ES2423209T3 - Plantas que tienen un aumento de características relacionadas con el rendimiento y un método para elaboración de las mismas - Google Patents

Abstract

Un método para incrementar el vigor temprano, la biomasa, y/o el rendimiento de semilla en plantas cultivadasbajo condiciones no estresadas con relación a plantas que sirven como control, que comprende incrementar laexpresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido transportador de amonio(AMT), en donde el polipéptido AMT comprende un dominio que tiene al menos una identidad de secuencia deaminoácidos del 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más con un Dominio Conservado (DC) como el representadopor la SEQ IS NO: 33, y opcionalmente seleccionar las plantas que tienen mayor vigor temprano, biomasa, y/o rendimiento de semilla, en donde dicho polipéptido AMT tiene al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 80%, 85%, 90%,95%, 98%, 99% o más con el polipéptido AMT como el representado por la SEQ ID NO: 2.

Description

Plantas que tienen un aumento de características relacionadas con el rendimiento y un método para elaboración de las mismas.

La presente invención se refere en general al campo de la biología molecular y se relaciona con un método para incrementar diferentes características de la planta relacionadas con el rendimiento, mediante el incremento de la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifca un polipéptido transportador de amonio (AMT). La presente invención también se relaciona con plantas que tienen una mayor expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT, en donde dichas plantas tienen más características relacionadas con el rendimiento con respecto a las plantas que sirven de control. La invención también provee construcciones útiles en los métodos de la invención.

La población mundial siempre en crecimiento y la oferta cada vez más escasa de tierras cultivables disponibles para la agricultura impulsan la investigación para lograr una mayor eficiencia de Ia agricultura. Los medios convencionales para la mejora hortícola y de los cultivos utilizan técnicas selectivas de fitomejoramiento para identificar las plantas que tienen rasgos deseables. Sin embargo, dichas técnicas selectivas de fitomejoramiento tiene varias desventajas, a saber, que estas técnicas son típicamente de trabajo intensivo y traen como resultado plantas que contienen a menudo componentes genéticos heterogéneos que no siempre resultan en la transmisión de la característica deseable a partir de las plantas progenitoras. Los avances en biología molecular le han permitido a la humanidad modificar el germoplasma de animales y de plantas. La modificación por ingeniería genética de las plantas supone el aislamiento y manipulación de material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de ese material genético en una planta. Dicha tecnología tiene la capacidad de proporcionar cultivos o plantas que tienen diferentes características económicas, agronómicas u hortícolas mejoradas.

Una característica de particular interés económico es un mayor rendimiento. El rendimiento normalmente se define como la producción medible de valor económico de un cultivo. Esto puede ser definido en términos de cantidad y/o de calidad. El rendimiento depende directamente de varios factores, por ejemplo, de la cantidad y tamaño de los órganos, de la arquitectura de la planta (por ejemplo, la cantidad de ramas), de la producción de semillas, de Ia senectud de la hoja y más. El desarrollo de la raíz, la captación de nutrientes, la tolerancia al estrés y el vigor inicial también pueden ser factores importantes para determinar el rendimiento. Por lo tanto, la optimización de los factores mencionados puede contribuir al incremento del rendimiento de los cultivos.

El rendimiento de semillas es una característica particularmente importante, ya que las semillas de muchas plantas son importantes para Ia nutrición humana y animal. Cultivos tales como maíz, arroz, trigo, canola y soja dan cuenta de más de la mitad de la ingesta total de calorías por parte de la humanidad, ya sea a través del consumo directo de las semillas en si mismas o a través del consumo de productos alimenticios producidos con semillas procesadas. Son además una fuente de azúcares, aceites y muchas clases de metabolitos utilizados en procesos industriales. Las semillas contienen un embrión (la fuente de nuevos brotes y raíces) y un endospermo (la fuente de nutrientes para el desarrollo del embrión durante la germinación y durante el desarrollo temprano de las plántulas). El desarrollo de una semilla involucra muchos genes, y requiere de la transferencia de metabolitos a partir de las raíces, hojas y tallos dentro de la semilla en desarrollo. El endospermo, en particular, asimila los precursores metabólicos de carbohidratos, aceites y proteínas y los sintetiza en macromoléculas de almacenamiento para llenar el grano.

La biomasa de la planta es producida por cultivos forrajeros como la alfalfa, el maíz ensilado y el heno. Se han utilizado muchos procedimientos en los cultivos de granos. Los principales entre todos estos son los estimados del tamaño de la planta. El tamaño de la planta puede medirse en muchas formas dependiendo de la especie y de la etapa de desarrollo, pero incluye el peso seco total de la planta, el peso seco por encima del suelo, el peso fresco por encima del suelo, el área foliar, el volumen del tallo, la altura de la planta, el diámetro del rosetón, la longitud de las hojas, la longitud de la raíz, la masa de la raíz, el número de brotes y el número de hojas. Muchas especies mantienen una relación conservadora entre el tamaño de las diferentes partes de la planta en una etapa de desarrollo dada. Estas relaciones alométricas se utilizan para extrapolar a partir de una de estas medidas de tamaño con respecto a otra (por ejemplo, Tittonell et al., 2005, Agric Ecosys & Environ 105: 213). El tamaño de la planta en una etapa de desarrollo temprano se correlacionará típicamente con el tamaño de la planta posterior en el desarrollo. Una planta más grande con un área foliar más grande puede absorber típicamente más luz y dióxido de carbono que una planta más pequeña y por lo tanto probablemente ganará un mayor peso durante el mismo periodo (Fasoula & Tollenaar, 2005, Maydica 50: 39). Esto se suma a la continuación potencial de la ventaja microambiental

o genética que Ia planta tenía para obtener el tamaño más grande inicialmente. Existe un componente genético fuerte en el tamaño de la planta y la velocidad de crecimiento (por ejemplo, ter Steege et al., 2005, Plant Physiology

139: 1078), y de este modo para una gama de genotipos diversos, el tamaño de la planta bajo una condición ambiental probablemente se correlaciona con el tamaño bajo otra (Hittalmani et al., 2003, Theoretical Applied Genetics 107: 679). De esa forma se utiliza un ambiente estándar como determinante para los ambientes diversos y dinámicos encontrados en diferentes sitios y momentos por los cultivos en el campo. Otra característica importante para muchos cultivos es el vigor inicial. La mejora del vigor inicial es un objetivo importante de los programas modernos de fitomejoramiento de arroz tanto en zonas de cultivo templadas como

tropicales de arroz. Raíces largas son importantes para el anclaje apropiado del suelo en arroz sembrado en agua. Cuando el arroz se siembra directamente en campos inundados, y donde las plantas deben emerger rápidamente a través del agua, los brotes más largos están asociados con el vigor. Donde se practica el cultivo por medio de sembradoras, mesocotilos y coleoptilos más largos son importantes para una buena aparición de las plántulas. La capacidad para modificar por ingeniería genética el vigor inicial en las plantas sería de gran importancia en la agricultura. Por ejemplo, un pobre vigor inicial ha sido una limitación para la introducción de híbridos de maíz (Zea mays L.) con base en el germoplasma del Cinturón de Maíz en el Atlántico Europeo.

El índice de cosecha, Ia relación del rendimiento de semillas con respecto al peso seco por encima del suelo, es relativamente estable bajo muchas condiciones ambientales y de este modo se puede obtener una muy buena correlación entre el tamaño de Ia planta y el rendimiento de granos (por ejemplo, Rebetzke et al., 2002, Crop Science 42: 739). Estos procesos están intrínsecamente enlazados porque la mayor parte de la biomasa del grano depende de Ia productividad fotosintética presente o almacenada por parte de las hojas y el tallo de Ia planta (Gardener et al., 1985, Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, páginas 68 - 73). Por lo tanto, la selección del tamaño de la planta, incluso en etapas tempranas de desarrollo, ha sido utilizada como un indicador del rendimiento potencial futuro (por ejemplo, Tittonell et al., 2005, Agric Ecosys & Environ 105: 213). Cuando se analiza el impacto de las diferencias genéticas sobre tolerancia al estrés, Ia capacidad de estandarizar las propiedades del suelo, la temperatura, la disponibilidad de agua y de nutrientes y la intensidad de la luz es una ventaja intrínseca del invernadero o de los ambientes con cámaras de crecimiento de plantas en comparación con el campo. Sin embargo, las limitaciones artificiales en el rendimiento debido a una pobre polinización provocada por la ausencia de viento o de insectos, o insuficiente espacio para la maduración de la raíz o el desarrollo del dosel, pueden restringir el uso de estos ambientes controlados para analizar las diferencias de rendimiento. Por lo tanto, las mediciones del tamaño de la planta en el desarrollo temprano, bajo condiciones estándar en una cámara de crecimiento o invernadero, son prácticas estándar para proporcionar una indicación de las ventajas potenciales de rendimiento genético.

Otra característica importante es aquella de la tolerancia mejorada al estrés abiótico. El estrés abiótico esa una de las causas principales de pérdida de cultivos en el mundo, reduciendo los rendimientos promedio para la mayoría de las plantas de cultivo en más del 50% (Wang et al. (2003) Planta 218: 1 - 14). Los estreses abióticos pueden ser provocados por sequía, salinidad, extremos de temperaturas, toxicidad química, exceso o deficiencia de nutrientes (macroelementos y/o microelementos), radiación y estrés oxidativo. La capacidad de incrementar la tolerancia de una planta al estrés abiótico sería una ventaja económica importante para los granjeros a nivel mundial y permitiría el cultivo de granos en condiciones adversas y en territorios donde el cultivo no puede ser posible de otro modo.

Por lo tanto, se puede incrementar el rendimiento del cultivo optimizando uno de los factores anteriormente mencionados.

Dependiendo del uso final, se puede favorecer a modificación de ciertas características de rendimiento con respecto a otras. Por ejemplo para aplicaciones tales como Ia producción de forraje o madera, o recursos de biocombustibles, puede ser deseable un incremento en las partes vegetativas de una planta, y para aplicaciones tales como la producción de harina, almidón, o de aceite, puede ser particularmente deseable un incremento en los parámetros de la semilla. Incluso entre los parámetros de la semilla, algunos pueden verse favorecidos sobre otros, dependiendo de la aplicación. Diferentes mecanismos pueden contribuir para incrementar el rendimiento de semilla, ya sea en la forma de mayor tamaño de la semilla o el incremento en el número de semillas.

Un enfoque para incrementar las características relacionadas con el rendimiento (rendimiento de semilla y/o de biomasa) en plantas puede ser a través de la modificación de los mecanismos inherentes al crecimiento de una planta, tal como el ciclo celular o diferentes rutas de señalización involucradas en el desarrollo de la planta o en mecanismos de defensa.

Ahora se ha encontrado que se pueden incrementar las diferentes características relacionadas con el rendimiento en las plantas con respecto a plantas que sirven de control, por medio del aumento de la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido transportador de amonio (AMT). El aumento de características relacionadas con el rendimiento comprende uno o más de: aumento del vigor inicial, aumento de la biomasa aérea, aumento de la biomasa de las raíces, aumento del rendimiento total de semillas por planta, aumento de la tasa de llenado de las semillas, aumento del número de semillas llenas, y mayor índice de cosecha.

Antecedentes

El amonio y el nitrato son fuentes primarias de nitrógeno para el crecimiento y desarrollo de las plantas. Las plantas requieren de transportadores para la adquisición tanto de amonio como de nitrato. Existen transportadores de amonio y de nitrato no sólo en las plantas, sino en casi todos los organismos. Los transportadores de amonio (AMT) existen por lo general en un genoma como familias de genes, por ejemplo, al menos: seis en Arabidopsis thaliana, ocho en Chlamydomonas reinhardtii (Gonzales-Ballester et al. (2004) Plant Molec Biol. 56: 863 - 878), catorce en el álamo (Couturier et al. (2007). New Phytologist 174: 137 - 150), seis de la diatomea Phaeodactylum tricornutum (Allen (2005) J Phycology 41).

Con base en el análisis filogenético, se identificaron tres subfamilias de transportadores de amonio (Loqué & von Wiren (2004) J. Exp. Bot 55 (401): 1293 - 1305):

1.

la subfamilia de AMT, incluyendo los transportadores de tipo AMT1 de la planta, y transportadores de amonio cianobacterial;

2.

la subfamilia de MEP, incluyendo los transportadores de tipo AMT2 de la planta, los transportadores de MEP de levadura, la AmtB de E. coli, y otros homólogos procariotas;

3.

La subfamilia Rh, incluyendo sólo los antígenos de los grupos sanguíneos Rh humanos y de animales.

Todos los polipéptidos AMT son proteínas de membrana altamente hidrófobas con al menos 10, más comúnmente 11 hélices putativas que abarcan toda la membrana. Se ha mostrado en numerosos reportes que los polipéptidos AMT son capaces de incorporar de amonio en un amplio rango de concentración, aunque con diferentes afinidades de un organismo a otro. Dentro de ciertos organismos, tales como plantas, se identificaron transportadores de amonio de baja y alta afinidad (Gazzarini et al. (1999) Plant Cell 11: 937 - 47). Además de las propiedades de afinidad, se han identificado varios otros mecanismos de regulación para la captación de amonio, por ejemplo, a niveles transcripcional y post-transcripcional (Yuan et al (2007) Plant Phys. 143: 732 - 744).

La sobreexpresión de una secuencia de ácido nucleico de arroz que codifica una AMT1 se llevó a cabo en dos variedades cultivadas de arroz (Taipéi 309 y Jarrah), utilizando un promotor de ubiquitina del maíz para expresión constitutiva. La biomasa de brotes y raíces de líneas transgénicas disminuyeron durante la etapa vegetativa temprana y de plántulas en comparación con el tipo silvestre, sobre todo cuando se cultiva en condiciones de alta nutrición de amonio (Hoque et al. (2006) Functional Plant Biol 33: 153 - 163). Los autores concluyeron que la disminución de la biomasa de las plantas transgénicas en las primeras etapas de crecimiento podría haber sido causada por la acumulación de amonio en la raíces debido a la incapacidad para que coincida la asimilación de amonio con la mayor captación de amonio.

En la patente de los Estados Unidos No. 6.620.610, se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT1 de Arabidopsis thaliana, plásmidos que comprenden la secuencia de ácido nucleico que codifica un AMT1 para la expresión en levaduras y bacterias.

En la patente de los Estados Unidos No. 6.833.492 se describen secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido AMT1 de soja, maíz, trigo y arroz. Se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT1 o un polipéptido AMT que tiene 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido aislado AMT1 de soja. Se describen plantas y semillas que comprenden una secuencia recombinante de ácido nucleico que codifica dicha secuencia de polipéptido, así como métodos para producir tales plantas. En el documento WO 2006/076423 se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT1 de la diatomea Cylindrotheca fusiformis.

Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que el aumento en la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido ATM produce plantas que tienen más características relacionadas con el rendimiento en relación con las plantas de control.

De acuerdo con una forma de realización, se proporciona un método para aumentar las características relacionadas con el rendimiento en plantas con relación a las plantas de control, que comprende aumentar la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT como se define aquí, en una planta. El aumento de características relacionadas con el rendimiento comprende uno o más de: aumento del vigor inicial, aumento de biomasa aérea, aumento de biomasa de la raíz, aumento del rendimiento total de semillas por planta, aumento de la tasa de llenado de las semillas, aumento del número de semillas llenas, aumento del número de flores por panícula, y aumento del índice de cosecha.

Definiciones

Polipéptido(s) / Proteína(s)

Los términos “polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente aquí y se refieren a aminoácidos en una forma polimérica de cualquier longitud, unidos por medio de enlaces peptídicos.

Polinucleótido(s) / Ácido(s) nucleico(s) / Secuencia(s) de ácido nucleico / Secuencia(s) de nucleótidos

Los términos "polinucleótido(s)", "secuencia(s) de ácido nucleico", "secuencia(s) de nucleótidos”, “ácido(s) nucleico(s)” se utilizan indistintamente aquí y se refieren a nucleótidos, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una combinación de ambos, en una forma polimérica no ramificada de cualquier longitud.

Planta(s) de control

La elección de plantas control adecuadas es una parte rutinaria de la programación de un experimento y puede incluir las plantas correspondientes de tipo silvestre o las plantas correspondientes sin el gen de interés. La planta

5 control es típicamente de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad que la planta que va a ser evaluada. La planta control puede ser también un nulicigoto de la planta que va a ser evaluada. Una “planta de control” tal como se utiliza aquí se refere no sólo a plantas enteras, sino también a partes de plantas, incluyendo semillas y partes de la semilla.

10 Homólogo(s)

Los "homólogos” de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tienen actividad biológica y funcional similar a la de la proteína no modificada de la cual se derivan.

Una supresión se refere a la remoción de uno o más aminoácidos de una proteína.

Una inserción se refiere a uno o más residuos de aminoácidos que se introducen en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden incluir fusiones en el terminal N y/o en el terminal C así como inserciones dentro 20 de la secuencia de uno solo o de múltiples aminoácidos. En general, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones en el terminal N o en el terminal C, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Los ejemplos de proteínas o péptidos de fusión del terminal N o C incluyen el dominio de enlazamiento o el dominio de activación de un activador transcripcional tal como el que se utiliza en el sistema de doble hibrido de levadura, las proteínas de recubrimiento de fago, la etiqueta de (histidina)6, la etiqueta

25 de glutationa S transferasa, la proteína A, la proteína de enlazamiento de maltosa, la dihidrofolato reductasa, el epítopo Tag·100, el epítopo c-myc, el epítopo FLAG®, lacZ, CMP (péptido de enlazamiento de calmodulina), el epítopo HA, el epítopo de proteína C y el epítopo VSV.

Una sustitución se refiere al reemplazo de aminoácidos de la proteína por otros aminoácidos que tienen propiedades

30 similares (tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras helicoidales a o estructuras de láminas � similares). Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero pueden agruparse dependiendo de las restricciones funcionales colocadas sobre el polipéptido; las inserciones usualmente serán del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos son preferiblemente sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las tablas de sustitución

35 conservadora son bien conocidas en la técnica (véase por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Eds.) y la Tabla 1 siguiente).

Tabla 1: Ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos

Residuo

Sustituciones conservadoras Residuo Sustituciones conservadoras

Ala

Ser Leu Ile; Val

Arg

Lys Lys Arg; Gln

Asn

Gln; His Met Leu; Ile

Asp

Glu Phe Met; Leu; Tyr

Gln

Asn Ser Thr, Gly

Cys

Ser Thr Ser, Val

Glu

Asp Trp Tyr

Gly

Pro Tyr Trp; Phe

His

Asn; Gln Val Ile; Leu

Ile

Leu, Val

40 Las sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos se pueden realizar fácilmente utilizando técnicas de síntesis de péptidos bien conocidas en la técnica, tales como la síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por medio de manipulación de ADN recombinante. Los métodos para la manipulación de las secuencias de ADN para producir las variantes de sustitución, inserción o supresión de una proteína son bien conocidos en la técnica. Por

45 ejemplo, las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN son bien conocidas por aquellos ordinariamente capacitados en la técnica e incluyen Ia mutagénesis M13, mutagénesis in vitro del Gen T7 (USB, Cleveland, OH), mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio.

50 Derivados

Los “derivados” incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos los cuales pueden, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la forma de la proteína de origen natural, tal como la proteína de interés, incluir sustituciones de aminoácidos con residuos de aminoácidos que no son de origen natural, o adiciones de residuos de aminoácidos

que no son de origen natural. Los “derivados” de una proteína también abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos los cuales incluyen residuos de aminoácidos de origen natural alterados (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados, etc.) o alterados de origen no natural comparado con la secuencia de aminoácidos de una forma de origen natural del polipéptido. Un derivado puede incluir también uno o más sustituyentes o adiciones que no son de aminoácidos comparado con la secuencia de aminoácidos de la cual se deriva, por ejemplo una molécula reportera u otro ligando, enlazado en forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula reportera que se enlaza para facilitar su detección, y residuos de aminoácidos de origen no natural con relación a la secuencia de aminoácidos de una proteína de origen natural.

Ortólogo(s) / Parálogo(s)

Los ortólogos y los parálogos abarcan conceptos evolucionarios utilizados para describir las relaciones ancestrales de los genes. Los parálogos son genes dentro de la misma especie que se han originado a través de la duplicación de un gen ancestral; los ortólogos son genes de diferentes organismos que se han originado a través de especiación, y se derivan también de un gen ancestral común.

Dominio

El término "dominio" se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones especificas a lo largo de una alineación de secuencias de proteínas relacionadas por evolución. Mientras que los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre homólogos, los aminoácidos que son altamente conservados en posiciones especificas indican aminoácidos que son probablemente esenciales en la estructura, estabilidad o función de una proteína. Identificados por su alto grado de conservación en secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteína, se pueden utilizar como identificadores para determinar si cualquier polipéptido en cuestión pertenece a una familia de polipéptidos previamente identificada.

Motivo / Secuencia de consenso / Firma

El término "motivo" o “secuencia de consenso" o “firma” se refieren a una región conservada corta en la secuencia de proteínas relacionadas por evolución. Los motivos son frecuentemente partes de dominios altamente conservados, pero pueden incluir también solamente parte del dominio, o estar localizados fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo caen fuera de un dominio definido).

Hibridación

El término “hibridación” como se defne aquí es un proceso en donde las secuencias nucleotídicas complementarias sustancialmente homólogas se aparean entre sí. El proceso de hibridación puede ocurrir completamente en solución, es decir ambas moléculas de ácido nucleico complementarias están en solución. El proceso de hibridación puede ocurrir también con una de las moléculas complementarias de ácido nucleico inmovilizadas a una matriz tal como perlas magnéticas, perlas de Sefarosa o cualquier otra resina. El proceso de hibridación puede ocurrir además con una de las moléculas complementarias de ácido nucleico inmovilizadas a un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa o de nailon o inmovilizada, por ejemplo, por medio de fotolitografía, por ejemplo a un soporte de vidrio silíceo (éste último conocido como arreglos de secuencias de ácido nucleico o microarreglos o como chips de secuencias de ácido nucleico). Con el propósito de permitir que se produzca la hibridación, las moléculas de ácido nucleico son generalmente desnaturalizadas térmica o químicamente para fundir una hebra bicatenaria en dos hebras individuales y/o para remover horquillas u otras estructuras secundarias de las moléculas de ácido nucleico monocatenario.

El término “rigurosidad” se refiere a las condiciones bajo las cuales tiene lugar una hibridación. La rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones tales como la temperatura, la concentración salina, la fuerza iónica y la composición del amortiguador de hibridación. En general, las condiciones de baja rigurosidad se seleccionan para que sean aproximadamente 30°C menores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia especifica a una fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones de rigurosidad media se dan en los casos donde la temperatura está 20°C por debajo de la Tm, y las condiciones de alta rigurosidad se dan en los casos cuando la temperatura está 10°C por debajo de la Tm. Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad se utilizan típicamente para aislar las secuencias de hibridación que tienen una gran similitud de secuencia con la secuencia de ácido nucleico objetivo. Sin embargo, las secuencias de ácido nucleico pueden desviarse en secuencia e incluso codificar un polipéptido sustancialmente idéntico, debido a la degeneración del código genético. Por lo tanto, algunas veces pueden ser necesarias condiciones de hibridación de rigurosidad media, para identificar tales moléculas de secuencia de ácido nucleico.

La Tm es la temperatura en condiciones de una fuerza iónica y pH defnidos, a la cual 50% de la secuencia objetivo hibrida a una sonda perfectamente emparejada. La Tm depende de las condiciones de la solución y de la composición base y la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas hibridan específcamente a temperaturas más elevadas. La velocidad máxima de hibridación se obtiene aproximadamente desde 16°C hasta 32°C por debajo de la Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electrostática entre las dos hebras de la secuencia de ácido nucleico promoviendo de este modo Ia formación del

híbrido; este efecto es visible para concentraciones de sodio de hasta 0,4 M (para concentraciones más elevadas, este efecto puede ignorarse). La formamida reduce la temperatura de fusión de los dúplex ADN-ADN y ADN-ARN con 0,6 hasta 0,7°C para cada por ciento de formamida, y la adición de 50% de formamida permite que la hibridación se lleve a cabo entre 30 a 45°C, si bien la velocidad de la hibridación se disminuirá. La falta de emparejamiento de los pares de bases reduce la velocidad de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. En promedio y para sondas largas, la Tm disminuye aproximadamente 1°C por % de falta de emparejamiento de las bases. La Tm puede calcularse utilizando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de híbridos:

1) híbridos de ADN - ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem, 138: 267 - 284, 1984):

Tm = 81,5°C + 16,6 x Iog10 [Na+]a + 0,41 x % [G/Cb] - 500 x [Lc]-1 - 0,61 x % de formamida

2) híbridos de ADN - ARN o ARN - ARN:

Tm = 79,8 + 18,5 (log10 [Na+]a) + 0,58 (% de G/Cb) + 11,8 (% de G/Cb)2 - 820/Lc

3) híbridos de oligo - ADN u oligo - ARNd:

Para <20 nucleótidos: Tm = 2 (In) Para 20 - 35 nucleótidos: Tm = 22 + 1,46 (In) a o para otro catión monovalente, pero sólo preciso en el rango de 0,01 - 0,4 M. b sólo preciso para % de GC en el rango de 30% a 75%. c L = longitud del dúplex en pares de bases. d oligo, oligonucleótido; ln, = longitud efectiva del cebador = 2 x (no. de G/C) + (no. de A/T).

El enlazamiento no específico se puede controlar utilizando cualquiera entre una cantidad de técnicas conocidas tales como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contienen proteína, adiciones de ARN heterólogo, ADN, y SDS al amortiguador de hibridación, y tratamiento con ARNasa. Para las sondas no homólogas, se puede llevar a cabo una serie de hibridaciones variando uno de (i) disminución progresiva de la temperatura de apareamiento (por ejemplo de 68°C hasta 42°C) o (ii) disminución progresiva de la concentración de formamida (por ejemplo desde 50% hasta 0%). La persona ordinariamente capacitada conoce diferentes parámetros que pueden ser alterados durante la hibridación y los cuales o bien mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Además de las condiciones de hibridación, la especifcidad de la hibridación típicamente también depende de la función de los lavados posteriores a la hibridación. Para eliminar el medio resultante de la hibridación no específca, se lavan las muestras con soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de tales lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución final de lavado: cuánto más baja la concentración de sal y más alta la temperatura de lavado, mayor la rigurosidad del lavado. Las condiciones de lavado se llevan a cabo típicamente en o por debajo de la rigurosidad de la hibridación. Una hibridación positiva produce una señal que es al menos dos veces aquella de la señal de fondo. En general, las condiciones rigurosas adecuadas para los ensayos de hibridación de la secuencia de ácido nucleico o los procedimientos de detección por amplificación génica son como se expusieron anteriormente. Las condiciones más o menos rigurosas también se pueden seleccionar. Una persona normalmente capacitada en la técnica conoce diferentes parámetros que pueden ser alterados durante el lavado y que o bien mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Por ejemplo, las condiciones típicas de hibridación de alta rigurosidad para los híbridos de ADN de longitud superior a 50 nucleótidos abarcan la hibridación a 65°C en 1x SSC o a 42°C en 1x SSC y 50% de formamida, seguido por un lavado a 65°C en 0,3x SSC. Los ejemplos de condiciones de hibridación de rigurosidad media para los híbridos de ADN de longitud superior a 50 nucleótidos abarcan la hibridación a 50°C en 4x SSC o a 40°C en 6x SSC y 50% de formamida, seguido por un lavado a 50°C en 2x SSC. La longitud del hibrido es de Ia longitud anticipada para la hibridación del ácido nucleico. Cuando se hibridan moléculas de ácido nucleico de secuencia conocida, se puede determinar Ia longitud del hibrido por medio de la alineación de las secuencias y la identificación de las regiones conservadas descritas aquí. 1x SSC es NaCl 0,15 M y citrato sódico 15 mM; la solución de hibridación y las soluciones de lavado pueden incluir además 5 x del reactivo de Denhardt, 0,5 - 1,0% de SDS, 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, 0,5% de pirofosfato de sodio.

Para los propósitos de defnir el nivel de rigurosidad, puede hacerse referencia a Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 y sus actualizaciones anuales).

Variante de Empalme

El término “variante de empalme" tal como se utiliza aquí abarca las variantes de una secuencia de ácido nucleico en las cuales se han suprimido, reemplazado, desplazado o agregado los intrones y/o exones seleccionados, o en las cuales se han acortado o alargado los intrones. Tales variantes serán aquellas en las cuales se retiene sustancialmente la actividad biológica de la proteína; esto se puede lograr reteniendo selectivamente segmentos

funcionales de Ia proteína. Tales variantes de empalme pueden hallarse en la naturaleza o pueden ser artificiales. Los métodos para predecir y aislar tales variantes de empalme son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo Foissac and Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).

Variante alélica

Los alelos o las variantes alélicas son formas alternativas de un gen dado, localizados en Ia misma posición cromosómica. Las variantes alélicas abarcan los Polimorfismos de un Solo Nucleótido (SNP por sus siglas en inglés), así como también los Polimorfismos de Inserción/Supresión pequeña (lNDEL por sus siglas en inglés). El tamaño de los lNDEL es usualmente inferior a 100 pb. Los SNP y los lNDEL forman el conjunto más grande de variantes de secuencia en las cadenas polimórficas de origen natural de la mayoría de los organismos.

Transposición de genes / Evolución dirigida

La transposición de genes o Ia evolución dirigida consiste de iteraciones de Ia transposición del ADN seguida por la detección y/o selección apropiada para generar variantes de secuencias de ácido nucleico o porciones de las mismas que codifcan las proteínas que tienen una actividad biológica modificada (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151 - 4; patentes estadounidenses Nos. 5.811.238 y 6.395.547).

Elemento regulador / Secuencia de control / Promotor

Los términos “elemento regulador”, "secuencia de control” y “promotor” se utilizan todos en forma intercambiable en Ia presente descripción y se deben tomar en un contexto amplio para referirse a secuencias reguladoras de ácido nucleico capaces de efectuar la expresión de las secuencias a las cuales están ligadas. El término ‘promotor’ típicamente se refiere a una secuencia control de la secuencia de ácido nucleico localizada secuencia arriba del inicio de la transcripción de un gen y la cual está involucrada en el reconocimiento y enlazamiento de la ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo de este modo la transcripción de un de ácido nucleico operativamente enlazado. Abarcados por los términos antes mencionados, se hallan las secuencias reguladoras de la transcripción que se derivan de un gen genómico eucariota clásico (que incluye la caja TATA la cual es necesaria para la iniciación precisa de la transcripción, con o sin una secuencia de la caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras secuencia arriba, reforzadoras y silenciadoras) los cuales alteran la expresión génica en respuesta a estímulos de desarrollo y/o externos, o en una forma específica del tejido. También se incluyen dentro del término una secuencia reguladora de la transcripción de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras de la transcripción de caja -10. El término “elemento regulador" también abarca una molécula sintética de fusión o un derivado que confiere, activa o mejora la expresión de una molécula de la secuencia de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano.

Un “promotor de una planta" incluye elementos reguladores, los cuales median la expresión de un segmento de una secuencia de codificación en células de plantas. El “promotor de la planta" preferiblemente se origina a partir de una célula de la planta, por ejemplo, a partir de la planta la cual es transformada con la secuencia de ácido nucleico que va a ser expresada en el proceso de la invención y descrita aquí. Esto también aplica a otras señales reguladoras de la “planta”, tales como terminadores de la “planta". Los promotores secuencia arriba de las secuencias nucleotídicas útiles en los métodos de la presente invención pueden ser modificados mediante una o más sustituciones, inserciones y/o supresiones de nucleótidos sin interferir con Ia funcionalidad o actividad ya sea de los promotores, el marco de lectura abierto (ORF por sus siglas en inglés) o la región reguladora 3' tal como terminadores u otras regiones reguladoras 3’ las cuales se localizan lejos del ORF. Además es posible que la actividad de los promotores se incremente por la modificación de su secuencia, o que sean completamente reemplazados por promotores más activos, incluso promotores de organismos heterólogos. Para la expresión en plantas, la molécula de la secuencia de ácido nucleico debe, como se describió anteriormente, estar operativamente enlazada a un promotor adecuado, o contener un promotor adecuado, el cual expresa al gen en el momento adecuado y con el patrón de expresión espacial requerido.

Para la identificación de promotores funcionalmente equivalentes, se pueden analizar la fuerza del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato por ejemplo enlazando operativamente el promotor a un gen reportero y ensayando el nivel de expresión y el patrón del gen reportero en diferentes tejidos de la planta. Los genes reporteros adecuados bien conocidos incluyen por ejemplo a Ia beta-glucuronidasa o a la beta-galactosidasa. La actividad del promotor se ensaya mediante Ia medición de la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o la betagalactosidasa. La fuerza del promotor y/o el patrón de expresión pueden ser comparados luego con la de un promotor de referencia (tal como el utilizado en los métodos de la presente invención). En forma alternativa, la fuerza del promotor se puede ensayar cuantificando los niveles de ARNm o comparando los niveles de ARNm de la secuencia de ácido nucleico utilizada en los métodos de Ia presente invención, con niveles de ARNm de los genes de mantenimiento tales como el ARNr 18S, utilizando métodos conocidos en Ia técnica, tal como las transferencias tipo Northern con análisis densitométrico de autorradiogramas, PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR (Heid et al, 1996, Genome Methods 6: 986 - 994). En general, por “promotor débil" se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia de codificación a un nivel bajo. Por “nivel bajo" se entiende a niveles de aproximadamente 1/10.000 de transcriptos hasta aproximadamente 1/100.000 de transcriptos, hasta

aproximadamente 1/500.0000 de transcriptos por célula. Por el contrario, un “promotor fuerte" dirige Ia expresión de una secuencia de codificación a nivel alto, o aproximadamente a 1/10 de transcriptos hasta aproximadamente 1/100 de transcriptos hasta aproximadamente 1/1.000 de transcriptos por célula. En general, por “promotor de fuerza media" se entiende un promotor que dirige Ia expresión de una secuencia de codificación a un nivel que está en

5 todos los casos por debajo de aquel obtenido bajo el control de un promotor 35S del CaMV.

Operativamente enlazado

EI término “operativamente enlazado” tal como se utiliza aquí, se refiere a un enlace funcional entre la secuencia 10 promotora y el gen de interés, de modo que la secuencia promotora pueda iniciar la transcripción del gen de interés.

Promotor constitutivo

Un "promotor constitutivo” se refere a un promotor que es transcripcionalmente activo durante Ia mayoría de las 15 fases, pero no necesariamente todas, de crecimiento y desarrollo y bajo la mayoría de las condiciones ambientales, en al menos una célula, tejido ú órgano. La Tabla 2a a continuación muestra ejemplos de promotores constitutivos.

Tabla 2a: Ejemplos de promotores constitutivos de la planta

Fuente de Genes

Referencia

Actina

McElroy et al, Plant Cell, 2: 163 - 171, 1990

HMGB

WO 2004/070039

GOS2

de Pater et al, Plant J Nov; 2(6): 837 - 44, 1992, WO 2004/065596

Ubiquitina

Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675 - 689, 1992

Ciclofilina de arroz

Buchholz et al, Plant Mol Biol. 25(5): 837 - 43, 1994

Histona H3 de maíz

Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276 - 285, 1992

Histona H3 de alfalfa

Wu et al. Plant Mol. Biol. 11: 641 - 649, 1988

Actina 2

An et al, Plant J. 10(1); 107 - 121, 1996

Subunidad pequeña de Rubisco

Patente de los Estados Unidos No. 4.962.028

Ocs

Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553

SAD1

Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

SAD2

Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

V-ATPasa

WO 01/14572

Proteínas de caja G

WO 94/12015

Promotor ubicuo

Un promotor ubicuo es activo sustancialmente en todos los tejidos o células de un organismo.

25 Promotor regulado por desarrollo

Un promotor regulado por desarrollo es activo durante ciertas etapas del desarrollo o en partes de la planta que experimentan cambios en el desarrollo.

30 Promotor inducible

Un promotor inducible ha inducido o incrementado la iniciación de la transcripción en respuesta a un estímulo químico (para una revisión véase Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89 - 108), ambiental o físico, o puede ser “inducible por estrés”, es decir activado cuando una planta es expuesta a diferentes condiciones

35 de estrés, o un promotor "inducible por patógenos”, es decir activado cuando una planta es expuesta a diferentes patógenos.

Promotor específco de un órgano / Específco de un tejido

40 Un promotor específco de un órgano o específico de un tejido es uno que es capaz de iniciar Preferiblemente la transcripción en ciertos órganos o tejidos, tales como las hojas, las raíces, el tejido de la semilla, etc. Por ejemplo, un “promotor específco de la raíz” es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en las raíces de la planta, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión defectuosa en estas otras partes de la planta. Los promotores capaces de iniciar la transcripción

45 en ciertas células únicamente se denominan aquí como “específicos de la célula".

Ejemplos de promotores específicos de la raíz se enumeran en la Tabla 2b a continuación:

Tabla 2b: Ejemplos de promotores específicos de la raíz

Fuente de Genes

Referencia

RCc3 de arroz

Xu et al (1995) Plant Mol Biol 27(2): 237 - 48

Transportador de fosfato PHT1 de Arabidopsis

Kovama et al., 2005

Transportador de fosfato de Medicago

Xiao et al., 2006

Pyk10 de Arabidopsis

Nitz et al. (2001) Plant Sci 161 (2): 337 - 346

Genes RB7, RD2, RD5, RH12 específicos de la raíz del tabaco

Conkling et al. (1990) Plant Phys 93(3): 1203-1211

Lectina específica de la raíz de cebada

Lerner & Raikhel (1989) Plant Phys 91: 124 - 129

Proteína rica en hidroxi-prolina específica de la raíz

Keller & Lamb (1989) Genes & Dev 3: 1639 - 1646

CDC27B/hobbit de Arabidopsis

Blilou et al. (2002) Genes & Dev 16: 2566 - 2575

Un promotor específco de semilla es transcripcionalmente activo predominantemente en el tejido de la semilla, pero

5 no necesariamente exclusivamente en el tejido de la semilla (en casos de expresión defectuosa). El promotor específico de la semilla puede estar activo durante el desarrollo de la semilla y/o durante la germinación. Ejemplos de promotores específicos de semilla se muestran en la Tabla 2c a continuación. Otros ejemplos de promotores específcos de semilla se presentan en Qing Qu y Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113 - 125, 2004), cuya divulgación se incorpora aquí por referencia como si se la hubiera expuesto en su totalidad.

Tabla 2c: Ejemplos de promotores específicos de la semillas

Fuente de Genes

Referencia

Gene específicos de la semilla

Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985.

Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.

Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

Albúmina de la nuez del Brasil

Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235 - 245, 1992.

Legumina

Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203 - 214, 1988.

glutelina (arroz)

Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15 - 22, 1986;

Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43 - 47, 1987.

Zeina

Matzke et al Plant Mol Biol, 14(3): 323 - 32 1990

NapA

Stalberg et al, Planta 199: 515 - 519, 1996.

Glutenina-1 LMW y HMW de trigo

Mol Gen Genet 216: 81 - 90, 1989; NAR 17: 461 - 2, 1989

SPA de trigo

Albani et al, Plant Cell, 9: 171-184, 1997

a, �, -gliadinas de trigo

EMBO J. 3: 1409 - 15, 1984

Promotor ltr1 de cebada

Diaz et al. (1995) Mol Gen Genet 248(5): 592 - 8

Hordeína B1, C, D de cebada

Theor Appl Gen 98: 1253 - 62, 1999; Plant J 4: 343 - 55, 1993; Mol Gen Genet 250: 750 - 60, 1996

DOF de cebada

Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53 - 62, 1998

blz2

EP99106056.7

Promotor sintético

Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629 - 640, 1998.

Prolamina NRP33 de arroz

Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885 - 889, 1998

a-globulina Glb-1 de arroz

Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885 - 889, 1998

OSH1 de arroz

Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117 - 8122, 1996

a-globulina REB/OHP-1 de arroz

Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513 - 522, 1997

ADP-glucosa pirofosforilasa de arroz

Trans Res 6: 157 - 68, 1997

Familia de genes ESR del maíz

Plant J 12: 235 - 46, 1997

a-kafirina del sorgo

DeRose et al., Plant Mol. Biol 32: 1029 - 35, 1996

KNOX

Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39: 257 - 71, 1999

Oleosina del arroz

Wu et al, J. Biochem. 123: 386, 1998

Oleosina de girasol

Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873 - 876, 1992

40S putativa del arroz, PR00117

WO 2004/070039

Proteína ribosomal

Alanina aminotransferasa del arroz, PRO0136

No publicada

Inhibidor ITR1 de tripsina (cebada), PRO0147

No publicada

WSI18 de arroz, PRO0151

WO 2004/070039

RAB21 de arroz, PRO0175

WO 2004/070039

PRO005

WO 2004/070039

PRO0095

WO 2004/070039

(continuación)

Fuente de Genes

Referencia

a-amilasa (Amy32b)

Lanahan et al, Plant Cell 4: 203 - 211, 1992; Skriver et al, Proc Natl Acad Sci USA 88: 7266 - 7270, 1991

Gen tipo catepsina �

Cejudo et al, Plant Mol Biol 20: 849 - 856, 1992

Cebada Ltp2

Kalla et al., Plant J. 6: 849 - 60, 1994

Chi26

Leah et al., Plant J. 4: 579 - 89, 1994

Maíz B-Perú

Selinger et al., Genetics 149; 1125 - 38, 1998

Un promotor específico del tejido verde como se define aquí, es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en tejido verde, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra de las partes de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión defectuosa en estas otras partes de la planta.

Ejemplos de promotores específicos del tejido verde que pueden ser utilizados para llevar a cabo los métodos de la invención son presentados en la Tabla 2d a continuación.

Tabla 2d: Ejemplos de promotores específicos del tejido verde

Gen

Expresión Referencia

Ortofosfato diquinasa del maíz

Específica de la hoja Fukavama et al., 2001

Fosfoenolpiruvato carboxilasa del maíz

Específica de la hoja Kausch et al., 2001

Fosfoenolpiruvato carboxilasa del arroz

Específica de la hoja Liu et al., 2003

Pequeña subunidad de Rubisco del arroz

Específica de la hoja Nomura et al., 2000

Beta expansina EXBP9 del arroz

Específica del brote WO 2004/070039

Pequeña subunidad de Rubisco del guandú

Específica de la hoja Panguluri et al., 2005

RBCS3A del guisante

Específica de la hoja

Otro ejemplo de un promotor específico del tejido es un promotor especifico del meristema, el cual es transcripcionalmente activo predominantemente en el tejido meristemático, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra de las partes de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión defectuosa en estas otras

15 partes de la planta. Ejemplos de promotores específicos del meristema que pueden ser utilizados para llevar a cabo los métodos de la invención se presentan en la Tabla 2e a continuación.

Tabla 2e: Ejemplos de promotores específcos del meristema

Fuente del gen

Patrón de expresión Referencia

OSH1 del arroz

Meristema apical del brote, desde la etapa globular embrionaria hasta la etapa de plántula Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117 - 8122

Metalotioneína del arroz

Específico del meristema BAD87835.1

WAK1 & WAK 2

Meristemas apicales de raíz y de brote, y en hojas y sépalos en expansión Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303 - 318

Terminador

El término "terminador" abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN al extremo de una unidad de transcripción la cual señala el procesamiento 3’ y la poliadenilación de un transcripto primario y la terminación de la

25 transcripción. El terminador puede derivarse del gen natural, a partir de una variedad de otros genes de planta, o del ADN-T. EI terminador que va a ser añadido puede derivarse de, por ejemplo, los genes de la nopalina sintasa o de la octopina sintasa, o en forma alternativa de otro gen de la planta, o con menor preferencia a partir de cualquier otro gen eucariota.

30 Modulación

El término “modulación” significa en relación con expresión o con expresión génica, un proceso en el cual el nivel de expresión es cambiado por dicha expresión génica en comparación con la planta de control, Preferiblemente el nivel de expresión se incrementa. La expresión original, no modulada puede ser de cualquier tipo de expresión de un ARN

35 estructural (ARNr, ARNt) o de ARNm con posterior traducción. El termino “que modula la actividad” significa cualquier cambio de la expresión de las secuencias de ácido nucleico de la invención o las proteínas codificadas, lo cual conduce a un mayor rendimiento y/o a un mayor crecimiento de las plantas.

Expresión incrementada / sobreexpresión

40 El término “expresión incrementada” o "sobreexpresión" tal como se utiliza aquí signifca cualquier forma de expresión que sea adicional al nivel original de expresión de tipo silvestre.

Los métodos para incrementar la expresión de los genes o de los productos génicos están bien documentados en la técnica e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión conducida por promotores apropiados, el uso de incrementadores de la transcripción o incrementadores de la traducción. Las secuencias de ácido nucleico aisladas que sirven como elementos promotores o incrementadores pueden ser introducidas en una posición apropiada (típicamente secuencia arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido para favorecer la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica al polipéptido de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos pueden ser alterados in vivo por medio de mutación, supresión, y/o sustitución (véase, Kmiec, patente de los Estados Unidos No. 5.565.350; Zarling et al., WO9322443), o se pueden introducir los promotores aislados en una célula de una planta en la orientación y distancia apropiados de un gen de la presente invención para controlar la expresión del gen.

Si se desea una expresión polipeptídica, en general es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3’ de un región de codificación del polinucleótido. La región de poliadenilación puede derivarse del gen natural, a partir de una variedad de otros genes de la planta, o a partir del ADN-T. La secuencia del extremo de 3’ que va a ser añadida puede derivarse, por ejemplo, de los genes de la nopalina sintasa o de la octopina sintasa, o en forma alternativa a partir de otro gen de la planta, o menos preferiblemente a partir de cualquier otro gen eucariota.

También se puede añadir una secuencia del intrón a la región no traducida (UTR) 5’ o en la secuencia codificadora de la secuencia de codificación parcial para incrementar la cantidad del mensaje de maduración que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón que puede empalmarse en la unidad de transcripción tanto en los constructos de expresión de plantas como de animales ha demostrado que incrementa la expresión génica tanto en los niveles de ARNm como de proteína hasta 1000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395 - 4405; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183 - 1200). Tal incremento del intrón de la expresión génica es típicamente mayor cuando se localiza cerca del extremo 5’ de Ia unidad de transcripción. El uso de los intrones del maíz, intrón Adh1-S 1, 2 y 6 y el intrón de Bronce-1 es conocido en la técnica. Para información general, véase: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Gen endógeno

La referencia aquí a un gen “endógeno” no sólo se refiere al gen en cuestión tal como se encuentra en una planta en su forma natural (es decir, sin que exista intervención humana alguna), sino que también se refiere al mismo gen (o un ácido nucleico/gen sustancialmente homólogo) en un forma aislada posteriormente (re)introducido en una planta (un transgén). Por ejemplo, una planta transgénica que contiene dicho transgén puede encontrar una reducción sustancial de la expresión del transgén y/o una reducción sustancial de la expresión del gen endógeno.

Expresión disminuida

La referencia que se hace aquí a una “expresión disminuida” o a una “reducción o eliminación sustancial" de la expresión se pretende que signifique una disminución en la expresión del gen endógeno y/o de los niveles de polipéptido y/o de la actividad del polipéptido con relación a las plantas de control. La reducción o la eliminación sustancial es en orden creciente de preferencia una reducción de al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más en comparación con las de las plantas de control.

Para la reducción o la eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno en una planta, se requiere de una longitud suficiente de nucleótidos sustancialmente contiguos de una secuencia de ácido nucleico. A fn de llevar a cabo el silenciamiento génico, este puede ser tan pequeño como de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos nucleótidos, alternativamente este puede ser tanto como el gen completo (incluyendo la UTR de 5’ y/o 3', ya sea en parte o completa). El alargamiento de nucleótidos sustancialmente contiguos puede derivarse de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés (gen objetivo), o de cualquier secuencia de ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, un parálogo o un homólogo de la proteína de interés. Preferiblemente, el alargamiento de los nucleótidos sustancialmente contiguos es capaz de formar enlaces de hidrógeno con el gen objetivo (ya sea una cadena sentido o antisentido), más preferiblemente, el alargamiento de los nucleótidos sustancialmente contiguos tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia del 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% con respecto al gen objetivo (ya sea una cadena sentido o antisentido). Una secuencia de ácido nucleico que codifca un polipéptido (funcional) no es un requerimiento para los diferentes métodos discutidos aquí para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno.

Esta reducción o eliminación sustancial de la expresión puede lograrse mediante el uso de herramientas y técnicas de rutina. Un método para la reducción o eliminación sustancial de la expresión del gen endógeno es mediante el silenciamiento mediado por ARN utilizando una repetición invertida de una secuencia de ácido nucleico o una parte de la misma (en este caso un alargamiento de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés, o de cualquier secuencia de ácido nucleico capaz de codifcar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), preferiblemente capaz de formar una estructura de horquilla. Otro ejemplo de un método de silenciamiento del ARN involucra la introducción de secuencias de ácido nucleico o de partes de las mismas (en este caso un alargamiento de nucleótidos sustancialmente contiguos que derivan del gen de interés, o de cualquier secuencia de ácido nucleico capaz de codifcar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), en una orientación sentido en una planta. Otro ejemplo de un método de silenciamiento de ARN involucra el uso de secuencias de

ácido nucleico antisentido. EI silenciamiento génico también puede lograrse mediante mutagénesis de inserción (por ejemplo, inserción de ADN-T o inserción de un transposón) o mediante estrategias como las descritas, entre otros, por Angeli y Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357 - 62), (Amplicón VIGS WO 98/36083), o Baulcombe (WO 99/15682). Otros métodos, tal como el uso de anticuerpos dirigidos a un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o la interferencia en la ruta de señalización en la cual está involucrado un polipéptido, serán bien conocidos por aquellos normalmente capacitados en el arte. Se pueden utilizar microARN artificiales (miARNa) y/o naturales para desactivar la expresión génica y/o la traducción del ARNm. Los miARN endógenos son los ARN monocatenarios pequeños típicamente de 19 - 24 nucleótidos de largo. Los microARN artificiales (miARNa), que tienen típicamente 21 nucleótidos de longitud, pueden ser modificados por ingeniería genética específicamente para regular en forma negativa la expresión génica de genes individuales o múltiples de interés. Los determinantes de la selección objetivo del ARN micro de una planta son bien conocidos en la técnica. Los parámetros empíricos para el reconocimiento del objetivo han sido definidos y pueden ser utilizados para ayudar en el diseño de los ARNmia específcos (Schwab et at., (2005) Dev Cell 8(4): 517 - 27). Las herramientas convenientes para el diseño y generación de los ARNmia y sus precursores también se encuentran disponibles al público (Schwab et al., (2006) Plant Cell 18(5): 1121 - 33).

Para un desempaño óptimo, las técnicas de silenciamiento génico utilizadas para reducir la expresión en una planta de un gen endógeno requieren del uso de secuencias de ácido nucleico de plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas, y de plantas dicotiledóneas para Ia transformación de plantas dicotiledóneas. Preferiblemente, se introduce una secuencia de ácido nucleico de cualquier especie de planta dada en esa misma especie. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requerimiento absoluto que la secuencia de ácido nucleico que va a ser introducida se origine a partir de la misma especie de planta que la planta en la cual será introducida. Es sufciente que exista homología sustancial entre el gen objetivo endógeno y la secuencia de ácido nucleico que va a ser introducida.

Se describieron anteriormente ejemplos de diferentes métodos para la reducción o eliminación sustancial de la expresión en una planta de un gen endógeno. Un persona normalmente capacitada en la técnica podría adaptar fácilmente los métodos anteriormente mencionados para el silenciamiento a fin de lograr la reducción de la expresión de un gen endógeno en una planta completa o en partes de Ia misma a través, por ejemplo, del uso de un promotor apropiado.

Marcador seleccionable (gen) / Gen reportero

Los términos "marcador seleccionable", "gen marcador seleccionable" o “gen reportero” incluyen a cualquier gen que confiera un fenotipo a una célula en la cual se exprese para facilitar la identificación y/o la selección de las células que son transfectadas o transformadas con un constructo de una secuencia de ácido nucleico de la invención. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia exitosa de las moléculas de la secuencia de ácido nucleico mediante una serie de principios diferentes. Los marcadores adecuados se pueden seleccionar de los marcadores que conferen resistencia antibiótica o herbicida, que introducen una nueva característica metabólica o que permiten una selección visual. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen a los genes que confieren resistencia a los antibióticos (tales como nptll que fosforilan la neomicina y la kanamicina, o hpt, que fosforila higromicina, o genes que confieran resistencia, por ejemplo, a la bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloramfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicima o blasticidina), a los herbicidas (por ejemplo bar el cual proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que proporcionan resistencia contra el glifosato, o los genes que conferen resistencia, por ejemplo, a la imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea), o genes que proporcionen una característica metabólica (tal como manA que le permite a las plantas utilizar manosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilización de xilosa, o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a la 2-desoxiglucosa). La expresión de los genes marcadores visuales resulta en la formación de color (por ejemplo -glucuronidasa, GUS o -galactosidasa con sus sustratos coloreados, por ejemplo X-Gal), luminiscencia (tal como el sistema de luciferina / luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP, y sus derivados). Esta lista representa sólo una pequeña cantidad de posibles marcadores. La persona ordinariamente capacitada en la técnica está familiarizada con tales marcadores. Se prefieren marcadores diferentes, dependiendo del organismo y del método de selección.

Se sabe que después de una integración estable o transitoria de secuencias de acido nucleico en las células de una planta, sólo una minoría de las células incorpora el ADN foráneo y, si se desea, lo integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión utilizado y de la técnica de transfección utilizada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce usualmente un gen que codifca un marcador seleccionable (tal como aquellos descritos anteriormente) en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden ser utilizados, por ejemplo, en mutantes en los cuales estos genes no son funcionales, por ejemplo, por medio de la supresión mediante métodos convencionales. Además, se pueden introducir las moléculas de la secuencia de ácido nucleico que codifican un marcador seleccionable en una célula huésped en el mismo vector que contiene Ia secuencia que codifica los polipéptidos de Ia invención o que se utilizan en los métodos de la invención, o también en un vector separado. Las células que han sido transfectadas en forma estable con la secuencia de ácido nucleico introducida pueden ser identificadas por ejemplo mediante selección (por ejemplo, las células que han integrado el marcador seleccionable sobreviven mientras que las otras células mueren).

Ya que los genes marcadores, particularmente los genes para resistencia a los antibióticos y herbicidas, no se requieren más o no son deseables en la célula huésped transgénica una vez que se han sido introducidos con éxito las secuencias de ácido nucleico, el proceso de acuerdo con Ia invención para introducir las secuencias de ácido nucleico emplea en forma conveniente técnicas que permiten Ia remoción o escisión de estos genes marcadores. Un de tales métodos es el que se conoce como cotransformación. El método de cotransformación emplea dos vectores en forma simultánea para la transformación, un vector que porta la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención y un segundo vector que porta el gen o los genes marcadores. Una gran proporción de transformantes recibe, o, en el caso de las plantas, incluye (hasta 40% o más de los transformantes), ambos vectores. En el caso de la transformación con Agrobacterias, los transformantes usualmente reciben solamente una parte del vector, es decir la secuencia flanqueada por el ADN-T, la cual usualmente representa el casete de expresión. Los genes marcadores pueden ser removidos posteriormente de la planta transformada por medio de cruzamientos. En otro método, los genes marcadores integrados en un transposón se utilizan para la transformación junto con la secuencia de ácido nucleico deseada (conocida como Ia tecnología Ac/Ds). Los transformantes se pueden cruzar con una fuente de transposasa o se transforman los transformantes con un constructo de la secuencia de ácido nucleico que confiere la expresión de una transposasa, en forma transitoria o estable. En algunos casos (aproximadamente el 10%), el transposón salta fuera del genoma de la célula huésped una vez a tenido lugar la transformación en forma exitosa y se pierde. En otro número de casos, el transposón salta a una ubicación diferente. En estos casos el gen marcador debe ser eliminado mediante la realización de cruzamientos. En microbiología, se desarrollaron técnicas que hacen posible, o facilitan, la detección de tales eventos. Un método ventajoso adicional se fundamenta en lo que se conoce como sistemas de recombinación, cuya ventaja es que se puede prescindir de la eliminación por cruzamiento. EI sistema más conocido de este tipo es el que se conoce como sistema Cre/Iox. Cre1 es una recombinasa que remueve las secuencias localizadas entre la secuencias de IoxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias de IoxP, es eliminado una vez que ha tenido lugar con éxito la transformación, por medio de la expresión de la recombinasa. Otros sistemas de recombinación son los sistemas HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255 - 22267; Velmurugan et aI., J. Cell Biol., 149, 2000: 553 - 566). Es posible una integración específica del sitio en el genoma de la planta de las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Naturalmente, estos métodos se pueden aplicar también a microorganismos tales como levaduras, hongos o bacterias.

Transgénico / Transgén / Recombinante

Para los propósitos de la invención, "transgénico", “transgén" o "recombinante" significan con respecto, por ejemplo, a una secuencia de ácido nucleico, un casete de expresión, una construcción génica o un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico o un organismo transformado con las secuencias de ácido nucleico, los casetes de expresión o los vectores de acuerdo con la invención, todos aquellos constructos logrados por métodos recombinantes en los cuales o bien

(a)

las secuencias de ácido nucleico que codifcan las proteína útiles en los métodos de Ia invención, o

(b)

la(s) secuencia(s) genética(s) de control que está(n) operativamente enlazada(s) con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención, por ejemplo un promotor, o

(c)

a ) y b)

no están localizadas en su ambiente genético natural o han sido modificadas por métodos recombinantes, siendo posible que la modifcación tomara la forma, por ejemplo, de una sustitución, adición, supresión, inversión o inserción de uno o más residuos nucleótidos. Se entiende que el ambiente genético natural signifca el locus genómico o cromosómico natural en la planta original o Ia presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácido nucleico es preferiblemente retenida, al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos en un costado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, Preferiblemente de al menos 500 pb, especialmente preferiblemente de al menos 100 pb, lo más preferible al menos 5000 pb. Un casete de expresión de origen natural - por ejemplo la combinación de origen natural del promotor natural de las secuencias de ácido nucleico con la correspondiente secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido útil en los métodos de la presente invención, como se definió anteriormente - convierte un casete de expresión transgénica cuando este casete de expresión es modificado por métodos sintéticos no naturales (“artificiales”) tales como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Los métodos adecuados son descritos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5.565.350 o en WO 00/15815.

Una planta transgénica para los propósitos de la invención se entiende entonces que significa, como se indicó anteriormente, que las secuencias de ácido nucleico utilizadas en el método de la invención no están en su locus natural en el genoma de dicha planta, siendo posible para las secuencias de ácido nucleico que sean expresadas en forma homóloga o heteróloga. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, transgénico también signifca que, mientras las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o utilizadas en el método de la invención, estén en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia ha sido modificada y con respecto a la secuencia natural, y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales han sido modificadas. Transgénico Preferiblemente signifca que la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en un locus no natural en el genoma, es decir, que tiene lugar una expresión homóloga o, Preferiblemente

heteróloga de las secuencias de ácido nucleico. Las plantas transgénicas preferidas se mencionan en Ia presente invención.

Transformación

El término “introducción” o "transformación" a los cuales se hace referencia aquí, abarcan la transferencia de un polinucleótido exógeno dentro de una célula huésped, independientemente del método utilizado para la transferencia. El tejido de la planta capaz de propagación clonal posterior, ya sea por medio de organogénesis o de embriogénesis, puede ser transformado con una construcción genética de la presente invención y se puede regenerar una planta entera a partir del mismo. El tejido particular escogido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles y más adecuados, para la especie particular que va a ser transformada. Los ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hoja, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, mega gametofitos, tejido del callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, yemas axilares, y meristemas de la raíz), y tejido meristemático inducido (por ejemplo, meristema del cotiledón y meristema del hipocotiledón). El polinucleótido puede ser introducido en forma transitoria o estable en una célula huésped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido. En forma alternativa, puede integrarse al genoma huésped. La célula de la planta transformada resultante puede ser luego utilizada para regenerar una planta transformada en una forma conocida por las personas ordinariamente capacitadas en la técnica.

La transferencia de genes foráneos dentro del genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de una especie de planta es hoy en día una técnica bastante rutinaria. En forma conveniente, se puede utilizar cualquiera de los diferentes métodos de transformación para introducir el gen de interés en una célula ancestral adecuada. Los métodos descritos para Ia transformación y regeneración de plantas a partir de tejidos de la planta o de células de la planta pueden ser utilizados para una transformación transitoria o estable. Los métodos de transformación incluyen el uso de Iiposomas, electroporación, productos químicos que aumentan Ia incorporación de ADN libre, inyección del ADN directamente a la planta, bombardeo de partículas, transformación que utiliza virus o polen y microproyección. Los métodos pueden ser seleccionados a partir del método de calcio/polietilén glicol para protoplastos (Krens, F. A. et al., (1982) Nature 296, 72 - 74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363 - 373); electroporación de protoplastos (Shillito R. D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099 - 1102); microinyección en material de la planta (Crossway A et al, (1986) Mol. Gen Genet 202: 179 - 185); bombardeo con partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein T. M. et al, (1987) Nature 327: 70) infección con virus (que no se integran) y similares. Las plantas transgénicas, que incluyen plantas de cultivo transgénicas, son producidas Preferiblemente mediante transformación mediada por Agrobacterium. Un método de transformación conveniente es la transformación in planta. Para este propósito, es posible, por ejemplo, permitir que las agrobacterias actúen en las semillas de la planta o inocular el meristema de Ia planta con las agrobacterias. Ha probado ser particularmente conveniente de acuerdo con la invención, permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúen sobre la planta intacta

o al menos sobre los primordios de la flor. Posteriormente se deja que se desarrolle la planta hasta obtener las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735 - 743). Los métodos para transformación del arroz mediados por Agrobacterium incluyen métodos bien conocidos para la transformación del arroz, tales como los descritos en cualquiera de las siguientes documentos: solicitud de patente europea EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612 - 617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491 - 506, 1993), Hiei el al. (Plant J 6 (2): 271 - 282, 1994). En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es el descrito ya sea en Ishida el al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745 - 50, 1996) o en Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13 - 22, 2002). Dichos métodos son descritos además a modo de ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128 - 143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205 - 225). Las secuencias de ácido nucleico o el constructo que va a ser expresado es clonado preferiblemente en un vector, el cual es adecuado para la transformación de Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Las agrobacterias transformadas por dicho vector pueden ser luego utilizadas en una forma conocida para la transformación de plantas, tales como las plantas utilizadas como modelo, del tipo Arabidopsis (Arabidopsis thaliana no es considerada dentro del alcance de la presente invención como una planta de cultivo), o plantas de cultivo tales como, por ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo, mediante la inmersión de las hojas magulladas o picadas en una solución de agrobacterias y luego se cultivan en medios adecuados. La transformación de las plantas por medio del Agrobacterium tumefaciens es descrita, por ejemplo, en Höfgen y Willmitzer en Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce, entre otros, a partir de F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, páginas 15 - 38.

Además de la transformación de células somáticas, las cuales tienen que ser luego regeneradas en plantas intactas, también es posible transformar las células de meristemas de la planta y en particular aquellas células que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando lugar a plantas transgénicas. De este modo, por ejemplo, se tratan las semillas de Arabidopsis con agrobacterias y se obtienen las semillas de las planta en desarrollo de las cuales una cierta proporción se transforma y de este modo se vuelven transgénicas. [Feldman, K. A. y Marks M. D. (1987). Mol Gen Genet 208: 274 - 289; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chua y J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, páginas 274 289]. Los métodos alternativos se basan en la remoción repetida de las inflorescencias y la incubación del sitio de escisión en el centro de la roseta con las agrobacterias transformadas, por lo que pueden obtenerse igualmente

semillas transformadas en un momento posterior en el tiempo (Chang (1994). Plant J. 5: 551 - 558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363 - 370). Sin embargo, un método especialmente efectivo es el método de infiltración al vacío con sus modificaciones tales como el método de "inmersión foral”. En el caso de infiltración al vacío de Arabidopsis, se tratan plantas intactas bajo presión reducida con una suspensión de agrobacterias [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194 - 1199], mientras que en el caso del método de la "inmersión floral" se incuba el tejido floral en desarrollo brevemente con una suspensión de agrobacterias tratada con un tensoactivo [CIough, S. J. y Bent A. F. (1998). The Plant J. 16, 735 - 743]. Se recolecta una cierta proporción de semillas transgénicas en ambos casos, y estas semillas pueden distinguirse de las semillas no transgénicas mediante el cultivo bajo las condiciones selectivas anteriormente descritas. Además, la transformación estable de los plástidos es ventajosa porque los plástidos se heredan del progenitor en la mayoría de los cultivos reduciendo o eliminando el riesgo de flujo transgénico a través del polen. La transformación del genoma del cloroplasto se logra generalmente mediante un proceso que ha sido presentado esquemáticamente en Klaus et aI., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225 - 229]. En resumen, las secuencias que van a ser transformadas se clonan junto con un gen marcador seleccionable entre secuencias de flanqueo homólogas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias de fanqueo homólogas dirigen la integración específica del sitio en el plastoma. La transformación plastidial ha sido descrita para muchas especies de plantas diferentes y se presenta una visión de conjunto en Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3): 425 - 38 o en Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20 - 28. Otro avance biotecnológico ha sido informado recientemente en la forma de transformantes del plástido libres de marcadores, que pueden producidos mediante un gen marcador cointegrado en forma transitoria (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225 - 229).

Marcación de la activación del ADN-T

La marcación de la activación del ADN-T (Hayashi et al. Science (1992) 1350 - 1353), involucra la inserción del ADN-T, que contiene usualmente un promotor (puede ser también un mejorador de la traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 kb secuencia arriba o secuencia abajo de la región de codificación de un gen en una configuración tal que el promotor dirige la expresión del gen objetivo. Típicamente, la regulación de la expresión del gen objetivo por su promotor natural se interrumpe y el gen cae bajo el control del promotor recientemente introducido. EI promotor está típicamente embebido en un ADN-T. Este ADN-T se inserta al azar en el genoma de la planta, por ejemplo, a través de la infección con Agrobacterium y conduce a la expresión modificada de los genes cerca del ADN-T insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la expresión modificada de los genes próximos al promotor introducido.

TILLING

El término “TILLING” (por sus siglas en inglés) es una abreviatura de “detección de lesiones locales inducidas en genomas" y se refiere a una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas con expresión y/o actividad modificada. TILLING también permite la selección de plantas que transportan tales variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden exhibir expresión modificada, ya sea en intensidad o en localización o en sincronización (si las mutaciones afectan al promotor por ejemplo). Estas variantes mutantes pueden exhibir mayor actividad que la exhibida por el gen en su forma natural. TILLING combina mutagénesis de alta densidad con métodos de selección de alto rendimiento. Las etapas típicamente seguidas en TILLING son: (a) mutagénesis EMS (Redei G. P. y Koncz C (1992) en Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapur, World Scientifc Publishing Co, páginas 16 - 82; Feldmann et al., (1994) en Meyerowitz E. M., Somerville C. R., eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, páginas 137 - 172; Lightner J y Caspar T (1998) en J Martinez-Zapater, J Salinas, eds. Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, páginas 91 - 104); (b) preparación y reunión del ADN de individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización y apareamiento para permitir Ia formación de heterodúplex; (e) DHPLC, donde la presencia de un heterodúplex en un consolidado se detecta como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación del individuo mutante; y (g) secuenciación del producto de PCR mutante. Los métodos para TILLING son bien conocidos en el arte (McCaIIum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455 - 457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145 - 50).

Recombinación homóloga

La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de una secuencia de ácido nucleico seleccionada en una posición seleccionada definida. La recombinación homóloga es una tecnología estándar utilizada en forma rutinaria en ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levadura o el musgo Physcomitrella. Los métodos para llevar a cabo la recombinación homóloga en plantas han sido descritos no sólo para las plantas modelo (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077 - 84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada et al. (2002) Nat Biotech 2000): 1030 - 4; Lida y Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132 - 8).

Rendimiento

EI término “rendimiento" en general significa una producción medible de valor económico, típicamente relacionado

con un cultivo específco, con un área, y con un periodo de tiempo. Las partes de plantas individuales contribuyen en forma directa al rendimiento con base en su cantidad, tamaño y/o peso, o el rendimiento real es el rendimiento por acre para un cultivo y el año, que se determina mediante la división de la producción total (incluye tanto producción cosechada como tasada) por los acres plantados. El término ‘rendimiento’ de una planta puede referirse a la biomasa vegetal, a órganos reproductivos, y/o a propágalos (tales como semillas) de esa planta.

Vigor temprano

El término “vigor temprano” se refere a un crecimiento bien balanceado, activo y saludable, especialmente durante las etapas tempranas del desarrollo de la planta, y puede resultar de una mayor aptitud de la planta, debido, por ejemplo, a que las plantas se adaptan mejor a su ambiente (es decir, la optimización del uso de los recursos energéticos y la repartición entre brote y raíz). Las plantas que tiene vigor temprano también muestran una mayor supervivencia de las plántulas y un mejor establecimiento del cultivo, lo qua a menudo resulta en campos muy uniformes (con el desarrollo del cultivo en forma uniforme, es decir, donde la mayoría de las plantas alcanzan las diferentes etapas del desarrollo sustancialmente al mismo tiempo), y a menudo con un rendimiento mejor y superior. Por Io tanto, el vigor temprano puede ser determinado midiendo diferentes factores, tales como el peso de mil granos, el porcentaje de germinación, el porcentaje de emergencia, el desarrollo de las plántulas, la altura de las plántulas, la longitud de la raíz, Ia biomasa de la raíz y de los brotes y muchos más.

Incremento / Mejoramiento / Intensificación

Los términos “incremento”, “mejoramiento” o “intensificación” son intercambiables y se entienden en el sentido de la aplicación de al menos 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10%, Preferiblemente de al menos 15% o 20%, más preferiblemente 25%, 30%, 35% o 40% de más rendimiento y/o desarrollo en comparación con las plantas de control según se define aquí.

Rendimiento de semillas

El incremento en el rendimiento de semillas puede manifestarse en sí mismo en una o más de las formas: a) un incremento en la biomasa de la semilla (peso total de la semilla) el cual puede ser con base en una semilla individual y/o por planta y/o por hectárea o acre, b) mayor número de flores por panícula y/o por planta; c) mayor número de semillas (llenas); d) mayor proporción de llenado de las semillas (la cual se expresa como la relación entre la cantidad de semilla llenas dividido por la cantidad total de semillas); e) mayor índice de cosecha, el cual se expresa como una relación del rendimiento de las partes cosechables, tal como las semillas, dividido por la biomasa total; y f) mayor número de panículas primarias, (g) mayor peso de mil granos (PMG), el cual se extrapola a partir del recuento de la cantidad de semillas llenas y su peso total. Un mayor PMG puede ser el resultado de un mayor tamaño de la semilla y/o del peso de la semilla, y también puede ser el resultado de un incremento en el tamaño del embrión y/o del endospermo.

Un incremento en el rendimiento de semillas puede manifestarse también como un incremento en el tamaño y/o el volumen de la semilla. Además, un incremento en el rendimiento puede manifestarse también como un incremento en el área de la semilla y/o de la longitud de la semilla y/o del ancho de la semilla y/o del perímetro de la semilla. Un mayor rendimiento puede dar como resultado también una arquitectura modificada, o puede ocurrir debido a una arquitectura modificada.

Índice de Verdor

El “índice de verdor” tal como se utiliza aquí descripción se calcula a partir de las imágenes digitales de las plantas. Para cada pixel perteneciente a la planta objetivo sobre la imagen, se calcula la relación del valor verde versus el valor rojo (en el modelo RGB para codificación del color). El índice de verdor se expresa como el porcentaje de píxeles para los cuales la relación verde con respecto a rojo excede un umbral dado. Bajo condiciones normales de desarrollo, bajo condiciones de desarrollo con estrés por salinidad, y bajo condiciones de desarrollo con una disponibilidad reducida de nutrientes, el índice de verdor de las planta se mide en la última imagen antes del florecimiento. Por el contrario, bajo condiciones de desarrollo con estrés por sequía, el índice de verdor de las plantas se mide en la primera imagen después de la sequía.

Planta

El término “planta" tal como se utiliza aquí, abarca plantas enteras, ancestros y progenie de las plantas y partes de la planta, que incluyen semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluyendo tubérculos), flores, y tejidos y órganos, en donde cada uno de los anteriormente mencionados incluye la secuencia del gen/ácido nucleico de interés. El término “planta” abarca además células de la planta, cultivos en suspensión, tejido del callo, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, nuevamente en donde cada uno de los mencionados anteriormente incluye la secuencia del gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de Ia invención incluyen a todas las plantas que

pertenezcan a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo forraje y leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stoionifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Anfocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo, Avena satíva, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, BertholIetia excelsea, Beta vulgaris, Brassíca spp. (por ejemplo, Brassíca napus, y Brassíca rapa spp. [canola, colza, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus Iongan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por ejemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus Carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo, Giycine max, Soja hispida o Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo, Helianthus annuus), HemerocalIis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea baratas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinans, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutanguia, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon iycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Matus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, MeIilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por ejemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp.. Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por ejemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum), Sorgo bicolor, Spinacía spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo, Triticum aestivum, Tritícum durum, Triticum turgidum, Triticum hybemum, Tritícum macha, Triticum sativum o Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccínium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania paiustris, Ziziphus spp., entre otras.

Descripción detallada de la invención

Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que al incrementar la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT como se define aquí, produce plantas que tienen más características relacionadas con el rendimiento con relación a las plantas de control. De acuerdo con una primera forma de realización, la presente invención provee un método para incrementar las características relacionadas con el rendimiento en plantas con relación a las plantas que sirven como control, que comprende incrementar la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifca un polipéptido AMT, siendo dichas características relacionadas con el rendimiento vigor temprano, biomasa, y/o rendimiento de semillas.

Un método preferido para incrementar la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT es mediante la introducción y expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifca un polipéptido AMT.

Cualquier referencia en adelante a una “proteína útil en los métodos de Ia invención” se entiende que significa un polipéptido AMT como se define aquí. Cualquier referencia que se haga en adelante a una "secuencia de ácido nucleico útil en los métodos de la invención" se entiende que significa una secuencia de ácido nucleico capaz de codifcar dicho polipéptido AMT. La secuencia de ácido nucleico que va a ser introducida en una planta (y por lo tanto útil para la realización de los métodos de la invención) es cualquier secuencia de ácido nucleico que codifca el tipo de polipéptido, que será descrito ahora, en adelante también denominado "secuencia de ácido nucleico para el AMT" o “gen AMT”.

Un “polipéptido AMT” como se define aquí se refiere a cualquier polipéptido que contiene un dominio que tiene en orden creciente de preferencia al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más identidad de secuencia de aminoácidos con un Dominio Conservado (DC) como se representa mediante la SEQ ID NO: 33. Un “polipéptido AMT” como se describe aquí se refiere a cualquier polipéptido que comprende: (i) un dominio transportador de amonio con un acceso InterPro IPR0001905; y (ii) al menos 10 hélices que abarcan toda la membrana.

Un “polipéptido AMT” como se describe aquí se refiere a cualquier secuencia de polipéptidos que cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético AMT, tal como aquel descrito en la Figura 2, se agrupa con el clado de polipéptidos AMT que comprende la secuencia de polipéptidos como la reportada por la SEQ ID NO: 2 (encerrada en un círculo en la Figura 2) en vez de con cualquier otro clado AMT. Adicionalmente, un “polipéptido AMT” como se

define aquí se refiere a cualquier polipéptido que contiene en orden creciente de preferencia al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido AMT como el representado por la SEQ ID NO: 2.

Un “polipéptido AMT” como se describe aquí es capaz de complementar una cepa de levadura MLY131 que carece de todos los tres transportadores de amonio de levadura nativa (Hildebrand (2005) J Phycol 41: 105 - 113).

Los términos “dominio” y “motivo” se definen aquí en la sección de “definiciones". Existen bases de datos especializadas para la identificación de dominios, por ejemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 95, 5857 - 5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242 -244, lnterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315 - 318), Prosite (Bucher y Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (ln) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., páginas 53 - 61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et aI., Nucl. Acids. Res. 32: D134 - D137, (2004)), o Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276 - 280 (2002). Un conjunto de herramientas para el análisis in silico de secuencias de proteína está disponible en el servidor de proteómicos ExPASY (Instituto Suizo de Bioinformática (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784 - 3788 (2003)). El análisis de la secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 2 se presenta más abajo aquí en el Ejemplo 4. Por ejemplo, un polipéptido AMT como se representa mediante la SEQ ID NO: 2 comprende un dominio transportador de amonio con un número de acceso lnterPro, IPR0001905. Los dominios se pueden identificar también utilizando técnicas de rutina, tales como mediante la alineación de secuencias. Una alineación de los polipéptidos de la Tabla A aquí, se muestra en la Figura 3. Tales alineaciones son útiles para identificar los dominios más conservados entre los polipéptidos AMT, tales como el Dominio Conservado (DC) como el representado por medio de la SEQ ID NO: 33 (comprendida en la SEQ ID NO: 2).

Los métodos para el alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica; tales métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP utiliza el algoritmo de Needleman & Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443 - 453) para hallar el alineamiento global (es decir, expansión de las secuencias completas) de dos secuencias que maximizan la cantidad de coincidencias y minimizan el número de brechas. El algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403 - 10) calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar el análisis con BLAST está disponible al público a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI por sus siglas en inglés). Los homólogos se pueden identificar fácilmente utilizando, por ejemplo, el algoritmo de alineación de secuencias múltiples ClustalW (versión 1.83), con los parámetros predeterminados de alineamiento por pares, y un método de asignación de puntajes en porcentaje. Los porcentajes globales de similitud y de identidad también se pueden determinar utilizando uno de los métodos disponibles en el paquete de software MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics, 10: 29. MatGAT: una aplicación que genera matrices de similitud/identidad utilizando secuencias de proteínas o de ADN). Se puede realizar una edición manual menor para optimizar el alineamiento entre los motivos conservados, como seria evidente para una persona normalmente capacitada en la técnica. Además, en lugar de utilizar secuencias de longitud completa para la identificación de homólogos, se pueden utilizar también dominios específcos. Los valores de identidad de secuencia se pueden determinar sobre la secuencia completa del ácido nucleico o la secuencia del polipéptido o sobre dominios seleccionados o el(los) motivo(s) conservado(s), utilizando los programas mencionados anteriormente que utilizan los parámetros predeterminados. El Ejemplo 3 describe aquí en la Tabla B el porcentaje de identidad entre el polipéptido AMT como el representado mediante la SEQ ID NO: 2 y los polipéptidos AMT enumerados en la Tabla A, el cual puede tener una identidad de secuencia de aminoácidos tan baja como del 44%. El porcentaje de identidad puede ser incrementado si el cálculo de identidad se realiza entre el Dominio Conservado (DC) como se representa por la SEQ lD NO: 33 (comprendida en la SEQ lD NO: 2 y en la SEQ lD NO: 4) y el Dominio Conservado de los polipéptidos AMT de la Tabla A y representado en la Figura 3. Los resultados de tales cálculos se presentan en la Tabla B1 de la presente solicitud.

La tarea de la predicción de la localización de la proteína subcelular es importante y bien estudiada. Conocer la localización de Ia proteína ayuda a elucidar su función. Los métodos experimentales para Ia localización de la proteína varían desde inmunolocalización hasta marcación de proteínas utilizando proteína fuorescente verde (GFP por sus siglas en inglés) o beta-glucuronidasa (GUS). Dichos métodos son precisos si bien son muy laboriosos en comparación con los métodos computacionales. Recientemente se ha realizado un avance importante en la predicción computacional de la localización de la proteína a partir de los datos de la secuencia. Entre los algoritmos bien conocidos por una persona normalmente capacitada en la técnica se encuentran disponibles en las herramientas ExPASy Proteomics de propiedad del Swiss Institute for Bioinformatics, por ejemplo, PSort, TargetP, ChIoroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, SignaIP, TMHMM y otras. La predicción de la localización subcelular de un polipéptido AMT como el representado por la SEQ ID NO: 2 se describe en el Ejemplo 5 de la presente solicitud.

Además, los polipéptidos AMT útiles en los métodos de la presente invención (al menos en su forma nativa) típicamente son capaces de transportar amonio a través de las membranas. Existen muchos ensayos para medir tal actividad de captación, incluidos ensayos de complementación de una cepa de levadura con transportadores defectuosos de amonio endógeno (Ninneman et al. (1994) EMBO J 13: 3464-3471), ensayos de captación en

levadura, Xenopus oocyctes (Ludewig et al. (2003) J Biol Chem 278: 45603-45610), células de la planta, raíces de la planta (Yuan et al. (2007) Plant Phys 143: 732-744), y plantas enteras (Hoque et al. (2006) Functional Plant Biology

33: 153-163).

La presente invención se ilustra mediante la transformación de plantas con la secuencia de ácido nucleico representada por la SEQ ID NO: 3 (comprendida en la SEQ ID NO: 1), que codifica la secuencia del polipéptido AMT de la SEQ ID NO: 4 (comprendida en la SEQ ID NO: 2). Sin embargo, Ia realización de la invención no se restringe a estas secuencias; los métodos de la invención se pueden realizar en forma conveniente utilizando cualquier secuencia de ácido nucleico que codifque un polipéptido AMT como se define aquí.

Ejemplos de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos AMT se exponen en la Tabla A del Ejemplo 1 aquí. Tales secuencias de ácido nucleico son útiles para llevar a cabo los métodos de la invención. Las secuencias de polipéptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1 son ejemplos de secuencias de ortólogos y parálogos del polipéptido AMT representadas por la SEQ ID NO: 2, o por la SEQ ID NO: 4, siendo los términos “ortólogos” y "parálogos” como se los define aquí. Otros ortólogos y parálogos pueden ser fácilmente identificados llevando a cabo una búsqueda denominada blast recíproco. Típicamente, esto implica un primer BLAST que involucra el someter una secuencia de consulta a BLAST (por ejemplo utilizando cualquiera de las secuencias enlistadas en la Tabla A del Ejemplo 1) contra cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos NCBI disponible al público. BLASTN o TBLASTX (que utilizan valores estándar predeterminados) se utilizan generalmente cuando se parte de una secuencia nucleotídica, y BLASTP o TBLASTN (que utilizan valores estándar predeterminados) cuando se parte de una secuencia de proteína. Los resultados de BLAST opcionalmente se pueden filtrar. Las secuencias de longitud completa ya sea de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados, se someten luego nuevamente a BLAST (segundo BLAST) contra las secuencias del organismo a partir del cual se deriva la secuencia de consulta (donde Ia secuencia de consulta es la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, el segundo BLAST sería por lo tanto contra las secuencias de Phaeodactylum tricomutum). Se comparan luego los resultados del primero y el segundo BLAST. Se identifica un parálogo si una respuesta pertinente de alto rango del primer blast es de la misma especie que aquella de la cual se deriva la secuencia de consulta, un BLAST posterior resulta idealmente luego en la secuencia de consulta como una respuesta pertinente más alta; se identifica un ortólogo si una respuesta pertinente de alto rango en el primer BLAST no proviene de la misma especie que aquella de Ia cual se deriva la secuencia de consulta, y preferiblemente resulta del BLAST posterior estando la secuencia de consulta entre las respuestas pertinentes más altas.

Las respuestas pertinentes de alto rango son aquellas que tienen un valor E bajo. Cuanto más bajo es el valor E, más significativo es el puntaje (o en otras palabras, es más baja la posibilidad de que la respuesta pertinente sea hallada por casualidad). La computación del valor E es bien conocida en Ia técnica. Además de los valores E, las comparaciones también se les da puntaje por identidad porcentual. La identidad porcentual se refiere a la cantidad de nucleótidos idénticos (o aminoácidos) entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptidos) comparadas sobre una longitud particular. En el caso de grandes familias, se puede utilizar ClustalW, seguido de un árbol filogenético (neighbour joining tree), para ayudar a visualizar el agrupamiento de genes relacionados y para identificar ortólogos y parálogos.

Las variantes de ácido nucleico también pueden ser útiles para llevar a la práctica los métodos de la invención. Los ejemplos de tales variantes incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de cualquiera de las secuencias de polipéptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, siendo los términos “homólogo" y “derivado” como se definieron aquí. También son útiles en los métodos de la invención las secuencias de ácido nucleico que codifican homólogos y derivados de ortólogos o parálogos de cualquiera de las secuencias de polipéptidos que se exponen en la Tabla A del Ejemplo 1. Los homólogos y derivados útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica y funcional que la proteína no modificada de la cual se derivan.

Otras variantes de ácido nucleico útiles en la práctica de los métodos de la invención incluyen porciones de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos AMT, secuencias de ácido nucleico que hibridan a secuencias de ácido nucleico que codifcan polipéptidos AMT, variantes de empalme de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos AMT, variantes alélicas de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos AMT y variantes de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos AMT obtenidos por medio de transposición de genes. Los términos secuencias de hibridación, variante de empalme, variante alélica y transposición de genes son como se describe aquí.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos AMT no necesitan ser secuencias de ácido nucleico de longitud completa, ya que el desempeño de los métodos de la invención no confía en el uso de secuencias de ácido nucleico de longitud completa. De acuerdo con la presente invención, se provee un método para aumentar las características relacionados con el rendimiento, en las plantas, que comprende la introducción y la expresión en una planta de una porción de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o una porción de una secuencia de ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de polipéptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, en donde dicha porción es una porción de la SEQ ID NO: 1 que tiene al menos 1380 o más nucleótidos de longitud.

Una porción de una secuencia de ácido nucleico se puede preparar, por ejemplo, haciendo una o más supresiones a la secuencia de ácido nucleico. Las porciones se pueden utilizar en forma aislada o se pueden fusionar a otras secuencias codifcadoras (o no codifcadoras) con el propósito de producir, por ejemplo, una proteína que combina diferentes actividades. Cuando se fusionan a otras secuencias codificadoras, el polipéptido resultante producido después de la traducción puede ser más grande que el predicho para la porción de proteína.

Las porciones útiles en los métodos de la invención, codifican un polipéptido AMT como se define aquí, y tienen sustancialmente Ia misma actividad biológica que las secuencias de polipéptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1. Preferiblemente, la porción es una porción de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o es una porción de una secuencia de ácido nucleico que codifica un ortólogo o un parálogo de cualquiera de las secuencias de polipéptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1. Preferiblemente la porción es, en orden creciente de preferencia al menos de 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1380 o más nucleótidos consecutivos de longitud, siendo los nucleótidos consecutivos de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o de una secuencia de ácido nucleico que codifica un ortólogo o un parálogo de cualquiera de las secuencias de polipéptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1. Preferiblemente, Ia porción es una porción de una secuencia nucleica que codifica un polipéptido de una secuencia de polipéptidos que comprende un dominio que tiene en orden creciente de preferencia al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más con un Dominio Conservado (DC) como el representado por la SEQ ID NO: 33. Más preferiblemente, la porción es una porción de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1. Lo más preferible, la porción es como la representada por la SEQ ID NO: 3

Otra variante de la secuencia de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar, en condiciones de rigurosidad reducida, preferiblemente bajo condiciones rigurosas, con una secuencia de ácido nucleico que codifca un polipéptido AMT como se define aquí, o con una porción como se define aquí.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para incrementar las características relacionadas con el rendimiento en plantas, que comprende la introducción y expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o que comprende la introducción y expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con una secuencia de ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, en donde dicha secuencia de ácido nucleico es capaz de hibridar con el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1.

Las secuencias de hibridación útiles en los métodos de la invención codifcan un polipéptido AMT como se define aquí, y tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias polipeptídicas presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1. Preferiblemente, Ia secuencia de hibridación es capaz de hibridar con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico presentadas en Ia Tabla A del Ejemplo 1, o a una porción de cualquiera de estas secuencias, siendo una porción como se definió anteriormente, o donde la secuencia de hibridación es capaz de hibridar con una secuencia de ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de una cualquiera de las secuencias de polipéptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1. Preferiblemente, la secuencia de hibridación es capaz de hibridar con una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptidos que comprende un dominio que tiene en orden creciente de preferencia al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 50%, 55%. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más con un Domino Conservado (DC) como se representa mediante la SEQ ID NO: 33. Más preferiblemente, la secuencia de hibridación es capaz de hibridar con una secuencia de ácido nucleico como la representada mediante la SEQ ID NO: 1 o una porción de la misma.

Otra variante de la secuencia de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es una variante de empalme que codifca un polipéptido AMT como se definió aquí anteriormente, siendo una variante de empalme como se definió aquí.

De acuerdo con Ia presente invención, se divulga un método para incrementar las características relacionadas con el rendimiento, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de empalme de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o una variante de empalme de una secuencia de ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de polipéptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1.

Las variantes de empalme preferidas son variantes de empalme de una secuencia de ácido nucleico representada por la SEQ lD NO: 1, o una variante de empalme de una secuencia de ácido nucleico que codifca un ortólogo o un parálogo de Ia SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, la variante de empalme es una variante de empalme de una secuencia de ácido nucleico que codifca una secuencia de polipéptidos que comprende un dominio que tiene en orden creciente de preferencia de al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90°/o, 95%, 98%, 99% o más con un Domino Conservado (DC) como se representa mediante la SEQ ID NO: 33.

Otra variante de secuencia de ácido nucleico útil en la realización de los métodos de la invención es una variante alélica de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT como se definió aquí anteriormente, siendo una variante alélica como la definida aquí.

De acuerdo con la presente invención, se provee un método para incrementar las características relacionadas con el rendimiento, que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de una secuencia de ácido nucleico que codifca un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias polipeptídicas presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1.

Las variantes alélicas útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica que el polipéptido AMT de Ia SEQ ID NO: 2 y cualquiera de las secuencias polipeptídicas descritas en la Tabla A del Ejemplo 1. Existen variantes alélicas en Ia naturaleza, y comprendido dentro de los métodos de la presente invención está el uso de estos alelos naturales. Preferiblemente, la variante alélica es una variante alélica de la SEQ ID NO: 1 o una variante alélica de una secuencia de ácido nucleico que codifica un ortólogo o un parálogo de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, la variante alélica es una variante alélica de una secuencia de polipéptidos que comprende un dominio que tiene en orden creciente de preferencia al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más con un Domino Conservado (DC) como se representa mediante Ia SEQ ID NO: 33

La transposición de genes o la evolución dirigida también se puede utilizar para generar variantes de secuencias de ácido nucleico que codifcan polipéptidos AMT como se definió anteriormente, siendo el término “transposición de genes” como se definió aquí.

De acuerdo con la presente invención, se divulga un método para incrementar las características relacionadas con el rendimiento, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante de una secuencia de ácido nucleico que codifca un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de polipéptidos presentadas en la Tabla A del Ejemplo 1, en donde la variante de la secuencia de ácido nucleico se obtiene por medio de transposición de genes.

Preferiblemente, la variante de la secuencia de ácido nucleico obtenida por transposición de genes codifica una secuencia de polipéptidos que comprende un dominio que tiene en orden creciente de preferencia al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más con un Domino Conservado (DC) como el representado mediante la SEQ ID NO: 33.

Además, también se pueden obtener variantes de la secuencia de ácido nucleico por mutagénesis dirigida al sitio. Varios métodos se encuentran disponibles para lograr una mutagénesis dirigida al sitio, siendo los más comunes los métodos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).

Las secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos AMT pueden derivarse de cualquier fuente natural o artificial. La secuencia de ácido nucleico puede ser modificada a partir de su forma nativa en composición y/o ambiente genómico a través de manipulación humana deliberada. La secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT es del dominio eucariota, preferiblemente del reino Cromalveolata, preferiblemente además de la Heterocaontophyta phylium. Más preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica una un polipéptido AMT es de la clase Bacillariophyceae (diatomeas), y por ejemplo, de los siguientes ordenes: Achnanthales, Bacillariales, Centrales (tales como Thalassiosira pseudonana), Cymbellales, Eunotiales, Mastogloiales, Naviculales, Pennales (tales como Pheaodactylum tricornutum), Rhopalodiales, Surirellales, o Thalassiophysales. Lo más preferible, la secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido AMT es de Pheaodactylum tricornutum.

El desempeño de los métodos de la invención producen plantas que tienen un incremento d características relacionadas con el rendimiento con relación a las plantas que sirven de control. Los términos “rendimiento” y “rendimiento de semilla” se describen con más detalle en la sección de “definiciones” aquí. Tomando el maíz como ejemplo, un incremento de rendimiento se puede manifestar como uno o más de lo siguiente: aumento en el número de plantas establecidas por hectárea o acre, un aumento en el número de mazorcas por planta, un aumento en el número de filas, en el número de granos por fila, peso del grano, peso de mil granos, longitud/diámetro de la mazorca, aumento en la taza de llenado de la semilla (que es el número de semillas llenas dividido por el número total de semillas y multiplicado por 100), entre otros. Tomando el arroz como ejemplo un aumento en el rendimiento se puede manifestar en sí mismo como un aumento en uno o más de lo siguiente: número de plantas por hectárea o acre, número de panículas por planta, número de espiguillas por panícula, número de flores (floretes) por panícula, que se expresa como una relación del número de semillas llenas sobre el número de panículas primarias), aumento en la tasa de llenado de semilla (que es el número de semillas llenas dividido por el número total de semillas y multiplicado por 100), aumento en el peso de mil granos, entre otros.

La presente invención proporciona un método para incrementar las características relacionadas con el crecimiento

de las plantas con relación a las plantas que sirven de control, cuyo método comprende incrementar la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT como se definió aquí, en donde las características relacionadas con el rendimiento son vigor temprano, biomasa, y/o rendimiento de semillas.

Ya que las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención tienen un aumento de características relacionadas con el rendimiento, es probable que estas plantas exhiban una mayor tasa de crecimiento (durante al menos parte de su ciclo de vida), con relación a la tasa de crecimiento de las plantas que sirven como control en una etapa correspondiente en su ciclo de vida.

La mayor tasa de crecimiento puede ser especifica para una o más partes de una planta (incluyendo las semillas), o puede ser sustancialmente a través de la planta completa. Las plantas con una mayor velocidad de crecimiento pueden tener un ciclo vital más corto. El ciclo de vida de una planta puede entenderse como el tiempo necesario para desarrollarse desde una semilla madura seca hasta la etapa donde la planta ha producido semillas maduras secas, en forma similar al material de partida. Este ciclo de vida puede estar influido por factores tales como el vigor temprano, la velocidad de crecimiento, el índice de verdor, el tiempo de floración y la velocidad de maduración de la semilla. El incremento en la velocidad del crecimiento puede tener lugar en una o más etapas en el ciclo de vida de una planta o sustancialmente durante todo el ciclo de vida de la planta. La mayor velocidad de crecimiento durante las etapas tempranas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar un mayor vigor (temprano). El incremento en la velocidad de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta permitiendo que las plantas sean sembradas más tarde y/o cosechadas más pronto de lo que seria posible de otro modo (se puede obtener un efecto similar con un tiempo de floración más temprano; la demora en la floración no es usualmente una característica deseable en los cultivos). Si la velocidad del crecimiento se incrementa lo suficiente, puede permitir el sembrado posterior de semillas de la misma especie de planta (por ejemplo el sembrado y cosecha de plantas de arroz seguido por el sembrado y cosecha de otras plantas de arroz todo dentro de un periodo de crecimiento convencional). De manera similar, si se incrementa suficientemente la velocidad de crecimiento, permitirá el posterior sembrado de diferente especies de planta (por ejemplo sembrado y cosecha de plantas de maíz, seguido por ejemplo, del sembrado y de cosecha opcional de soja, patata o cualquier otra planta adecuada). También se puede cosechar varias veces a partir del mismo rizoma en el caso de algunas plantas de cultivo. La alteración del ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un incremento en la producción anual de biomasa por acre (debido a un incremento en el número de veces (digamos en un año) que cualquier planta particular puede ser cultivada y cosechada). Un incremento en la velocidad de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que sus contrapartes de tipo silvestre, dado que las limitaciones territoriales para el crecimiento de un cultivo a menudo están determinadas por condiciones ambientales adversas ya sea en el momento de la plantación (a principios de la estación) o en el momento de la cosecha (finales de la estación). Estas condiciones adversas se pueden evitar si se acorta el ciclo de la cosecha. La velocidad de crecimiento puede determinarse por medio de la derivación de diferentes parámetros a partir de las curvas de crecimiento; dichos parámetros pueden ser: T-Mid (el tiempo que les toma a las plantas alcanzar 50% de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que les toma a las plantas alcanzar 90% de su tamaño máximo), entre otros.

De acuerdo con una característica preferida de Ia presente invención, el desempeño de los métodos de la invención produce plantas que tienen una mayor tasa de crecimiento con respecto a las plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para incrementar la tasa de crecimiento de las plantas, en donde dicho método comprende incrementar la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT como se definió aquí.

Un incremento de las características relacionadas con el rendimiento se presenta si la planta está bajo condiciones no estresadas o si la planta es expuesta a varios tipos de estrés en comparación con las plantas control cultivadas bajo condiciones comparables. Las plantas típicamente responden a la exposición al estrés creciendo en forma más lenta. En condiciones de estrés severo, la planta puede incluso detener el crecimiento completamente. Un estrés moderado por otro lado se define aquí como cualquier estrés al cual se expone una planta que no produce como resultado que la planta cese su crecimiento completamente sin la capacidad de reanudarlo. Un estrés moderado en el sentido de la invención conduce a una reducción en el crecimiento de las plantas estresadas de menos del 40%, 35% o 30%, preferiblemente menos del 25%, 20% o 15%, más preferiblemente menos de 14%, 13%, 12%, 11% o 10% o menos en comparación con las plantas control bajo condiciones no estresantes. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos con pesticidas) no se encuentran a menudo estreses severos en las plantas de cultivo sembradas. En consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por un estrés moderado a menudo es una característica indeseable para Ia agricultura. Los estreses moderados son los estreses bióticos y/o abióticos (ambientales) de cada temporada a los cuales está expuesta una planta. Los estreses abióticos pueden deberse a sequía o exceso de agua, estrés anaeróbico, estrés por salinidad, toxicidad química, estrés oxidativo y temperaturas calurosas, frías o congelantes. El estrés abiótico puede ser un estrés osmótico causado por un estrés por agua (particularmente debido a sequía), estrés por salinidad, estrés oxidativo o un estrés iónico. Los estreses bióticos son típicamente aquellos estreses causados por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos, nemátodos, e insectos. El término condiciones “no estresantes” como se usa aquí son aquellas condiciones ambientales que permiten el óptimo crecimiento de las plantas. Las personas normalmente capacitadas en el arte son conscientes de las condiciones normales de suelo y las climáticas para una ubicación dada.

El desempeño de los métodos de la invención produce plantas cultivadas bajo condiciones no estresantes o bajo condiciones de estrés moderado que tienen más características relacionadas con el rendimiento, con respecto a plantas de control cultivadas bajo condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para incrementar las características relacionadas con el rendimiento en plantas cultivadas bajo condiciones no estresantes o bajo condiciones de estrés moderado, en donde el método comprende incrementar la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT.

El desempeño de los métodos de acuerdo con la presente invención da lugar a plantas cultivadas bajo condiciones de estrés abiótico que tienen más características relacionadas con el rendimiento con respecto a plantas control cultivadas bajo condiciones de estrés comparables. De acuerdo a lo reportado en Wang et al. (Planta (2003) 218: 1 14), un estrés abiótico conduce a una serie de cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que afectan adversamente el crecimiento y la productividad de la planta. Se sabe que la sequía, salinidad, temperaturas extremas y estrés oxidativo están interconectados y pueden inducir daño celular y de crecimiento a través de mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755 - 1767) describe un grado particularmente elevado de “interferencia” entre el estrés por sequía y el estrés por alta salinidad. Por ejemplo, la sequía y/o la salinización se manifiestan principalmente como estrés osmótico, produciendo la interrupción de la homeostasis y la distribución de iones en la célula. El estrés oxidativo, que con frecuencia acompaña a temperaturas altas o bajas, al estrés por salinidad o por sequía, puede causar desnaturalización de proteínas funcionales y estructurales. Como consecuencia, estos diversos estreses ambientales a menudo activan rutas de señalización celular y respuestas celulares similares, tales como la producción de proteínas por estrés, favorecimiento de la expresión de antioxidantes, acumulación de solutos compatibles y detención del crecimiento. Dado que diversos estreses ambientales activan rutas similares, el ejemplo de la presente invención con estrés por sequía no debe interpretarse como una limitación al estrés por sequía, sino más bien como una selección para indicar la participación de los polipéptidos AMT como se definió anteriormente, en el incremento de las características relacionadas con el rendimiento con respecto a plantas de control cultivadas bajo condiciones de estrés comparable, en estreses abióticos en general.

El término "estrés abiótico” como se define aquí se entiende que significa uno o más de: estrés por agua (causado por sequía o exceso de agua), estrés anaeróbico, estrés por salinidad, estrés por temperatura (causada por temperaturas elevadas, frías o congelantes), estrés por toxicidad química y estrés oxidativo. De acuerdo con un aspecto de la invención, el estrés abiótico es un estrés osmótico, seleccionado de estrés por agua, estrés por salinidad, estrés oxidativo y estrés iónico. Preferiblemente, el estrés por agua es estrés por sequía. El término estrés por salinidad no se restringe a la sal común (NaCl), sino que puede ser cualquier estrés causado por una o más de: NaCl, KCI, LiCI, MgCl2, CaCl2, entre otras.

El desempeño de los métodos de la invención produce plantas que tienen más características relacionadas con el rendimiento, bajo condiciones de estrés abiótico con respecto a las plantas de control cultivadas bajo condiciones de estrés comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para incrementar las características relacionadas con el rendimiento, en plantas cultivadas bajo condiciones de estrés abiótico, en donde el método comprende incrementar la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT. De acuerdo con un aspecto de la invención, el estrés abiótico es un estrés osmótico, seleccionado de uno o más de los siguientes: estrés por agua, estrés por salinidad, estrés oxidativo y estrés iónico.

Otro ejemplo de estrés ambiental abiótico es la disponibilidad reducida de uno o más nutrientes que deben ser asimilados por las plantas para su crecimiento y desarrollo. Debido a la fuerte influencia de la eficiencia de la utilización de la nutrición sobre el rendimiento de la planta y la calidad del producto, se vierte una enorme cantidad de fertilizante en los campos para optimizar el crecimiento y calidad de las plantas. La productividad de las plantas en general está limitada por tres nutrientes principales, fósforo, potasio y nitrógeno, donde usualmente entre estos tres se encuentra el elemento limitante de la velocidad de crecimiento de las plantas. Por lo tanto el elemento nutricional principal requerido para el crecimiento de las plantas es el nitrógeno (N). Es un constituyente de numerosos compuestos importantes hallados en las células vivientes, incluidos aminoácidos, proteínas (enzimas), ácidos nucleicos y clorofila. 1,5% a 2% del material seco de una planta es nitrógeno y aproximadamente 16% de la proteína total de la planta. Por lo tanto, la disponibilidad de nitrógeno es un factor limitante principal para el crecimiento y producción de las plantas de cultivo (Frink et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(4): 1175 - 1180), y tiene también un impacto principal en la acumulación de proteínas y composición de los aminoácidos. Por lo tanto, son de gran interés las plantas de cultivo con más características relacionadas con el rendimiento, cuando se cultivan bajo condiciones limitantes de nitrógeno.

El desempeño de los métodos de la invención produce plantas que crecen bajo condiciones de disponibilidad reducida de nutrientes, particularmente bajo condiciones de disponibilidad reducida de nitrógeno, que tienen más características relacionadas con el rendimiento con respecto a las plantas de control cultivadas bajo condiciones de estrés comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para incrementar las características relacionadas con el rendimiento en plantas cultivadas bajo condiciones de disponibilidad reducida de nutrientes, preferiblemente disponibilidad reducida de nitrógeno, en donde el método comprende incrementar la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifca un polipéptido AMT. La disponibilidad reducida de nutrientes puede resultar de una deficiencia o exceso de nutrientes tales como nitrógeno, fosfatos y

otros compuestos que contienen fósforo, potasio, calcio, cadmio, magnesio, manganeso, hierro y boro, entre otros. Preferiblemente la disponibilidad reducida de nutrientes es disponibilidad reducida de nitrógeno.

La presente invención abarca plantas o partes de las mismas (incluidas semillas) o células de las mismas que pueden ser obtenidas mediante los métodos de acuerdo con la presente invención. Las plantas o partes de las mismas o células de las mismas comprenden un transgén de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT, como se definió anteriormente.

La invención también divulga construcciones y vectores genéticos para facilitar la introducción y/o mayor expresión en plantas de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos AMT como se define aquí. Las construcciones génicas se pueden insertar en los vectores, que pueden estar comercialmente disponibles, adecuados para la transformación en plantas y para la expresión del gen de interés en las células transformadas. La invención también provee el uso de una construcción génica como se define aquí en los métodos de la invención.

En forma más específica, la presente invención divulga una construcción que comprende:

(a)

una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT como se definió anteriormente;

(b)

una o más secuencias control capaces de incrementar la expresión de la secuencia del ácido nucleico de (a); y opcionalmente

(c)

una secuencia de terminación de la transcripción.

Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT es como se definió anteriormente. El término "secuencia control" y “secuencia de terminación" son como se definen aquí.

Preferiblemente, una de las secuencias control de una construcción es un promotor constitutivo aislado de un genoma de una planta. Un ejemplo de un promotor constitutivo es un promotor GOS2, preferiblemente un promotor GOS2 de arroz, más preferiblemente un promotor GOS2 como el representado mediante la SEQ ID NO: 34.

Las plantas se transforman con un vector que comprende cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente. La persona calificada en Ia técnica es muy consciente de los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector a fin de transformar, seleccionar y propagar exitosamente las células huéspedes que contienen la secuencia de interés. La secuencia de interés está operativamente enlazada a una o más secuencias de control (al menos a un promotor).

Convenientemente, se puede utilizar cualquier tipo de promotor, ya sea natural o sintético, para incrementar la expresión de la secuencia de ácido nucleico. Un promotor constitutivo es particularmente útil en los métodos, preferiblemente un promotor constitutivo aislado de un genoma de una planta. El promotor constitutivo de una planta dirige la expresión de una secuencia codificadora en un nivel que está en todos los casos por debajo de aquel obtenido bajo el control de un promotor viral 35S del CaMV.

Otros promotores específicos del órgano, por ejemplo para la expresión preferida en hojas, tallos, tubérculos, meristemas, semillas (embrión y/o endospermo), son útiles para llevar a cabo los métodos de invención. Véase la sección "Definiciones" aquí para las definiciones de los diferentes tipos de promotores.

Debe aclararse que la aplicabilidad de la presente invención no está restringida a una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido AMT, como el representado mediante la SEQ lD NO: 1 o mediante la SEQ ID NO: 3, ni la aplicabilidad de la invención está restringida a la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido AMT cuando está dirigida por un promotor constitutivo.

Opcionalmente, se pueden utilizar una o más secuencias terminadoras en la construcción introducida en una planta. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir mejoradores de la transcripción así como también de traducción. Las personas normalmente capacitadas en la técnica serán conscientes de las secuencias terminadoras y mejoradores que puedan ser adecuadas para uso en la realización de la invención. También se puede añadir una secuencia de intrón a la región no traducida (UTR) 5’ o en la secuencia de codificación para incrementar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol, como se describe en la sección de las definiciones. Otras secuencias control (además de las secuencias promotoras, mejoradoras, silenciadoras, del intrón, regiones 3'UTR y/o 5'UTR) pueden ser proteínas y/o elementos estabilizantes del ARN. Tales secuencias serían conocidas o pueden ser fácilmente obtenidas por una persona normalmente capacitada en la técnica.

Las construcciones genéticas divulgadas en Ia invención pueden incluir además un origen de secuencia de replicación que se requiere para el mantenimiento y/o replicación en un tipo de célula específico. Un ejemplo es cuando se requiere mantener una construcción genética en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (por ejemplo, una molécula de plásmido o de cósmido). Los orígenes de replicación preferidos incluyen, pero no se limitan al f1-ori y colE1.

Para la detección de la transferencia exitosa de las secuencias de ácido nucleico tal como se utiliza en los métodos

de la invención y/o selección de planta transgénicas que comprende estas secuencias de ácido nucleico, es conveniente utilizar genes marcadores (o genes reporteros). Por lo tanto, la construcción genética puede comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables se describen en más detalle en la sección “definiciones” aquí.

Se sabe que tras la integración estable o transitoria de secuencias de ácido nucleico en las células de la planta, sólo una minoría de las células incorpora el ADN foráneo y, si se desea, lo integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión utilizado y de la técnica de transfección utilizada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifca para un marcador seleccionable (tal como los descritos anteriormente) es usualmente introducido en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores, por ejemplo, pueden utilizarse en mutantes en los cuales estos genes no son funcionales, por ejemplo, por medio de la supresión mediante métodos convencionales. Además, se pueden introducir moléculas de secuencias de ácido nucleico que codifcan un marcador seleccionable en una célula huésped sobre el mismo vector que comprende la secuencia que codifca los polipéptidos de la invención o que se utiliza en los métodos de la invención, o bien en un vector separado. Las células que han sido transfectadas en forma estable con la secuencia introducida de ácido nucleico se pueden identificar por ejemplo mediante selección (por ejemplo, las células que han integrado el marcador seleccionable sobreviven mientras que las otras células mueren). Los genes marcadores pueden ser removidos o escindidos de la célula transgénica una vez que no se los necesita. Las técnicas para remoción del gen marcador son conocidas en el arte; las técnicas útiles fueron descritas anteriormente en la sección de definiciones.

La invención también provee un método para la producción de plantas transgénicas que tienen más características relacionadas con el rendimiento con relación a las plantas que sirven como control, que comprende la introducción y expresión en una planta de cualquier secuencia de ácido nucleico que codifque un polipéptido ATM como se definió aquí anteriormente.

Más específicamente, la presente invención provee un método para la producción de plantas transgénicas que tienen más características relacionadas con el rendimiento con respecto a las plantas que sirven como control, el cual comprende:

(i)

la introducción y expresión en una planta, parte de una planta, o una célula de una planta, de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT como se definió aquí, bajo el control de un promotor constitutivo de una planta; y

(ii)

el cultivo la célula de la planta, parte de la planta o la planta en condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.

La secuencia de ácido nucleico de (i) puede ser cualquiera de las secuencias de ácido nucleico capaces de codificar un polipéptido AMT como se definió aquí.

La secuencia de ácido nucleico se puede introducir directamente en una célula de una planta o dentro de la planta misma (incluyendo Ia introducción en un tejido, órgano o cualquier otra parte de una planta). De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, se introduce preferiblemente la secuencia de ácido nucleico en una planta mediante transformación. El término "transformación" se describe en forma más detallada, en la sección “definiciones" en Ia presente descripción.

Las células de la planta genéticamente modificadas se pueden regenerar mediante todos los métodos con los cuales está familiarizado la persona capacitada en la técnica. Los métodos adecuados pueden encontrarse en las publicaciones antes mencionadas por S. D. Kung y R. Wu, Potrykus o Höfgen y Wilimitzer.

En general después de Ia transformación, las células de la planta o los agrupamientos celulares se seleccionan para determinar la presencia de uno o más marcadores que son codificados por genes que pueden expresase en una planta transferidos junto con el gen de interés, después de lo cual se regenera el material transformado en una planta entera. Para seleccionar las plantas transformadas, el material vegetal obtenido en la transformación es sometido, como regla, a condiciones selectivas de modo que las plantas transformadas puedan distinguirse de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas en la forma antes descrita se pueden plantar y, después de un período de crecimiento inicial, ser sometidas a una selección adecuada por medio de rociado. Otra posibilidad adicional consiste en el crecimiento de las semillas, si procede después de esterilización, sobre placas de agar utilizando un agente de selección adecuado de modo que únicamente las semillas transformadas pueden convertirse en plantas. En forma alternativa, se seleccionan las plantas transformadas para determinar la presencia de un marcador seleccionable tal como los descritos anteriormente.

Después de la transferencia y regeneración del ADN, las plantas putativamente transformadas también se pueden evaluar, por ejemplo utilizando el análisis tipo Southern, para determinar la presencia del gen de interés, el número de copias y/o organización genómica. En forma alternativa o adicional, se pueden monitorear los niveles de expresión del ADN recientemente introducido utilizando análisis tipo Northern y/o tipo Western, siendo ambas técnicas bien conocidas por las personas ordinariamente capacitadas en la técnica.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar mediante una variedad de medios, tales como por medio de técnicas de propagación clonal o de fitomejoramiento clásico. Por ejemplo, una primera generación de la planta transformada (o T1) puede ser autofecundada y los transformantes homocigotos de segunda generación (o T2) seleccionados, y las plantas T2 pueden ser luego adicionalmente propagadas a través de las técnicas clásicas de fitomejoramiento. Los organismos transformados generados pueden adoptar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y de células no transformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y sin transformar (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado a un vástago sin transformar).

La presente invención claramente se extiende a cualquier célula de una planta o planta producida mediante uno cualquiera de los métodos descritos aquí, y a todas las partes de la planta y propágulos de la misma. La presente invención se extiende además para abarcar la progenie de una célula primaria transformada o transfectada, tejido, órgano o planta completa que ha sido producida mediante cualquiera de los métodos antes mencionados, siendo el único requisito que la progenie exhiba la(s) misma(s) característica(s) fenotípica(s) y/o genotípica(s) que las producidas por la progenie en los métodos de acuerdo con la invención.

La invención también divulga células huéspedes que contienen una secuencia de ácido nucleico aislada que codifca un polipéptido AMT como se definió aquí anteriormente, operativamente enlazada a un promotor constitutivo. Las células huésped preferidas de acuerdo con la invención son las células de la planta. Las plantas huésped para las secuencias de ácido nucleico o el vector utilizado en el método de acuerdo con la invención, el casete de expresión

o la construcción o el vector están, en principio, en forma conveniente en todas las plantas, las cuales son capaces de sintetizar los polipéptidos utilizados en el método de la invención.

Los métodos de la invención se aplican convenientemente a cualquier planta. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Los ejemplos de plantas de cultivo incluyen soja, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, patata y tabaco. Preferiblemente además, la planta es una planta monocotiledónea. Los ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen a la caña de azúcar. Más preferiblemente la planta es un cereal. Los ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo y avena.

La invención también se extiende a las partes cosechables de una planta que comprende una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica un AMT (como se definió aquí anteriormente) operativamente enlazado a un promotor constitutivo de una planta, tal como, pero sin limitarse a semillas, hojas, frutos, flores, tallos, rizomas, tubérculos y bulbos. La invención se refiere además a productos derivados, preferiblemente directamente derivados de una parte cosechable de dicha planta, tal como gránulos o polvos secos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas.

Los métodos para incrementar la expresión de las secuencias de ácido nucleico o los genes, o productos génicos, están bien documentados en la técnica y se proveen ejemplos en la sección de definiciones.

Como se mencionó anteriormente, un método preferido para incrementar la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifca un polipéptido AMT es por medio de la introducción y expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT; sin embargo, los efectos de llevar a cabo el método, es decir, de incrementar las características relacionadas con el rendimiento, también pueden lograrse utilizando otras técnicas bien conocidas, que incluyen pero no se limitan a marcación de la activación del ADN-T, TlLLING, recombinación homóloga. Una descripción de estas técnicas es suministrada en la sección de definiciones.

La presente invención abarca también el uso de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos AMT como se describe aquí; y el uso de estos polipéptidos AMT para incrementar cualquiera de las características relacionadas con el rendimiento anteriormente mencionadas en plantas, bajo condiciones de crecimiento normales, bajo condiciones de crecimiento de estrés abiótico (preferiblemente condiciones de crecimiento de estrés osmótico), y bajo condiciones de crecimiento de disponibilidad reducida de nutrientes, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad reducida de nitrógeno.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos AMT descritos aquí, o los mismos polipéptidos AMT, pueden encontrar uso en programas de fitomejoramiento en los cuales se identifica un marcador de ADN que puede estar genéticamente enlazado a un gen que codifica un polipéptido AMT. Las secuencias de genes/ ácido nucleico, o los mismos polipéptidos AMT pueden ser utilizados para definir un marcador molecular. Este ADN o marcador de proteína pueden ser luego utilizados en programas de fitomejoramiento para seleccionar plantas que tienen más características relacionadas con rendimiento, como se definió aquí anteriormente en los métodos de la invención.

Las variantes alélicas de una secuencia de un gen/ácido nucleico que codifican un polipéptidos AMT pueden encontrar uso también en programas de fitomejoramiento asistidos por marcadores. Tales programas de fitomejoramiento algunas veces requieren la introducción de una variante alélica por medio de tratamiento mutagénico de las plantas, utilizando por ejemplo mutagénesis EMS; en forma alternativa, el programa puede

iniciarse con un grupo de variantes alélicas de las así llamadas de origen “natural” originadas en forma no intencional. La identificación de variantes alélicas tiene lugar entonces, por ejemplo, por medio de PCR. Esto es seguido por una etapa para la selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y que producen más características relacionadas con el rendimiento. La selección se lleva a cabo típicamente monitoreando el desempeño del crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión. El desempeño del crecimiento puede ser monitoreado en un invernadero o en el campo. Otras etapas opcionales incluyen cruzamiento de plantas en las cuales se identificó la variante alélica superior con otra planta. Esto podría ser utilizado, por ejemplo, para elaborar una combinación de características fenotípicas interesantes.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos AMT pueden ser utilizadas también como sondas para mapear genética y físicamente los genes de los cuales hacen parte, y como marcadores para características enlazadas a esos genes. Tal información puede ser útil en fitomejoramiento de plantas con el propósito de desarrollar líneas con fenotipos deseados. Tal uso de las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptidos AMT requiere únicamente una secuencia de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido AMT se pueden utilizar como marcadores de polimorfismo con la longitud del fragmento de restricción (RFLP por sus siglas en inglés). Las transferencias tipo Southern (Sambrook J, Fritsch EF y Maníatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) del ADN genómico de la planta digerido con enzimas de restricción pueden ser sondeados con las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido AMT. Los patrones de bandas resultantes pueden ser luego sometidos a análisis genético utilizando programas de computador tales como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174 - 181) con el propósito de construir un mapa genético. Además, las secuencias de ácido nucleico pueden ser utilizadas para examinar las transferencias tipo Southern que contienen los ADN genómicos tratados con endonucleasa de restricción de un conjunto de individuos que representan al progenitor y a la progenie de un cruce genético definido. Se observa la segregación de los polimorfismos de ADN y se utilizan para calcular la posición de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT en el mapa genético previamente obtenido utilizando esta población (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314 - 331).

La producción y el uso de las sondas derivadas de genes de la planta para uso en mapeo genético se describe en Bernatzky y Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37 - 41. Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clones específicos de ADNc utilizando la metodología expuesta anteriormente o variantes de la misma. Por ejemplo, poblaciones de entrecruzamientos F2, poblaciones de retrocruzamiento, poblaciones apareadas al azar, líneas isogénicas cercanas, y otros conjuntos de individuos pueden ser utilizados para el mapeo. Estas metodologías son bien conocidas por aquellos ordinariamente capacitados en la técnica.

Las sondas de la secuencias de ácido nucleico también se pueden utilizar para mapeo físico (es decir, colocación de secuencias sobre mapas físicos; véase Hoheisel et al. En: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, páginas 319 - 346, y las referencias citadas allí).

En otra realización, las sondas de secuencias de ácido nucleico pueden ser utilizadas en el mapeo de la hibridación in situ de fluorescencia directa (FISH por su siglas en inglés) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149 - 154). Aunque los métodos actuales de mapeo FISH favorecen el uso de clones grandes (varios kb hasta varios cientos de kb, véase Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13 - 20), las mejoras en sensibilidad pueden permitir la realización del mapeo FISH utilizando sondas más cortas.

Una variedad de métodos basados en la amplificación de las secuencias de ácido nucleico para mapeo genético y físico pueden ser llevados a cabo utilizando las secuencias de ácido nucleico. Los ejemplos incluyen amplificación específica de alelos (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95 - 96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325 - 332), Iigación específca de alelos (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077 - 1080), reacciones de extensión del nucleótido (Sokolov (1990) Nucleic Acid Sequence Res. 18: 3671), Mapeo Híbrido por Radiación (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22 - 28) y Mapeo Happy (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Sequence Res. 17: 6795 - 6807). Para estos métodos, se utiliza la secuencia de una secuencia de ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores para uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión del cebador. El diseño de tales cebadores es bien conocido por aquellos ordinariamente bien capacitados en la técnica. En los métodos que emplean mapeo genético con base en PCR, puede ser necesario identificar las diferencias en la secuencia de ADN entre los progenitores del mapeo entrecruzado en la región correspondiente a la presente secuencia de ácido nucleico. Esto, sin embargo, generalmente, no es necesario para métodos de mapeo.

Los métodos de acuerdo con la presente invención dan como resultado plantas que tienen más características relacionadas con el rendimiento, como se describió anteriormente aquí. Estas características pueden ser combinadas también con otras características económicamente ventajosas, tales como las características que incrementan adicionalmente el rendimiento, la tolerancia al estrés abiótico y biótico, tolerancia a herbicidas, insecticidas, características que modifican diferentes patrones arquitectónicos y/o características bioquímicas y/o fisiológicas.

Descripción de las figuras

La presente invención será descrita a continuación con referencia a las siguientes figuras en las cuales:

La Figura 1 representa la salida gráfica del algoritmo TMHMM2.0 para la SEQ ID NO: 2. A partir de la predicción del algoritmo, se localiza el terminal N del polipéptido sobre el lado exterior de la membrana (extracitosólico), seguido por 11 hélices que abarcan toda la membrana, el terminal C del polipéptido del polipéptido que está siendo localizado sobre el lado interno de la membrana (citosólico).

La Figura 2 muestra un árbol filogenético de polipéptidos AMT de diferentes organismos fuente: el Grupo I representa la agrupación de secuencias de polipéptidos útiles en la realización de los métodos de la invención, como se delimita por medio del paréntesis. El círculo representa el punto de ramificación en el árbol entre los polipéptidos útiles en la realización de los métodos de la invención, y los otros polipéptidos AMT.

La Figura 3 muestra una alineación de secuencia múltiple AIignX (del Vector NTI 10.3, lnvitrogen Corporation) de los polipéptidos AMT de la Tabla A. El comienzo y el final del Dominio Conservado (DC), por ejemplo como el representado por la SEQ ID NO: 33, se muestra utilizando paréntesis y marcado por medio de las X bajo la secuencia de consenso. Se presenta en una caja un residuo conservado G (Gly) involucrado en la función propia de AMT (Ludewig et al., (2003) J Biol Chem 278: 45603 - 10).

La Figura 4 muestra el vector binario para mayor expresión en Oryza sativa de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT bajo el control de un promotor GOS2 (pGOS2) de arroz.

La Figura 5 detalla ejemplos de secuencias útiles para realizar los métodos de acuerdo con la presente invención.

Ejemplos

La presente invención será descrita a continuación con referencia a los siguientes y ejemplos, que se citan sólo para efectos ilustrativos. Los siguientes ejemplos no pretenden definir completamente o limitar de algún otro modo el alcance de la invención.

Manipulación del ADN: a menos que se establezca otra cosa, las técnicas de ADN recombinante se llevan acabo de acuerdo con protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3° Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales estándar y los métodos para el trabajo molecular de la planta se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R. D. D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU).

Ejemplo 1: Identificación de secuencias relacionadas con Ia secuencia de ácido nucleico utilizada en los métodos de la invención

Las secuencias (ADNc de longitud completa, los EST o genómicas) relacionadas con Ia secuencia de ácido nucleico usadas en los métodos de la presente invención fueron identificadas entre aquellas mantenidas en la base de datos de nucleótidos Entrez en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando herramientas de búsqueda de secuencias en la base de datos, tales como la Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 - 410; y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 - 3402). El programa se utiliza para encontrar regiones de similitud local entre secuencias mediante la comparación de secuencias de ácido nucleico o de secuencias de polipéptidos con las bases de datos de secuencias y calculando el significado estadístico de las coincidencias. Por ejemplo, el polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de la presente invención se utilizó para el algoritmo TBLASTN, con parámetros predeterminados y el filtro desactivado para ignorar secuencias de baja complejidad. El resultado del análisis se obtuvo a través de la comparación por pares, y se clasificó de acuerdo con el puntaje de la probabilidad (valor E), donde el puntaje refleja la probabilidad de que ocurra una alineación particular al azar (entre más bajo el valor E, más significativa la coincidencia). Además de los valores E, también se dio puntaje a las comparaciones mediante el porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refere a la cantidad de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácido nucleico (o polipeptídicas) comparadas sobre una longitud particular. En algunos casos, se pueden ajustar los parámetros por defecto para modificar la rigurosidad de la búsqueda. Por ejemplo, se puede incrementar el valor E para mostrar menos coincidencias estrictas. De este modo, se pueden identificar coincidencias cortas casi exactas.

La Tabla A proporciona un listado de secuencias de ácidos nucleico relacionadas con la secuencia de ácido nucleico utilizada en los métodos de la presente invención.

Tabla A: Ejemplos de secuencias de polipéptidos AMT, y secuencias codificadoras de ácido nucleico:

Nombre

Organismo fuente Número de acceso en la base de datos pública Secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: Secuencia del polipéptido SEQ ID NO:

Phatr_AMT1_FL

Phaeodactylum tricornutum jgi_Phatr2_20754_e stExt_gwp_gw1.C_c hr_100028 1 2

Phatr_AMT1_parcial

Phaeodactylum tricornutum jgi_Phatr2_20754_e stExt_gwp_gw1.C_c hr_100028 3 4

Phatr_AMT2

Phaeodactylum tricornutum jgi_Phatr2_22927_e stExt_gwp_gw1.C_c hr_200095 5 6

Phatr_AMT3

Phaeodactylum tricornutum jgi_Phatr2_20954_e stExt_gwp_gw1.C_c hr_110018 7 8

Phatr_AMT4

Phaeodactylum tricornutum jgi_Phatr2_34491_f genesh1_pg.C_chr_ 5000291 9 10

Phatr_AMT5

Phaeodactylum tricornutum jgi_Phatr2_33710_f genesh1_pg.C_chr_ 4000065 11 12

Phatr_AMT6

Phaeodactylum tricornutum jgi_Phatr2_53344_p hatr1_ua_pm.chr_1 0000004 13 14

Phatr_AMT7

Phaeodactylum tricornutum jgi_Phatr2_43458_e stExt_fgenesh1_pg. C_chr_20211 15 16

Cylfu_AMT1

Cylindrotheca fusiformis AF360394 17 18

Cylfu_AMT1 variante

Cylindrotheca fusiformis AY651852 19 20

Cylfu_AMT2a

Cylindrotheca fusiformis AY651853 21 22

Thaps_AMT1

Thalassiosira pseudonana jgi_Thaps3_258067 _thaps1_ua_pm.chr _7000085 23 24

Thaps_AMT2

Thalassiosira pseudonana jgi_Thaps3_261441 _thaps1_ua_kg.chr_ 2000265 25 26

Thaps_AMT3

Thalassiosira pseudonana jgi_Thaps3_7968_fg enesh1_pg.C_chr_9 000136 27 28

Thaps_AMT4

Thalassiosira pseudonana jgi_Thaps3_2305_fg enesh1_pg.C_chr_2 000260 29 30

Thaps_AMT6

Thalassiosira pseudonana jgi_Thaps3_257021 _thaps1_ua_pm.chr _4000455 31 32

En algunos casos, las secuencias relacionadas han sido ensambladas tentativamente y divulgadas al público por

5 parte de instituciones de investigación, tales como The Institute for Genomic Research (TIGR). La base de datos Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) puede ser utilizada para identificar tales secuencias relacionadas, ya sea por medio de una búsqueda de palabras clave o por medio del uso del algoritmo BLAST con Ia secuencia de ácido nucleico o la secuencias de polipéptidos de interés. En otros casos, se han creado bases de datos especiales de secuencias de ácido nucleico para organismos particulares, tales como por el Joint Genome Institute, por ejemplo

10 para Thalassiosira pseudonana y Phaeodactylum tricomutum.

Ejemplo 2: Alineación de secuencias de polipéptidos AMT

La alineación de secuencias múltiples de todas las secuencias de polipéptidos AMT en la Tabla A se llevó a cabo

15 utilizando el algoritmo AlignX (del Vector NTI 10.3, lnvitrogen Corporation). Los resultados de la alineación se muestran en la Figura 3 de la presente solicitud. El comienzo y el final del Dominio Conservado (DC), por ejemplo como el representado por la SEQ ID NO: 33, se muestra utilizando paréntesis y marcado por medio de las X bajo la secuencia de consenso. Se presenta en una caja un residuo conservado G (Gly) involucrado en la función propia de AMT (Ludewig et al., (2003) J Biol Chem 278: 45603 - 10).

20 Ejemplo 3: Cálculo del porcentaje global de identidad entre secuencias de polipéptidos útiles en la realización de los métodos de la invención

Se determinaron los porcentajes globales de similitud e identidad entre secuencias de polipéptidos de longitud

25 completa útiles para llevar a cabo los métodos de Ia invención utilizando uno de los métodos disponibles en el arte, el software MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: una aplicación que genera matrices de similitud/identidad utilizando secuencias de proteína o de ADN. Campanella J. J., Bitincka L, Smalley J; software administrado por Ledion Bitincka). El software MatGAT genera matrices de similitud/identidad para secuencias de ADN o de proteína sin necesidad de una alineación previa para los datos. El programa realiza

30 una serie de alineaciones de pares utilizando el algoritmo de alineación global de Myers y Miller (con una

penalización por apertura de brecha de 12, y una penalización por extensión de brecha de 2), calcula la similitud y la identidad utilizando por ejemplo Blosum 62 (para polipéptidos), y luego coloca los resultados en una matriz de distancia. La similitud de secuencia se muestra en la mitad inferior de la línea divisoria y la identidad de la secuencia se muestra en la mitad superior de la línea divisoria en diagonal.

Los parámetros utilizados en la comparación fueron:

Matriz de puntuación: BIosum62 Primera brecha: 12

10 Extensión de la brecha: 2

Los resultados del análisis del software se muestran en la Tabla B para Ia similitud e identidad global sobre Ia longitud completa de las secuencias de polipéptidos (excluyendo las secuencias parciales de polipéptidos).

15 Se hizo el mismo análisis entre el Dominio Conservado (DC) como el representado por la SEQ ID NO: 33 (y comprendida en la SEQ ID NO: 2 y el la SEQ ID NO: 4) y el Dominio Conservado de los polipéptidos de la Tabla A (como se resalta en la Figura 3) y los resultados se muestran en la Tabla B1.

Tabla B.1: Resultados de MatGAT para la similitud e identidad globales sobre el Dominio Conservado de las secuencias de polipéptidos de la Tabla A

El porcentaje de identidad entre las secuencias de polipéptidos de longitud completa útiles en la realización de los métodos de la invención puede ser tan baja como una de identidad de aminoácido del 44% en comparación con la SEQ ID NO: 2.

5 El porcentaje de identidad entre el Dominio Conservado (DC) como el representado por la SEQ ID NO: 33 (y comprendida en la SEQ ID NO: 2 y el la SEQ ID NO: 4) y el Dominio Conservado de los polipéptidos de la Tabla A (como se resalta en la Figura 3) incrementa la identidad de aminoácidos hasta un 55%, como se muestra en la Tabla B1.

10 Ejemplo 4: Identificación de dominios comprendidos en las secuencias de polipéptidos útiles en la realización de los métodos de la invención.

La base de datos de Recursos Integrados de Familias de Proteínas, Dominios y Sitios (InterPro) es una interfaz integrada para las bases de datos de firma comúnmente utilizadas para búsquedas con base en textos y secuencias.

15 La base de datos InterPro combina estas bases de datos, que utilizan diferentes metodologías y diferentes grados de información biológica sobre proteínas bien caracterizadas para derivar firmas de proteína. Las bases de datos colaboradoras incluyen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, Panther, ProDom y Pfam, Smart y TlGRFAMs. lnterPro se encuentra alojada en el European Bioinformatics Institute en el Reino Unido.

20 Los resultados del barrido con InterPro de Ia secuencia de polipéptidos representadas por la SEQ ID NO: 2 se presentan en la Tabla C.

Tabla C: Resultados del barrido con InterPro de la secuencia de polipéptidos como la representada por la SEQ ID NO: 2

Nombre y número de acceso de InterPro

Nombre de la base de datos integrada Número de acceso de la base de datos integrada Nombre de acceso de la base de datos integrada

Transportador de Amonio IPR0001905

Panther PTHR11730 Transportador de Amonio

Transportador de Amonio IPR0001905

TIGR TIGR00836 Amt: Transportador de Amonio

Transportador de Amonio IPR0001905

Prosite PS01219 Transportador de Amonio

Transportador de Amonio/proteína tipo Rh IPR010256

PFAM F00909 Transportador de Amonio

No IPR integrado

Panther PTHR11730:SF8 Transportador de Amonio 1

No IPR integrado

tmhmm Regiones transmembrana

Ejemplo 5: Predicción de la localización subcelular de las secuencias de polipéptidos útiles para llevar a cabo los métodos de Ia invención

30 Los métodos experimentales para la localización de proteína varían desde inmunolocalización hasta marcación de las proteínas utilizando proteína fluorescente verde (GFP) o beta-glucuronidasa (GUS). Por ejemplo, se localizaron transportadores AMT de Arabidopsis thaliana en la membrana plasmática utilizando experimentos de fusión GFP (Yuan et al. (2003) Plant Cell 19: 2636 - 2652).

35 Se llevó a cabo también una predicción computacional de localización de proteína a partir de los datos de la secuencia. Entre los algoritmos bien conocidos por una persona normalmente capacitada en la técnica se encuentran disponibles en las herramientas de ExPASy Proteomics alojada en el Swiss Institute for Bioinformatics, por ejemplo, PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, SignalP, TMHMM y otras.

40 Un dominio transmembrana usualmente denota una sola hélice alfa transmembrana de una proteína transmembrana. Se llama “dominio” debido a que una hélice alfa en la membrana se puede plegar independientemente del resto de la proteína. En forma más amplia, un dominio transmembrana es cualquier estructura tridimensional de una proteína que es termodinámicamente estable en la membrana. Esta puede ser una

45 sola hélice alfa, un complejo estable de varias hélices alfa transmembrana, un barril beta transmembrana, una hélice beta de gramicidina A, o cualquier otra estructura.

Las hélices transmembrana son usualmente aproximadamente de 20 aminoácidos de longitud, aunque pueden ser mucho más largas o cortas. TMHMM2.0 es un algoritmo que puede predecir hélices que abarcan toda la membrana

50 en proteínas. El algoritmo se aloja en el servidor de la Universidad Técnica de Dinamarca. La tabla D a continuación muestra la salida de TMHMM2.0 utilizando la información de la secuencias de polipéptidos de la SEQ ID NO: 2. A partir de la predicción, se localiza el terminal N del polipéptido sobre el lado externo de la membrana

(extracitosólico), seguido por 11 hélices que abarcan toda la membrana, el terminal C del polipéptido del polipéptido que está localizado sobre el lado interno de la membrana (citosólico). La misma configuración aplica a la SEQ ID NO: 4, excepto porque la primera porción exterior es más pequeña. La Figura 1 es una representación gráfica de la salida como en la Tabla D.

Tabla D. Salida TMHMM2.0 utilizando la información de la secuencia de polipéptidos de la SEQ ID NO: 2

Localización

Coordenadas del aminoácido

externa

1 - 53

hélice TM

54 - 76

interna

77 - 87

hélice TM

88 - 110

externa

111 - 131

hélice TM

132 - 154

interna

155 - 160

hélice TM

161 - 183

externa

184 - 202

hélice TM

203 - 225

interna

226 - 245

hélice TM

246 - 268

externa

269 - 282

hélice TM

283 - 305

interna

306 - 317

hélice TM

318 - 340

externa

341 - 344

hélice TM

345 - 367

interna

368 - 379

hélice TM

380 - 402

externa

403 - 429

hélice TM

430 - 452

interna

453 - 521

El compartimiento subcelular predicho del polipéptido AMT como se representa mediante la SEQ lD NO: 4 utilizando 10 el algoritmo TMHMM2.0 es la membrana.

Ejemplo 6: Ensayo relacionado con las secuencias de polipéptidos útiles en Ia realización de los métodos de Ia invención.

15 Los polipéptidos AMT son capaces de transportar amonio a través de las membranas. Existen muchos ensayos para medir tal actividad de captación, incluidos ensayos de complementación de una cepa de levadura con transportadores de amonio endógeno defectuosos (Ninneman et al. (1994) EMBO J 13: 3464 - 3471), ensayos de captación en levadura, Xenopus oocyctes (Ludewig et al. (2003) J Biol Chem 278: 45603 - 45610), células de plantas, raíces de la planta (Yuan et al. (2007) Plant Phys 143: 732 - 744), y plantas completas (Hoque et al. (2006)

20 Functional Plant Biology 33: 153 - 163). Una persona capacitada en el arte es consciente de tales procedimientos experimentales para medir la actividad de AMT, incluida la actividad de AMT de un polipéptido AMT como el representado por la SEQ ID NO: 2.

Ejemplo 7: Clonación de una secuencia de ácido nucleico como la representada por la SEQ ID NO: 1

25 A menos que se establezca otra cosa, se llevan a cabo técnicas de ADN recombinante de acuerdo con protocolos estándar que se describen en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3° edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales y métodos estándar para trabajo molecular en plantas se

30 describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R. D. D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU).

El ADNc de Arabidopsis thaliana que codifica la secuencia de polipéptidos AMT como la representada por la SEQ ID NO: 4 se amplificó por medio de PCR utilizando como molde ADNc de sintetizado a partir del ARNm extraído de

35 Phaeodactylum tricornutum en diferentes etapas de la multiplicación, y bajo diferentes condiciones de crecimiento. Los siguientes cebadores, que incluyen los sitios AttB para recombinación Gateway, fueron utilizados para la amplificación por PCR:

1) Prm 09458 (SEQ ID N0: 35, sentido):

40 5’- ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgatgcaggccggg- 3' 2) Prm 09459 (SEQ ID NO: 36, inversa, complementaria):

5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtacacgagcagcaattaaacc- 3'

La PCR se realizó utilizando Hiffi Taq ADN polimerasa en condiciones estándar. Se amplificó y purificó también un fragmento PCR de la longitud esperada (incluyendo sitos attB), empleando métodos estándar. Luego se llevó a cabo la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento de la PCR recombinado in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada". Se adquirió el plásmido pDONR201 a través de lnvitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

Ejemplo 8: Construcción del vector de expresión utilizando las secuencias de ácido nucleico como las representadas por la SEQ ID NO: 1

El clon de entrada que comprende la SEQ ID NO: 3 se utilizó posteriormente en una reacción LR con un vector de destinación usado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contenía como elementos funcionales dentro de los bordes del ADN-T: un marcador seleccionable de una planta; un casete de expresión de un marcador cribable; y un casete Gateway destinado a la recombinación in vivo de LR con la secuencia de ácido nucleico de interés ya clonada en el clon de entrada. Se localizó un promotor GOS2 de arroz (SEQ lD NO: 34) para expresión constitutiva secuencia arriba de este casete Gateway.

Después de la etapa de recombinación de LR, se transformó el vector de expresión resultante pGOS2::AMT (Figura 4) en una cepa LBA4044 de Agrobacterium, de acuerdo con los métodos bien conocidos en el arte.

Ejemplo 9: Transformación de plantas

Transformación de arroz

Se utilizó Agrobacterium que contiene el vector de expresión para transformar plantas de Oryza sativa. Se descascarillaron semillas secas maduras de la variedad de cultivo Japónica de arroz Nipponbare. Se realizó la esterilización incubando durante un minuto en etanol al 70%, seguido por 30 minutos en HgCl2 al 0,2%, seguido de 6 lavados durante 15 minutos con agua destilada estéril. Las semillas estériles fueron luego germinadas en un medio que contenía 2,4-D (medio de inducción de callos). Después de la incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, se cortaron y propagaron los callos embriogénicos derivados de escutelo sobre el mismo medio. Al cabo de dos semanas, los callos se multiplicaron o propagaron mediante un subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas, se multiplicaron o propagaron los callos por medio de subcultivo sobre el mismo medio durante otras dos semanas. Se subcultivaron piezas de callo sobre medio fresco 3 días antes del cocultivo (para reforzar la actividad de la división celular).

Se utilizó la cepa LBA4404 de Agrobacterium que contenía cada vector de expresión individual independientemente para el cocultivo. Se inoculó Agrobacterium sobre medio AB con los antibióticos apropiados y se cultivó durante 3 días a 28°C. Se recolectaron luego las bacterias y se suspendieron en un medio de cocultivo líquido hasta una densidad (OD600) de aproximadamente 1. Se transfirió luego la suspensión a una placa de Petri y se sumergieron los callos en la suspensión durante 15 minutos. Los tejidos de los callos fueron transferidos secos sobre un papel de filtro y transferidos a un medio de cocultivo solidificado e incubados durante 3 días en la oscuridad a 25°C. Los callos cocultivados crecieron en un medio que contenía 2,4-D durante 4 semanas en la oscuridad a 28°C en presencia de un agente de selección. Durante este período, se desarrollaron rápidamente islas de callos resistentes. Luego de transferir este material a un medio de regeneración e incubarlo a la luz, se liberó el potencial embriogénico y se desarrollaron brotes en las próximas cuatro a cinco semanas. Se cortaron los brotes de los callos y se incubaron durante 2 a 3 semanas en un medio que contenía auxina, desde el cual fueron transferidos al suelo. Se cultivaron los brotes encallecidos bajo humedad alta y días cortos en un invernadero.

Se generaron aproximadamente 35 transformantes independientes de arroz T0 para cada construcción. Los transformantes primarios se transfirieron desde una cámara de cultivo de tejido a un invernadero. Luego de un análisis por PCR cuantitativo para verificar la cantidad de copias del inserto de ADN-T, se conservaron únicamente copias simples de plantas transgénicas que exhibieron tolerancia al agente de selección para la cosecha de semillas T1. Luego se cosecharon las semillas tres a cinco meses después de ser trasplantadas. El método produjo transformantes de un solo Iocus en una proporción superior al 50 % (Aldemita y Hodges1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).

Ejemplo 10: Procedimiento de evaluación fenotípica

10.1 Disposición para la evaluación

Se generaron aproximadamente 35 nuevos transformantes independientes de arroz T0. Se transfirieron los transformantes primarios desde una cámara de cultivo de tejidos hasta un invernadero para crecimiento y cosecha de semilla T1. Se retuvieron seis eventos, de los cuales la progenie T1 segregó 3:1 por la presencia /ausencia del transgén. Para cada uno de estos eventos se seleccionaron aproximadamente 10 plantas de semillero T1 que contenían el transgén (hetero y homocigotos) y aproximadamente 10 plantas de semillero T1 que carecían del

transgén (nulicigotos) y por medio de control visual de expresión del marcador. Las plantas transgénicas y los correspondiente nulicigotos se cultivaron uno al lado del otro en posiciones aleatorias. Las condiciones del invernadero fueron de días cortos (12 horas de luz), 28°C en la luz y 22°C en la oscuridad, y una humedad relativa del 70%.

Se evaluaron adicionalmente cuatro eventos T1 en la generación T2 siguiendo el mismo procedimiento de evaluación que para la generación T1 pero con más individuos por evento. Desde la etapa de cultivo hasta la etapa de maduración, se pasaron las plantas varias veces a través de una cabina de formación de imágenes digitales. En cada instante de tiempo se tomaron imágenes digitales (2048 x 1536 pixeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes.

10.2 Análisis estadístico: prueba F

Se utilizó un ANOVA de dos factores (análisis de variantes) como un modelo estadístico para la evaluación general de las características fenotípicas de las plantas. Se realizó una prueba F sobre todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen de la presente invención. Se realizó la prueba F para controlar el efecto del gen sobre todos los eventos de transformación y para verificar el efecto total del gen, también conocido como efecto global del gen. El umbral de significación para un efecto global verdadero del gen se fijó en un nivel de probabilidad del 5% para la prueba F. Un valor significativo de la prueba F indica un efecto del gen, lo que significa que no es sólo la mera presencia o la posición del gen lo que está causando las diferencias en el fenotipo.

10.3 Parámetros medidos

Medición de parámetros relacionados con la biomasa

Desde la etapa de cultivo hasta la etapa de maduración, se pasaron las plantas varias veces a través de una cabina de formación de imágenes digitales. En cada instante de tiempo se tomaron imágenes digitales (2048 x 1536 pixeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes.

Se determinó el área de la planta sobre el suelo (o biomasa foliar) contando el número total de píxeles en la imágenes digitales de partes de la planta aéreas discriminadas desde el fondo. Se promedió este valor para las fotos tomada en el mismo instante de tiempo desde los diferentes ángulos y fue convertido a un valor de superficie física expresado en mm cuadrados por calibración. Los experimentos muestran que el área de la planta sobre el suelo medida de esta manera se correlaciona con la biomasa de las partes de la planta aéreas. El área por encima del suelo es el área medida en el instante de tiempo en el que la planta había alcanzado su biomasa foliar máxima. El vigor temprano es el área por encima del suelo de la planta (planta de semillero) tres semanas después de la germinación. El aumento de la biomasa de la raíz se expresa como un aumento en la biomasa total de la raíz (medida como biomasa máxima de las raíces observada durante la vida útil de una planta); o como un aumento en el índice raíz / brote (medido como la relación entre los masa de la raíz y la masa de los brotes en el período de crecimiento activo de las raíces y los brotes).

Mediciones de parámetros relacionados con la semilla

Se cosecharon las panículas primarias maduras, se contaron, se empacaron en bolsas, se etiquetaron con un código de barras y luego se secaron durante tres días en un horno a 37° C. Se trillaron luego las panículas, y se recogieron y contaron todas las semillas. Se separaron las vainas llenas de las vacías utilizando un dispositivo de soplado de aire. Las vainas vacías se descartaron y la fracción restante se contó de nuevo. Las vainas llenas se pesaron en una balanza analítica. El número de semillas llenas se determinó contando el número de vainas llenas que quedó después de la etapa de separación. El peso total de semillas por planta se midió pesando todas las vainas llenas cosechadas de una planta. Se midió la cantidad total de semillas por planta contando el número de vainas cosechadas de una planta. Se extrapoló el Peso de Mil Granos (PMG) a partir del número de semillas llenascontadas y su peso total. El Índice de Cosecha (IC) en la presente invención se define como la relación entre el peso total de semillas por planta y el área por encima del suelo (mm2), multiplicado por un factor de 106. El número total de flores por panícula tal como se define en la presente invención es la relación entre el número total de semillas y el número de panículas primarias maduras. La tasa de llenado de semilla tal como se define en la presente invención es la proporción (expresada como %) del número de semillas llenas sobre el número total de semillas (o floretes).

Ejemplo 11: Resultados de la evaluación fenotípica de las plantas de arroz transgénicas que expresan la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT como el representado por la SEQ ID NO: 2

Los resultados de la evaluación de plantas de arroz transgénicas generación T2 que expresan la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT como el representado por la SEQ ID NO: 2, bajo el control del promotor GOS2 para expresión constitutiva, y cultivadas bajo condiciones normales de desarrollo, se presentan a continuación.

Existió un incremento significativo en el vigor temprano, en la biomasa aérea, en la biomasa de la raíz, en el rendimiento total de semilla por planta, en la tasa de llenado de la semilla, en el número de semillas llenas, en el número de flores por panícula, y en el índice de cosecha de las plantas transgénicas comparado con los correspondientes nulicigotos (controles), como se muestra en la Tabla E.

Tabla E: Resultados de la evaluación de las plantas de arroz transgénico generación T2 que expresan la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT como el representado por la SEQ ID NO: 2, bajo el control del promotor GOS2 para expresión constitutiva.

Característica

Incremento total promedio en % en 4 eventos en la generación T2

Vigor temprano

39%

Biomasa aérea

16%

Biomasa de la raíz

4%

Rendimiento total de semilla por planta

31%

Tasa de llenado de semilla

12%

Número de semillas llenas

31%

Número de flores por panícula

6%

Índice d cosecha

17%

Ejemplo 12: Ejemplos de transformación de otros cultivos

Transformación de maíz

15 La transformación de maíz (Zea mays) se realiza con una modificación del método que describió por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745 - 50. La transformación depende del genotipo en el maíz y únicamente genotipos específicos son responsables por la transformación y regeneración. La línea endogámica A188 (Universidad de Minnesota) o híbridos con A188 como progenitores son buenas fuentes de material donante para transformación, pero también pueden utilizarse otros genotipos exitosamente. Se cosecharon las mazorcas de plantas de maíz

20 aproximadamente 11 días después de la polinización (DAP por sus siglas en inglés) cuando la longitud del embrión inmaduro es de aproximadamente 1 a 1,2 mm. Se cocultivaron los embriones inmaduros con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión, y se recuperaron las plantas transgénicas a través de organogénesis. Se cultivaron los embriones cortados en un medio de inducción de callos, luego en un medio de regeneración de maíz, que contiene el agente de selección (por ejemplo imidazolinona, pero pueden utilizarse

25 diferentes marcadores de selección). Las placas de Petri se incubaron a la luz a 25°C durante 2 - 3 semanas, o hasta que crecieron brotes. Los brotes verdes se transfieren desde cada embrión a un medio enraizador de maíz y se incuba a 25°C durante 2 - 3 semanas, hasta que brotan raíces. Los brotes con raíces se trasplantan a suelo en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de las plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de trigo

La transformación de trigo se realiza con el método descrito por Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745 - 50. La variedad cultivada Bobwhite (disponible a través de ClMMYT, Méjico) es comúnmente utilizada en la 35 transformación. Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens que contienen el vector de expresión, y se recuperan las plantas transgénicas a través de organogénesis. Después de incubación con Agrobacterium, se cultivan los embriones in vitro en un medio de inducción de callos, luego en un medio de regeneración que contiene el agente de selección (por ejemplo imidazolinona, pero pueden utilizarse diferentes marcadores de selección). Las placas de Petri se incuban a la luz a 25°C durante 2 - 3 semanas, o hasta que se

40 desarrollaron brotes. Los brotes verdes se transfieren de cada embrión al medio enraizador y se incuban a 25°C durante 2 - 3 semanas, hasta que brotaron raíces. Los brotes con raíces se trasplantan a suelo en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de las plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

45 Transformación de soja

La soja se transforma de acuerdo con una modificación del método que se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5.164.310 de Texas A&M. Diferentes variedades comerciales de soja son adecuadas para la transformación mediante este método. La variedad cultivada Jack (disponible a través de la fundación de Semillas 50 de Illinois) es comúnmente utilizada para la transformación. Las semillas de soja se esterilizan para el sembrado in vitro. Se cortan el hipocotilo, la radícula y un cotiledón de plántulas jóvenes de 7 días. Se cultivan luego el epicotilo y el cotiledón restante hasta desarrollar nodos axiales. Estos nodos axiales se cortan y se incuban con Agrobacterium tumefaciens que contenían el vector de expresión. Después del tratamiento de cocultivo, se lavaron los explantes y se los transfirió a un medio de selección. Los brotes regenerados se cortan y se colocan en un medio para 55 alargamiento del brote. Los brotes no mayores a 1 cm se colocan en un medio de enraizamiento hasta desarrollar raíces. Los brotes con raíces se trasplantan a suelo en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de las

plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de colza / canola

Se usaron pecíolos e hipocotilos de cotiledones de una plántula joven de 5 - 6 días como explantes para el cultivo de tejidos, y se transformaron de acuerdo con Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183 - 188). La variedad cultivada comercial Westar (Agriculture Canada) es la variedad estándar usada para Ia transformación, pero también pueden usarse otras variedades. Las semillas de canola se esterilizan en la superficie para la siembra in vitro. Se cortan los explantes de pecíolo de cotiledón con el cotiledón unido a partir de las plántulas in vitro, y se inoculan con Agrobacterium (que contienen el vector de expresión) sumergiendo el extremo cortado del explante del pecíolo en la suspensión bacteriana. Se cultivan luego los explantes durante 2 días sobre medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, 3% de sacarosa, 0,7% de Phytagar a 23°C, con 16 h de luz. Después de dos días de cocultivo con Agrobacterium, los explantes de pecíolos se transfieren a un medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/l de BAP, cefotaxima, carbenicilina o Timentina (300 mg/l) durante 7 días, y luego se cultivaron sobre medio MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o Timentina y un agente de selección hasta la regeneración de los brotes. Cuando los brotes tienen 5 - 10 mm de longitud, se cortan y se transfieren al medio para alargamiento de los brotes (MSBAP0,5, que contiene 0,5 mg/l de BAP). Se transfieren los brotes de aproximadamente 2 cm de longitud al medio de enraizado (MS0) para Ia inducción de la raíz. Los brotes con raíces se trasplantan a suelo en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de las plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de alfalfa

Se transforma un clon de regeneración de alfalfa (Medicago sativa) utilizando el método de (McKersie el al., 1999 Plant Physiol 119: 839 - 847). La regeneración y transformación de alfalfa depende del genotipo y por lo tanto se requiere una planta regeneradora. Ya se han descrito métodos para obtener plantas que se regeneran. Por ejemplo, estas pueden seleccionarse de la variedad cultivada Rangelander (Agriculture Canada) o de cualquier otra variedad comercial de alfalfa como lo describe Brown D. C. W. y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111 - 112). Alternativamente, se ha seleccionado Ia variedad RA3 (Universidad de Wisconsin) para ser usada en el cultivo de tejidos (Walker et al., 1978 Am J Bot 65: 654 - 659). Los explantes de pecíolos se cocultivan con un cultivo de C58C1 pMP9O de Agrobacterium tumefaciens durante la noche (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839 - 847)

o LBA4404 que contiene el vector de expresión. Los explantes se cocultivan durante 3 días en la oscuridad en un medio de inducción SH que contiene 288 mg/L de Pro, 53 mg/L de tioprolina, 4,35 g/L de K2SO4, y 100 μm de acetosiringinona. Los explantes se lavan en un medio de Murashige-Skoog de fuerza media (Murashige y Skoog, 1962) y se siembran en placa sobre el mismo medio de inducción SH sin acetosiringinona, pero con un agente de selección adecuado y un antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Después de varias semanas, se transfieren los embriones somáticos a un medio de desarrollo BOi2Y que no contiene reguladores de crecimiento ni antibióticos, y con 50 g/L de sacarosa. Luego se germinan los embriones somáticos en un medio de Murashige-Skoog de fuerza media. Las plántulas enraizadas se trasplantaron a macetas y se desarrollaron en un invernadero. Se producen semillas T1 a partir de las plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de algodón

La transformación del algodón (Gossypium hirsutum L.) se lleva a cabo utilizando Agrobacterium tumefaciens, sobre explantes de hipocotilos. Las variedades de cultivo comerciales tales como Coker 130 o Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX) son variedades estándares utilizadas para la transformación, pero también se pueden utilizar otras variedades. Las semillas se esterilizan en la superficie y se germinan en la oscuridad. Los explantes de hipocotilos se cortan de las plántulas germinadas hasta longitudes de aproximadamente 1 - 1,5 centímetros. El explante de hipocotilo se sumerge en el inóculo de Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de expresión, durante 5 minutos y luego se cocultivan durante 48 horas sobre MS + 1,8 mg/l de KNO3 + 2% de glucosa a 24° C, en la oscuridad. Los explantes se transfieren al mismo medio que contiene los marcadores seleccionables apropiados bacterianas y vegetales (renovados varias veces), hasta que se observan callos embriogénicos. Los callos se separan y se subcultivan hasta que aparecen embriones somáticos. Las plántulas derivadas de los embriones somáticos se maduran sobre el medio de enraizamiento hasta que se desarrollan las raíces. Los brotes con raíz se trasplantan a suelo en macetas en el invernadero. Se producen semillas T1 a partir de las plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Ejemplo 13: Ejemplos de cribas de estrés abiótico

Criba por sequía

Se cultivan plantas de un número seleccionado de eventos en tierra para macetas bajo condiciones normales hasta que se acercan a la etapa de retiro de las mismas. A continuación, se transfieren a una sección "seca", donde se suprime el riego. Se insertan sondas de humedad en macetas elegidas al azar para controlar el contenido de agua del suelo (CAS). Cuando el CAS va por debajo de ciertos umbrales, se riega nuevamente las plantas en forma

automática y continua hasta que se vuelva a alcanzar un nivel normal. Las plantas son entonces transferidas de nuevo a condiciones normales. El resto del cultivo (maduración de la planta, cosecha de semillas) es el mismo que para las plantas no cultivadas bajo condiciones de estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registran como se detalla para el crecimiento bajo condiciones normales.

Criba por estrés salino

Las plantas se cultivan en un sustrato elaborado a base de fibras de coco y Argex (relación 3 a 1). Se utiliza una solución nutriente normal durante las dos primeras semanas después del trasplante de las plántulas en el invernadero. Después de las dos primeras semanas, se añade sal 25 mM (NaCl) a la solución nutriente, hasta que se cosechan las plantas. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registran como se detalla para el crecimiento bajo condiciones normales.

Cribado por disponibilidad reducida en nutrientes (nitrógeno)

Se cultivan plantas de seis eventos (semillas T2) en tierra para macetas bajo condiciones normales excepto para la solución nutriente. Las macetas se riegan desde el trasplante hasta la maduración con una solución nutriente específica que tiene un contenido reducido de nitrógeno (N), usualmente entre 7 a 8 veces menos. El resto del cultivo (maduración de la planta, cosecha de semillas) es el mismo que para las plantas no cultivadas bajo estrés abiótico. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registran como se detalla para el cultivo bajo condiciones normales.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CropDesign N.V.

<120> Plantas que tienen un aumento de características relacionadas con el rendimiento y un método para elaboración de las mismas

<130> PF60250

<160> 36

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 1566

<212> ADN

<213> Phaeodactylum tricomutum

<400> 1

<210> 2

<211> 521

<212> PRT

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 2

<210> 3

<211> 1380

<212> ADN

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 3

<210> 4

<211> 459

<212> PRT

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 4

<210> 5

<211> 1620

<212> ADN

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 5 <210> 6

<211> 539

<212> PRT

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 6

<210> 7

<211> 1695

<212> ADN

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 7 <210> 8

<211> 564

<212> PRT

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 8

<210> 9

<211> 1554

<212> ADN

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 9

<210> 10

<211> 517

<212> PRT

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 10

<210> 11

<211> 1704

<212> ADN

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 11

<210> 12

<211> 567

<212> PRT

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 12

<210> 13

<211> 1665

<212> ADN

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 13

<210> 14

<211> 554

<212> PRT

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 14

<210> 15

<211> 1620

<212> ADN

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 15

<210> 16

<211> 539

<212> PRT

<213> Phaeodactylum tricornutum

<400> 16

<210> 17

<211> 1557

<212> ADN

<213> Cylindrotheca fusiformis

<400> 17

<210> 18

<211> 511

<212> PRT

<213> Cylindrotheca fusiformis

<400> 18

<210> 19

<211> 1622

<212> ADN

<213> Cylindrotheca fusiformis

<400> 19

<210> 20

<211> 450

<212> PRT

<213> Cylindrotheca fusiformis

<400> 20

<210> 21

<211> 1536

<212> ADN

<213> Cylindrotheca fusiformis

<400> 21

<210> 22

<211> 511

<212> PRT

<213> Cylindrotheca fusiformis

<400> 22

<210> 23

<211> 1563

<212> ADN

<213> Thalassiosira pseudonana

<400> 23

<210> 24

<211> 520

<212> PRT

<213> Thalassiosira pseudonana

<400> 24

<210> 25

<211> 1608

<212> ADN

<213> Thalassiosira pseudonana

<400> 25

<210> 26

<211> 535

<212> PRT

<213> Thalassiosira pseudonana

<400> 26

<210> 27

<211> 1632

<212> ADN

<213> Thalassiosira pseudonana

<400> 27

<210> 28

<211> 543

<212> PRT

<213> Thalassiosira pseudonana

<400> 28

<210> 29

<211> 1572

<212> ADN

<213> Thalassiosira pseudonana

<400> 29

<210> 30

<211> 511

<212> PRT

<213> Thalassiosira pseudonana

<400> 30

<210> 31

<211> 1791

<212> ADN

<213> Thalassiosira pseudonana

<400> 31

<210> 32

<211> 596

<212> PRT

<213> Thalassiosira pseudonana

<400> 32

<210> 33

<211> 407 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Dominio conservado comprendido dentro de la SEQ ID NO: 02 y dentro de la SEQ ID NO: 04

<400> 33

<210> 34

<211> 2194

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 34

5

<210> 35 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> cebador: prm09458 <400> 35 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aaacaatgat gcaggccggg 50

15

<210> 36 <211> 49 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20

<220> h<223> cebador: prm09459

<400> 36 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta cacgagcagc aattaaacc

49

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para incrementar el vigor temprano, la biomasa, y/o el rendimiento de semilla en plantas cultivadas bajo condiciones no estresadas con relación a plantas que sirven como control, que comprende incrementar la expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido transportador de amonio (AMT), en donde el polipéptido AMT comprende un dominio que tiene al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más con un Dominio Conservado (DC) como el representado por la SEQ IS NO: 33, y opcionalmente seleccionar las plantas que tienen mayor vigor temprano, biomasa, y/o rendimiento de semilla, en donde dicho polipéptido AMT tiene al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más con el polipéptido AMT como el representado por la SEQ ID NO: 2.

2. 2.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT se representa por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 1 o una porción de la misma que es de al menos 1380 o más nucleótidos consecutivos de longitud, o una secuencia capaz de hibridar con la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 1.

3. 3.

   Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde dicha mayor expresión se efectúa por una cualquiera o más de: marcación de la activación de ADN-T, TILLING, o recombinación homóloga.

4. 4.

   Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde dicha mayor expresión se efectúa por medio de la introducción y expresión en una planta de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT.

5. 5.

   Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde dicha secuencia de ácido nucleico está operativamente enlazada a un promotor constitutivo.

6. 6.

   Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde dicha secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT es de Heterokontophyta phylum.

7. 7.

   El uso de una construcción que comprende:

   (a)

   una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT como se define en la reivindicación 1 o 2 y del orden de Pennales;

   (b)

   una o más secuencias control capaces de dirigir la expresión de la secuencia del ácido nucleico de (a); y opcionalmente

   (c)

   una secuencia de terminación de la transcripción en donde dicha secuencia de control es un promotor GOS2 constitutivo de una planta, en un método para elaborar plantas que tienen mayor vigor temprano, biomasa, y/o rendimiento de semilla con relación a plantas que sirven de control.

8. 8. Un método para la producción de plantas transgénicas que tienen mayor vigor temprano, biomasa, y/o rendimiento de semilla con relación a plantas que sirven de control, que comprende:

   (i)

   la introducción y expresión en una planta, parte de una planta, o una célula de una planta, de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, bajo el control de un promotor constitutivo de una planta; y

   (ii)

   el cultivo de la célula de la planta, parte de la planta, o la planta bajo condiciones no estresadas que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.

9. 9. El uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMT como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en incrementar el vigor temprano, la biomasa, y/o el rendimiento de semilla en plantas cultivadas bajo condiciones no estresadas.

   SEQ ID NO: 1 Secuencia de ácido nucleico de longitud completa Phatr_AMT1 de Phaeodactylum tricornutum

   SEQ ID NO: 2 Secuencia del polipéptido completamente traducido Phatr_AMT1 de Phaeodactylum tricornutum

   SEQ ID NO: 3 Secuencia partcial de ácido nucleico de longitud completa Phatr_AMT1 de Phaeodactylum tricornutum

   FIGURA 5

   SEQ ID NO: 4 Secuencia parcial del polipéptido Phatr_AMT1 de Phaeodactylum tricornutum

   SEQ ID NO: 5 Secuencia de ácido nucleico Phatr_AMT2 de Phaeodactylum tricornutum

   FIGURA 5 (continuación)

   SEQ ID NO: 6 Secuencia traducida del polipéptido Phatr_AMT2 de Phaeodactylum tricornutum

   SEQ ID NO: 7 Secuencia de ácido nucleico Phatr_AMT3 de Phaeodactylum tricornutum

   SEQ ID NO: 8 Secuencia traducida del polipéptido Phatr_AMT3 de Phaeodactylum tricornutum

   FIGURA 5 (continuación)

   SEQ ID NO: 9 Secuencia de ácido nucleico Phatr_AMT4 de Phaeodactylum tricornutum

   SEQ ID NO: 10 Secuencia traducida de polipéptido Phatr_AMT4 de Phaeodactylum tricornutum

   SEQ ID NO: 11 Secuencia de ácido nucleico Phatr_AMT5 de Phaeodactylum tricornutum

   FIGURA 5 (continuación)

   SEQ ID NO: 12 Secuencia traducida del polipéptido Phatr_AMT5 de Phaeodactylum tricornutum

   SEQ ID NO: 13 Secuencia de ácido nucleico Phatr_AMT6 de Phaeodactylum tricornutum

   FIGURA 5 (continuación)

   SEQ ID NO: 14 Secuencia traducida del polipéptido Phatr_AMT6 de Phaeodactylum tricornutum

   SEQ ID NO: 15 Secuencia de ácido nucleico Phatr_AMT7 de Phaeodactylum tricornutum

   FIGURA 5 (continuación)

   SEQ ID NO: 16 Secuencia traducida del polipéptido Phatr_AMT7 de Phaeodactylum tricornutum

   SEQ ID NO: 17 Secuencia de ácido nucleico Cylfu_AMT1 de Cylindrotheca fusiformis

   FIGURA 5 (continuación)

   SEQ ID NO: 18 Secuencia traducida del polipéptido Cylfu_AMT1 de Cylindrotheca fusiformis

   SEQ ID NO: 19 Secuencia de la variante de ácido nucleico Cylfu_AMT1 de Cylindrotheca fusiformis

   SEQ ID NO: 20 Secuencia traducida de la variante del polipéptido Cylfu_AMT1 de Cylindrotheca fusiformis

   FIGURA 5 (continuación)

   SEQ ID NO: 21 Secuencia de ácido nucleico Cylfu_AMT2a de Cylindrotheca fusiformis

   SEQ ID NO: 22 Secuencia traducida del polipéptido Cylfu_AMT2a de Cylindrotheca fusiformis

   SEQ ID NO: 23 Secuencia de ácido nucleico Thaps_AMT1 de Thalassiosira pseudonana

   FIGURA 5 (continuación)

   SEQ ID NO: 24 Secuencia traducida del polipéptido Thaps_AMT1 de Thalassiosira pseudonana

   SEQ ID NO: 25 Secuencia de ácido nucleico Thaps_AMT2 de Thalassiosira pseudonana

   FIGURA 5 (continuación)

   SEQ ID NO: 26 Secuencia traducida del polipéptido Thaps_AMT2 de Thalassiosira pseudonana

   SEQ ID NO: 27 Secuencia de ácido nucleico Thaps_AMT3 de Thalassiosira pseudonana

   FIGURA 5 (continuación)

   SEQ ID NO: 28 Secuencia traducida del polipéptido Thaps_AMT3 de Thalassiosira pseudonana

   SEQ ID NO: 29 Secuencia de ácido nucleico Thaps_AMT4 de Thalassiosira pseudonana

   SEQ ID NO: 30 Secuencia traducida del polipéptido Thaps_AMT4 de Thalassiosira pseudonana

   FIGURA 5 (continuación)

   SEQ ID NO: 31 Secuencia de ácido nucleico Thaps_AMT6 de Thalassiosira pseudonana

   SEQ ID NO: 32 Secuencia traducida del polipéptido Thaps_AMT6 de Thalassiosira pseudonana

   SEQ ID NO: 33 Dominio Conservado comprendido dentro de la SEQ ID NO: 2 y dentro de la SEQ ID NO: 4

   FIGURA 5 (continuación)

   SEQ ID NO: 34 Promotor GOS2 de Oryza sativa

   SEQ ID NO: 35 Prm09458

   SEQ ID NO: 36 Prm09459

   FIGURA 5 (continuación)