ES2358913T3 - Plantas que tienen características de crecimiento mejoradas y método para obtener la mismas. - Google Patents

Abstract

Método para incrementar en rendimiento de una planta, con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre, que comprende un aumento de la actividad en una planta de una proteína y seleccionar las plantas que tienen mayor rendimiento con relación a la correspondiente planta de tipo silvestre, siendo dicha proteína seleccionada del grupo que consiste de a) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEQ ID NO: 2; b) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 35% idéntica a la secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEQ ID NO: 2 que tiene actividad transportadora de cationes; c) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 35% idéntica a la secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEQ ID NO: 2 que tiene actividad transportadora de cationes y contiene una secuencia de consenso como la mostrada en la SEQ ID NO: 9; d) una proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 1; y e) una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones rigurosas a la secuencia de ácido nucleico como la mostrada en la SEQ ID NO: 1, en donde la proteína tiene actividad trasportadora de cationes.

Description

La presente invención se relaciona en general con el campo de la biología molecular y tiene que ver con un método para mejorar las características de crecimiento de una planta. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un método para mejorar las características de crecimiento de una planta, en particular para incrementar el rendimiento, incrementando la actividad en una planta de una proteína cotransportadora de Na+ - K+ (HKT) o un homólogo de la misma. La presente divulgación también se relaciona con plantas que tienen mayor actividad de HKT, donde dichas plantas tienen mejores características de crecimiento con respecto a las plantas correspondientes de tipo silvestre. La divulgación también provee construcciones útiles en los métodos de la invención.

En razón a una población mundial siempre creciente y a la disminución del área de las tierras disponibles para la agricultura, sigue siendo un objetivo fundamental para la investigación en agricultura el mejoramiento de la eficiencia en las prácticas agrícolas y el incremento de la diversidad de las plantas en horticultura. Los medios convencionales para mejoras hortícolas y de los cultivos utilizan técnicas selectivas de fitomejoramiento para identificar las plantas que tienen características deseables. Sin embargo, tales técnicas selectivas de fitomejoramiento tienen varios inconvenientes, a saber, que esas técnicas son típicamente de mano de obra intensiva y resultan en plantas que contienen a menudo complementos genéticos heterogéneos que no siempre resultan en la trasmisión del rasgo deseable por parte de las plantas madre. Los avances en biología molecular le han permitido al género humano manipular el germoplasma de animales y de plantas. La modificación por ingeniería genética de las plantas implica el aislamiento y la manipulación de material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de ese material genético en una planta. Tal tecnología ha conducido al desarrollo de plantas que tienen diferentes rasgos hortícolas, agronómicos o económicos mejorados. Los rasgos de interés económico particular son características de desarrollo tales como una alta productividad. Normalmente se define la productividad como la producción medible de valor económico de un cultivo. Esta puede ser definida en términos de cantidad y/o de calidad. La productividad depende directamente de diferentes factores, por ejemplo, del número y tamaño de los órganos, de la arquitectura de la planta (por ejemplo, el número de ramas), de la producción de semilla y más. El desarrollo de la raíz, la absorción de nutrientes y la tolerancia al estrés pueden ser también factores importantes para la determinación de la productividad. Se puede incrementar por lo tanto la productividad del cultivo optimizando uno de los factores anteriormente mencionados.

Un factor de estrés abiótico principal para las plantas es la salinidad. El estrés por salinidad, y en particular el estrés por Na+, puede influir negativamente sobre diferentes procesos celulares. Además del daño hiperosmótico, que incluye la disfunción de la membrana, altas concentraciones de sodio pueden interferir con enzimas sensibles al Na+ y puede dar como resultado un trasporte distorsionado de los iones (para un resumen de las respuestas celulares y moleculares, ver Hasegawa et al., 2000. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51, 463 - 499). Por otro lado, el potasio es un nutriente importante, necesario para neutralizar cargas negativas sobre las proteínas, activación de enzimas que dependen de K+, mantenimiento de la turgencia celular y homeostasis osmótica. El transporte de Na+ y K+ están relacionados entre sí: los datos experimentales indican que ambos iones utilizan las mismas proteínas de transporte y las plantas pueden compensar la disminución del potasio incorporando sodio (Pitman, 1967. Nature 216, 1343 - 1344; Pitman et al., 1968. Aust. J. Biol. Sci 21, 871 - 881). Los canales de cationes monovalentes insensibles al voltaje (VIC) pueden jugar un papel importante en la absorción de Na+ y K+ en células vegetales (White, 1999. Trends Plant Sci. 4, 245 - 246). Además, se han descrito varias proteínas para absorción de K+ en Arabidopsis (Maser et al., 2001. Plant Physiol. 126: 1646 - 1667): las proteínas de canal tipo AKT/KAT, las proteínas trasportadoras tipo HAK/AT/KUP y las proteínas trasportadoras tipo HKT. Las proteínas HKT de la planta son parte de una superfamilia de trasportadores de cationes que también incluyen las proteínas Trk de levadura y las proteínas KdpA, KrkH y KtrB de procariotas (Schachtman & Liu, 1999. Trends Plant Sci. 4, 281 - 286).

Se demostró que la proteína transmembrana AtHKT1 está también involucrada en la absorción de Na+ en las raíces y en la tolerancia a la sal en Arabidopsis (Uozumi et al., 2000. Plant Physiol. 122, 1249 - 1259; Rus et al., 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 14150 - 14155); su contraparte del arroz (OsHKT1) cumple una función similar bajo condiciones de privación de potasio (Garciadeblás et al, 2003. Plant J. 34, 788 - 801). También se reportó que AtHKT1 es importante en la recirculación de Na+ desde los brotes hasta las raíces, contribuyendo así a la tolerancia de la sal por la planta (Berthomieu et al, 2003. EMBO J. 22, 2004 - 2014). En arroz, se han identificado y caracterizado 9 tipos de transportadores HKT (Garciadeblás et al, 2003. Plant J. 34, 788 - 801, Horie et al, 2001. Plant J. 27, 129 - 138). Además, HKT1 del arroz no solamente media en el transporte de Na+ y K+, sino que también media en el trasporte de otros cationes alcalinos (Golldack et al., 2002. Plant J. 31, 529 - 542). El efecto de niveles altos y bajos de proteína HKT1 fue estudiado en el arroz (Golldack et al., 2002): la línea tolerante a la sal Pokkali y la línea sensible a la sal IR29 difieren significativamente entre sí en su habilidad para absorber o excluir sodio. Altas concentraciones de iones alcalinos reprimieron la expresión de OsHKT1 en ambas líneas, pero esta represión fue menos pronunciada en tejidos vasculares de raíces y de hojas de la línea IR29 que en la línea tolerante a la sal Pokkali.

Pocos datos están disponibles con respecto a expresión heteróloga de genes HKT1 en plantas. Schroeder y Schachtman (WO96/05722) divulgan una proteína HKT1 de trigo y sugieren el uso de esta proteína HKT1 para modular la absorción de sal del ambiente por medio de la manipulación de su expresión, resultando en plantas que pueden ser utilizadas para desalinización (aumento de la absorción de sodio por expresión mejorada de HKT1) o en plantas que son resistentes a metales alcalinos tóxicos (disminución o inhibición de la absorción por represión de la expresión de HKT1). Sin embargo, como demostraron Laurie et al. (Plant J. 32, 139 - 149, 2002), las plantas que sobreexpresan HKT1 tenían un fenotipo que no era muy diferente del de las plantas de control: bajo estrés de NaCl, se redujo el peso fresco de la línea que sobreexpresa HKT1 en un grado similar al de las plantas de control y no hubo un incremento significativo en el contenido de Na+ de las raíces, comparado con el control. Laurie et al. También han demostrado que las condiciones para obtener una menor expresión de HKT1 son bastante complejas. Hasta ahora, el estado del arte relacionado con HKT1 se enfocó principalmente en el transporte de cationes y en la homeostasis de iones, y se efectuaron muchos estudios en levadura o Xenopus oocytes, cuyos resultados no reflejan completamente la función de HKT1 en las plantas.

AtHKT1 es una proteína codificada por un solo gen en Arabidopsis thaliana. Se cree que el gen está presente en todos los genomas de las plantas, y muchas veces está presente como una pequeña familia de genes, por ejemplo como el arroz. El gen AtHKT1 se expresa en las raíces y en menor medida en otros tejidos (Uozumi et al., 2000). Se construyó un modelo tridimensional de una proteína del tipo HKT utilizando análisis de secuencia e hidrofobicidad (Durell et al., Biophys. J. 77, 775 - 788, 1999; Durell y Guy, Biophys. J. 77, 789 - 807, 1999): se demostró que la proteína es hidrófoba e incluye una estructura central de ocho dominios transmembrana que flanquean cuatro bucles que forman un poro (en otras palabras: cuatro unidades de un dominio transmembrana - dominio que forma un poro

- dominio transmembrana), se predijo que cada dominio que forma un poro está localizado parcialmente dentro de la membrana (ver la Figura 1) y comprende un residuo conservado de Glicina o Serina. La expresión heteróloga de AtHKT1 de tipo silvestre reveló que esta proteína media selectivamente el trasporte de Na+ mientras que el trasporte de K+ se presentó en un menor grado (Uozumi et al., 2000). Otras proteínas HKT de diferentes especies de plantas mostraron una actividad cotransportadora de Na+/K+. Se cree que la selectividad iónica está determinada por el primer dominio formador de poro (o bucle P). Cambiando Ser-68 por Glicina en el gen AtHKT1 restableció la permeabilidad para el K+. Los residuos de glicina correspondientes a la Gly-68 mutada de AtHKT1 fueron encontrados en otras proteínas HKT; se demostró que esta es la primera Gly en un motivo "GYG" conservado que funciona como un filtro de selectividad iónica (Mäser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 6428 - 6433, 2002). Además de Na+ y K+, proteínas de tipo HKT también demostraron trasportar otros cationes como Rb+, Li+ y Cs+ (Golldack et al., 2002). Además de Arabidopsis, se aislaron proteínas HKT de muchas otras especies de plantas, incluido arroz, trigo, Eucalyptus camaldulensis, Hordeum vulgare y Mesembryanthemum crystallinum.

Sorprendentemente se ha encontrado ahora que una creciente actividad de una proteína HKT o un homólogo de la misma en una planta da lugar a plantas que tienen características de crecimiento mejoradas comparado con plantas de tipo silvestre, en particular bajo condiciones no estresantes.

De acuerdo con una modalidad de la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de una planta como se describe en la reivindicación 1. Opcionalmente se puede seguir una etapa para seleccionar plantas que tengan mayor rendimiento. Convenientemente, la realización de los métodos de acuerdo con la presente invención resulta en plantas que tienen mayor rendimiento, particularmente rendimiento de semilla.

El término “mayor rendimiento” como se define aquí pretende significar un incremento en uno o más de los siguientes, cada uno con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre: (i) mayor biomasa (peso) de una o más partes de una planta, particularmente las partes que están por encima del suelo (cosechables), mayor biomasa de raíces o mayor biomasa de cualquier otra parte cosechable; (ii) mayor rendimiento total de semillas, que incluye un incremento en la biomasa de las semillas (peso de las semillas) y que puede ser un incremento en el peso de las semillas por planta o con base en una semilla individual; (iii) mayor número de semillas (llenas); (iv) mayor tamaño de las semilla; (v) mayor volumen de las semillas, (vi) mayor área de las semillas individuales; (vii) mayor longitud de las semillas individuales; (viii) mayor índice de cosecha, que se expresa como la proporción del rendimiento de las partes cosechables, tal como semillas, sobre la biomasa total; (ix) mayor número de floretes por panícula que se extrapola del número total de semillas contabilizadas y del número de panículas primarias; y (x) mayor peso de mil granos (TKW), que se extrapola a partir del número de semillas llenas contabilizadas y su peso total. Un mayor TKW puede resultar de un mayor tamaño de la semilla (largo, ancho o ambos) y/o mayor peso de la semilla. Un mayor TKW puede resultar de un incremento en el tamaño del embrión y/o el tamaño del endospermo.

Tomando al maíz como ejemplo, un mayor rendimiento puede manifestarse como uno o más de los siguiente: un incremento en el número de plantas por hectárea o por acre, un incremento en el número de espigas por planta, un incremento en el número de hileras, en el número de granos por hilera, en el peso del grano, TKW, en la longitud/diámetro de las espigas, entre otros. Tomando al arroz como ejemplo, un mayor rendimiento puede manifestarse como un incremento en uno o más de los siguiente: en el número de plantas por hectárea o por acre, en el número de panículas por planta, en el número de espiguillas por panícula, en el número de flores por panícula, un incremento en la tasa de llenado de la semillas, un incremento en TKW, entre otros. Un incremento en el rendimiento puede resultar también en una arquitectura modificada, o puede ocurrir como resultado de una arquitectura modificada.

El desempeño de los métodos de acuerdo con la presente invención resulta en plantas que tienen mayor rendimiento y más particularmente, mayor biomasa y/o mayor rendimiento de semilla.

Ya que las plantas mejoradas de acuerdo a la presente invención tienen un mayor rendimiento, es probable que estas plantas exhiban una mayor tasa de crecimiento (al menos durante parte de su ciclo de vida), con relación a la tasa de crecimiento de las correspondientes plantas de tipo silvestre en una etapa correspondiente en su ciclo de vida. La mayor tasa de crecimiento puede ser específica para una o más partes o tipos de células de una planta (incluidas las semillas), o puede ser sustancialmente a través de la planta completa. Las plantas que tienen una mayor tasa de crecimiento pueden tener un ciclo de vida más corto. El ciclo de vida de una planta puede ser entendido como el tiempo necesario para crecer a partir de una semilla madura seca hasta la etapa en la cual la planta ha producido semillas maduras secas, en forma similar al material de partida. Este ciclo de vida puede estar influenciado por factores tales como el vigor inicial, la tasa de crecimiento, el período de floración y la velocidad de maduración de la semilla. Un incremento en la tasa de crecimiento puede presentarse en una o más etapas en el ciclo de vida de una planta o sustancialmente durante el ciclo de vida completo de la planta. Una mayor tasa de crecimiento durante las primeras etapas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar un vigor mejorado. El incremento en la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta permitiendo que las plantas sean sembradas más tarde y/o cosechadas más pronto de lo que sería posible. Si se incrementa suficientemente la tasa de crecimiento, se posibilitaría la siembra de más semillas de la misma especie de planta (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de arroz seguido por la siembra y cosecha de más plantas de arroz todo dentro de un período de crecimiento convencional). En forma similar, si se incrementa suficientemente la tasa de crecimiento, se posibilitaría la siembra adicional de semillas de diferentes especies de plantas (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de arroz seguido por, por ejemplo, la siembra y cosecha opcional de soja, patatas o cualquier otra planta adecuada). Puede ser posible entonces realizar varias cosechas del mismo rizoma en el caso de algunas plantas. La alteración del ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un incremento en la producción anual de biomasa por acre (debido a un incremento en el número de veces (digamos en un año) que puede ser cultivada y cosechada una planta particular). Un incremento en la tasa de crecimiento puede permitir también en cultivo de plantas transgénicas en áreas geográficas más amplias que sus contrapartes de tipo silvestre, ya que las limitaciones territoriales para el desarrollo de un cultivo a menudo están determinadas por condiciones ambientales adversas ya sea en el momento de la siembra (comienzo de la temporada) o al momento de la cosecha (fin de la temporada). Tales condiciones adversas pueden ser evitadas si se acorta el ciclo de la cosecha. La tasa de crecimiento puede estar determinada por diferentes parámetros que se derivan de las gráficas de las curvas de crecimiento de experimentos de crecimiento, tales parámetros pueden ser: T Medio (el tiempo que le toma a las plantas alcanzar el 50% de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que le toma a las plantas el 90% de su tamaño máximo), entre otros.

Un incremento en la productividad y/o en la tasa de crecimiento se presenta ya sea que la planta se encuentre bajo condiciones no estresantes o que la planta esté expuesta a diferentes tipos de estrés comparado con las plantas de control. Debe entenderse por lo tanto que en la presente invención el incremento en rendimiento y/o en la tasa crecimiento no depende de las condiciones de crecimiento, ya sea que sean condiciones de estrés o no estresantes. Las plantas responden típicamente a la exposición al estrés desarrollándose más lentamente. En condiciones de estrés severo, la planta puede incluso detener su crecimiento completamente. Por otro lado se define aquí un estrés moderado como un tipo de estrés al cual está expuesta una planta que no conduce a que la planta deje de crecer completamente sin la capacidad para reanudar el crecimiento. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos con pesticidas) no se encuentran a menudo estreses severos en plantas de cultivo. En consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por un estrés moderado es a menudo una característica indeseable para la agricultura. Los estreses moderados son los estreses típicos a los cuales puede estar expuesta una planta. Estos estreses pueden ser los estreses bióticos y/o abióticos diarios (ambientales) a los cuales está expuesta una planta. Los estreses ambientales o abióticos típicos incluyen estreses por temperatura causados por un calentamiento atípico o temperaturas frías/congelantes; estrés por salinidad; estrés por agua (sequía o exceso de agua). Los estreses abióticos pueden ser causados también por compuestos químicos. Los estreses bióticos son típicamente aquellos estreses provocados por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos e insectos. El término “condiciones no estresantes” como se lo utiliza aquí son aquellas condiciones ambientales que no van significativamente más allá de las condiciones climáticas diarias y otros condiciones abióticas que pueden encontrar las plantas. Las personas capacitadas en el arte son conscientes de las condiciones normales del suelo y de las condiciones climáticas para una ubicación geográfica dada.

Las características de crecimiento anteriormente mencionadas pueden ser modificadas convenientemente en cualquier planta.

El término “planta” como se lo utiliza aquí abarca a plantas enteras, ancestros y progenie de las plantas y partes de las plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluidos tubérculos), flores, y tejidos y órganos, en donde cada uno de los anteriormente mencionados incluye al gen/ácido nucleico de interés o la modificación específica en el gen /ácido nucleico de interés. El término “planta” también abarca células vegetales, cultivos en suspensión, tejido de callo, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen, y microesporas, nuevamente donde cada uno de los anteriormente mencionados incluyen al gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen algas, helechos y todas las plantas que pertenecen a la superfamilia de Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluyendo forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles, o arbustos seleccionados de la lista que comprende Abelmoschus spp., Acer spp., Actinidia spp., Agropyron spp., Allium spp., Amaranthus spp., Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arabidopsis thaliana, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena sativa, Averrhoa carambola, Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp., Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carthamus tinctorius, Carya spp., Castanea spp., Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Cola spp., Colocasia esculenta, Corylus spp., Crataegus spp., Cucumis spp., Cucurbita spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Eleusine coracana, Eriobotrya japonica, Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp., Gossypium hirsutum, Helianthus spp., Hibiscus spp., Hordeum spp., Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lemna spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Macrotyloma spp., Malpighia emarginata, Malus spp., Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Panicum miliaceum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Persea spp., Petroselinum crispum, Phaseolus spp., Phoenix spp., Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Rubus spp., Saccharum spp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Solanum spp., Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp., Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otros.

De acuerdo a una característica preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo que incluye soja, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, patata o tabaco. Más preferiblemente, la planta de acuerdo con la presente invención es una planta monocotiledónea tal como caña de azúcar, lo más preferible un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, mijo, cebada, centeno, avena o sorgo.

La actividad de una proteína HKT o de un homólogo de la misma puede ser incrementada incrementando los niveles del polipéptido HKT, por ejemplo incrementando el nivel de ácidos nucleicos que codifican una proteína HKT. Alternativamente, también se puede incrementar la actividad cuando no existen cambios en los niveles de una HKT,

o incluso cuando existe una reducción en los niveles de una HKT. Esto puede presentarse cuando se alteran las propiedades intrínsecas del polipéptido, por ejemplo elaborando un mutante o seleccionando una variante que sea más activa que el tipo silvestre.

El término proteína “HKT” o un homólogo de la misma como se define aquí se refiere a un polipéptido con actividad de HKT y cuyo polipéptido contiene cuatro unidades de un domino transmembrana - un dominio formador de poro un dominio transmembrana. La proteína HKT tiene una secuencia como la representada por la SEQ ID NO: 2, o es un homólogo de la misma que tiene en orden creciente de preferencia al menos 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidad de la secuencia total con el aminoácido representado por la SEQ ID NO: 2 que tiene actividad de trasportes de catión. La identidad total de la secuencia se determina utilizando un algoritmo de alineación que puede realizar las alineaciones globales, tal como el algoritmo de Needleman-Wunsch en el programa GAP (GCG, Wisconsin Package, Accelrys).

Una proteína "HKT o un homólogo de la misma" que cae dentro de la definición anterior puede ser fácilmente identificada utilizando técnicas de rutina bien conocidas por las personas capacitadas en el arte. Por ejemplo, la actividad de HKT como trasportador de catión puede ser determinada fácilmente in vitro o in vivo utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Por ejemplo, la complementación y el efecto sobre la absorción de K+ tras la clonación de un gen HKT en la cepa LB2003 de Escherichia coli (deficiente para los sistemas de absorción de K+ Trk, Kup y Kdp) se puede analizar cómo lo describen Uozumi et al. (2000). En forma similar, la cepa CY162 de Saccharomyces cerevisiae (deficiente para los sistemas de absorción de alta afinidad trk1 y trk2) puede ser complementada por clonación de un gen HKT, mientras que la cepa de levadura G19 (deficiente para los genes de ATPasa ENA1 hasta ENA4 que extruyen Na+) o una cepa de levadura de tipo silvestre exhibirá inhibición del crecimiento tras la clonación de un gen HKT (Horie et al., 2001). Alternativamente, se puede realizar un ensayo de tensión de humedad utilizando ovocitos de Xenopus laevis (ver por ejemplo Horie et al., 2001) o una prueba de absorción/reducción de cationes en raíces o levaduras como lo describen Garciadeblas et al. (Plant J. 34, 788-801, 2003) y Banuelos et al. (Plant Physiol. 130, 784 - 795, 2002). Al menos uno de los ensayos anteriormente mencionados (u otros ensayos conocidos en el arte) demostrará la actividad de trasporte de cationes de una proteína HKT o un homólogo de la misma. Alternativamente, tal "proteína HKT o un homólogo de la misma", cuando se expresa bajo el control de un promotor WSI18 en la variedad de cultivo Nipponbare de Oryza sativa, se incrementa el rendimiento de semilla comparado con las correspondiente planas de tipo silvestre. Este incremento en rendimiento de semilla se puede medir en diferentes formas, por ejemplo como un incremento del número de semillas llenas. La mayor actividad de HKT abarca por lo tanto al menos uno de los mayores niveles de un ácido nucleico que codifica una proteína HKT o un homólogo de la misma, mayores niveles de una proteína HKT o un homólogo de la misma, mayor actividad trasportadora o mayor rendimiento de semilla.

Las técnicas para medir los mayores niveles de un ácido nucleico que codifica HKT son conocidas en el arte e incluyen por ejemplo Transferencias tipo Northern, PCR Cuantitativo o PCR en Tiempo Real. Se pueden determinar mayores niveles de proteína HKT utilizando por ejemplo Transferencias tipo Western, estimando la intensidad de la banda/mancha después de electroforesis en gel de una muestra de proteína cruda, o analizando la actividad enzimática (si procede).

Los diferentes dominios estructurales en una proteína HKT pueden ser identificados utilizando bases de datos especializadas, por ejemplo, SMART (Schultz y colaboradores (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857 - 5864; Letunic y colaboradores (2002) Nucleic Acids Res 30, 242 -244; http://smart.embl-heidelberg.de/), InterPro (Mulder y colaboradores, (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315 -318; http://www.ebi.ac.uk/interpro/), Prosite (Bucher y Bairoch (1994), A generalizad profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., páginas 53 - 61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo y colaboradores, Nucl. Acids. Res. 32: D134 - D137, (2004), http://www.expasy.org/prosite/) o Pfam (Bateman y colaboradores, Nucleic Acids Research 30(1): 276 - 280 (2002), http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/).

Los dominios estructurales en una proteína HKT son conocidos en el arte y el modelo topológico está soportado por evidencia experimental (Kato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 6488 - 6493, 2001). El grupo HKT de proteínas consiste de proteínas que comprenden cuatro unidades "dominio transmembrana - dominio de poro - dominio transmembrana " (MPM). Cada uno de los cuatro dominios formadores de poro incluye un residuo conservado de Glicina o Serina. El residuo conservado de Glicina (o Serina) en el primer dominio de formación de poro (indicado por un asterisco en el dominio A en la Figura 1) determina la especificidad del catión. Cada unidad del MPM comprende un motivo del MPM como el caracterizado por Durell et al. (1999). Por ejemplo, la cuarta unidad de MPM en AtHKT1 (SEQ ID NO: 2) incluye el motivo:

imagen1

(SEQ ID NO: 7), en donde las partes subrayadas en negrilla de la secuencia representa el motivo transmembrana y la parte subrayada en cursiva indica el motivo del bucle que forma el poro, con el residuo conservado de Glicina en cursiva en negrilla.

Las proteínas HKT, tales como la SEQ ID NO: 2, también incluyen un dominio TrkH (número de acceso Pfam PF02386, acceso Interpro IPR003445) (comenzando en G145 y terminando con Y502 para la SEQ ID NO: 2), que es característico para un grupo de proteínas que comprende proteínas para trasporte de potasio (Trk) y la subunidad J de ATP sintasa de sodio tipo V o la translocación ATPasa J.

Preferiblemente, la proteína HKT útil en la presente invención incluye en el cuarto dominio formador de poro una secuencia de consenso correspondiente a EVISAYGNVGFTTGY (SEQ ID NO: 8) en donde los residuos indicados en negrilla están invariablemente conservados y en donde los otros residuos pueden variar (ver por ejemplo la Figura 2). Preferiblemente, la secuencia de consenso en el cuarto dominio formador de poro corresponde a E(V,I) (I,V)SA(Y,F)G(N,T) (V,A,I)G(F,L,Y) (T,S) (T,I,L,V,M)GY (SEQ ID NO:9). Más preferiblemente, la secuencia de consenso en el cuarto dominio formador de poro corresponde a E(V,I) (I,V)SA(Y,F)GNVG(F,L,Y) (T,S) (T,L,V)GY.

Alternativamente, la proteína HKT útil en los métodos de la presente invención incluye en el cuarto dominio formador de poro una firma de secuencia SA(Y,F)GN y una firma de secuencia DP(I,L)N(Y,F,L) (SEQ ID NO: 10). Preferiblemente, la secuencia de firma de la SEQ ID NO: 10 es DP(I,L)NF.

Si un polipéptido tiene al menos 35% de identidad con el aminoácido representado por la SEQ ID NO: 2 puede ser fácilmente establecido por medio de Métodos de alineación de secuencia para la búsqueda e identificación de homólogos de HKT, lo cual estaría dentro del ámbito de las personas capacitadas en el arte. Tales métodos incluyen la comparación de las secuencias representadas por la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, en un formato legible por un ordenador, con secuencias que están disponibles en bases públicas de datos tales como MIPS (http://mips.gsf.de/), GenBank (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html) o la EMBL Nucleotide Sequence Database (http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html), utilizando algoritmos bien conocidos en el arte para la alineación o

comparación de secuencias, tales como GAP (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48; 443 - 453 (1970)), BESTFIT (utilizando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2; 482 -489 (1981))), BLAST (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J., J. Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990)), FASTA y TFASTA (W. R. Pearson y D. J. Lipman Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444 - 2448 (1988)), o 5 utilizando, por ejemplo, el programa de alineación múltiple VNTI AlignX, basado en un algoritmo Clustal W modificado (InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com), con la configuración predeterminada para penalización por abertura de espacios de 10 y una extensión de espacios de 0,05. El software para llevar a cabo análisis BLAST se encuentra públicamente disponible a través del National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Los homólogos mencionados más abajo fueron identificados utilizando parámetros predeterminados de

10 BLAST (matriz BLOSUM62, penalización por abertura de espacios de 11 y extensión de espacios de 1) y preferiblemente las secuencias de longitud completa son utilizadas para análisis.

Los ejemplos de polipéptidos que caen bajo la definición de una "HKT o un homólogo de la misma" incluyen dos homólogos de Eucalyptus camandulensis (SEQ ID NO: 16, Acceso del GenBank No. AAF97728 y SEQ ID NO: 18, Acceso del GenBank No. AAD53890); dos homólogos de Mesembryanthemum crystallinum (SEQ ID NO: 14, Acceso 15 del GenBank No. AAK52962 y SEQ ID NO: 12, Acceso del GenBank No. AAO73474). Otros homólogos adecuados para la realización del método de acuerdo con la invención incluyen los homólogos de arroz representados en los Accesos del GenBank Nos. AAG37274 (OsHKT1, SEQ ID NO: 20), BAB61791 (OsHKT2, SEQ ID NO: 22), CAD37187 (OsHKT3, SEQ ID NO: 24), CAD37183 (OsHKT4, SEQ ID NO: 26), CAD37185 (OsHKT6, SEQ ID NO: 28), CAD37197 (OsHKT7, SEQ ID NO: 30), BAB93392 (OsHKT8, SEQ ID NO: 32) y CAD37199 (OsHKT9, SEQ ID 20 NO: 34), y un homólogo del trigo (Acceso del GenBank No. AAA52749, SEQ ID NO: 36). No obstante puede preverse que los homólogos de HKT con una identidad de secuencia menor al 35% con la SEQ ID NO: 2 pueden ser aún adecuados en los métodos de la presente invención; ejemplos de tales proteínas son un homólogo de Suaeda maritima (SEQ ID NO: 38, Acceso del GenBank No. AY530754), u homólogos no vegetales tales como TRK1 de levadura (SEQ ID NO: 40, Acceso del GenBank No. NP_012406) o TRK2 (SEQ ID NO: 42, Acceso del GenBank No.

25 CAA82128) o TRK1 de Saccharomyces uvarum (Acceso del GenBank No. JU0466 o AAA34661).

La Tabla 1 enlista ejemplos de proteínas HKT y homólogos de otros organismos, la longitud de la proteína y su identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2.

Tabla 1

Secuencia de la proteína

aa de longitud % de identidad con AAF68393-AtHKT1

SEQ ID NO: 2

AAF68393-AtHKT1 506 100,0

SEQ ID NO: 12

AAO73474-McHKT2 543 43,2

SEQ ID NO: 14

AAK52962-McHKT1 505 43,0

SEQ ID NO: 16

AAF97728-EcHKT1 550 46,0

SEQ ID NO: 18

AAD53890-EcHKT2 549 45,5

SEQ ID NO: 36

AAA52749-TaHKT1 533 36,9

SEQ ID NO: 20

AAG37274-OsHKT1 530 36,9

SEQ ID NO: 22

BAB61791-OsHKT2 530 37,0

SEQ ID NO: 24

CAD37187-OsHKT3 509 35,1

SEQ ID NO: 26

CAD37183-OsHKT4 552 37,1

SEQ ID NO: 28

CAD37185-OsHKT6 531 43,1

SEQ ID NO: 30

CAD37197-OsHKT7 500 42,2

SEQ ID NO: 32

BAB93392-OsHKT8 554 42,0

SEQ ID NO: 34

CAD37199-OsHKT9 509 35,1

SEQ ID NO: 38

AY530754-SmHKT1 485 33,5

SEQ ID NO: 40

NP_012406-ScTRK1 1235 11,3

SEQ ID NO: 42

CAA82128-ScTRK2 889 13,9

SEQ ID NO: 44

JU0466-SuTRK1 1241 9,7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

At, Arabidopsis thaliana; Mc, Mesembryanthemum crystallinum; Ec, Eucalyptus camaldulensis; Ta, Triticum aestivum; Os, Oryza sativa; Sc, Saccharomyces cerevisiae; Sm, Suaeda maritima; Su, Saccharomyces uvarum.

A pesar de lo que puede parecer una homología de secuencia relativamente baja con la SEQ ID NO: 2 (tan baja como aproximadamente del 35%), las proteínas HKT están altamente conservadas en estructura, con proteínas de longitud completa que tienen cuatro unidades de "dominio transmembrana - dominio de poro - dominio transmembrana " (MPM) y preferiblemente incluyen en el cuarto dominio de formación de poro una secuencia de consenso correspondiente a EVISAYGNVGFTTGY (SEQ ID NO: 8) en donde los residuos indicados en negrilla están invariablemente conservados y en donde los otros residuos pueden variar. Preferiblemente, la secuencia de consenso en el cuarto dominio de formación de poro corresponde a la SEQ ID NO: 9. Más preferiblemente, la secuencia de consenso en el cuarto dominio de formación de poro corresponde a E(V,I)(I,V)SA(Y,F)GNVG(F,L,Y)(T,S)(T,L,V)GY. Alternativamente, la proteína HKT útil en la presente invención incluye en el cuatro dominio de formación de poro una secuencia SA(Y,F)GN y una secuencia DP(I,L)N(Y,F,L). Además, cuando se comparan las secuencias de HKT de diferentes fuentes, se pueden identificar los aminoácidos conservados a través de la secuencia (la Figura 2, que no representa un listado limitante de proteínas HKT) y la identidad de secuencia dentro de la cuarta unidad MPM entre diferentes especies puede ser tal alta como del 70%. Por lo tanto, pueden encontrarse fácilmente genes HKT en otras especies de plantas. Debe entenderse por lo tanto que el término "polipéptido HKT o un homólogo del mismo" no se limita a las secuencias representadas por la SEQ ID NO: 2 ni a las SEQ ID NOs: 12 a 36 enlistadas más arriba, sino que cualquier polipéptido que reúna los criterios de tener actividad de HKT y de tener una topología de HKT como se indicó anteriormente y de tener al menos 35% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 puede ser adecuado para uso en los métodos de la invención. Como se señaló anteriormente, puede preverse sin embargo que las proteínas que tienen la topología de HKT descritas anteriormente pero que tienen una identidad de secuencia menor al 35% con la SEQ ID NO: 2 pueden aún ser útiles en los métodos de la presente invención.

El ácido nucleico que codifica un polipéptido HKT o un homólogo del mismo puede ser cualquier ácido nucleico natural o sintético. Un polipéptido HKT o un homólogo del mismo como se definió aquí anteriormente es codificado por un gen/ácido nucleico para HKT. Por lo tanto el término "gen/ácido nucleico para HKT" como se definió aquí es cualquier gen/ácido nucleico que codifica un polipéptido HKT o un homólogo del mismos como se definió aquí anteriormente. Los ejemplos de ácidos nucleicos para HKT incluyen a aquellos que codifican la SEQ ID NO: 2 y la secuencia representada por la SEQ ID NO: 1, o ácidos nucleicos que codifican proteínas representadas por las SEQ ID NOs: 12 a 36 (con los números de acceso del GenBank AAF97728, AAD53890, AAK52962, AA073474, AAG37274, BAB61791, CAD37187, CAD37183, CAD37185, CAD37197, BAB93392, CAD37199, o AAA52749. Sin embargo, los ácidos nucleicos que codifican proteínas que tienen la topología de HKT descrita anteriormente pero que tienen una identidad de secuencia menor al 35% con la SEQ ID NO: 2 pueden también ser útiles en los métodos de la presente invención; los ejemplos incluyen las SEQ ID NOs: 38 a 44. Los ácidos nucleicos/genes para HKT y las variantes funcionales de los mismos pueden ser adecuados en la realización de los métodos de la invención. Las variantes funcionales del ácido nucleico/genes para HKT incluyen porciones de un ácido nucleico/gen para HKT y/o ácido nucleico capaces de hibridar con un ácido nucleico/gen para HKT. El término "funcional" en el contexto de una variante funcional se refiere a una variante (es decir una porción o una secuencia de hibridación) que codifica un polipéptido que tiene actividad de HKT y cuyo polipéptido incluye cuatro unidades de un dominio transmembrana dominio formador de poro -dominio transmembrana, en donde el cuarto dominio formador de poro comprende preferiblemente una secuencia de consenso correspondiente a EVISAYGNVGFTTGY (SEQ ID NO: 8) en donde los residuos indicados en negrilla están invariablemente conservados y en donde los otros residuos pueden variar. Preferiblemente, la secuencia de consenso en el cuarto dominio formador de poro corresponde a la SEQ ID NO: 9. Más preferiblemente, la secuencia de consenso en el cuarto dominio formador de poro corresponde a E(V,I)(I,V)SA(Y,F)GNVG(F,L,Y)(T,S)(T,L,V)GY. Alternativamente, la variante de la proteína HKT puede incluir en el cuarto dominio formador de poro una secuencia SA(Y,F)GN y una secuencia DP(I,L)N(Y,F,L).

El término porción como se define aquí se refiere a un pedazo de un ADN que contiene al menos 80 nucleótidos o más, preferiblemente al menos 330 nucleótidos, cuya porción codifica un polipéptido que tienen actividad de HKT y cuyo polipéptido contiene al menos una unidad de un dominio transmembrana - un dominio formador de poro - un dominio transmembrana. Se puede preparar una porción, por ejemplo, haciendo una o más supresiones a un ácido nucleico HKT. Se pueden utilizar las porciones en forma aislada o pueden estar fusionadas a otra de las secuencias

5

15

25

35

45

de codificación (o no codificadoras) con el propósito, por ejemplo, de producir una proteína que combina diferentes actividades, siendo una de ellas la actividad de HKT, tal como por ejemplo la actividad transportadora de cationes. Cuando se fusionan a otras secuencias de codificación, el polipéptido resultante producido después de la traducción podría ser más grande que aquel predicho para el fragmento de HKT. Preferiblemente, la porción funcional es una porción de un ácido nucleico como el representado por la SEQ ID NO: 1, o una porción de ácidos nucleicos que codifican proteínas como se definió anteriormente, y cuya porción codifica un polipéptido que tiene actividad de HKT.

Otro tipo de variante de HKT en un ácido nucleico capaz de hibridar bajo condiciones rigurosas, con un ácido nucleico/gen HKT que tiene la SEQ ID NO: 1 como se definió aquí anteriormente, donde la secuencia de hibridación codifica un polipéptido que tiene actividad de HKT y cuyo polipéptido comprende al menos una unidad de un domino transmembrana - un dominio formador de poro - un dominio transmembrana. La secuencia de hibridación es preferiblemente al menos de 80 nucleótidos de longitud, más preferiblemente al menos de 330 nucleótidos de longitud.

El término “hibridación” como se define aquí es un proceso en donde secuencias complementarias de nucleótidos sustancialmente homólogas se aparean entre sí. El proceso de hibridación puede ocurrir completamente en solución, es decir ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. El proceso de hibridación puede presentarse también con uno de los ácidos nucleicos complementarios y movilizados a una matriz tal como partículas magnéticas, partículas de Sefarosa o cualquier otra resina. El proceso de hibridación puede presentarse además con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados a un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa o de nylon o inmovilizado, por ejemplo, por medio de fotolitografía, por ejemplo, a un soporte de vidrio silíceo (este último conocido como arreglos o microarreglos de ácido nucleico o como chips de ácido nucleico). Con el propósito de permitir que ocurra la hibridación, generalmente se desnaturalizan térmica o químicamente las moléculas de ácido nucleico para fundir una cadena doble en donde cadenas sencillas y/o para remover horquillas u otras estructuras secundarias de los ácidos nucleicos monocatenarios. La rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones tales como la temperatura, la concentración de sal, la fuerza iónica y la composición del amortiguador de hibridación.

Las “condiciones rigurosas de hibridación” y “las condiciones rigurosas de lavado de hibridación” en el contexto de los experimentos de hibridación de ácido nucleico tales como las hibridaciones tipo Southern y Northern son dependientes de la secuencia y son diferentes bajo parámetros ambientales diferentes. La persona capacitada es consciente de diferentes parámetros que pueden ser alterados durante la hibridación y el lavado y que o bien mantendrán o cambiaran las condiciones rigurosas.

La Tm es la temperatura bajo una fuerza iónica y pH definidos, a la cual 50% de la secuencia objetivo hibrida con una sonda perfectamente emparejada. La Tm depende de las condiciones de la solución y de la composición de la base y de la longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más altas. La tasa máxima de hibridación se obtiene aproximadamente desde 16ºC hasta 32ºC por debajo de la Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electroestática entre las dos cadenas de ácido nucleico promoviendo así la formación del híbrido; este efecto es visible para concentraciones de sodio hasta de 0,4 M. La formamida reduce la temperatura de fusión de los dúplex de ADN-ADN y ADN-ARN con 0,6 a 0,7ºC por cada porcentaje de formamida, y la adición de 50% de formamida permite que se lleve a cabo la hibridación entre 30 y 45ºC, aunque la tasa de hibridación será menor. La falta de correspondencia de pares de bases reduce la tasa de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. En promedio y para sondas largas, la Tm disminuye aproximadamente 1ºC por % de falta de correspondencia de las bases. La Tm se puede calcular utilizando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de híbridos:

 híbridos de ADN-ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138: 267 - 284, 1984):

Tm = 81,5ºC + 16,6 x log[Na+]a + 0,41 x %[G/Cb] – 500 x [Lc]-1 - 0,61 x % de formamida

 híbridos de ADN - ARN o ARN - ARN:

Tm = T9,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (% de G/Cb) + 11,8 (% de G/Cb)2 - 820/Lc

 híbridos de oligo-ADN u oligo - ARNd:

Para < 20 nucleótidos: Tm = 2 (/n)

Para 20 - 35 nucleótidos: Tm = 22 + 1,46 (/n)

a o para otro catión monovalente, pero únicamente preciso en el rango de 0,01 - 0,4 M.

b únicamente preciso para el % de GC en el rango de 30% a 75%.

c L = longitud del dúplex en pares de bases.

d Oligo, oligonucleótido; /n, longitud efectiva del iniciador = (no. de G/C) + (no. de A/T).

Nota: por cada 1% de formamida, se reduce la Tm aproximadamente en 0,6 a 0,7ºC, mientras que la presencia de urea 6 M reduce la Tm aproximadamente en 30ºC.

5 La especificidad de la hibridación es típicamente la función de los lavados posteriores a la hibridación. Para remover las bases resultantes de la hibridación no específica, se lavan las muestras con soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de tales lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución final de lavado: entre menos la concentración de sal y más alta la temperatura de lavado, más alta la rigurosidad del lavado. Las condiciones de lavado se realizan típicamente en o por debajo de la rigurosidad de hibridación. Generalmente, las

10 condiciones rigurosas adecuadas para los ensayos de hibridación de ácido nucleico o los procedimientos de detección de la amplificación génica son como se expuso más arriba. Se pueden seleccionar también condiciones más o menos rigurosas. Generalmente, se seleccionan condiciones de baja rigurosidad que sean aproximadamente 50ºC menores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica con una fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones de rigurosidad media son cuando la temperatura está 20ºC por debajo de la Tm, y las condiciones de

15 alta rigurosidad son cuando la temperatura está 10ºC por debajo de la Tm. Por ejemplo, condiciones rigurosas son aquellas que son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones de A-L; y condiciones de rigurosidad reducida son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones de M-R. Se puede controlar el enlazamiento no específico por medio del uso de una cualquiera de las técnicas conocidas, tales como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contienen proteína, adiciones de ARN heterólogo, ADN y SDS al amortiguador de

20 hibridación y tratamiento con ARNasa.

Los ejemplos de condiciones de hibridación y de lavado están enlistados en la Tabla 2:

Tabla 2:

Condición de Rigurosidad

Polinucleótido Híbrido ± Longitud del Híbrido (pb) ‡ Temperatura de Hibridación y Amortiguador † Temperatura de Lavado y Amortiguador †

A

ADN:ADN > o igual a 50 65°C 1 X SSC; o 42°C, 1 X SSC y 50% de formamida 65°C; 0,3 X SSC

B

ADN:ADN <50 Tb*; 1 X SSC Tb*; 1 X SSC

C

ADN:ARN > o igual a 50 67°C 1 X SSC; o 45°C, 1 X SSC y 50% de formamida 67°C; 0,3 X SSC

D

ADN:ARN <50 Td*; 1 X SSC Td*; 1 X SSC

E

ARN:ARN > o igual a 50 70°C 1 X SSC; o 50°C, 1 X SSC y 50% de formamida 70°C; 0,3 X SSC

F

ARN:ARN <50 Tf*; 1 X SSC Tf*; 1 X SSC

G

ADN:ADN > o igual a 50 65°C 4 X SSC; o 45°C, 4 X SSC y 50% de formamida 65°C; 1 X SSC

Condición de Rigurosidad

Polinucleótido Híbrido ± Longitud del Híbrido (pb) ‡ Temperatura de Hibridación y Amortiguador † Temperatura de Lavado y Amortiguador †

H

ADN:ADN <50 Th*; 4 X SSC Th*; 4 X SSC

I

ADN:ARN > o igual a 50 67°C 4 X SSC; o 45°C, 4 X SSC y 50% de formamida 67°C; 1 X SSC

J

ADN:ARN <50 Tj*; 4 SSC Tj*; 4 X SSC

K

ARN:ARN > o igual a 50 70°C 4 X SSC; o 40°C, 6 X SSC y 50% de formamida 67°C; 1 X SSC

L

ARN:ARN <50 TI*; 2 X SSC TI*; 2 X SSC

M

ADN:ADN > o igual a 50 50°C 4 X SSC; o 40°C, 6 X SSC y 50% de formamida 50°C; 2 X SSC

N

ADN:ADN <50 Tn*; 6 X SSC Tn*; 6 X SSC

O

ADN:ARN > o igual a 50 55°C 4 X SSC; o 42°C, 6 X SSC y 50% de formamida 55°C; 2 X SSC

P

ADN:ARN <50 Tp*; 6 X SSC Tp*; 6 X SSC

Q

ARN:ARN > o igual a 50 60°C 4 X SSC; o 45°C, 6 X SSC y 50% de formamida 60°C.; 2 X SSC

R

ARN:ARN <50 Tr*; 4 X SSC Tr*; 4 X SSC

‡ La “longitud del híbrido” es la longitud anticipada para el ácido nucleico que hibrida. Cuando se hibridan los ácidos nucleicos de secuencia conocida, se puede determinar la longitud del híbrido por medio de la alineación de las secuencias y la identificación de las regiones conservadas descritas aquí. † SSPE (1 X SSPE es NaCl 0,15 M, NaH2PO4 10 mM, y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) puede ser sustituido por SSC (1 X SSC es NaCl 0,15 M y citrato de sodio 15 mM) en los amortiguadores de hibridación y lavado; se llevan a cabo los lavados durante 15 minutos después de completar la hibridación. Las hibridaciones y los lavados pueden incluir adicionalmente reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0,5 - 1,0%, 100 g/ml de ADN desnaturalizado y fragmentado de esperma de salmón, pirofosfato de sodio al 0,5%, y hasta 50% de formamida. * Tb-Tr: La temperatura de hibridación para híbridos que se anticipó que eran de menos de 50 pares de bases de longitud debe ser 5 - 10°C menor que la temperatura de fusión Tm de los híbridos; la Tm se determina de acuerdo a las ecuaciones anteriormente mencionadas. ± La presente invención también abarca la sustitución de una o más parejas de híbridos de ADN o ARN ya sea con un PNA, o un ácido nucleico modificado.

Para los propósitos de definir el nivel de rigurosidad, convenientemente se puede hacer referencia a Sambrook y colaboradores (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, 5 CSH, New York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989).

Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 2 o un homólogo de la misma puede ser utilizado en un experimento de hibridación. Alternativamente, pueden utilizarse fragmentos del mismo como sondas. Dependiendo del fondo común de partida de secuencias a partir de las cuales se va a identificar la proteína HKT, se pueden seleccionar diferentes fragmentos para hibridación. Por ejemplo, cuando se desean un número limitado de

10 homólogos con una alta identidad de secuencia con HKT, se puede utilizar un fragmento menos conservado para hibridación. Por medio de la alineación de la SEQ ID NO: 2 y de los homólogos de la misma, es posible diseñar fragmentos equivalentes de ácido nucleico útiles como sondas para hibridación.

Después de hibridación y lavado, se pueden detectar los dúplex por medio de autorradiografía (cuando se utilizaron sondas marcadas en forma radioactiva) o por medio de quimioluminiscencia, inmunodetección, por detección fluorescente o cromogénica, dependiendo del tipo de marcación de la sonda. Alternativamente, se puede realizar un ensayo de protección de la ribonucleasa para la detección de híbridos de ARN : ARN.

Se puede derivar un ácido nucleico HKT o una variante del mismo a partir de cualquier fuente natural o artificial. Se puede aislar el ácido nucleico/gen o una variante del mismo a partir de una fuente microbiana, tal como bacterias, levaduras u hongos, o a partir de una fuente vegetal, alga o animal (incluida humana). Este ácido nucleico puede ser modificado a partir de su forma nativa en composición y/o ambiente genómico a través de manipulación humanan deliberada. El ácido nucleico es preferiblemente de origen vegetal, ya sea de la misma especie de planta (por ejemplo en aquella en la cual va a ser introducida) o de una especie vegetal diferente. Se puede aislar el ácido nucleico de una especie dicotiledónea, preferiblemente de la familia Brassicaceae, preferiblemente además de Arabidopsis thaliana. Más preferiblemente, la HKT aislada de Arabidopsis thaliana está representada por la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos para HKT está representada por la SEQ ID NO: 2.

La actividad de un polipéptido HKT o un homólogo del mismo, se puede incrementar por medio de la introducción de una modificación genética (preferiblemente en el locus de un gen HKT). El locus de un gen como se define aquí se entiende que es una región genómica que incluye al gen de interés y 10 kb secuencia arriba o secuencia debajo de la región de codificación.

Se puede introducir la modificación genética, por ejemplo, por medio de uno (o más) de los siguientes métodos: activación de TADN, TILLING, mutagénesis dirigida al sitio, recombinación homóloga, evolución dirigida o por medio de la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica a un polipéptido HKT o un homólogo del mismo, siempre y cuando cada uno de los métodos requiera de intervención humana. Después de la introducción de la modificación genética sigue una etapa de selección para una mayor expresión de un polipéptido HKT, cuyo incremento en actividad produce plantas que tienen características mejoradas de crecimiento.

El etiquetado de la activación de T-ADN (Hayashi et al. Science (1992) 1350 - 1353) involucra la inserción de T-ADN que usualmente contiene un promotor (puede ser también un potenciador de traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 kB secuencia arriba o secuencia debajo de la región de codificación de un gen en una configuración de tal manera que tal promotor dirige la expresión del gen objetivo. Típicamente, la regulación de la expresión del gen objetivo por su promotor natural se interrumpe y el gen cae bajo el control del promotor recientemente introducido. El promotor es típicamente incorporado en un T-ADN. Este T-ADN es insertado en forma aleatoria en el genoma de la planta, por ejemplo, a través de infección de Agrobacterium y conduce a sobreexpresión de genes cerca del T-ADN insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la sobreexpresión de genes dosificada al promotor introducido. El promotor que se introduce puede ser cualquier promotor capaz de dirigir la expresión de un gen en el organismo deseado, en este caso una planta. Por ejemplo, un promotor constitutivo, específico del tejido, específico del tipo de célula e inducible son todos adecuados para uso en la activación de T-ADN.

Se puede introducir también una modificación genética en el locus de un gen HKT utilizando la técnica de TILLING (Targeted Induced Local Lesions IN Genomes: Lesiones Locales Inducidas Objetivo en Genomas). Esta es una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar, y para eventualmente aislar variantes de mutagénesis de una molécula de ácido nucleico HKT capaz de exhibir actividad de HKT. TILLING también permite la selección de plantas que portan tales variantes mutantes. TILLING combina mutagénesis de alta densidad con métodos de selección de alto rendimiento. Las etapas típicamente seguidas en TILLING son: (a) mutagénesis EMS (Redei y Koncz (1992), En: C Koncz, N - H Chua, J Schell, eds, Methods in Arabidopsis Research. World Scientific, Singapore, páginas 16 - 82; Feldmann y colaboradores, (1994) En: EM Meyerowitz, CR Somerville, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, páginas 137 - 172; Lightner y Caspar (1998), En: J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, páginas 91 104); (b) preparación y reunión del ADN de individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización e hibridación para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, donde la presencia de un heterodúplex en un fondo común es detectada como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación mutantes individuales; y (g) secuenciación del producto PCR mutante. Los métodos para TILLING son bien conocidos en el arte (McCallum Nature Biotechnol. 18, 455 - 457, 2000, Stemple Nature Rev. Genet. 5, 145 - 150, 2004).

Se puede utilizar la mutagénesis dirigida al sitio para generar variantes de ácidos nucleicos HKT o porciones de los mismos que retienen actividad (tal como la actividad de la quinasa que depende de la ciclina). Se encuentran disponibles diferentes métodos para lograr una mutagénesis dirigida al sitio siendo los más comunes los métodos con base en la PCR (Ver por ejemplo Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds. http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html).

También se puede utilizar evolución dirigida para generar variantes funcionales de moléculas de ácido nucleico HKT que codifican polipéptidos HKT u homólogos, o porciones de las mismas que tiene una mayor actividad biológica como se describió anteriormente. La evolución dirigida consiste de iteraciones de arrastre de ADN seguido por detección y/o selección apropiada (Castle y colaboradores, (2004) Science 304(5674): 1151 -4; patentes estadounidenses Nos. 5.811.238 y 6.395.547).

La activación de TADN, TILLING, la mutación dirigida al sitio y la evolución dirigida son ejemplos de tecnologías que permiten la generación de nuevos alelos y variantes de HKT que retienen la función de HKT y que son útiles por lo tanto en los métodos de la invención.

La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homóloga es una tecnología estándar utilizada rutinariamente en ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levadura o el musgo Physcomitrella. Se han descrito métodos para llevar a cabo la recombinación homóloga en plantas so solamente para plantas modelo (Offringa y colaboradores (1990) EMBO J. 9, 3077 - 3084) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo, arroz (Terada y colaboradores, (2002) Nature Biotechnol. 20, 1030 - 1034; o lida y Terada (2004) Curr. Opin. Biotechnol. 15, 132 138). El ácido nucleico que va a ser dirigido (que puede ser una molécula de ácido nucleico HKT o una variante de la misma como se definió aquí anteriormente) no necesita ser dirigido al locus de un gen HKT, sino que puede ser introducido, por ejemplo, en regiones de alta expresión. El ácido nucleico que va a ser dirigido puede ser un alelo mejorado utilizado para remplazar el gen endógeno o puede ser introducido además al gen endógeno.

De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, se pueden mejorar las características de crecimiento de la planta por medio de la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido HKT o un homólogo del mismo.

Un método preferido para introducir una modificación genética (que en este caso necesita estar en el locus de un gen HKT) es introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido HKT o un homólogo del mismo. Un polipéptido HKT o un homólogo del mismo como se mencionó anteriormente es un polipéptido que tiene actividad de HKT y cuatro unidades de un dominio transmembrana - un dominio formador de poro, un dominio transmembrana. El polipéptido HKT tiene, en orden creciente de preferencia, que tiene al menos 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2, y tiene actividad transportadora de cationes o es como la representada en la SEQ ID NO: 2.

Los “homólogos” de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tienen actividad biológica y funcional similar a la proteína no modificada de la cual se deriva.

Abarcadas por el término “homólogas” también se encuentran dos formas especiales de homología, que incluyen secuencias ortólogas y secuencias parálogas, que abarcan conceptos evolucionarios utilizados para describir relaciones ancestrales de genes. El término “parálogos” se relaciona con duplicaciones de genes dentro del genoma de una especie que conduce a genes parálogos. El término “ortólogos” se relaciona con genes homólogos en diferentes organismos debido a especiación. Se pueden encontrar fácilmente ortólogos, por ejemplo, en especies de plantas monocotiledóneas llevando a cabo la así llamada búsqueda reciproca por explosión. Esto puede hacerse por medio de una primera explosión que implica explotar la secuencia en cuestión (por ejemplo, siendo las SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, de Arabidopsis thaliana) contra cualquier base de datos de secuencia, tal como la base de datos NCBI que se encuentra públicamente disponible y que puede ser encontrada en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Si se buscaran ortólogos en el arroz, se explotaría la secuencia en cuestión, por ejemplo, contra los 28.469 clones de ADNc de longitud completa de Nipponbare de Oryza sativa disponibles en NCBI. Se pueden utilizar BLASTn o tBLASTX cuando se parte de nucleótidos o BLASTP o TBLASTN cuando se parte de la proteína, con valores estándar por defecto. Se pueden filtrar los resultados de la explosión. Se explotan nuevamente las secuencias de longitud completa ya sea de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados (segunda explosión) contra las secuencias del organismo a partir del cual se deriva la secuencia en cuestión, en este caso Arabidopsis thaliana. Se comparan luego los resultados de la primera y segunda explosiones. Se encuentra un ortólogo cuando los resultados de la segunda explosión producen como aciertos con la similitud más alta un ácido nucleico HKT de consulta o un polipéptido HKT. Si uno de los aciertos en el primer BLAST es del mismo organismo, entones se ha encontrado un parálogo. Tal parálogo es también considerado un homólogo de HKT, siempre y cuando este homólogo tenga actividad de HKT e incluya cuatro unidades de un dominio transmembrana - dominio formador de poro - dominio transmembrana y preferiblemente también incluya las secuencias conservadas definidas anteriormente. En el caso de familias grandes, se puede utilizar ClustalW, seguido por la construcción de un árbol de unión de vecinos, para ayudar a visualizar el agrupamiento.

Un homólogo puede estar en la forma de una “variante de sustitución” de una proteína, es decir, donde se ha removido al menos un residuo en una secuencia de aminoácidos y se ha insertado en su lugar un residuo diferente. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero pueden agruparse dependiendo de restricciones funcionales colocadas sobre el polipéptido; las inserciones serán usualmente aproximadamente del orden de 1 a 10 residuos aminoácidos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos incluyen sustituciones conservadoras de aminoácidos (Tabla 3). Para producir tales homólogos, se pueden remplazar aminoácidos de la proteína por otros aminoácidos que tengan propiedades similares (tales como similar hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión a formar o a romper estructuras de hélice α o estructuras de lámina β). Las tablas de sustitución conservadora son bien conocidas en el arte (ver por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company).

Tabla 3: Ejemplos de sustituciones conservadas de aminoácidos:

Residuo

Sustituciones Conservadoras Residuo Sustituciones Conservadoras

Ala

Ser Leu Ile; Val

Arg

Lys Lys Arg; Gln

Asn

Gln; His Met Leu; Ile

Asp

Glu Phe Met; Leu; Tyr

Gln

Asn Ser Thr; Gly

Cys

Ser Thr Ser; Val

Glu

Asp Trp Tyr

Gly

Pro Tyr Trp; Phe

His

Asn; Gln Val Ile; Leu

Ile

Leu, Val

Pueden hacerse sustituciones menos conservadas en caso de que las propiedades anteriormente mencionadas de 10 los aminoácidos no sean tan críticas.

Un homólogo puede ser también en la forma de una “variante de inserción” de una proteína, es decir en donde se introducen uno o más residuos aminoácidos en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden incluir fusiones en el terminal amino y/o en el terminal carboxilo así como inserciones dentro de la secuencia de múltiples aminoácidos o de aminoácidos individuales. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de 15 aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones del terminal amino o del terminal carboxilo, aproximadamente del orden de 1 a 10 residuos. Los ejemplos de proteínas o péptidos de fusión del terminal amino o del terminal carboxilo incluyen al dominio de enlazamiento o al dominio de activación de un activador transcripcional como el utilizado en el sistema híbrido doble de levadura, proteínas de recubrimiento de fago, etiqueta de (histidina)6, etiqueta de glutationa S-transferasa, proteína A, proteína para enlazamiento de maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo de Tag 100,

20 epítopo de c-myc, epítopo de FLAG®, lacZ, CMP (péptido para enlazamiento de calmodulina), epítopo de HA, epítopo de proteína C y epítopo de VSV.

Los homólogos en la forma de “variantes de supresión” de una proteína se caracterizan por la remoción de uno o más aminoácidos de una proteína.

Se pueden elaborar fácilmente variantes de aminoácidos de una proteína utilizando técnicas para síntesis de

25 péptidos bien conocidas en el arte, tales como las síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por medio de manipulaciones de ADN recombinante. Los métodos para la manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o supresión de una proteína son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, las técnicas para elaboración de mutaciones en sitios predeterminados en el ADN son bien conocidas por aquellos capacitados en el arte e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH),

30 mutagénesis Dirigida al Sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio.

El polipéptido HKT o un homólogo del mismo puede ser un derivado. Los “derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden incluir sustituciones, supresiones o adiciones de residuos aminoácidos de ocurrencia natural o no natural comparado con la secuencia de aminoácidos de una forma de ocurrencia natural de la proteína, por ejemplo, como se presenta en la SEQ ID NO: 2. Los "derivados" de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden incluir residuos aminoácidos alterados, glicosilados, acilados de ocurrencia natural o residuos aminoácidos de ocurrencia no natural comparado con la secuencia de aminoácidos de una forma de ocurrencia natural del polipéptido. Un derivado puede incluir también uno o más sustituyentes no aminoácidos comparado con la secuencia de aminoácidos de la cual se deriva, por ejemplo una molécula reportera u otro ligando, enlazado en forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula reportera que se enlaza para facilitar su detección, y residuos de aminoácidos de ocurrencia no natural con relación a la secuencia de aminoácidos de una proteína de ocurrencia natural.

El polipéptido HKT o un homólogo del mismo pueden ser codificados por una variante alternativa de empalme de una molécula de ácido nucleico o gen HKT. El término “variante alternativa de empalme” como se lo utiliza aquí abarca variantes de una secuencia de ácido nucleico en la cual se han cortado, reemplazado o añadido intrones y/o exones seleccionados. Tales variantes serán aquellas en las cuales se retiene la actividad biológica de la proteína, lo cual puede lograrse reteniendo selectivamente segmentos funcionales de la proteína. Tales variantes de empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden ser elaboradas por el hombre. Los métodos para la elaboración de tales variantes de empalme son bien conocidos en el arte. Las variantes preferidas de empalme son las variantes de empalme derivadas del ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 3. Se prefieren además las variantes de empalme que codifican un polipéptido que tiene actividad de HKT y que contienen al menos una , y preferiblemente cuatro unidad(es) de un dominio transmembrana - dominio formador de poro - dominio transmembrana. Una variante de empalme preferida está representada por la SEQ ID NO: 1.

El homólogo puede ser también codificado también por una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido HKT o un homólogo del mismo, preferiblemente una variante alélica del ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 1. Preferiblemente además, el polipéptido codificado por la variante alélica tiene actividad de HKT e incluye al menos uno, y preferiblemente cuatro unidad(es) de un dominio transmembrana - dominio formador de poro

- dominio transmembrana. El homólogo puede ser codificado también por una variante alélica de un ácido nucleico representado por las SEQ ID Nos: 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 35 ó 37. Existen variantes alélicas en la naturaleza y está incluido dentro de los métodos de la presente invención el uso de estos alelos naturales. Las variantes alélicas abarcan Polimorfismos de Nucleótidos Individuales (los SNP), así como Polimorfismos Pequeños de Inserción/Supresión (los INDEL). El tamaño de los INDEL es usualmente menor a 100 pb. Los SNP y los INDEL forman el conjunto más grande de variantes de secuencia en cadenas polimórficas de ocurrencia natural de la mayoría de los organismos.

De acuerdo con un aspecto preferido de la presente invención, se prevé una expresión mejorada o potenciada de la molécula de ácido nucleico HKT o una variante de la misma. Los métodos para obtener una expresión potenciada o mejorada (sobreexpresión) de genes o de productos génicos están bien documentados en el arte e incluyen, por ejemplo, sobreexpresión dirigida por promotores adecuados, el uso de potenciadores de transcripción o potenciadores de traducción. Se pueden introducir ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores

o potenciadores en una posición apropiada (típicamente secuencia arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido para favorecer la expresión de un ácido nucleico HKT o variante del mismo. Por ejemplo, se pueden alterar in vivo promotores endógenos por medio de mutación, supresión, y/o sustitución (ver Kmiec, patente estadounidense No. 5.565.350; Zarling y colaboradores, PCT/US93/03868), o se pueden introducir promotores aislados en una célula vegetal en la orientación apropiada y distancia del gen modificado de acuerdo con la presente invención para controlar la expresión del gen.

Si se desea la expresión del polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación del extremo 3’de una región para codificación de nucleótidos. La región de poliadenilación se puede derivar del gen natural, a partir de una variedad de otros genes de la planta, o a partir T-ADN. La secuencia del extremo 3’ que va a ser añadida se puede derivar, por ejemplo, de los genes para la nopalina sintasa u octopina sintasa, o alternativamente a partir de otro gen de la planta, o menos preferiblemente a partir de cualquier otro gen eucariota.

Se puede añadir también una secuencia de un intrón a la región 5’ no traducida o la secuencia de codificación de la secuencia parcial de codificación para incrementar la cantidad del mensaje de madurez que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón empalmable en la unidad de transcripción tanto en construcciones para expresión en plantas como en animales ha demostrado que incrementa la expresión génica tanto en ARNm como en los niveles de proteína hasta en 1000 veces (Buchman y Berg, Mol. Cell Biol. 8, 4395 - 4405 (1988); Callis y colaboradores, Genes Dev. 1, 1183 - 1200 (1987)). Tal mejora en el intrón de la expresión génica es típicamente mayor cuando se coloca cerca del extremo 5’ de la unidad de transcripción. El uso de los intrones del maíz, como a los intrones 1, 2, y 6 de Adh1-S, el intrón de Bronze-1 son conocidos en el arte. Ver en forma general, The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

La divulgación también suministra construcciones genéticas y vectores para facilitar la introducción y/o expresión de las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de acuerdo con la invención.

Por lo tanto, se proporciona una construcción génica que contiene:

(i)

una molécula aislada de ácido nucleico HKT o una variante funcional de la misma;

(ii)

una o más secuencia(s) de control capaz(ces) de dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i); y opcionalmente

(iii) una secuencia de terminación de la transcripción.

Preferiblemente, la secuencia de control utilizada en la construcción del gen es una secuencia de control específica de la semilla.

Se pueden elaborar construcciones útiles en los métodos de acuerdo con la presente invención utilizando tecnología de ADN recombinante bien conocida por las personas capacitadas en el arte. Se pueden insertar las construcciones génicas en vectores, que pueden encontrarse comercialmente disponibles, adecuadas para la transformación en plantas y adecuadas para expresión del gen de interés en las células transformadas.

Se transforman las plantas con un vector que contiene la secuencia de interés (es decir, un ácido nucleico HKT o una variante del mismo). La secuencia de interés está operativamente enlazada a una o más secuencias de control (al menos a un promotor). Los términos “elemento regulador”, “secuencia de control” y “promotor” son todos utilizados en forma intercambiable aquí y deben ser tomados en un contexto amplio para referirse a secuencias reguladoras de ácido nucleico capaces de efectuar la expresión de las secuencias con las cuales están enlazadas. Abarcadas por los términos anteriormente mencionados están las secuencias reguladoras de la transcripción derivadas de un gen genómico eucariota clásico (incluida la caja TATA que es requerida para la iniciación precisa de la transcripción, con o sin una secuencia de la caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias, reforzadores y silenciadores activadores secuencia arriba) que modulan la expresión génica en respuesta a estímulos externos y/o de desarrollo, o en una forma específica del tejido. También está incluida dentro del término una secuencia reguladora de transcripción de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras de la transcripción de caja -10. El término “elemento regulador” también abarca una molécula sintética de fusión o un derivado que confiere, activa o refuerza la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. El término “operativamente enlazado” como se lo utiliza aquí se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora sea capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.

Convenientemente, se puede utilizar cualquier tipo de promotor para conducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor inducible, es decir, que ha inducido o incrementado la iniciación de la transcripción en respuesta a un estímulo de desarrollo, químico, ambiental o físico. Un ejemplo de tal promotor es un promotor inducible por estrés. Adicionalmente o alternativamente, el promotor puede ser un promotor constitutivo. El término “constitutivo” como se lo define aquí se refiere a un promotor que se expresa predominantemente en al menos un tejido u órgano y predominantemente en cualquier etapa de la vida de la planta. Preferiblemente el promotor constitutivo se expresa predominantemente a través de toda la planta. Adicionalmente o alternativamente, el promotor puede ser un promotor específico del tejido, es decir uno que sea capaz de iniciar preferencialmente la transcripción en ciertos tejidos, tales como las hojas, las raíces, tejido de las semillas, etc.

Preferiblemente, el ácido nucleico HKT aislado o una variante del mismo está operativamente enlazado a un promotor específico de la semilla. Preferiblemente además, el promotor específico de la semilla es específico del embrión y de la aleurona y activo principalmente durante las etapas embriogénicas finales. El término "específico de la semilla" como se lo define aquí se refiere a un promotor que se expresa predominantemente en las semillas de la planta. Preferiblemente el promotor se expresa predominantemente en la capa del embrión y/o de la aleurona. Más preferiblemente, el promotor específico de la semilla tiene un perfil de expresión comparable con el promotor WSI18. Lo más preferible, el promotor específico de la semilla es el promotor WSI18 del arroz (WO2004/070039), tal como figura en la SEQ ID NO: 45 (correspondiente a los nucleótidos 1 a 1828 e la SEQ ID NO: 4). El promotor WSI18 del arroz es sensible al ácido abscisico (ABA) y altamente inducido por las condiciones que involucran ABA, tal como la desecación de la semilla. Por lo tanto, un promotor preferido para uso en la presente invención puede ser también cualquier otro promotor inducido por ABA y/o por condiciones de estrés tales como sequía. Debe ser claro sin embargo que la aplicabilidad de la presente invención no está restringida al ácido nucleico HKT representado por la SEQ ID NO: 1, ni la aplicabilidad de la invención está restringida a la expresión de un ácido nucleico HKT cuando está dirigido por un promotor WSI18. Los ejemplos de otros promotores específicos de la semilla que pueden ser utilizados también para dirigir la expresión de un ácido nucleico HKT están enlistados en la Tabla 4.

Tabla 4: Ejemplos de promotores

Fuente del Gen

Patrón de Expresión Referencia

genes específicos de la semilla

semilla Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

albúmina de Nuez del Brasil

semilla Pearson, et al., Plant Mol. Biol. 18: 235 - 245, 1992.

legumina

semilla Ellis, et al., Plant Mol. Biol. 10: 203 - 214, 1988.

glutelina (arroz)

semilla Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15 - 22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43 - 47, 1987.

zeína

semilla Matzke et al Plant Mol Biol, 14(3): 323 - 321990

napA

semilla Stalberg, et al, Planta 199: 515 - 519, 1996.

glutenina-1 de HMW y LMW de trigo

endospermo Mol Gen Genet 216: 81 - 90, 1989; NAR 17: 461 - 2, 1989

SPA de trigo

semilla Albani et al, Plant Cell, 9: 171 - 184, 1997

α, β, γ-gliadinas de trigo

endospermo EMBO J. 3:1409 - 15, 1984

promotor ltr1 de cebada

endospermo

hordeína B1, C, D de cebada

endospermo Theor Appl Gen 98: 1253 - 62, 1999; Plant J 4: 343 - 55, 1993; Mol Gen Genet 250: 750 - 60, 1996

DOF de cebada

endospermo Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53 - 62, 1998

blz2

endospermo EP99106056.7

promotor sintético

endospermo Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629 - 640, 1998.

prolamina NRP33 de arroz

endospermo Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8)

885 - 889, 1998

α-globulina Glb-1 de arroz

endospermo Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885 - 889, 1998

OSH1 del arroz

embrión Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117 - 8122, 1996

α-globulina REB/OHP-1 de arroz

endospermo Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513 522, 1997

ADP-glucosa PP de arroz

endospermo Trans Res 6: 157 - 68, 1997

familia del gen ESR del maíz

endospermo Plant J 12: 235 - 46, 1997

γ -kafirina de sorgo

endospermo PMB 32: 1029 - 35, 1996

KNOX

embrión Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39: 257 - 71, 1999

oleosina de arroz

embrión y aleurón Wu et at, J. Biochem., 123: 386, 1998

oleosina de girasol

semilla (embrión y semilla seca) Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873 - 876, 1992

proteína ribosomal 40S putativa del arroz PRO0117

débil en el endospermo WO2004/070039

α-globulina del arroz, PRO0135

fuerte en el endospermo

alanina aminotransferasa del arroz, PRO0136

débil en el endospermo

inhibidor de tripsina ITR1 (cebada), PRO0147

débil en el endospermo

RAB21 del arroz, PRO0175

embrión + estrés WO2004/070039

oleosina del arroz de 18 kd, PRO0218

aleurona + embrión

Opcionalmente, se pueden utilizar también una o más secuencias terminadoras en la construcción introducida en una planta. El término “terminadora” abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN al extremo de una unidad transcripcional que señala el procesamiento y poliadenilación 3’ de un transcripto primario y la

5 terminación de la transcripción. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir reforzadores transcripcionales así como de traducción. Aquellos capacitados en el arte serán conscientes de secuencias terminadoras y reforzadoras que pueden ser adecuadas para uso en la realización de la invención. Tales secuencias serían conocidas o las puede obtener fácilmente una persona capacitada en el arte.

Las construcciones genéticas de la invención pueden incluir además un origen de la secuencia de replicación, que

10 es requerido para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo específico de célula. Un ejemplo es cuando se requiere mantener una construcción genética en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (por ejemplo una molécula de plásmido o de cósmido). Los orígenes preferidos de replicación incluyen, pero no se limitan al, f1-ori y colE1.

La construcción genética puede incluir opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como se lo utiliza aquí, el término “gen marcador seleccionable” incluye a cualquier gen que confiera un fenotipo sobre una célula en la cual se exprese para facilitar la identificación y/o selección de las células que son transfectadas o transformadas con una construcción de ácido nucleico de la invención. Los marcadores adecuados pueden seleccionarse entre los marcadores que confieren resistencia antibiótica o herbicida, que introducen una nueva característica metabólica o que permiten selección visual. Los ejemplo de genes marcadores seleccionables incluyen a los genes que codifican proteínas que confieren resistencia a los antibióticos (tal como nptll que fosforila neomicina y kanamicina, o hpt, que fosforila higromicina), a herbicidas (por ejemplo bar que proporciona resistencia a Basta; aroA o gox que proporcionan resistencia contra el glifosato), o genes que proporcionan una característica metabólica (tal como manA que permite que las plantas utilicen manosa como fuente única de carbono). Los genes que codifican proteínas marcadoras visuales resultan en la formación de color (por ejemplo β-glucuronidasa, GUS), luminiscencia (tal como luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP, y derivados de la misma).

En una modalidad preferida, la construcción genética como se mencionó anteriormente, incluye un ácido nucleico HKT en orientación sentido acoplado a un promotor que es preferiblemente un promotor específico de la semilla, tal como por ejemplo el promotor WSI18 del arroz. Por lo tanto, otro aspecto de la presente divulgación es una construcción de un vector que porta un casete de expresión esencialmente similar a la SEQ ID NO 4, que contiene un promotor WSI18, el gen HKT del arroz y la secuencia terminadora de la transcripción zeína T + T-rubisco deltaGA. Una secuencia esencialmente similar a la SEQ ID NO 4 abarca una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un homólogo de proteína a la SEQ ID NO 2 o que hibrida a la SEQ ID NO 1, cuyo primer ácido nucleico está operativamente enlazado a un promotor WSI18 o a un promotor con un patrón de expresión similar, adicionalmente o alternativamente el primer ácido nucleico está enlazado a una secuencia de terminación de la transcripción.

La presente divulgación también abarca plantas o partes (incluidas células vegetales) de las mismas que pueden ser obtenidas por medio de los métodos de acuerdo con la presente invención. La presente divulgación provee por lo tanto plantas o partes de las mismas (incluidas células vegetales) que pueden ser obtenidas por medio de los métodos de acuerdo con la presente invención, a cuyas plantas se les ha introducido un ácido nucleico aislado HKT

o una variante del mismo, o a cuyas plantas se les ha introducido una modificación genética, preferiblemente en el locus de un gen HKT.

La invención también provee un método para incrementar el rendimiento de una planta como se describe en la reivindicación 4.

Más específicamente, la presente invención provee un método para la producción de plantas transgénicas que tienen mayor rendimiento como se describe en la reivindicación 10.

Se puede introducir directamente el ácido nucleico en una célula vegetal o en la misma planta (incluida la introducción en un tejido, órgano o cualquier otra parte de una planta). De acuerdo a una característica preferida de la presente invención, se introduce preferiblemente el ácido nucleico en una planta por medio de transformación.

El término “transformación” como se mencionó aquí abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del método utilizado para la transferencia. El tejido de la planta capaz de una propagación clónica subsiguiente, ya sea por organogénesis o por embriogénesis, puede ser transformado con una construcción genética de la presente invención y una planta completa regenerada a partir de allí. El tejido particular escogido variará dependiendo de los sistemas clónicos de propagación disponibles para, y mejor adaptados para, la especie particular que está siendo transformada. Los ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, mega gametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, yemas axilares, y meristemas de la raíz), y tejido de meristema inducido (por ejemplo, meristema de cotiledón y meristema de hipocotiledón). El polinucleótido puede ser introducido en forma transitoria o estable en una célula huésped y puede ser mantenido en forma no integrada, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede estar integrado en el genoma huésped. La célula vegetal transformada resultante puede ser utilizada entonces para regenerar una planta transformada en una forma conocida por las personas capacitadas en el arte.

La transformación de una especie de planta es ahora una técnica bastante rutinaria. Convenientemente, se puede utilizar cualquiera de los diferentes métodos de transformación para introducir el gen de interés en un ancestro adecuado de la célula. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que incrementan la absorción de ADN libre, inyección del ADN directamente dentro de la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación utilizando virus o polen y microinyección. Se pueden seleccionar los métodos a partir del método con calcio/polietilén glicol para protoplastos (Krens y colaboradores (1982) Nature 296, 72 - 74; Negrutiu y colaboradores (1987) Plant Mol. Biol. 8, 363 - 373); electroporación de protoplastos (Shillito y colaboradores (1985) Bio/Technol 3, 1099 - 1102); microinyección dentro del material de la planta (Crossway y colaboradores (1986) Mol. Gen. Genet. 202, 179 - 185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein y colaboradores (1987) Nature 327, 70); Infección (no integradora) con virus y similares. Las plantas de arroz transgénico que expresan una CDKA de acuerdo con la presente invención son preferiblemente producidas a través de transformación mediada por Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos para la transformación de arroz, tal como se describe en cualquiera de los siguientes documentos: solicitud de publicada de patente europea EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199, 612 - 617, 1996); Chan y colaboradores (Plant Mol. Biol. 22, 491 - 506, 1993), Hiei y colaboradores (Plant J. 6, 271 - 282, 1994). En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como el descrito ya sea por Ishida y colaboradores (Nature Biotechnol. 14, 745 - 50, 1996) o Frame y colaboradores (Plant Physiol. 129, 13 - 22, 2002), cuyas divulgaciones se incorporan aquí como referencias como si hubieran sido expuestas en su totalidad.

Generalmente después de la transformación, se seleccionan células vegetales o agrupaciones celulares por la presencia de uno o más marcadores que son codificados por genes expresables en la planta cotrasnformados con el gen de interés, después de lo cual se regenera el material transformado en una planta completa.

Después de la transferencia y regeneración del ADN, se pueden evaluar las plantas putativamente transformadas, por ejemplo utilizando análisis tipo Southern, por la presencia del gen de interés, el número de copias y/o la organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, se pueden monitorear los niveles de expresión del ADN recientemente introducido utilizando análisis tipo Northern y/o tipo Western siendo ambas técnicas bien conocidas por las personas ordinariamente capacitas en el arte. El cultivo de células vegetales transformadas en plantas maduras puede abarcar por lo tanto etapas de selección y/o regeneración y/o de crecimiento hasta alcanzar la madurez.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar por medio de una variedad de medios, tales como por medio de propagación clónica o por medio de técnicas clásicas de fitomejoramiento. Por ejemplo, una primera generación de plantas transformadas (o T1) puede ser autofecundada para producir una segunda generación de transformantes homocigotos (o T2), y se pueden propagar adicionalmente las plantas T2 a través de técnicas clásicas de fitomejoramiento.

Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y de células no transformadas; los transformantes clónicos (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado a un vástago no transformado).

La presente divulgación claramente se extiende a cualquier célula vegetal o planta producida por cualquiera de los métodos descritos aquí, y a todas las partes de la planta y propágulos de la misma. La presente divulgación se extiende además para abarcar a la progenie de una célula primaria transfectada o transformada, tejido, órgano o planta completa que ha sido producido por medio de cualquiera de los métodos anteriormente mencionados, siendo el único requisito que la progenie exhiba la(s) misma(s) característica(s) genotípica(s) y/o fenotípica(s) que aquellas producidas en los padres por medio de los métodos de acuerdo con la invención. La divulgación también incluye células huésped que contienen un ácido nucleico aislado HKT o una variante del mismo. Las células huésped preferidas de acuerdo con la divulgación son células vegetales. La divulgación también se extiende a partes cosechables de una planta como las divulgadas aquí, tales como, pero sin limitarse a semillas, hojas, frutos, flores, tallos, rizomas, tubérculos y bulbos. La divulgación se relaciona además con productos directamente derivados de una parte cosechable de tal planta, tales como gránulos secos o polvos, aceite, ácidos grasos y grasa, almidón o proteínas.

La presente invención también abarca el uso de los ácidos nucleicos HKT anteriormente mencionados o variantes de los mismos y con el uso de polipéptidos HKT u homólogos de los mismos para incrementar el rendimiento de las plantas.

El rendimiento de semillas puede incluir uno o más de lo siguiente: mayor número de semillas (llenas), mayor peso de las semillas, mayor índice de cosecha, mayor peso de mil granos, tasa de llenado de las semillas, entre otros.

Los ácidos nucleicos HKT anteriormente mencionados o variantes de los mismos o polipéptidos HKT u homólogos de los mismos pueden encontrar uso en programas de fitomejoramiento en los cuales se identifica un marcador de ADN que puede estar genéticamente enlazado a un gen HKT o a una variante del mismo. Dicho HKT o variantes del mismo o HKT u homólogos del mismo pueden ser utilizados para definir un marcador molecular para identificación de plantas que tienen mayor rendimiento.

Las variantes alélicas de un HKT pueden encontrar también uso en programas de fitomejoramiento asistido por marcadores. Tales programas de fitomejoramiento requieren algunas veces de la introducción de una variación alélica por medio de tratamiento mutagénico de las plantas, utilizando por ejemplo mutagénesis EMS; alternativamente, el programa puede iniciar con una colección de variantes alélicas del así llamado origen “natural” causado en forma no intencional. La identificación de variantes alélicas tiene lugar entonces, por ejemplo, por medio de PCR. Esto es seguido por una etapa de selección para la selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y la cual produce características de crecimiento mejoradas en una planta. La selección se lleva a cabo típicamente por medio del monitoreo del desempeño del crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión, por ejemplo, diferentes variantes alélicas de la SEQ ID NO: 1, o de ácidos nucleicos que codifican a cualquiera de los homólogos anteriormente mencionados. El desempeño de crecimiento puede ser monitoreado en un invernadero o en el campo. Otras etapas opcionales incluyen el cruzamiento de plantas, en las cuales se identificó la variante alélica superior, con otra planta. Esto podría ser utilizado, por ejemplo, para hacer una combinación de rasgos fenotípicos interesantes.

Se pueden utilizar también ácidos nucleicos HKT o variantes de los mismos como se mencionó anteriormente como sondas para cartografiar genética y físicamente los genes de los cuales hacen parte, y como marcadores para rasgos enlazados con esos genes. Tal información puede ser útil en fitomejoramiento de plantas con el propósito de desarrollar líneas con fenotipos deseados. Tal uso de ácidos nucleicos HKT o de variantes de los mismos requiere únicamente de una secuencia de ácido nucleico de al menos 10 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos HKT o las variantes de los mismos pueden ser utilizados como marcadores de polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Las transferencias tipo Southern de ADN genómico de la planta digerido con enzimas de restricción pueden ser sondadas con los ácidos nucleicos CDKA o variantes de los mismos. Los patrones de las bandas resultantes pueden ser luego sometidas a análisis genético utilizando programas de computador tales como MapMaker (Lander y colaboradores (1987) Genomics 1, 174 - 181) con el propósito de construir un mapa genético. Además, se pueden utilizar ácidos nucleicos para sondar transferencias tipo Southern que contienen los ADN genómicos tratados con endonucleasa de restricción de un grupo de individuos que representan a los padres y a la progenie de un cruce genético definido. La segregación de los polimorfismos de ADN es anotada y utilizada para calcular la posición del ácido nucleico HKT o de una variante del mismo en el mapa genético previamente obtenido utilizando esta población (Botstein y colaboradores (1980) Am. J. Hum. Genet. 32, 314 - 331).

La producción y el uso de sondas derivadas de genes de plantas para uso en cartografía genética están descritos en Bematzky y Tanksley (Genetics 112, 887 - 898, 1986). Numerosas publicaciones describen la cartografía genética de clones específicos de ADNc utilizando la metodología esbozada anteriormente o variaciones de la misma. Por ejemplo, las poblaciones con entrecruzamiento F2, las poblaciones con retrocruzamiento, las poblaciones apareadas en forma aleatoria, las líneas casi isogénicas, y otros grupos de individuos pueden ser utilizados para cartografía. Tales metodologías son bien conocidas por aquellos capacitados en el arte.

Se pueden utilizar también sondas de ácido nucleico para cartografía física (es decir, colocación de secuencias sobre mapas físicos; ver Hoheisel y colaboradores En: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, páginas. 319 - 346, y las referencias citadas allí).

En otra modalidad, se pueden utilizar sondas de ácido nucleico en cartografía de hibridación in situ con fluorescencia directa (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7, 149 - 154). Aunque los métodos actuales de cartografía por FISH favorecen el uso de clones grandes (desde unos pocos hasta varios cientos de kb; ver Laan y colaboradores (1995) Genome Res. 5, 13 - 20), las mejoras en sensibilidad pueden permitir la realización de cartografía por FISH utilizando sondas más cortas.

Se pueden llevar a cabo una variedad de métodos con base en la amplificación de ácido nucleico de cartografía genética y física utilizando los ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen amplificación específica de alelos (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med. 11, 95 - 96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR, (CAPS; Sheffield y colaboradores (1993) Genomics 16, 325 - 332), ligación específica de alelos (Landegren y colaboradores (1988) Science 241, 1077 - 1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18, 3671), Radiation Hybrid Mapping (Walter y colaboradores (1997) Nat. Genet. 7, 22 - 28) y Happy Mapping (Dear y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17, 6795 - 6807). Para estos métodos, se utiliza la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir pares de iniciadores para uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión del iniciador. El diseño de tales iniciadores es bien conocido por aquellos capacitados en el arte. En métodos que emplean cartografía genética con base en PCR, puede ser necesario identificar diferencias en la secuencia de ADN entre los padres del mapeo cruzado en la región correspondiente a la presente secuencia de ácido nucleico. Esto, sin embargo, generalmente no es necesario para métodos de cartografía.

De este modo, se puede llevar a cabo la generación, identificación y/o aislamiento de plantas con mayor actividad de HKT que muestra mayor rendimiento.

Los ácidos nucleico HKT o variantes de los mismos o polipéptidos HKT u homólogos de los mismos pueden encontrar uso también como reguladores de crecimiento. Ya que estas moléculas han demostrado ser útiles en el mejoramiento de las características de crecimiento de las plantas, también serían útiles reguladoras de crecimiento, tal como herbicidas o estimuladoras del crecimiento. La presente invención proporciona por lo tanto una composición que contiene un HKT o una variante del mismo o un polipéptido HKT u homólogo del mismo, junto con un portador adecuado, diluyente o excipiente, para uso como regulador del crecimiento, preferiblemente como un promotor del crecimiento.

La realización de los métodos de acuerdo con la presente invención resulta en plantas que tienen mayor rendimiento, como se describió aquí anteriormente. Estas características conveniente de crecimiento pueden ser combinadas también con otros rasgos económicamente convenientes, tal como otros rasgos que mejoran el rendimiento, la tolerancia a diferentes estreses, rasgos que modifican diferentes elementos arquitectónicos y/o rasgos bioquímicos y/o fisiológicos, con la condición de que las secuencias representadas en el Acceso al GenBank No. U16709 no sean utilizadas para modificar la tolerancia a la sal de una planta o para acumulación de metales alcalinos.

Descripción de las figuras

Se describirá ahora la presente invención con referencia a las siguientes figuras en las cuales:

Fig. 1 Representación esquemática de una proteína HKT (Maser et al., 2002). Los dominios transmembrana están marcados con los números romanos I a VIII y los cuatro dominios formadores de poro están indicados con las letras A hasta D. La alineación muestra al dominio formador de poro A de diferentes HKT de planta comparado con Trk1 de S. cerevisiae (M21328), TrkH de Pseudomonas aeruginosa (AAG06598), KtrB de Vibrio alginolyticus (BAA32063), y con el dominio formador de poro del canal Agitador de Drosophila (S00479). El residuo correspondiente a la primera glicina del motivo GYG del canal de K+ está marcado con un asterisco.

Fig. 2 Múltiples alineaciones de diferentes secuencias de proteína HKT. Se dan los números de acceso de la base de datos; abreviaturas utilizadas: At, Arabidopsis thaliana; Mc, Mesembryanthemum crystallinum; Ec, Eucalyptus camandulensis; Os, Oryza sativa. JU0466 representa la secuencia TRK1 de Saccharomyces uvarum y CAA82128 es la secuencia TRK2 de Saccharomyces cerevisiae.

Fig. 3 Representación esquemática del clon de entrada p036, que contiene CDS1532 dentro de los sitios AttL1 y AttL2 de clonación Gateway® en la columna vertebral pDONR201. CDS1532 es el código interno para la secuencia que codifica HKT de Arabidopsis. Este vector contiene también un casete de resistencia a la kanamicina bacteriana y un origen bacteriano de replicación.

Fig. 4 muestra un vector binario para expresión en Oryza sativa del gen HKT de Arabidopsis (referencia interna CDS1532) bajo el control del promotor WSI18 de arroz (referencia interna PRO0151). Este vector contiene T-ADN derivado del Plásmido Ti, limitado por un borde izquierdo (repetición LB, LB Ti C58) y un borde derecho (repetición RB, RB Ti C58)). Desde el borde izquierdo hasta el borde derecho, este T-ADN contiene: un casete para selección antibiótica de plantas transformadas; un promotor constitutivo - marcador seleccionable - casete terminador NOS para selección visual de plantas transformadas; la zeína de la construcción PRO0151-CDS1532 y el casete terminador doble rbcS-deltaGA para expresión del gen HKT de Arabidopsis. Este vector también contiene un origen de replicación de pBR322 par replicación bacteriana y un marcador seleccionable (Spe/SmeR) para selección bacteriana con espectinomicina y estreptomicina.

Fig. 5 detalla ejemplos de secuencias útiles en la realización de los métodos de acuerdo con la presente invención.

Ejemplos

Se describirá ahora la presente invención con referencia a los siguientes ejemplos, que son únicamente para propósitos de ilustración.

Manipulación de ADN: a menos que se establezca otra cosa, se llevan a cabo las técnicas de ADN recombinante de acuerdo a protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel y colaboradores (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales y métodos estándar para trabajo molecular en plantas están descritos en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R. D. D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU).

Ejemplo 1: Clonación Génica

Se amplificó HKT de Arabidopsis (referencia interna CDS1532) por medio de PCR utilizando como molde una biblioteca de ADNc de plantas de semillero de Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, RU). Después de transcripción inversa del ARN extraído de las plantas de semillero, se clonaron los ADNc en pCMV Sport 6.0. El tamaño promedio del inserto del banco fue de 1,5 kb, y el número original de clones fue de 1,59 x 107 cfu. Se determinó que el título original era e 9,6 x 105 cfu/ml, y se convirtió después de una primera amplificación en 6 x 1011 cfu/ml. Después de la extracción del plásmido, se utilizaron 200 ng de molde en una mezcla PCR de 50 μl. Se utilizaron los iniciadores prm3283 (SEQ ID NO: 5) y prm8443 (SEQ ID NO: 6), que incluyen los sitios AttB para recombinación Gateway, para amplificación por PCR. Se llevó a cabo la PCR utilizando Hifi Taq ADN polimerasa bajo condiciones estándar. Se amplificó y purificó un fragmento PCR de 1613 pb utilizando también métodos estándar. Se llevó a cabo entonces la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento PCR se recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway®, un “clon de entrada”, p036 (Fig. 3). Se adquirió el plásmido pDONR201 a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

Ejemplo 2: Construcción del Vector

Se utilizó posteriormente el clon de entrada p036 en una reacción LR con p56, un vector de destinación utilizado para transformación de Oryza sativa. Este vector contenía como elementos funcionales dentro de los bordes del TADN: un marcador seleccionable de planta; un marcador visual, y un casete Gateway destinado a recombinación in vivo LR con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Se localizó un promotor WSI18 de arroz para expresión constitutiva (PR00151) secuencia arriba de este casete Gateway. Después de la etapa de recombinación LR, el vector de expresión resultante p060 (Fig. 4) que contiene al casete de expresión de la SEQ ID NO: 4 puede ser transformado dentro de la cepa LBA4404 de Agrobacterium y posteriormente en plantas de Oryza sativa. Se les permitió a las plantas de arroz transformadas crecer y luego fueron examinadas por los parámetros descritos en el Ejemplo 3.

Ejemplo 3: Evaluación de los Transformantes: Mediciones de Crecimiento

Aproximadamente se generaron 15 a 20 transformantes independientes T0. Se transfirieron los transformantes primarios desde las cámaras de cultivo de tejidos hasta un invernadero para crecimiento y cosecha de semillas T1. Cinco eventos de los cuales se retuvo la progenie T1 segregada 3:1 por la presencia/ausencia del transgén. Para cado uno de estos eventos, se seleccionaron 10 plántulas T1 que contenían al transgén (hetero y homocigotos), y 10 plántulas T1 que carecían del transgén (nulicigotos), por medio de selección del marcador visual. Se transfirieron las plantas seleccionadas T1 a un invernadero. Cada planta recibió una etiqueta única con código de barras para enlazar en forma inequívoca los datos de fenotipificación con la planta correspondiente. Se cultivaron las plantas T1 seleccionadas sobre suelo en macetas de 10 cm de diámetro bajo las siguientes parámetros ambientales: período de luz = 11,5 h, intensidad de luz natural = 30.000 lux o más, temperatura durante el día = 28°C o superior, temperatura durante la noche = 22°C, humedad relativa = 60 - 70%. Se cultivaron las plantas transgénicas y los correspondientes nulicigotos lado a lado en posiciones aleatorias. A partir de la etapa de siembra hasta la etapa de madurez, se pasaron las plantas varias veces a través de un gabinete para formación de imágenes digitales. En cada instante de tiempo se tomaron imágenes digitales (2048 x 1536 pixeles, 16 millones de colores) de cada planta al menos a partir de 6 ángulos diferentes.

Se cosecharon las panículas primarias maduras, se ensacaron, se marcaron con código de barras y luego se secaron durante tres días en el horno a 37ºC. Se trillaron luego las panículas y se recogieron todas las semillas. Se separaron las vainas llenas de las vacías utilizando un dispositivo de soplado de aire. Después de la separación, se contaron luego ambos lotes de semillas utilizando una máquina contadora comercialmente disponible. Se descartaron las vainas vacías. Se pesaron las vainas llenas en una balanza analítica y se midió el área de sección transversal de las semillas utilizando formación de imágenes digitales. Este procedimiento condujo al conjunto de parámetros relacionados con la semilla descrito más adelante.

Estos parámetros se obtuvieron en una forma automatizada a partir de las imágenes digitales utilizando un software para análisis de imágenes y se hizo un análisis estadístico. Se utilizó un ANOVA de dos factores (análisis de varianza) corregido por el diseño desequilibrado como modelo estadístico para la evaluación total de las características fenotípicas de la planta. Se llevó a cabo una prueba F sobre todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con ese gen. Se realizó la prueba F para verificar el efecto del gen sobre todos los eventos de transformación y para verificar un efecto total del gen, también denominado aquí como un “efecto génico global”. Si el valor de la prueba F mostró que los datos eran significativos, entonces se concluyó que existió un efecto “génico”, lo cual significa que no solamente la presencia o la posición del gen fue la causante del efecto. El umbral de significancia para un efecto génico global verdadero se estableció en un nivel de probabilidad del 5% para la prueba F.

Para verificar el efecto de los genes dentro de un evento, es decir, para un efecto específico de línea, se realizó una prueba t dentro de cada evento utilizando conjuntos de datos de las plantas transgénicas y de las correspondientes plantas nulas. “Plantas nulas” o “segregantes nulos” o “nulicigotos” se refiere a las plantas tratadas en la misma forma que las plantas transgénicas, pero a partir de las cuales se segregó el transgén. Se pueden describir también plantas nulas como las plantas homocigotos transformadas negativas. El umbral de significación para la prueba t fue establecido en un nivel de probabilidad del 10%. Los resultados para algunos eventos pueden estar por encima o por debajo de este umbral. Esto se basa en la hipótesis de que un gen puede tener únicamente un efecto en ciertas posiciones en el genoma, y que la ocurrencia de este efecto que depende de la posición no es poco común. Esta clase de efecto génico también denominado aquí como un “efecto de línea del gen”. Se obtuvo el valor p por

5

10

15

20

25

30

35

comparación del valor t con la distribución t o alternativamente, por comparación del valor F con la distribución F. El valor p conduce a la probabilidad de que la hipótesis nula (es decir, que no exista efecto del transgén) sea correcta.

Los datos obtenidos en el primer experimento fueron confirmados en un segundo experimento con plantas T2. Se seleccionaron tres líneas que tenían el patrón correcto de expresión para análisis adicionales. Se seleccionaron lotes de semillas de las plantas positivas (tanto hetero como homocigotas) en T1 monitoreando la expresión del marcador. Para cada evento escogido, se retuvieron luego los lotes de semillas heterocigotas para evaluación T2. Dentro de cada lote de semillas, se cultivaron un número igual de plantas positivas y negativas en el invernadero para evaluación.

Se evaluó un número total de 120 plantas transformadas con HKT en la generación T2, esto es, 30 plantas por evento de las cuales 15 fueron positivas para el transgén y 15 negativas.

Debido a que se llevaron a cabo dos experimentos con eventos de solapamiento, se llevó a cabo un análisis combinado. Esto es útil para verificación de la consistencia de los efectos sobre los dos experimentos, y si es el caso, para acumular evidencia a partir de ambos experimentos con el propósito de incrementar la confianza en la conclusión. El método utilizado fue un modelo mezclado. El método utilizado fue una aproximación de un modelo mezclado que tiene en cuenta la estructura multinivel de los datos (es decir experimento - evento - segregantes). Se obtuvieron los valores p por comparación de la prueba de razón de verosimilitud con las distribuciones chi cuadrado.

Ejemplo 4: Evaluación de Transformantes: medición de parámetros relacionados con la productividad

Después del análisis de las semillas como se describió anteriormente, los inventores encontraron que las plantas transformadas con la construcción génica AtHKT obtuvieron mejores puntajes para diferentes parámetros e rendimiento, incluido el número de semillas llenas, el rendimiento total y el índice de cosecha comparado con las plantas nulicigotos. Se midió el rendimiento total de semillas pesando todas las vainas llenas recolectadas de una planta. Se determinó el número de semillas llenas haciendo un recuento del número de vainas llenas que quedaron después de la etapa de separación. El índice de cosecha se define en la presente invención como la relación entre el rendimiento total de semilla y el área por encima de suelo (en mm2).

Se seleccionaron cuatro eventos para una evaluación en plantas T2. Los resultados para mayor rendimiento estaban también presentes en la generación T2. Los incrementos para las líneas individuales variaron entre 8 y 20% para el índice de cosecha, entre 12 y 24% para el peso total de semillas y fue alrededor del 15% para el número de semillas llenas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CropDesign N.V.

<120> Plantas que tienen características mejoradas de crecimiento y método para lograrlo

<130> CD-125-PCT

<150> EP 04105406.5

<151> 2004-10-29

<150> US 60/624.892

<151> 2004-11-04

<160> 45

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 1521

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

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5

<210> 2

<211> 506

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana 10 <400> 2

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<210> 3

<211> 3817

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 3

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<210> 4

<211> 4308 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> casete de expresión

<400> 4

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<210> 5

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

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<223> iniciador: prm3283

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggac agagtggtgg ca

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<210> 6

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> iniciador: prm3286

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg aaatatgtta ggaagacgag gg

52

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio

<400> 7

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<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> dominio

<400> 8

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<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia de consenso

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (2)..(2)

<223> Xaa puede ser Val o Ile

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (3)..(3)

<223> Xaa puede ser Ile o Val

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (6)..(6)

<223> Xaa puede ser Tyr o Phe

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (8)..(8)

<223> Xaa puede ser Asn o Thr

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (9)..(9)

<223> Xaa puede ser Val, Ala o Thr

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (11)..(11)

<223> Xaa puede ser Phe, Leu o Tyr

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (12)..(12)

<223> Xaa puede ser Thr o Ser

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (13).. (13)

<223> Xaa puede ser Thr, Ile, Leu, Val o Met

<400> 9

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<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> firma

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (3)..(3)

<223> Xaa puede ser Ile o Leu

<220>

<221> CARACTERÍSTICA NUEVA

<222> (5)..(5)

<223> Xaa puede ser Tyr, Phe o Leu

<400> 10

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<210> 11

<211> 1632

<212> ADN

<213> Mesembryanthemum crystallinum

<400> 11 <210> 12

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<211> 543

<212> PRT

<213> Mesembryanthemum crystallinum

<400> 12 <210> 13 <211> 1518

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<212> ADN

<213> Mesembryanthemum crystallinum

<400> 13

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<210> 14

<211> 505 10 <212> PRT

<213> Mesembryanthemum crystallinum

<400> 14

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<210> 15

<211> 1653

<212> ADN

<213> Eucalyptus camaldulensis

<400> 15

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10

<210> 16

<211> 550

<212> PRT

<213>

Eucalyptus camaldulensis 15 <400> 16

<210> 17

<211> 1650

<212> ADN

<213> Eucalyptus camaldulensis

<400> 17

<210> 18

<211> 549

<212> PRT

<213> Eucalyptus camaldulensis

<400> 18

<210> 19

<211> 1593

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 19

<210> 20

<211> 530

<212> PRT

<213>

Oryza sativa 15 <400> 20

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10

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<210> 21

<211> 1593

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 21

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<210> 22

<211> 530

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 22

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<210> 23

<211> 1530

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 23

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<210> 24 10 <211> 509

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 24

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<210> 25

<211> 1659

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 25

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10

<210> 26

<211> 552

<212> PRT

<213>

Oryza sativa 15 <400> 26

<210> 27

<211> 1596

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 27

<210> 28

<211> 531

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 28

<210> 29

<211> 1503

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 29

<210> 30

<211> 500

<212> PRT

<213>

Oryza sativa 15 <400> 30

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10

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<210> 31

<211> 1665

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 31

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<210> 32

<211> 554

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 32

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<210> 33

<211> 1530

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 33

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<210> 34 10 <211> 509

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 34

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<210> 35

<211> 1602

<212> ADN

<213> Triticum aestivum

<400> 35

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10

<210> 36

<211> 533

<212> PRT

<213> Triticum aestivum 15 <400> 36

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<210> 37

<211> 1458

<212> ADN

<213> Suaeda maritima subsp. salsa

<400> 37 <210> 38

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<211> 485

<212> PRT

<213> Suaeda maritima subespecie salsa

<400> 38

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<210> 39

<211> 3708

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 39

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<210> 40

<211> 1235

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 40

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<210> 41

<211> 2670

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 41

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<210> 42

<211> 889

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 42

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<210> 43

<211> 3726

<212> ADN

<213> Saccharomyces uvarum

<400> 43

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<210> 44

<211> 1241

<212> PRT

<213> Saccharomyces uvarum

<400> 44

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<210> 45

<211> 1828

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 45

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REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

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WO 9605722 A [0005] • WO 2004070039 A [0075]

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US 5811238 A [0051] • EP 99106056 A [0075]

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US 6395547 A [0051] • EP 1198985 A1 [0085]

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Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Método para incrementar en rendimiento de una planta, con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre, que comprende un aumento de la actividad en una planta de una proteína y seleccionar las plantas que tienen mayor rendimiento con relación a la correspondiente planta de tipo silvestre, siendo dicha proteína seleccionada del grupo que consiste de

   a) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEQ ID NO: 2; b) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 35% idéntica a la secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEQ ID NO: 2 que tiene actividad transportadora de cationes; c) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 35% idéntica a la secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEQ ID NO: 2 que tiene actividad transportadora de cationes y contiene una secuencia de consenso como la mostrada en la SEQ ID NO: 9; d) una proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 1; y e) una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones rigurosas a la secuencia de ácido nucleico como la mostrada en la SEQ ID NO: 1, en donde la proteína tiene actividad trasportadora de cationes.

2. 2.

   Método de la reivindicación 1, en donde dicha mayor actividad se lleva a cabo por medio de la introducción de una modificación genética en el locus de un gen que codifica la proteína HKT.

3. 3.

   Método de la reivindicación 2, en donde dicha modificación genética se lleva a cabo por medio de mutagénesis dirigida al sitio, evolución dirigida, recombinación homóloga, TILLING y activación de T-ADN.

4. 4.

   Método para incrementar el rendimiento de una planta con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre, que comprende la introducción y expresión en una planta de una molécula de ácido nucleico para HKT que es seleccionada del grupo que consiste de:

   a) una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia como la mostrada en la SEQ ID NO: 1; b) una molécula de ácido nucleico que es capaz de hibridar bajo condiciones rigurosas a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 1, cuando dicha molécula de ácido nucleico codifica una proteína que tiene actividad transportadora de cationes.

5. 5.

   Método de acuerdo a la reivindicación 4, en donde dicha molécula de ácido nucleico para HKT está operativamente enlazada a un promotor específico de la semilla.

6. 6.

   Método de acuerdo a la reivindicación 4 ó 5, en donde dicha molécula de ácido nucleico para HKT está operativamente enlazada a un promotor específico de embrión y/o aleurona.

7. 7.

   Método de acuerdo a la reivindicación 5 ó 6, en donde dicho promotor tiene un perfil de expresión comparable a un promotor WSI18.

8. 8.

   Método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde dicho mayor rendimiento es mayor rendimiento de biomasa y/o mayor rendimiento de semilla.

9. 9.

   Método de acuerdo a la reivindicación 8, en donde dicho mayor rendimiento de semilla se selecciona de uno o más de (i) mayor biomasa de semilla; (ii) mayor número de semillas; (iii) mayor número de semillas llenas; (iv) mayor tamaño de semilla; (v) mayor volumen de semilla; (vi) mayor índice de cosecha (HI); y (vii) mayor peso de mil granos (TKW).

10. 10.

    Método para la producción de una planta transgénica que tiene mayor rendimiento cuyo método comprende:

    (i)

    la introducción en una planta de una molécula de ácido nucleico como la definida en la reivindicación 4;

    (ii)

    el cultivo de la célula vegetal bajo condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.

11. 11.

    Uso de una molécula de ácido nucleico como la definida en la reivindicación 4 o una proteína como la definida en la reivindicación 1 mayor rendimiento de las plantas.

12. 12.

    Uso de acuerdo a la reivindicación 11, en donde dicho mayor rendimiento comprende al menos un mayor número de semillas llenas.

13. 13.

    Uso de una molécula de ácido nucleico como la definida en la reivindicación 4 como un marcador molecular para identificar plantas que exhiban mayor rendimiento.