ES2338028T3 - Plantas que tienen caracteristicas de crecimiento mejoradas y metodo para hacer las mismas. - Google Patents

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ES2338028T3 ES05776204T ES05776204T ES2338028T3 ES 2338028 T3 ES2338028 T3 ES 2338028T3 ES 05776204 T ES05776204 T ES 05776204T ES 05776204 T ES05776204 T ES 05776204T ES 2338028 T3 ES2338028 T3 ES 2338028T3
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Abstract

Método para incrementar el rendimiento en crecimiento de plantas bajo condiciones sin tensión con relación a plantas de control, que comprende introducir y expresar en una planta una molécula de ácido nucleico SnRK2 aislada que codifica un polipéptido SnRK2 que comprende lo siguiente: (i)un dominio quinasa serina/treonina funcional; (ii)la secuencia distintiva conservada W(F/Y)(L/M/R/T)(K/R)(N/G/R) (UP/I)(P/L)(AIGN/R/K/1)(D/EN) (SEQ ID NO: 6); y (iii)un dominio de terminal C ácido que parte del último residuo de la SEQ ID NO: 6.

Description

Plantas que tienen características de crecimiento mejoradas y método para hacer las mismas.
La presente invención se relaciona generalmente con el campo de la biología molecular y se relaciona con un método para incrementar el rendimiento en el crecimiento de las plantas bajo condiciones sin estrés al incrementar la actividad de una proteína quinasa relacionada con SNF1 (SnRK2) o un homólogo de la misma en una planta. La presente invención también se relaciona con plantas que tienen expresión incrementada de un ácido nucleico que codifica una proteína quinasa SnRK2 o un homólogo de la misma, tales plantas tienen características de rendimiento incrementadas con relación a las plantas de tipo natural correspondientes. También se proporcionan las construcciones útiles en los métodos de la invención.
Dada la cada vez más creciente población mundial, y el área de disminución de las tierras disponibles para la agricultura, sigue siendo un objetivo principal de la investigación agrícola mejorar la eficiencia de la agricultura e incrementar la diversidad de plantas en horticultura. Los medios convencionales para el cultivo y las mejoras de la horticultura utilizan técnicas de reproducción selectiva para identificar plantas que tienen las características deseadas. Sin embargo, dichas técnicas de reproducción selectiva tiene varios inconvenientes, a saber, que estas técnicas típicamente tienen mano de obra intensa y resulta en plantas que contienen a menudo complementos genéticos heterogéneos, que no siempre pueden resultar en el rasgo deseable que se transmite de plantas progenitoras. Los avances en biología molecular han permitido a la humanidad manipular el germoplasma de animales y plantas. La ingeniería genética de plantas implica el aislamiento y la manipulación de material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de ese material genético en una planta. Tal tecnología ha llevado al desarrollo de plantas que tienen varios rasgos económicos, hortícolas o agronómicos mejorados. Los rasgos de interés económico particulares son características de crecimiento tales como de alto rendimiento. El rendimiento se define normalmente como el producto medible de valor económico de un cultivo. Esto puede ser definido en términos de cantidad y/o calidad. El rendimiento es directamente dependiente de varios factores, por ejemplo, el número y tamaño de los órganos, arquitectura de la planta (por ejemplo, el número de ramas), la producción de semillas y más. El desarrollo de la raíz, la absorción de nutrientes y la tolerancia al estrés también pueden ser factores importantes en la determinación del rendimiento. Por lo tanto se puede aumentar el rendimiento de los cultivos al optimizar uno de los factores anteriormente
mencionados.
Se reporta que la levadura de la proteína quinasa SNF1 se involucra en la respuesta a la tensión de en ayuno de glucosa. Se supone que participa en la activación de los genes que son reprimidos por la glucosa al fosforilar la proteína represora Mig1. El SNF1 tiene ortólogos en otros organismos tales como la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) en los mamíferos. La AMPK se activa por concentraciones de 5'-AMP incrementadas como un resultado del agotamiento de ATP, que puede ser originado por condiciones de tensión, que incluyen el choque térmico o ayuno de glucosa. Las plantas también tienen quinasas relacionadas con SNF1, llamadas SnRKs. Las plantas SnRKs se dividen en tres subgrupos, SnRK1 a SnRK3. El subgrupo SnRK1 está más estrechamente relacionado con SNF1, estructural y funcionalmente, mientras que los subgrupos SnRK2 y SnRK3 pueden ser únicos en las plantas. Las proteínas SnRK2 carecen del dominio regulador de terminal C encontrado en SNF1, peo en cambio tienen a su terminal C un alargamiento acídico de ácidos glutámico y aspártico. Las proteínas SnRK2 tienen un peso molecular de aproximadamente 40 kDa y se codifican por una pequeña familia de genes: la Arabidopsis y el arroz que se han reportado por tener 10 genes SnRK2. La primera proteína quinasa relacionada con SNF1 de planta 2 (SnRK2), designada PKABA1, fue aislada por Anderberg y Walker-Simmons (Proc. Natl. Acad. EE.UU. 89, 10183-10187, 1992). Se encuentra que es inducida por ácido abscísico (ABA) y deshidratación. Más tarde, se aislaron las proteínas relacionadas, tales como ASK1 y ASK2, (Park et al., Plant Molecular Biology 22, 615-624, 1993). Se reportan estos genes por ser expresados en varios órganos de la planta, pero fueron más abundantes en las hojas. Otro miembro del subgrupo SnRK2 es OST1 (Mustilli et al., célula de planta 14, 3089-3099, 2002). Se expresa el OST1 en las células guardianas de estomas y el tejido vascular, y se postula para actuar entre la percepción de ácido abscísico (ABA) y la producción de especies reactivas de oxígeno que provocan el cierre de los estomas. En el arroz, se encuentran que todas las proteínas SnRK2 se activan por el estrés hiperosmótico y algunas de ellas también se activan por ABA (Kobyashi et al., célula de planta 16, 1163-1177, 2004). Se reporta el REK (renombrado SAPK3, Kobyashi et al., 2004) por ser expresado en las hojas y semillas de maduración, pero no en los tallos o raíces. Las proteínas REK recombinantes muestran actividad de autofosforilación incrementada en la presencia de
Ca^{2+}.
La WO 98/05760 describe más de secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas involucradas en la absorción de fósforo y el metabolismo (proteínas psr). Una de estas proteínas psr es la proteína quinasa psrPK, una proteína relacionada con SnRK2 que se expresa luego de ayuno de fosfato. Se especula que esta proteína y otras proteínas psr pueden ser útiles en la manipulación del metabolismo del fósforo, sin embargo ninguno de los fenotipos propuestos, se habilitan muchas de ellas que se relacionan con la resistencia al estrés incrementada. Assmann y Li (WO 01/02541) describe la proteína quinasa AAPK, otras relacionadas con SnRK2. Se reporta la pérdida de la función de AAPK por reducir la sensibilidad al cierre de estomas inducido por ácido abscísico. Se sugiere por lo tanto que el opuesto, (expresión incrementada o actividad incrementada de AAPK) puede resultar en las plantas con resistencia a la sequía. Los autores sin embargo no muestran que este es el caso. Hasta ahora los datos experimentales disponibles para las proteínas relacionadas con SnRK2 sugieren principalmente un papel en las respuestas al estrés de las
plantas.
Ninguno de los documentos de la técnica anterior ha demostrado o sugerido que la expresión incrementada o actividad incrementada y/o expresión de una proteína SnRK2 resulta en el incremento del rendimiento, relacionado con el tipo natural correspondiente y las plantas no estresadas.
Ahora se ha encontrado de forma sorprendente que la actividad y/o expresión incrementada de una proteína SnRK2 en las plantas resulta en las plantas que tienen características de crecimiento mejoradas, y en el rendimiento particular, relacionado con las plantas de tipo natural correspondientes. Se obtienen estos resultados bajo condiciones de crecimiento de planta estándar, y este incremento del rendimiento no es la consecuencia de la resistencia al estrés incrementada.
Estructuralmente, las proteínas SnRK2 son proteínas quinasa serina/treonina, con un dominio catalítico que se clasifica en la base de datos SMART como un tipo S-TKc (número de Acceso SMART SM00220). El sitio activo corresponde al PROSITE distintivo, PS00108 (Prosite, Instituto Suizo de Bioinformática, http://us.expasy.org):
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La parte del terminal C comprende un alargamiento de poliresiduos (Glu y/o Asp) de función no conocida.
De acuerdo con una realización de la presente invención se proporciona un método para mejorar las características de crecimiento de una planta que comprende la actividad y/o expresión incrementada en una planta de un polipéptido SnRK2 o un homólogo del mismo y opcionalmente seleccionar a las plantas que tienen características de crecimiento mejoradas.
Ventajosamente, el desempeño del método de acuerdo con la presente invención resulta en plantas que tienen una variedad de características de crecimiento mejoradas, tales como rendimiento mejorado, biomasa mejorada, cada uno relacionado con plantas de tipo natural correspondientes. Preferiblemente, las características de crecimiento mejoradas comprenden por lo menos rendimiento incrementado con relación una planta de tipo natural correspondientes. Preferiblemente, el rendimiento incrementado es biomasa incrementada y/o rendimiento de semilla incrementado, que incluye uno o más de los números incrementados de semillas (cargadas), peso total incrementado de semillas, peso del grano aumentado por mil e índice de cosecha incrementado. Se debe notar que el incremento del rendimiento no es la consecuencia de la resistencia al estrés incrementada.
El término "rendimiento incrementado" como se define aquí significa un incremento en uno cualquiera o más de los siguientes, cada uno relativo una planta de tipo natural correspondientes: (i) biomasa incrementada (peso) de una o más partes de una planta, particularmente partes sobre la superficie (aprovechable), biomasa de raíz incrementada o biomasa incrementada de cualquier otra parte aprovechable; (ii) rendimiento de semilla total incrementado, que incluye un incremento en la biomasa de semilla (peso de semilla) y que puede ser un incremento en el peso de semilla por planta o en una base de semilla individual; (iii) número incrementado de semillas (cargadas); (iv) tamaño de semilla incrementado; (v) volumen de semilla incrementado; (vi) área de semilla individual incrementada; (vii) longitud de semilla individual incrementada; (viii) índice de cosecha incrementado, que se expresa como una proporción del rendimiento de las partes aprovechables, tales como semillas, sobre la biomasa total; (ix) número incrementado de florecillas por panícula que se extrapolan del número total de semillas contadas y el número de panículas principales; y (x) peso del grano incrementado por mil (TKW), que se extrapola del número de semillas cargadas contadas y su peso total. Un TKW incrementado puede resultar de un tamaño de semilla incrementado (longitud, anchura o ambos) y/o peso de semilla. Un TKW incrementado puede resultar de un incremento en el tamaño del embrión y/o tamaño del endosperma.
Tomando el maíz como un ejemplo, se puede manifestar un incremento en el rendimiento como uno o más de los siguientes: incremento en el número de plantas por hectárea o acre, un incremento en el número de mazorcas por planta, un incremento en el número de hileras, números de granos por hilera, peso del grano, TKW, longitud/diámetro de la mazorca, entre otros. Tomando el arroz como un ejemplo, se puede manifestar un incremento en el rendimiento en uno o más de los siguientes: número de plantas por hectárea o acre, número de panículas por planta, número de espiguillas por panícula, número de flores por panícula, incremento en el índice de semilla cargada, incremento en TKW, entre otros.
Preferiblemente, el desarrollo de los métodos de acuerdo con la presente invención resulta en plantas que tienen rendimiento incrementado y más particularmente, biomasa incrementada y/o rendimiento de semilla incrementado. Preferiblemente, el rendimiento de semilla incrementado comprende un incremento en uno o más del número de semillas (cargadas), peso total de semilla, tamaño de semilla, peso de grano por mil e índice de cosecha, cada uno relativo a las plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento de la planta, cuyo método comprende actividad y/o expresión incrementada en una planta de un polipéptido SnRK2 o un homólogo del mismo.
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Ya que las plantas mejoradas de acuerdo con la presente invención tienen rendimiento incrementado, es probable que estas plantas exhiban un índice de crecimiento incrementado (durante por lo menos parte de su ciclo de vida), relativo al índice de crecimiento de las plantas de tipo natural correspondientes en una etapa correspondiente en su ciclo de vida. Se puede especificar el índice de crecimiento incrementado en una o más partes o tipos de célula de una planta (que incluye semillas), o puede ser sustancialmente la planta completa. Las plantas que tienen un índice de crecimiento incrementado tienen un ciclo de vida más corto. El ciclo de vida de una planta se puede entender como el tiempo necesario para crecer de una semilla madura seca hasta la etapa en donde la planta ha producido semillas maduras secas, similares al material de partida. Se puede influenciar este ciclo de vida por factores tales como vigor temprano, índice de crecimiento, tiempo y velocidad de floración de la maduración de la semilla. Un incremento de en el índice de crecimiento puede tener lugar en una o más etapas en el ciclo de vida de una planta o durante sustancialmente el ciclo de vida de la planta total. El índice de crecimiento incrementado durante las primeras etapas del ciclo de vida de una planta puede reflejar vigor mejorado. Un incremento en el índice de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de plantas que permiten a una planta ser sembrada tarde y/o cosechada antes de lo que de otro modo sería posible. Si el índice de crecimiento es lo suficientemente incrementado, puede permitir la siembra de semillas adicionales de la misma especie de planta (por ejemplo, la siembra y cosecha de plantas de arroz seguido por la siembra y cosecha de plantas de arroz adicionales todas dentro de un período de crecimiento convencional). De forma similar, si el índice de crecimiento es suficientemente incrementado, puede permitir la siembra de semillas adicionales de especies de plantas diferentes (por ejemplo, la siembra y cosecha de plantas de arroz seguido de, por ejemplo, la siembra y cosecha opcional de soya, papas o cualesquier otras plantas adecuadas). También pueden ser posibles los tiempos adicionales de cosecha del mismo rizoma en el caso de algunas plantas. La alteración del ciclo de cosecha de una planta puede llevar a un incremento en la producción de biomasa anual por acre (debido a un incremento en el número de veces (por ejemplo en un año) en que cualquier planta particular se puede cultivar y cosechar). Un incremento en el índice de crecimiento también se puede permitir para el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica mayor que sus contrapartes tipo natural, ya que las limitaciones territoriales para el crecimiento de un cultivo a menudo se determinan por condiciones ambientales adversas, ya sea en el tiempo de la siembra (a principios de temporada) o en el tiempo de la cosecha (final de temporada). Se pueden evitar tales condiciones adversas si se acorta el ciclo de cosecha. Se puede determinar el índice de crecimiento al derivar varios parámetros de los experimentos de crecimiento graficados en curvas de crecimiento, tales parámetros pueden ser: T-Mid (el tiempo tomado por las plantas para alcanzar el 50% de su tamaño máximo) y T-90 (tiempo tomado por las plantas para alcanzar el 90% de su tamaño máximo), entre
otros.
Un incremento en el rendimiento ocurre si la planta no está bajo condiciones de estrés o si la planta se expone a varios estrés comparadas con las plantas de control. Las plantas típicamente responden a la exposición al estrés al crecer más lentamente. En condiciones de estrés severo, la planta incluso puede dejar de crecer por completo. El estrés leve por otra parte se definido aquí como cualquier estrés al que se expone una planta que no resulta en cesamiento de la planta para crecer por completo sin la capacidad de reanudar el crecimiento. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (riego, fertilización, tratamientos fitosanitarios) el estrés severo no se encuentra a menudo en plantas de cultivo. Como una consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por estrés leve es a menudo una característica no deseable para la agricultura. El estrés leve es el estrés típico al que se puede exponer una planta. Este estrés puede ser estrés biótico y/o abiótico diario (medio ambiente) al que se expone una planta. El estrés ambiental o abiótico típico incluye estrés por temperatura causadas por temperaturas de calor o frío/congelación atípicas; estrés salino; estrés hídrico (sequía o el exceso de agua). También se pueden originar los estreses abióticos por productos químicos. Los estrés bióticos son típicamente aquellos estrés originados por agentes patógenos, tales como bacterias, virus, hongos e insectos.
Se pueden mejorar de forma ventajosa Las características de crecimiento anteriormente mencionadas en cualquier planta.
El término "planta" como se utiliza aquí abarca plantas completas, antecesores y progenie de las plantas y partes de planta, que incluyen semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (que incluyen tubérculos), flores, y tejidos y órganos, en donde cada una de las partes anteriormente mencionadas comprenden el gen/ácido nucleico de interés o la modificación genética en el gen/ácido nucleico agregado. El término "planta" también abarca células de planta, los cultivos de suspensión, tejido calloso, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen, y microesporas, de nuevo en donde cada uno de los anteriormente mencionados comprende el gen/ácido nucleico de
interés.
Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen algas, helechos, y todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, que incluyen forraje, leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos para alimento, árboles, o arbustos seleccionados de la lista que comprende Abelmoschus spp., Acer spp., Actinidia spp., Agropyron spp., Allium spp., Amaranthus spp., Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arabidopsis thaliana, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena sativa, Averrhoa carambola, Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp., Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carthamus tinctorius, Carya spp., Castanea spp., Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Cola spp., Colocasia esculenta, Corylus spp., Crataegus spp., Cucumis spp., Cucurbita spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Eleusine coracana, Eriobotrya japonica, Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glicina spp., Gossypium hirsutum, Helianthus spp., Hibiscus spp., Hordeum spp., Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lemna spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Macrotyloma spp., Malpighia emarginata, Malus spp., Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Panicum miliaceum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Persea spp., Petroselinum crispum, Phaseolus spp., Phoenix spp., Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Rubus spp., Saccharum spp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Solanum spp., Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp., Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre
otras.
De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo que comprende soya, girasol, canola, alfalfa, colza o slgodón. Preferible y adicionalmente, la planta de acuerdo con la presente invención es una planta monocotiledónea tal como caña de azúcar, más preferiblemente un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, mijo, cebada, centeno, avena o sorgo.
Se puede incrementar la actividad de una proteína SnRK2 al incrementar los niveles del polipéptido SnRK2. Alternativamente, también se puede incrementar la actividad cuando no hay cambio en los niveles de un SnRK2, o aún cuando existe una reducción en los niveles de un SnRK2. esto puede ocurrir cuando se alteran las propiedades intrínsecas del polipéptido, por ejemplo, al hacer un muíante o seleccionar una variante que es más activa que el tipo natural.
El término "SnRK2 u homólogo del mismo" como se define aquí se refiere a un polipéptido que comprende (i) un dominio de quinasa serina/treonina funcional, (ii) la secuencia distintiva conservada W(F/Y)(L/M/R/T)(K/R)(N/G/R)
(L/P/I)(P/L) (A/G/V/R/K/I)(D/E/V) (SEQ ID NO: 6) y (iii) un dominio de terminal C acídico que inicia del último residuo de la SEQ ID NO: 6. El "SnRK2 u homólogo del mismo" tiene en orden ascendente de preferencia por lo menos 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia completa con el aminoácido representado por la SEQ ID NO: 2. Se determina la identidad de secuencia completa utilizando un algoritmo de alineación global, tal como el algoritmo Needleman Wunsch en el programo GAP (GCG Wisconsin Package,
Accelrys).
Adicionalmente, tal "SnRK2 u homólogo del mismo", cuando se expresa bajo control de un promotor GOS2 en los cultivos de Oryza sativa Nipponbare, incrementa la biomasa del suelo y/o rendimiento de semilla comparado con plantas de tipo natural correspondientes. Se puede medir este incremento en el rendimiento de semilla en varias formas, por ejemplo como un incremento del peso del grano por mil.
Se pueden identificar los varios dominios estructurales en una proteína SnRK2 utilizando bases de datos especializadas por ejemplo SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244; http://smart.embl- heidelberg.de/), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318; http://www.ebi.ac.uk/interpro/), Prosite (Bucher and Bairoch (1994), una sintaxis de perfil generalizada para motivos de secuencias biomoleculares y su función en interpretación de secuencia automática. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAlPress, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004), http://www.expasy.org/prosite/) o Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1):276-280 (2002), http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/).
El dominio quinasa de SnRK2 es de un tipo S_TKc (número de acceso SMART SM00221, número de acceso InterPro IPR002290), y es funcional en el sentido que este tiene actividad quinasa Ser/Thr. El sitio activo predicho (ICHRDLKLENTLL, en donde D es el residuo catalítico predicho) corresponde al PROSITE PS00108 distintivo. El sitio de unión ATP (IGAGNFGVARLMKVKNSKELVAMK) corresponde al PROSITE PS00107 distintivo.
Preferiblemente, la secuencia distintiva conservada de la SEQ ID NO: 6 tiene la secuencia: W(F/Y)(LM/R)K(N/R)(L/I) P(A/G/V/R/K/I)(D/E), más preferiblemente, la secuencia distintiva conservada de la SEQ ID NO: 6 tiene la secuencia: W(F/Y) LKNLP(R/K)E; más preferiblemente, la secuencia distintiva conservada de la SEQ ID NO: 6 tiene la secuencia: WFLKNLPRE.
El dominio de Terminal C ácido como se utiliza aquí se define como la parte de terminal C de la proteína SnRK2 que parte del ultimo residuo en la secuencia distintiva conservada definida anteriormente (D o E en la SEQ ID NO: 6), y cuya parte de terminal C tiene un punto isoeléctrico (pl) que varía entre 2.6 y 4.1, preferiblemente entre 3.6 y 3.9, más preferiblemente el pl del dominio de Terminal C ácido es 3.7. Se calculan los valores pl utilizando el empaque EMBOSS (Rice et al., Trends in Genetics 16,276-277,2000).
Los métodos para la búsqueda e identificación de homólogos SnRK2 estarían bien dentro del ámbito de las personas expertas en la técnica. Tales métodos comprende comparación de las secuencias representadas por la SEQ ID NO: 1 o 2, en un formato legible por computador, con secuencias que están disponibles en las bases de datos públicas tales como MIPS (http://mips.gsf.de/), GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html) o Bases de Datos de Secuencia de Nucleótido EMBL (http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html), utilizando algoritmos bien conocidos en la técnica para la alineación o comparación de secuencias, tales como GAP (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)), BESTFIT (utilizando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2; 482-489 (1981))), BLAST (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)), FASTA y TFASTA (W. R. Pearson y D. J. Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444- 2448 (1988)). El software para desarrollar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI). Los homólogos mencionados adelante se identifican utilizando parámetros de BLAST por defecto (matriz BLOSUM62, pena de apertura de intervalo 11 y pena de extensión de intervalo 1) y preferiblemente se utilizan secuencias de longitud completa para
análisis.
Ejemplos de proteínas que caben bajo la definición del "polipéptido SnRK2 o un homólogo del mismo" incluyen proteínas Arabidopsis y proteínas de otras especies tales como arroz, soya y tabaco.
Dos formas especiales de homología, ortóloga y paráloga, son conceptos revolucionarios utilizados para describir las relaciones ancestrales de los genes. El término "parálogo" se relaciona con genes homólogos que resultan de una o más duplicaciones de gen dentro del genoma de una especie. El término "ortólogo" se relaciona con genes homólogos en diferentes organismos debido a la relación ancestral de estos genes.
Los parálogos de los polipéptidos SnRK2 se pueden identificar fácilmente al desarrollar un análisis BLAST contra un conjunto de secuencias de las mismas especies como la secuencia de consulta. Los ortólogos en, por ejemplo, especies de plantas monocotiledóneas se pueden encontrar fácilmente al desarrollar una así llamada búsqueda blast recíproca. Esto se puede hacer mediante un primer blast que involucra la secuencia blasting en cuestión (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, que es de Arabidopsis thaliana) contra cualquier base de datos de secuencia, tal como la base de datos NCBI disponible públicamente que se puede encontrar en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Si se buscan los ortólogos en el arroz, a la secuencia en cuestión se le realizaría blasting contra, por ejemplo, 28,469 clones de cADN de longitud completa de Oryza sativa Nipponbare disponibles en NCBI. Se puede utilizar BLASTn o tBLASTX cuando se parte de nucleótidos o BLASTP o TBLASTN cuando se parte de la proteína, con valores por defecto estándar. Se pueden filtrar los resultados blast. Las secuencias de longitud completa de los resultados filtrados o los resultados no filtrados se le realizaría de nuevo blasting (segundo blast) contra las secuencias del organismo del que se deriva la secuencia en cuestión, in casu Arabidopsis thaliana. Luego se comparan los resultados del primer y segundo blasts. Se encuentra un ortólogo cuando los resultados del segundo blast dan como aciertos con la similitud mayor con un ácido nucleico de consulta SnRK2 o polipéptido SnRK2. Si para una secuencia de consulta específica el mayor acierto es un parálogo de SnRK2 entonces tal secuencia de consulta también se considera un homólogo de SnRK2, dado que este homólogo comprende un dominio quinasa serina/treonina funcional, la secuencia distintiva conservada de la SEQ ID NO: 6 y una región de terminal C ácida como se definió anteriormente. En el caso de familias grandes, se puede utilizar ClustalW, seguido por la construcción de un árbol de unión vecino, para ayudar a visualizar la agrupación.
El término "homólogos" como se utiliza aquí también abarca parálogos y ortólogos de las proteínas útiles en los métodos de acuerdo con la invención. Los parálogos de Arabidopsis incluyen las proteínas como se da en los accesos GenBank NP_172563, NP_849834 (SEQ ID NO: 8), NP_201170 (SEQ ID NO: 10), NP_196476 (SEQ ID NO: 12), NP_567945 (SEQ ID NO: 14), NP_179885 (SEQ ID NO: 16), NP_201489 (SEQ ID NO: 18), NP_974170 (SEQ ID NO: 20), NP_190619 (SEQ ID NO: 22), NP_195711 (SEQ ID NO: 24). Los ortólogos y parálogos de arroz (que incluyen accesos GenBank BAD17997 (SEQ ID NO: 26), BAD17998 (SEQ ID NO: 28), BAD17999 (SEQ ID NO: 30), BAD18000 (SEQ ID NO: 32), BAD18001 (SEQ ID NO: 34), BAD18002 (SEQ ID NO: 36), BAD18003 (SEQ ID NO: 38), BAD18004 (SEQ ID NO: 40), BAD18005 (SEQ ID NO: 42), BAD18006 (SEQ ID NO: 44)), de B. napus (AAA33003 (SEQ ID NO: 46) y AAA33004 (SEQ ID NO: 48)), de soya (AAB68961 (SEQ ID NO: 50) y AAB68962 (SEQ ID NO: 52)) y de tabaco (AAL89456 (SEQ ID NO: 54)) se identifican utilizando un procedimiento BLAST recíproco. Preferiblemente los ortólogos y parálogos tienen la misma estructura y actividad como SnRK2 y tienen la similitud mayor a SnRK2 como se representa por SEQ ID NO: 2 en una búsqueda BLAST
recíproca.
Para determinar la actividad quinasa de SnRK2, están disponibles varios ensayos y son bien conocidos en la técnica (por ejemplo Current Protocols in Molecular Biology, Volúmenes 1 y 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols; u online tal como http://www.protocol-online.org). En resumen, el ensayo quinasa involucra generalmente (1) traer la proteína quinasa en contacto con un polipéptido sustrato con un polipéptido sustrato que contiene el sitio objetivo a ser fosforilado; (2) luego de la fosforilación del sitio objetivo en un amortiguador quinasa apropiado bajo condiciones apropiadas; (3) separar los productos fosforilados del sustrato no fosforilado después de un periodo de reacción adecuado. La presencia o ausencia de la actividad quinasa se determina mediante la presencia o ausencia de un objetivo fosforilado. Adicionalmente, se puede desarrollar mediciones cuantitativas.
La proteína SnRK2 purificada, o los extractos celulares que contiene o se enriquecen en la proteína SnRK2 se puede utilizar como fuente para la proteína quinasa. Como un sustrato, son particularmente bien adecuados péptidos pequeños. El péptido puede comprender uno o más residuos serina, treonina, o tirosina en un motivo de sitio de fosforilación. Una compilación de sitios de fosforilación se puede encontrar en Biochimica et Biophysica Acta 1314, 191-225, (1996). Adicionalmente, los sustratos de péptido pueden tener ventajosamente una carga positiva neta para facilitar la unión a filtros fosfocelulosa, (que permite separar los péptidos fosforilados de los no fosforilados y para detectar los péptidos fosforilados). Si no se conoce un motivo de sitio de fosforilación, se puede utilizar un sustrato de tirosina quinasa general. Por ejemplo, "péptido relacionado con Src" (RRLIEDAEYAARG) es un sustrato para muchas tirosina quinasa receptoras y no receptoras). Para determinar los parámetros cinéticos para la fosforilación del péptido sintético, se requiere un rango de concentraciones de péptido. Para las reacciones iniciales, se puede utilizar una concentración de péptido de 0.7-1.5 mM. Para cada enzima quienasa, es importante para determinar el amortiguador óptimo, la resistencia iónica, y pH para actividad. Un Amortiguador Quinasa estándar 5x contiene 5 mg/ml BSA (Albúmina de Suero Bovino que evita la adsorción quinasa al tubo de ensayo), 150 mM Tris-Cl (pH 7.5), 100 mM MgCl_{2}. Se requieren cationes divalentes para la mayoría de tirosinas quinasas, aunque algunas tirosinas quinasa (por ejemplo, insulina-, IGF-1-, y quinasas del receptor PDGF) requieren MnCl_{2} en lugar de MgCl_{2} (o en adición a MgCl_{2}). Las concentraciones óptimas de cationes divalentes se pueden determinar empíricamente para cada proteína quinasa. Un donante utilizado comúnmente del grupo foforilo es [gama-^{32}P]ATP radiomarcado (normalmente a 0.2 mM de concentración final). La cantidad de ^{32}P incorporada en los péptidos se puede determinar al medir la actividad en las almohadillas secas de nitrocelulosa en un contador de
centelleo.
Alternativamente, la actividad de una proteína SnRK2 u homólogo de la misma se puede evaluar al expresar la proteína SnRK2 u homólogo de la misma bajo el control de un promotor GOS2 en el cultivo de Oryza sativa Nipponbare, que resulta en plantas con biomasa sobre la superficie incrementada y/o rendimiento de semilla incrementado comparado con plantas de tipo natural correspondientes. Este incremento en el rendimiento visto se puede medir en varias formas, por ejemplo como un incremento de peso de grano por mil.
El ácido nucleico que codifica un polipéptido SnRK2 o un homólogo del mismo puede ser cualquier ácido nucleico sintético o natural. Un polipéptido SnRK2 o un homólogo del mismo como se definió aquí anteriormente se codifica por una molécula de ácido nucleico SnRK2. Por lo tanto el término "molécula de ácido nucleico SnRK2" o "gen SnRK2" como se define aquí es cualquier molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido SnRK2 o un homólogo del mismo como se definió aquí anteriormente. Ejemplos de moléculas de ácido nucleico SnRK2 incluyen aquellas representadas por la SEQ ID NO: 1, y aquellas que codifican los homólogos mencionados anteriormente. Los ácidos nucleicos SnRK2 de variante funcional incluyen porciones de una molécula de ácido nucleico SnRK2 y/o ácidos nucleicos capaces de hibridar con una molécula de ácido nucleico SnRK2. El término "funcional" en el contexto de una variante funcional se refiere a un ácido nucleico SnRK2 variante (es decir una porción o una secuencia de hibridación), que codifica un polipéptido que comprende un dominio quinasa funcional, la secuencia distintiva conservada de la SEQ ID NO: 6 y un dominio de terminal C ácido como se definió anterior-
mente.
Las quinasas tipo SnRK2 en plantas tienen una estructura modular, que consiste de un dominio quinasa y un dominio rico E y/o D ácido. Las variantes preferidas incluyen aquellas generadas por la eliminación del dominio, apilamiento o mezcla (ver por ejemplo He et al., Science 288, 2360-2363, 2000; o Patentes Estadounidenses 5,811,238 y 6,395,547).
El término porción como se define aquí se refiere a una pieza de ADN que comprende por lo menos 700 nucleótidos y cuya porción comprende un dominio quinasa funcional, la secuencia distintiva conservada de la SEQ ID NO: 6 y un dominio de Terminal C ácido se definió anteriormente. Se puede preparar una porción, por ejemplo, al hacer una o más eliminaciones en un ácido nucleico SnRK2. Se pueden utilizar las porciones en forma aislada o ellas se pueden fusionar a otras secuencias codificantes (o no codificantes) con el fin de, por ejemplo, producir una proteína que combina varias actividades, una de ellas es la actividad de proteína quinasa. Cuando se fusiona a otras secuencias codificantes, el polipéptido resultante producido luego de traducción puede ser más grande que lo predicho para el fragmento SnRK2. Las porciones útiles en los métodos de la presente invención comprende por lo menos un dominio quinasa funcional, la secuencia distintiva conservada de la SEQ ID NO: 6 y un dominio de terminal C ácido como se definió anteriormente. La porción funcional puede ser una porción de ácidos nucleicos como se representa por uno cualquiera de la SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 y 53. Preferiblemente, la porción funcional es una porción de ácido nucleico como se representa por SEQ ID
NO: 1.
El término "hibridación" como se define aquí es un proceso en donde las secuencias de nucleótido sustancialmente homólogas se hibridan una a la otra. El proceso de hibridación puede ocurrir completamente en la solución, es decir los ácidos nucleicos complementarios están en la solución. El proceso de hibridación también puede ocurrir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados a una matriz tal como glóbulos magnéticos, glóbulos de Sefarosa o cualquier otra resina. El proceso de hibridación puede ocurrir adicionalmente con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados en un soporte sólido tal como una nitrocelulosa o membrana de nylon o inmovilizados mediante por ejemplo fotolitografía en, por ejemplo, un soporte de vidrio silíceo (el último conocido cima disposiciones de ácido nucleico o microdisposiciones o como chips de ácido nucleico). Con el fin de permitir que ocurra hibridación, las moléculas de ácido nucleico generalmente se desnaturalizan térmicamente o químicamente para fundir estructuras bicatenarias en dos hebras únicas y/o para remover horquillas u otras estructuras secundarias de los ácidos nucleicos monocatenarios. La exigencia de hibridación se influencia mediante condiciones tales como temperatura, concentración de sal, resistencia iónica y composición de amortiguador de
hibridación.
"Condiciones de hibridación exigentes" y "condiciones de lavado de hibridación exigentes" en el contexto de experimentos de hibridación de ácido nucleico tales como hibridaciones Southern y Northern son dependientes de secuencia y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. El experto es consciente de varios parámetros que se pueden alterar durante hibridación y lavado y que mantendrá o cambiará las condiciones exigentes. El T_{m} es la temperatura bajo resistencia iónica definida y pH, en el que 50% de la secuencia objetivo hibrida a una sonda perfectamente ajustada. El T_{m} es dependiente de las condiciones de la solución y la composición base y longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas hibridan específicamente en temperaturas mayores. La velocidad máxima de hibridación se obtiene de aproximadamente 16ºC hasta 32ºC por debajo del T_{m}. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electrostática entre las dos hebras de ácido nucleico que promueve por lo tanto la formación híbrida; este efecto es visible para concentraciones de sodio de hasta 0.4M. La formamida reduce la temperatura de ebullición de dúplex de ADN-ADN y ADN-ARN con 0.6 a 0.7ºC para cada porcentaje de formamida, y la adición de 50% de formamida permite la hibridación a ser desarrollada de 30 a 45ºC, aunque la velocidad de hibridación será más baja. Los desfases de par base reducen la velocidad de hibridación y la estabilidad térmica de los duplex. En promedio y para sondas grandes, el T_{m} reduce aproximadamente 1ºC por % de base de desfase. El T_{m} se puede calcular utilizando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de
híbridos:
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\bullet híbridos de ADN-ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):
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2 
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\bullet híbridos de ADN-ARN o ARN-ARN:
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3 
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\bullet Híbridos oligo-ADN o oligo-ARN^{d}:
Para <20 nucleótidos
T_{m}=2 (/_{n})
Para 20-35 nucleótidos
T_{m}=22+1.46 (/_{n}).
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^{a} para otro catión monovalente, pero solo exacto en el rango de 0.01-0.4 M.
^{b} solo exacto para %GC en el rango de 30% a 75%.
^{c} L = longitud de dúplex en pares base.
^{d} Oligo, oligonucleótido; /_{n}, longitud efectiva de cebador = 2 (no. de G/C)+(no. de A/T).
Nota: para cada 1% formamida, el T_{m} se reduce mediante aproximadamente 0.6ao 0.7ºC, aunque la presencia de 6M urea reduce el T_{m} por aproximadamente 30ºC.
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La especificidad de hibridación es típicamente la función de lavados post-hibridación. Para remover el antecedente resultante de hibridación no específica, se lavan muestras con soluciones de sal diluidas. Los factores críticos de tales lavaos incluyen la resistencia iónica y temperatura de la solución de lavado final: la concentración de sal inferior y la temperatura de lavado mayor, la exigencia mayor del lavado. Las condiciones de lavado se desarrollan típicamente en o por debajo de la exigencia de hibridación. Generalmente, las condiciones de exigencia adecuadas para ensayos de hibridación de ácido nucleico o procedimientos de detección de amplificación de gen son como se estableció anteriormente. También se pueden seleccionar condiciones más o menos exigentes. Generalmente, se seleccionan condiciones de exigencia baja por ser aproximadamente 50ºC inferior que el punto de ebullición térmico (T_{m}) para la secuencia específica en una resistencia iónica definida y pH. Las condiciones de exigencia de medio son cuando la temperatura es 20ºC por debajo de T_{m}, y las condiciones de exigencia alta son cuando la temperatura es 10ºC por debajo de T_{m}. Por ejemplo, las condiciones exigentes son aquellas que son por lo menos tan exigentes como, por ejemplo, condiciones A-L; y las condiciones de exigencia reducidas son por lo menos tan exigentes como, por ejemplo, condiciones M-R. La unión no específica se puede controlar utilizando una cualquiera de un número de técnicas conocidas tal como, por ejemplo, bloquear la membrana con soluciones que contienen proteína, adiciones de ARN heterólogo, ADN, y SDS para el amortiguador de hibridación, y tratamiento con
ARNsa.
Ejemplos de hibridación y las condiciones de lavado se listan en la tabla 1:
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TABLA 1
4
5
Para los propósitos de definir el nivel de exigencia, se puede hacer de forma conveniente referencia a Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ra Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York o en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989).
Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica SEQ ID NO: 2 o un homólogo del mismo se puede utilizar en un experimento de hibridación. Alternativamente se pueden utilizar fragmentos del mismo como sondas. Dependiendo del grupo de partida de las secuencias de las que la proteína SnRK2 se identifica, se pueden seleccionar diferentes fragmentos para hibridación. Por ejemplo, cuando se desea un número de homólogos limitado con una identidad de secuencia alta a SnRK2, un fragmento menos conservado se puede utilizar para hibridación. Por alineación la SEQ ID NO: 2 y los homólogos del mismo, es posible diseñar fragmentos de ácido nucleico equivalentes útiles como sondas para hibridación.
Después de hibridación y lavado, los dúplex se pueden detectar mediante autoradiografía (cuando se utilizan sondas radiomarcadas) o mediante quimioluminescencia, inmunodetección, mediante detección fluorescente o cromogénica, que depende del tipo de marcado de sonda. Alternativamente, se puede desarrollar un ensayo de protección ribonucleasa para la detección de híbridos ARN: ARN.
La molécula de ácido nucleico SnRK2 o variante funcional de la misma se puede derivar de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico/gen o variante funcional del mismo se puede aislar de una fuente microbiana, tal como fuente de bacterias, levadura u hongos, o de una planta, alga o animal (que incluye humano). Este ácido nucleico se puede modificar de su forma nativa en composición y/o ambiente genómico a través de la manipulación humana suministrada. El ácido nucleico es preferiblemente de origen de plantas, si de la misma especie de planta (por ejemplo a uno en el que este se introduce) o si de una especie de planta diferente. El ácido nucleico se puede aislar de una especie de dicotiledónea, preferiblemente de la familia Brassicaceae, adicionalmente preferiblemente de Arabidopsis thaliana. Más preferiblemente, el SnRK2 aislado de Arabidopsis thaliana se representa por la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácido SnRK2 es como se representa por la SEQ ID NO: 2.
El polipéptido SnRK2 u homólogo del mismo se puede codificar por una variante dividida alternativa de una molécula de ácido nucleico SnRK2 o gen. El término "variante dividida alternativa" como se utiliza aquí abarca variantes de una secuencia de ácido nucleico en el que los intrones y/o exones seleccionados se han cortado, reemplazado o agregado. Tales variantes serán onas en las que la actividad biológica de la proteína como se destacó anteriormente se retiene, que se puede lograr mediante segmentos funcionales retenidos selectivamente de la proteína. Tales variantes divididas se pueden encontrar en la naturaleza o pueden ser hechos por el hombre. Los métodos para hacer tales variantes divididas son bien conocidos en la técnica. Las variantes divididas preferidas son todas variantes divididas del ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 3, tal como SEQ ID NO: 1. Se prefieren adicionalmente variantes divididas que codifican un polipéptido que tiene un dominio quinasa funcional flanqueado por la secuencia distintiva conservada de la SEQ ID NO: 6 y el dominio ácido de Terminal C definido anteriormente.
El homólogo también se puede codificar mediante una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SnRK2 o un homólogo del mismo, preferiblemente una variante alélica del ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 1. Adicionalmente preferiblemente, el polipéptido codificado por la variante alélica tiene un dominio quinasa funcional flanqueado por la secuencia distintiva conservada de la SEQ ID NO: 6 y el dominio ácido de terminal C definido anteriormente. Las variantes alélicas que existen en la naturaleza y que se abarcan dentro de los métodos de la presente invención es el uso de estos alelos naturales. Las variantes alélicas abarcan Polimorfismos de Nucleótido Únicos (SNP), así como también Polimorfismos de Inserción/Eliminación Pequeños (INDEL). El tamaño de los INDEL es usualmente menos de 100 bp. Los SNP y INDEL forman el conjunto más grande de variantes de secuencia en cepas polimórficas de ocurrencia natural de la mayoría de los organismos.
La actividad y/o expresión de un polipéptido SnRK2 o un homólogo del mismo se pueden incrementar al introducir una modificación genética (preferiblemente en el locus de un gen SnRK2). El locus de un gen como se define aquí se toma que significa una región genómica que incluye el gen de interés y 10 kb en la dirección 3' o 5' de la región codificante.
La modificación genética se puede introducir, por ejemplo, mediante uno cualquiera (o más) de los siguientes métodos: activación TADN, TILLING, mutagenia dirigida a sitio, recombinación homóloga, evolución directa o al introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido SnRK2 o un homólogo del mismo. Luego de la introducción de la modificación genética sigue una etapa de seleccionar la actividad incrementada y/o expresión de un polipéptido SnRK2, cuyo incremento en la actividad y/o expresión da plantas que tienen rendimiento incrementado.
El objetivo de activación T-ADN (Hayashi et al. Science 258, 1350-1353, 1992) involucra la inserción de T-ADN que contiene usualmente un promotor (también puede ser una mejorador de traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 KB en la dirección 3' o 5' de la región codificante de un gen en una configuración de tal manera que tal promotor dirige la expresión del gen objetivado. Típicamente, la regulación de la expresión del gen objetivo mediante su promotor natural se interrumpe y el gen cabe bajo el control del promotor nuevamente introducido. El promotor se embebe típicamente en un T-ADN. Este T-ADN se inserta aleatoriamente en el genoma de la planta, por ejemplo, a través de la infección de Agrobacterium y conduce a la sobreexpresión de genes cerca al T-ADN insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la sobreexpresión de genes cerca al promotor introducido. El promotor a ser introducido puede ser cualquier promotor capaz de dirigir la expresión de un gen en el organismo deseado, en este caso una planta. Por ejemplo, promotores constitutivos, preferidos de tejido, preferidos de tipo de célula e inducibles son bien adecuados para uso en la activación de T-ADN.
También se puede introducir una modificación genética en el locus de un gen SnRK2 utilizando la técnica de TILLING (Lesiones Locales Inducidas Objetivo IN Genomas). Esto es una tecnología de mutagenia útil para generar y/o identificar, y para aislar variantes mutagenizadas de una molécula de ácido nucleico SnRK2 capaz de exhibir la actividad de SnRK2. El TILLING también permite la selección de plantas que llevan tales variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden aún exhibir actividad mayor SnRK2 que aquel exhibido por el gen en su forma natural. El TILLING combina mutagenia de alta densidad con métodos de detección de alto rendimiento. Las etapas típicamente seguidas en TILLING son: (a) mutagenia EMS (Redei y Koncz (1992), In: C Koncz, N-H Chua, J Schell, eds, Methods in Arabidopsis Research. World Scientific, Singapore, pp 16-82; Feldmann et al., (1994) In: EM Meyerowitz, CR Somerville, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner y Caspar (1998), In: J Martinez- Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91- 104); (b) preparación de ADN y agrupamiento de individuos; (c) amplificación PCR de una región de interés; (d) desnaturalización e hibridación para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, donde la presencia de un heterodúplex en un grupo se detecta como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación del individuo mutante; y (g) secuenciamiento del producto PCR mutante. Los métodos para TILLING son bien conocidos en la técnica (McCallum Nature Biotechnol. 18, 455-457, 2000, Stemple Nature Rev. Genet. 5, 145-150, 2004).
Se puede utilizar mutagenia dirigida a sitio para generar variantes de ácidos nucleicos SnRK2 o porciones de las mismas que retienen la actividad, a saber, actividad proteína quinasa. Están disponibles varios métodos para lograr mutagenia dirigida a sitio, los métodos con base en PCR que son más comunes (Ver por ejemplo Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds. http://www._4ulr.com/products/currentprotocols/index.html).
Se puede utilizar evolución directa para generar variantes funcionales de moléculas de ácido nucleico SnRK2 que codifican los polipéptidos SnRK2 u homólogos, o porciones de los mismos que tienen una actividad biológica incrementada como se destacó anteriormente. La evolución directa consiste de iteraciones de mezcla de ADN seguido por detección y/o selección apropiada (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151-4; US patents 5,811,238 y 6,395,547).
La activación de TADN, TILLING, mutagenia dirigida a sitio y evolución directa son ejemplos de tecnologías que permiten la generación de alelos novedosos y variantes funcionales de SnRK2 que retienen la función SnRK2 como se destacó anteriormente y que son por lo tanto útiles en los métodos de la invención.
La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homóloga es una tecnología estándar utilizada rutinariamente en ciencias biológicas para el organismo inferior tal como levadura o el moss Physcomitrella. Los métodos para desarrollar recombinación homóloga en plantas se ha descrito no solo para plantas modelo (Offringa et al. (1990) EMBO J. 9, 3077-3084) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada et al., (2002) Nature Biotechnol. 20, 1030-1034; o lida y Terada (2004) Curr. Opin. Biotechnol. 15, 132-138). El ácido nucleico a ser objetivado (que puede ser una molécula de ácido nucleico SnRK2 o la variante funcional de la misma como se definió aquí anteriormente) no necesita ser objetivado en el locus de un gen SnRK2, pero se puede introducir en, por ejemplo, regiones de alta expresión. El ácido nucleico a ser objetivado puede ser un alelo mejorado utilizado para reemplazar el gen endógeno o se puede introducir en adición al gen endógeno.
De acuerdo con una realización preferida de la invención, se pueden mejorar las características de crecimiento de planta al introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido SnRK2 o un homólogo del mismo.
Un método preferido para introducir una modificación genética (que en este caso no necesita estar en el locus de un gen SnRK2) es introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido SnRK2 o un homólogo del mismo. Un polipéptido SnRK2 o un homólogo del mismo como se mencionó anteriormente es uno que tiene actividad quinasa y, en incremento con el fin de preferencia, que tiene por lo menos 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% identidad de secuencia completa para la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 2, y adicionalmente que comprende un dominio quinasa, la secuencia distintiva conservada como se representa por la SEQ ID NO: 6 y un dominio ácido de Terminal C como se definió anteriormente.
"Homólogos" de una proteína abarca péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones de aminoácido, eliminaciones y/o inserciones con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tiene actividad funcional y biológica similar como la proteína no modificada de la que ellos se derivan.
Un homólogo puede estar en la forma de una "variante sustitucional" de una proteína, es decir donde por lo menos un residuo en una secuencia de aminoácido se ha removido y un residuo diferente insertado en su lugar. Las sustituciones de aminoácido son típicamente de residuos únicos, pero se pueden agrupar dependiendo de limitaciones funcionales colocadas en el polipéptido; las inserciones serán usualmente del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácido. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácido comprenden sustituciones de aminoácido conservadoras (Tabla 2). Para producir tales homólogos, los aminoácidos de la proteína se pueden reemplazar por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tal como hidrofobicidad similar, hidrofilicidad, antigenicidad, propensidad para formar o romper estructuras \alpha-helicoidales o estructuras de lámina \beta). Las tablas de sustitución conservadora son bien conocidas en la técnica (ver por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman y Company).
TABLA 2 Ejemplos de sustituciones de aminoácido conservadoras
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Se pueden hacer sustituciones menos conservadas en el caso de propiedades de aminoácido mencionadas anteriormente que no son muy críticas.
Un homólogo también puede estar en la forma de una "variante de inserción" de una proteína, es decir donde uno o más residuos de aminoácido se introducen en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones de terminal amino y/o de terminal carboxi así como también inserciones intra-secuencia de un único o múltiples aminoácidos. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácido serán más pequeñas que las fusiones de terminal amino- o carboxi, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de proteínas o péptidos de fusión de terminal amino- o carboxi incluyen el dominio de unión o dominio de activación de un activador transcripcional como se utiliza en el sistema de dos híbridos de levadura, proteínas cubiertas de fago, (histidina)6-etiqueta, glutationa Stransferasa- etiqueta, proteína A, proteína de unión maltosa, reductasa dihidrofolato, epítopo de Etiqueta 100, epítopo c-myc, epítopo FLAG®, lacZ, CMP (péptido de unión a calmodulina), epítopo HA, epítopo de proteína C y epítopo VSV.
Los homólogos en la forma de "variantes de eliminación" de una proteína se caracterizan por la remoción de uno o más aminoácidos de una proteína.
Las variantes de aminoácido de una proteína se pueden hacer fácilmente utilizando técnicas sintéticas de péptido bien conocidas en el arte, tal como síntesis de fase sólida y similares, o mediante manipulaciones de ADN recombinante. Los métodos para la manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o eliminación de una proteína son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las técnicas para hacer mutaciones en sitios predeterminados en ADN son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen mutagenia M13, mutagenia in Vitro de T7-Gen (USB, Cleveland, OH), mutagenia Dirigida a Sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), protocolos de mutagenia dirigida a sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagenia dirigida a sitio.
El polipéptido SnRK2 u homólogo del mismo puede ser un derivado. Los "derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden comprender sustituciones, eliminaciones o adiciones de residuos de aminoácidos de ocurrencia natural y no natural comparados con la secuencia de aminoácidos de una forma de ocurrencia natural de la proteína, por ejemplo, como se presenta en la SEQ ID NO: 2. Los "Derivados" de una proteína abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden comprender residuos de aminoácidos alterados, glicosilados, acilados o de ocurrencia no natural comparados con la secuencia de aminoácidos de una forma de ocurrencia natural del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes sin aminoácidos comparados con la secuencia de aminoácidos de la que este se deriva, por ejemplo una molécula indicadora u otro ligando, unido covalentemente o no covalentemente a la secuencia de aminoácido, tal como una molécula indicadora que se une para facilitar su detección, y residuos de aminoácido de ocurrencia no natural relativos a la secuencia de aminoácido de un proteína de ocurrencia natural.
De acuerdo con un aspecto preferido de la presente invención, se prevé la expresión mejorada o incrementada de la molécula de ácido nucleico SnRK2. Los métodos para obtener expresión mejorada o incrementada de genes o productos de gen están bien documentados en la técnica e incluyen., por ejemplo, la sobreexpresión impulsada por los promotores apropiados, el uso de los mejoradores de transcripción o mejoradores de traducción. Los ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o mejoradores se pueden introducir en una posición apropiada (típicamente en la dirección 5') de una forma no heteróloga de un polinucleótido de tal manera que regula en dirección 5' la expresión de un ácido nucleico SnRK2 o variante funcional del mismo. Por ejemplo, se pueden alterar los promotores endógenos in vivo mediante mutación, eliminación, y/o sustitución (ver, Kmiec, Patente Estadounidense No. 5,565,350; Zarling et al., PCT/US93/03868), o se pueden introducir promotores aislados en una célula de planta en la orientación apropiada y 
\hbox{distancia
a partir de un gen de la presente invención  con el fin de controlar
la expresión del gen.}
Si se desea la expresión del polipéptido, es deseable generalmente incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de un polinucleótido que codifica una región. Se puede derivar la región de poliadenilación a partir de un gen natural, a partir de una variedad de otros genes de planta, o a partir del T-ADN. Se puede derivar la secuencia de extremo 3' a ser agregada a partir de, por ejemplo, los genes de sintasa nopalina o sintasa octopina, o alternativamente a partir de otros genes de planta, o preferiblemente menos a partir de cualquier otro gen eucariota.
También se puede agregar una secuencia de intrón a la región no traducida 5' o la secuencia de codificación de la secuencia de codificación parcial para incrementar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón deempalme en la unidad de transcripción en ambas construcciones de expresión de plantas y animales se ha mostrado por incrementar la expresión del gen en ambos niveles de mARN y de proteína hasta 1000 veces (Buchman and Berg, Mol. Cell Biol. 8, 4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1, 1183-1200 (1987)). Tal mejora de intrón de la expresión de es típicamente mayor cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de los intrones de maíz del intrón Adh1-S 1, 2, y 6, el intrón Bronze-1 se conocen en la técnica. Ver generalmente, The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).
Se proporcionan las construcciones y vectores para facilitar la introducción y/o expresión de las secuencias de nucleótido útiles en los métodos de acuerdo con la invención.
Por lo tanto, se proporciona una construcción de gen que comprende:
(i)
una molécula de ácido nucleico SnRK2 o variante funcional de la misma;
(ii)
una o más secuencias de control capaces de conducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i); y opcionalmente
(iii)
una secuencia de terminación de transcripción.
Las construcciones útiles en los métodos de acuerdo con la presente invención se pueden construir utilizando tecnología de ADN recombinante bien conocidas por las personas expertas en la técnica. Se pueden insertar las construcciones de gen en los vectores, que pueden estar comercialmente disponibles, adecuados para transformar plantas y adecuados para la expresión de los genes de interés en las células transformadas.
Se transforman las plantas con un vector que comprende la secuencia de interés (es decir, un ácido nucleico SnRK2 o variante funcional del mismo). La secuencia de interés se liga operablemente a una o más secuencias de control (por lo menos a un promotor). Los términos "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" se utilizan todos intercambiablemente aquí y se toman en un amplio contexto para referirse a las secuencias de ácido nucleico reguladoras capaces de efectuar la expresión de las secuencias a las que ellas están ligadas. Abarcados por los términos mencionados anteriormente están las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariótico clásico (que incluye la caja TATA que se requiere para la iniciación de transcripción exacta, con o sin una secuencia de caja CCAAT) y reguladores de elemento adicionales (es decir secuencias activantes en dirección 5', mejoradores y silenciadores) que alteran la expresión de gen en respuesta al desarrollo y/o estímulo externo, o en una forma específica de tejido. También incluidos dentro del término esta una secuencia reguladora transcripcional de un gen procariótico clásico, en cuyo caso este puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras transcripcionales de caja -10 box. El término "elemento regulador" también abarca una molécula de fusión sintética o derivado que confiere, activa o mejora la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. El término "ligado operablemente" como se utiliza aquí se refiere a un ligado funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, tal que la secuencia promotora es capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.
De forma ventajosa, se puede utilizar cualquier tipo de promotor para conducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor inducible, es decir que tiene iniciación de transcripción inducida o incrementada en respuesta a un desarrollo, estímulo químico, ambiental o físico. Un ejemplo de un promotor inducible es un promotor inducible por estrés, es decir un promotor activado cuando se expone una planta a varias condiciones de estrés, es el estrés hídrico inducido por el promotor WSI18. Adicionalmente o alternativamente, el promotor puede ser un promotor específico a tejido, es decir uno que es capaz de iniciar preferencialmente la transcripción en ciertos tejidos, tales como tejidos de hojas, raíces, semilla etc. Un ejemplo de un promotor específico a semillas es el promotor de oleosin de arroz 18 kDa (Wu et al. (1998) J Biochem 123(3): 386-91).
Preferiblemente, el ácido nucleico SnRK2 o variante funcional del mismo se liga operablemente a un promotor constitutivo. El término "constitutivo" como se define aquí se refiere a un promotor que se expresa predominantemente en por lo menos un tejido u órgano y predominantemente en cualquier etapa de vida de la planta. Preferiblemente se expresa el promotor predominantemente a través de la planta. Preferiblemente, el promotor constitutivo capaz de expresar preferencialmente el ácido nucleico a través de la planta tiene un perfil de expresión comparable con un promotor GOS2. Más preferiblemente, el promotor constitutivo tiene el mismo perfil de expresión como el promotor GOS2 del arroz, más preferiblemente, el promotor capaz de expresar preferencialmente el ácido nucleico a través de la planta es el promotor GOS2 a partir del arroz representado en la SEQ ID NO: 55. Debe ser claro que la aplicabilidad de la presente invención no se restringe al ácido nucleico SnRK2 representado por la SEQ ID NO: 1, ni es la aplicabilidad de la invención restringida a la expresión de un ácido nucleico SnRK2 cuando se conduce por un promotor GOS2. Ejemplos de otros promotores constitutivos que también se pueden utilizar para conducir la expresión de un ácido nucleico SnRK2 se muestran en la Tabla 3 adelante.
TABLA 3 Ejemplos de promotores constitutivos
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Opcionalmente, también se puede utilizar una o más secuencias terminadoras en la construcción introducida en una planta. El término "terminador" abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional que señala el procesamiento 3' y la poliadenilación de una transcripción principal y terminación de transcripción. Los reguladores de elemento adicionales pueden incluir mejoradores transcripcionales así como también mejoradores traduccionales. Aquellos expertos en la técnica serán conscientes de las secuencias terminadoras y mejoradoras que pueden ser adecuadas para el uso en el desarrollo de la invención. Tales secuencias pueden ser conocidas o se pueden obtener fácilmente por una persona experta en la técnica.
Las construcciones genéticas pueden incluir adicionalmente un origen de secuencia de replicación, que se requiere para el mantenimiento y/o replicación en un tipo de célula específica. Un ejemplo es cuando se requiere una construcción genética para ser mantenida en una célula bacteriana como un elemento genético episómico (por ejemplo molécula de plásmido o cósmido). Los orígenes preferidos de replicación incluyen, pero no se limitan a, el f1-ori y colE1.
La construcción genética puede comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como se utiliza aquí, el término "gen marcador seleccionable" incluye cualquier gen que confiere un fenotipo en una célula en la que esta se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células que se transfectan o transforman con una construcción de ácido nucleico de la invención. Se pueden seleccionar los marcadores adecuados a partir de los marcadores que confieren resistencia antibiótica o herbicida, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permite selección visual. Ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a los antibióticos (tales como nptII que fosforila la neomicina y kanamicina, o hpt, que fosforila la higromicina), a los herbicidas (por ejemplo barra que proporciona resistencia a Basta; aroA o gox que proporciona resistencia contra glifosato), o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tal como manA que permite a las plantas utilizar manosa como única fuente de carbono). Los genes marcadores visuales resultan en la formación de color (por ejemplo b-glucuronidasa, GUS), luminescencia (tal como luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP, y derivados de los mismos).
La invención también proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen rendimiento incrementado, que comprenden la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico SnRK2 o una variante funcional del mismo.
Más específicamente, la presente invención proporciona un método para la producción de plantas que tienen rendimiento transgénico incrementado, cuyo método comprende:
(i)
introducir en una planta o célula de planta un ácido nucleico SnRK2; y
(ii)
cultivar la célula de planta bajo condiciones que promueven el crecimiento y desarrollo de la planta.
Se puede introducir el ácido nucleico directamente en una célula de planta o en la planta en si misma (que incluye la introducción en un tejido, órgano o cualquier otra parte de una planta). De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico se introduce preferiblemente en una planta mediante transformación.
El término "transformación" como se denomina aquí abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula anfitriona, independiente del método utilizado para la transferencia. El tejido de la planta que es capaz de propagación clónica posterior, sea mediante organogenia o embriogenia, se puede transformar con una construcción genética de la presente invención y una planta entera regenerada de ella. El tejido particular escogido variará dependiendo de los sistemas de propagación clónica disponibles para, y mejor adecuados con, la especie particular que se transforma. Los objetivos de tejido de ejemplo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, yemas axilares y meristemas de raíz), y tejido de meristema inducido (por ejemplo, meristema de cotiledón y meristema de hipocótilo). El polinucleótido puede ser transitorio o introducido de manera estable en una célula anfitriona y no se puede mantener integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, se puede integrar en el genoma del anfitrión. La célula de planta transformada resultante puede entonces ser utilizada para regenerar una planta transformada en una forma conocida por las personas expertas en la técnica.
La transformación de especies de planta es actualmente una técnica de rutina. De forma ventajosa, se puede utilizar cualquiera de los varios métodos de transformación para introducir el gen de interés en una célula antecesora adecuada. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que incrementan la absorción de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación utilizando virus o polen y microproyección. Se pueden seleccionar los métodos del método calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens et al. (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8, 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en material de planta (Crossway et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202, 179-185); bombardeo de partícula recubierta con ADN o ARN (Klein et al. (1987) Nature 327, 70) infección con virus (no de integración) y similares. Se producen preferiblemente las plantas de arroz transgénicas que expresan un transgen SnRK2 por vía de transformación mediada por Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos para la transformación del arroz, tal como se describe en cualquiera de los siguientes: solicitud de patente Europea publicada EP 1198985 A1, Aldemita and Hodges (Plant 199, 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22, 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6, 271-282, 1994), cuyas descripciones se incorporan como referencia aquí como si se relacionaran completamente. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido en como se describe en Ishida et al. (Nature Biotechnol. 14, 745-50, 1996) o Frame et al. (Plant Physiol. 129, 13-22, 2002), cuyas descripciones se incorporan como referencia aquí como si se relacionaran completamente.
Generalmente después de la transformación, se seleccionan las células de planta o grupos de células por la presencia de uno o más marcadores que se codifican por genes que se expresan en plantas cotransferidos con el gen de interés, luego que se regenera el material transformado en una planta completa.
Luego de la transferencia y regeneración del ADN, se pueden evaluar las plantas transformadas puttivamente, por ejemplo utilizando análisis Southern, para la presencia del gen de interés, el número de copias y/o organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, se pueden monitorear los niveles de expresión del ADN introducido nuevamente utilizando análisis Northern y/o Western, ambas técnicas son bien conocidas por personas medianamente versadas en la técnica. El cultivo de células de planta transformadas en plantas maduras puede así abarcar las etapas de selección y/o regeneración y/o crecimiento para madurez.
Se pueden propagar las plantas transformadas generadas mediante una variedad de medios, tales como mediante propagación clónica o técnicas de reproducción clásicas. Por ejemplo, se puede autofecundar una planta transformada de primera generación (o T1) para dar los transformantes de segunda generación homocigotos (o T2), y se propagan adicionalmente las plantas T2 a través de técnicas de reproducción clásicas.
Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, ellos pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clónicos (por ejemplo, todas las células transformadas contienen el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma injertado en un injerto no transformado).
La presente invención también abarca el uso de ácido nucleico SnRK2s y el uso de polipéptidos SnRK2 de los mismos.
Uno de tales usos se relaciona con el rendimiento incrementado de plantas, tales como biomasa incrementada y/o rendimiento de semilla incrementado. El rendimiento de semilla puede incluir uno o más de los siguientes: número incrementado de semillas (cargadas), peso incrementado de semilla, índice de cosecha incrementado, peso del grano incrementado por mil, entre otros.
Los ácidos nucleicos SnRK2 o variantes de los mismos o polipéptidos SnRK2 u homólogos de los mismos pueden encontrar uso en los programas de reproducción en los que se identifica un marcador de ADN que se puede ligar genéticamente a un gen SnRK2 o variante del mismo. Se puede utilizar el SnRK2 o variantes del mismo o proteínas SnRK2 u homólogos de las mismas para definir un marcador molecular. Luego se puede utilizar este ADN o marcador de proteína en programas de reproducción para seleccionar plantas que tienen características de crecimiento mejoradas. El gen SnRK2 o variante del mismo puede, por ejemplo, ser un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 1, o un ácido nucleico que codifica cualquiera de los homólogos anteriormente mencionados.
Las variantes alélicas de un gen SnRK2 pueden también encontrar uso en los programas de reproducción asistidos por marcador. Tales programas de reproducción algunas veces requieren la introducción de variación alélica mediante tratamiento mutagénico de las plantas, utilizando por ejemplo mutagenia EMS; alternativamente, el programa puede iniciar con una colección de variantes alélicas denominadas de origen "natural" causadas no intencionalmente. Luego tiene lugar la identificación de variantes alélicas por, por ejemplo, PCR. Este es seguido por una etapa para selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y que da características de crecimiento mejoradas en una planta. Se lleva a cabo la selección típicamente al monitorear el desempeño del crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión, por ejemplo, variantes alélicas diferentes de la SEQ ID NO: 1, o de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los homólogos anteriormente mencionados. Se puede monitorear el desempeño del crecimiento en un invernadero o en el campo. Las etapas opcionales adicionales incluyen cruzar plantas, en las que se identifican la variante alélicas superior, con otra planta. Esto se puede utilizar, por ejemplo, para hacer una combinación de características fenotípicas de interés.
También se puede utilizar por lo tanto un ácido nucleico SnRK2 o variante del mismo como una sonda para mapear genética y físicamente los genes en los que ellos son una parte de, y como marcadores para rasgos ligados a aquellos genes. Tal información puede ser útil en la reproducción de plantas con el fin de desarrollar estirpes con fenotipos deseados. Tal uso de los ácidos nucleicos SnRK2 o variantes de los mismos requiere solo una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 10 nucleótidos en longitud. Se pueden utilizar los ácidos nucleicos SnRK2 o variantes de los mismos como marcadores de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP). Se pueden determinar los Southern blots de ADN genómico de plantas digeridas con restricción con los ácidos nucleicos SnRK2 o variantes de los mismos. Luego se pueden someter los patrones de bandas resultantes a análisis genéticos utilizando programas de computador tales como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1, 174-181) con el fin de construir un mapa genético. En adición, se puede utilizar el ácido nucleico para determinar los blots Southern que contienen los ADN genómicos tratados con restricción de endonucleasa de un conjunto de individuos que representan el progenitor y la progenie de un cruce genético definido. Se anota la segregación de los polimorfismos de ADN y se utiliza para calcular la posición del ácido nucleico SnRK2 o variante del mismo en el mapa genético previamente obtenido utilizando esta población (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32, 314-331).
La producción y uso de sondas derivadas de genes de planta para uso en mapeo genético se describe en Bematzky and Tanksley (Plant Mol. Biol. Reporter 4, 37-41, 1986). Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clones de cADN específicos utilizando la metodología bosquejada anteriormente o variaciones de la misma. Por ejemplo, las poblaciones de intercruce F2, poblaciones de retrocruzamiento, poblaciones acopladas aleatoriamente, líneas isogénicas cercanas, y se pueden utilizar otros conjuntos de individuos para mapear. Tales metodologías con bien conocidas por aquellos expertos en la técnica.
También se pueden utilizar las sondas de ácido nucleico para mapeo físico (es decir, localización de secuencias en mapas físicos; ver Hoheisel et al. In: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, y la referencias citadas allí).
En otra realización, se pueden utilizar las sondas de ácido nucleico en fluorescencia directa en mapeo de hibridación in situ (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7, 149-154). Aunque los métodos actuales de mapeo FISH favorecen el uso de clones grandes (kb varios a varios cientos; ver Laan et al. (1995) Genome Res. 5, 13-20), las mejoras en la sensibilidad pueden permitir el desarrollo de mapeo FISH utilizando sondas más cortas.
Se puede llevar a cabo una variedad de métodos basados en amplificación de ácido nucleico de mapeo genético y físico utilizando los ácidos nucleicos. Ejemplos incluyen las amplificación específica de alelo (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med. 11, 95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16, 325-332), ligamiento específico a alelo (Landegren et al. (1988) Science 241, 1077-1080), reacciones de extensión de nucleótido (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18, 3671), Mapeo Híbrido de Radiación (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7, 22-28) y Mapeo Happy (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17, 6795-6807). Para estos métodos, se utiliza la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir los pares de cebador para uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión de cebador. El diseño de tales cebadores es bien conocido por aquellos expertos en la técnica. En los métodos que emplean mapeo genético basado en PCR, puede ser necesario identificar las diferencias de secuencia de ADN entre los progenitores del cruce de mapeo en la región que corresponde a la secuencia de ácido nucleico instantánea. Esto, sin embargo, no es generalmente necesario para los métodos de mapeo.
En esta forma, se pueden desarrollar la generación, identificación y/o aislamiento de plantas mejoradas con actividad SnRK2 alterada y/o expresión, características de exhibición de crecimiento mejoradas.
Los ácidos nucleicos SnRK2 o variantes funcionales de los mismos o polipéptidos SnRK2 u homólogos de los mismos también pueden encontrar uso como reguladores de crecimiento. Debido a que estas moléculas se han mostrado por ser útiles en mejorar las características de crecimiento de las plantas, ellas también serían reguladores de crecimiento útiles, tales como herbicidas o estimuladores de crecimiento.
Descripción de las figuras
La presente invención ahora se describirá con referencia a las siguientes figuras en las que:
La Figura 1 da una visión gráfica de SnRK2. El pentagrama representa el dominio de quinasa mientras que la región de terminal C en gris claro representa la región acídica rica en Asp y/o Glu.
La Figura 2 muestra un vector binario para la transformación y expresión en Oryza sativa de un SnRK2 de Arabidopsis thaliana (la referencia interna CDS0758) bajo el control de un promotor de arroz GOS2 (referencia interna PRO0129).
La Figura 3 detalla los ejemplos de secuencias útiles en el desarrollo de los métodos de acuerdo con la presente invención. La SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 representan la secuencia de nucleótido y proteína de SnRK2 utilizada en los ejemplos. La SEQ ID NO: 3 representa la secuencia de ADN no empalmada de SnRK2. La SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 son secuencias de cebador utilizadas para aislar el ácido nucleico SnRK2. La SEQ ID NO: 6 representa una secuencia de consenso de una parte conservada en las proteínas SnRK2. La SEQ ID NO: 7 a 53 son secuencias de nucleótido y proteína de homólogos de la secuencia de codifica el SnRK2 y la secuencia de proteína como se da en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
Ejemplos
La presente invención ahora se describirá con referencia a los siguientes ejemplos, que son solo por vía de ilustración.
Manipulación de ADN: a menos que se indique de otra forma, se desarrollan técnicas de ADN recombinante de acuerdo con protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols (http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html). Los materiales estándar y métodos para trabajo molecular de planta se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Croy, published by BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications (UK).
Ejemplo 1
Clonación de Gen
Se amplifica el SnRK2 de Arabidopsis (código interno CDS0758) por PCR utilizando como plantilla una colección de cADN de plántula de Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, UK). Después de la transcripción inversa del ARN extraído de las plántulas, se clonan los cADN en pCMV Sport 6.0. El tamaño del inserto promedio del banco es 1.5 kb, y el número original de clones es 1.59x10^{7} cfu. Se determina el título original por ser 9.6x10^{5} cfu/ml, y después de una primera amplificación de 6x10^{11} cfu/ml. después de la extracción del plásmido, se utilizan 200 ng de la plantilla en un mezclador PCR de 50 \mul. Los cebadores Prm02295 (SEQ ID NO: 4, codificante) y Prm02296 (SEQ ID NO: 5, complementariedad inversa), que incluye los sitios AttB para recombinación Gateway, se utilizan para la amplificación PCR. Se desarrolla PCR utilizando polimerasa de ADN Hifi Taq en condiciones estándar. Se amplifica un fragmento PCR de 1130 bp (sin los sitios attB) y se purifica también utilizando métodos estándar. Luego se desarrolla la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual en fragmento PCR se recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway®, un "clon de entrada", p028. Se compra el plásmido pDONR201 de Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.
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Ejemplo 2
Construcción de Vector y Transformación de Arroz
Se utiliza posteriormente el clon de entrada p028 en una reacción LR con p03069, un vector de destino utilizado para transformación Oryza sativa. Este vector contenido como elementos funcionales dentro de los bordes T-ADN: un marcador seleccionable de planta; un casete de expresión de marcador visual; y un casete Gateway destinado para recombinación LR in vivo con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Se localiza un promotor de arroz GOS2 para expresión constitutiva con dirección 5' de este casete Gateway.
Después de la etapa de recombinación LR, se transforma el vector de expresión p033 resultante (Figura 2) en la cepa de Agrobacterium LBA4404 y posteriormente a plantas Oryza sativa. Se les permite a las plantas de arroz crecer y ser luego examinadas para los parámetros descritos en el Ejemplo 3.
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Ejemplo 3
Evaluación de Transformantes: Medidas de Crecimiento
Aproximadamente se generan 15 a 20 transformantes T0 independientes. Se transfieren los transformantes principales de las cámaras de cultivo de tejido a un invernadero para crecimiento y cosecha de semilla T1. Se retienen cinco eventos de los cuales la progenie T1 segregada 3:1 para presencia/ausencia del transgen. Para cada uno de estos eventos, se seleccionan 10 plántulas T1 que contienen el transgen (hetero- y homocigotos), y 10 plántulas T1 que carecen del transgen (nulicigotos), mediante detección de marcador visual. Se transfieren las plantas T1 seleccionadas a un invernadero. Cada planta recibe una única etiqueta de código de barras para vincular de forma inequívoca los datos fenotípicos a la planta correspondiente. Se hacen crecer las plantas T1 seleccionadas en el suelo en macetas de 10 cm de diámetro bajo los parámetros ambientales: fotoperiodo= 11.5 h, intensidad de luz del día = 30,000 lux o más, temperatura diurna = 28ºC o mayor, temperatura nocturna = 22ºC, humedad relativa= 60-70%. Se hacen crecer las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes de lado a lado en posiciones aleatorias. A partir de la etapa de siembra hasta la etapa de madurez se pasan las plantas varias veces a un gabinete de imagen digital. Se toman en cada punto de tiempo las imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde por lo menos 6 ángulos diferentes.
Se cosechan las panículas principales, se colocan en sacos, se etiquetan con código de barras y luego se secan durante tres días en el horno a 37ºC. Luego se trillan las panículas y se recolectan todas las semillas. Se separan las cáscaras cargadas de las vacías utilizando un dispositivo de inyección de aire. Después de separación, luego se cuentan los lotes de semillas utilizando una máquina de conteo disponible comercialmente. Se desechan las cáscaras vacías. Se pesan las cáscaras cargadas en una balanza analítica y se mide el área de la sección de cruce de las semillas utilizando la imagen digital. Este procedimiento resulta en el conjunto de parámetros relacionados con semillas descritos adelante.
Se derivan estos parámetros en una forma automatizada a partir de las imágenes digitales utilizando el software de análisis de imagen y se analizan estadísticamente. Se utiliza un ANOVA de dos factores (análisis de varianza) corregido para el diseño no balanceado como modelo estadístico para la completa de las características fenotípicas de la planta. Se lleva a cabo una prueba F en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con tal gen, también denominado aquí "efecto de gen global". Si el valor de la prueba F muestra que los datos son significativos, se concluye que existe un efecto de "gen", lo que significa que no solo la presencia o la posición del gen es la que origina el efecto. El umbral de importancia para un efecto de un gen global verdadero se establece en 5% del nivel de probabilidad para la prueba F.
Para verificar un efecto de los genes dentro de un evento, es decir, para un efecto específico de línea, se desarrolla una prueba t dentro de cada evento utilizando los conjuntos de datos de las plantas transgénicas y las plantas nulas correspondiente. Las "plantas nulas" o "segregantes nulos" o "nulicigotos" son las plantas tratadas en la misma forma como la planta transgénica, pero de las que se ha segregado el transgen. También se pueden describir las plantas nulas como las plantas transformadas negativas homocigotas. El umbral de importancia para la prueba t se establece en 10% de nivel de probabilidad. Los resultados para algunos eventos pueden estar por encima o por debajo de este umbral. Esto se basa en la hipótesis de que un solo gen podría tener un efecto en ciertas posiciones en el genoma, y que la ocurrencia de este efecto dependiente de posición no es raro. Esta clase de efecto de gen también se denomina aquí un "efecto de línea del gen". Se obtiene el valor p al comparar el valor t con la distribución t o alternativamente, al comparar el valor F con la distribución F. El valor p luego da la probabilidad de que sea correcta la hipótesis nula (es decir, que no exista efecto del transgen).
Se confirman los datos obtenidos en el primer experimento en un segundo experimento con plantas T2. Se seleccionan tres líneas que tienen el patrón de expresión corregido para análisis adicional. Las tandas de semillas de las plantas positivas (hetero- y homocigotas) en T1, se detectan al monitorear la expresión del marcador. Para cada evento escogido, las tandas de semilla heterocigota luego se retienen para evaluación T2. Dentro de cada tanda de semilla se hacen crecer un número igual de plantas positivas y negativas en el invernadero para evaluación.
Se evalúan un número total de 120 plantas transformadas SnRK2 en la generación T2, que es 40 plantas por evento de las cuales 20 son positivas para el transgen, y 20 negativas.
Debido a que se han llevado a cabo dos experimentos con eventos traslapantes, se desarrolla un análisis combinado. Esto es útil para comprobar la consistencia de los efectos en los dos experimentos, y si este es el caso, acumular evidencia de ambos experimentos, con el fin de incrementar la confianza en la conclusión. El método utilizado es un método de modelo mezclado que tiene en cuenta la estructura multinivel de los datos (es decir experimento - evento - segregantes). Se obtienen los valores P al comparar la prueba de relación de verosimilitud con las distribuciones de chi cuadrado.
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Ejemplo 4
Evaluación de Transformantes: Medidas de Parámetros Relacionados con el Rendimiento
Luego del análisis de las semillas como se describió anteriormente, los inventores encuentran que las plantas transformadas la construcción de gen SnRK2 tienen una mayor biomasa (expresada como Areamax total ) y un peso del grano incrementado por mil (TKW) comparado con las plantas que carecen el transgen SnRK2. Los resultados positivos obtenidos para las plantas en la generación T1 (Peso de Grano incrementado por mil y un incremento de biomasa de 9% (valor p 0.0309)) se obtienen de nuevo en la generación T2. En la Tabla 4, lo datos muestran los % de incrementos totales para la biomasa y el TKW, calculados a partir de los datos de las líneas individuales de la generación T2, y los valores p respectivos de la prueba F. Se reevalúan estos datos T2 n un análisis combinado con los resultados para la generación T1, y los valores p obtenidos muestra que los efectos observados son significativos.
TABLA 4
8
Biomasa sobre la Superficie
Se determina el área sobre la superficie de la planta al contar el número total de píxeles de las partes sobre la superficie de la planta discriminadas desde el fondo. Se promedia este valor para las fotos tomadas en el mismo punto de tiempo desde los diferentes ángulos y se convierte en un valor de superficie física expresado en milímetros cuadrados mediante calibración (Areamax Total). Los experimentos muestran que el área sobre la superficie de la planta medida de esta forma se correlaciona con la biomasa de las partes sobre la superficie de la planta. Existe un incremento significativo en la biomasa sobre la superficie en la generación T1, y esto se confirma en la generación T2 (con, valor ps de respectivamente 0,0309 en T1 y 0,0158 en T2). También el análisis combinado muestra que el incremento obtenido en la biomasa es altamente significativo (valor p de 0,0006).
Peso de Grano por Mil
Se extrapola el Peso de Grano por Mil (TKW) a partir del número de semillas cargadas contadas y su peso total. Existe una tendencia para incrementar el TKW en la generación T1, y en la generación T2, se muestra que el incremento es un efecto completo verdadero y es significativo. En particular, 2 de las cuatro líneas probadas muestran TKW significativamente incrementado.
<110> CropDesign N.V.
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<120> Plantas que tienen características de crecimiento mejoradas y método para hacer las mismas
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<130> CD-119-prio
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<150> EP 04103421.6
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2004-07-16
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/589, 765
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2004-07-21
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1092
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 363
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<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
10 
\hskip0,8cm
11 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3121
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip0,8cm
12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador delantero: prm02295
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggac aagtacgagc tggt 
\hfill
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso: prm02296
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gacgacttct ttcttacaca g 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia distintiva conservada
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa can be Phe o Tyr
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa can be Leu, Met o Thr
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa can be Asn, Gly o Arg
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa can be Leu, Pro o Ile
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa can be Pro o Leu
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa can be Ala, Gly, Val, Arg, Lys o Ile
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa can be Asp, Glu o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip0,8cm
13 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1086
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip0,8cm
14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip0,8cm
15 
\hskip0,8cm
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1083
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip0,8cm
17 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 360
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip0,8cm
18 
\hskip0,8cm
19 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1062
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
20 
\hskip0,8cm
200 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 353
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip0,8cm
21 
\hskip0,8cm
22 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1089
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip0,8cm
23 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 362
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip0,8cm
24 
\hskip0,8cm
25 
\hskip0,9cm
26 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1020
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 339
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
28 
\hskip0,8cm
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1086
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
30 
\hskip0,8cm
300 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
31 
\hskip0,8cm
32 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1032
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip0,8cm
33 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 343
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip0,8cm
34 
\hskip0,8cm
35 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1089
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip0,8cm
36 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 362
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip0,8cm
37 
\hskip0,8cm
38 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1053
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
39 
\hskip0,8cm
390 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 350
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
40 
\hskip0,8cm
41 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1029
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip0,8cm
42 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 342
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip0,8cm
43 
\hskip0,8cm
44 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1020
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 339
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
46 
\hskip0,8cm
47 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1005
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
48 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 334
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
49 
\hskip0,8cm
50 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1083
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip0,8cm
51 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 360
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip0,8cm
52 
\hskip0,8cm
53 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 370
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
55 
\hskip0,8cm
56 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1098
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
57 
\hskip0,8cm
570 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 365
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip0,8cm
58 
\hskip0,8cm
59 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1080
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip0,8cm
60 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 359
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
61 
\hskip0,8cm
62 
\hskip0,8cm
63 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip0,8cm
64 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 371
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip0,8cm
65 
\hskip0,8cm
66 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1086
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip0,8cm
67 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
68 
\hskip0,8cm
69 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1089
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
70 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 362
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
71 
\hskip0,8cm
72 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1080
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip0,8cm
73 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 359
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
74 
\hskip0,8cm
75 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1065
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip0,8cm
76 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 354
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Brassica napus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip0,8cm
77 
\hskip0,8cm
78 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1056
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
79 
\hskip0,8cm
790 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 351
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\hskip0,8cm
80 
\hskip0,8cm
81 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1050
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip0,8cm
82 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\hskip0,8cm
83 
\hskip0,8cm
84 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1071
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana tabacum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
85 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 356
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana tabacum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
86 
\hskip0,8cm
87 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2193
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
88

Claims (9)

1. Método para incrementar el rendimiento en crecimiento de plantas bajo condiciones sin tensión con relación a plantas de control, que comprende introducir y expresar en una planta una molécula de ácido nucleico SnRK2 aislada que codifica un polipéptido SnRK2 que comprende lo siguiente:
(i)
un dominio quinasa serina/treonina funcional;
(ii)
la secuencia distintiva conservada W(F/Y)(L/M/R/T)(K/R)(N/G/R) (UP/I)(P/L)(AIGN/R/K/1)(D/EN) (SEQ ID NO: 6); y
(iii)
un dominio de terminal C ácido que parte del último residuo de la SEQ ID NO: 6.
2. Método de la reivindicación 1, en donde dicha molécula de ácido nucleico SnRK2 se sobreexpresa en una planta.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha molécula de ácido nucleico SnRK2 es de origen de planta, preferiblemente de una planta dicotiledónea, adicionalmente preferiblemente de la familia Brassicaceae, más preferiblemente el ácido nucleico es de Arabidopsis thaliana.
4. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha molécula de ácido nucleico SnRK2 se liga operablemente a un promotor constitutivo.
5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho promotor constitutivo es un promotor GOS2.
6. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho rendimiento incrementado es biomasa incrementada y/o rendimiento de semilla incrementado.
7. Método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho rendimiento de semilla incrementado se selecciona de uno cualquiera o más de (i) biomasa de semilla incrementada; (ii) número incrementado de (cargadas) semillas; (iii) tamaño de semilla incrementado; (iv) volumen de semilla incrementado; (v) índice de cosecha incrementado (HI); y (vi) peso del grano incrementado por mil (TKW).
8. Uso de una molécula de ácido nucleico SnRK2 como se define en la reivindicación 1 o uso de un polipéptido SnRK2 como se define en la reivindicación 1 en incrementar el rendimiento en crecimiento de plantas bajo condiciones sin tensión, en particular en rendimiento mejorado, especialmente rendimiento de biomasa y/o semilla.
9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho rendimiento de semilla mejorado comprende por lo menos peso del grano incrementado por mil.
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