemplos de tales variantes incluyen secuencias de acidos nucleicos que codifican hom6logos y derivados de cualquiera de las secuencias de polipeptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, siendo los terminos "hom6logo" y "derivado" como se definieron aqui. Tambien son utiles en los metodos de la invenci6n las secuencias de acido nucleico que codifican hom6logos y derivados de ort6logos o paralogos de cualquiera de las secuencias de polipeptidos que se exponen en la Tabla A del Ejemplo 1. Los hom6logos y derivados utiles en los metodos de la presente invenci6n tienen sustancialmente la misma actividad biol6gica y funcional que la proteina no modificada de la cual se derivan.

Variantes de acido nucleico tambien pueden ser utiles en la practica de los metodos de la invenci6n. Los ejemplos de tales variantes incluyen secuencias de acido nucleico que codifican hom6logos y derivados de cualquiera de las secuencias de polipeptidos dadas en la Tabla A del Ejemplo 1, siendo los terminos "hom6logo" y "derivado" como se define aqui. Tambien utiles en los metodos de la invenci6n son las secuencias de acido nucleico que codifican hom6logos y derivados de ort6logos o paralogos de cualquiera de las secuencias de polipeptidos dadas en la Tabla A del Ejemplo 1. Los hom6logos y derivados utiles en los metodos de la presente invenci6n tienen sustancialmente la misma actividad biol6gica y funcional que la proteina no modificada a partir de la cual se derivan.

Otras variantes de acido nucleico utiles en la practica de los metodos de la invenci6n incluyen porciones de acido nucleico que codifican polipeptidos AHL 19/20, secuencias de acido nucleico que hibridan a secuencias de acido nucleico que codifcan polipeptidos AHL 19/20, variantes de empalme de secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos AHL 19/20, variantes alelicas de secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos AHL 19/20 y variantes de secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos AHL 19/20 obtenidos por medio de transposici6n de genes. Los terminos secuencias de hibridaci6n, variante de empalme, variante alelica y transposici6n de genes son como se describe aqui.

Las secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos AHL 19/20 no necesitan ser secuencias de acido nucleico de longitud completa, ya que el desempefo de los metodos de la invenci6n no confia en el uso de secuencias de acido nucleico de longitud completa. De acuerdo con la presente invenci6n, se provee un metodo

para aumentar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas, en las plantas, que comprende la introducci6n y la expresi6n en una planta de una porci6n de cualquiera de las secuencias de acido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o una porci6n de una secuencia de acido nucleico que codifica un ort6logo, paralogo u hom6logo de cualquiera de las secuencias de polipeptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1.

Variantes de la secuencia de acidos nucleicos que codifican hom6logos y derivados de la SEQ lD NO: 46 tambien pueden ser utiles en la practica de los metodos de la invenci6n, siendo los terminos "hom6logo" y "derivado" como se define en este documento. Tambien utiles en los metodos de la invenci6n son secuencias de acido nucleico que codifican hom6logos y derivados de ort6logos o paralogos de la SEQ lD NO: 46. Los hom6logos y derivados utiles en los metodos de la presente invenci6n tienen sustancialmente la misma actividad biol6gica y funcional que la proteina no modificada de la que se derivan.

Una porci6n de una secuencia de acido nucleico se puede preparar, por ejemplo, haciendo una o mas supresiones a la secuencia de acido nucleico. Las porciones se pueden utilizar en forma aislada o se pueden fusionar a otras secuencias codifcadoras (o no codifcadoras) con el prop6sito de producir, por ejemplo, una proteina que combina diferentes actividades. Cuando se fusionan a otras secuencias codificadoras, el polipeptido resultante producido despues de la traducci6n puede ser mas grande que el predicho para la porci6n de proteina.

Las porciones utiles en los metodos de la invenci6n, codifican un polipeptido AHL 19/20 como se define aqui, y tienen sustancialmente la misma actividad biol6gica que las secuencias de polipeptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1. Preferiblemente, la porci6n es una porci6n de cualquiera de las secuencias de acido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o es una porci6n de una secuencia de acido nucleico que codifica un ort6logo o un paralogo de cualquiera de las secuencias de polipeptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1. Preferiblemente la porci6n es, en orden creciente de preferencia al menos de 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 940 nucle6tidos consecutivos de longitud, siendo los nucle6tidos consecutivos de cualquiera de las secuencias de acido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o de una secuencia de acido nucleico que codifica un ort6logo o un paralogo de cualquiera de las secuencias de polipeptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1. Preferiblemente, la porci6n es una porci6n de una secuencia nucleica que codifica un polipeptido de una secuencia de polipeptidos que cuando se utiliza en la construcci6n de un arbol filogenetico de AHL, tal como aquella descrita en la Figura 1 o en la Figura 2, agrupaciones con el grupo de polipeptidos AHL 19/20 que comprende la secuencia de polipeptidos representada por la SEQ lD NO: 2 en vez de con cualquier otro grupo de AHL. Mas preferiblemente, la porci6n es una porci6n de la secuencia de acido nucleico de la SEQ lD NO: 1.

Otra variante de la secuencia de acido nucleico util en los metodos de la invenci6n es una secuencia de acido nucleico capaz de hibridar, en condiciones de rigurosidad reducida, preferiblemente bajo condiciones rigurosas, con una secuencia de acido nucleico que codifca un polipeptido que incrementa el rendimiento seleccionado del grupo que consiste de: uno localizado en el nucleo 19/20 con el motivo AT-hook (AHL 19/20), o con una porci6n como se define aqui.

De acuerdo con la presente invenci6n, en una forma de realizaci6n se provee un metodo para incrementar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas en plantas, que comprende la introducci6n y expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico capaz de hibridar con cualquiera de las secuencias de acido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o que comprende la introducci6n y expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico capaz de hibridar con una secuencia de acido nucleico que codifica un ort6logo, paralogo u hom6logo de cualquiera de las secuencias de acido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1.

Las secuencias de hibridaci6n utiles en los metodos de la invenci6n codifcan un polipeptido AHL 19/20 como se define aqui, y tienen sustancialmente la misma actividad biol6gica que las secuencias polipeptidicas presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1. Preferiblemente, la secuencia de hibridaci6n es capaz de hibridar con cualquiera de las secuencias de acido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o a una porci6n de cualquiera de estas secuencias, siendo una porci6n como se defini6 anteriormente, o donde la secuencia de hibridaci6n es capaz de hibridar con una secuencia de acido nucleico que codifica un ort6logo o paralogo de una cualquiera de las secuencias de polipeptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1. Preferiblemente, la secuencia de hibridaci6n es capaz de hibridar con una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de polipeptidos que cuando se utiliza en la construcci6n de un arbol filogenetico de AHL, tal como el descrito en la Figura 1 o en la Figura 2, se agrupa con el grupo de polipeptidos AHL 19/20 que comprende la secuencia de polipeptidos representada por la SEQ lD NO: 2 en vez de con cualquier otro grupo de AHL. Mas preferiblemente, la secuencia de hibridaci6n es capaz de hibridar con una secuencia de acido nucleico como la representada mediante la SEQ lD NO: 1 o con una porci6n de la misma.

Otra variante de la secuencia de acido nucleico util en los metodos de la invenci6n es una variante de empalme que codifca unpolipeptidoqueincrementaelrendimiento seleccionadodelgrupoqueconsistede: unolocalizadoen el nucleo 19/20 con el motivo AT-hook (AHL 19/20) o una variante de empalme como se defini6 aqui.

De acuerdo con la presente invenci6n, se provee un metodo para incrementar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de empalme de cualquiera de las secuencias de acido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o una variante de empalme de una secuencia de acido nucleico que codifica un ort6logo, paralogo u hom6logo de cualquiera de las secuencias de polipeptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1.

En una forma de realizaci6n, las variantes de empalme son variantes de empalme de una secuencia de acido nucleico representada por la SEQ lD NO: 1, o una variante de empalme de una secuencia de acido nucleico que codifca un ort6logo o un paralogo de la SEQ lD NO: 2. Preferiblemente, la variante de empalme es una variante de empalme de una secuencia de acido nucleico que codifca una secuencia de polipeptidos que cuando se usa en la construcci6n de un arbol filogenetico de AHL, tal como el descrito en la Figura 1 o en la Figura 2, se agrupa con el grupo de polipeptidos AHL 19/20 que comprende la secuencia de polipeptidos representada por la SEQ lD NO: 2 en vez de con cualquier otro grupo de AHL.

Otra variante de la secuencia de acido nucleico util en la realizaci6n de los metodos de la invenci6n es una variante alelica de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido que incrementa el rendimiento seleccionado del grupo que consiste de: uno localizado en el nucleo 19/20 con el motivo AT-hook (AHL 19/20) o una variante alelica como se defini6 aqui.

En una forma de realizaci6n de acuerdo con la presente invenci6n, se provee un metodo para incrementar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante alelica de cualquiera de las secuencias de acido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante alelica de una secuencia de acido nucleico que codifca un ort6logo, paralogo u hom6logo de cualquiera de las secuencias polipeptidicas presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1.

Las variantes alelicas utiles en los metodos de la presente invenci6n tienen sustancialmente la misma actividad biol6gica que el polipeptido AHL 19/20 de la SEQ lD NO: 2 y cualquiera de las secuencias polipeptidicas descritas en la Tabla A del Ejemplo 1. Existen variantes alelicas en la naturaleza, y comprendido dentro de los metodos de la presente invenci6n esta el uso de estos alelos naturales. Preferiblemente, la variante alelica es una variante alelica de la SEQ lD NO: 1 o una variante alelica de una secuencia de acido nucleico que codifica un ort6logo o un paralogo de la SEQ lD NO: 2. Preferiblemente, la variante alelica es una variante alelica de una secuencia de polipeptidos que cuando se usa en la construcci6n de un arbol filogenetico de AHL, tal como el descrito en la Figura 1 o en la Figura 2, se agrupa con el grupo de polipeptidos AHL 19/20 que comprende la secuencia de polipeptidos representada por la SEQ lD NO: 2 en vez de con cualquier otro grupo de AHL.

La transposici6n de genes o la evoluci6n dirigida tambien se puede utilizar para generar variantes de secuencias de acido nucleico que codifcan polipeptidos que incrementan el rendimiento seleccionados del grupo que consiste de: uno localizado en el nucleo 19/20 con el motivo AT-hook (AHL 19/20), siendo el termino "transposici6n de genes" como se defini6 aqui.

En una forma de realizaci6n de acuerdo con la presente invenci6n, se provee un metodo para incrementar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de cualquiera de las secuencias de acido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante de una secuencia de acido nucleico que codifca un ort6logo, paralogo u hom6logo de cualquiera de las secuencias de polipeptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, en donde la variante de la secuencia de acido nucleico se obtiene por medio de transposici6n de genes.

Preferiblemente, la variante de la secuencia de acido nucleico obtenida por transposici6n de genes codifica una secuencia de polipeptidos que cuando se usa en la construcci6n de un arbol filogenetico de AHL, tal como el descrito en la Figura 1 o en la Figura 2, se agrupa con el grupo de polipeptidos AHL 19/20 que comprende la secuencia de polipeptidos representada por la SEQ lD NO: 2 en vez de con cualquier otro grupo de AHL.

Ademas, tambien se pueden obtener variantes de la secuencia de acido nucleico por mutagenesis dirigida al sitio. Varios metodos se encuentran disponibles para lograr una mutagenesis dirigida al sitio, siendo los mas comunes los metodos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology. (iley Eds.).

Las secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos AHL 19/20 pueden derivarse de cualquier fuente natural

o artificial. La secuencia de acido nucleico puede ser modificada a partir de su forma nativa en composici6n y/o ambiente gen6mico a traves de manipulaci6n humana deliberada. Preferiblemente, la secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20 es de una planta, preferiblemente ademas de una planta dicotiled6nea, mas preferiblemente de la familia Brassicaceae, lo mas preferible, la secuencia de acido nucleico es de Arabidopsis thaliana.

El desempefo de los metodos de la invenci6n producen plantas que tienen un incremento d caracteristicas relacionadas con el rendimiento con relaci6n a las plantas que sirven de control. Los terminos "rendimiento" y "rendimiento de semilla" se describen con mas detalle en la secci6n de "definiciones" aqui.

Rendimiento de los metodos de la invenci6n produce plantas cultivadas bajo condiciones de estres abi6tico que tienen rasgos mejorados relacionados con el rendimiento en relaci6n con las plantas de control. En particular, el rendimiento de los metodos de la invenci6n produce plantas cultivadas bajo condiciones de estres abi6tico que tienen mayor vigor temprano y mayor rendimiento, especialmente aumento de la biomasa y mayor rendimiento de semilla, en relaci6n con las plantas de control. Los terminos "rendimiento" y "rendimiento de semillas" se describen en mas detalle en la secci6n "definiciones" de este documento.

La referencia aqui a los rasgos relacionados con rendimiento mejorado se considera que significa un aumento en el vigor temprano y / o en la biomasa (peso) de una o mas partes de una planta, que puede incluir partes aereas (cosechables) y / o partes por debajo del suelo (cosechables). En particular, tales partes cosechables son biomasa y / o semillas, y el rendimiento de los metodos de la invenci6n resulta en plantas que crecen bajo condiciones de estres abi6tico que tienen mayor vigor inicial, biomasa y / o rendimiento de semillas con relaci6n al vigor inicial, biomasa o rendimiento de semillas de las plantas de control cultivadas en condiciones comparables.

Rendimiento de los metodos de la invenci6n produce plantas que tienen rasgos mejorados relacionados con el rendimiento. En particular, el rendimiento de los metodos de la invenci6n produce plantas que tienen mayor rendimiento, especialmente mayor rendimiento de semillas con relaci6n a las plantas de control. Los terminos "rendimiento" y "rendimiento de semillas" se describen en mas detalle en la secci6n "definiciones" de este documento.

La referencia aqui a rasgos mejorados relacionados con el rendimiento se entiende que significa un incremento en biomasa (peso) de una o mas partes de una planta, que puede incluir partes aereas (cosechables) y / o partes por debajo del suelo (cosechable). En particular, tales partes cosechables son semillas.

La referencia aqui a los rasgos mejorados relacionados con el rendimiento se entiende que significa un incremento en biomasa (peso) de una o mas partes de una planta, que puede incluir partes aereas (cosechables) y / o partes por debajo del suelo (cosechable). En particular, dichas partes cosechables son semillas, y el rendimiento de los metodos de la invenci6n resulta en plantas que tienen mayor rendimiento de semillas con relaci6n al rendimiento de semillas de las plantas de control.

Tomando el maiz como ejemplo, un incremento de rendimiento se puede manifestar como uno o mas de lo siguiente: aumento en el numero de plantas establecidas por hectarea o acre, un aumento en el numero de mazorcas por planta, un aumento en el numero de filas, en el numero de granos por fila, peso del grano, peso de mil granos, longitud/diametro de la mazorca, aumento en la taza de llenado de la semilla (que es el numero de semillas llenas dividido por el numero total de semillas y multiplicado por 100), entre otros. Tomando el arroz como ejemplo un aumento en el rendimiento se puede manifestar en si mismo como un aumento en uno o mas de lo siguiente: numero de plantas por hectarea o acre, numero de paniculas por planta, numero de espiguillas por panicula, numero de flores (floretes) por panicula, que se expresa como una relaci6n del numero de semillas llenas sobre el numero de paniculas primarias), aumento en la tasa de llenado de semilla (que es el numero de semillas llenas dividido por el numero total de semillas y multiplicado por 100), aumento en el peso de mil granos, entre otros.

En una forma de realizaci6n, la presente invenci6n proporciona un metodo para incrementar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas de las plantas con relaci6n a las plantas que sirven de control, cuyo metodo comprende incrementar la expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20 como se defini6 aqui.

Ia que las plantas transgenicas de acuerdo con la presente invenci6n tienen un aumento de caracteristicas relacionadas con el rendimiento, es probable que estas plantas exhiban una mayor tasa de crecimiento (durante al menos parte de su ciclo de vida), con relaci6n a la tasa de crecimiento de las plantas que sirven como control en una etapa correspondiente en su ciclo de vida.

En una forma de realizaci6n, la presente invenci6n proporciona un metodo para mejorar las caracteristicas relacionados con el rendimiento de una planta bajo condiciones de crecimiento de estres abi6tico, especialmente el rendimiento de biomasa y / o de semillas de las plantas, en relaci6n con las plantas de control cultivadas en condiciones comparables, cuyo metodo comprende incrementar la expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido de GRP como se define aqui.

Ia que las plantas transgenicas de acuerdo con la presente invenci6n que crecen bajo condiciones de estres abi6tico tienen un aumento de caracteristicas relacionadas con el rendimiento, es probable que estas plantas exhiban una mayor tasa de crecimiento (durante al menos parte de su ciclo de vida), con relaci6n a la tasa de

crecimiento de las plantas que sirven como control en una etapa correspondiente en su ciclo de vida, y bajo condiciones de crecimiento comparables.

Ia que las plantas transgenicas de acuerdo con la presente invenci6n tienen mayor rendimiento, es probable que estas plantas exhiban una mayor tasa de crecimiento (durante al menos parte de su ciclo de vida), con relaci6n a la tasa de crecimiento de las plantas que sirven como control en una etapa correspondiente en su ciclo de vida.

La mayor tasa de crecimiento puede ser especifica para una o mas partes de una planta (incluyendo las semillas), o puede ser sustancialmente a traves de la planta completa. Las plantas con una mayor velocidad de crecimiento pueden tener un ciclo vital mas corto. El ciclo de vida de una planta puede entenderse como el tiempo necesario para desarrollarse desde una semilla madura seca hasta la etapa donde la planta ha producido semillas maduras secas, en forma similar al material de partida. Este ciclo de vida puede estar influido por factores tales como el vigor temprano, la velocidad de crecimiento, el indice de verdor, el tiempo de floraci6n y la velocidad de maduraci6n de la semilla. El incremento en la velocidad del crecimiento puede tener lugar en una o mas etapas en el ciclo de vida de una planta o sustancialmente durante todo el ciclo de vida de la planta. La mayor velocidad de crecimiento durante las etapas tempranas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar un mayor vigor (temprano). El incremento en la velocidad de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta permitiendo que las plantas sean sembradas mas tarde y/o cosechadas mas pronto de lo que seria posible de otro modo (se puede obtener un efecto similar con un tiempo de floraci6n mas temprano; la demora en la floraci6n no es usualmente una caracteristica deseable en los cultivos). Si la velocidad del crecimiento se incrementa lo suficiente, puede permitir el sembrado posterior de semillas de la misma especie de planta (por ejemplo el sembrado y cosecha de plantas de arroz seguido por el sembrado y cosecha de otras plantas de arroz todo dentro de un periodo de crecimiento convencional). De manera similar, si se incrementa suficientemente la velocidad de crecimiento, permitira el posterior sembrado de diferente especies de planta (por ejemplo sembrado y cosecha de plantas de maiz, seguido por ejemplo, del sembrado y de cosecha opcional de soja, patata o cualquier otra planta adecuada). Tambien se puede cosechar varias veces a partir del mismo rizoma en el caso de algunas plantas de cultivo. La alteraci6n del ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un incremento en la producci6n anual de biomasa por acre (debido a un incremento en el numero de veces (digamos en un afo) que cualquier planta particular puede ser cultivada y cosechada). Un incremento en la velocidad de crecimiento tambien puede permitir el cultivo de plantas transgenicas en un area geografica mas amplia que sus contrapartes de tipo silvestre, dado que las limitaciones territoriales para el crecimiento de un cultivo a menudo estan determinadas por condiciones ambientales adversas ya sea en el momento de la plantaci6n (a principios de la estaci6n) o en el momento de la cosecha (finales de la estaci6n). Estas condiciones adversas se pueden evitar si se acorta el ciclo de la cosecha. La velocidad de crecimiento puede determinarse por medio de la derivaci6n de diferentes parametros a partir de las curvas de crecimiento; dichos parametros pueden ser: T-Mid (el tiempo que les toma a las plantas alcanzar 50% de su tamafo maximo) y T-90 (el tiempo que les toma a las plantas alcanzar 90% de su tamafo maximo), entre otros. La tasa de crecimiento definida aqui no pretende significar retraso en la floraci6n.

De acuerdo con una caracteristica preferida de la presente invenci6n, el desempefo de los metodos de la invenci6n produce plantas que tienen una mayor tasa de crecimiento con respecto a las plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invenci6n, se provee un metodo para incrementar la tasa de crecimiento de las plantas, en donde dicho metodo comprende incrementar la expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20 como se defini6 aqui.

Un incremento de las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas se presenta si la planta esta bajo condiciones no estresadas o si la planta es expuesta a varios tipos de estres en comparaci6n con las plantas control cultivadas bajo condiciones comparables. Una mejora de las caracteristicas relacionadas con el rendimiento (un incremento en el rendimiento de semillas y/o en la tasa de crecimiento) se presenta si la planta esta bajo condiciones no estresadas o si la planta es expuesta a diferentes tipos de estres comparado con las plantas de control.

En una forma de realizaci6n particularmente preferida, los metodos de la presente invenci6n se llevan a cabo bajo condiciones no estresadas. Sin embargo, un incremento en el rendimiento y/o en la tasa de crecimiento se presenta si la planta esta bajo condiciones no estresadas o si la planta es expuesta a diferentes tipos de estres comparado con las plantas de control.

Las plantas tipicamente responden a la exposici6n al estres creciendo en forma mas lenta. En condiciones de estres severo, la planta puede incluso detener el crecimiento completamente. Un estres moderado por otro lado se define aqui como cualquier estres al cual se expone una planta que no produce como resultado que la planta cese su crecimiento completamente sin la capacidad de reanudarlo. Un estres moderado en el sentido de la invenci6n conduce a una reducci6n en el crecimiento de las plantas estresadas de menos del 40%, 35% o 30%, preferiblemente menos del 25%, 20% o 15%, mas preferiblemente menos de 14%, 13%, 12%, 11% o 10% o menos en comparaci6n con las plantas control bajo condiciones no estresantes. Debido a los avances en las practicas agricolas (irrigaci6n, fertilizaci6n, tratamientos con pesticidas) no se encuentran a menudo estreses severos en las

plantas de cultivo sembradas. En consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por un estres moderado a menudo es una caracteristica indeseable para la agricultura. Los estreses moderados son los estreses bi6ticos y/o abi6ticos (ambientales) de cada temporada a los cuales esta expuesta una planta. Los estreses abi6ticos pueden deberse a sequia o exceso de agua, estres anaer6bico, estres por salinidad, toxicidad quimica, estres oxidativo y temperaturas calurosas, frias o congelantes. El estres abi6tico puede ser un estres osm6tico causado por un estres por agua (particularmente debido a sequia), estres por salinidad, estres oxidativo o un estres i6nico. Los estreses bi6ticos son tipicamente aquellos estreses causados por pat6genos, tales como bacterias, virus, hongos, nematodos, e insectos. El termino condiciones "no estresantes" como se usa aqui son aquellas condiciones ambientales que permiten el 6ptimo crecimiento de las plantas. Las personas normalmente capacitadas en el arte son conscientes de las condiciones normales de suelo y las climaticas para una ubicaci6n dada.

De acuerdo a lo reportado en (ang et al. (Planta (2003) 218: 1 -14), un estres abi6tico conduce a una serie de cambios morfol6gicos, fisiol6gicos, bioquimicos y moleculares que afectan adversamente el crecimiento y la productividad de la planta. Se sabe que la sequia, salinidad, temperaturas extremas y estres oxidativo estan interconectados y pueden inducir dafo celular y de crecimiento a traves de mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755 -1767) describe un grado particularmente elevado de "interferencia" entre el estres por sequia y el estres por alta salinidad. Por ejemplo, la sequia y/o la salinizaci6n se manifiestan principalmente como estres osm6tico, produciendo la interrupci6n de la homeostasis y la distribuci6n de iones en la celula. El estres oxidativo, que con frecuencia acompafa a temperaturas altas o bajas, al estres por salinidad o por sequia, puede causar desnaturalizaci6n de proteinas funcionales y estructurales. Como consecuencia, estos diversos estreses ambientales a menudo activan rutas de sefalizaci6n celular y respuestas celulares similares, tales como la producci6n de proteinas por estres, favorecimiento de la expresi6n de antioxidantes, acumulaci6n de solutos compatibles y detenci6n del crecimiento. El termino condiciones "no estresantes" como se usa aqui son aquellas condiciones ambientales que permiten el 6ptimo crecimiento de las plantas. Las personas normalmente capacitadas en el arte son conscientes de las condiciones normales de suelo y las climaticas para una ubicaci6n dada.

En una forma de realizaci6n, el desempefo de los metodos de la invenci6n produce plantas cultivadas bajo condiciones no estresantes o bajo condiciones de estres moderado que tienen mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento, con respecto a plantas de control cultivadas bajo condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invenci6n, se provee un metodo para incrementar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento en plantas cultivadas bajo condiciones no estresantes o bajo condiciones de estres moderado, en donde el metodo comprende incrementar la expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20.

En una forma de realizaci6n, el desempefo de los metodos de la invenci6n produce plantas cultivadas bajo condiciones de estres moderado que tienen mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento, con respecto a plantas de control cultivadas bajo condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con una forma de realizaci6n de la presente invenci6n, se provee un metodo para incrementar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento en plantas cultivadas bajo condiciones de estres moderado, en donde el metodo comprende incrementar la expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido de GRP.

El desempefo de los metodos de acuerdo con la presente invenci6n da como resultado plantas que crecen bajo condiciones de estres abi6tico que tienen mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento para controlar a las plantas que crecen bajo condiciones comparables de estres. De acuerdo a lo reportado en (ang et al. (Planta (2003) 218: 1 -14), un estres abi6tico conduce a una serie de cambios morfol6gicos, fisiol6gicos, bioquimicos y moleculares que afectan adversamente el crecimiento y la productividad de la planta. Se sabe que la sequia, salinidad, temperaturas extremas y estres oxidativo estan interconectados y pueden inducir dafo celular y de crecimiento a traves de mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755 -1767) describe un grado particularmente elevado de "interferencia" entre el estres por sequia y el estres por alta salinidad. Por ejemplo, la sequia y/o la salinizaci6n se manifiestan principalmente como estres osm6tico, produciendo la interrupci6n de la homeostasis y la distribuci6n de iones en la celula. El estres oxidativo, que con frecuencia acompafa a temperaturas altas o bajas, al estres por salinidad o por sequia, puede causar desnaturalizaci6n de proteinas funcionales y estructurales. Como consecuencia, estos diversos estreses ambientales a menudo activan rutas de sefalizaci6n celular y respuestas celulares similares, tales como la producci6n de proteinas por estres, favorecimiento de la expresi6n de antioxidantes, acumulaci6n de solutos compatibles y detenci6n del crecimiento. Ia que diversos tipos de estres ambiental activan rutas similares, los ejemplos de la presente invenci6n con estres por sequia no deben ser considerados como una limitaci6n al estres por sequia, sino mas como una selecci6n para indicar la participaci6n de polipeptidos AHL 19/20 como se defini6 anteriormente, en el incremento de las caracteristicas relacionadas con el rendimiento con relaci6n a las plantas que sirven como control cultivadas en condiciones de estres comparables, en estreses abi6ticos en general.

Ia que diversos estreses ambientales activan rutas similares, los ejemplos de la presente invenci6n con estres por sequia y estres por salinidad no deben ser considerados como una limitaci6n al estres por sequia o al estres por salinidad, sino mas como una selecci6n para indicar la participaci6n de polipeptidos de GRP como se defini6

anteriormente, en el mejoramiento de las caracteristicas relacionadas con el rendimiento con relaci6n a las plantas que sirven como control cultivadas en condiciones de estres comparables, en estreses abi6ticos en general.

El termino "estres abi6tico" como se define aqui se entiende que significa uno o mas de: estres por agua (causado por sequia o exceso de agua), estres anaer6bico, estres por salinidad, estres por temperatura (causada por temperaturas elevadas, frias o congelantes), estres por toxicidad quimica y estres oxidativo. De acuerdo con un aspecto de la invenci6n, el estres abi6tico es un estres osm6tico, seleccionado de estres por agua, estres por salinidad, estres oxidativo y estres i6nico. Preferiblemente, el estres por agua es estres por sequia. El termino estres por salinidad no se restringe a la sal comun (NaCl), sino que puede ser cualquier estres causado por una o mas de: NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2, entre otras.

Preferiblemente, el estres abi6tico es estres por salinidad. Alternativamente, el estres abi6tico es estres por salinidad.

En una forma de realizaci6n, el desempefo de los metodos de la invenci6n produce plantas que tienen mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas, bajo condiciones de estres abi6tico con respecto a las plantas de control cultivadas bajo condiciones de estres comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invenci6n, se provee un metodo para incrementar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas, en plantas cultivadas bajo condiciones de estres abi6tico, en donde el metodo comprende incrementar la expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20. De acuerdo con un aspecto de la invenci6n, el estres abi6tico es un estres osm6tico, seleccionado de uno o mas de los siguientes: estres hidrico, estres por salinidad, estres oxidativo y estres i6nico.

En una forma de realizaci6n el desempefo de los metodos de la invenci6n produce plantas que crecen bajo condiciones de estres abi6tico que tienen caracteristicas mejoradas relacionadas con el rendimiento en relaci6n con las plantas de control cultivadas en condiciones de estres comparable. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invenci6n, se proporciona un metodo para mejorar las caracteristicas relacionados con el rendimiento en plantas cultivadas bajo condiciones de estres abi6tico, cuyo metodo comprende incrementar la expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido de GRP. De acuerdo con un aspecto de la invenci6n, el estres abi6tico es un estres osm6tico, seleccionado de uno o mas de los siguientes: estres hidrico, estres por salinidad, estres oxidativo y estres i6nico. Preferiblemente, el estres abi6tico es estres por sequia. Alternativa o adicionalmente, el estres abi6tico es estres por salinidad.

Otro ejemplo de estres ambiental abi6tico es la disponibilidad reducida de uno o mas nutrientes que deben ser asimilados por las plantas para su crecimiento y desarrollo. Debido a la fuerte influencia de la eficiencia de la utilizaci6n de la nutrici6n sobre el rendimiento de la planta y la calidad del producto, se vierte una enorme cantidad de fertilizante en los campos para optimizar el crecimiento y calidad de las plantas. La productividad de las plantas en general esta limitada por tres nutrientes principales, f6sforo, potasio y nitr6geno, donde usualmente entre estos tres se encuentra el elemento limitante de la velocidad de crecimiento de las plantas. Por lo tanto el elemento nutricional principal requerido para el crecimiento de las plantas es el nitr6geno (N). Es un constituyente de numerosos compuestos importantes hallados en las celulas vivientes, incluidos aminoacidos, proteinas (enzimas), acidos nucleicos y clorofila. 1,5% a 2% del material seco de una planta es nitr6geno y aproximadamente 16% de la proteina total de la planta. Por lo tanto, la disponibilidad de nitr6geno es un factor limitante principal para el crecimiento y producci6n de las plantas de cultivo (Frink et al. (1999) Proc Natl Acad Sci EUA 96(4): 1175 -1180), y tiene tambien un impacto principal en la acumulaci6n de proteinas y composici6n de los aminoacidos. Por lo tanto, son de gran interes las plantas de cultivo con mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento, cuando se cultivan bajo condiciones limitantes de nitr6geno.

En una forma de realizaci6n, el desempefo de los metodos de la invenci6n produce plantas que crecen bajo condiciones de disponibilidad reducida de nutrientes, particularmente bajo condiciones de disponibilidad reducida de nitr6geno, que tienen mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas con respecto a las plantas de control cultivadas bajo condiciones de estres comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invenci6n, se provee un metodo para incrementar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento en plantas cultivadas bajo condiciones de disponibilidad reducida de nutrientes, preferiblemente disponibilidad reducida de nitr6geno, en donde el metodo comprende incrementar la expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleicoquecodifcaun polipeptido AHL 19/20. La disponibilidad reducida de nutrientes puede resultar de una deficiencia o exceso de nutrientes tales como nitr6geno, fosfatos y otros compuestos que contienen f6sforo, potasio, calcio, cadmio, magnesio, manganeso, hierro y boro, entre otros. Preferiblemente la disponibilidad reducida de nutrientes es disponibilidad reducida de nitr6geno.

En una forma de realizaci6n, el desempefo de los metodos de la invenci6n produce plantas que crecen bajo condiciones de disponibilidad reducida de nutrientes, particularmente bajo condiciones de disponibilidad reducida de nitr6geno, que tienen caracteristicas mejoradas relacionadas con el rendimiento con respecto a las plantas de control cultivadas bajo condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invenci6n, se provee un metodo para mejorar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento en plantas cultivadas bajo condiciones de disponibilidad reducida de nutrientes, en donde el metodo comprende incrementar la expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifca un polipeptido de GRP. La disponibilidad reducida de nutrientes puede comprender una disponibilidad reducida de nutrientes tales como nitr6geno, fosfatos y otros compuestos que contienen f6sforo, potasio, calcio, cadmio, magnesio, manganeso, hierro y boro, entre otros.

La presente invenci6n abarca plantas o partes de las mismas (incluidas semillas) o celulas de las mismas que pueden ser obtenidas mediante los metodos de acuerdo con la presente invenci6n. Las plantas o partes de las mismas o celulas de las mismas comprenden un transgen de acido nucleico que codifica un polipeptido que incrementa el rendimiento seleccionado del grupo que consiste de: uno localizado en el nucleo 19/20 con el motivo AT-hook (AHL 19/20) como se defini6 anteriormente.

La invenci6n tambien provee construcciones y vectores geneticos para facilitar la introducci6n y/o mayor expresi6n en plantas de secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos que incrementan el rendimiento seleccionados del grupo que consiste de: uno localizado en el nucleo 19/20 con el motivo AT-hook (AHL 19/20). Las construcciones genicas se pueden insertar en vectores, que pueden encontrarse comercialmente disponibles, adecuados para la transformaci6n en plantas y para la expresi6n del gen de interes en las celulas transformadas. La invenci6n tambien provee el uso de una construcci6n genica como se define aqui en los metodos de la invenci6n.

En forma mas especifica, la presente invenci6n provee una construcci6n que comprende:

(a): una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido que incrementa el rendimiento seleccionado del grupo que consiste de: uno localizado en el nucleo 19/20 con el motivo AT-hook (AHL 19/20) como se defini6 anteriormente;

(b): una o mas secuencias de control capaces de incrementar la expresi6n de la secuencia del acido nucleico de (a); y opcionalmente

(c): una secuencia de terminaci6n de la transcripci6n.

En una forma de realizaci6n, la secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20 es como se defini6 anteriormente. El termino "secuencia control" y "secuencia de terminaci6n" son como se definen aqui.

Preferiblemente, una de las secuencias control de una construcci6n es un promotor constitutivo aislado de un genoma de una planta. Un ejemplo de un promotor constitutivo es un promotor GOS2, preferiblemente un promotor GOS2 de arroz, mas preferiblemente un promotor GOS2 como el representado mediante la SEQ lD NO: 35.

Las plantas se transforman con un vector que comprende cualquiera de las secuencias de acido nucleico descritas anteriormente. La persona calificada en la tecnica es muy consciente de los elementos geneticos que deben estar presentes en el vector a fin de transformar, seleccionar y propagar exitosamente las celulas huespedes que contienen la secuencia de interes. La secuencia de interes esta operativamente enlazada a una o mas secuencias de control (al menos a un promotor).

Convenientemente, se puede utilizar cualquier tipo de promotor, ya sea natural o sintetico, para incrementar la expresi6n de la secuencia de acido nucleico. Un promotor constitutivo es particularmente util en los metodos, preferiblemente un promotor constitutivo aislado de un genoma de una planta. El promotor constitutivo de una planta dirige la expresi6n de una secuencia codificadora en un nivel que esta en todos los casos por debajo de aquel obtenido bajo el control de un promotor viral 35S del CaMV.

Otros promotores especificos del 6rgano, por ejemplo para la expresi6n preferida en hojas, tallos, tuberculos, meristemas, semillas (embri6n y/o endospermo), son utiles para llevar a cabo los metodos de invenci6n. Vease la secci6n "Definiciones" aqui para las definiciones de los diferentes tipos de promotores.

Debe aclararse que la aplicabilidad de la presente invenci6n no esta restringida a una secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido AHL 19/20, como el representado mediante la SEQ lD NO: 1, ni la aplicabilidad de la invenci6n esta restringida a la expresi6n de una secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido AHL 19/20 cuando esta dirigida por un promotor constitutivo.

El promotor constitutivo es preferiblemente un promotor GOS2, preferiblemente un promotor GOS2 de arroz. Preferiblemente ademas, el promotor GOS2 esta representado por una secuencia de acido nucleico sustancialmente similar a la SEQ lD NO: 47, lo mas preferible, el promotor GOS2 es como el representado por la SEQ lD NO: 47. Vease la Tabla 2 en la secci6n de "Definiciones" aqui para otros ejemplos de promotores constitutivos.

Vease aqui la secci6n "Definiciones" para las definiciones de los distintos tipos de promotores. Particularmente util en los metodos de la invenci6n es un promotor especifico de la raiz, en particular un promotor especifico de la epidermis de la raiz. El promotor especifico de la raiz es preferiblemente un promotor transportador de nitrato, mas preferiblemente de arroz (promotor Os NRT1 como lo describe Lin, 2000). El promotor esta representado por la SEQ lD NO: 59. Una secuencia de acido nucleico sustancialmente similar a la SEQ lD NO: 59 tambien seria util en los metodos de la invenci6n. Ejemplos de otros promotores especificos de la raiz, que tambien pueden ser utilizados para llevar a cabo los metodos de la invenci6n se muestran en la Tabla 2b en la secci6n "Definiciones" mas arriba.

Opcionalmente, se pueden utilizar una o mas secuencias terminadoras en la construcci6n introducida en una planta. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir mejoradores de la transcripci6n asi como tambien de traducci6n. Las personas normalmente capacitadas en la tecnica seran conscientes de las secuencias terminadoras y mejoradores que puedan ser adecuadas para uso en la realizaci6n de la invenci6n. Tambien se puede afadir una secuencia de intr6n a la regi6n no traducida (UTR) 5' o en la secuencia de codificaci6n para incrementar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol, como se describe en la secci6n de las definiciones. Otras secuencias control (ademas de las secuencias promotoras, mejoradoras, silenciadoras, del intr6n, regiones 3'UTR y/o 5'UTR) pueden ser proteinas y/o elementos estabilizantes del ARN. Tales secuencias serian conocidas o pueden ser facilmente obtenidas por una persona normalmente capacitada en la tecnica.

Las construcciones geneticas divulgadas en la invenci6n pueden incluir ademas un origen de secuencia de replicaci6n que se requiere para el mantenimiento y/o replicaci6n en un tipo de celula especifico. Un ejemplo es cuando se requiere mantener una construcci6n genetica en una celula bacteriana como un elemento genetico episomal (por ejemplo, una molecula de plasmido o de c6smido). Los origenes de replicaci6n preferidos incluyen, pero no se limitan al f1-ori y colE1.

Para la detecci6n de la transferencia exitosa de las secuencias de acido nucleico tal como se utiliza en los metodos de la invenci6n y/o selecci6n de planta transgenicas que comprende estas secuencias de acido nucleico, es conveniente utilizar genes marcadores (o genes reporteros). Por lo tanto, la construcci6n genetica puede comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables se describen en mas detalle en la secci6n "definiciones" aqui.

Los genes marcadores pueden ser removidos o cortados de la celula transgenica una vez no se los necesite mas. Las tecnicas para remoci6n del marcador se conocen en la tecnica. Se describen tecnicas utiles mas arriba en la secci6n de definiciones.

Se sabe que tras la integraci6n estable o transitoria de secuencias de acido nucleico en las celulas de la planta, s6lo una minoria de las celulas incorpora el ADN foraneo y, si se desea, lo integra en su genoma, dependiendo del vector de expresi6n utilizado y de la tecnica de transfecci6n utilizada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifca para un marcador seleccionable (tal como los descritos anteriormente) es usualmente introducido en las celulas huesped junto con el gen de interes. Estos marcadores, por ejemplo, pueden utilizarse en mutantes en los cuales estos genes no son funcionales, por ejemplo, por medio de la supresi6n mediante metodos convencionales. Ademas, se pueden introducir moleculas de secuencias de acido nucleico que codifcan un marcador seleccionable en una celula huesped sobre el mismo vector que comprende la secuencia que codifca los polipeptidos de la invenci6n o que se utiliza en los metodos de la invenci6n, o bien en un vector separado. Las celulas que han sido transfectadas en forma estable con la secuencia introducida de acido nucleico se pueden identificar por ejemplo mediante selecci6n (por ejemplo, las celulas que han integrado el marcador seleccionable sobreviven mientras que las otras celulas mueren). Los genes marcadores pueden ser removidos o escindidos de la celula transgenica una vez que no se los necesita. Las tecnicas para remoci6n del gen marcador son conocidas en el arte; las tecnicas utiles fueron descritas anteriormente en la secci6n de definiciones.

En una forma de realizaci6n, la invenci6n tambien provee un metodo para la producci6n de plantas transgenicas que tienen mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas con relaci6n a las plantas que sirven como control, que comprende la introducci6n y expresi6n en una planta de cualquier secuencia de acido nucleico que codifque un polipeptido AHL 19/20 como se defini6 aqui anteriormente.

Mas especificamente, la presente invenci6n provee un metodo para la producci6n de plantas transgenicas que tienen mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas con respecto a las plantas que sirven como control, el cual comprende:

(i): la introducci6n y expresi6n en una planta, parte de una planta, o una celula de una planta, de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20, bajo el control de un promotor constitutivo de una planta; y

(ii): el cultivo de la celula de la planta, parte de la planta o la planta en condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.

La secuencia de acido nucleico de (i) puede ser cualquiera de las secuencias de acido nucleico capaces de codificar un polipeptido AHL 19/20 como se defini6 aqui.

La secuencia de acido nucleico se puede introducir directamente en una celula de una planta o dentro de la planta misma (incluyendo la introducci6n en un tejido, 6rgano o cualquier otra parte de una planta). De acuerdo con una caracteristica preferida de la presente invenci6n, se introduce preferiblemente la secuencia de acido nucleico en una planta mediante transformaci6n. El termino "transformaci6n" se describe en forma mas detallada, en la secci6n "definiciones" en la presente descripci6n.

Las celulas de la planta geneticamente modificadas se pueden regenerar mediante todos los metodos con los cuales esta familiarizado la persona capacitada en la tecnica. Los metodos adecuados pueden encontrarse en las publicaciones antes mencionadas por S. D. Kung y R. (u, Potrykus o H6fgen y(illmitzer.

En general despues de la transformaci6n, las celulas de la planta o los agrupamientos celulares se seleccionan para determinar la presencia de uno o mas marcadores que son codificados por genes que pueden expresase en una planta transferidos junto con el gen de interes, despues de lo cual se regenera el material transformado en una planta entera. Para seleccionar las plantas transformadas, el material vegetal obtenido en la transformaci6n es sometido, como regla, a condiciones selectivas de modo que las plantas transformadas puedan distinguirse de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas en la forma antes descrita se pueden plantar y, despues de un periodo de crecimiento inicial, ser sometidas a una selecci6n adecuada por medio de rociado. Otra posibilidad adicional consiste en el crecimiento de las semillas, si procede despues de esterilizaci6n, sobre placas de agar utilizando un agente de selecci6n adecuado de modo que unicamente las semillas transformadas pueden convertirse en plantas. En forma alternativa, se seleccionan las plantas transformadas para determinar la presencia de un marcador seleccionable tal como las descritas anteriormente.

Despues de la transferencia y regeneraci6n del ADN, las plantas putativamente transformadas tambien se pueden evaluar, por ejemplo utilizando el analisis tipo Southern, para determinar la presencia del gen de interes, el numero de copias y/o organizaci6n gen6mica. En forma alternativa o adicional, se pueden monitorear los niveles de expresi6n del ADN recientemente introducido utilizando analisis tipo Northern y/o tipo (estern, siendo ambas tecnicas bien conocidas por las personas ordinariamente capacitadas en la tecnica.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar mediante una variedad de medios, tales como por medio de tecnicas de propagaci6n clonal o de fitomejoramiento clasico. Por ejemplo, una primera generaci6n de la planta transformada (o T1) puede ser autofecundada y los transformantes homocigotos de segunda generaci6n (o T2) seleccionados, y las plantas T2 pueden ser luego adicionalmente propagadas a traves de las tecnicas clasicas de fitomejoramiento. Los organismos transformados generados pueden adoptar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de celulas transformadas y de celulas no transformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las celulas transformadas para contener el casete de expresi6n); injertos de tejidos transformados y sin transformar (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado a un vastago sin transformar).

La presente invenci6n claramente se extiende a cualquier celula de una planta o planta producida mediante uno cualquiera de los metodos descritos aqui, y a todas las partes de la planta y propagulos de la misma. La presente invenci6n se extiende ademas para abarcar la progenie de una celula primaria transformada o transfectada, tejido, 6rgano o planta completa que ha sido producida mediante cualquiera de los metodos antes mencionados, siendo el unico requisito que la progenie exhiba la(s) misma(s) caracteristica(s) fenotipica(s) y/o genotipica(s) que las producidas por la progenie en los metodos de acuerdo con la invenci6n.

En una forma de realizaci6n, la invenci6n tambien incluye celulas huesped que contienen una secuencia aislada de acido nucleico que codifca un polipeptido AHL 19/20 como se defini6 aqui anteriormente, operativamente enlazada a un promotor constitutivo.

Las celulas huesped preferidas de acuerdo con la invenci6n son las celulas de la planta. Las plantas huesped para los acidos nucleicos o el vector utilizado en el metodo de acuerdo con la invenci6n, el casete de expresi6n o la construcci6n o el vector estan, en principio, en forma conveniente en todas las plantas, las cuales son capaces de sintetizar los polipeptidos utilizados en el metodo de la invenci6n.

Los metodos de la invenci6n se aplican convenientemente a cualquier planta. Las plantas que son particularmente utiles en los metodos de la invenci6n incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiled6neas y dicotiled6neas que incluyen forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, arboles o arbustos. De acuerdo con una realizaci6n preferida de la presente invenci6n, la planta es una planta de cultivo. Los ejemplos de plantas de cultivo incluyen soja, girasol, canola, alfalfa, colza, algod6n, tomate, patata y tabaco. Preferiblemente ademas, la planta es una planta monocotiled6nea. Los ejemplos de plantas monocotiled6neas incluyen a la cafa de azucar. Mas preferiblemente la planta es un cereal. Los ejemplos de cereales incluyen arroz, maiz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo y avena.

La invenci6n tambien se extiende a las partes cosechables de una planta que comprende una secuencia aislada de acido nucleico que codifica un AHL 19/20 (como se defini6 aqui anteriormente) operativamente enlazado a un promotor constitutivo de una planta, tal como, pero sin limitarse a semillas, hojas, frutos, flores, tallos, rizomas, tuberculos y bulbos. La invenci6n se refiere ademas a productos derivados, preferiblemente directamente derivados de una parte cosechable de dicha planta, tal como granulos o polvos secos, aceite, grasa y acidos grasos, almid6n o proteinas.

Los metodos para incrementar la expresi6n de las secuencias de acido nucleico o los genes, o productos genicos, estan bien documentados en la tecnica y se proveen ejemplos en la secci6n de definiciones.

Como se mencion6 anteriormente, un metodo preferido para incrementar la expresi6n de una secuencia de acido nucleico que codifca un polipeptido AHL 19/20 es por medio de la introducci6n y expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20; sin embargo, los efectos de llevar a cabo el metodo, es decir, de incrementar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento, tambien pueden lograrse utilizando otras tecnicas bien conocidas, que incluyen pero no se limitan a marcaci6n de la activaci6n del ADN-T, TlLLlNG, recombinaci6n hom6loga. Una descripci6n de estas tecnicas es suministrada en la secci6n de definiciones.

La presente invenci6n abarca tambien el uso de secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos AHL 19/20 como se describe aqui; y el uso de estos polipeptidos AHL 19/20 para incrementar cualquiera de las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas anteriormente mencionadas en plantas, bajo condiciones de crecimiento normales, y bajo condiciones de disponibilidad reducida de nutrientes, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad reducida de nitr6geno.

Las variantes alelicas de una secuencia de un gen/acido nucleico que codifican un polipeptido que incrementa el rendimiento pueden encontrar uso tambien en programas de fitomejoramiento asistidos por marcadores. Tales programas de fitomejoramiento algunas veces requieren la introducci6n de una variante alelica por medio de tratamiento mutagenico de las plantas, utilizando por ejemplo mutagenesis EMS; alternativamente, el programa puede iniciarse con un grupo de variantes alelicas de las asi llamadas de origen "natural" originadas en forma no intencional. La identificaci6n de variantes alelicas tiene lugar entonces, por ejemplo, por medio de PCR. Esto es seguido por una etapa para la selecci6n de variantes alelicas superiores de la secuencia en cuesti6n y que producen mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento. La selecci6n se lleva a cabo tipicamente monitoreando el desempefo del crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alelicas de la secuencia en cuesti6n. El desempefo del crecimiento puede ser monitoreado en un invernadero o en el campo. Otras etapas opcionales incluyen cruzamiento de plantas en las cuales se identific6 la variante alelica superior con otra planta. Esto podria ser utilizado, por ejemplo, para elaborar una combinaci6n de caracteristicas fenotipicas interesantes.

Los acidos nucleicos que codifican un polipeptido que incrementa el rendimiento pueden ser utilizados tambien como sondas para mapear genetica y fisicamente los genes de los cuales hacen parte, y como marcadores para caracteristicas enlazadas a esos genes. Tal informaci6n puede ser util en fitomejoramiento de plantas con el prop6sito de desarrollar lineas con fenotipos deseados. Tal uso de las secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos que incrementan el rendimiento requiere unicamente una secuencia de acido nucleico de al menos 15 nucle6tidos de longitud. Los acidos nucleicos que codifican un polipeptido que incrementa el rendimiento se pueden utilizar como marcadores de polimorfismo con la longitud del fragmento de restricci6n (RFLP). Las transferencias tipo Southern (Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) del ADN gen6mico de la planta digerido con enzimas de restricci6n pueden ser sondeadas con los acidos nucleicos del tipo AAT. Los patrones de bandas resultantes pueden ser luego sometidos a analisis genetico utilizando programas de computador tales como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174 - 181) con el prop6sito de construir un mapa genetico. Ademas, los acidos nucleicos pueden ser utilizados para examinar las transferencias tipo Southern que contienen los ADN gen6micos tratados con endonucleasa de restricci6n de un conjunto de individuos que representan al progenitor y a la progenie de un cruce genetico definido. Se observa la segregaci6n de los polimorfismos de ADN y se utilizan para calcular la posici6n del acido nucleico que codifica un polipeptido que incrementa el rendimiento en el mapa genetico previamente obtenido utilizando esta poblaci6n (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314 -331).

La producci6n y el uso de las sondas derivadas de genes de la planta para uso en mapeo genetico se describe en Bernatzky y Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37 -41. Numerosas publicaciones describen el mapeo genetico de clones especificos de ADNc utilizando la metodologia expuesta anteriormente o variantes de la misma. Por ejemplo, poblaciones de entrecruzamientos F2, poblaciones de retrocruzamiento, poblaciones apareadas al azar, lineas isogenicas cercanas, y otros conjuntos de individuos pueden ser utilizados para el mapeo. Estas metodologias son bien conocidas por aquellos ordinariamente capacitados en la tecnica.

Las sondas de la secuencias de acido nucleico tambien se pueden utilizar para mapeo fisico (es decir, colocaci6n de secuencias sobre mapas fisicos; vease Hoheisel et al. En: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, paginas 319 - 346, y las referencias citadas alli).

En otra realizaci6n, las sondas de secuencias de acido nucleico pueden ser utilizadas en el mapeo de la hibridaci6n in situ de fluorescencia directa (FlSH por su siglas en ingles) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149 -154). Aunque los metodos actuales de mapeo FlSH favorecen el uso de clones grandes (varios kb hasta varios cientos de kb, vease Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13 -20), las mejoras en sensibilidad pueden permitir la realizaci6n del mapeo FlSH utilizando sondas mas cortas.

Una variedad de metodos basados en la amplificaci6n de las secuencias de acido nucleico para mapeo genetico y fisico pueden ser llevados a cabo utilizando las secuencias de acido nucleico. Los ejemplos incluyen amplificaci6n especifica de alelos (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95 -96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325 -332), ligaci6n especifca de alelos (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077 -1080), reacciones de extensi6n del nucle6tido (Sokolov (1990) Nucleic Acid Sequence Res. 18: 3671), Mapeo Hibrido por Radiaci6n ((alter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22 -28) y Mapeo Happy (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Sequence Res. 17: 6795 -6807). Para estos metodos, se utiliza la secuencia de una secuencia de acido nucleico para disefar y producir pares de cebadores para uso en la reacci6n de amplificaci6n o en reacciones de extensi6n del cebador. El disefo de tales cebadores es bien conocido por aquellos ordinariamente bien capacitados en la tecnica. En los metodos que emplean mapeo genetico con base en PCR, puede ser necesario identificar las diferencias en la secuencia de ADN entre los progenitores del mapeo entrecruzado en la regi6n correspondiente a la presente secuencia de acido nucleico. Esto, sin embargo, generalmente, no es necesario para metodos de mapeo.

Los metodos de acuerdo con la presente invenci6n dan como resultado plantas que tienen mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas, como se describi6 anteriormente aqui. Estas caracteristicas pueden ser combinadas tambien con otras caracteristicas econ6micamente ventajosas, tales como las caracteristicas que incrementan adicionalmente el rendimiento, tolerancia a otros estreses abi6ticos y bi6ticos, caracteristicas que modifican diferentes caracteristicas arquitect6nicas y/o caracteristicas bioquimicas y/o fisiol6gicas.

Los metodos de acuerdo con la presente invenci6n dan como resultado plantas cultivadas bajo condiciones de estres abi6tico que tienen caracteristicas mejoradas relacionadas con el rendimiento, como se describi6 aqui anteriormente. Estas caracteristicas pueden ser combinadas tambien con otras caracteristicas econ6micamente ventajosas, tales como las caracteristicas que incrementan adicionalmente el rendimiento, tolerancia a otros estreses abi6ticos y bi6ticos, caracteristicas que modifican diferentes caracteristicas arquitect6nicas y/o caracteristicas bioquimicas y/o fisiol6gicas.

En una forma de realizaci6n, la invenci6n se relaciona con la materia resumida de la siguiente manera:

item 1: Un metodo para aumentar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas en plantas en relaci6n con las plantas de control, que comprende incrementar la expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido 19/20 localizado en el nucleo con el motivo AT-hook (AHL19/20), donde el polipeptido AHL19/20 comprende un dominio que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o mas de identidad de secuencia de aminoacidos de un dominio conservado (CD) como se representa por la SEQ lD NO: 36, y, opcionalmente, seleccionar las plantas que tienen un aumento de caracteristicas relacionados con el rendimiento de semillas.

item 2: Metodo de acuerdo con el item 1, en donde dicho polipeptido AHL 19/20 comprende: (i) un motivo que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o mas identidad de secuencia de aminoacidos con un motivo AThook como el representado por la SEQ lD NO: 37, y (ii) un dominio que tiene al menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o mas identidad de secuencia de aminoacidos con un dominio conservado de planta y de procariota (PPC), tal como el representado por la SEQ lD NO: 38 .

item 3: Metodo de acuerdo con el item 1 o 2 , en el que dicho polipeptido AHL 19/20 comprende: (i) una sefal de localizaci6n nuclear; (ii) un motivo de enlazamiento de ADN AT-hook con una entrada lnterPro lPR014476, y (iii) un dominio conservado de planta y de procariota (PPC) con una entrada lnterPro lPR005175.

item 4: Metodo de acuerdo con cualquier item anterior, en el que dicho polipeptido AHL 19/20, cuando se utiliza en la construcci6n de un arbol filogenetico AHL, tal como el representado en la Figura 1 o en la Figura 2, se agrupa con el grupo de polipeptidos AHL 19/20 que comprenden la secuencia de polipeptido tal como la representada por la SEQ lD NO: 2, en lugar de con cualquier otro grupo de AHL.

item 5: Metodo de acuerdo con cualquier item anterior, en el que dicho polipeptido AHL 19/20 tiene en orden creciente de preferencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o mas identidad de secuencia de aminoacidos con el polipeptido AHL 19/20 tal como el representado por la SEQ lD NO: 2

o con cualquiera de las secuencias de polipeptidos presentados en la Tabla A en este documento.

item 6: Metodo de acuerdo con cualquier item anterior, en el que dicha secuencia de acido nucleico que codifica un

polipeptido AHL 19/20 esta representado por una cualquiera de las secuencias de acidos nucleicos SEQ lD NOs presentadas en la Tabla A o una parte de las mismas, o una secuencia capaz de hibridarse con una cualquiera de las secuencias de acidos nucleicos SEQ lD NOs presentadas en la Tabla A.

item 7: Metodo de acuerdo con cualquier item anterior, en el que dicha secuencia de acido nucleico codifica un ort6logo o paralogo de cualquiera de las secuencias de polipeptido de las SEQ lD NOs presentadas en la Tabla A.

item 8: Metodo de acuerdo con cualquier item anterior, en el que dicho aumento de la expresi6n es llevado a cabo por uno o mas cualquiera de: marcado de la activaci6n del ADN-T, TlLLlNG, o recombinaci6n hom6loga.

item 9: Metodo de acuerdo con cualquier item anterior, en el que dicho aumento de la expresi6n se lleva a cabo mediante la introducci6n y expresi6n en una planta de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20.

item 10: Metodo de acuerdo con cualquier item anterior, en el que dicho aumento de caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas es uno o mas de: (i) aumento del numero de flores por panicula; (ii) aumento del peso total de las semillas por planta; (iii) aumento del numero de semillas llenas; o (iv) aumento de indice de cosecha.

item 11: Metodo de acuerdo con cualquier item anterior, en el que dicho aumento de caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas se produce en plantas cultivadas bajo condiciones de disponibilidad reducida de nutrientes, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad reducida de nitr6geno, en relaci6n con las plantas de control.

item 12: Metodo segun el item 11, en el que dicho aumento de caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas es uno o mas de: (i) aumento del rendimiento total de semillas por planta, (ii) aumento del numero de semillas llenas, o (iii) aumento de indice de cosecha.

item 13: Metodo de acuerdo con cualquier item anterior, en el que dicha secuencia de acido nucleico esta operativamente enlazada a un promotor constitutivo, preferiblemente a un promotor constitutivo de la planta, mas preferiblemente a un promotor GOS2, lo mas preferible a un promotor GOS2 de arroz como el representado por la SEQ lD NO: 35.

item 14: Metodo de acuerdo con cualquier item anterior, en el que dicha secuencia de acido nucleico que codifica una polipeptido AHL 19/20 es de origen vegetal, preferiblemente de una planta dicotiled6nea, adicionalmente preferiblemente de la familia Brassicaceae, lo mas preferible de Arabidopsis thaliana.

item 15: Plantas, sus partes (incluidas las semillas), o celulas de la planta que se pueden obtener por un metodo de acuerdo con cualquier item anterior, en el que dicha planta, parte o celula de la misma contienen un transgen de acido nucleico aislado que codifica una polipeptido AHL 19/20 operativamente enlazado a un promotor constitutivo de la planta.

item 16: construcci6n que comprende:

(a): Una secuencia de acido nucleico que codifica una polipeptido AHL 19/20 como se define en cualquiera de los items 1 a 5;

(b): una o mas secuencias de control capaces de dirigir la expresi6n de la secuencia de acido nucleico de (a); y opcionalmente;

(c): una secuencia de terminaci6n de la transcripci6n.

item 17: Construcci6n de acuerdo con el item 16, en el que dicha secuencia de control es un promotor constitutivo de la planta, preferiblemente un promotor GOS2, mas preferiblemente un promotor GOS2 como el representado por la SEQ lD NO: 35.

item 18: El uso de una construcci6n de acuerdo con los items 16 o 17 en un metodo para la elaboraci6n de plantas que tienen mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas en relaci6n con las plantas de control, en donde dicho aumento de caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas son una o mas de: (i) aumento del numero de flores por panicula; (ii) aumento del peso total de las semillas por planta; (iii) aumento en el numero de semillas llenas; o (iv) aumento del indice de cosecha.

item 19: Planta, parte de la planta o celula de la planta transformada con una construcci6n de acuerdo con el item 16

o 17.

item 20: Metodo para la producci6n de plantas transgenicas que tienen mayores caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas en relaci6n con las plantas de control, que comprende:

(i): introducir y expresar en una planta, parte de la planta, o celula de la planta, una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20 como se define en uno cualquiera de los items 1 a 6, bajo el control del promotor constitutivo de la planta; y

(ii): cultivar la celula de la planta, parte de la planta, o planta en condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.

item 21: Planta transgenica que tiene un aumento de caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas en relaci6n con las plantas de control, como resultado de un aumento de la expresi6n de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20 como se define en cualquiera de los items 1 a 5, operativamente enlazada a un promotor constitutivo de la planta, o una celula de una planta transgenica o parte de la planta transgenica derivada de dicha planta transgenica.

item 22: Planta transgenica de acuerdo con el item 15, 19 o 21, en donde dicha planta es una planta de cultivo o una monocotiled6nea o un cereal, tal como arroz, maiz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo y avena, o una celula de la planta transgenica derivada de dicha planta transgenica.

item 23: Partes cosechables que contienen una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20 de una planta de acuerdo con el item 22, en donde dichas partes cosechables son preferiblemente semillas.

item 24: Productos derivados de una planta de acuerdo con el item 22 y / o de partes cosechables de una planta de acuerdo al item 23.

item 25: Uso de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20 como se define en cualquiera de los items 1 a 6 en el aumento de las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas, que comprende uno o mas de: (i) aumento del numero de flores por panicula; (ii) aumento del peso total de las semillas por planta; (iii) aumento en el numero de semillas llenas; o (iv) aumento del indice de cosecha.

item 26: El uso de acuerdo con el item 25, en el que dicho aumento de caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas se presenta en condiciones de disponibilidad reducida de nutrientes, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad reducida de nitr6geno.

Descripci6n de las figuras

La presente invenci6n sera descrita a continuaci6n con referencia a las siguientes figuras en las cuales:

La Figura 1 representa un arbol filogenetico construido despues de una alineaci6n de todos los polipeptidos que pertenecen a la familia AHL (descrito en Fujimoto et al., (2004) Plant Molec Biol., 56: 225 - 239) llevado a cabo utilizando el algoritmo Clustal (1.83) de alineaci6n progresiva, utilizando valores predeterminados. El grupo de interes, que comprende los dos paralogos de Arabidopsis AHL19 (SEQ lD NO: 2 o AT3G04570) y AHL20 (SEQ lD NO: 4 o AT4G14465) ha sido encerrado en un circulo .

La Figura 2 representa un arbol filogenetico construido despues de una alineaci6n de todos los polipeptidos que pertenecen a la familia AHL (descrito en Fujimoto et al., (2004) Plant Molec Biol., 56: 225 - 239), y todos los ort6logos y paralogos AHL 19/20 de la Tabla A en el Ejemplo 1 en este documento, llevado a cabo utilizando el algoritmo Clustal (1.83) de alineaci6n progresiva, utilizando valores predeterminados.

La Figura 3 representa un boceto de un polipeptido AHL 19/20 tal como el representado por la SEQ lD NO: 2, que comprende la siguientes caracteristicas: una NLS predicha, un motivo de enlazamiento de ADN AT-hook (del que el nucleo es el tripeptido GRP; comprendido en la entrada lnterPro lPR014476 (enlazamiento predicho de ADN AThook)), un dominio de PPC (dominio conservado de planta y de procariotas; comprendido en la entrada lnterPro lPR005175 (proteina de funci6n desconocida DUF296)), y Dominio Conservado (CD) que comprende tanto un motivo de enlazamiento de ADN AT-hook y un dominio de PPC.

La Figura 4 muestra una alineaci6n de multiples secuencias por CLUSTAL ( (1.83) del Dominio Conservado de polipeptidos AHL 19/20 de la Tabla A (como el representado por la SEQ lD NO: 38 para la SEQ lD NO: 2), donde se identifican una serie de caracteristicas. Desde el extremo del terminal N hasta el extremo del terminal C de los polipeptidos, estos son: (i) una sefal de localizaci6n nuclear predicha (NLS), (ii) un motivo de enlazamiento de ADN AT-hook, con el nucleo tripeptido GRP, y (iii) un dominio de PPC (DUF 296) .

La Figura 5 muestra el vector binario para aumento de la expresi6n en Oryza sativa de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20 bajo el control de un promotor GOS2 (pGOS2) de arroz.

La Figura 6 detalles ejemplos de secuencias utiles en la realizaci6n de los metodos de acuerdo con la presente invenci6n.

Ejemplos

La presente invenci6n sera descrita a continuaci6n con referencia a los siguientes y ejemplos, que se citan s6lo para efectos ilustrativos. Los siguientes ejemplos no pretenden definir completamente o limitar de algun otro modo el alcance de la invenci6n.

Manipulaci6n del ADN: a menos que se establezca otra cosa, las tecnicas de ADN recombinante se llevan acabo de acuerdo con protocolos estandar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3° Edici6n Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New Iork) o en los Volumenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales estandar y los metodos para el trabajo molecular de la planta se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R. D. D. Croy, publicado por BlOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU).

Ejemplo1: ldentificaci6n de secuencias relacionadas con la secuencia de acido nucleico utilizada en los metodos de la invenci6n

Las secuencias (ADNc de longitud completa, los EST o gen6micas) relacionadas con la secuencia de acido nucleico usadas en los metodos de la presente invenci6n fueron identificadas entre aquellas mantenidas en la base de datos de nucle6tidos Entrez en el National Center for Biotechnology lnformation (NCBl) usando herramientas de busqueda de secuencias en la base de datos, tales como la Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 -410; y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 - 3402). El programa se utiliza para encontrar regiones de similitud local entre secuencias mediante la comparaci6n de secuencias de acido nucleico o de secuencias de polipeptidos con las bases de datos de secuencias y calculando el significado estadistico de las coincidencias. Por ejemplo, el polipeptido codificado por la secuencia de acido nucleico de la presente invenci6n se utiliz6 para el algoritmo TBLASTN, con parametros predeterminados y el filtro desactivado para ignorar secuencias de baja complejidad. El resultado del analisis se obtuvo a traves de la comparaci6n por pares, y se clasific6 de acuerdo con el puntaje de la probabilidad (valor E), donde el puntaje refleja la probabilidad de que ocurra una alineaci6n particular al azar (entre mas bajo el valor E, mas significativa la coincidencia). Ademas de los valores E, tambien se dio puntaje a las comparaciones mediante el porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refere a la cantidad de nucle6tidos (o aminoacidos) identicos entre las dos secuencias de acido nucleico (o polipeptidicas) comparadas sobre una longitud particular. En algunos casos, se pueden ajustar los parametros por defecto para modificar la rigurosidad de la busqueda. Por ejemplo, se puede incrementar el valor E para mostrar menos coincidencias estrictas. De este modo, se pueden identificar coincidencias cortas casi exactas.

La Tabla A proporciona un listado de secuencias de acidos nucleico relacionadas con la secuencia de acido nucleico utilizada en los metodos de la presente invenci6n.

Tabla A: Ejemplos de polipeptidos AHL 19/20: (continuaci6n)

Nombre: Organismo fuente Acido nucleico SEQ lD NO: Polipeptido SEQ lD NO: Numero de acceso a la base de datos Estatus

Arath AHL19: Arabidopsis thaliana 1 2 AT3G04570 NP 566232 Longitud completa (FL)

Arath AHL20: Arabidopsis thaliana 3 4 AT4G14465 NP 567432 FL

Aqufo AHL19/20: Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens 5 6 C6ntigo de DT758489, DT758488.1 FL

Brana AHL19/20: Brassica napus 7 8 CS226287 FL

Brara AHL 19/20: Brassica rapa 9 10 AC189468 FL

Glyma AHL19/20: Glycine max 11 12 CS137412 FL

Goshi AHL19/20: Gossypium hirsutum 13 14 D(519458 FL

Lacsa AHL19/2 0: Lactuca sativa 15 16 D(047323 FL

Lotja AHL19/20: Lotus japonicus 17 18 AP004971 FL

Orysa AHL19/2 0: Oryza sativa 19 20 AK110263 Os08g056320 0 FL

Orysa AHL19/2 0 ll: Oryza sativa 21 22 CT837915 Os02g082080 0 FL

Poptr AHL19/20: Populus tremuloides 23 24 scaff Xlll.441 FL

Soltu AHL19/20: Solanum tuberosum 25 26 C6ntigo de CN215397.1 CK276075.1 FL

Thlca AHL19/2 0: Thlaspi caerulescens 27 28 DQ022564 FL

Vitvi-AHL19/20: Vitis vinifera 29 30 AM463589 FL

Vitvi AHL19/20 ll: Vitis vinifera 31 32 AM429692 FL

Zeama AHL19/ 20: Zea mays 33 34 AC190270 FL

En algunos casos, las secuencias relacionadas han sido ensambladas tentativamente y divulgadas al publico por

5 parte de instituciones de investigaci6n, tales como The lnstitute for Genomic Research (TlGR). La base de datos Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) puede ser utilizada para identificar tales secuencias relacionadas, ya sea por medio de una busqueda de palabras clave o por medio del uso del algoritmo BLAST con la secuencia de acido nucleico o la secuencias de polipeptidos de interes. En otros casos, se han creado bases de datos especiales de secuencias de acido nucleico para organismos particulares, tales como por el Joint Genome lnstitute, por ejemplo

10 para Ostreococcus tauri.

Ejemplo 2: Alineaci6n de secuencias de polipeptidos de la invenci6n

La alineaci6n de secuencias de polipeptidos se lleva a cabo utilizando el programa AlignX del paquete Vector NTl (lnvitrogen), que se basa en el algoritmo popular Clustal( de alineaci6n progresiva (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876 -4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497 -3500). Los valores predeterminados

15 son para la penalizaci6n por abertura de espacio de 10, para penalizaci6n por extensi6n de espacio de 0,1 y la matriz de peso seleccionada es Blosum 62 (si se alinean polipeptidos). Se puede hacer una edici6n manual menor se puede hacer para optimizar aun mas la alineaci6n. Se construye un arbol filogenetico de polipeptidos utilizando un algoritmo de agrupamiento uni6n de vecinos (neighbour-joining) conforme a lo dispuesto en el programa AlignX de Vector NTl (lnvitrogen) .

20 La alineaci6n de todas las secuencias de polipeptidos AHL de Arabidopsis thaliana identificadas en Fujimoto et al. (2004; Tableau mas adelante) se realiz6 usando el algoritmo Clustal (1.83) de alineaci6n progresiva, con valores predeterminados (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876 -4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497 -3500). Se construy6 un arbol de uni6n de vecinos despues de eso, y se representa en la Figura 1 de la presente solicitud. El grupo de interes, que comprende los dos paralogos AHL19 de Arabidopsis (SEQ lD NO: 2 o

25 AT3G04570), y AHL20 (SEQ lD NO: 4 o AT4G14465) encerrado en un circulo. Cualquier polipeptido que caiga dentro de este grupo de AHL19/20 (despues de una nueva etapa de alineaci6n multiple como se describe anteriormente en esta memoria ) se considera que es util en la realizaci6n de los metodos de la invenci6n como se describi6 en este documento mas arriba.

Tabla A1: Polipeptidos AHL identificados en Arabidopsis thaliana

Numero AHL: Numero de acceso de Tair Numero de acceso del NCBl

AHL1: At4g12080 NP 192945

AHL2: At4g22770 NP 194008

AHL3: At4g25320 NP 194262

AHL4: At5g51590 NP 199972

AHL5: At1g63470 NP 176536

AHL6: At5g62260 NP 201032

AHL7: At4g00200 NP 191931

AHL8: At5g46640 NP 199476

(continuaci6n)

Numero AHL: Numero de acceso de Tair Numero de acceso del NCBl

AHL9: At2g45850 NP 182109

AHL10: At2g33620 NP 565769

AHL11: At3q61310 NP 191690

AHL12: At1g63480 NP 176537

AHL13: At4g17950 NP 567546

AHL14: At3g04590 NP 187109

AHL15: At3g55560 NP 191115

AHL16: At2g42940 NP 181822

AHL17: At5g49700 NP 199781

AHL18: At3g60870 NP 191646

AHL19: At3g04570 NP 566232

AHL20: At4g14465 NP 567432

AHL21: At2g35270 NP 181070

AHL22: At2g45430 NP 182067

AHL23: At4g17800 NP 193515

AHL24: At4g22810 NP 194012

AHL25: At4g35390 NP 195265

AHL26: At4g12050 NP 192942

AHL27: At1g20900 NP 173514

AHL28: At1g 14490 NP 172901

AHL29: At1g76500 NP 177776

Una segunda alineaci6n de secuencias multiples se realiz6 incluyendo todos los polipeptidos ort6logos AHL19/20 de la Tabla A y todas las secuencias de AHL de la Tabla A1. Se construy6 un arbol de uni6n de vecinos despues de eso, y se representa en la Figura 2 de la presente solicitud. El grupo de interes, que comprende los dos paralogos AHL19 de Arabidopsis (SEQ lD NO: 2 o AT3G04570), y AHL20 (SEQ lD NO: 4 o AT4G14465) ha sido encerrado en un circulo. Cualquier polipeptido que caiga dentro de este grupo de AHL19/20 se considera que es util en la realizaci6n de los metodos de la invenci6n como se describe en este documento.

El Dominio Conservado (CD) de la SEQ lD NO: 2, tal como la representada por la SEQ lD NO: 36, fue identificado despues de la alineaci6n de multiples secuencia de los polipeptidos AHL19/20 de la Tabla A. En una segunda etapa, se seleccionaron los CD de los polipeptidos AHL19/20 de la Tabla A (fuera de la secuencia del polipeptido de longitud completa) y alinearon, utilizando el algoritmo Clustal (1.83) de alineaci6n progresiva, utilizando valores predeterminados. Se pueden identificar una cantidad de caracteristicas, y estan marcadas en la Figura 4. Desde el extremo del terminal N hasta el extremo del terminal C de los polipeptidos, estos son: (i) una sefal de localizaci6n nuclear predicha (NLS) , (ii) un motivo de enlazamiento de ADN AT-hook, con el tripeptido nuclear GRP, y (iii) un dominio de PPC (DUF 296) .

Ejemplo 3: Calculo del porcentaje global de identidad entre secuencias de polipeptidos utiles en la realizaci6n de los metodos de la invenci6n

Se determinaron los porcentajes globales de similitud e identidad entre secuencias de polipeptidos de longitud completa utiles para llevar a cabo los metodos de la invenci6n utilizando uno de los metodos disponibles en el arte, el software MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: una aplicaci6n que genera matrices de similitud/identidad utilizando secuencias de proteina o de ADN. Campanella J. J., Bitincka L, Smalley J; software administrado por Ledion Bitincka). El software MatGAT genera matrices de similitud/identidad para secuencias de ADN o de proteina sin necesidad de una alineaci6n previa para los datos. El programa realiza una serie de alineaciones de pares utilizando el algoritmo de alineaci6n global de Myers y Miller (con una penalizaci6n por apertura de brecha de 12, y una penalizaci6n por extensi6n de brecha de 2), calcula la similitud y la identidad utilizando por ejemplo Blosum 62 (para polipeptidos), y luego coloca los resultados en una matriz de distancia. La similitud de secuencia se muestra en la mitad inferior de la linea divisoria y la identidad de la secuencia se muestra en la mitad superior de la linea divisoria en diagonal.

Los parametros utilizados en la comparaci6n fueron:

Matriz de puntuaci6n: Blosum62

Primera brecha: 12

Extensi6n de la brecha: 2 Tambien se pueden generar una tabla de MATGAT para alineaci6n local de un dominio especifico, o datos sobre en % de identidad / similitud entre dominios especificos.

Los resultados del analisis del software se muestran en la Tabla B para la similitud e identidad global sobre la longitud completa de las secuencias de polipeptidos (excluyendo las secuencias parciales de polipeptidos). El 5 porcentaje de identidad se presenta encima de la diagonal y el porcentaje de similitud se presenta debajo de la diagonal.

El porcentaje de identidad entre las secuencias de polipeptidos utiles en la realizaci6n de los metodos de la invenci6n puede ser tan bajo como un 52% de identidad de aminoacidos comparado con la SEQ lD NO: 2.

Tabla B: Resultados de MatGAT para la similitud e identidad globales sobre la longitud completa de las secuencias 10 de polipeptidos.

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

1. Aqufo AHL19 20: 63 64 61 61 60 73 66 71 59 61 66 70 63 73 71 58

2. Arath AHL19: 72 56 94 94 56 59 61 59 48 55 61 63 97 61 57 52

3. Arath AHL20: 76 70 54 54 56 63 63 61 54 58 59 61 57 61 63 54

4. Brana AHL19 20: 70 96 67 100 56 59 61 58 49 55 60 61 94 60 56 52

5. Brara AHL19 20: 70 96 67 100 56 59 61 58 49 55 60 61 94 60 56 52

6. Glyma AHL19 20: 75 68 73 68 68 60 64 59 52 58 66 63 58 67 59 55

7. Goshi AHL19 20: 82 69 75 67 67 77 64 70 61 66 64 67 59 71 79 61

8. Lacsa AHL19 20: 79 72 77 72 72 81 80 63 56 59 69 73 61 72 64 56

9. Lotja AHL19 20: 82 72 75 71 71 74 80 77 59 61 63 69 58 71 72 62

10. Orysa AHL19 20: 67 58 65 58 58 65 68 69 66 66 52 55 48 56 62 70

11.Orysa AHL19 20\ll: 71 64 69 63 63 73 76 73 72 70 59 60 56 60 66 67

12. Poptr AHL19 20: 81 71 73 71 71 80 80 81 80 64 74 72 61 75 62 54

13. Soltu AHL19 20: 82 75 76 75 75 79 77 81 80 61 70 87 63 78 66 58

14. Thlca AHL19 20: 73 98 69 95 95 70 68 72 73 58 66 72 75 61 58 52

15. Vitvi AHL19 20: 85 72 74 71 71 81 79 82 82 65 70 85 90 71 69 57

16. Vitvi AHL19 20 ll: 80 66 74 66 66 73 84 78 79 70 76 75 76 66 78 63

Se puede aumentar considerablemente el porcentaje de identidad si el calculo de identidad se lleva a cabo entre el Dominio Conservado (CD) de la SEQ lD NO: 2 (como el representado por la SEQ lD NO: 36) y los CD de los polipeptidos utiles en la realizaci6n de la invenci6n. Un CD comprende un motivo de enlazamiento de ADN AT-hook

15 (tal como el representado por la SEQ lD NO: 37 para la SEQ lD NO: 2) y un dominio de PPC (como el representado por la SEQ lD NO: 38 para la SEQ lD NO: 2). El porcentaje de identidad sobre los CD entre las secuencias de polipeptidos utiles en la realizaci6n de los metodos de la invenci6n oscila entre 75% y 99% de identidad de aminoacidos, como se muestra en la Tabla B1. Esto es significativamente mas alto que el porcentaje de identidad de aminoacidos calculado entre las secuencias de polipeptidos AHL19/20 de longitud completa.

20 Tabla B1: Resultados de MatGAT para similitud e identidad globales sobre el dominio de los CD entre las secuencias de polipeptidos

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

1. CD Aqufo AHL19 20: 81 81 80 80 77 92 83 87 86 87 81 84 81 84 92 86

2. CD Arath AHL19: 91 78 98 98 75 82 77 78 76 80 78 80 99 81 81 77

3. CD Arath AHL20: 93 88 77 77 73 84 80 79 77 81 76 79 78 79 82 78

4. CD Brana AHL19 20: 91 99 88 100 75 82 77 78 76 79 78 79 98 80 80 78

5. CD Brara AHL19 20: 91 99 88 100 75 82 77 78 76 79 78 79 98 80 80 78

6. CD Glyma AHL19 20: 92 88 89 88 88 80 78 80 74 79 81 78 75 82 80 78

7. CD Goshi AHL19 20: 98 91 93 91 91 93 86 92 87 89 85 88 82 90 94 88

8. CD Lacsa AHL19 20: 96 90 92 90 90 92 96 81 78 83 86 87 77 88 83 78

(continuaci6n)

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

9. CD Lotja AHL19 20: 96 90 93 90 90 94 98 95 86 86 81 86 78 86 94 89

10. CD Orysa AHL19 20: 94 87 89 87 87 89 92 92 93 89 78 84 76 81 86 95

11. CD Orysa AHL19 20/ll: 94 88 89 88 88 93 95 93 96 95 81 87 80 86 89 90

12. CD Poptr AHL19 20: 96 88 91 88 88 93 97 95 96 92 93 86 78 87 84 78

13. CD Soltu AHL19 20: 94 89 91 89 89 93 96 95 96 90 93 96 80 90 89 83

14. CD Thlca AHL19 20: 91 100 88 99 99 88 91 90 90 87 88 89 89 81 81 77

15.CD Vitvi AHL19 20: 94 90 91 90 90 94 96 96 96 90 93 95 96 90 88 81

16. CD Vitvi AHL19 20\ll: 96 90 92 90 90 93 98 94 99 92 95 95 95 90 95 87

17. CD Zeama AHL19 20: 94 88 90 88 88 91 94 93 95 96 96 92 90 88 90 93

Ejemplo 4: ldentificaci6n de dominios comprendidos en las secuencias de polipeptidos utiles en la realizaci6n de los 5 metodos de la invenci6n.

La base de datos de Recursos lntegrados de Familias de Proteinas, Dominios y Sitios (lnterPro) es una interfaz integrada para las bases de datos de firma comunmente utilizadas para busquedas con base en textos y secuencias. La base de datos lnterPro combina estas bases de datos, que utilizan diferentes metodologias y diferentes grados de informaci6n biol6gica sobre proteinas bien caracterizadas para derivar firmas de proteina. Las bases de datos

10 colaboradoras incluyen S(lSS-PROT, PROSlTE, TrEMBL, PRlNTS, Panther, ProDom y Pfam, Smart y TlGRFAMs. lnterPro se encuentra alojada en el European Bioinformatics lnstitute en el Reino Unido.

Los resultados del barrido con lnterPro de la secuencia de polipeptidos representadas por la SEQ lD NO: 2 se presentan en la Tabla C.

Tabla C: Resultados del barrido con lnterPro de la secuencia de polipeptidos como la representada por la SEQ lD 15 NO: 2

Nombre y�nmmero de�acceso del InterPro: Nombre �en la base�de �datos integrada Nmmero�de acceso en�la�base de�datos integrada Nombre �de acceso en�la�base de�datos integrada Coordenadas �del aminoacido en�l� SEQ �ID�NO: 2

lPR005175 Dominio: Proteina de funci6n desconocida DUF296: PFAM PF03479 DUF 296 107 - 232

lnterPro lPR014476 Familia: Motivo de enlazamiento predicho de ADN AT-hook: PlR PlRSF016021 ESCAROLA 1 - 315

Ejemplo 5: Predicci6n de la localizaci6n subcelular de las secuencias de polipeptidos utiles para llevar a cabo los metodos de la invenci6n

TargetP 1.1 predice la localizaci6n subcelular de las proteinas eucariotas. La asignaci6n de ubicaci6n se basa en la

presencia predicha de cualquiera de las secuencias previas del terminal N: peptido de transito al cloroplasto (cTP), peptido mitocondrial objetivo (mTP) o peptido sefal de la ruta secretora (SP). Los puntajes en los que se basa la predicci6n final no son realmente probabilidades, y no necesariamente se afaden a uno. Sin embargo, la ubicaci6n con el puntaje mas alto es la mas probable de acuerdo con TargetP, y la relaci6n entre los puntajes (la clase de confiabilidad) puede ser una indicaci6n de que tan cierta es la predicci6n. La clase de confiabilidad (RC) varia de 1 a 5, donde 1 indica la predicci6n mas fuerte. TargetP es mantiene en el servidor de la Universidad Tecnica de Dinamarca.

Para las secuencias que se predice que contienen una secuencia previa en el terminal N se puede predecir tambien un sitio de escisi6n potencial.

Se seleccionaron una cantidad de parametros, tales como el grupo del organismo (vegetal o no vegetal), conjuntos de puntos de corte (ninguno, conjuntos de puntos de corte predefinidos, o conjunto de puntos de corte especificados por el usuario), y el calculo de la predicci6n de los sitios de escisi6n (si o no).

Los resultados del analisis con TargetP 1.1 de la secuencia polipeptidica como la representada por la SEQ lD NO: 2 se presentan en la Tabla D7. El grupo del organismo "planta" ha sido seleccionado, y no se definieron puntos de corte. La localizaci6n subcelular predicha de la secuencia polipeptidica como la representada por la SEQ lD NO: 2 no es del cloroplasto, no es mitocondrial y no es la ruta secretora, sino mas probablemente del nucleo.

Una sefal de localizaci6n nuclear prevista (NLS) se encuentra (por medio de la alineaci6n de secuencias multiples, seguida por inspecci6n ocular, por ejemplo) en el polipeptido AHL19/20 de la SEQ lD NO: 2. Una NLS es una o mas secuencias cortas lisinas o argininas positivamente cargadas. Se predice que la SEQ lD NO: 2 de la presente invenci6n se localiza en el compartimento nuclear de las celulas eucariotas.

Tabla D. Analisis con TargetP 1.1 de la secuencia de polipeptidos como la representada por la SEQ lD NO: 2

Longitud (AA): 315

Peptido de transito en el cloroplasto: 0.100

Peptido de transito mitocondrial: 0.278

Peptido sefal de la ruta secretora: 0.033

Otro objetivo subcelular: 0.703

Ubicaci6n predicha: Otra

Clase de confiabilidad: 3

Los resultados del analisis con TargetP 1.1 de la secuencia de polipeptido como la representada por la SEQ lD NO: 51 se presentan a continuaci6n.

Predicci6n de TargetP: mitocondrial (0,837, calidad 2)

Se pueden utilizar muchos algoritmos para llevar a cabo los analisis de predicci6n de la ubicaci6n subcelular, incluyendo:

•: ChloroP 1.1 alojado en el servidor de la Universidad Tecnica de Dinamarca;

•: Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor versi6n 1.2 alojado en el servidor del lnstitute de Biociencia Molecular, Universidad de Queensland, Brisbane, Australia;

•: PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5 alojado en el servidor de la Universidad de Alberta, Edmonton, Alberta, Canada;

•: TMHMM, alojado en el servidor de la Universidad Tecnica de Dinamarca;

Ejemplo 6: Clonaci6n de una secuencia de acido nucleico de la invenci6n.

A menos que se establezca otra cosa, se llevan a cabo tecnicas de ADN recombinante de acuerdo con protocolos estandar que se describen en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3° edici6n Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva Iork) o en los Volumenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales y metodos estandar para trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R. D. D. Croy, publicado por BlOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU).

Se amplific6 el ADNc de Arabidopsis thaliana que codifica el polipeptido AHL 19/20 por medio de PCR utilizando como molde un banco de ADNc de Arabidopsis sintetizado a partir del ARNm extraido de tejidos mezclados de plantas. Se utilizaron el cebador prm8135 (SEQ lD NO: 41, sentido: 5'

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcgaatccatggtg-3') y el cebador prm08136 SEQ lD NO: 42; inverso, complementario: 5' -ggggaccactttgtacaagaaagctgggttaaaaaccattttaacgcacg -3'), que incluyen los sitios AttB para recombinaci6n Gateway, para amplificaci6n por PCR. Se llev6 a cabo la PCR utilizando Taq ADN polimerasa Hifi en condiciones estandar. Se amplific6 y purific6 tambien un fragmento PCR de la longitud esperada (incluyendo sitos attB), empleando metodos estandar. Luego se llev6 a cabo la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacci6n BP, durante la cual el fragmento de la PCR recombinado in vivo con el plasmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminologia Gateway, un "clon de entrada". Se adquiri6 el plasmido pDONR201 a traves de lnvitrogen, como parte de la tecnologia Gateway®.

Ejemplo 7: Construcci6n del vector de expresi6n utilizando una secuencia de acido nucleico como la divulgada

El clon de entrada que comprende la SEQ lD NO: 1 se utiliz6 posteriormente en una reacci6n LR con un vector de destinaci6n usado para la transformaci6n de Oryza sativa. Este vector contenia como elementos funcionales dentro de los bordes del ADN-T: un marcador seleccionable de una planta; un casete de expresi6n de un marcador cribable; y un casete Gateway destinado a la recombinaci6n in vivo de LR con la secuencia de acido nucleico de interes ya clonada en el clon de entrada. Se localiz6 un promotor GOS2 de arroz (SEQ lD NO: 35) para expresi6n constitutiva secuencia arriba de este casete Gateway.

Despues de la etapa de recombinaci6n de LR, se transform6 el vector de expresi6n resultante pGOS2::de AHL 19/20 y (Figura 5) en una cepa LBA4044 de Agrobacterium, de acuerdo con los metodos bien conocidos en el arte.

Ejemplo 8: Transformaci6n de plantas

Transformaci6n de arroz

Se utiliz6 Agrobacterium que contiene los vectores de expresi6n en forma independiente para transformar plantas de Oryza sativa. Se descascarillaron semillas secas maduras de la variedad de cultivo Jap6nica de arroz Nipponbare. Se realiz6 la esterilizaci6n incubando durante un minuto en etanol al 70%, seguido por 30 minutos en HgCl2 al 0,2%, seguido de 6 lavados durante 15 minutos con agua destilada esteril. Las semillas esteriles fueron luego germinadas en un medio que contenia 2,4-D (medio de inducci6n de callos). Despues de la incubaci6n en la oscuridad durante cuatro semanas, se cortaron y propagaron los callos embriogenicos derivados de escutelo sobre el mismo medio. Al cabo de dos semanas, los callos se multiplicaron o propagaron mediante un subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas, se multiplicaron o propagaron los callos por medio de subcultivo sobre el mismo medio durante otras dos semanas. Se subcultivaron piezas de callo sobre medio fresco 3 dias antes del cocultivo (para reforzar la actividad de la divisi6n celular).

Se utiliz6 la cepa LBA4404 de Agrobacterium que contenia cada vector de expresi6n individual en forma independiente para el cocultivo. Se inocul6 Agrobacterium sobre medio AB con los antibi6ticos apropiados y se cultiv6 durante 3 dias a 28°C. Se recolectaron luego las bacterias y se suspendieron en un medio de cocultivo liquido hasta una densidad (OD600) de aproximadamente 1. Se transfiri6 luego la suspensi6n a una placa de Petri y se sumergieron los callos en la suspensi6n durante 15 minutos. Los tejidos de los callos fueron transferidos secos sobre un papel de filtro y transferidos a un medio de cocultivo solidificado e incubados durante 3 dias en la oscuridad a 25°C. Los callos cocultivados crecieron en un medio que contenia 2,4-D durante 4 semanas en la oscuridad a 28°C en presencia de un agente de selecci6n. Durante este periodo, se desarrollaron rapidamente islas de callos resistentes. Luego de transferir este material a un medio de regeneraci6n e incubarlo a la luz, se liber6 el potencial embriogenico y se desarrollaron brotes en las pr6ximas cuatro a cinco semanas. Se cortaron los brotes de los callos y se incubaron durante 2 a 3 semanas en un medio que contenia auxina, desde el cual fueron transferidos al suelo. Se cultivaron los brotes encallecidos bajo humedad alta y dias cortos en un invernadero.

Se generaron aproximadamente 35 transformantes independientes de arroz T0 para cada construcci6n. Los transformantes primarios se transfirieron desde una camara de cultivo de tejido a un invernadero. Luego de un analisis por PCR cuantitativo para verificar la cantidad de copias del inserto de ADN-T, se conservaron unicamente copias simples de plantas transgenicas que exhibieron tolerancia al agente de selecci6n para la cosecha de semillas T1. Luego se cosecharon las semillas tres a cinco meses despues de ser trasplantadas. El metodo produjo transformantes de un solo locus en una proporci6n superior al 50 % (Aldemita y Hodges1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).

Ejemplo 9: Procedimiento de evaluaci6n fenotipica

10.1 Disposici6n para la evaluaci6n

Se generaron aproximadamente 35 nuevos transformantes independientes de arroz T0. Se transfirieron los transformantes primarios desde una camara de cultivo de tejidos hasta un invernadero para crecimiento y cosecha de semilla T1. Se retuvieron seis eventos, de los cuales la progenie T1 segreg6 3:1 por la presencia /ausencia del transgen. Para cada uno de estos eventos se seleccionaron aproximadamente 10 plantas de semillero T1 que contenian el transgen (hetero y homocigotos) y aproximadamente 10 plantas de semillero T1 que carecian del transgen (nulicigotos) y por medio de control visual de expresi6n del marcador. Las plantas transgenicas y los correspondiente nulicigotos se cultivaron uno al lado del otro en posiciones aleatorias. Las condiciones del invernadero fueron de dias cortos (12 horas de luz), 28°C en la luz y 22°C en la oscuridad, y una humedad relativa del 70%.

Desde la etapa de siembra hasta la etapa de maduraci6n, se pasaron varias veces las plantas a traves de una cabina de formaci6n de imagenes digitales. En cada instante de tiempo se tomaron imagenes digitales (2048 x 1536 pixeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 angulos diferentes.

Cribado de la disponibilidad reducida de nutriente (nitr6geno)

Las plantas de seis eventos (semillas T2) fueron cultivadas en tierra para macetas en condiciones normales excepto por la soluci6n de los nutrientes. Las macetas se regaron desde el trasplante hasta la maduraci6n con una soluci6n nutriente especifica que tenia un contenido reducido de nitr6geno (N), por lo general entre 7 a 8 veces menos. El resto del cultivo (maduraci6n de la planta, la cosecha de semillas) fue el mismo que para las plantas no cultivadas bajo estres abi6tico. Los parametros de crecimiento y el rendimiento se registraron como se detalla para el crecimiento en condiciones normales.

10.2 Analisis estadistico: prueba F

Se utiliz6 un ANOVA de dos factores (analisis de variantes) como un modelo estadistico para la evaluaci6n general de las caracteristicas fenotipicas de las plantas. Se realiz6 una prueba F sobre todos los parametros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen de la presente invenci6n. Se realiz6 la prueba F para controlar el efecto del gen sobre todos los eventos de transformaci6n y para verificar el efecto total del gen, tambien conocido como efecto global del gen. El umbral de significaci6n para un efecto global verdadero del gen se fij6 en un nivel de probabilidad del 5% para la prueba F. Un valor significativo de la prueba F indica un efecto del gen, lo que significa que no es s6lo la mera presencia o la posici6n del gen lo que esta causando las diferencias en el fenotipo.

Cuatro eventos T1 fueron evaluados en la generaci6n T2 siguiendo el mismo procedimiento de evaluaci6n que para la generaci6n T1 pero con mas individuos por evento.

Cuando se llevaron a cabo dos experimentos con eventos de solapamiento, se realiz6 un analisis combinado. Es util comprobar la consistencia de los efectos sobre los dos experimentos, y si este es el caso, acumular evidencia a partir ambos experimentos con el fin de aumentar la confianza en la conclusi6n. El metodo utilizado es un enfoque de modelo mixto que tiene en cuenta la estructura multinivel de los datos (es decir, experimento -evento segregantes). Los valores de p fueron obtenidos por comparaci6n de la prueba de tasa de probabilidad con las distribuciones de chi cuadrado.

10.3 Parametros medidos

Medici6n de parametros relacionados con la biomasa

Desde la etapa de siembra hasta la etapa de maduraci6n, se pasaron las plantas varias veces a traves de una cabina de formaci6n de imagenes digitales. En cada instante de tiempo se tomaron imagenes digitales (2048 x 1536 pixeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 angulos diferentes.

Se determin6 el area de la planta sobre el suelo (o biomasa foliar) contando el numero total de pixeles en la imagenes digitales de partes de la planta aereas discriminadas desde el fondo. Se promedi6 este valor para las fotos tomada en el mismo instante de tiempo desde los diferentes angulos y fue convertido a un valor de superficie fisica expresado en mm cuadrados por calibraci6n. Los experimentos muestran que el area de la planta sobre el suelo medida de esta manera se correlaciona con la biomasa de las partes de la planta aereas. El area por encima del suelo es el area medida en el instante de tiempo en el que la planta habia alcanzado su biomasa foliar maxima. El vigor temprano es el area por encima del suelo de la planta (planta de semillero) tres semanas despues de la

germinaci6n. El aumento de la biomasa de la raiz se expresa como un aumento en la biomasa total de la raiz (medida como biomasa maxima de las raices observada durante la vida util de una planta); o como un aumento en el indice raiz / brote (medido como la relaci6n entre los masa de la raiz y la masa de los brotes en el periodo de crecimiento activo de las raices y los brotes).

El vigor inicial se determin6 contando el numero total de pixeles de partes de la planta sobre el suelo discriminadas del fondo. Este valor fue el promedio de las fotografias tomadas en el mismo instante desde diferentes angulos y se convirti6 en un valor de superficie fisica expresado en milimetros cuadrados por medio de calibraci6n. Los resultados relativos al vigor inicial descritos a continuaci6n son para plantas tres semanas despues de la germinaci6n.

Mediciones de parametros relacionados con la semilla

Se cosecharon las paniculas primarias maduras, se contaron, se empacaron en bolsas, se etiquetaron con un c6digo de barras y luego se secaron durante tres dias en un horno a 37° C. Se trillaron luego las paniculas, y se recogieron y contaron todas las semillas. Se separaron las vainas llenas de las vacias utilizando un dispositivo de soplado de aire. Las vainas vacias se descartaron y la fracci6n restante se cont6 de nuevo. Las vainas llenas se pesaron en una balanza analitica. El numero de semillas llenas se determin6 contando el numero de vainas llenas que qued6 despues de la etapa de separaci6n. El peso total de semillas por planta se midi6 pesando todas las vainas llenas cosechadas de una planta. Se midi6 la cantidad total de semillas por planta contando el numero de vainas cosechadas de una planta. Se extrapol6 el Peso de Mil Granos (PMG) a partir del numero de semillas llenas contadas y su peso total. El indice de Cosecha (lC) en la presente invenci6n se define como la relaci6n entre el peso total de semillas por planta y el area por encima del suelo (mm2), multiplicado por un factor de 106. El numero total de flores por panicula tal como se define en la presente invenci6n es la relaci6n entre el numero total de semillas y el numero de paniculas primarias maduras. La tasa de llenado de semilla tal como se define en la presente invenci6n es la proporci6n (expresada como %) del numero de semillas llenas sobre el numero total de semillas (o floretes).

Ejemplo 10: Resultados de la evaluaci6n fenotipica de las plantas de arroz transgenicas bajo condiciones de crecimiento normales

Los resultados de la evaluaci6n de plantas de arroz transgenicas que expresan la secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20 como el representado por la SEQ lD NO: 2, bajo el control del promotor GOS2 para expresi6n constitutiva, y cultivadas bajo condiciones normales de crecimiento, se presentan a continuaci6n.

Hubo un incremento significativo en el numero de floretes por panicula, en el rendimiento total de semillas por planta, en el numero de semillas llenas, y en el indice de cosecha de las plantas transgenicas comparado con los correspondientes nulicigotos (controles), como se muestra en la Tabla E.

Tabla E: Resultados de la evaluaci6n de las plantas de arroz transgenico que expresan la secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20 como el representado por la SEQ lD NO: 2, bajo el control del promotor GOS2 para expresi6n constitutiva, bajo condiciones de crecimiento normales.

Caracteristica: lncremento promedio en % en 6 eventos en la generaci6n T1

Numero de flores por panicula: 14%

Rendimiento total de semillas por planta: 17%

Numero total de semillas llenas: 17%

indice d cosecha: 17%

Ejemplo 11: Resultados de la evaluaci6n fenotipica de las plantas de arroz transgenicas bajo condiciones de crecimiento con disponibilidad reducida de nutrientes (nitr6geno)

Los resultados de la evaluaci6n de plantas de arroz transgenicas que expresan la secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20 como el representado por la SEQ lD NO: 2, bajo el control del promotor GOS2 para expresi6n constitutiva, y cultivadas bajo condiciones de crecimiento con disponibilidad reducida de nutrientes (nitr6geno), se presentan a continuaci6n.

Hubo un incremento significativo en el rendimiento total de semillas por planta, en el numero de semillas llenas, y en el indice de cosecha de las plantas transgenicas comparado con los correspondientes nulicigotos (controles), como se muestra en la Tabla F.

Tabla F: Resultados de la evaluaci6n de las plantas de arroz transgenico que expresan la secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20 como el representado por la SEQ lD NO: 2, bajo el control del promotor GOS2 para expresi6n constitutiva, bajo condiciones de crecimiento con disponibilidad reducida de nutrientes (nitr6geno).

Caracteristica: lncremento promedio en % en 2 eventos en la generaci6n T1

Vigor temprano: 18%

Rendimiento total de semillas por planta: 26%

Numero total de semillas llenas: 27%

Numero total de semillas: 24%

Ejemplo 12: Ejemplos de transformaci6n de otros cultivos

Transformaci6n de maiz

La transformaci6n de maiz (Zea mays) se realiza con una modificaci6n del metodo que describi6 por lshida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745 -50. La transformaci6n depende del genotipo en el maiz y unicamente genotipos especificos son responsables por la transformaci6n y regeneraci6n. La linea endogamica A188 (Universidad de Minnesota) o hibridos con A188 como progenitores son buenas fuentes de material donante para transformaci6n, pero tambien pueden utilizarse otros genotipos exitosamente. Se cosecharon las mazorcas de plantas de maiz aproximadamente 11 dias despues de la polinizaci6n (DAP) cuando la longitud del embri6n inmaduro es de aproximadamente 1 a 1,2 mm. Se cocultivaron los embriones inmaduros con Agrobacterium tumefaciens que contenia el vector de expresi6n, y se recuperaron las plantas transgenicas a traves de organogenesis. Se cultivaron los embriones cortados en un medio de inducci6n de callos, luego en un medio de regeneraci6n de maiz, que contiene el agente de selecci6n (por ejemplo imidazolinona, pero pueden utilizarse diferentes marcadores de selecci6n). Las placas de Petri se incubaron a la luz a 25°C durante 2 -3 semanas, o hasta que crecieron brotes. Los brotes verdes se transfieren desde cada embri6n a un medio enraizador de maiz y se incuba a 25°C durante 2 3 semanas, hasta que brotan raices. Los brotes con raices se trasplantan a suelo en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de las plantas que exhiben tolerancia al agente de selecci6n y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformaci6n de trigo

La transformaci6n de trigo se realiza con el metodo descrito por lshida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745 -50. La variedad cultivada Bobwhite (disponible a traves de ClMMIT, Mejico) es comunmente utilizada en la transformaci6n. Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens que contienen el vector de expresi6n, y se recuperan las plantas transgenicas a traves de organogenesis. Despues de incubaci6n con Agrobacterium, se cultivan los embriones in vitro en un medio de inducci6n de callos, luego en un medio de regeneraci6n que contiene el agente de selecci6n (por ejemplo imidazolinona, pero pueden utilizarse diferentes marcadores de selecci6n). Las placas de Petri se incuban a la luz a 25°C durante 2 -3 semanas, o hasta que se desarrollaron brotes. Los brotes verdes se transfieren de cada embri6n al medio enraizador y se incuban a 25°C durante 2 - 3 semanas, hasta que brotaron raices. Los brotes con raices se trasplantan a suelo en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de las plantas que exhiben tolerancia al agente de selecci6n y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformaci6n de soja

La soja se transforma de acuerdo con una modificaci6n del metodo que se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5.164.310 de Texas A&M. Diferentes variedades comerciales de soja son adecuadas para la transformaci6n mediante este metodo. La variedad cultivada Jack (disponible a traves de la fundaci6n de Semillas de lllinois) es comunmente utilizada para la transformaci6n. Las semillas de soja se esterilizan para el sembrado in vitro. Se cortan el hipocotilo, la radicula y un cotiled6n de plantulas j6venes de 7 dias. Se cultivan luego el epicotilo y el cotiled6n restante hasta desarrollar nodos axiales. Estos nodos axiales se cortan y se incuban con Agrobacterium tumefaciens que contenian el vector de expresi6n. Despues del tratamiento de cocultivo, se lavaron los explantes y se los transfiri6 a un medio de selecci6n. Los brotes regenerados se cortan y se colocan en un medio para alargamiento del brote. Los brotes no mayores a 1 cm se colocan en un medio de enraizamiento hasta desarrollar raices. Los brotes con raices se trasplantan a suelo en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de las plantas que exhiben tolerancia al agente de selecci6n y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformaci6n de colza / canola

Se usaron peciolos e hipocotilos de cotiledones de una plantula joven de 5 - 6 dias como explantes para el cultivo de tejidos, y se transformaron de acuerdo con Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183 -188). La variedad cultivada

comercial (estar (Agriculture Canada) es la variedad estandar usada para la transformaci6n, pero tambien pueden usarse otras variedades. Las semillas de canola se esterilizan en la superficie para la siembra in vitro. Se cortan los explantes de peciolo de cotiled6n con el cotiled6n unido a partir de las plantulas in vitro, y se inoculan con Agrobacterium (que contienen el vector de expresi6n) sumergiendo el extremo cortado del explante del peciolo en la suspensi6n bacteriana. Se cultivan luego los explantes durante 2 dias sobre medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, 3% de sacarosa, 0,7% de Phytagar a 23°C, con 16 h de luz. Despues de dos dias de cocultivo con Agrobacterium, los explantes de peciolos se transfieren a un medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, cefotaxima, carbenicilina o Timentina (300 mg/l) durante 7 dias, y luego se cultivaron sobre medio MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o Timentina y un agente de selecci6n hasta la regeneraci6n de los brotes. Cuando los brotes tienen 5 -10 mm de longitud, se cortan y se transfieren al medio para alargamiento de los brotes (MSBAP0,5, que contiene 0,5 mg/l de BAP). Se transfieren los brotes de aproximadamente 2 cm de longitud al medio de enraizado (MS0) para la inducci6n de la raiz. Los brotes con raices se trasplantan a suelo en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de las plantas que exhiben tolerancia al agente de selecci6n y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformaci6n de alfalfa

Se transforma un clon de regeneraci6n de alfalfa (Medicago sativa) utilizando el metodo de (McKersie el al., 1999 Plant Physiol 119: 839 -847). La regeneraci6n y transformaci6n de alfalfa depende del genotipo y por lo tanto se requiere una planta regeneradora. Ia se han descrito metodos para obtener plantas que se regeneran. Por ejemplo, estas pueden seleccionarse de la variedad cultivada Rangelander (Agriculture Canada) o de cualquier otra variedad comercial de alfalfa como lo describe Brown D. C. (. y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111 112). Alternativamente, se ha seleccionado la variedad RA3 (Universidad de (isconsin) para ser usada en el cultivo de tejidos ((alker et al., 1978 Am J Bot 65: 654 -659). Los explantes de peciolos se cocultivan con un cultivo de C58C1 pMP9O de Agrobacterium tumefaciens durante la noche (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839 -847)

o LBA4404 que contiene el vector de expresi6n. Los explantes se cocultivan durante 3 dias en la oscuridad en un medio de inducci6n SH que contiene 288 mg/L de Pro, 53 mg/L de tioprolina, 4,35 g/L de K2SO4, y 100 !m de acetosiringinona. Los explantes se lavan en un medio de Murashige-Skoog de fuerza media (Murashige y Skoog, 1962) y se siembran en placa sobre el mismo medio de inducci6n SH sin acetosiringinona, pero con un agente de selecci6n adecuado y un antibi6tico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Despues de varias semanas, se transfieren los embriones somaticos a un medio de desarrollo BOi2I que no contiene reguladores de crecimiento ni antibi6ticos, y con 50 g/L de sacarosa. Luego se germinan los embriones somaticos en un medio de Murashige-Skoog de fuerza media. Las plantulas enraizadas se trasplantaron a macetas y se desarrollaron en un invernadero. Se producen semillas T1 a partir de las plantas que exhiben tolerancia al agente de selecci6n y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformaci6n de algod6n

La transformaci6n del algod6n (Gossypium hirsutum L.) se lleva a cabo utilizando Agrobacterium tumefaciens, sobre explantes de hipocotilos. Las variedades de cultivo comerciales tales como Coker 130 o Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX) son variedades estandares utilizadas para la transformaci6n, pero tambien se pueden utilizar otras variedades. Las semillas se esterilizan en la superficie y se germinan en la oscuridad. Los explantes de hipocotilos se cortan de las plantulas germinadas hasta longitudes de aproximadamente 1 -1,5 centimetros. El explante de hipocotilo se sumerge en el in6culo de Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresi6n, durante 5 minutos y luego se cocultivan durante 48 horas sobre MS + 1,8 mg/l de KNO3 + 2% de glucosa a 24° C, en la oscuridad. Los explantes se transfieren al mismo medio que contiene los marcadores seleccionables apropiados bacterianas y vegetales (renovados varias veces), hasta que se observan callos embriogenicos. Los callos se separan y se subcultivan hasta que aparecen embriones somaticos. Las plantulas derivadas de los embriones somaticos se maduran sobre el medio de enraizamiento hasta que se desarrollan las raices. Los brotes con raiz se trasplantan a suelo en macetas en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de las plantas que exhiben tolerancia al agente de selecci6n y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Ejemplo 13: Ejemplos de cribas de estres abi6tico

Criba por sequia

Se cultivan plantas de un numero seleccionado de eventos en tierra para macetas bajo condiciones normales hasta que se acercan a la etapa de retiro de las mismas. A continuaci6n, se transfieren a una secci6n "seca", donde se suprime el riego. Se insertan sondas de humedad en macetas elegidas al azar para controlar el contenido de agua del suelo (CAS). Cuando el CAS va por debajo de ciertos umbrales, se riega nuevamente las plantas en forma automatica y continua hasta que se vuelva a alcanzar un nivel normal. Las plantas son entonces transferidas de nuevo a condiciones normales. El resto del cultivo (maduraci6n de la planta, cosecha de semillas) es el mismo que para las plantas no cultivadas bajo condiciones de estres abi6tico. Los parametros de crecimiento y rendimiento se registran como se detalla para el crecimiento bajo condiciones normales.

Criba por estres salino

Las plantas se cultivan en un sustrato elaborado a base de fibras de coco y Argex (relaci6n 3 a 1). Se utiliza una soluci6n nutriente normal durante las dos primeras semanas despues del trasplante de las plantulas en el invernadero. Despues de las dos primeras semanas, se afade sal 25 mM (NaCl) a la soluci6n nutriente, hasta que

5 se cosechan las plantas. Los parametros de crecimiento y rendimiento se registran como se detalla para el crecimiento bajo condiciones normales.

Ejemplo 14: Cribas por estres abi6tico

Cribado de eficiencia con uso de nitr6geno

Se cultivan plantas de arroz de generaciones T1, T2 o posteriores en tierra para macetas bajo condiciones normales

10 excepto para la soluci6n nutriente. Las macetas se riegan desde el trasplante hasta la maduraci6n con una soluci6n nutriente especifica que tiene un contenido reducido de nitr6geno (N), usualmente entre 7 a 8 veces menos. El resto del cultivo (maduraci6n de la planta, cosecha de semillas) es el mismo que para las plantas no cultivadas bajo estres abi6tico. Los parametros de crecimiento y rendimiento se registran como se detalla para el cultivo bajo condiciones normales.

15 LlSTADO DE SECUENClAS

<110> BASF Plant Science GmbH

<120> Plantas que tienen un aumento de caracteristicas relacionadas con el rendimiento y un metodo para elaboraci6n de las mismas

<130> PF59353 20 <160> 59

<170> Patentln versi6n 3.3

<210> 1

<211> 948

<212> ADN 25 <213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

<210> 2

<211> 315

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

10 <210> 3

<211> 846

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 3

<210> 4

<211> 281

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

<210> 5

<211> 867

<212> ADN

<213> Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens

<400> 5 <210> 6

<211> 288

<212> PRT

<213> Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens

<400> 6

<210> 7

<211> 948

<212> ADN

<213> Brassica napus

<400> 7

<210> 8

<211> 315

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 8

<210> 9

<211> 978

<212> ADN

<213> Brassica rapa

<400> 9

<210> 10

<211> 315

<212> PRT

<213> Brassica rapa

<400> 10

<210> 11

<211> 843

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 11

<210> 12

<211> 280

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 12

<210> 13

<211> 834

5 <212> ADN

<213> Gossypium hirsutum

<400> 13

<210> 14

<211> 277

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

15 <400> 14

<210> 15

<211> 813

<212> ADN

<213> Lactuca sativa

<400> 15

<210> 16

<211> 270

<212> PRT

<213> Lactuca sativa

<400> 16

<210> 17

<211> 882

<212> ADN

<213> Lotus japonicus

<400> 17

<210> 18

<211> 293

<212> PRT

<213> Lotus japonicus

<400> 18

<210> 19

<211> 708

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 19

<210> 20

<211> 235

<212> PRT

<213> Oryza sativa

15 <400> 20

<210> 21

<211> 801

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 21

<210> 22

<211> 266

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 22

<210> 23

10 <211> 855

<212> ADN

<213> Populus tremuloides

<400> 23

<210> 24

<211> 284

<212> PRT

<213> Populus tremuloides

<400> 24

<210> 25

<211> 885

<212> ADN

<213> Solanum tuberosum

<400> 25

<210> 26

<211> 294

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<400> 26

<210> 27

<211> 939

<212> ADN

<213> Thlaspi caerulescens

<400> 27

<210> 28

<211> 312

<212> PRT

<213> Thlaspi caerulescens

<400> 28

<210> 29

<211> 876

<212> ADN

<213> Vitis vinifera

<400> 29

<210> 30

<211> 291

<212> PRT

<213> Vitis vinifera

<400> 30

<210> 31

<211> 783

<212> ADN

<213> Vitis vinifera

<400> 31

10 <210> 32

<211> 260

<212> PRT

<213> Vitis vinifera

<400> 32 <210> 33

<211> 810

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 33 <210> 34

<211> 269

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 34

<210> 35

<211> 2194

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 35

<210> 36

<211> 173

5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio conservado comprendido en la SEQ lD NO: 2

<400> 36

<210> 37

<211> 14

5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> AT hook

<220> 10 <221> VARlANTE

<222> (8) .. (8)

<223> /reemplazo = "Ala"

<220>

<221> VARlANTE

15 <222> (11) .. (11)

<223> /reemplazo = "Arg"

<400> 37

20 <210> 38

<211> 125

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio de PPC (DUF296) comprendido en la SEQ lD NO: 2

<400> 38 <212> ADN

<210> 39

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10: <220>

<223> cebador: prm8135

<400> 39

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aaacaatggc gaatccatgg tg: 52

<210> 40

15: <211> 50

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador: prm8136

20: <400> 40

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt aaaaaccatt ttaacgcacg: 50

<210> 41

<211> 948

<213> Brassica oleracea

<400> 41

<210> 42

<211> 315

<212> PRT 10 <213> Brassica oleracea

<400> 42

<210> 43

<211> 918

<212> ADN

<213> Medicago truncatula

<400> 43

<210> 4

10 <211> 305

<212> PRT

<213> Medicago truncatula

<400> 44

<210> 45

<211> 632

5 <212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 45

<210> 46

<211> 81

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

15 <400> 46

<210> 47

<211> 2194

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 47

<210> 48

<211> 53

10 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador: prm03240

<400> 48

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgtct tgctgtggag gaa: 53

<210> 49

<211> 47

5: <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador: prm03241

<400> 49

10: ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tcacttgcag gtgcaag 47

<210> 50

<211> 1566

<212> ADN

<213> Chlamydomonas reinhardtii

15: <400> 50

<210> 51

<211> 521

<212> PRT

<213> Chlamydomonas reinhardtii

<400> 51

<210> 52

<211> 1416

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 52

<210> 53

<211> 52

5: <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador: prm08408

<400> 53

10: ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aaacaatgcg gaaggaagcg ac 52

<210> 54

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15: <220>

<223> cebador: prm08409

<400> 54

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gaattgctaa gctgttacga: 50

<210> 55

91

<211> 1453

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 55

<210> 56

<211> 483

10 <212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 56

<210> 57

<211> 2559

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 57

<210> 58

<211> 49

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador: prm001646

<400> 58

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggct gctcccagc: 49

<210> 59

<211> 46

<212> ADN

5: <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador: prm001647

<400> 59

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta attcagtcgc ggtacg: 46

10

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para incrementar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas bajo condiciones de cultivo normales, condiciones de cultivo reducidas en nitr6geno y/o condiciones de cultivo con disponibilidad reducida de nutrientes en plantas de arroz con relaci6n a las plantas que sirven como control,

que comprende incrementar la expresi6n en una planta de arroz de una secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido que incrementa el rendimiento 19/20 localizado en el nucleo con el motivo AT-hook (AHL 19/20),

en donde se logra el incremento de la expresi6n por medio de la introducci6n y expresi6n en una planta de un acido nucleico que codifica un polipeptido AHL 19/20, y

en donde dicho polipeptido AHL 19/20 comprende un dominio que tiene al menos 80% o mas identidad de secuencia de aminoacidos con un Dominio Conservado (DC) como el representado por la SEQ lS NO: 36,

y opcionalmente seleccionar plantas de arroz que tienen mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas,

dicha caracteristica relacionada con el rendimiento de semillas es una o mas de: (i) aumento del numero de flores por panicula; (ii) aumento del peso total de las semillas por planta; (iii) aumento del numero de semillas llenas; o (iv) aumento de indice de cosecha.
2.

Un metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en donde dicho polipeptido que incrementa el rendimiento tiene al menos 50% o mas identidad de secuencia de aminoacidos con el polipeptido AHL 19/20 como el representado por la SEQ lD NO: 2 o con cualquiera de las secuencias polipeptidicas suministradas en la Tabla A aqui.
3.

Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicaci6n precedente, en donde dicha mayor expresi6n se logra por una cualquiera o mas de: marcaci6n de la activaci6n de ADN-T, TlLLlNG, o recombinaci6n hom6loga.
4.

Construcci6n que comprende:

(a)

Una secuencia de acido nucleico que codifica una polipeptido que incrementa el rendimiento seleccionado del grupo que consiste de: un 19/20 localizado en el nucleo (AHL 19/20) con un motivo AT-hook como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2;

(b)

una o mas secuencias de control capaces de dirigir la expresi6n de la secuencia de acido nucleico de (a); en donde dicha secuencia de control es un promotor GOS2 de arroz; y opcionalmente;

(c)

una secuencia de terminaci6n de la transcripci6n.
5.

Una construcci6n de acuerdo con la reivindicaci6n 4, en donde la secuencia de acido nucleico esta operativamente enlazada a un promotor GOS2 de arroz como el representado por la SEQ lD NO: 35..
6.

El uso de una construcci6n que comprende:

(a)

Una secuencia de acido nucleico que codifica una polipeptido que incrementa el rendimiento seleccionado del grupo que consiste de: un 19/20 localizado en el nucleo (AHL 19/20) con un motivo AT-hook como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2;

(b)

una o mas secuencias de control capaces de dirigir la expresi6n de la secuencia de acido nucleico de (a); y opcionalmente;

(c)

una secuencia de terminaci6n de la transcripci6n

en un metodo para elaborar plantas de arroz que tienen mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas con relaci6n a plantas que sirven de control bajo condiciones de cultivo normales, condiciones de cultivo reducidas en nitr6geno y/o condiciones de cultivo con disponibilidad reducida de nutrientes, cuyas caracteristicas relacionada con el rendimiento de semillas son una o mas de: (i) aumento del numero de flores por panicula; (ii) aumento del peso total de las semillas por planta; (iii) aumento del numero de semillas llenas; o (iv) aumento de indice de cosecha.
7. Planta de arroz, parte de la planta o celula de la planta de arroz, por lo cual la planta de arroz, parte de la planta o

celula de la planta de arroz es

(i)

transformada con una construcci6n que comprende:

(a)

una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido que incrementa el rendimiento seleccionado del grupo que consiste de: un 19/20 localizado en el nucleo (AHL 19/20) con un motivo AT-hook como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en done la secuencia de acido nucleico esta

(aa) operativamente enlazada con un promotor constitutivo; o

(bb) operativamente enlazada con un promotor constitutivo de la planta; o

(cc)

operativamente enlazada con un promotor GOS2; o (dd) operativamente enlazada con un promotor GOS2 de arroz como el representado por la SEQ lD NO: 35;

(b)

una o mas secuencias de control capaces de dirigir la expresi6n de la secuencia de acido nucleico de (a); y opcionalmente;

(c)

una secuencia de terminaci6n de la transcripci6n o

(ii)

se obtiene por medio de un metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 2; por lo cual las partes de la planta o las celulas de la planta comprenden la construcci6n de acuerdo con el item (i).
8. Un metodo para la producci6n de plantas de arroz transgenico que tienen mas caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas con relaci6n a plantas que sirven de control bajo condiciones de cultivo normales, condiciones de cultivo reducidas en nitr6geno y/o condiciones de cultivo con disponibilidad reducida de nutrientes, que comprende:

(i)

la introducci6n y expresi6n en una planta de arroz, parte de una planta de arroz, o una celula de una planta de arroz, de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido para incrementar el rendimiento seleccionado del grupo que consiste de: uno 19/20 localizado en el nucleo con un motivo AT-hook (AHL 19/20) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, bajo el control de un promotor constitutivo de una planta; y

(ii)

el cultivo de la celula de la planta, parte de la planta de arroz, o la planta de arroz bajo condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.
9. Partes cosechables de arroz que comprenden una secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido que incrementa el rendimiento 19/20 localizado en el nucleo con un motivo AT-hook (AHL 19/20) como se define en las reivindicaciones 1 o 2 de una planta de arroz de acuerdo con la reivindicaci6n 7, en donde dichas partes cosechables son semillas y en donde dichas partes cosechables contienen una construcci6n que comprende:

(a) una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido que incrementa el rendimiento seleccionado del grupo que consiste de: un 19/20 localizado en el nucleo (AHL 19/20) con un motivo AT-hook como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en done la secuencia de acido nucleico esta

(aa) operativamente enlazada con un promotor constitutivo; o

(bb) operativamente enlazada con un promotor constitutivo de la planta; o

(cc)

operativamente enlazada con un promotor GOS2; o (dd) operativamente enlazada con un promotor GOS2 de arroz como el representado por la SEQ lD NO: 35;

(b)

una o mas secuencias de control capaces de dirigir la expresi6n de la secuencia de acido nucleico de (a); y opcionalmente;

(c)

una secuencia de terminaci6n de la transcripci6n
10. El uso de una secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido que incrementa el rendimiento 19/20 localizado en el nucleo con un motivo AT-hook (AHL 19/20) como se define en las reivindicaciones 1 o 2, en incrementar las caracteristicas relacionadas con el rendimiento de semillas bajo condiciones de cultivo normales,

condiciones de cultivo reducidas en nitr6geno y/o condiciones de cultivo con disponibilidad reducida de nutrientes en 5 plantas de arroz, que comprende una o mas de: (i) aumento del numero de flores por panicula; (ii) aumento del peso total de las semillas por planta; (iii) aumento del numero de semillas llenas; o (iv) aumento de indice de cosecha.
11. El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 2, en donde la secuencia de acido nucleico esta

(a) operativamente enlazada con un promotor constitutivo; o

(b) operativamente enlazada con un promotor constitutivo de la planta; o 10 (c) operativamente enlazada con un promotor GOS2; o

(d) operativamente enlazada con un promotor GOS2 de arroz como el representado por la SEQ lD NO: 35.

FIGURA 1

FIGURA 2

FIGURA 3

FIGURA �

FIGURA � ��

FIGURA �

FIGURA 5

FIGURA 7

FIGURA 9

FIGURA 8