DE112009001560T5 - Planzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zur Herstellung derselben - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung verschiedener ertragsbezogener Eigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein TFL1_like (Terminal Flower Like 1)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein TFL1_like-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte TFL1_Like-codierende Nukleinsäuren und Konstrukte, welche diesselben umfassen, bereit, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Verbesserung verschiedener, den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die eine R5PI (D-Ribose-5-phosphat-Isomerase) codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein R5PI-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen verbesserte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind. Noch weiter, betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener, den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Zinkfinger(Zpf)-Domäne-haltiges A20/AN1-Polypeptid codiert in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch eine Nukleinsäuresequenz, Polypeptidsequenz und Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung verschiedener ertragsbezogener Eigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein TFL1_like(Terminal Flower Like 1)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein TFL1_like-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte TFL1_Like-codierende Nukleinsäuren und Konstrukte, welche diesselben umfassen, bereit, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind.
• Ferner betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Verbesserung verschiedener, den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die eine R5PI (D-Ribose-5-phosphat-Isomerase) codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein R5PI-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen verbesserte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
• Noch weiter, betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener, den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Zinkfinger(Znf)-Domäne-haltiges A20/AN1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch eine Nukleinsäuresequenz, Polypeptidsequenz und Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
• Ferner betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener, den Pflanzensamenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Pflanzen-Homeodomäne-Zinkfinger(PHD-zf)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte Samenertrag-bezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung betrifft außerdem Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Pflanzen, welche die Nukleinsäuresequenzen enthalten.
• Ferner betrifft die vorliegende Erfindung allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein REF/ALY (RNA und Export-Faktor-bindendes Protein; auch bekannt als ALY) codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein REF/ALY-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen verbesserte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
• Die stetig anwachsende Weltbevölkerung und die schwindende Reserve an anbaufähigem Land, das für die Landwirtschaft zur Verfügung steht, treibt die Forschung hin zur Erhöhung der Effizienz der Landwirtschaft. Herkömmliche Methoden für Verbesserungen bei Nutzpflanzen und Gartenpflanzen wenden selektive Züchtungstechniken zum Identifizieren von Pflanzen mit wünschenwerten Merkmalen an. Allerdings weisen derartige selektive Züchtungstechniken mehrere Nachteile dahingehend auf, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, welche häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, welche nicht immer dazu führen können, dass die erwünschte Eigenschaft von Elternpflanzen weitergegeben wird. Die Fortschritte in der Molekularbiologie haben es der Menschheit erlaubt, das Keimplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die gentechnische Manipulation von Pflanzen beinhaltet die Isolierung und Manipulierung von genetischem Material (typischerweise in der Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einbringung dieses genetischen Materials in eine Pflanze. Diese Technologie weist das Vermögen auf, Nutzpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, landwirtschaftlichen oder gärtnerischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.
• Eine Eigenschaft von besonderem wirtschaftlichen Interesse ist ein erhöhter Ertrag. Der Ertrag ist normalerweise als der messbare Gewinn von ökonomischem Wert aus einer Nutzpflanze definiert. Dies kann in Bezug auf die Quantitiät und/oder Qualität definiert sein. Der Ertrag ist direkt von mehreren Faktoren, wie zum Beispiel der Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel der Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blatt-Seneszenz und sonstigem, abhängig. Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Frühwuchskraft können ebenfalls bedeutende Faktoren bei der Bestimmung des Ertrags sein. Das Optimieren der oben erwähnten Faktoren kann daher zu einer Erhöhung des Nutzpflanzenertrags beitragen.
• Der Samenertrag ist ein besonders wichtiges Merkmal, da die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Nutzpflanzen, wie Mais, Reis, Weizen, Canola und Sojabohne machen über die Hälfte der gesamten menschlichen Kalorienaufnahme aus, ob durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch Verzehr von Fleischprodukten, welche auf Grundlage verarbeiteter Samen erzeugt wurden. Sie stellen ebenfalls eine Quelle für Zucker, Öle und viele Arten von Metaboliten dar, die in industriellen Verfahren verwendet werden. Samen enthalten einen Embryo (die Quelle von neuen Sprossen und Wurzeln) sowie ein Endosperm (die Quelle von Nährstoffen für das Embryowachstum während der Keimung und während des frühen Wachstums von Sämlingen). Die Entwicklung eines Samens beteiligt zahlreiche Gene und erfordert den Transfer von Metaboliten aus den Wurzeln, Blättern und Stengeln in den wachsenden Samen. Das Endosperm assimiliert im Besonderen die Stoffwechselvorläufer von Kohlehydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert sie zu Speichermakromolekülen, um das Korn auszufüllen.
• Die Pflanzenbiomasse ist der Ertrag für Futterpflanzen, wie Alfalfa, Silomais und Heu. Bei Getreidepflanzen hat man zahlreiche Stellvertreter für den Ertrag verwendet. Am bedeutendsten unter diesen sind Schätzungen der Pflanzengröße. Die Pflanzengröße kann auf vielen Wegen gemessen werden, abhängig von der Spezies und der Entwicklungsstufe, beinhaltet jedoch das Gesamtpflanzen-Trockengewicht, das oberirdische Trockengewicht, das oberirdische Frischgewicht, die Blattfläche, das Stengelvolumen, die Pflanzenhöhe, den Rosettendurchmesser, die Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, die Triebzahl und die Blattzahl. Viele Spezies halten ein konservatives Verhältnis zwischen der Größe der verschiedenen Teile der Pflanze bei einer gegebenen Entwicklungsstufe ein. Diese allometrischen Beziehungen werden verwendet, um aus einem dieser Größenmaße auf ein anderes zu schließen (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Die Pflanzengröße bei einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße später in der Entwicklung korrelieren. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann in der Regel mehr Licht und Kohlendioxid absorbieren als eine kleinere Pflanze, und wird deshalb wahrscheinlich während derselben Zeitdauer ein größeres Gewicht gewinnen (Fasoula & Tollenaar, 2005, Maydica 50: 39). Dies kommt zusätzlich zu der potentiellen Fortdauer des mikroumgebungsbezogenen oder genetischen Vorteils hinzu, den die Pflanze hatte, um anfänglich die höhere Größe zu erreichen. Es existiert eine starke genetische Komponente hinsichtlich Pflanzengröße und Wachstumsrate (z. B. ter Steege et al., 2005, Plant Physiology 139: 1078), und daher besteht, für eine Auswahl an diversen Genotypen, wahrscheinlich eine Korrelation der Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung mit der Größe unter einer anderen (Hittalmani et al., 2003, Theoretical Applied Genetics 107: 679). Auf diese Weise wird eine Standardumgebung als Stellvertreter für die vielfältigen und dynamischen Umgebungen benutzt, welche von Nutzpflanzen auf dem Feld an unterschiedlichen Örtlichkeiten und Zeitpunkten angetroffen werden.
• Eine andere bedeutende Eigenschaft für viele Nutzpflanzen ist die Frühwuchskraft. Die Verbesserung der Frühwuchskraft ist ein wichtiges Ziel bei modernen Reis-Züchtungsprogrammen sowohl bei gemäßigten als auch tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind wichtig für eine korrekte Bodenverankerung bei in Wasser ausgesätem Reis. Falls Reis direkt in überflutete Ackerfelder ausgesät wird, und falls die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen müssen, stehen längere Sprosse bzw. Triebe mit der Wuchskraft in Zusammenhang. Wo eine Aussaat mit Drillvorrichtung praktiziert wird, sind längere Mesokotyle und Koleoptile für eine günstige Setzlingsemergenz bedeutsam. Die Fähigkeit, Frühwuchskraft künstlich in Pflanzen einzubringen, wäre für die Landwirtschaft von großer Bedeutung. Zum Beispiel war eine geringe Frühwuchskraft eine Einschränkung bei der Einführung von Mais(Zea mays L.)-Hybriden auf Basis von ”Corn Belt”-Keimplasma im europäischen Atlantikraum.
• Der Ernteindex, das Verhältnis von Samenertrag zu oberirdischem Trockengewicht, ist unter vielen Umweltbedingungen verhältnismäßig stabil, und somit kann häufig eine beständige Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag erhalten werden (z. B. Rebetzke et al., 2002, Crop Science 42: 739). Diese Prozesse sind intrinsisch verknüpft, weil die Mehrheit der Kornbiomasse von der aktuellen oder gespeicherten photosynthetischen Produktivität seitens der Blätter und des Stengels der Pflanze abhängig ist (Gardener et al., 1985, Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, S. 68-73). Deshalb ist das Selektieren hinsichtlich der Pflanzengröße sogar bei frühen Entwicklungsstadien, als ein Indikator für den zukünftigen potentiellen Ertrag verwendet worden (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Beim Testen hinsichtlich der Auswirkung von genetischen Unterschieden auf die Stresstoleranz ist die Fähigkeit zur Standardisierung von Bodeneigenschaften, Temperatur, Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit sowie Lichtintensität ein spezifischer Vorteil von Gewächshaus- oder Pflanzenwachstumskammer-Umgebungen im Vergleich zu Feldbedingungen. Allerdings können künstliche Einschränkungen auf den Ertrag wegen geringer Bestäubung aufgrund des Fehlens von Wind oder Insekten oder wegen ungenügendem Raum für die reife Wurzel oder das Laubkronenwachstum (canopy growth) die Anwendung dieser regulierten Umgebungen für das Testen von Ertragsunterschieden begrenzen. Deshalb sind Messungen der Pflanzengröße in der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus Standardpraktiken, um Hinweise auf potentielle genetische Ertragsvorteile bereitzustellen.
• Ein weiteres wichtiges Merkmal ist jenes der verbesserten Toleranz gegenüber abiotischem Stress. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweiten Ernteverlust, wobei die Durchschnittserträge für die meisten wichtigen Nutzpflanzen um mehr als 50% reduziert werden (Wang et al. (2003) Planta 218: 1-14). Abiotische Stressformen können durch Dürre, Salzgehalt, Temperatur-Extreme, chemische Toxizität, und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit zur Verbesserung der Pflanzentoleranz gegenüber abiotischem Stress wäre weltweit für Landwirte von großem wirtschaftlichen Vorteil und würde den Anbau von Nutzpflanzen während ungünstigen Bedingungen sowie in Territorien, auf welchen eine Kultivierung von Nutzpflanzen ansonsten nicht möglich sein kann, gestatten.
• Der Nutzpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben erwähnten Faktoren erhöht werden.
• Abhängig von der Endanwendung kann die Modifikation bestimmter Ertragseigenschaften gegenüber anderen bevorzugt sein. Beispielsweise kann für Anwendungen, wie Futtermittel- oder Holzproduktion, oder Biotreibstoff-Ressourcen, ein Zuwachs bei den vegetativen Teilen einer Pflanze wünschenswert sein, und für Anwendungen, wie Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann ein Zuwachs hinsichtlich der Samenparameter besonders erwünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können, abhängig vom Verwendungszweck, manche gegenüber anderen bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Erhöhung des Samenertrags beitragen, ungeachtet dessen, ob diese in Form einer erhöhten Samengröße oder einer erhöhten Samenzahl vorliegt.
• Eine Vorgehensweise zur Erhöhung des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann durch Modifikation der inhärenten Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie etwa dem Zellzyklus oder verschiedenen Signalleitungswegen, die am Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind.
• Es ist jetzt festgestellt worden, dass ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen verbessert werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like in einer Pflanze codiert, in einer Pflanze moduliert.
• Ferner ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen verbessert werden können, indem man die Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, welche eine R5PI (D-Ribose-5-phosphat-Isomerase) in einer Pflanze codiert, moduliert.
• Noch weiter, ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Zinkfinger(Znf)-Domäne-haltiges A20/AN1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze erhöht. Die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhter Frühwuchskraft, erhöhter oberirdischer Biomasse, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Samenfüllrate und erhöhtem Ernteindex.
• Noch darüber hinaus ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene samenertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Pflanzen-Homeodomäne-Zinkfinger(PHD-zf)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze erhöht. Die erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: vergrößerte Pflanzenhöhe, erhöhte Samenfüllrate, erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispen, und erhöhtes Tausendkerngeweicht (TKW).
• Außerdem ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene Wachstumscharakteristika in Pflanzen durch Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein REF/ALY (RNA und Export-Faktor-bindendes Protein; auch bekannt als ALY) in einer Pflanze codiert, verbessert werden können.
• Hintergrund
• 1. TFL1-like-Polypeptide
• Die erfolgreiche Reproduktion bei blütentragenden Pflanzen beinhaltet den Übergang vom vegetativen in das reproduktive Stadium (Baurle und Dean, 2006, Cell, 125, 655-664.). Das Umschalten zum Erblühen beinhaltet die Integration von entwicklungs- als auch umweltmäßigen Signalen, welche zur Erzeugung von Blütenmeristemen führt. Blütenmeristeme entstehen aus dem Sprossmeristem, das die Stammzellen beherbergt, welche Schlüssel-Wachstumspunkte in Pflanzen vorsehen. Die Erzeugung einer Blüte aus einem Blütenmeristem hängt von der Einhaltung eines passenden Gleichgewichts zwischen meristematischer Aktivität und Organogenese ab. Während der Blütenentwicklung wird dieses Gleichgewicht hin zur Organogenese verschoben, was das Blütenmeristem dazu bringt, sich nach Hervorbringung einer genetisch festgelegten Anzahl an Blüten zu terminieren. Der erfolgreiche Abschluss der Reproduktion, der zur Frucht- und/oder Samenproduktion führt, erfordert ferner die koordinierte Entwicklung von männlichen und weiblichen Organen, um eine Bestäubung und Samenbildung zu erzielen. Mehrere Dutzend Gene beeinflußen den Übergang von der vegetativen in die Blüte-Phase und die erfolgreiche Reproduktion bei Pflanzen, aber nur von wenigen wurde nachgewiesen, eine ausschlaggebende Rolle in diesen Prozessen zu spielen. Vertreter der PEBP (Phosphatidylethanolamin-bindendes Protein)-Genfamilie wirken auf die Steuerung der Blühzeit und die Festlegung der Bestimmung von Blütenstandmeristem und Pflanzenarchitektur ein.
• Die PEBP-Genfamilie ist eine hoch konservierte Gruppe von Proteinen, die in zahlreichen Geweben in einer großen Vielzahl von Organismen identifiziert worden sind, einschließlich Bakterien, Hefe, Nematoden, Pflanzen, Drosophila und Säugern. In Pflanzen besteht die PEBP-Genfamilie aus drei Haupt-Homologieklassen (den sogenannten TFL1-LIKE-, MFT-LIKE- und FT-LIKE-Subfamilien (Chardon und Damerval, J. Mol. Evol. 2005, 61(5): 579-90). Trotz der hohen Konservierung in der Aminosäuresequenz unter den Proteinen, die von der PEBP-Genefamilie codiert sind, wirken Vertreter der TFL1-like- und FT-like-Subfamilien in einer entgegengesetzten Weise. TFL ist ein Repressor des Blühens, wohingegen FT ein Aktivator ist (Kardailsky et al. (1999) Science 286, 1962-1965; Kobayashi, et al. (1999) Science 286, 1960-1962). Ungeachtet des oben Gesagten, führten Funktions-Zugewinn-Studien den funktionellen Unterschied zwischen TFL1 und FT eher auf die Proteinsequenz als auf das Expressionsmuster zurück (Kardailsky, et al., 1999; Kobayashi et al., 1999; Ratcliffe, et al. (1998) Development 125, 1609-1615). Strukturuntersuchungen identifizierten konservierte Schlüsselreste, welche funktionelle FT- und TFL-Homologe eindeutig unterscheiden (Ahn et al. 2006. EMBO, 25, 605-614). TFL1-like-Gene (ebenfalls bezeichnet als TFL-Gene) sind aus mehreren Pflanzenspezies identifiziert und kloniert worden, einschließlich des homologen CENTRORADIALIS(CEN)-Gens von Antirrhinum-Gen und mehreren Homologan aus Mais (Danilevskaya et al 2008 Plant Physiol. 2008; 146(1): 250-64.). In Arabidosis thaliana besteht die TFL1-like-Familie aus drei Genen TFL1, ATC (Arabidosis thaliana-Centroradialis-Homolog) und BFT (”Bruder von FT”). Spezifische Expressionsmuster für die TFL1-like-Isoformen in Arabidopsis thaliana sind beschrieben worden. Allerdings wurde die funktionale Redundanz zwischen TFL1 und ATC durch die ähnlichen Effekte enthüllt, welche bei Überexpression in transgenen Pflanzen verursacht werden (Mimida et al. 2001 Genes Cells. 2001 6(4): 327-36). TFL1-like-homologe Gene, die vor kurzem im Genom von Weinrebe identifiziert wurden, lassen sich in in drei Subkladen sammeln, die mit BFT, TFL1 und ATC von Arabidopsis verwandt sind (Carmona et al. 2007, Plant Mol. Biol. (2007) 63: 637-650). Alle bei Weinrebe vorhandenen TFL1-like-Isoformen tragen konservierte, geladene Reste His88 und Asp144 in ähnlichen Positionen zu TFL1 sowie die charakteristische Aminosäure-Triade ENE, END und DNG für VvTFL1A, VvTFL1B bzw. VvTFL1C. Die phylogenetische Analyse, die von Igasaki et al. 2008 (Plant Cell Physiol. 49(3): 291-300) zum Klassifizieren von Vertretern der FT/TFL1-Familie angewandt wurde, enthüllte, dass die Proteine in der BFT-Klade und TFL1-Klade näher miteinander verwandt sind als beliebige der MFT(”Mutter von FT”)- oder FT-Kladen bzw. -Aste.
• Die konstitutive Überexpression von Reis-TFL1/CEN-Homologen in Reispflanzen unter der Steuerung eines Virus-abgeleiteten Promotors verlängerte die vegetative Wachstumsphase der Pflanzen. Darüber hinaus führten die veränderte Rispenmorphologie und die Verzögerung der Rispenentwicklung zur Produktion von unreifen Blüten, was die Bestäubung und Samenbildung behinderte (Nakawaga 2002, The Plant Journal, (2002), 29, 743-750). Einige andere Mittel und Methoden zur Änderung der Blühzeit, Erhöhung des vegetativen Wachstums und/oder eine veränderte Verzweigung durch Manipulation der TFL1-Spiegel in einer Pflanze sind beschrieben worden (Patentanmeldung US2006/0070141, Patente US 6573430 und US 6025543 ). Allerdings führten solche Experimente nicht zur Steigerung von Samenbezogenen Eigenschaften. Für die Anwendung einer derartigen Technologie bei landwirtschaftlich wichtigen Samennutzpflanzen, wie Weizen, Gerste, Reis, Futtergrässern, und anderen monokotyledonen Pflanzen, besteht einerseits eine Notwendigkeit, eine mögliche negative Auswirkung auf die Samenproduktion, die zum Beispiel durch eine Verzögerung in der Blütenstand-Reifung und anderer reproduktiven Organe verursacht wird, welche die Samenbildung vereitelt, zu verhindern, und andererseits wäre es wünschenswert, Samenbezogene Eigenschaften, wie die Anzahl an Samen, die Samenfüllung und das Gewicht an geernteten Samen, zu verbessern.
• Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, welche ein TFL1-like-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Pflanzensamenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• 2. Ribose-5-phosphat-Isomerase (R5PI)
• Ribose-5-phosphat-Isomerase (R5PI) ist ein Enzym, das die reversible Umwandlung von Ribose-5-phosphat in Ribulose-5-phosphat katalysiert.
• Ribose-5-phosphat-Isomerase ist bei allen lebenden Zellen ubiquitar. In Pflanzen ist Ribose-5-phosphat ein Produkt des oxidativen Pentosephosphat-Wegs, lokalisiert sowohl im Cytosol als auch in Plastiden, während Ribulose-5-phosphat ein essentieller Teil des Calvin-Zyklus in Chloroplasten ist. In Übereinstimmung damit werden Isoformen von Ribose-5-phosphat-Isomerase sowohl im Cytosol als auch im Chloroplasten von Pflanzenzellen gefunden. Es wurde gezeigt, dass das Enzym im Chloroplast in einem Fünf-Enzym-Proteinkomplex arbeitet.
• Viele Verbindungen sind letztendlich von R5P abgeleitet, wie 3PGA, 3-Phosphoglycerat; Xyl-5P, Xylulose-5-phosphat und Ru1,5 bis P, Ribulose-1,5-bis-phosphat. Dashalb spielt das R5PI-Enzym eine zentrale Rolle im Pflanzenzellmetabolismus, mit Effekten auf die Synthese von Nukleinsäuren, Coenzymen, wie NADH, NADPH, FAD, Vitamin B12, und anderen aromatischen Verbindungen.
• Es wurde berichtet, dass eine Mutation in Ribose-5-phosphat-Isomerase die Cellulosesynthese in Arabidopsis thaliana verringert (Howles et al; 2006).
• Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, welche ein R5PI-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein R5PI-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• 3. Zinkfinger (Znf) Domäne-haltiges A20/AN1-Polypeptid
• Protein-Protein- und Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen sind essentielle Funktionen vieler Proteine. Proteine haben unterschiedliche Wege entwickelt, um andere Moleküle zu binden. Zink-bindende Repeats, bekannt als Zinkfinger-Domäne (ZnF), sind ein solches molekulares Grundgerüst. Von Proteinen, die Zinkfinger-Domäne(n) enthalten, wurde festgestellt, bedeutende Rollen in eukaryotischen Zellen zu spielen, wobei sie verschiedene Wege der Signaltransduktion regulieren und Prozesse, wie Entwicklung und programmierten Zelltod, steuern. Die Zinkfinger-Domäne gestattet verschiedenen Proteinen, mit DNA, RNA oder anderen Proteinen wechselzuwirken oder zu binden, und ist in den Proteomen vieler verschiedener Organismen vorhanden. Es gibt viele Typen von Zinkfinger-Domäne-haltigen Proteinen, die gemäß der Anzahl und Reihenfolge der Cystein(Cys)- und Histidin(His)-Reste welche die Zinkatome) binden, klassifiziert werden.
• Eine Klasse von Zinkfinger-Domäne-haltigen Proteinen ist die A20/AN1-Unterfamilie, die durch die Gegenwart von mindestens zwei Zinkfinger-Domänen gekennzeichnet ist: einer A20-Zinkfinger-Domäne (üblicherweise C-terminal) und einer AN1-Zinkfinger-Domäne (üblicherweise N-terminal). Die A20-Zinkfinger-Domäne wurde zuerst wegen ihrer Rolle in der Regulierung der Immunantwort in Säugersystemen identifiziert (Opipari et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 14705-14708). Sie ist durch die Gegenwart mehrerer Cys2/Cys2-Fingermotive gekennzeichnet, bindet ein einzelnes Zinkatom und ist an der Ubiquitin-Signalgebung durch Aufzeigen von Ubiquitin-Ligase-Aktivität beteiligt (Hishiya et al. (2006) EMBO J. 25: 554-564). Die AN1-Zinkfinger-Domäne wurde zuerst als ein Zinkfinger am C-Terminus von AN1 identifiziert, einem Ubiquitin-ähnlichen Protein in Xenopus laevis (Linnen et al. (1993) Gene 128: 181-188). Sie ist durch die Gegenwart von sechs konservierten Cys und zwei His gekennzeichnet, welche potentiell 2 Zinkatome koordinieren könnten.
• In Pflanzen sind Gene, die ZnF A20/AN1-Proteine codieren, Teil einer Multigen-Familie mit mindestens 14 Vertreten in Arabidopsis thaliana, mindestens 18 Vertreten in Reis, mindestens 19 in Pappel, und mindestens 10 in Physcomitrella patens (Shubha & Tyagi (2008) Funct. Integr. Genomics). Die Analyse der Domänenorganisation dieser Polypeptide enthüllt eine weite Vielfalt hinsichtlich der Domänenorganisation, wobei bis zu siebzehn verschiedene Klassen identifiziert wurden. Eine dieser Klassen ist die Klasse von Polypeptiden, die mindestens jeweils eines von: einer A20-Zinkfinger-Domäne und einer AN1-Zinkfinger-Domäne (Shubha & Tyagi (2008) siehe oben) umfassen.
• Transgene Reis- und Tabakpflanzen, die mit einem Reis-Znf A20/AN1-Polypeptid (OsSAP8) unter der Steuerung eines konstitutiven Ubiquitinpromotors transformiert waren, zeigten eine erhöhte Toleranz gegen Salz-, Dürre- und Kältestress im Samenkeimungs/Sämling-Stadium. Transgene Reispflanzen waren tolerant gegenüber Salz und Dürre während des Anthese-Stadiums ohne Ertragseinbuße im Vergleich zu ungestressten transgenen Pflanzen (Kanneganti & Gupta (2008) Plant Mol. Biol. 66: 445-462).
• In der EP-Patentanmeldung EP1033405 wird ein Arabidopsis thaliana-Znf A20/AN1-Polypeptid als SEQ ID NR: 10503, und die entsprechende Nukleinsäuresequenz als SEQ ID NR: 10502, identifiziert. Im US-Patent US7214786 wird ein Triticum aestivum-Znf A20/AN1-Polypeptid als SEQ ID NR: 10787 von 211,164 Sequenzen identifiziert.
• Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein Zinkfinger(Znf)-Domäne-haltiges A20/AN1-Polypeptid codiert, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Zinkfinger(Znf)-Domäne-haltiges A20/AN1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhter Frühwuchskraft, erhöhter oberirdischer Biomasse, erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhter Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Samenfüllrate und erhöhtem Ernteindex.
• 4. PHD-zf-Polypeptid
• Zinkfinger(zf)-Domäne-haltige Proteine zählen zu den weitverbreitetsten Proteinen in eukaryotischen Genomen. Zinkfinger-Proteine können als eine modulare Domäne in Kombination mit anderen konservierten Strukturen an DNA, RNA, andere Proteine oder Lipide binden. Aufgrund dieser kombinatorischen Diversität leisten verschiedene Vertreter der Zinkfinger-Superfamilien einen Beitrag zu vielen einzelnen zellulären Prozessen, einschließlich Transkriptionsregulierung, mRNA-Stabilität und -Prozessierung und Protein-Umsatz. Zinkfinger-Domäne sind relativ kleine Proteinmotive, welche ein oder mehrere Zinkionen binden, wobei das Zinkion tetraedrisch von Cysteinen und Histidinen koordiniert wird.
• Zinkfinger-Domäne-haltige Proteine können in evolutionär und funktional divergente Protein-Subfamilien klassifiziert werden. Eine dieser Subfamilien ist die Pflanzen-Homeodomäne-Zinkfinger(PDH-zf)-Domänenfamilie, benannt nach der Klasse von Proteinen (Pflanzen-Homeodomäne), in der sie zuerst gefunden wurde (Aasland & Stewart (1995) Trends Biochem. Sci. 20: 56-9). Die PHD ist ein ungefähr 50 Aminosäuren großes Motiv, das hauptsächlich in Proteinen gefunden wird, die an eukatvotischer Transkriptionsregulation beteiligt sind. Das charakteristische Sequenzmerkmal ist ein konserviertes Cys₄-HisCys₃-Zinkbindungsmotiv. PHD-Domänen koordinieren zwei Zinkatome, und eines der Gründungsmitglieder, genannt Alfin-1(alfalfa-induced-1), wurde ursprünglich durch differentielles Screening einer cDNA-Bibliothek zwischen salztoleranten und normalen Alfalfa-Zellen isoliert (Bastola, et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 1123-35). Es wurde spekuliert, dass die Alfin-1-PHD-Domäne die Rolle der Bindung von DNA auf EDTA-empfindliche Weise übernimmt, weswegen auf die Notwendigkeit von Zink für die Bindung geschlossen wurde (Bastola, et al., 1998, siehe oben). Acht PHD-zf codierende Gene wurden in Arabidopsis (Riechmann, J. L., et al., (2000) Science 290: 2105–10), und mindestens neun in Reis und dreizehn in Mais, identifiziert.
• PHD-zf-Domänen enthalten ein C4HC3-Zinkfinger-ähnliches Motiv, das in nukleären Proteinen gefunden wird, von dem angenommen wird, an der Chromatin-vermittelten Transkriptionsregulierung beteiligt zu sein, und genauer gesagt DNA an einem Kern-Hexamermotiv aus entweder GNGGTG oder GTGGNG zu binden (Bastola, et al., 1998). Innerhalb dieser PHD-zf-Domäne befindet sich ein hochkonservierter Trp-Rest. PHD-zf-Polypeptide enthalten auch eine saure Region, die für DNA-bindende Proteine charakteristisch ist, welche mit anderen Proteinen interagieren.
• Winicov und Bastola bewirkten eine Überexpression von Alfin-1 mit Hilfe des konstitutiven 35S-Promotors und zeigten, dass die transgenen Alfalfa-Pflanzen in normaler Weise ohne auffälligen Phänotyp wuchsen, außer dass die Blätter etwas breiter waren als diejenigen der untransformierten Pflanze (Winicov & Bastola (1999) Plant Physiol. 120: 473-480). Im Gegensatz dazu wuchsen transgene Pflanzen, die Alfin-1 in der Antisense-Orientierung überexprimerten, schlechter im Erdboden, was nahelegt, dass Alfin-1 für das normale Pflanzenwachstum essentiell ist. Es wurde gezeigt, dass die konstitutive Expression durch den 35S-Promotor von Alfin-1 die Salztoleranz von transgenen Pflanzen erhöht (Winicov & Bastola (1999) siehe oben). Die weitere Charakterisierung dieser transgenen Pflanzen zeigte, dass das Wurzelwachstum, sowohl in normalen als auch salzbelasteten Böden, gesteigert war (Winicov (2000) Planta 210: 416-22). Winicov berichtete von milden Steigerungen beim Sprossgewicht der transgenen Alfalfa-Pflanzen.
• In der internationalen Patentanmeldung WO99/53016 sind Nukleinsäuresequenzen, die PHD-zf-Polypeptide codieren, und Konstrukte, welche diese umfassen, beschrieben. Es werden transgene Pflanzen, welche ein PHD-zf (Alfin-1) überexprimieren, mit erhöhter Toleranz gegenüber dem Salzgehalt im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufgeführt. Diese Pflanzen sind weiterhin durch ein verstärktes Wurzelwachstum in normalen und salzigen Böden gekennzeichnet.
• Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Erhöhung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, welche ein PHD-zf-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Erhöhung samenertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid codiert, wie hierin definiert, in einer Pflanze. Die erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhter Pflanzenhöhe, erhöhter Samenfüllrate, erhöhter Anzahl an Blüten pro Rispen, und erhöhtem Tausendkerngewicht (TKW).
• 5. REF/ALY-Polypeptide
• Die Proteinbiosynthese in lebenden Zellen erfolgt über einen mehrstufigen Prozess, der Gentranskription zu Botschafter-RNA (mRNA) und die anschließende Translation solcher mRNA in ein Protein beinhaltet. Bei Eukaryoten erfordert die Genexpression den Export der mRNAs vom Ort ihrer Transkription, im Zellkern, aus zum Cytoplasma, wo sie translatiert werden. Es gibt hunderte von Genen, die Genexpression steuern, und nur einige wenige von ihnen besitzen gezeigtermaßen einen nutzbringenden Effekt auf Eigenschaften von Interesse für die landwirtschaftliche Industrie, wenn ihre Expression in der Pflanze moduliert wird (Vinocur und Altman, 2005, Current Opinion in Biotechnology 16, 123–132; Gutterson und Reuber 2004. Current Opinion in Plant Biology, 7, 465–471).
• Insbesondere wurden die RFF/ALY-Proteine mit transkriptioneller Coaktivierung und mit dem mRNA-Zellkernexport-Transport in Verbindung gebracht. Die REF/ALY-Proteine sind über die taxonomischen Reiche hinweg konserviert. Das Hefegenom codiert ein einzelnes REF/ALY-Protein, während höhere Eukaryoten eine kleine Familie von Genen enthalten, die REF/ALY-Proteine codieren. ALY-Proteine sind ungefähr 30 kD große Proteine und weisen eine hochkonservierte Domänenstruktur auf. Diese besteht aus kurzen N-terminalen und C-terminalen Motiven, die zwei variable Regionen flankieren, enthaltend variable Anzahlen an Arg-Gly-Gly(RGG)-Repeats, die in nicht-konservierter Aminosäuresequenz eingebettet sind. Die zentrale Domäne des Proteins enthält eine RNA-bindende Domäne (ebenfalls bezeichnet als ein RNA-Erkennungs-Motiv [RRM]), welche zwei höher konservierte Subdomänen, RNP1 und RNP2, enthält.
• In Arabidopsis thaliana sind zwei der vier Vertreter der REF/ALY-Proteinfamilie durch ihre Fähigkeit charakterisiert worden, an die PARP (Poly-ADP-Ribose-Polymerase) zu binden, ein Protein, das an der Steuerung von Genomintegrität, Chromatinstruktur, DNA-Reparatur und Zelltod beteiligt ist (Storozhenko et at. 2001. J. Exp. Bot. 52, 1375–1380). Ferner interagiert ein anderes Mitglied der Familie berichtetermaßen mit dem P19-Protein von Tomato Bushy Stunt Virus (Uhrig et al. 2004, Plant Physiology, Band 135, S. 2411–2423).
• Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, welche ein REF/ALY-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften ergibt.
• Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein REF/ALY-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Definitionen
• Polypeptid(e)/Protein(e)
• Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden hierin austauschbar verwendet und betreffen Aminosäuren in einer polymeren Form von beliebiger Länge, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
• Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
• Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, ”Nukleinsäuremolekül” werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, entweder Ribonuklotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beiden, in einer polymeren unverzweigten Form von beliebiger Länge.
• Kontrollpflanze(n)
• Die Auswahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein routinemäßiger Teil eines experimentellen Ansatzes und kann entsprechende Wildtyp-Pflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das Gen von Interesse einschließen. Die Kontrollpflanze stammt typischerweise aus der gleichen Pflanzenart oder sogar aus der gleichen Varietät, wie die zu untersuchende Pflanze. Die Kontrollpflanze kann auch sein. Nullzygote der zu untersuchenden Pflanze sein. Nullzygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich nicht nur auf ganze Pflanzen, sondern auch auf Pflanzenteile, einschließlich Samen und Samenteilen.
• Homolog(e)
• ”Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme, welche Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen im Vergleich zum betreffenden unmodifizierten Protein aufweisen und eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind, aufweisen.
• Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
• Eine Insertion bezieht sich darauf, dass ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorherbestimmte Stelle in einem Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Intra-Sequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren umfassen. Im Allgemeinen werden Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Resten, sein. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide zählen die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG^®-Epitop, IacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.
• Eine Substitution bezieht sich auf die Ersetzung von Aminosäuren des Proteins durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie etwa einer ähnlichen Hydrophobizität, Hydrophilizität, Antigenizität, Neigung zur Bildung oder Aufbrechung von α-helikalen Strukturen oder β-Blatt-Strukturen) Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise an Einzelresten vorhanden, aber können abhängig von den funktionellen Erfordernissen, welche dem Polypeptid auferlegt sind, gehäuft vorliegen; Insertionen werden üblicherweise eine Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten aufweisen. Die Aminosäuresubstitutionen sind vorzugsweise konservative Aminosäuresubstitutionen. Tabellen über konservative Substitution sind im Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman und Company (Hrsg.) sowie die nachstehende Tabelle 1). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen

  Rest	Konservative Substitutionen	Rest	Konservative Substitutionen
  Ala	Ser	Leu	Ile; Val
  Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
  Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
  Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
  Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
  Cys	Ser	Thr	Ser; Val
  Glu	Asp	Trp	Tyr
  Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
  His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
  Ile	Leu, Val

• Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen können mit Hilfe von auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Peptidsynthesetechniken, wie etwa der Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, leicht durchgeführt werden. Verfahren für die Manipulierung von DNA-Sequenzen zur Erzeugung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel sind Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange-ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige ortsgerichtete Mutagenase-Protokolle ein.
• Derivate
• ”Derivate” schließen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide ein, die im Vergleich zur Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie dem Protein von Interesse, Substitutionen von Aminosäuren mit nicht-natürlichen vorkommenden Aminosäureresten, oder Additionen von nicht-natürlich vorkommenden Aminosäureresten, umfassen können. ”Derivate” eines Proteins beinhalten außerdem Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche natürlich vorkommende, veränderte (glykosierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristylierte, sulfatierte, etc.) oder nicht-natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann außerdem eine oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder -Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, aus der es abgeleitet ist, wie zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Ligand, der kovalent oder nicht-kovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie etwa ein Reportermolekül, das gebunden ist, um deren Nachweis zu erleichtern, sowie nicht-natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zur Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins, umfassen. Ferner zählen zu ”Derivaten” ebenfalls Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Übersichtsartikel über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003).
• Ortholog(e)/Paralog(e)
• Orthologe und Paraloge umfassen evolutionäre Konzepte, die zur Beschreibung der ancestralen Beziehungen von Genen zur Anwendung kommen. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Spezies, welche aus der Duplikation eines ancestralen Gens hervorgegangen sind; Orthologe sind Gene aus unterschiedlichen Organismen, welche durch Speziation hervorgegangen sind, und sind ebenfalls von einem gemeinsamen ancestralen Gen abgeleitet.
• Domäne
• Der Begriff ”Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen evolutionär verwandter Proteine konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen variieren können, deuten Aminosäure, welche an spezifischen Positionen hochkonserviert sind, auf Aminosäuren hin, die wahrscheinlich in der Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins wesentlich sind. Identifiziert durch das hohe Ausmaß ihrer Konservierung in alignierten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen, können sie als Identifikatoren verwendet werden, um zu ermitteln, ob ein beliebiges, fragliches Polypeptid einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie angehört.
• Motiv/Consensus-Seguenz/Signatur
• Der Begriff ”Motiv” oder ”Consensus-Sequenz” oder ”Signatur” bezieht sich auf eine kurze, konservierte Region in der Sequenz von evolutionär verwandten Proteinen. Motive sind häufig hochkonservierte Teile von Domänen, aber können ebenfalls lediglich einen Teil der Domäne einschließen oder außerhalb einer konservierten Domäne liegen (wenn alle der Aminosäuren des Motives außerhalb einer definierten Domäne liegen).
• Hybridisierung
• Der Begriff ”Hybridisierung”, wie hierin definiert, ist ein Verfahren, in dem im wesentlichen homologe, komplementäre Nukleotidsequenzen miteinander annealen bzw. sich aneinander anlagern. Das Hybridisierungsverfahren kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Das Hybridisierungsverfahren kann ebenfalls stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an eine Matrix, wie magnetische Kügelchen, Sepharose-Kügelchen oder ein beliebiges anderes Harz, immobilisiert ist. Das Hybridisierungsverfahren kann ferner stattfinden, wobei eine der komplementären Nukleinsäuren an einem festen Träger immobilisiert ist, wie etwa einer Nitrozellulose- oder Nylonmembran, oder z. B. durch Photolithografie beispielsweise an einem silikatischen Glasträger immobilisiert ist (wobei man letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder Mikroarrays oder als Nukleinsäure-Chips kennt). Um zu ermöglichen, dass eine Hybridisierung stattfindet, werden die Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufzuschmelzen und/oder Haarnadeln oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen.
• Der Begriff ”Stringenz” bezieht sich auf die Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Strigenz einer Hybridisierung wird von Bedingungen, wie der Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und der Hybridisierungspuffer-Zusammensetzung, beeinflusst. Im Allgemeinen werden Niederstringenzbedingungen so gewählt, dass sie um etwa 30°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert sind. Mittlere Stringenzbedingungen liegen vor, Temperatur 20°C unterhalb der T_m liegt, und Hochstringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 10°C unterhalb der T_m liegt. Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen werden in der Regel zum Isolieren von hybridisierenden Sequenzen angewandt, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ziel-Nukleinsäuresequenz aufweisen. Allerdings können Nukleinsäuren hinsichtlich der Sequenz abweichen und aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes immer noch ein im Wesentlichen identisches Polypeptid codieren. Deshalb können manchmal mittelstringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich sein, um derartige Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren.
• Die Tm ist die Temperatur bei definierter Ionenstärke und pH, bei welcher 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Die T_m ist von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung sowie der Länge der Sonde abhängig. Zum Beispiel hybridisieren längere Sequenzen spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Rate der Hybridisierung wird bei etwa 16°C bis 32°C unterhalb der T_m erhalten. Das Vorhandensein von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung verringert die elektrostatische Abstoßung zwischen den zwei Nukleinsäuresträngen, wodurch die Hybridbildung gefördert wird; dieser Effekt ist für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M sichtbar (für höhere Konzentrationen kann dieser Effekt vernachlässigt werden). Formamid senkt die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen um 0,6 bis 0,7°C für jedes Prozent an Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid gestattet, dass die Hybridisierung bei 30 bis 45°C durchgeführt werden kann, obwohl die Rate bzw. Geschwindigkeit der Hybridisierung vermindert wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die thermische Stabilität der Duplizes. Im Durchschnitt, und für große Sonden, sinkt die Tm um etwa 1°C je Prozent an Basenfehlpaarung. Die Tm kann mit Hilfe der folgenden Gleichungen, abhängig von den Typen der Hybride, berechnet werden:
• 1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984): T_m = 81,5°C + 16,6 × log₁₀[Na⁺]^a + 0,41 × %[G/C^b] – 500×[L^c]^–1 – 0,61× % Formamid
• 2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: T_m = 79,8 + 18,5 (log₁₀[Na⁺]^a) + 0,58 (%G/C^b) + 11,8 (%G/C^b)² – 820/L^c
• 3) Oligo-DNA- oder Oligo-RNA^d-Hybride: Für <20 Nukleotide: T_m = 2 (I_n) Für 20-35 Nukleotide: T_m = 22 + 1,46 (I_n)
• ^a oder für ein sonstiges einwertiges Kation, aber nur exakt im Bereich von 0,01-0,4 M.
• ^b nur exakt für %GC im Bereich von 30% bis 75%.
• ^c L = Länge des Duplex in Basenpaaren.
• ^d Oligo, Oligonukleotid; I_n = effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. v. G/C) + (Anz. v. A/T).
• Nicht-spezifische Bindung kann unter Anwendung einer beliebigen von vielen bekannten Techniken reguliert werden, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusetzungen von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nicht-homologe Sonden kann eine Serie von Hybridisierungen mittels Variieren von einem von (i) progressivem Senken der Annealing-Temperatur (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) progressivem Senken der Formamidkonzentration (zum Beispiel von 50% auf 0%) durchgeführt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während einer Hybridisierung verändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
• Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung in der Regel auch von der Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten ab. Um den aus nicht-spezifischer Hybridisierung resultierenden Hintergrund zu entfernen, werden Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu den kritischen Faktoren bei derartigen Waschschritten zählen die Ionenstärke und Temperatur der letztendlichen Waschlösung: je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur, umso höher ist die Stringenz des Waschschritts. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unterhalb der Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, welches mindestens das Zweifache von demjenigen des Hintergrundes ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays oder Genamplifikations-Nachweisverfahren wie oben angegeben beschaffen. Auch können mehr oder weniger stringente Bedingungen gewählt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während des Waschens abgeändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
• Zum Beispiel umfassen typische Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC. Beispiele von Mittelstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die vorhergesehene Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Wenn Nukleinsäuren von bekannter Sequenz hybridisiert werden, kann die Hybridlänge bestimmt werden durch Alignieren der Sequenzen und Identifizieren der hierin beschriebenen konservierten Regionen. 1 × SSC steht für 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und Waschlösungen können zusätzlich 5× Denhardt-Reagenz, 0,5-1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 0,5% Natriumpyrophosphat, enthalten.
• Für die Zwecke des Definierens der Höhe der Stringenz kann auf Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder auf Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Aktualisierungen) Bezug genommen werden.
• Splice-Variante
• Der begriff ”Splice-Variante”, wie hierin verwendet, Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in welchen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verschoben oder hinzugefügt worden sind, oder in welchen Introns verkürzt oder verlängert worden sind. Derartige Varianten werden solche sein, in denen die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleibt; dies kann durch selektives Beibehalten von funktionellen Segmenten des Proteins bewirkt werden. Derartige Splice-Varianten können in der Natur vorgefunden oder vom Menschen erzeugt sein. Verfahren zum Vorhersagen und Isolieren derartiger Splice-Varianten sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
• Allelische Variante
• Allele oder allelische Varianten sind alternative Formen eines gegebenen Gens, welche an der gleichen chromosomalen Position lokalisiert sind. Allelische Varianten umfassen Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), sowie ”Kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen” (INDELs). Die Größe von INDELs beträgt in der Regel weniger als 100 bp. SNPs und INDELs bilden die grösste Gruppe von Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
• Gen-Shuffling/gerichtete Evolution
• Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution besteht aus Iterationen des DNA-Shuffling, gefolgt von einem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Abschnitten davon zu erzeugen, welche Proteine mit einer modifizierten biologischen Aktivität codieren (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151-4; U.S.-Patente 5 811 238 und 6 395 547 ).
• Requlatorisches Element/Steuerungssequenz/Promotor
• Die Begriffe ”regulatorisches Element”, ”Steuerungssequenz” und ”Promotor” werden hierin alle austauschbar verwendet und beziehen sich, wobei sie in einem weiten Kontext zu verstehen sind, auf regulatorische Nukleinsäuresequenzen, die zum Bewirken der Expression der Sequenzen in der Lage sind, an welche sie ligiert sind. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäure-Steuerungssequenz, welche sich stromaufwärts vom transkriptionellen Start eines Gens befindet und welche an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verbundenen Nukleinsäure gesteuert wird. Bei den zuvor erwähnten Begriffen sind transkriptionelle regulatorische Sequenzen, die aus einem klassischen eukaryotischen genomischen Gen abgeleitet sind (einschließend die TATA-Box, welche für eine exakte Transkriptionsinitiation erforderlich ist, mit oder ohne einer CCAAT-Box-Sequenz), sowie weitere regulatorische Elemente (d. h. ”Upstream-Aktivierende Sequenzen”, ”Enhancer” und ”Silencer”), welche die Genexpression in Antwort auf entwicklungsmäßige und/oder externe Stimuli oder in einer gewebespezifischen Weise verändert, eingeschlossen. Ebenfalls innerhalb des Begriffs eingeschlossen ist eine transkriptionelle regulatorische Sequenz eines klassischen prokaryotischen Gens, wobei er in diesem Fall eine -35-Box-Sequenz und/oder transkriptionsregulierende -10-Box-Sequenzen einschließen kann. Der Begriff ”regulatorisches Element” beinhaltet außerdem ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, welches die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ herbeiführt, aktiviert oder steigert.
• Ein ”Pflanzenpromotor” umfasst regulatorische Elemente, welche die Expression eines codierenden Sequenzsegments in Pflanzenzellen vermitteln. Folglich muss ein Pflanzenpromotor nicht von pflanzlichem Ursprung sein, sondern kann aus Viren oder Mikroorganismen stammen, beispielsweise aus Viren, welche Pflanzenzellen angreifen. Der ”Pflanzenpromotor” kann auch aus einer Pflanzenzelle stammen, z. B. aus der Pflanze, welche mit der Nukleinsäuresequenz transformiert wird, die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden soll und hierin beschrieben ist. Dies gilt auch für andere regulatorische ”Pflanzen”-Signale, wie etwa ”pflanzliche” Terminatoren. Die Promotoren stromaufwärts der Nukleotidsequenzen, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -Insertion(en) und/oder -Deletion(en) modifiziert sein, ohne die Funktionalität oder Aktivität von entweder den Promotoren, dem offenen Leserahmen (ORF) oder der 3'-regulatorischen Region, wie Terminatoren oder sonstigen 3'-regulatorischen Regionen, welche sich entfernt vom ORF befinden, zu stören. Es ist ferner möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht wird, oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar Promotoren aus heterologen Organismen, ersetzt werden. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, oder diesen umfassen, welcher das Gen zum richtigen Zeitpunkt und mit dem erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
• Für die Identifizierung von funktionell äquivalenten Promotoren können die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, zum Beispiel durch funktionsfähiges Verknüpfen des Promotors an ein Reportergen und Testen des Expressionsspiegels und -musters des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze. Zu geeigneten, allgemein bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase. Die Promotoraktivität wird durch Messen der enzymatischen Aktivität der Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase getestet. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit denjenigen eines Referenzpromotors verglichen werden (wie etwa jenem, der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren von mRNA-Spiegeln oder durch Vergleich von mRNA-Spiegeln der, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten, Nukleinsäure mit mRNA-Spiegeln von Haushaltsgenen, wie etwa 18S-rRNA, geassayt werden, wobei im Fachgebiet bekannte Verfahren, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Neid et al., 1996 Genome Methods 6: 986-994) zur Anwendung kommen. Mit ”schwacher Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor bezeichnet, der die Expression einer codierenden Sequenz auf einem geringen Spiegel antreibt. Mit ”geringer Spiegel” werden Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis etwa 1/100000 Transkripte, bis etwa 1/5000000 Transkripten pro Zelle gemeint.
• Demgegenüber treibt ein ”starker Promotor” die Expression einer codierenden Sequenz bei einem hohen Niveau oder bei etwa 1/10 Transkripte bis etwa 1/100 Transkripte bis etwa 1/1000 Transkripte pro Zelle an. Mit ”mittelstarker Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor gemeint, der die Expression einer codierenden Sequenz bei einem niedrigeren Spiegel als ein starker Promotor antreibt, insbesondere bei einem Spiegel, welcher in allen Fällen unterhalb von demjenigen liegt, der unter der Steuerung eines 35S-CaMV-Promotors erhalten wird.
• Funktionsfähig verbunden
• Der Begriff ”funktionsfähig verbunden”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine funktionale Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem Gen von Interesse, so dass die Promotorsequenz in der Lage ist, die Transkription des Gens von Interesse zu initiieren.
• Konstitutiver Promotor
• Ein ”konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, der während den meisten, aber nicht notwendigerweise allen, Phasen des Wachstums und der Entwicklung, sowie unter den meisten Umweltbedingungen, in mindestens einer/einem Zelle, Gewebe oder Organ transkriptionell aktiv ist. Die nachstehende Tabelle 2a gibt Beispiele von konstitutiven Promotoren an. Tabelle 2a: Beispiele von konstitutiven Promotoren

  Gen-Quelle	Literatur-Bezugsstelle
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  HMGP	WO 2004/070039
  CAMV 35S	Odell et al., Nature, 313: 810-812, 1985
  CaMV 19S	Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456-462, 1997
  GOS2	de Pater et al., Plant J. Nov; 2(6): 837-44, WO 2004/065596
  Ubiquitin	Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992
  Reis-Cyclophilin	Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25(5): 837-43, 1994
  Mais H3-Histon	Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992
  Alfalfa H3-Histon	Wu et al., Plant Mol. Biol. 11: 641-649, 1988
  Actin 2	An et al., Plant J. 10(1); 107-121, 1996
  34S FMV	Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443
  kleine Rubisco-Untereinheit	US 4 962 028
  OCS	Leisner (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
  SAD1	Jain et al., Crop Science, 39(6), 1999: 1696
  SAD2	Jain et al., Crop Science, 39(6), 1999: 1696
  nos	Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831-7846
  V-ATPase	WO 01/14572
  Super-Promotor	WO 95/14098
  G-Box-Proteine	WO 94/12015

• Ubiquitärer Promotor
• Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
• Entwicklungsmäßig regulierter Promotor
• Ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor ist während bestimmter Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, die entwicklungsbedingten Änderungen unterliegen, aktiv.
• Induzierbarer Promotor
• Ein induzierbarer Promotor zeigt induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation in Antwort auf eine Chemikalie (zur Übersicht siehe Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108), einen umweltmäßigen oder physikalischen Stimulus, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt wird, oder ”pathogeninduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze der Exposition an verschiedene Pathogene ausgesetzt wird.
• Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
• Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein solcher, der fähig ist, die Transkription in bestimmten Organen oder Geweben, wie Blättern, Wurzeln, Samengewebe, etc., präferentiell zu initiieren. Zum Beispiel ist ein ”wurzelspezifischer Promotoren” ein Promotor, der vorwiegend in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Promotoren, die zum Initiieren der Transkription nur in bestimmten Zellen fähig sind, werden hierin als ”zellspezifisch” bezeichnet.
• Beispiele wurzelspezifischer Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2b aufgeführt: Tabelle 2b: Beispiele von wurzelspezifischen Promotoren

  Gen-Quelle	Literatur-Bezugsstelle
  RCc3	Plant Mol. Biol. 1995 Jan; 27(2): 237-48
  Arabidopsis PHT1	Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
  Medicago Phosphat-Transporter	Xiao et al., 2006
  Arabidopsis Pyk10	Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337-346
  wurzelexprimierbare Gene	Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987.
  Tabak, Auxin-induzierbares Gen	Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.
  β-Tubulin	Oppenheimer, et al., Gene 63: 87, 1988.
  Tabak, wurzelspezifische Gene	Conkling, et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.
  B. napus G1-3b Gen	US-Patent Nr. 5 401 836
  SbPRP1	Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109-119, 1993.
  LRX1	Raumberner et al. 2001, Genes & Dev. 15: 1128
  BTG-26 Brassica napus	US 20050044585
  LeAMT1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
  The LeNRT1-1 (Tomate)	Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
  Klasse I Patatin-Gen (Kartoffel)	Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386-395, 1991.
  KDC1 (Daucus carota)	Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
  TobRB7-Gen	W. Song (1997) PhD-Dissertation, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
  OsRAB5a (Reis)	Wang et al. 2002, Plant Cell 163: 273
  ALF5 (Arabidopsis)	Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
  NRT2;1Np (N. plumbaginifolia)	Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)

• Ein samenspezifischer Promotor ist hauptsächlich in Samengewebe transkriptionell aktiv, jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich in Samengewebe (in Fällen von Leckexpression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promotor kann Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch sein. Beispiele samenspezifischer Promotoren (Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch) sind in Tabelle 2c bis Tabelle 2f nachstehend gezeigt. Weitere Beispiele samenspezifischer Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113-125, 2004) angegeben, wobei diese Offenbarung, als ob sie vollständig dargelegt ist, hierin durch den Bezug darauf einbezogen wird. Tabelle 2c: Beispiele von samenspezifischen Promotoren

  Gen-Quelle	Literatur-Bezugsstelle
  samenspezifische Gene	Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
  	Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.;
  	Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
  Paranuss-Albumin	Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992.
  Legumin	Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988.
  Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986;
  	Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987.
  Zein	Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14(3): 323-32 1990
  napA	Stalberg et al., Planta 199: 515-519, 1996.
  Weizen-LMW- und HMW-Glutenin-1	Mol. Gen. Genet. 216: 81-90, 1989; NAR 17: 461-2, 1989
  Weizen-SPA	Albani et al., Plant Cell, 9: 171-184, 1997
  Weizen, α-, β-, γ-Gliadine	EMBO J. 3: 1409-15, 1984
  Gerste Itr1-Promotor	Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592-8
  Gerste B1-, C-, D-Hordein	Theor. Appl. Gen. 98: 1253-62, 1999; Plant J. 4: 343-55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750-60, 1996
  Gerste DOF	Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998
  blz2	EP99106056.7
  synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998.
  Reis Prolamin NRP33	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998
  Reis a-Globulin Glb-1	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998
  Reis OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996
  Reis α-Globulin REB/OHP-1	Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997
  Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Trans. Res. 6: 157-68, 1997
  Mais ESR-Genfamilie	Plant J. 12: 235-46, 1997
  Sorghum α-Kafirin	DeRose et al., Plant Mol. Biol 32: 1029-35, 1996
  KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257-71, 1999
  Reis-Oleosin	Wu et al., J. Biochem. 123: 386, 1998
  Sonnenblume-Oleosin	Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992
  PRO0117, putatives Reis 40S ribosomales Protein	WO 2004/070039
  PRO0136, Reis Alanin-Aminotransferase	unveröffentlicht
  PRO0147, Trypsininhibitor ITR1 (Gerste)	unveröffentlicht
  PRO0151, Reis-WSI18	WO 2004/070039
  PRO0175, Reis-RAB21	WO 2004/070039
  PRO005	WO 2004/070039
  PRO0095	WO 2004/070039
  α-Amylase (Amy32b)	Lanahari et al., Plant Cell 4: 203-211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266-7270, 1991
  Cathepsin β-like Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849-856, 1992
  Gerste-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849-60, 1994
  Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579-89, 1994
  Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125-38, 1998

  Tabelle 2d: Beispiele von endosperm-spezifischen Promotoren:

  Gen-Quelle	Literatur-Bezugsstelle
  Glutelin (Reis)	Takaiwa et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 208: 15-22; Takaiwa et al. (1987) FERS Letts. 221: 43-47
  Zein	Matzke et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 323-32
  Weizen LMW- und HMW-Glutenin-1	Colot et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 216: 81-90, Anderson et al. (1989) NAR 17: 461-2
  Weizen SPA	Albani et al. (1997) Plant Cell 9: 171-184
  Weizen Gliadine	Rafalski et al. (1984) EMBO 3: 1409-15
  Gerste Itr1-Promoter	Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592-8
  Gerste B1-, C-, D-Hordein	Cho et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 98: 1253-62; Muller et al. (1993) Plant J. 4: 343-55; Sorenson et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 250: 750-60
  Gerste DOF	Mena et al, (1998) Plant J. 116(1): 53-62
  blz2	Onate et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(14): 9175-82
  synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J. 13: 629-640
  Reis Prolamin NRP33	Wu et al., (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885-889
  Reis Globulin Glb-1	Wu et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885-889
  Reis Globulin REB/OHP-1	Nakase et al. (1997) Plant Molec. Biol. 33: 513-522
  Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Russell et al. (1997) Trans. Res. 6: 157-68
  Mais ESR-Genfamilie	Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J. 12: 235-46
  Sorghum-Kafirin	DeRose et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1029-35

  Tabelle 2e: Beispiele von embryospezifischen Promotoren:

  Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
  Reis-OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996
  KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257-71, 1999
  PRO0151	WO 2004/070039
  PRO0175	WO 2004/070039
  PRO005	WO 2004/070039
  PRO0095	WO 2004/070039

  Tabelle 2f: Beispiele von aleuronspezifischen Promotoren:

  Genquelle	Literatur-Bezugsstelle
  α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203-211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266-7270, 1991
  Cathepsin β-like Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849-856, 1992
  Gerste-Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849-60, 1994
  Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579-89, 1994
  Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125-38, 1998

• Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, wie hierin definiert, ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß jeglicher sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird.
• Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2g gezeigt. Tabelle 2g: Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren

  Gen	Expression	Literatur-Bezugsstelle
  Mais, Orthophosphat-Dikinase	blattspezifisch	Fukavama et al., 2001
  Mais, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Kausch et al., 2001
  Reis, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	blattspezifisch	Liu et al., 2003
  Reis, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Nomura et al., 2000
  Reis, beta-Expansin EXBP9	spross-spezifisch	WO 2004/070039
  Straucherbse, kleine Rubisco-Untereinheit	blattspezifisch	Panguluri et al., 2005
  Erbse RBCS3A	blattspezifisch

• Ein weiteres Beispiel eines gewebespezifischen Promotors ist ein meristemspezifischer Promotor, der vorwiegend in meristematischem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine gewisse Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Beispiele von für grünes Meristem spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2h gezeigt. Tabelle 2h: Beispiele von meristemspezifischen Promotoren

  Genquelle	Expressionsmuster	Literatur-Bezugsstelle
  Reis-OSH1	Spross-Apikalmeristem, vom globulären Embryostadium bis zum Setzlingsstadium	Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122
  Reis-Metallothionein	meristemspezifisch	BAD87835.1
  WAK1 & WAK2	Spross- und Wurzel-Apikalmeristeme, und in expandierenden Blättern und Kelchblättern.	Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303-318

• Terminator
• Der Begriff ”Terminator” beinhaltet eine Steuerungssequenz, welche eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit ist, welche die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines Primärtranskripts und die Termination der Transkription signalisiert. Der Terminator kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel aus den Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthese-Genen oder alternativ aus einem anderen Pflanzengenen oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen anderen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
• Modulierung
• Der Begriff ”Modulierung” bedeutet in Bezug auf Expression oder Genexpression ein Verfahren, in welchem der Expressionsspiegel durch die Genexpression im Vergleich zur Kontrollpflanze verändert wird, wobei der Expressionsspiegel erhöht oder verringert werden kann. Die ursprüngliche, nicht modulierte Expression kann jede Art von Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation sein. Der Begriff ”Modulieren der Aktivität” soll jedwede Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder codierten Proteine bedeuten, welche zu einem erhöhten Ertrag und/oder erhöhten Wachtsum der Pflanzen führt.
• Expression
• Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet insbesondere die Transkription von einem Gen oder Genen oder einem gentechnischen Konstrukt zu struktureller RNA (rRNA, tRNA) oder zu mRNA mit oder ohne anschließende Translation der letzteren in ein Protein. Das Verfahren beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des resultierenden mRNA-Produkts.
• Erhöhte Expression/Überexpression
• Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie hierin verwendet, bedeutet eine beliebige Form von Expression, welche zusätzlich zum ursprünglichen Wildtyp-Expressionsspiegel erfolgt.
• Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert und beinhalten zum Beispiel die durch geeignete Promotoren angetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder von Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, welche als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (typischerweise stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, welche das Polypeptid von Interesse codiert, hochreguliert wird. Beispielsweise können endogene Promotoren in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5 565 350 ; Zarling et al., WO 9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der richtigen Orientierung und im richtigen Abstand zu einem Gen der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
• Wenn eine Polypeptidexpression gewünscht wird, ist es im Allgemeinen wünschenswert, eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer codierenden Polynukleotidregion einzuschließen. Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Die 3'-End-Sequenz, welche hinzugefügt werden soll, kann zum Beispiel aus den Genen für Nopalin-Synthase oder Octopin-Synthase oder alternativ dazu aus einem anderen Pflanzengen, oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen sonstigen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
• Auch eine Intronsequenz kann an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder die codierende Sequenz der partiellen codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert. Der Einschluss eines spleißbaren Introns in der Transkriptionseinheit sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Expressionskonstrukten erhöht gezeigtermaßen die Genexpression sowohl auf der mRNA- als auch der Protein-Ebene bis zu 1000-fach (Buchman und Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183-1200). Eine derartige Intron-Verstärkung der Genexpression ist typischerweise am größten bei Platzierung nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S Intron 1, 2 und 6, sowie des Bronze-1-Introns sind im Fachgebiet bekannt. Für allgemeine Informationen siehe: The Maize Handbook, Kapitel 116, Hrsg.: Freeling und Walbot, Springer, N. Y. (1994).
• Endogenes Gen
• Die Bezugnahme hierin auf ein ”endogenes” Gen bezieht sich nicht nur auf das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form (d. h. ohne dass irgendein menschlicher Eingriff stattgefunden hat) vorgefunden wird, sondern bezieht sich außerdem auf das gleiche Gen (oder ein(e) im Wesentlichen homologe(s) Nukleinsäure/Gen) in einer isolierten Form, welches anschließend in eine Pflanze (wieder)eingeführt wurde (ein Transgen). Zum Beispiel kann eine transgene Pflanze die ein derartiges Transgen enthält eins erhebliche Reduktion der Transgen-Expression und/oder eine erhebliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder vom Menschen, zum Beispiel durch chemische Synthese, erzeugt werden.
• Verringerte Expression
• Eine Bezugnahme hierin auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” von Expression wird verwendet, um eine Verringerung der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptidspiegel und/oder der Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen zu bezeichnen. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung beträgt, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Verringerung im Vergleich zu derjenigen von Kontrollpflanzen. Verfahren für die Verringerung der Expression sind im Fachgebiet bekannt, und der Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon beispielsweise durch Verwenden eines geeigneten Promotors erreicht wird.
• Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze wird eine ausreichende Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz benötigt. Um ein ”Gensilencing” durchzuführen kann diese so gering wie 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide sein, wobei sie alternativ so groß sein kann, wie das gesamte Gen (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder zum Teil oder insgesamt). Die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden kann aus der Nukleinsäure, welche das Protein von Interesse codiert (Zielgen), oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist, abgeleitet sein. Vorzugsweise ist die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden in der Lage, Wasserstoffbrücken mit dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang) zu bilden, und weiter bevorzugt besitzt die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zum Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, welche ein (funktionales) Polypeptid codiert, ist keine Voraussetzung für die verschiedenen, hierin erörterten, Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
• Beispiele von verschiedenen Verfahren zur Verringerungen oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze, oder zur Verminderung der Spiegel und/oder Aktivität eines Proteins, sind dem Fachmann bekannt. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten Promotors.
• Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann unter Anwendung von routinemäßigen Hilfsmitteln und Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder substantielle Eliminierung von endogener Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, eines genetischen Konstrukts, in welches die Nukleinsäure (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von einem beliebigen Protein von Interesse in der Lage ist) als ein invertierter Repeat (teilweise oder vollständig), getrennt durch einen Spacer bzw. Abstandhalter (nicht-codierende DNA), einkloniert ist.
• In einem derartigen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines invertierten Repeats einer Nukleinsäure oder eines Teils davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paraiogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist), welcher vorzugsweise zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur fähig ist. Der ”Invertierte Repeat” wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Steuerungssequenzen umfasst. Eine nicht-codierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Abstandhalter, zum Beispiel ein Matrix-Anheftungs-Region-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker, etc.) ist zwischen den zwei invertierten Nukleinsäuren, welche den ”Invertierten Repeat” bilden, befindlich. Nach der Transkription des invertierten Repeats wird eine chimäre RNA mit einer selbst-komplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als die Haarnadel-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, welche in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut werden. Der RISC spaltet die mRNA-Transkripte weiter, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die zu Polypeptiden translatiert werden können, wesentlich verringert wird. Für weitere allgemeine Einzelheiten, siehe zum Beispiel Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ).
• Die Ausführung der Verfahren der Erfindung beruht nicht auf dem Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem genetischen Konstrukt, in welches die Nukleinsäure als ein ”Inverted Repeat” einkloniert ist, sondern es können ein oder mehrere beliebige von einigen, allgemein bekannten ”Gen-Silencing”-Verfahren zur Anwendung kommen, um die gleichen Effekte zu erzielen.
• Ein derartiges Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-
• vermittelte Silencing von Genexpression (Herunterregulieren). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze von einer doppelsträngigen RNA-Sequenz (dsRNA) ausgelöst, welche im Wesentlichen ähnlich zum endogenen Zielgen ist. Diese dsRNA wird von der Pflanze zu etwa 20 bis etwa 26 Nukleotiden weiterprozessiert, welche als kurze interferierende RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, welcher das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
• Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense-Orientierung” bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche homolog zu einem mRNA-Transkript davon ist. Deswegen wird man in eine Pflanze mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz einführen. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens verringern, was zur Entstehung eines Phänomens führt, welches als Co-Suppression bekannt ist. Die Reduktion der Genexpression wird noch erheblicher sein, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und der Auslösung von Co-Suppression besteht.
• Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die ein Protein codiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz ist. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem endogenen Gen, welches stumm gemacht bzw. gesilenct werden soll. Die Komplementarität kann in der ”codierenden Region” und/oder in der ”nicht-codierenden Region” eines Gens lokalisiert sein. Der Begriff ”codierende Region” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff ”nicht-codierende Region” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche die codierende Region flankieren und welche transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (ebenfalls bezeichnet als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen).
• Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß den Regeln der Watson-und-Crick-Basenpaarung entworfen werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann zur gesamten Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) komplementär sein, aber kann ebenfalls ein Oligonukleotid sein, welches den Antisense zu lediglich einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der 5'- und 3'-UTR der mRNA) darstellt. Zum Beispiel kann die Antisense-Oligonukleotidsequenz komplementär zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid codiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotidsequenz ist im Fachgebiet bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung kann unter Anwendung von chemischer Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine Antisense-Oligonukleotidsequenz) chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedenartig modifizierte Nukleotide verwendet werden, entworfen zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität des zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildeten Duplex, wobei z. B. Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden können. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Zyklisierung und 'Caps' sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, wie etwa Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
• Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektor hergestellt werden, in welchen eine Nukleinsäuresequenz in einer Antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h., die von der inserierten Nukleinsäure transkribierte RNA wird bezüglich einer Ziel-Nukleinsäure von Interesse eine Antisense-Orientierung aufweisen). Vorzugsweise findet die Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäure-Konstrukts statt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verbundenes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
• Die in den Verfahren der Erfindung zum Silencing verwendeten Nukleinsäuremoleküle (ob in eine Pflanze eingeführt oder in situ erzeugt) hybridisieren oder binden an, ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte und/oder genomische DNA, um dadurch die Expression des Proteins, z. B. durch inhibieren von Transkription und/oder Translation, zu hemmen. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex oder, zum Beispiel im Fall einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, welche an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix erfolgen. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer spezifischen Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ dazu können Antisense-Nukleinsäuresequenzen modifiziert sein, um ausgewählte Zellen anzuzielen, und dann systemisch verabreicht werden. Für die systemische Verabreichung können Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Beispiel so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, welche an Zelloberflächen-Rezeptoren oder -Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen zugeführt werden.
• Gemäß eines weiteren Aspekts ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische, doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15: 6625-6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann außerdem ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15, 6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987) FERS Lett. 215, 327-330) umfassen.
• Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung von endogener Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen durchgeführt werden. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche zum Spalten einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, wie einer mRNA, zu der sie eine knmplementäre Region aufweisen, in der Lage sind. Somit können Ribozyme (z. B. Hammerkopf-Ribozyme; beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334, 585-591) verwendet werden, um ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, wodurch die Anzahl an mRNA-Transkripten, welche in ein Polypeptid translatiert werden können, wesentlich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entworfen werden (siehe zum Beispiel: Cech et al., U.S.-Patent Nr. 4 987 071 ; und Cech et al., U.S.-Patent Nr. 5 116 742 ). Alternativ dazu können mRNA-Transkripte, welche einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren (Bartel und Szostak (1993) Science 261, 1411-1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist auf dem Fachgebiet bekannt (z. B., Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 , und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
• Gen-Silencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie unter anderem von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J. 20(3): 357-62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden.
• Gen-Silencing kann auch auftreten, wenn eine Mutation auf einem endogenen Gen und/oder eine Mutation auf einem isolierten Gen/Nukleinsäure, welche(s) anschließend in eine Pflanze eingebracht wird, vorhanden ist. Die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzung(en) können daher ein Polypeptid vorsehen, das noch zum Binden an interagierende Proteine (wie etwa Rezeptorproteine) in der Lage ist, aber seine normale Funktion (wie etwa Signalleitungs-Ligand) nicht aufzeigen kann.
• Ein weiteres Vorgehen für das Gen-Silencing besteht im Ziellenker von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens (z. B. dem Promotor und/oder Enhancern) komplementär sind, wodurch tripelhelikale Strukturen gebildet werden, welche die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27-36, 1992; und Maher, L. J., Bioassays 14, 807-15, 1992.
• Andere Verfahren, wie etwa die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, zum Inhibieren von dessen Funktion in planta oder zum Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann allgemein bekannt sein. Insbesondere mag es in Betracht gezogen werden, dass vom Menschen geschaffene Moleküle zum Inhibieren der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder zur Störung des Signalleitungsweges, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
• Alternativ dazu kann ein Screening-Programm angesetzt werden, um natürliche Varianten eines Gens in einer Pflanzenpopulation zu identifizieren, wobei die Varianten Polypeptide mit verringerter Aktivität codieren. Solche natürlichen Varianten können beispielsweise auch zur Ausführung von homologer Rekombination angewandt werden.
• Künstliche und/oder natürliche MicroRNAS (miRNAs) können verwendet werden, um Genexpression und/oder mRNA-Translation auszuknocken. Endogene miRNAs sind einzelsträngige, kleine RNAs mit einer Länge von typischerweise 19-24 Nukleotiden. Sie funktionieren vorwiegend zum Regulieren der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen MicroRNAs (miRNAs) weisen eine perfekte oder beinahe perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Allerdings gibt es natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Sie werden aus längeren nicht-codierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch Doppelstrang-spezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert.
• Nach der Prozessierung werden sie in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) durch Binden an dessen Hauptkomponente, ein Argonaute-Protein, eingebaut. MiRNAs dienen als die Spezifitätskomponenten des RISC, da sie mit Zielnukleinsäuren, vorwiegend mRNAs, im Cytoplasma eine Rasenpaarung eingehen. Anschließende regulatorische Ereignisse beinhalten die Ziel-mRNA-Spaltung und -Zerstörung und/oder die Translationsinhibition. Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich deshalb häufig in verringerten mRNA-Spiegeln von Zielgenen.
• Artifizielle MikroRNAs (amiRNAs), welche typischerweise eine Länge von 21 Nukleotiden besitzen, können in spezifischer Weise gentechnisch erzeugt werden, um die Genexpression von einzelnen oder mehreren Genen von Interesse negativ zu regulieren. Determinanten der Pflanzen-MikroRNA-Zielauswahl sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Empirische Parameter für die Zielerkennung sind definiert worden und können angewandt werden, um beim Entwurf von spezifischen amiRNAs zu helfen (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517-527, 2005). Zweckdienliche Hilfsmittel für den Entwurf und die Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorläufern sind ebenfalls öffentlich verfügbar (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121-1133, 2006).
• Für eine optimale Leistung erfordern die Gen-Silencing-Techniken, die zum Reduzieren der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze angewandt werden die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotyledonen Pflanzen für die Transformation monokotyledoner Pflanzen, und aus dikotyledonen Pflanzen für die Transformation dikotyledoner Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer beliebigen gegebenen Pflanzenspezies in diese selbe Spezies eingebracht. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Allerdings ist es kein absolutes Erfordernis, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz aus derselben Pflanzenspezies stammt, wie die Pflanze, in welcher sie eingeführt wird. Es ist ausreichend, dass eine wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäure besteht.
• Beispiele verschiedener Verfahren für die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze sind oben beschrieben. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die oben genannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch Verwenden eines geeigneten Promotors.
• Selektierbares Marker(gen)/Reportergen
• Unter ”selektierbarer Marker, ”selektierbares Markergen” oder ”Reportergen” ist ein beliebiges Gen eingeschlossen, welches einen Phänotyp an eine Zelle vermittelt, in der es exprimiert wird, so dass die Identifizierung und/oder Selektion von Zellen erleichtert wird, die mit einem Nukleinsäure-Konstrukt der Erfindung transfiziert oder transformiert sind. Diese Markergene ermöglichen die Identifizierung eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuremoleküle durch eine Reihe unterschiedlicher Prinzipien. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, welche Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz vermitteln, welche eine neue metabolische Eigenschaft einbringen oder welche eine visuelle Selektion zulassen. Zu Beispielen von selektierbaren Markergenen zählen Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie etwa nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, welche Resistenz zum Beispiel gegen Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin vermitteln) sowie gegen Herbizide vermitteln (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta^® vermittelt; aroA oder gox, welche Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, welche zum Beispiel Resistenz gegen Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff vermitteln), oder Gene, die ein metabolisches Merkmal bereitstellen (wie etwa manA, das Pflanzen gestattet, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, oder Xylose-Isomerase für die Verwertung von Xylose, oder antinutritive Marker, wie die Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Erzeugung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit seinen gefärbten Substraten, beispielsweise X-Gal), Lumineszenz (wie etwa das Luciferin/Luciferase-System) oder Fluoreszenz (Grün-fluoreszierendes Protein, GFP, und Derivate davon). Diese Liste repräsentiert nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit derartigen Markern vertraut. Es werden, abhängig von dem Organismus und dem Selektionsverfahren, unterschiedliche Marker bevorzugt.
• Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeteten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie diejenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktional sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markergen-Entfernung sind im Fachgebiet bekannt, verwendbare Techniken sind oben im Abschnitt 'Definitionen' beschrieben.
• Da die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich oder unerwünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, wendet das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen der Nukleinsäuren in vorteilhafter Weise Techniken an, welche die Entfernung oder Exzision dieser Markergene ermöglichen. Ein derartiges Verfahren ist die sogenannte Co-Transformation. Das Co-Transformations-Verfahren verwendet zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und ein zweiter die Markergen(e) trägt. Ein großer Anteil an Transformanten empfängt oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beide Vektoren. Im Fall der Transformation mit Agrobakterien empfangen die Transformation in der Regel nur einen.
• Teil des Vektors, d. h. die von der T-DNA flankierte Sequenz, welche üblicherweise die Expressionskassette repräsentiert. Die Markergene können anschließend durch Ausführen von Kreuzungen aus der transformierten Pflanze entfernt werden. In einem anderen Verfahren werden in ein Transposon integrierte Markergene für die Transformation gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (bekannt als A_C/D_S-Technologie). Die Transformanten können mit einer Transposase-Quelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäurekonstrukt, welches die Expression einer Transposase vermittelt, transient oder stabil transformiert In einigen Fällen (ungefähr 10%), springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle heraus, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fallen muss das Markergen durch Ausführen von Kreuzungen elimiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, welche das Detektieren derartiger Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen; deren Vorteil besteht darin, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieses Typs ist das sogenannte Cre/Iox-System. Cre 1 ist eine Rekombinase, welche die zwischen den IoxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Wenn das Markergen zwischen den IoxP-Sequenzen integriert ist, wird es entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und zwar durch die Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Selbstverständlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen, wie Hefe, Pilze oder Bakterien, angewandt werden.
• Transgenisch/Transgen/Rekombinant
• Für die Zwecke der Erfindung bedeuten ”transgenisch”, ”Transgen” oder ”rekombinant”, zum Beispiel in Hinsicht auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, der die Nukleinsäuresequenz umfasst, oder einen Organismus, der mit den Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren gemäß der Erfindung transformiert ist, alle diejenigen Konstruktionen, die durch rekombinante Verfahren bewerkstelligt werden, in welchen entweder
• (a) die Nukleinsäuresequenzen, die in den Verfahren der Erfindung nützliche Proteine codieren, oder
• (b) genetische Steuerungsequenz(en), welche funktionsfähig mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz verknüpft sind, wie beispielsweise ein Promotor, oder
• (c) a) und b)
nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung lokalisiert sind oder durch rekombinante Verfahren modifiziert worden sind, wobei es möglich ist, dass die Modifikation zum Beispiel die Form einer Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotidresten annimmt. Es versteht sich, dass mit der natürlichen genetischen Umgebung der natürliche genomische oder chromosomale Locus bzw. Genort in der Ursprungspflanze oder das Vorhandensein in einer genomischen Bibliothek gemeint ist. Im Falle einer genomischen Bibliothek wird die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise zumindest teilweise beibehalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz mindestens auf einer Seite und besitzt eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, vorzugsweise mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, am stärksten bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der Nukleinsäuresequenzen mit der entsprechenden Nukleinsäuresequenz, welche ein in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliches Polypeptid codiert, wie oben definiert – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese Expressionskassette durch nicht-natürliche, synthetische (”künstliche”) Verfahren, wie zum Beispiel mutagene Behandlung, modifiziert wird. Geeignete Verfahren sind zum Beispiel in US 5 565 350 oder WO 00/15815 beschrieben.
• Es versteht sich daher, dass mit einer transgenen Pflanze für die Absichten der Erfindung, wie oben, gemeint ist, dass die im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Genort im Genom der Pflanze vorliegen, wobei es möglich ist, dass die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Wie erwähnt, bedeutet ”transgen” jedoch ebenfalls, dass, obwohl die erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren an ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz im Vergleich zur natürlichen Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Es versteht sich, dass ”transgen” vorzugsweise die Expression der Nukleinsäuren gemäß der Erfindung an einem unnatürlichen Genort im Genom, d. h. homolog, bedeutet, oder dass vorzugsweise eine heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen sind hierin erwähnt.
• Transformation
• Der Begriff ”Einbringung” oder ”Transformation”, wie hierin darauf Bezug genommen wird, beinhaltet den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des für den Transfer angewandten Verfahrens. Pflanzengewebe, das zur anschließenden klonalen Vermehrung in der Lage ist, ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem genetischen Konstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert, und eine gesamte Pflanze daraus regeneriert werden. Das gewählte, jeweilige Gewebe wird abhängig von den klonalen Propagationssystemen variieren, welche für die zu transformierende jeweilige Spezies verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebeziele schließen Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Callusgewebe, existierendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonmeristem und Hypokotylmeristem) ein. Das Polynukleotid kann transient oder stabil in eine Wirtszelle eingebracht und kann nicht-
• integriert, zum Beispiel als ein Plasmid, beibehalten werden. Alternativ dazu kann es in das Wirtsgenom integriert werden. Die resultierende, transformierte Pflanzenzelle kann dann zum Regenerieren einer transformierten Pflanze auf eine Weise, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, verwendet werden.
• Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenspezies ist heutezutage eine durchaus routinemäßige Technik. In vorteilhafter Weise kann ein beliebiges von mehreren Transformationsverfahren angewandt werden, um das Gen von Interesse in eine geeignete Vorfahrenzelle einzubringen. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren können für transiente oder für stabile Transformation angewandt werden. Transformationsverfahren beinhalten die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, welche die Aufnahme freier DNA erhöhen, direkte Injektion der DNA in die Pflanze, Beschuss mit einer Partikelkanone, Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen sowie Mikroprojektion. Man kann Verfahren auswählen unter dem Calcium/Polyethylenglykol-Verfahren für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 363-373); der Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al. (1985) Bio/Technol. 3, 1099-1102); der Mikroinjektion in Pflanzenmaterial hinein (Crossway, A., et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 179-185); dem Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Teilchen (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70), der Infektion mit (nicht-integrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, einschließlich transgener Nutzpflanzen, werden vorzugsweise durch Agrobacteriumvermittelte Transformation hergestellt. Ein vorteilhaftes Transformationsverfahren ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck ist es zum Beispiel möglich, den Agrobakterien zu gestatten, auf Pflanzensamen einzuwirken, oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien zu inokulieren. Es hat sich gemäß der Erfindung als besonders zweckmäßig erwiesen, zu gestatten, dass eine Suspension transformierter Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest auf die Blütenanlagen einwirkt. Die Pflanze wird anschließend weiter wachsen gelassen, bis die Samen der behandelten Pflanze erhalten werden (Clough und Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis schließen allgemein bekannte Verfahren für die Reistransformation ein, wie etwa diejenigen, welche in einem beliebigen von Folgendem beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6 (2): 271-282, 1994), wobei diese Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargelegt wären. Im Falle von Mais-Transformation ist das bevorzugte Verfahren beschaffen, wie entweder in Ishida et al. (Nat. Biotechnol. 14(6): 745-50, 1996) oder Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13-22, 2002) beschrieben, deren Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wären. Die Verfahren sind beispielsweise ferner in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143, sowie in Potrykus (Anno. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Die Nukleinsäuren oder das Konstrukt, welche(s) exprimiert werden sollen, wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der zum Transformieren von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711).
• Mit einem derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie etwa Pflanzen, welche als Modell herangezogen werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung nicht als Nutzpflanze betrachtet), oder Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, beispielsweise durch Eintauchen von zerquetschten Blättern oder zerhackten Blättern in einer Agrobakterienlösung und danach Kultivieren derselben in geeigneten Medien.
• Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist zum Beispiel von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877, beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38, bekannt.
• Zusätzlich zur Transformation von somatischen Zellen, welche dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, ist es ebenfalls möglich, die Zellen von Pflanzenmeristemen und insbesondere diejenigen Zellen, welche sich zu Gameten entwickeln, zu transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung, wodurch es zur Entstehung transgener Pflanzen kommt. So werden beispielsweise Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und Samen werden aus den sich entwickelnden Pflanzen erhalten. von denen ein gewisser Anteil transformiert und somit transgen ist [Feldman, KA, und Marks, MD (1987). Mol. Gen Genet. 208: 274-289; Feldmann, K., (1992). In: C. Koncz, N-H. Chua und J. Shell (Hrsg.), Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274-289]. Alternative Verfahren basieren auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und der Inkubation der Schnittstelle im Zentrum der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch transformierte Samen in ähnlicher Weise zu einem späteren Zeitpunkt erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol. Gen Genet., 245: 363-370). Ein besonders effektives Verfahren ist jedoch das Vakuuminfiltrationsverfahren mit seinen Modifikationen, wie dem ”floral dip”-Verfahren. Im Falle von Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N. (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194-1199], wohingegen im Fall des ”floral dip”-Verfahrens das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer tensidbehandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ, und Bent, AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. In beiden Fällen wird ein gewisser Anteil an transgenen Samen geerntet, und diese Samen können von nicht-transgenen Samen durch Kultivieren unter den oben beschriebenen selektiven Bedingungen unterschieden werden. Darüber hinaus besitzt die stabile Transformation von Plastiden Vorteile, weil Plastiden in den meisten Nutzpflanzen maternal vererbt werden, was das Risiko eines Transgen-Flusses durch Pollen verringert oder eliminiert. Die Transformation des Chloroplastengenoms wird im Allgemeinen durch ein Verfahren bewirkt, das in Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229] schematisch geschildert worden ist. Kurz gesagt, werden die zu transformierenden Sequenzen zusammen mit einem selektierbaren Markergen zwischen flankierende Sequenzen, die homolog zum Chloroplastengenom sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen lenken die ortsspezifische Integration in das Plastom. Plastidäre Transformation ist für viele verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden, und eine Übersicht erhält man in Bock (2001) "Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology". J. Mol. Biol., 21. Sep. 2001; 312(3): 425-38, oder Maliga, P. (2003) "Progress towards commercialization of plastid transformation technology". Trends Biotechnol. 21, 20-28. In jüngster Zeit ist über einen weiteren biotechnologischen Fortschritt in Form von markerfreien Plastidentransformanten, welche mittels eines transienten, cointegrierten Markergens hergestellt werden können, berichtet worden (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).
• T-DNA-Aktivierungs-Tagging
• T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, üblicherweise enthaltend einen Promotor (es kann sich auch um einen Translations-Enhancer oder einen Intron handeln), in die genomische Region des Gens von Interesse oder 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der codierenden Region eines Gens in einer derartigen Konfiguration, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Typischerweise wird die Regulierung der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor zerstört, und das Gen kommt unter die Kontrolle des neu eingebrachten Promotors. Der Promotor ist typischerweise in einer T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom inseriert, zum Beispiel durch Agrobacterium-Infektion, und führt zur modifizierten Expression von Genen nahe der inserierten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression von Genen nahe dem eingebrachten Promotor.
• TILLING
• Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnoligie, die zum Erzeugen und/oder Identifizieren von Nukleinsäuren nützlich ist, welche Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität codieren. TILLING erlaubt auch die Selektion von Pflanzen, welche derartige Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufzeigen, entweder hinsichtlich Stärke oder Lokalisierung oder Zeitgebung (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufzeigen, als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. TILLING vereinigt Hochdichte-Mutagenese mit Hochdurchsatz-Screeningverfahren. Die beim TILLING typischerweise befolgten Schritte sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei, GP, und Koncz, C (1992), in: Methods in Arabidopsis Research, Koncz, C, Chua, NH, Schell, J (Hrsg.), Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16-82; Feldmann et al., (1994) in: Meyerowitz. EM, Somerville. CR (Hrsg.), "Arabidopsis". Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137-172; Lightner, J., und Caspar, T. (1998) in: J. Martinez-Zapater, J. Salinas, (Hrsg.), Methods an Molecular Biology, Bd. 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91-104); (b) DNA-Präparation und Vereinigen bzw. Poolen von Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer Region von Interesse; (d) Denaturieren und Annealen, um die Bildung von Heteroduplexen zu gestatten; (e) DHPLC, wobei die Gegenwart eines Heteroduplex in einem Pool als ein Extra-Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifikation des Mutanten-Individuums; und (g) Sequenzieren des Mutanten-PCR-Produkts. Verfahren für TILLING sind im Fachgebiet allgemein bekannt (McCallum et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18: 455-457; übersichtmäßig zusammengefasst von Stemple (2004) Nat. Rev. Genet. 5(2): 145-50).
• Homologe Rekombination
• Homologe Rekombination gestattet die Einbringung einer gewählten Nukleinsäure in einem Genom an einer definierten gewählten Position. Homologe Rekombination ist eine Standardtechnologie, die in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen, wie Hefe oder das Moos Physcomitrella, routinemäßig angewandt wird. Verfahren zur Durchführung homologer Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen beschrieben worden (Offringa et al. (1990) EMBO J. 9(10): 3077-84) sondern auch für Nutzpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al. (2002) Nat. Biotech. 20(10): 1030-4; Iida und Terada (2004) Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132-8), und es existieren Vorgehensweisen, welche, ungeachtet des Zielorganismus, allgemein anwendbar sind (Miller et al., Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007).
• Ertrag
• Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen einen messbaren Gewinn von wirtschaftlichem Wert, typischerweise in Bezug auf eine spezifizierte Nutzpflanze, ein Gebiet und eine Zeitperiode. Individuelle Pflanzenteile tragen auf Basis ihrer Anzahl, Größe und/oder Gewicht direkt zum Ertrag bei, oder die tatsächliche Ausbeute ist der Ertrag pro Quadratmeter für eine Nutzpflanze und pro Jahr, was mittels Dividieren der Gesamtproduktion (einschließend sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion) durch die bepflanzten Quadratmeter bestimmt wird. Der Begriff ”Ertrag” an einer Pflanze kann sich auf vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Sprossbiomasse), auf die reproduktiven Organe und/oder auf Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze beziehen.
• Frühwuchskraft
• ”Frühwuchskraft” bezieht sich auf aktives gesundes, richtig ausgewogenes Wachstum, insbesondere während der frühen Stadien des Pflanzenwachstums, und kann aus einer erhöhten Pflanzenfitness resultieren, beispielsweise aufgrund dessen, dass die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. Optimieren der Verwendung von Energieresourcen und der Aufteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit Frühwuchskraft zeigen außerdem erhöhtes Setzlings-Überleben und eine bessere Hervorbringung der Nutzpflanze, was häufig zu sehr gleichmäßigen Feldern (wobei die Nutzpflanze in gleichmäßiger Weise wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen die verschiedenen Stadien der Entwicklung im Wesentlichen zur gleichen Zeit erreicht) und oftmals zu einem besseren und höheren Ertrag führt. Deshalb kann die Frühwuchskraft durch Messen verschiedener Faktoren, wie etwa Tausendkerngewicht, Prozentsatz der Keimung, Prozentsatz der Emergenz, Setzlingswachstum, Setzlingshöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und vielen anderen, bestimmt werden.
• Erhöhen/Verbessern/Steigern
• Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind austauschbar und sollen im Sinne der Patentanmeldung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, weiter bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wie hierin definiert, bedeuten.
• Samenertrag
• Erhöhter Samenertrag kann sich als eines oder mehrere der folgenden manifestieren: a) eine Erhöhung der Samenbiomasse (Gesamtsamengewicht), welche auf Einzelsamen-Basis und/oder pro Pflanze und/oder pro Quadratmeter bezogen sein kann; b) erhöhte Anzahl von Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl von (gefüllten) Samen; d) erhöhte Samen-Füllrate (welche als das Verhältnis zwischen der Zahl gefüllter Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Ernteindex, der als ein Verhältnis des Ertrags an erntefähigen Teilen, wie Samen, dividiert durch die Gesamtbiomasse, ausgedrückt wird; und f) erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW), und g) erhöhte Anzahl an Hauptrispen, was aus der gezählten Zahl gefüllter Samen und deren Gesamtgewicht extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKW kann aus erhöhter Samengröße und/oder Samengewicht resultieren, und kann auch aus einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße resultieren.
• Eine Erhöhung im Samenertrag kann sich auch als eine Erhöhung in Samengröße und/oder Samenvolumen manifestieren. Ferner kann sich eine Erhöhung des Samenertrags auch als eine Erhöhung bei Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder Samenumfang manifestieren. Erhöhter Samenertrag kann auch zu modifierter Architektur führen, oder kann aufgrund modifierter Architektur auftreten.
• Grünheits-Index
• Der ”Grünheits-Index”, wie hierin verwendet, wird aus Digitalbildern von Pflanzen berechnet. Für jeden Pixel, der zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehört, wird das Verhältnis des Grünwerts gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell zum Codieren von Farbe) berechnet. Der Grünheits-Index wird als der Prozentsatz an Pixeln ausgedrückt, für den das Grün-zu-Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit wird der Grünheits-Index von Pflanzen in der letzten Abbildung vor dem Aufblühen gemessen. Im Gegensatz dazu wird der Grünheits-Index von Pflanzen unter Dürrestress-Wachstumsbedingungen in der ersten Abbildung nach der Dürre gemessen.
• Pflanze
• Der Begriff ”Pflanze”, wie hierin verwendet, umfasst ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen sowie Pflanzenteile, einschließlich Samen, Sprosse, Stengel, Blätter Wurzeln (einschließlich Knollen) Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst. Der Begriff ”Pflanze” beinhaltet außerdem Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Callusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst.
• Zu Pflanzen, welche in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen- einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen Zierpflanzen Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher, die aus der Liste ausgewählt sind, die unter anderem Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölsamenraps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus Iongan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidum spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticale sp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., umfasst.
• Ausführliche Beschreibung der Erfindung
• Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein TFL1_Like-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein TFL1_like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, und gegebenenfalls das Selektieren nach Pflanzen mit gesteigertem Samenertrag umfasst.
• Weiterhin ist es nun überraschenderweise festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein R5PI-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein R5PI-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, und gegebenenfalls das Selektieren nach Pflanzen mit gesteigertem Samenertrag umfasst.
• Überraschenderweise ist es nun ferner festgestellt worden, dass die Erhöhung der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäuresequenz, welche ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• In Bezug auf Znf-A20/AN1-Polypeptide stellt die Erfindung auch bislang unbekannte Znf A20/AN1-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen sowie Znf A20/AN1-Polypeptide bereit.
• Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher eine isolierte Nukleinsäuresequenz bereitgestellt, umfassend:
• (i) eine Nukleinsäuresequenz, eine wie durch eine beliebige von SEQ ID NRs: 280 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334 oder 336 repräsentiert;
• (ii) das Komplement einer Nukleinsäuresequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NRs: 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334 oder 336 repräsentiert;
• (iii) eine Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu der Polypeptidsequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NRs: 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124 oder 126 repräsentiert;
• Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, umfassend:
• (i) eine Polypeptidsequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NRs: 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335 oder 337;
• (ii) eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu der Polypeptidsequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NRs: 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335 oder 337 repräsentiert;
• (iii) Derivate von beliebigen der in (i) oder (ii) oben angegebenen Polypeptidsequenzen.
• Weiterhin ist es nun überraschenderweise festgestellt worden, dass die Erhöhung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, welche ein PHD-zf-Polypeptid wie hierin definiert, codiert, Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen von samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide stellt die Erfindung auch bislang unbekannte, PHD-zf-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen sowie PHD-zf-Polypeptide bereit Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das aus folgendem gewählt wird:
• (i) eine Nukleinsäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 475, SEQ ID NR: 477, SEQ ID NR: 479, SEQ ID NR: 481, SEQ ID NR: 483, SEQ ID NR: 485, SEQ ID NR: 487, SEQ ID NR: 489 repräsentiert;
• (ii) das Komplement einer Nukleinsäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 475, SEQ ID NR: 477, SEQ ID NR: 479, SEQ ID NR: 481, SEQ ID NR: 483, SEQ ID NR: 485, SEQ ID NR: 487, SEQ ID NR: 489 repräsentiert;
• (iii) eine Nukleinsäuresequenz, codierend ein PHD-zf-Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu der durch SEQ ID NR: 348 repräsentierten Polypeptidsequenz, und mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 491 (welche die Konservierte Domäne bzw. 'Conserved Domain' von SEQ ID NR: 348 repräsentiert).
• Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das aus folgendem gewählt wird:
• (i) eine Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 476, SEQ ID NR: 478, SEQ ID NR: 480, SEQ ID NR: 482, SEQ ID NR: 484, SEQ ID NR: 486, SEQ ID NR: 488, SEQ ID NR: 490;
• (ii) eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Polypeptidsequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NR: 476, SEQ ID NR: 478, SEQ ID NR: 480, SEQ ID NR: 482, SEQ ID NR: 484, SEQ ID NR: 486, SEQ ID NR: 488, SEQ ID NR: 490 repräsentiert;
• (iii) Derivate von beliebigen der in (i) oder (ii) oben angegebenen Polypeptidsequenzen.
• Weiterhin ist es nun überraschenderweise festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein REF/ALY-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein REF/ALY-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• In Bezug auf TFL1-like-Polypeptide erfolgt ein bevorzugtes Verfahren für das Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid codiert, durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die Erhöhung der Expression beträgt in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mehr als das 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100-fache, oder mehr, des Spiegels der Expression eine TFL1-like-Gens in der natürlichen Pflanze. Verfahren zur Messung des Expressionsspiegels eines Gens sind im Fachgebiet allgemein bekannt (Sambrook et al. 1989).
• in Bezug auf R5PI-Polypeptide erfolgt ein bevorzugtes Verfahren für das Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein R5PI-Polypeptid codiert, durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein R5PI-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die Erhöhung der Expression beträgt in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mehr als das 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100-fache des Spiegels der Expression des gleichen und/oder des homologen R5PI-Gens in einer Pflanze, die nicht modifiziert worden ist, um die Expression dieses R5PI-Gens zu erhöhen. Verfahren zur Messung des Expressionsspiegels eines Gens sind im Fachgebiet allgemein bekannt (Sambrook et al. 1989).
• In Bezug auf Znf A20/AN1-Polypeptide erfolgt ein bevorzugtes Verfahren für das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide erfolgt ein bevorzugtes Verfahren für das Erhöhen der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid codiert, durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, welche ein PHD-zf-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
• In Bezug auf REF/ALY-Polypeptide erfolgt ein bevorzugtes Verfahren für das Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die ein REF/ALY-Polypeptid codiert, durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein REF/ALY-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die Erhöhung der Expression beträgt in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mehr als das 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 fache des Spiegels der Expression der gleichen und/oder der homologen Nukleinsäure, die ein REF/ALY-Polypeptid codiert, in einer Kontrolle. Verfahren zur Messung des Expressionsspiegels eines Gens sind im Fachgebiet allgemein bekannt (Sambrook et al. 1989; John Wiley & Sons 1989, und jährliche Aktualisierungen).
• In Bezug auf TFL1-like-Polypeptide versteht sich jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein TFL1-like-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die zum Codieren eines solchen TFL1-like-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher nützlich bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung ist) ist jedwede Nukleinsäure, welche den Typ von Protein codiert, der jetzt beschrieben wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”TFL1-like-Nukleinsäure” oder ”TFL1-like-Gen”.
• Ein ”TFL1-like-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, das eine Phosphatidylethanolamin-Bindungsprotein(PEBP)-Domäne (Domänen-Zugangsnummer in Pfam: PFAM01161) umfasst und einen konservierten Histidin(His oder H)- oder einen Tyrosin(Tyr oder Y)-Aminosäurerest an einer Stelle, äquivalent zu jener von Aminosäurerest His86 (H86) in SEQ ID NR: 2, sowie einen konservierten Asparaginsäure(D)-Aminosäure- oder einen Glutaminsäure(Glu)-Aminosäurerest an einer Stelle, äquivalent zu jener von Aminosäurerest Asp142 (D142) in SEQ ID NR: 2 aufweist.
• His86 bezeichnet den Histidinrest, der an Aminosäureposition 86 in SEQ ID NR: 2 gefunden wird. In gleicher Weise bezeichnet Asp142 (D142) den Asparaginsäure-Aminosäurerest, der an Aminosäureposition 142 in SEQ ID NR: 2 gefunden wird Ein bevorzugtes TFL1-like Polypeptid der Erfindung bezieht sich auf jedwedes Polypeptid, das folgendes umfasst:
• (ii) eine Phosphatidylethanolamin-Bindungsprotein(PEBP)-Domäne (Domänen-Zugangsnummer in Pfam: PFAM01161), vorzugsweise wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A1 vorhanden, weiter bevorzugt wie repräsentiert durch die Sequenz, die zwischen den Aminosäuren 66-88 in SEQ ID NR: 2 enthalten ist, noch weiter bevorzugt wie in SEQ ID NR: 26 (P.trichocarpa_575797_BFT) vorhanden; und
• (iii) einen konservierten Histidin(His oder H)- oder vorzugsweise einen Tyrosin (Tyr oder Y)-Rest an einer Stelle, äquivalent zu jener von Aminosäurerest His86 (H86) in SEQ ID NR: 2, sowie einen konservierten Asparaginsäure(D)-Aminosäure- oder vorzugsweise einen Glutaminsäure(Glu)-Aminosäurerest an einer Stelle, äquivalent zu jener von Aminosäurerest Asp142 (D142) in SEQ ID NR: 2.
• Alternativ dazu, bezieht sich ein bevorzugtes TFL1-like-Polypeptid der Erfindung auf ein beliebiges Polypeptid, umfassend:
• (ii) eine Proteindomäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu der PEBP-Domäne in SEQ ID NR: 26; und
• (iii) einen konservierten Histidin(His oder H)- oder vorzugsweise einen Tyrosin(Tyr oder Y)-Rest an einer Stelle, äquivalent zu jener von Aminosäurerest His86 (H86) in SEQ ID NR: 2, sowie einen konservierten Asparaginsäure(D)-Aminosäure- oder vorzugsweise einen Glutaminsäure(Glu)-Aminosäurerest an einer Stelle, äquivalent zu jener von Aminosäurerest Asp142 (D142) in SEQ ID NR: 2.
• Alternativ dazu, bezieht sich ein bevorzugtes TFL1-like-Polypeptid der Erfindung auf ein beliebiges Polypeptid, umfassend:
• (i) eine Phosphatidylethanolamin-Bindungsprotein(PEBP)-Domäne (Domänen-Zugangsnummer in Pfam: PFAM01161), vorzugsweise wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A1 vorhanden, weiter bevorzugt wie repräsentiert durch die Sequenz, die zwischen den Aminosäuren 66 – 88 in SEQ ID NR: 2 enthalten ist, noch weiter bevorzugt wie in SEQ ID NR: 25 vorhanden wobei in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 Aminosäuren durch eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise durch eine konservative Aminosäure, substituiert sein können; und
• (ii) einen konservierten Histidin(His oder H)- oder vorzugsweise einen Tyrosin(Tyr oder Y)-Aminosäurerest an einer Stelle, äquivalent zu jener von Aminosäurerest His86 (H86) in SEQ ID NR: 2, sowie einen konservierten Asparaginsäure(D)-Aminosäure- oder vorzugsweise einen Glutaminsäure(Glu)-Aminosäurerest an einer Stelle äquivalent zu jener von Aminosäurerest Asp142 (D142) in SFQ ID NR: 2.
• Die Phosphatidylethanolamin-Bindungsprotein(PEBP)-Domäne (Domänen-Zugangsnummer in Pfam: PFAM01161, entsprechend der Interpro-Eintragsnummer IPR008914) ist eine konservierte Sequenz von ungefähr 145 Aminosäuren Länge, die in Phosphatidylethanolamin-Bindungsproteinen vorhanden ist. Die Struktur einer PEBP-Domäne besteht aus einem großen zentralen Beta-Blatt, flankiert von einem kleineren Beta-Blatt auf einer Seite, und einer Alpha-Helix auf der anderen. Sequenzalignments (siehe Beispiele-Abschnitt) zeigen zwei konservierte Zentralregionen, welche eine Consensus-Signatur für die PEBP-Familie bilden. Diese zwei Regionen bilden einen Teil der Liganden-Bindungsstelle, welche verschiedene anionische Gruppen aufnehmen kann. Eine Phosphatidylethanolamin-Bindungsprotein(PEBP)-Domäne wird durch die Aminosäuresequenz repräsentiert, die in SEQ ID NR: 2, gelegen zwischen den Aminosäuren 12-170, vorgefunden wird. Die in PEBP-Domänen gefundene konservierte Phosphatidyltehanolamin-Bindungsstelle kann durch die Sequenz repräsentiert werden, welche zwischen den Aminosäuren 66-88 in SEQ ID NR: 2 enthalten ist.
• Ein bevorzugtes TFL1-Polypeptid, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, umfasst eine Domäne mit in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zur PEBP-Domäne in SEQ ID NR: 2, vorausgesetzt dass das Polypeptid die konservierten Aminosäurereste, wie oben dargelegt, umfasst.
• TFL1-like-Polypeptide, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, besitzen einen konservierten Aminosäurerest an einer Position, äquivalent zum Histidin 86 von SEQ ID NR: 2 und an einer Position, äquivalent zum Rest 142 von SEQ ID NR: 2. Werkzeuge zum Bestimmen von Aminosäureresten in einem TFL-like-Polypeptid an einer Stelle, die zu jener der Aminosäurereste His86 (H86) und Asp147 (D147) in SFQ ID NR 7 äquivalent ist, sind für den Fachmann auf dem Gebiet leicht verfügbar. Zum Beispiel erlaubt ein Vergleich in einem Sequenzalignment zweier Polypeptide die Identifizierung der äquivalenten Aminosäuren in den zwei Polypeptiden an einer gegebenen Stelle. Bevorzugte Verfahren zur Ausführung des Alignments sind im Fachgebiet allgemein bekannt und benutzen vorzugsweise den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453). Alternativ dazu kann ein lokales Alignment durchgeführt werden, um äquivalente Reste unter Polypeptiden zu identifizieren. Für lokale Alignments wird der Smith-Waterman-Algorithmus bevorzugt (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol. 147(1): 195-71). Wieterhin können multiple Alignments von Proteinsequenzen angewandt werden, um Aminosäurereste an äquivalenten Stellen zu identifizieren. Die Identifizierung der konservierten Histidin- und Asparaginsäure-Aminosäurereste in TFL1-like-Polypeptiden an einer Stelle, die zu jener der Aminosäurereste His86 (H86) und Asp142 (D142) in SEQ ID NR: 2 äquivalent ist, wird im Beispiele-Abschnitt veranschaulicht. Alternativ dazu können äquivalente Aminosäurereste zwischen Polypeptiden durch Vergleichen ihrer Tertiärstrukturen ermittelt werden (Ahn et al. 2006. EMBO, 25, 605-614).
• Darüber hinaus können in den Verfahren der Erfindung nützliche TFL1-like-Polypeptide eine konservierte Aminosäureregion umfassen, entsprechend dem Segment B, wie von Anh et al. 2007 definiert, das charakteristische Aminosäuretriaden umfasst. Vorzugsweise umfassen in den Verfahren der Erfindung nützliche TFL1-like-Polypeptide eine konservierte Aminosäuretriade, die an einer zu den Aminosäureresten 152-154 von SEQ ID NR: 2 äquivalenten Position befindlich ist und, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, durch eine beliebige von SEQ ID NR: 138-139, SEQ ID NR: 129-139 (YNG, ENG, END, ENE, ENG, DNG, QND, VND, UND, ENN und EYD) repräsentiert wird.
• Ferner umfasst ein im Verfahren der Erfindung nützliches TFL1-like-Polypeptid typischerweise A. eine Sequenz mit in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% zu einem beliebigen der folgenden Motive:
• (i) Motiv 1 (SEQ ID NR: 121: EHI/LHV)
• (ii) Motiv 2 (SEQ ID NR: 122: IPGTTD)
• (iii) Motiv 3 (SEQ ID NR: 123: (I/V/A)GIHRF/Y)
• (iv) Motiv 4 (SEQ ID NR: 124: TRRGSVVSVPSYRDQ)
• (v) Motiv 5 (SEQ ID NR: 125: TAARRR/K)
oder alternativ.
• B. ein Motiv mit einer Sequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NR: 121 bis SEQ ID NR: 125 repräsentiert, worin, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, 0, 1, 2, 3, 4, 5 Aminosäuren durch eine beliebige Aminosäure, vorzugsweise durch eine konservative Aminosäure, subsituiert sein können.
• Vorzugsweise umfasst ein im Verfahren der Erfindung nützliches TFL1-like-Polypeptid Motiv 1, 2, 3 und 5, weiter bevorzugt Motiv 1, 2, 3 und 5, wie in SEQ ID NR: 26 (P.trichocarpa_575797_BFT) vorhanden.
• Alternativ dazu, bezieht sich ein TFL1-like-Polypeptid der Erfindung auf ein beliebiges Ortholog, Paralog oder Homolog eines TFL1- oder eines BFT-Proteins. TFL- und BFT-Polypeptide sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
• Alternativ weist das Homolog eines TFL1-like-Proteins in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 2, auf, vorausgesetzt dass das homologe Protein die konservierten Aminosäurereste, wie oben dargelegt, umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen von reifen Proteinen (d. h. ohne Berücksichtigen von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden) ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
• Alternativ dazu, besitzt ein in den Verfahren der Erfindung nützliches, bevorzugtes Polypeptid eine Sequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Carmona et al. 2007 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von TFL1-like-Polypeptiden, die die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt. Weiter bevorzugt clustert die Polypeptidsequenz mit der das Arabidopsis-ATC-, das Anthirrinum-CEN-, das Lycopersicum-SP-, das Nicotiana-CET2- und das Vitis-VvTFL1A-Polypeptid umfassenden Klade. Die 2 von Carmona et al., 2007, ist hierin in 2A abgebildet.
• Alternativ dazu, besitzt ein in den Verfahren der Erfindung nützliches, noch weiter bevorzugtes Polypeptid eine Sequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Igasaki et al. 2008 (Plant Cell Physiol. 49(3): 291-300,) abgebildet ist, verwendet wird, im TFL1-Ast, weiter bevorzugt sogar im BFT (”Brother of FT”)-Ast, weiter bevorzugt bei BFT einordnen lässt. Die 2 von Igasaki et al., 2008, ist in der 2B abgebildet.
• In Bezug auf R5PI-Polypeptide, führt die erhöhte Expression einer ein R5PI-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze vorzugsweise zu erhöhten Spiegeln an D-Ribose-5-phosphat-Isomerase-Aktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Weiter bevorzugt sind die Spiegel an D-Ribose-5-phosphat-Isomerase-Aktivität im Cytosol der Zelle erhöht. Am stärksten bevorzugt ist die Aktivität der cytosolischen Fraktion des R5PI-Polypeptids erhöht, wenn sie mit der chloroplastidären Fraktion verglichen wird. Verfahren zum Fraktionieren des Proteingehalts von zellulären Kompartimenten, wie Cytosol und Chloroplast einer Pflanzenzelle, sind im Fachgebiet allgemein bekannt (Ausubel et al. 1994).
• Jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” versteht sich so, dass ein R5PI-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die zum Codieren eines solchen R5PI-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher nützlich bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung ist) ist jedwede Nukleinsäure, welche den Typ von Protein codiert, der jetzt beschrieben wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”R5PI-Nukleinsäure” oder ”R5PI-Gen”.
• Ein ”R5PI-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, das eine Rib_5-P_isom_A(RiPA)-Domäne mit der Zugangsnummer in pfam: PFAM06026) und mit Ribose-5-phosphat-Isomerase-Aktivität umfasst.
• Ribose-5-phosphat-Isomerase (EC 5.3.1.6) ist ein Enzym, das die chemische Reaktion für die Interkonversion von D-Ribose-5-phosphat zu D-Ribulose-5-phosphat katalysiert. Verfahren zur Messung von Ribose-5-phosphat-Isomerase-Aktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt (Jung et al. 2000 Arch. Biochm. Biophys 373, 409-17; Gontero et al. 1988 173, 437-43).
• Die Rib_5-P_isom_A(RIPA)-Domäne (mit Zugangsnummer in pfam: PFAM06026) bezieht sich auf eine konservierte Aminosäuresequenz von etwa 170 Aminosäuren Länge, welche in Ribose-5-phosphat-Isomere A(Phosphoriboisomerase A)-Polypeptiden vorhanden ist. Die Tertiärstruktur einer Anzahl von Phosphoriboisomerase-A-Polypeptiden ist aufgeklärt worden (Holmes et al; 2006 Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun; 62(Pt 5): 427-431).
• Eine Rib_5-P_isom_A(RiPA)-Domäne wird durch die zwischen den Aminosäureresten 77-261 von SEQ ID NR: 141 gelegene Aminosäuresequenz repräsentiert. Die RiPA-Domäne umfasst ein konserviertes Sequenzmotiv DGADE (SEQ ID NR: 206), entsprechend den Aminosäureresten 111-115 in SEQ ID NR: 141, welche Teil der aktiven Stelle des Phosphoriboisomerase A-Enzyms sind.
• Ein bevorzugtes, in den Verfahren der Erfindung nützliches R5PI-Polypeptid umfasst eine Domäne mit in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der RIPA-Domäne in SEQ ID NR: 141 (SEQ ID NR: 204).
• Ferner umfassen Phosphoriboisomerase A-Enzyme typischerweise die folgenden konservierten Aminosäuremotive:
  Motiv 6: GXGXGST
  Motiv 7: DGADE
  Motiv 8: KG×G(G/A)
  Motiv 9: GV(V/I)(E/D)HG(M/L)F
• Ein bevorzugtes R5PI-Polypeptid, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, umfasst eines oder mehrere beliebige der folgenden Motive:
• (i) Motiv 1: GXGXGST (SEQ ID NR: 205), worin 1, 2 oder 3 Reste durch eine beliebige Aminosäure substituiert sein können.
• (ii) Motiv 2: DGADE (SEQ ID NR: 206), worin 1, 2 oder 3 Reste durch eine beliebige Aminosäure substituiert sein können.
• (iii) Motiv 3: KG×G(G/A) (SEQ ID NR: 207), worin 1, 2 oder 3 Reste durch eine beliebige Aminosäure substituiert sein können.
• (iv) Motiv 4: GV(V/I)(E/D)HG(M/L)F, (SEQ ID NR: 208), worin 1, 2 oder 3 Reste durch eine beliebige Aminosäure substituiert sein können.
• Alternativ dazu besitzt das Homolog eines R5PI-Proteins in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 141.
• Vorzugsweise ist das in den Verfahren der Erfindung nützliche R5PI-Polypeptid ein solches, das sich, wenn es in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 5 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe I, welche die durch SEQ ID NR: 141 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
• In Bezug auf Znf-A20/AN1-Polypeptide, versteht sich jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein Znf-A20/AN1-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäuresequenz” versteht sich so, dass eine Nukleinsäuresequenz gemeint ist, die zum Codieren eines solchen Znf-A20/AN1-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäuresequenz, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher nützlich bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung ist) ist jedwede Nukleinsäuresequenz, welche den Typ von Polypeptid codiert, der jetzt beschrieben wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”Znf-A20/AN1-Nukleinsäuresequenz” oder ”Znf-A20/AN1-Gen”.
• Ein ”Znf-A20/AN1-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, umfassend: (i) mindestens eine A20-Typ-Zinkfinger-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR00Z653 (Prosite-Zugangsnummer PS51036); und (ii) mindestens eine AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR000058 (ProSite-Zugangsnummer PS51039).
• Alternativ oder zusätzlich, bezieht sich ein ”Znf A20/AN1-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf ein beliebiges Polypeptid, umfassend: (i) eine Domäne mit mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer A20-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 338 oder durch SEQ ID NR: 339 repräsentiert; und (ii) eine Domäne mit mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 340, oder durch SEQ ID NR: 341, repräsentiert.
• Alternativ oder zusätzlich bezieht sich ein ”Znf A20/AN1-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf ein beliebiges Polypeptid, das, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem Znf A20/AN1-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 213 oder durch SEQ ID NR: 215 repräsentiert, oder zu beliebigen der hierin in Tabelle A3 angegebenen Volllängen-Polypeptidsequenzen aufweist.
• Alternativ oder zusätzlich dazu, umfasst ein ”Znf A20/AN1-Polypeptid” eine A20-Zinkfinger-Domäne und eine AN1-Zinkfinger-Domäne, welche in einem Hefe-Zwei-Hybrid-Wechselwirkungs-Assay miteinander interagieren (Kanneganti et al. (2008) Plant Molec. Biol. 66: 445-462).
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide, versteht sich jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäuresequenz” versteht sich so, dass eine Nukleinsäuresequenz gemeint ist, die fähig ist zum [....] Nukleinsäuresequenz” oder ”PHD-zf-Gen”.
• Ein ”PHD-zf-Polypeptid” wie hierin definiert bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, umfassend (i) in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer ”Conserved Domain”, wie durch SEQ ID NR: 491 repräsentiert; und (ii) in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Pflanzen-Homeodomäne-Zinkfinger(PHD-zf)-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR001965, wie durch SEQ ID NR: 492 repräsentiert.
• Außerdem umfasst ein ”PHD-zf-Polypeptid”, wie hierin definiert, ferner eines oder mehrere von: (i) einer vorhergesagten Transmembran-Domäne; (ii) einem E/D-reichen Motiv; und (iii) einem Zinkfinger mit der Consensus-Sequenz CXXC_8-21CXXC₄HXXC_12-46CXXC, worin C für Cys steht, und H für His steht.
• Alternativ oder zusätzlich bezieht sich ein ”PHD-zf-Polypeptid” wie hierin definiert auf eine beliebige Polypeptidsequenz mit in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 348 repräsentiert.
• Alternativ oder zusätzlich bezieht sich ein ”PHD-zf-Polypeptid” wie hierin definiert auf ein beliebiges Polypeptid mit in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A4 hierin angegeben sind, [codierend ein solches PHD-zf-Polypeptid]. Die Nukleinsäuresequenz, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher nützlich bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung ist) ist jedwede Nukleinsäuresequenz, welche den Typ von Polypeptid codiert, der jetzt beschrieben wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”PHD-zf” In Bezug auf REF/ALY-Polypeptide versteht sich jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” so, dass ein REF/ALY-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die zum Codieren eines solchen REF/ALY-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher nützlich bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung ist) ist jedwede Nukleinsäure, welche den Typ von Protein codiert, der jetzt beschrieben wird, hierin nachstehend ebenfalls bezeichnet als ”REF/ALY-Nukleinsäure” oder ”REF/ALY-Gen”.
• Ein ”REF/ALY-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, das eine RRM(RNA Recognition Motif)-Domäne umfasst. Ferner umfasst ein ”REF/ALY-Polypeptid” ein oder mehrere Proteinmotive mit in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einem konservierten Proteinmotiv, gewählt aus:
• (i) Motiv 10, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 540 (SAEDLDADLDKYHS)
• (ii) Motiv 11, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 541 (LDMSLDDMIAKNRK)
• (iii) Motiv 12, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 542 (KAPESTWGHDMF)
• (iv) Motiv 13, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 543 (WQHDMY)
• (v) Motiv 14, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 544 (KLYISNLDYGV)
• Die Motive 10, 11, 12, 13 und 14 umfassen ferner eine Sequenz, wie durch SEQ ID NR: 540, 541, 542, 543 bzw. 544 repräsentiert, worin ein beliebiger Aminosäurerest durch einen konservativen Aminosäurerest gemäß Tabelle 1 substituiert ist.
• Beispiele von Varianten der konservierten Motive 10 und 11, wie in REF/ALY-Polypeptiden, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, vorgefunden, sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3.

  REF/ALY-Polypeptid SEQ ID NR:	Motiv 10	Motiv 11
  498	SAEDLDADLDKYHSGDM	LDMSLDDMIAKNRK
  512	SAEELDAELEKYHAQGA	IDMSLDDIIKNNKK
  530	SAEELDAELEKYHAQGT
  534	SAEELDAELEKYHAQGT	LDMSLEDIIKSNKK
  520	SAEELDADLEKYHADAM	LDMTLDDIIKNNKK
  536	STEELDADLEKYHADAM	LDMTLDDIIKNNKK
  538	KNSMLIWRSIMLMRCRP	LDMTLDDIIKNNKK
  506	ADDLDADLEKYHAEAM	MDMSLDDIIKNNKK
  516	SAEDLDAELEKYHAEAM	LDMTLEDIIKNNKK
  508	AEDLDADLEKYHAEAM	LDMTLEDIIKNNKK
  518	AEDLDADLMKYHTEAM	LDVSLDDLIKRNKS
  526	AEDLDADLMKYHTEAM	LDMTLDDLIKKNKT
  500	TAEDLDADLEKYHAEAM	LDVSLDDLIKRNKS
  502	AEDLDADLEKYHSEAM	LDMSLDDIIENNRK
  522	AEDLDADLEKYHSEAM	LDMSLDDIIKNNKK

• In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Motiv 10 am C-Terminus und das Motiv 11 am N-Terminus des in den Verfahren der Erfindung nützlichen REF/ALY-Polypeptids befindlich.
• In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das REF/ALY-Polypeptid zwei Glycin-reiche Regionen, umfassend eine variierende Anzahl an Arginin-Glycin- oder Glycin-Arginin(GR oder RG)-Dipeptid. Vorzugsweise flankieren die Glycin-reichen Regionen die RRM-Domäne. In der Regel beläuft sich die Anzahl an GR- oder RG-Dipeptiden, die im REF/ALY-Polypeptid enthalten sind, auf 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20.
• RRM-Domänen sind im Fachgebiet allgemein bekannt und bestehen aus ungefähr 80-90 Aminosäuren; sie weisen eine Struktur auf, die aus vier Strängen und zwei Helizes, angeordnet in einem Alpha/Beta-Sandwich besteht, wobei während der RNA-Bindung manchmal eine dritte Helix vorhanden ist. RRM-Domäne-haltige Proteine weisen eine modulare Struktur auf. RRM-Domänen können mit Hilfe von SMART (a Simple Modular Architecture Research Tool: Identification of signaling domains, Schultz et al. PNAS, 95, 5857-5864 (1998), siehe ebenfalls: Letunic et al., Recent improvements to the SMART domainbased sequence annotation resource (Nucleic Acids Res. 30(1), 242-244)) identifiziert werden, oder, alternativ dazu, können in einer Polypeptidsequenz vorhandene RRM-Domänen durch Scannen von Datenbanken, wie Interpro oder pfam, gefunden werden. Der Beispiele-Abschnitt gibt die Ergebnisse an, die beim Durchrastern der Datenbanken Interpro und Pfam mit SEQ ID NR: 498 erhalten werden.
• Die in den Verfahren der Erfindung nützlichen REF/ALY-Polypeptide umfassen eine Domäne, die typischerweise im zentralen Teil des Proteins lokalisiert ist und in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der RRM-Domäne von SEQ ID NR: 498, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 539 (KLYISNLDYGYMNEDIKELFAEVGELKRYTVHFDRSGRSKGTAEVVYSRRGDALAAVKKYNDVQLDGKPMKIE) aufweist.
• Alternativ dazu, besitzt das Homolog eines in den Verfahren der Erfindung nützlichen REF/ALY-Proteins in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 498, vorausgesetzt dass das homologe Protein die konservierten Motive, wie oben dargelegt, umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen von reifen Proteinen (d. h. ohne Berücksichtigen von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden) ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
• Vorzugsweise lässt sich die Polypeptidsequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 16 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe 1 von REF/ALY-Polypeptiden, die die durch SEQ ID NR: 498 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind im Abschnitt ”Definitionen” hierin definiert. Es existieren Spezialdatenbanken für die Identifizierung von Domänen, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (in:) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Hrsg.: Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., S. 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134-D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002)). Eine Auswahl an Werkzeugen für die Analyse von Proteinsequenzen in silico ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server (Schweizer Institut für Bioinformatik; Gasteiger et al., "ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis", Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788 (2003)) verfügbar. Domänen oder Motive können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie etwa durch Sequenzalignment, identifiziert werden.
• In Bezug auf Znf-A20/AN1-Polypeptide ist eine Analyse der Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 213 nachstehend im Beispiele-Abschnitt hierin präsentiert. Zum Beispiel umfasst ein Znf-A20/AN1-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 213 oder durch SEQ ID NR: 215, mindestens eine A20-Typ-Zinkfinger-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR002653 (ProSite-Zugangsnummer PS51036) und mindestens eine AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR000058 (ProSite-Zugangsnummer PS51039) in der InterPro-Domänen-Datenbank. Domänen können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie etwa durch Sequenzalignment, identifiziert werden. Ein Alignment der A20-Typ-Zinkfinger-Domäne der Polypeptide von Tabelle A3 hierin ist in 9 gezeigt, und ein Alignment der AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne der Polypeptide von Tabelle A3 hierin ist in derselben 9 gezeigt. Solche Alignments sind zum Identifizieren der am meisten konservierten Aminosäuren zwischen den Znf-A20/AN1-Polypeptiden nützlich, wie etwa den A20-Typ-Zinkfinger-Domäne-Aminosäureresten und ihren konservierten Cys-Resten, oder den AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne-Aminosäureresten und ihren konservierten Cys- und His-Resten.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide ist ein Alignment der Polypeptide von Tabelle A4 hierin in der 13 gezeigt. Solche Alignments sind nützlich zum Identifizieren der am meisten konservierten Domänen oder Motive zwischen den PHD-zf-Polypeptiden, wie hierin definiert. Eine derartige Domäne ist eine Conserved Domain, die in 13 eingerahmt ist, und wie sie durch SEQ ID NR: 491 repräsentiert wird. Eine andere ist eine PHD-zf-Domäne mit der Consensus-Sequenz CXXC_8-21CXXC₄HXXC_12-46CXXC, worin die konservierten C (Cys) und H (His) leicht zu identifizieren sind (siehe 13).
• Verfahren für das Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wobei GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA zu derartigen Verfahren zählen. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453) zur Ermittlung des globalen (d. h. die vollständigen Sequenzen überspannenden) Alignments von zwei Sequenzen, welches die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10) berechnet die prozentuale Sequenzidentität und führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen durch. Die Software zum Ausführen der BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich verfügbar. Homologe können leicht identifiziert werden, indem zum Beispiel der ClustalW-Multiple-Sequenz-Alignment-Algorithmus (Version 1.83) mit den vorgegebenen paarweisen Alignment-Parametern und einer Bewertungsmethode in Prozent angewandt wird. Die globalen Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität können auch unter Anwendung eines der Verfahren ermittelt werden, die im MatGAT-Software-Paket(Campanella et al., BMC Bioinformatics. 10. Juli 2003; 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences) verfügbar sind. Zur Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein wird. Darüber hinaus können, anstatt der Verwendung von Volllängensequenzen zur Identifizierung von Homologen, auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) hinweg bestimmt werden, wobei die oben erwähnten Programme unter Anwendung der Standardparameter verwendet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol. 147(1); 195-7).
• In Bezug auf Znf-A20/AN1-Polypeptide besitzen die Znf-A20/AN1-Polypeptide, außerhalb der A20-Typ-Zinkfinger-Domäne und der AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne, angeblich geringe Aminosäuresequenzidentität. Der Beispiele-Abschnitt hierin beschreibt in Tabelle B die prozentuale Identität zwischen dem Znf A20/AN1-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 213, oder durch SEQ ID NR: 215 repräsentiert, und den in Tabelle A gelisteten Znf-A20/AN1-Polypeptiden, welche so niedrig wie 25% Aminosäuresequenzidentität sein kann. Der Prozentsatz der Identität kann erheblich erhöht werden, wenn die Identitätsberechnung zwischen der A20-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 338, enthalten in SEQ ID NR: 213, und der A20-Typ-Zinkfinger-Domäne der Znf A20/AN1-Polypeptide der Tabelle A (eingerahmt in 9), und den QLQ-Domänen der bei der Ausführung der Erfindung nützlichen Polypeptide, durchgeführt wird. In ähnlicher Weise kann der Prozentsatz der Identität erheblich erhöht werden, wenn die Identitätsberechnung zwischen der AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 338, und der AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne der bei der Ausführung der Erfindung nützlichen Polypeptide (eingerahmt in 9), durchgeführt wird.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide beschreibt der Beispiele-Abschnitt in Tabelle B den Prozentsatz der Identität zwischen dem PHD-zf-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 348, und den in Tabelle A aufgelisteten PHD-zf-Polypeptiden, welche so niedrig wie 50% Aminosäuresequenzidentität sein kann.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide kann außerdem die Gegenwart eines E/D-reichen Motivs ebenfalls leicht identifiziert werden. Die Primär-Aminosäurezusammensetzung (in %) zur Bestimmung, ob eine Polypeptid-Domäne reich an spezifischen Aminosäuren ist, kann unter Verwendung von Software-Programmen von dem ExPASy-Server berechnet werden, insbesondere dem Werkzeug ProtParam (Gasteiger E et al. (2003) ExPASy: the proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res 31: 3784-3788). Die Zusammensetzung des Proteins von Interesse kann dann mit der Durchschnitts-Aminosäurezusammensetzung (in %) in der 'Swiss-Prot'-Proteinsequenz-Datenbank verglichen werden. Innerhalb dieser Datenbank betragen der mittlere Gehalt an Asp (D) und Glu (E) 5,3% bzw. 6,6 %, wobei der kombinierte Mittelwert 11,9% beträgt. Wie hierin definiert, besitzt ein E/D-reiches Motiv einen kombinierten Asp(D)- und Glu(E)-Gehalt (ausgedrückt in %) über demjenigen, der in der durchschnittlichen Aminosäurezusammensetzung (ausgedrückt in %) der Proteine in der 'Swiss-Prot'-Proteinsequenz-Datenbank gefunden wird. Ein E/D-reiches Motiv kann Teil einer Transkriptionsaktivierungsdomäne sein. Eukaryotische Transkriptionsaktivierungsdomänen sind gemäß ihres Aminosäuregehalts klassifiziert worden, und Hauptkategorien schließen saure, glutaminreiche und prolinreiche Aktivierungsdomänen ein (Rutherford et al. (2005) Plant J. 43(5): 769-88, und Bezugsstellen darin). Alternativ dazu kann ein konserviertes E/D-reiches Motiv auch einfach durch visuelle Inspektion eines multiplen Sequenzalignments identifiziert werden, zum Beispiel der Polypeptidsequenz von Tabelle A4, und wie gezeigt in 13.
• PHD-zf-Polypeptide können zusätzlich ein KRAR-Motiv umfassen, worin K für Lys, R für Arg und A für Ala steht. Dieses Motiv ist in den letzten 10 Aminosäuren des C-terminalen Endes des Polypeptids lokalisiert (siehe 13). Die Gegenwart des KRAR-Motivs kann unter Anwendung von Verfahren für das Alignment von Sequenzen zum Vergleich, wie hierin oben beschrieben, identifiziert werden. In manchen Fällen können die Standardparameter angepasst werden, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann mit Hilfe von BLAST die statistische Signifikanzschwelle (genannt ”expect”- bzw. Erwartungs-Wert) für das Berichten von Übereinstimmungen gegenüber Datenbanksequenzen erhöht werden, so dass weniger stringente Übereinstimmungen gezeigt werden. Auf diese Weise können kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifiziert werden.
• Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Die Kenntnis der Lokalisierung eines Proteins hilft dabei, seine Funktion aufzuklären. Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisation bis zum Tagging von Proteinen unter Einsatz von Grün-fluoreszierendem Protein (GFP) oder beta-Glucuronidase (GUS). Derartige Verfahren sind exakt, wenngleich arbeitsintensiv im Vergleich zu computergestützten Verfahren. Kürzlich sind große Fortschritte bei der computergestützten Vorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht worden. Unter den, einem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannten Algorithmen sind bei den ExPASy-Proteomics-Werkzeugen, welche vom Swiss Institute for Bioinformatics (Schweizer Institut für Bioinformatik) bereitgestellt werden, zum Beispiel PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale und andere verfügbar.
• In Bezug auf Znf A20/AN1-Polypeptide sagt TargetP beispielsweise eine nicht-chloroplastidäre, nicht-mitochondriale und nicht ”sekretorischer-Weg” subzelluläre Lokalisierung für ein Znf A20/AN1-Polypeptid, wie es durch SEQ ID NR: 213 repräsentiert und im Beispiele-Abschnitt beschrieben ist, vorher. Die bevorzugte subzelluläre Lokalisierung eines Znf A20/AN1-Polypeptids, wie durch SEQ ID NR: 213 repräsentiert, ist das Cytoplasma und/oder der Zellkern.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide wird mit Hilfe der Transmembran-Voraussage-Software TMHMM eine vorhergesagte Transmembrandomäne in den zur Ausführung der Verfahren der [...Erfindung...] nützlichen Polypeptide identifiziert (siehe den Beispiele-Abschnitt und 12 hierin).
• Ferner haben TFL1-like-Polypeptide, wenn sie ektopisch in Arabidopsis thaliana-Pflanzen exprimiert werden, das Blühen im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen oder zu Kontrollpflanzen verzögert; oder haben, wenn sie in Reis-Pflanzen exprimiert werden, typischerweise eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen oder zu Kontrollpflanzen Erhöhung der Samenausbeute/Samenzahl unter Nicht-Stress- oder unter Dürrestress-Wachstumsbedingungen und Erhöhung der Wurzelbiomasse. Hilfsmittel und Techniken zur Messung der oben genannten Aktivitäten sind im Fachgebiet allgemein bekannt (Carmona et al. 2007) und im Beispiele-Abschnitt weiter beschrieben.
• Darüber hinaus ergeben TFL1-like-Polypeptide, bei Expression in Reis gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie im Beispiele-Abschnitt dargelegt, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, und ergeben insbesondere ein beliebiges aus erhöhtem Samenertrag, erhöhter Samenzahl und erhöhtem Ernteindex.
• Ferner besitzen R5PI-Polypeptide typischerweise D-Ribose-5-phosphat-Isomerase-Aktivität. Hilfsmittel und Techniken zur Messung von D-Ribose-5-phosphat-Isomerase-Aktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt (Jung et al. 2000).
• Darüber hinaus ergeben R5PI-Polypeptide, bei Expression in Reis gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie im Beispiele-Abschnitt dargelegt, Pflanzen mit ein oder mehreren erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, gewählt aus Wurzelbiomasse, Gesamtgewicht an Samen pro Pflanze, Anzahl gefüllter Samen pro Pflanze, Anzahl an Blüten pro Rispe, Gesamtzahl an Samen pro Pflanze.
• Ferner besitzen in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliche Znf-A20/AN1-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise, aber nicht notwendig, transkriptionsregulierende Aktivität und das Vermögen, mit anderen Proteinen zu interagieren. DNA-Bindungsaktivität und Protein-Protein-Wechselwirkungen können leicht unter Verwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Techniken in vitro oder in vivo (zum Beispiel in Current Protocols in Molecular Biology, Bände 1 und 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols) bestimmt werden. Zum Beispiel sind die A20-Zinkfinger-Domäne und die AN1-Zinkfinger-Domäne von Znf A20/AN1-Polypeptiden in Hefezellen zur Wechselwirkung miteinander in vivo befähigt, während ein Hefe-Zwei-Hybrid-Protein-Protein-Wechselwirkungs-Assay (Kanneganti & Gupta, siehe oben) angewandt wird.
• REF/ALY-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) können Nukleinsäure bindende Aktivität aufweisen, wobei die Nukleinsäure vorzugsweise Ribonukleinsäure ist. Hilfsmittel und Techniken zur Messung von Nukleinsäure-Bindungsaktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel kann RNA-Eindungs-Aktivität leicht in vitro oder in vivo mit Hilfe von im Fachgebiet allgemein bekannten Techniken bestimmt werden. Beispiele für In-vitro-Assays umfassen: Nukleinsäure-Bindungsassays unter Anwendung der North-Western- und/oder South-Western-Analyse (Suzuki et al. Plant Cell Physiol. 41(3): 282-288 (2000)); RNA-Bindungs-Assays mit Hilfe von UV-Vernetzung; Electrophoretischer Mobilitäts-Verschiebungs(Shift)-Assay für RNA-Eindungs-Proteine (Smith, RNA-Protein Interactions – A Practical Approach 1998, University of Cambridge); Chromatin-Immunopräzipitations-Assay (Suganuma et al. FEBS J. 2005; 272(11): 2696-704). Zu Beispielen von In-vivo-Assays gehören: TRAP (translationale Repression-Assay-Prozedur) (Paraskeva E, Atzberger A, Hentze MW: A translational repression assay procedure (TRAP) für RNA-protein interactions in vivo. PNAS, 3. Feb 1998; 95(3): 951-6.).
• Ferner können REF/ALY-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) in der Lage sein, Hefestämme zu komplementieren, die hinsichtlich Yra1p defekt sind, einem konservierten nukleären RNA-Bindungsprotein in Hefe, wie von Strässer, K., und Hurt, E., (2000). EMBO J. 19(3): 410-20, beschrieben.
• Alternativ dazu können REF/ALY-Polypeptide fähig sein, mit dem P19-Protein von ”Tomato Bushy Stunt”-Virus (TBSV) zu interagieren. Hilfsmittel und Techniken zum Testen der Wechselwirkung von REF/ALY-Polypeptiden und dem P19 von TBSV sind von Uhrig et al. 2004, Plant Physiology, Band 135, S. 2411-2423, beschrieben worden.
• Darüber hinaus ergeben REF/ALY-Polypeptide, bei Expression in Reis gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie im Beispiele-Abschnitt dargelegt, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere einem oder mehreren beliebigen von erhöhter Emergenz-wuchskraft, erhöhtem Gesamtsamengewicht und erhöhter Anzahl an gefüllten Samen pro Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• In Bezug auf TFL1-like-Polypeptide wird die vorliegende Erfindung veranschaulicht durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz, die durch SEQ ID NR: 1 und durch SEQ ID NR: 25 repräsentiert wird, codierend die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 2 bzw. SEQ ID NR: 26. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen TFL1_Like codierenden Nukleinsäure oder eines beliebigen TFL1-like-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
• Beispiele von Nukleinsäuren, die TFL1-like-Polypeptide codieren, sind in der Tabelle A1 von Beispiel 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäure sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 2 und/oder 26 repräsentierten TFL1-like-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung beliebiger der in Tabelle A1 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hocheingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• In Bezug auf R5PI-Polypeptide wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 140 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 141 codiert, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen R5PI-codierenden Nukleinsäure oder eines beliebigen R5PI-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
• Beispiele von Nukleinsäuren, die R5PI-Polypeptide codieren, sind in der Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuren sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 141 repräsentierten R5PI-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung beliebiger der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nichtgefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 140 oder SEQ ID NR: 141 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• In Bezug auf Znf-A20/AN1-Polypeptide wird die vorliegende Erfindung veranschaulicht durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 212, oder wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 214, welche jeweilig eine Znf A20/AN1-Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 213 oder die Znf A20/AN1-Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 215 codieren. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen Nukleinsäuresequenz durchgeführt werden, welche ein Znf A20/AN1 Polypeptid, wie hierin definiert, codiert.
• Beispiele von Nukleinsäuresequenzen, die Znf A20/AN1-Polypeptide codieren, sind in der Tabelle A3 von Beispiel 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuresequenzen sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 213 repräsentierten Znf A20/AN1-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung beliebiger der in Tabelle A3 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 212 oder SEQ ID NR: 213 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hocheingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 347 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die PHD-zf-Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 348 codiert, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, durchgeführt werden.
• Beispiele von Nukleinsäuresequenzen, die PHD-zf-Polypeptide codieren, sind in der Tabelle A4 von Beispiel 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuresequenzen sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 348 repräsentierten PHD-zf-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung beliebiger der in Tabelle A4 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nichtgefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 347 oder SEQ ID NR: 348 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Lycopersicon esculentum-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• In Bezug auf REF/ALY-Polypeptide wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 497 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 498 codiert, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer beliebigen REF/ALY-codierenden Nukleinsäure oder eines beliebigen REF/ALY-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
• Beispiele von Nukleinsäuren, die REF/ALY-Polypeptide codieren, sind in der Tabelle A5 des Beispiele-Abschnitts hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuren sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des von SEQ ID NR: 498 repräsentierten REF/ALY-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung beliebiger der in Tabelle A5 des Beispiele-Abschnitts aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemninen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nichtgefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 497 oder SEQ ID NR: 498 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
• Hoch-eingestufte Übereinstimmungstreffer sind diejenigen mit einem niedrigen E-Wert. Je niedriger der E-Wert, umso signifikanter die Wertung (oder in anderen Worten, umso niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Treffer durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Fachgebiet allgemein bekannt. Zusätzlich zu E-Werten, werden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. Im Fall von großen Familien kann ClustalW eingesetzt werden, gefolgt von einem Nachbarkopplungs- bzw. ”Neighbour-joining”-Baum, um bei der Visualisierung der Einordnung bzw. Clusterung verwandter Gene zu helfen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
• Im Bezug auf R5PI-Polypeptide, codiert eine bevorzugte R5PI-Nukleinsäure, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein R5PI-Polypeptid, das typischerweise (zumindest in seiner natürlichen Form) in/auf dem Cytosol einer Zelle exprimiert wird. Eine weiter bevorzugte R5PI-Nukleinsäure codiert ein R5PI-Polypeptid, das typischerweise (zumindest in seiner natürlichen Form) auf dem Chloroplasten einer Zelle exprimiert wird, wobei eine solche R5PI-Nukleinsäure modifiziert ist, um im Cytosol exprimiert zu werden. Verfahren zum spezifischen Exprimieren einer Nukleinsäure in einem bevorzugten subzellulären Kompartiment sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wie zum Beispiel in Ausubel et al. 1994. Zum Beispiel kann ein cytosolisches Zellulär-Targeting eines Proteins, das natürlicherweise im Chloroplast exprimiert wird durch Entfernen von dem chlorplastischen Targetring-Signal bewirkt werden Andererseits kann ein typischerweise cytosolisch exprimiertes Protein im Chloroplast exprimiert werden, indem eine Chloroplasten-Targeting-Signalgebung in dem Gen eingebaut wird. Verfahren zum Identifizieren eines Chloroplasten-Targeting-Signals und Verfahren zum Einbauen oder Entfernen solcher Signale aus Polypeptiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
• Auch Nukleinsäurevarianten können bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sein. Zu Beispielen solcher Varianten zählen Nukleinsäuren, welche Homologe und Derivate von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hierin definiert beschaffen sind. Außerdem sind Nukleinsäuren in den Verfahren der Erfindung nützlich, die Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, besitzen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität, wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind.
• Ferner zählen zu den, bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlichen Nukleinsäurevarianten Abschnitte von Nukleinsäuren, die TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide codieren, Nukleinsäuren, die an Nukleinsäuren hybridisieren, welche TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide codieren, Splice-Varianten von Nukleinsäuren, die TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide codieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die TFL1-like Polypeptide codieren, und Varianten von Nukleinsäuren, die TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide codieren, welche durch Gen-Shuffling erhalten werden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Splice-Variante, allelische Variante und Gen-Shuffling sind wie hierin beschrieben beschaffen.
• Nukleinsäuren, die TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide codieren, müssen nicht Volllängen-Nukleinsäuren sein, da die Ausführung der Verfahren der Erfindung nicht auf der Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit Volllänge beruht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder einem Abschnitt von einer Nukleinsäure, codierend ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen.
• Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel durch Vornehmen einer oder mehrerer Deletionen an der Nukleinsäure hergestellt werden. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder sie können an andere codierende (oder nicht-codierende) Sequenzen fusioniert sein, um zum Beispiel ein Protein zu erzeugen, das mehrere Aktivitäten vereint. Sofern es an andere codierende Sequenzen fusioniert ist, kann das resultierende Polypeptid, das nach Translation produziert wird, größer sein als jenes, das für den Proteinabschnitt vorhergesagt wird.
• In Bezug auf TFL1-like-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein TFL1-like-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 100, 150, 200, 250, 300, 350 400, 450 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder aus einer Nukleinsäure sind, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Carmona et al. 2007 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von TFL1-like-Polypeptiden, die die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt. Weiter bevorzugt lässt sich die Abschnittsequenz innerhalb der das Arabidopsis-ATC-, das Anthirrinum-CEN-, das Lycopersicum-SP-, das Nicotiana-CET2- und das Vitis-VvTFL1A-Polypeptid umfassenden Klade einordnen bzw. ”clustern”.
• In Bezug auf R5PI-Polypeptide codieren Abschnitte die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein R5PI-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinanderfolgenden Nuklotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder aus einer Nukleinsäure sind, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 140. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 5 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe I, welche die durch SEQ ID NR: 141 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
• In Bezug auf Znf A20/AN1-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein Znf A20/AN1-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz, umfassend: (i) eine Domäne mit mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer A20-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 338 oder durch SEQ ID NR: 339 repräsentiert; und (ii) eine Domäne mit mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie sie durch SEQ ID NR: 340 oder durch SEQ ID NR: 341 repräsentiert wird. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 212 oder von SEQ ID NR: 214.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein PHD-zf-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem PHD-zf-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 348, oder zu beliebigen der in Tabelle A4 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 347.
• In Bezug auf REF/ALY-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein REF/ALY-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die Aminosäuresequenzen, die in Tabelle A5 des Beispiele-Abschnitts angegeben sind, auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder aus einer Nukleinsäure sind, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 497 Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe 1 von REF/ALY-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 498 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
• Eine andere Nukleinsäurevariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen verringerter Stringenz, vorzugsweise unter stingenten Bedingungen, zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure die ein TFL1-like-Polypeptid oder ein R5PI-Polypeptid oder ein Znf A20/AN1-Polypeptid oder ein PHD-zf-Polypeptid oder ein REF/ALY-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, oder mit einem Abschnitt, wie hierin definiert, in der Lage ist.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A1 bis A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuren in der Lage ist, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure in der Lage ist, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert.
• In Bezug auf TFL1-like-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein TFL1-like-Polypeptid, wie hierin definiert, aufweisend im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement von einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuren, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen, in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure in der Lage, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 1, oder an SEQ ID NR: 25, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage.
• In Bezug auf TFL1-like-Polypeptide codiert die hybridisierende Sequenz vorzugsweise ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in Volllänge vorliegt und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Carmona et al. 2007 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von TFL1-like-Polypeptiden, die die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt. Weiter bevorzugt clustert die Polypeptidsequenz innerhalb der das Arabidopsis-ATC-, das Anthirrinum-CEN-, das Lycopersicum-SP-, das Nicotiana-CET2- und das Vitis-VvTFL1A-Polypeptid umfassenden Klade, oder lässt sich, alternativ dazu, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Igasaki et al. 2008 (Plant Cell Physiol. 49(3): 291-300,) abgebildet ist, verwendet wird, im TFL1-Ast, weiter bevorzugt im BFT(”Brother of FT”)-Ast, noch weiter bevorzugt bei BFT einordnen. Die 2 von Igasaki et al., 2008, ist in der 2B abgebildet.
• In Bezug auf R5PI-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein R5PI-Polypeptid, wie hierin definiert, aufweisend im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuren, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen, in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure in der Lage, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 140, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage.
• In Bezug auf R5PI-Polypeptide codiert die hybridisierende Sequenz vorzugsweise ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in Volllänge vorliegt und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 5 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe I, welche die durch SEQ ID NR: 141 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
• In Bezug auf Znf A20/AN1-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein Znf A20/AN1-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen auf. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen, in der Lage. wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert, in der Lage ist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz in der Lage, codierend eine Polypeptidsequenz, umfassend: (i) eine Domäne mit mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer A20-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 338 oder durch SEQ ID NR: 339 repräsentiert; und (ii) eine Domäne mit mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie sie durch SEQ ID NR: 340 oder durch SEQ ID NR: 341 repräsentiert wird. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieruen an eine Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert von SEQ ID NR: 212, oder an einen Abschnitt derselben, oder von SEQ ID NR: 214, oder an einen Abschnitt derselben, in der Lage.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein PHD-zf-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen auf. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder an ein Komplement davon, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen, in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert, oder an ein Komplement davon, in der Lage ist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz in der Lage, codierend eine Polypeptidsequenz mit in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem PHD-zf-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 348, oder zu beliebigen der in Tabelle A4 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert von SEQ ID NR: 347, oder an einen Abschnitt derselben, in der Lage.
• In Bezug auf REF/ALY-Polypeptide codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche, hybridisierende Sequenzen ein REF/ALY-Polypeptid, wie hierin definiert, aufweisend im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement von einer beliebigen der in Tabelle A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuren, oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen, in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure in der Lage, welche ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 497, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage.
• Vorzugsweise codiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in Vollänge vorliegt und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 16 abgebildet ist, eher bei der Gruppe 1 von REF/ALY-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 498 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
• Eine andere Nukleinsäurevariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Splice-Variante, die ein TFL1-like-Polypeptid oder ein R5PI-Polypeptid oder ein Znf A20/AN1-Polypeptid oder ein PHD-zf-Polypeptid oder ein REF/ALY-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert, wobei eine Splice-Variante wie hierin definiert beschaffen ist.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Splice-Variante von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder einer Splice-Variante von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
• In Bezug auf TFL1-like-Polypeptide, handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 1, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Carmona et al. 2007 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von TFL1-like-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen. Weiter bevorzugt clustert die Splice-Varianten-Sequenzen innerhalb der das Arabidopsis-ATC-, das Anthirrinum-CEN-, das Lycopersicum-SP-, das Nicotiana-CET2- und das Vitis-VvTFL1A-Polypeptid umfassenden Klade, oder lässt sich, alternativ dazu, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Igasaki et al. 2008 (Plant Cell Physiol. 49(3): 291-300,) abgebildet ist, verwendet wird, im TFL1-Ast, weiter bevorzugt im BFT(”Brother of FT”)-Ast, noch weiter bevorzugt bei BFT einordnen. Die 2 von Igasaki et al., 2008, ist in der 2B abgebildet.
• In Bezug auf R5PI-Polypeptide, handelt es sich bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 140, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 141 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 5 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe I, welche die durch SEQ ID NR: 141 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• In Bezug auf Znf A20/AN1-Polypeptide, handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 212 oder durch SEQ ID NR: 214, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 213 oder von SEQ ID NR: 215 codiert. Vorzugsweise ist die Splice-Variante eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die eine Polypeptidsequenz codiert, umfassend: (i) eine Domäne mit mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer A20-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 338 oder durch SEQ ID NR: 339 repräsentiert; und (ii) eine Domäne mit mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie sie durch SEQ ID NR: 340 oder durch SEQ ID NR: 341 repräsentiert wird.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide, handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 347, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 348 codiert. Vorzugsweise ist die Splice-Variante eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die eine Polypeptidsequenz codiert, welche in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem PHD-zf-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 348, oder zu beliebigen der in Tabelle A4 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen, aufweist.
• In Bezug auf REF/ALY-Polypeptide, handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 497, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 498 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 16 abgebildet ist, eher bei der Gruppe 1 von REF/ALY-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 498 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• Eine andere Nukleinsäurevariante, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid oder ein R5PI-Polypeptid oder ein Znf A20/AN1-Polypeptid oder ein PHD-zf-Polypeptid oder ein REF/ALY-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert, wobei eine allelische Variante wie hierin definiert beschaffen ist.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer allelischen Variante von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuren, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer allelischen Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
• In Bezug auf TFL1-like-Polypeptide weisen die, von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das TFL1-like-Polypeptid von SEQ ID NR: 2 und beliebige der in Tabelle A1 des Beispiele-Abschnitts dargestellten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 1 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Carmona et al. 2007 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe von TFL1-like-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen. Weiter bevorzugt clustert die allelische Varianten-Sequenz innerhalb der das Arabidopsis-ATC-, das Anthirrinum-CEN-, das Lycopersicum-SP-, das Nicotiana-CET2- und das Vitis-VvTFL1A-Polypeptid umfassenden Klade, oder lässt sich, alternativ dazu, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Igasaki et al. 2008 (Plant Cell Physiol. 49(3): 291-300,) abgebildet ist, verwendet wird, im TFL1-Ast, weiter bevorzugt im BFT(”Brother of FT”)-Ast, noch weiter bevorzugt bei BFT einordnen. Die 2 von Igasaki et al., 2008, ist in der 2B abgebildet.
• In Bezug auf R5PI-Polypeptide weisen die, von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das R5PI-Polypeptid von SEQ ID NR: 141 und beliebige der in Tabelle A2 des Beispiele-Abschnitts dargestellten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 140 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 141 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 5 abgebildet ist, verwendet wird, eher bei der Gruppe I, welche die durch SEQ ID NR: 141 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• In Bezug auf Znf A20/AN1-Polypeptide weisen die, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das Znf A20/AN1-Polypeptid von SEQ ID NR: 213 oder von SEQ ID NR: 215 und beliebige der in Tabelle A3 von Beispiel 1 dargestellten Polypeptidsequenzen auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 212 oder von SEQ ID NR: 214 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 213 codiert. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante einer Polypeptidsequenz, umfassend: (i) eine Domäne mit mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer A20-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 338 oder durch SEQ ID NR: 339 repräsentiert; und (ii) eine Domäne mit mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie sie durch SEQ ID NR: 340 oder durch SEQ ID NR: 341 repräsentiert wird.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide weisen die, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das PHD-zf-Polypeptid von SEQ ID NR: 348 und beliebige der in Tabelle A4 von Beispiel 1 dargestellten Polypeptidsequenzen auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 347 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 348 codiert. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante einer Polypeptidsequenz, welche in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem PHD-zf-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 348, oder zu beliebigen der in Tabelle A4 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen, aufweist.
• In Bezug auf REF/ALY-Polypeptide weisen die, von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen allelischen Varianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das REF/ALY-Polypeptid von SEQ ID NR: 498 und beliebige der in Tabelle A5 des Beispiele-Abschnitts dargestellten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 497 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 498 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 16 abgebildet ist, eher bei der Gruppe 1 von REF/ALY-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 498 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution können ebenfalls zur Anwendung kommen, um Varianten von Nukleinsäuren zu erzeugen, welche TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide, wie oben definiert, codieren, wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” wie hierin definiert beschaffen ist.
• In Bezug auf TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Variante von einer beliebigen der in Tabelle A1 oder Tabelle A2 oder Tabelle A3 oder Tabelle A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 oder Tabelle A2 oder Tabelle A3 oder Tabelle A5 des Beispiele-Abschnitts angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, wobei die Varianten-Nukleinsäure durch Gen-Shuffling erhalten wird.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren- in einer Pflanze, von einer Variante von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert, wobei die Varianten-Nukleinsäuresequenz durch Gen-Shuffling erhalten wird.
• In Bezug auf TFL1-like-Polypeptide lässt sich die, von der durch Genshuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Carmona et al. 2007 abgebildet ist, verwendet wird, vorzugsweise eher bei der Gruppe von TFL1-like-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 2 repräsentierte Aminosäuresequenz umfass, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen. Weiter bevorzugt clustert die Polypeptidsequenz innerhalb der das Arabidopsis-ATC-, das Anthirrinum-CEN-, das Lycopersicum-SP-, das Nicotiana-CET2- und das Vitis-VvTFL1A-Polypeptid umfassenden Klade, oder lässt sich, alternativ dazu, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 von Igasaki et al. 2008 (Plant Cell Physiol. 49(3): 291-300,) abgebildet ist, verwendet wird, im TFL1-Ast, weiter bevorzugt im BFT(”Brother of FT”)-Ast, noch weiter bevorzugt bei BFT einordnen. Die 2 von Igasaki et al., 2008, ist in der 2B abgebildet.
• In Bezug auf R5PI-Polypeptide lässt sich die, von der durch Genshuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 5 abgebildet ist, verwendet wird, vorzugsweise eher bei der Gruppe I, welche die durch SEQ ID NR: 141 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• In Bezug auf Znf A20/AN1-Polypeptide codiert die durch Genshuffling erhaltene Varianten-Nukleinsäuresequenz vorzugsweise eine Polypeptidsequenz, umfassend: (i) eine Domäne mit mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer A20-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 338 oder durch SEQ ID NR: 339 repräsentiert; und (ii) eine Domäne mit mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie sie durch SEQ ID NR: 340 oder durch SEQ ID NR: 341 repräsentiert wird.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide codiert die durch Genshuffling erhaltene Varianten-Nukleinsäuresequenz vorzugsweise eine Polypeptidsequenz mit in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem PHD-zf-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 348, oder zu beliebigen der in Tabelle A4 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen.
• In Bezug auf REF/ALY-Polypeptide lässt sich die, von der durch Genshuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 16 abgebildet ist, verwendet wird, vorzugsweise eher bei der Gruppe 1 von REF/ALY-Polypeptiden, welche die durch SEQ ID NR: 498 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
• Darüber hinaus können Nukleinsäure-Varianten auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Es sind mehrere Verfahren verfügbar, um eine ortsgerichtete Mutagenese zu bewirken, wobei die häufigsten PCR-basierende Verfahren sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, Hrsg.).
• TFL1-like-Polypeptide codierende Nukleinsäuren können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die TFL1-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer heterologen Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
• In vorteilhafter Weise sieht die vorliegende Erfindung bislang unbekannte TFL1-like-Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen vor.
• Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, umfassend:
• (i) eine Nukleinsäure, das durch SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 31 oder SEQ ID NR: 117 repräsentiert wird;
• (ii) eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, die/das zu SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 31 oder SEQ ID NR: 117 komplementär ist;
• (iii) eine Nukleinsäure, codierend ein TFL1-like-Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 31 oder SEQ ID NR: 117;
• (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen zum Hybridisieren an eine beliebige der oben in (i), (ii) oder (iii) angegebenen Nukleinsäuren in der Lage ist.
• Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, umfassend:
• (i) eine Aminosäuresequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 32 oder SEQ ID NR: 118;
• (ii) Derivate von beliebigen der in (i) angegebenen Aminosäuresequenzen.
• R5PI-Polypeptide codierende Nukleinsäuren können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die R5PI-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
• Znf A20/AN1-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die, ein Znf-A20/AN1-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana. Alternativ dazu ist die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz weiter bevorzugt aus der Familie Fabaceae (ebenfalls Papillonaceae genannt), am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Medicago truncatula.
• PHD-zf-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Die ein PHD-zf-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz stammt aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Solanaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Lycopersicon esculentum.
• REF/ALY-Polypeptide codierende Nukleinsäuren können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die REF/ALY-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
• In vorteilhafter Weise sieht die Erfindung auch bislang unbekannte REF/ALY codierende Nukleinsäuren und REF/ALY-Polypeptide vor.
• Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das aus folgendem gewählt ist:
• (i) eine Nukleinsäure, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 505, 507 und 535;
• (ii) das Komplement einer Nukleinsäure, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 505, 507 und 535;
• (iii) eine Nukleinsäure, codierend das Polypeptid, wie repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 506, 508 und 536, wobei die isolierte Nukleinsäure, vorzugsweise als ein Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, aus einer Polypeptidsequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NR: 506, 508 und 536 repräsentiert, abgeleitet sein kann und weiter bevorzugt gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
• (iv) eine Nukleinsäure die, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98%, oder 99% Sequenzidentität zu beliebigen der Nukleinsäuresequenzen von Tabelle A aufweist und weiter bevorzugt gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
• (v) ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt;
• (vi) eine Nukleinsäure, codierend ein REF/ALY-Polypeptid, das, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 506, 508 und 536, und jedweden der anderen Polypeptidsequenzen in Tabelle A5, aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt.
• Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das aus folgendem gewählt ist:
• (i) eine Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 506, 508 und 536;
• (ii) eine Aminosäuresequenz, die, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 506, 508 und 536, und jedweden der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A5, aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt.
• (iii) Derivate von beliebigen der oben in (i) oder (ii) angegebenen Aminosäuresequenzen.
• Die Ausführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften. Insbesondere ergibt die Ausführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hierin ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
• Es versteht sich, dass die Bezugnahme hierin auf gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften eine Erhöhung der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeutet, welche oberirdische (erntefähige) Teile und/oder (erntefähige) Teile unterhalb des Erdbodens einschließen kann. Insbesondere handelt es sich bei derartigen erntefähigen Teilen um Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zum Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen.
• Wenn man Mais als ein Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung, unter anderem, als eines oder mehreres der folgenden manifestieren: Erhöhung der Anzahl an Pflanzen, welche pro Quadratmeter hervorgebracht werden, eine Erhöhung der Anzahl von Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Ackerreihen, der Anzahl der Kerne pro Reihe, des Kerngewichts, des Tausendkerngewichts, der Ährenlänge/Durchmesser, Erhöhung der Samen-Füllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist). Wenn man Reis als Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem als eine Erhöhung bei einem oder mehreren der folgenden manifestieren: Anzahl an Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl an Rispen pro Pflanze, Anzahl an Ährchen pro Rispe, Anzahl an Blüten (Blütchen) pro Rispe (welche ausgedrückt wird als ein
• Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen gegenüber der Anzahl an Hauptrispen), Erhöhung der Samenfüllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100, ist), Erhöhung des Tausendkerngewichts.
• Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vor, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid oder ein R5PI-Polypeptid oder ein Znf A20/AN1-Polypeptid oder ein PHD-zf-Polypeptid oder ein REF/ALY-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Da die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung erhöhte ertragsbezogene und/oder samenertragsbezogene Eigenschaften aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen eine erhöhte Wachstumsrate (wenigstens während eines Teils ihres Lebenszyklus) im Vergleich zur Wachstumsrate von Kontrollpflanzen bei einem entsprechenden Stadium in ihrem Lebenszyklus aufzeigen.
• Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen überall in der gesamten Pflanze herrschen. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen Der Lebenszyklus einer Pflanze kann sich so verstehen, dass die Zeit gemeint ist, welche benötigt wird, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, an welchem die Pflanze trockene reife Samen erzeugt hat, die ähnlich zum Ausgangsmaterial sind. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Geschwindigkeit der Keimung, Frühwuchskraft, Wachstumsrate, Grünheits-Index, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann an einer oder mehreren Stufen im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Pflanzenlebenszyklus stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der frühen Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann eine gesteigerte Wuchskraft reflektieren. Die Erhöhung in der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, was gestattet, dass Pflanzen später ausgesät und/oder früher geerntet werden, als es sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt kann mit einer früheren Blütezeit erreicht werden). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann sie das weitere Aussäen von Samen derselben Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel Säen und Ernten von Reispflanzen, gefolgt von Säen und Ernten weiterer Reispflanzen, sämtlich innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht wird, kann sie, in ähnlicher Weise, das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel das Säen und Ernten von Maispflanzen, gefolgt zum Beispiel von Aussaat und gegebenenfalls Ernte von Sojabohne, Kartoffel oder einer beliebigen anderen geeigneten Pflanze). Im Falle mancher Nutzpflanzen kann auch das mehrmalige Abernten vom gleichen Wurzelstock möglich sein. Das Ändern des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (aufgrund einer Erhöhung der Mehrmaligkeit (z. B. in einem Jahr), bei der eine beliebige jeweilige Pflanze angebaut und geerntet werden kann). Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann auch die Kultivierung transgener Pflanzen in einem weiteren geographischen Gebiet als bei ihren Wildtyp-Gegenstücken zulassen, da die territorialen Eingrenzungen für den Anbau einer Nutzpflanze häufig von nachteiligen Umweltbedingungen entweder zur Zeit des Pflanzens (frühe Jahreszeit) oder zur Zeit des Erntens (späte Jahreszeit) bestimmt werden. Derartige nachteilige Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt wird. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven ermittelt werden, wobei es sich bei derartigen Parametern, unter anderem, um T-Mid (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 50% ihrer maximalen Größe zu erreichen) und T-90 (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 90% ihrer maximalen Größe zu erreichen) handeln kann.
• Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung, ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontorpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein in Verfahren zum Erhöhen der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid oder ein R5PI-Polypeptid oder ein Znf A20/AN1-Polypeptid oder ein PHD-zf-Polypeptid oder ein REF/ALY-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate und/oder ertragsbezogener Eigenschaften und/oder samenertragsbezogener Eigenschaften tritt im Vergleich zu Kontrollpflanzen ungeachtet dessen auf, ob sich die Pflanze unter Nicht-Stress-Bediengungen befindet oder ob die Pflanze verschiedenen Stressformen ausgesetzt ist. Pflanzen antworten in der Regel auf eine Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Milder bzw. mäßiger Stress ist demgegenüber hierin als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig, ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums, einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, weiter bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen. Wegen der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizidbehandlungen) sind starke Stressformen bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig anzutreffen. Als eine Konsequenz ist das, von mäßigem Stress induzierte, beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressformen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressformen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressformen können zurückzuführen sein auf Dürre oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen. Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (insbesondere wegen Dürre), Salzstress, oxidativen Stress oder einem ionischen Stress verursacht wird. Biotische Stressformen sind typischerweise diejenigen Stressarten, die von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden.
• Im Besonderen können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen mit milder Dürre durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Wie in Wang et al. (Planta (2003) 218: 1-14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003) 133: 1755-1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen umweltbedingten Stressformen häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stress-Proteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit. Pflanzen bei optimalen Wachstumsbedingungen (angebaut unter Nicht-Stress-Bedingungen) ergeben typischerweise, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann auf der Grundlage von Ernte und/oder Saison berechnet werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Durchschnittsertrags-Produktionen einer Nutzpflanze.
• In Bezug auf TFL1-like-Polypeptide, gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre wachsen gelassen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags in Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• In Bezug auf R5PI-Polypeptide, gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre wachsen gelassen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags in Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein R5PI-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• In Bezug auf Znf A20/AN1-Polypeptide ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen von mildem Stress wachsen gelassen werden, mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen von mildem Stress wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen von mildem Stress wachsen gelassen werden, mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen von samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen von mildem Stress wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• In Bezug auf REF/ALY-Polypeptide, gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre angebaut werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags in Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen milder Dürre wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein REF/ALY-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
• Es versteht sich, dass der Begriff ”abiotischer Stress”, wie hierin definiert, ein oder mehrere beliebige von folgenden bedeutet: Wasserstress (wegen Dürre oder überschüssigem Wasser), anaerober Stress, Salzstress, Temperaturstress (durch heiße, kalte oder Frost-Temperaturen), Stress durch chemische Toxizität und oxidativer Stress. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus Wasserstress, Salzstress, oxidativem Strass und ionischem Strass Vorzugsweise ist dar Wasserstress ein Dürrestress Der Begriff Salzstress ist nicht auf gewöhnliches Salz (NaCl) eingeschränkt, sondern es kann sich um einen beliebigen Stress handeln, der unter anderem von einem oder mehreren von: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂, verursacht wird.
• In Bezug auf Znf A20/AN1-Polypeptide ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, unter abiotischen Stressbedingungen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die bei vergleichbaren Stressbedingungen wachsen gelassen werden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter abiotischen Stressbedingungen wachsen gelassen werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus einem oder mehreren der folgenden: Wasserstress, Salzstress, oxidativer Stress und ionischer Stress.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften, unter abiotischen Stressbedingungen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die bei vergleichbaren Stressbedingungen wachsen gelassen werden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur 1 Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter abiotischen Stressbedingungen kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein PHD-zf-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus einem oder mehreren der folgenden: Wasserstress, Salzstress, oxidativer Stress und ionischer Stress.
• Ein weiteres Beispiel für abiotischen Umweltstress ist die verringerte Verfügbarkeit von einem oder mehreren Nährstoffen, welche von den Pflanzen für das Wachstum und die Entwicklung assimiliert werden müssen. Wegen des starken Einflusses der Nährstoffverwertungseffizienz auf den Pflanzenertrag und die Produktqualität wird eine gewaltige Menge an Düngemitteln über Feldern verteilt, um Pflanzenwachstum und -qualität zu optimieren. Die Produktivität von Pflanzen wird gewöhnlicherweise von drei Hauptnährstoffen limitiert, nämlich Phosphor, Kalium und Stickstoff, der, unter diesen dreien, gewöhnlich das geschwindigkeitslimitierende Element beim Pflanzenwachstum ist. Deshalb ist das für Pflanzenwachstum erforderliche, hauptsächliche Nährstoff-Element der Stickstoff (N). Er ist ein Bestandteil von zahlreichen wichtigen Verbindungen, welche in lebenden Zellen angetroffen werden, einschließlich Aminosäuren, Proteinen (Enzymen), Nukleinsäuren und Chlorophyll, Stickstoff macht 1,5 bis 2% der Pflanzen-Trockensubstanz und ungefähr 16% des gesamten Pflanzenproteins aus. Somit ist die Stickstoffverfügbarkeit ein hauptsächlicher limitierender Faktor für Nutzpflanzenwachstum und -produktion (Frink et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(4): 1175-1180) und besitzt außerdem einen sehr großen Einfluss auf die Proteinakkumulation und Aminosäure-Zusammensetzung. Daher sind Nutzpflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften bei Anbau unter Stickstoff-limitierenden Bedingungen von großem Interesse.
• Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt Pflanzen, die unter Bedingungen mit Nährstoffmangel, insbesondere unter Bedingungen mit Stickstoffmangel, wachsen gelassen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in, unter Bedingungen von Nährstoffmangel kultivierten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein TFL1-like-Polypeptid oder ein R5PI-Polypeptid oder ein Znf A20/AN1-Polypeptid oder ein PHD-zf-Polypeptid oder ein REF/ALY-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Nährstoffmangel kann aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren. In Bezug auf Znf-A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide handelt es sich bei verringerter Nährstoffverfügbarkeit vorzugsweise um eine verringerte Stickstoffverfügbarkeit.
• Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt Pflanzen, die unter Bedingungen von Salzstress kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in, unter Bedingungen von Salzstress kultivierten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid oder ein R5PI-Polypeptid oder ein REF/ALY-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Begriff Salzstress ist nicht auf gewöhnliches Salz (NaCl) eingeschränkt, sondern es kann sich dabei, unter anderem, um ein oder mehrere beliebige von: NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂ handeln.
• Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen) oder Zellen davon, die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon, oder Zellen davon, umfassen ein Nukleinsäure-Transgen, das ein TFL1-like-Polypeptid oder ein R5PI-Polypeptid oder ein Znf A20/AN1-Polypeptid oder ein PHD-zf-Polypeptid oder ein REF/ALY-Polypeptid, wie oben definiert, codiert.
• Die Erfindung sieht außerdem genetische Konstrukte und Vektoren zum Erleichtern des Einbringens und/oder der Expression von TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptid codierenden Nukleinsäuren in Pflanzen vor. Die Genkonstrukte können in Vektoren inseriert werden, welche kommerziell erhältlich sein können, die für das Transformieren in Pflanzen hinein geeignet sind und für die Expression des Gens von Interesse in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hierin definiert, in den Verfahren der Erfindung vor.
• Im Genaueren sieht die vorliegende Erfindung ein Konstrukt vor, umfassend:
• (a) eine Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid oder ein R5PI-Polypeptid oder ein Znf A20/AN1-Polypeptid oder ein PHD-zf-Polypeptid oder ein REF/ALY-Polypeptid, wie oben definiert, codiert;
• (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
• (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
• Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, welche ein REF/ALY-Polypeptid codiert, wie oben definiert beschaffen. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert beschaffen.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide, ist eine der Steuerungssequenzen eines Konstrukts vorzugsweise ein aus einem Pflanzengenom isolierter konstitutiver Promotor. Ein Beispiel eines konstitutiven Promotors ist ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis, am stärksten bevorzugt eine GOS2-Sequenz, wie durch SEQ ID NR: 494 repräsentiert.
• Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine beliebige der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, die auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen erfolgreich zu transformieren und Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig an eine oder mehrere Steuerungssequenzen (mindestens an einen Promotor) verknüpft.
• In Bezug auf TFL1-like-Polypeptide kann in vorteilhafter Weise ein beliebiger Typ von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz anzutreiben, aber vorzugsweise ist der Promotor von pflanzlichem Ursprung. Ein konstitutiver Promotor ist in den Verfahren besonders nützlich. Vorzugsweise ist der konstitutive Promotor ebenfalls ein ubiquitärer Promotor mittlerer Stärke. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin.
• In Bezug auf R5PI-Polypeptide kann in vorteilhafter Weise ein beliebiger Typ von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz anzutreiben, aber vorzugsweise ist der Promotor von pflanzlichem Ursprung. Ein konstitutiver Promotor ist in den Verfahren besonders nützlich. Vorzugsweise ist der konstitutive Promotor ebenfalls ein ubiquitärer Promotor mittlerer Stärke. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin.
• In Bezug auf Znf A20/AN1-Polypeptide kann in vorteilhafter Weise ein beliebiger Typ von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz zu erhöhen. Ein konstitutiver Promotor ist in den Verfahren besonders nützlich, vorzugsweise ein konstitutiver Promotor, der aus einem Pflanzengenom isoliert ist. Der pflanzliche konstitutive Promotor treibt die Expression einer codierenden Sequenz bei einem Spiegel an, der in allen Fällen unterhalb von demjenigen liegt, der unter der Steuerung eines viralen 35S-CaMV-Promotors erhalten wird.
• Andere organspezifische Promotoren, zum Beispiel für bevorzugte Expression in Blättern, Stengeln, Knollen, Meristemen, Samen (Embryo und/oder Endosperm), sind nützlich in der Ausführung der Verfahren der Erfindung. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide kann in vorteilhafter Weise ein beliebiger Typ von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz zu erhöhen. Ein konstitutiver Promotor ist in den Verfahren besonders nützlich, vorzugsweise ein konstitutiver Promotor, der aus einem Pflanzengenom isoliert ist. Der pflanzliche konstitutive Promotor treibt die Expression einer codierenden Sequenz bei einem Spiegel an, der in allen Fällen unterhalb von demjenigen liegt, der unter der Steuerung eines viralen 35S-CaMV-Promotors erhalten wird. Ein Beispiel eines solchen Promotors ist ein GOS2-Promotor, wie durch SEQ ID NR: 494 repräsentiert.
• Organspezifische Promotoren, zum Beispiel für bevorzugte Expression in Blättern, Stengeln, Knollen, Meristemen, Samen, sind nützlich in der Ausführung der Verfahren der Erfindung. Entwicklungs-regulierte und induzierbare Promotoren sind ebenfalls nützlich in der Ausführung der Verfahren der Erfindung. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen siehe den der Verfahren der Erfindung. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin.
• In Bezug auf REF/ALY-Polypeptide kann in vorteilhafter Weise ein beliebiger Typ von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz anzutreiben, aber vorzugsweise ist der Promotor von pflanzlichem Ursprung. Ein konstitutiver Promotor ist in den Verfahren besonders nützlich. Vorzugsweise ist der konstitutive Promotor ebenfalls ein ubiquitärer Promotor mittlerer Stärke. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin In Bezug auf TFL1-like-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die TFL1-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 1 repräsentiert wird, begrenzt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer TFL1-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
• Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Promotor von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, wie ein GOS2-Promotor, weiter bevorzugt ist der Promotor ein GOS2-Promotor aus Reis. Noch weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, welche im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 128 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 128 repräsentiert. Siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin für weitere Beispiele von konstitutiven Promotoren.
• In Bezug auf R5PI-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die R5PI-Polypeptid codierende Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 140, beschränkt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer R5PI-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
• Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, weiter bevorzugt gewählt aus einem pflanzlich-abgeleitetem Promotor, wie etwa einem GOS2-Promotor, stärker bevorzugt ist der Promotor ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, die im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 211 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 211 repräsentiert. Siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin für weitere Beispiele von konstitutiven Promotoren.
• Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, umfassend einen GOS2-Promotor, der im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 211 ist, und die Nukleinsäure, welche das R5PI-Polypeptid codiert.
• In Bezug auf Znf A20/AN1-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf eine das Znf A20/AN1-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 212 oder durch SEQ ID NR: 214 beschränkt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer Znf-A20/AN1-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz unter der Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
• Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- wie auch Translations-Erhöher einschließen. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Terminator- und Increaser- bzw. Erhöher-Sequenzen, welche zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Außerdem kann eine Intron-Sequenz an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder in der codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert, wie es im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben ist. Weitere Steuerungssequenzen (neben Promotor, Erhöher, Silencer, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Derartige Sequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt oder können von ihm ohne weiteres erhalten werden.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf eine das PHD-zf-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 347, beschränkt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer PHD-zf-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz unter der Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
• Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- wie auch Translations-Erhöher einschließen. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Terminator- und Erhöher-Sequenzen, welche zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Außerdem kann eine Intron-Sequenz an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder in der codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkuumuliert, wie es im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben ist. Weitere Steuerungssequenzen (neben Promotor, Erhöher, Silencer, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Derartige Sequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt oder können von ihm ohne weiteres erhalten werden.
• In Bezug auf REF/ALY-Polypeptide sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die REF/ALY-Polypeptid codierende Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 497, beschränkt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer REF/ALY-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
• Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein Promotor mittlerer Stärke, weiter bevorzugt gewählt aus einem pflanzlich-abgeleitetem Promotor, wie etwa einem GOS2-Promotor oder einem HMGP(High Mobility Group Protein)-Promotor, und ist weiter bevorzugt der GOS2-Promotor aus Reis oder ein HMGP-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, die im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 547 oder zu SEQ ID NR: 548 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 547 oder SEQ ID NR: 548 repräsentiert. Siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin für weitere Beispiele von konstitutiven Promotoren.
• Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, umfassend einen GOS2-Promotor, der im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 547 oder zu SEQ ID NR: 548 ist, und die Nukleinsäure, welche das REF/ALY-Polypeptid codiert.
• Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- wie auch Translations-Enhancer einschließen. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Terminator- und Enhancer-Sequenzen, welche zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Außerdem kann eine Intron-Sequenz an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder in der codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert, wie es im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben ist. Weitere Steuerungssequenzen (neben Promotor, Enhancer, Silencer, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Derartige Sequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt oder können von ihm ohne weiteres erhalten werden.
• Die genetischen Konstrukte der Erfindung können ferner eine Replikationsursprung-Sequenz enthalten, welche für die Beibehaltung und/oder Replikation in einem spezifischen Zelltyp erfordert wird. Ein Beispiel besteht in dem Fall, dass ein genetisches Konstrukt in einer Bakterienzelle als ein episomales genetisches Element (z. B. Plasmid- oder Cosmid-Molekül) gehalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den f1-ori und colE1 ein.
• Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie in den Verfahren der Erfindung verwendet, und/oder die Selektion von transgenen Pflanzen, welche diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Deshalb kann das genetische Konstrukt gegebenenfalls ein selektierbares Markergen umfassen. Selektierbare Marker sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markerentfernung sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
• Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäure-sequenzen in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeteten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie denjenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktionsfähig sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuresequenzmoleküle, die einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäuresequenz transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markergen-Entfernung sind im Fachgebiet bekannt, verwendbare Techniken sind oben im Abschnitt 'Definitionen' beschrieben.
• In Bezug auf TFL1-like-Polypeptide sieht die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von jedweder Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert.
• Im Genaueren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem (Samen)ertrag, bereit, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
• (i) das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle, von einer TFL1-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure; und
• (ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines TFL1-like-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
• In Bezug auf R5PI-Polypeptide sieht die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer beliebigen Nukleinsäure, die ein R5PI-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert.
• Im Genaueren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem (Samen)ertrag, bereit, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
• (i) das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle, von einer R5PI-Polypeptid codierenden Nukleinsäure; und
• (ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines R5PI-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
• In Bezug auf Znf A20/AN1-Polypeptide sieht die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert.
• Im Genaueren, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren umfasst:
• (i) das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle; und
• (ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• Die Nukleinsäuresequenz von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen sein, die zum Codieren eines Znf A20/AN1-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
• In Bezug auf PHD-zf-Polypeptide sieht die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert.
• Im Genaueren, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
• (i) das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle; und
• (ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• Die Nukleinsäuresequenz von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen sein, die zum Codieren eines PHD-zf-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage ist.
• In Bezug auf REF/ALY-Polypeptide, stellt die Erfindung auch ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Einbringen und die Expression, in einer Pflanze, von einer beliebigen Nukleinsäure codierend ein REF/ALY-Polypeptid, wie hierin oben definiert umfasst.
• Im Genaueren, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem (Samen)ertrag, bereit, wobei das Verfahren umfasst:
• (i) das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder Pflanzenzelle, von einer REF/ALY-Polypeptid codierenden Nukleinsäure; und
• (ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines REF/ALY-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
• Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich Einbringung in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung, wird die Nukleinsäure vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” ist ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” hierin beschrieben.
• Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren können in den oben erwähnten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer gefunden werden.
• Nach einer Transformation werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen im Allgemeinen hinsichtlich Gegenwart von einem oder mehreren Markern selektiert, welche von pflanzlichexprimierbaren Genen codiert werden, die mit dem Gen von Interesse co-transferiert wurden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial, in der Regel, selektiven Bedingungen unterworfen, so dass transformierte Pflanzen von nicht-transformierten Pflanzen unterschieden werden können. Zum Beispiel können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und, nach einer anfänglichen Wachstumsperiode, einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Wachsenlassen der Samen, zutreffendenfalls nach Sterilisation, auf Agarplatten unter Anwendung eines geeigneten Selektionsmittels, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen hinsichtlich der Gegenwart eines selektierbaren Markers, wie denjenigen, die oben beschrieben sind, gescreent.
• Im Anschluss an DNA-Transfer und Regeneration können vermeintlich transformierte Pflanzen auch, zum Beispiel unter Anwendung von Southern-Analyse, hinsichtlich der Gegenwart des Gens von Interesse, der Kopienzahl und/oder der genomischen Organisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können Expressionsspiegel der neu eingeführten DNA unter Anwendung von Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind Die erzeugten, transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Methoden vermehrt werden, wie etwa durch klonale Propagation oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder T1) geselbstet, und homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann durch klassische Züchtungstechniken werter vermehrt werden. Die erzeugten, transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen einnehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nicht-transformierten Zellen; klonale Transformanten (z. B. wobei alle Zellen transformiert sind, um die Expressionskassette zu enthalten); Propfungen von transformierten und nicht-transformierten Geweben (z. B. in Pflanzen, in denen ein transformierter Wurzelstock an einen nicht-transformierten Spross gepropft wird) sein.
• Die vorliegende Erfindung erstreckt sich in deutlicher Weise auf eine beliebige Pflanzenzelle oder Pflanze, welche durch ein beliebiges der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie auf alle Pflanzenteile und Fortpflanzungskeime bzw. Verbreitungseinheiten davon. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner dahingehend, dass die Nachkommenschaft eines/einer primären transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, welche(s) durch ein beliebiges der zuvor erwähnten Verfahren hergestellt worden ist, beinhaltet ist, wobei die einzige Anforderung dann besteht, dass die Nachkommen in den Verfahren gemäß der Erfindung dieselben genotypischen und/oder phänotypischen Merkmal(e) aufzeigen, wie diejenigen, welche von der Elternform hervorgebracht werden.
• Die Erfindung schließt auch Wirtszellen ein, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, welche ein TFL1-like-Polypeptid oder ein R5PI-Polypeptid oder ein Znf A20/AN1-Polypeptid oder ein PHD-zf-Polypeptid oder ein REF/ALY-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert. Bevorzugte Wirtszellen gemäß der Erfindung sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, welche in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind, im Prinzip, in vorteilhafter Weise alle Pflanzen, welche zum Synthetisieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptide in der Lage sind.
• Die Verfahren der Erfindung sind in vorteilhafter Weise auf eine beliebige Pflanze anwendbar. Zu Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäumen oder Sträuchern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Nutzpflanze. Zu Beispielen von Nutzpflanzen zählen Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Alfalfa, Raps, Leinsamen, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt ist die Pflanze eine monokotyledone Pflanze. Zu Beispielen von monokotyledonen Pflanzen zählt Zuckerrohr. Weiter bevorzugt ist die Pflanze ein Getreide. Zu Beispielen von Getreiden zählen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer.
• Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf erntefähige Teile einer Pflanze, wie, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stengel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln, wobei die erntefähigen Teile eine rekombinante Nukleinsäure umfassen, welche ein TFL1-like-Polypeptid oder ein R5PI-Polypeptid oder ein Znf A20/AN1-Polypeptid, oder ein PHD-zf-Polypeptid oder ein REF/ALY-Polypeptid codiert. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet, vorzugsweise direkt abgeleitet sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
• Gemäß eines bevorzugten Merkmals der Erfindung, ist die modulierte Expression eine erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen, oder Genprodukten, sind im Fachgebiet gut dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
• Wie oben erwähnt, erfolgt ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid oder ein R5PI-Polypeptid oder ein Znf A20/AN1-Polypeptid, oder ein PHD-zf-Polypeptid oder ein REF/ALY-Polypeptid codiert, durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid oder ein R5PI-Polypeptid oder ein Znf A20/AN1-Polypeptid, oder ein PHD-zf-Polypeptid oder ein REF/ALY-Polypeptid codiert; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften, auch unter Verwendung anderer gut bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
• Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die TFL1-like-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Verwendung dieser TFL1-like-Polypeptide bei der Steigerung beliebiger der oben erwähnten ertagsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen.
• Ferner umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die R5PI-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Anwendung dieser R5PI-Polypeptide in der Steigerung beliebiger der zuvor erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen.
• Noch weiter umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die Znf A20/AN1-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Anwendung dieser Znf A20/AN1-Polypeptide in der Erhöhung beliebiger der zuvor erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen unter normalen Wachstumsbedingungen, unter abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen (vorzugsweise osmotischen Stress-Wachstumsbedingungen) und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit.
• Noch weiter umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die PHD-zf-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Anwendung dieser PHD-zf-Polypeptide in der Erhöhung beliebiger der zuvor erwähnten samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen unter normalen Wachstumsbedingungen, unter abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen (vorzugsweise osmotischen Stress-Wachstumsbedingungen) und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit.
• Ferner umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Nukleinsäuren, die REF/ALY-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Anwendung dieser REF/ALY-Polypeptide in der Steigerung beliebiger der zuvor erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen.
• Nukleinsäuren, die TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide, die hieim beschrieben sind codieren, oder die TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide selbst, können Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein Gen gekoppelt sein kann, das TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide codiert. Die Nukleinsäuren/Gene, oder die TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide selbst, können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und/oder samenertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
• Allelische Varianten eine(r/s) TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide codierenden Nukleinsäure/-Gens können ebenfalls Anwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Solche Züchtungsprogramme erfordern machmal das Einbringen von allelischer Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese angewandt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Sammlung von allelischen Varianten von, unabsichtlich verursachtem, sogenannten ”natürlichen” Ursprung beginnen. Die Identifizierung allelischer Varianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von höherwertigen allelischen Varianten der betreffenden Sequenz, und welche erhöhten Ertrag ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen, die verschiedene allelische Varianten der betreffenden Sequenz entnalten, ausgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte beinhalten das Kreuzen von Pflanzen, in denen die höherwertige allelische Variante identifiziert wurde, mit einer anderen Pflanze. Dies könnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
• Nukleinsäuren, die TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide codieren, können ebenfalls als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, sowie als Marker für mit diesen Genen gekoppelte Merkmale verwendet werden. Derartige Informationen können in der Pflanzenzucht nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwicklen. Eine derartige Verwendung von Nukleinsäuren, die TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide codieren, erfordert lediglich eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Die TFL1-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäuren können als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus(RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J., Fritsch, EF., und Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsverdauter pflanzlicher genomischer DNA können mit den TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die resultierenden Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174-181) unterzogen werden, um eine genetische Karte zu erstellen. Darüber hinaus können die Nukleinsäuren verwendet werden, um Southern-Blots zu sondieren, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs aus einer Auswahl von Individuen enthalten, welche Eltern und Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird aufgezeichnet und verwendet, um die Position der Nukleinsäure, welche TFL1-like-Polypeptide oder R5PI-Polypeptide oder Znf A20/AN1-Polypeptide oder PHD-zf-Polypeptide oder REF/ALY-Polypeptide codiert, in der genetischen Karte zu berechnen, welche zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331).
• Die Herstellung und Anwendung von Pflanzengen-abgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37-41, beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwenden der oben geschilderten Methodik oder Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Interkross-Populationen, Rückkreuzungs-Populationen, wahllos gekreuzte Populationen, beinahe-isogene Linien und andere Individuengruppierungen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
• Die Nukleinsäure-Sonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al., in: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319-346, und darin zitierte Literaturstellen).
• In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäure-Sonden bei der direkten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH)-Kartierung verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149-154). Obwohl derzeitige Verfahren zur FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone begünstigen (mehrere kb bis einige hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13-20), können Verbesserungen der Empfindlichkeit eine Ausführung der FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden erlauben.
• Eine Vielzahl von auf Nukleinsäure-Amplifikation basierenden Verfahren zur genetischen und physikalischen Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95-96), Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325-332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077-1080), Nukleotid-Verlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping bzw. Bestrahlungs-Hybridkartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22-28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795-6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure verwendet, um Primerpaare zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen zu entwerfen und herzustellen. Das Entwerfen derartiger Primer ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. In Verfahren unter Anwendung von PCR-basierter genetischer Kartierung kann es notwendig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
• Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit erhöhten L ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften, wie etwa weiteren ertragserhöhenden Eigenschaften, Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen Stressformen, Toleranz gegenüber Herbiziden, Insektiziden, Eigenschaften, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren, kombiniert werden.
• Merkmals-Gesichtspunkte
• 1. Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like, Terminal Flower1-like, -Polypeptid codiert, und gegebenenfalls das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit gesteigertem Samenertrag umfasst.
• 2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das TFL1-like-Polypeptid eine Sequenz umfasst die in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, folgendes aufweist: (i) eine Phosphatidylethanolamin-Bindungsprotein(PEBP)-Domäne (Domänen-Zugangsnummer in Pfam: PFAM01161), vorzugsweise wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden, weiter bevorzugt wie durch die Sequenz repräsentiert, die zwischen den Aminosäuren 66-88 in SEQ ID NR: 2 enthalten ist, noch weiter bevorzugt wie in SEQ ID NR: 26 (P.trichocarpa_575797_BFT) vorhanden; und (ii) einen konservierten Histidin (His oder H)- oder vorzugsweise einen Tyrosin(Tyr oder Y)-Rest an einer Stelle, äquivalent zu jener von Aminosäurerest His86 (H86) in SEQ ID NR: 2, sowie einen konservierten Asparaginsäure(D)-Aminosäure- oder vorzugsweise einen Glutaminsäure(Glu)-Aminosäurerest an einer Steile, äquivalent zu jener von Aminosäurerest Asp142 (D142) in SEQ ID NR: 2.
• 3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
• 4. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A1 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
• 5. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von beliebigen der in Tabelle A1 angegebenen Proteine codiert.
• 6. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhte Biomasse, vorzugsweise Spross- und/oder Wurzelbiomasse, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
• 7. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei die gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaft aus der Gruppe gewählt wird, die aus Samenertrag, Anzahl an Samen pro Pflanze, Anzahl gefüllter Samen pro Rispe und Ernteindex besteht.
• 8. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1 bis 7, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Dürrestress-Wachstumsbedingungen erhalten werden.
• 9. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
• 10. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Salicaceae, am stärksten bevorzugt aus Populus tichocarpa ist.
• 11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein TFL1-like-Polypeptid codiert.
• 12. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend ein beliebiges aus folgendem: (i) eine Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 31 oder SEQ ID NR: 117 repräsentiert wird; (ii) eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, welche(s) zu (i) SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 31 oder SEQ ID NR: 117 komplementär ist; (iii) eine Nukleinsäure, codierend ein TFL1-like-Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu (i) SEQ ID. 11, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 31 oder SEQ ID NR: 117; (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen zum Hybridisieren an eine beliebige der oben in (i), (ii) oder (iii) angegebenen Nukleinsäuren in der Lage ist.
• 13. isoliertes Polypeptid, umfassend: (i) eine Aminosäuresequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu (i) SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 32 oder SEQ ID NR: 118; und/oder (ii) Derivate von beliebigen der in (i) angegebenen Aminosäuresequenzen.
• 13. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, codierend ein TFL1-like-Polypeptid, wie in den Punkten 1, 2 oder 13 definiert, oder eine Nukleinsäure gemäß Punkt 12; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 14. Konstrukt gemäß Punkt 14, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis ist.
• 16. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 14 oder 15 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 17. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 14 oder 15 transformiert ist.
• 18. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, codierend ein TFL1-like-Polypeptid, wie in Punkt 1, 2 oder 13 definiert, oder einer Nukleinsäure gemäß Punkt 12; und (ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern; und gegebenenfalls (iii) das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag.
• 19. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure resultiert, die ein TFL1-like-Polypeptid, wie in Punkt 1, 2 oder 13 definiert, codiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 20. Transgene Pflanze gemäß Punkt 11, 17 oder 19, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
• 21. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 20, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
• 22. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 20 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 21 abgeleitet sind.
• 23. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Samenertrags im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 24. Verfahren zur Steigerung ertragsbezogenenr Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein R5PI, Ribose-5-Phosphat-Isomerase-Polypeptid codiert, und gegebenenfalls Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit gesteigertem Samenertrag.
• 25. Verfahren gemäß Punkt 24, wobei das R5PI-Polypeptid eine Sequenz umfasst, die in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz folgendes aufweist: (i) eine Proteindomäne mit 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Domäne Rib_5-Pisom_A in SEQ ID NR: 140, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 204, und/oder (ii) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von beliebigen der Polypeptide von Tabelle A2; und/oder (iii) ein Motiv mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu der Aminosäure, repräsentiert durch ein beliebiges von Motiv 6 bis Motiv 9, wie jeweils durch SEQ ID NR: 205 bis 208 repräsentiert.
• 26. Verfahren gemäß Punkt 24 oder 25, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein R5PI-Polypeptid codiert, bewirkt wird.
• 27. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 24 bis 26, wobei die ein R5PI-Polypeptid codierende Nukleinsäure ein beliebiges der in Tabelle A2 gelisteten Proteine codiert, oder ein Abschnitt einer solchen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure in der Lage ist.
• 28. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 24 bis 27, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A2 angegebenen Proteine codiert.
• 29. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 24 bis 28, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhte Biomasse, vorzugsweise Spross- und/oder Wurzelbiomasse, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
• 30. Verfahren gemäß Punkt 24 bis 28, wobei die gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaft gewählt ist aus der Gruppe, die aus dem Gesamtgewicht pro Pflanze, der Anzahl an Samen pro Pflanze, der Anzahl gefüllter Samen pro Pflanze und der Anzahl an Blüten pro Rispe besteht.
• 31. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 24 bis 30, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stress-Bedingungen erhalten werden.
• 32. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 24 bis 30, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Stickstoffmangel-Wachstumsbedingungen erhalten werden.
• 33. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 26 bis 32, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
• 34. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 24 bis 33, wobei die Nukleinsäure, die ein R5PI-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brasicaceae, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana ist.
• 35. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein TFL1-like-Polypeptid codiert.
• 36. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, codierend ein R5PI-Polypeptid, wie in den Punkten 24 oder 25 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 37. Konstrukt gemäß Punkt 36, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis ist.
• 38. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 36 oder 37 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 39. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 35 oder 38 transformiert ist.
• 40. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein R5PI-Polypeptid codiert, wie in Punkt 24 oder 25 definiert, in einer Pflanze; und (ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern; und gegebenenfalls (iii) das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag
• 41. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure resultiert, die ein R5PI-Polypeptid codiert, wie in Punkt 24 oder 25 definiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 42. Transgene Pflanze gemäß Punkt 35, 39 oder 40, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
• 43. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 42, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
• 44. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 42 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 43 abgeleitet sind.
• 45. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein R5PI-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Samenertrags im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 46. Verfahren zur Erhöhung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Erhöhen der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Zinkffinger(Znf)-Domäne-haltiges A20/AN1-Polypeptid, wobei das Znf A20/AN1-Polypeptid (i) mindestens eine A20-Typ-Zinkfinger-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR002653 (ProSite-Zugangsnummer PS51036); und (ii) mindestens eine AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR000058 (ProSite-Zugangsnummer PS51039) umfasst, und gegebenenfalls das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften.
• 47. Verfahren gemäß Punkt 46, wobei das Znf A20/AN1-Polypeptid umfasst: (i) eine Domäne mit mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer A20-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 338 oder durch SEQ ID NR: 339 repräsentiert; und (ii) eine Domäne mit mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 340, oder durch SEQ ID NR: 341, repräsentiert.
• 48. Verfahren gemäß Punkt 46 oder 47, wobei das Znf A20/AN1-Polypeptid, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem Znf A20/AN1-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 213 oder durch SEQ ID NR: 215 repräsentiert, oder zu beliebigen der hierin in Tabelle A3 angegebenen Polypeptidsequenzen aufweist.
• 49. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 46 bis 48, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, repräsentiert wird durch eine beliebige der in Tabelle A3 angegebenen Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NRn, oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die zum Hybridisieren mit einer beliebigen der in Tabelle A4 angegebenen Nukleinsäuresequenzen-SEQ ID NRn in der Lage ist.
• 50. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 46 bis 49, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 angegebenen Polypeptidsequenz-SEQ ID-NRn codiert.
• 51. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 46 bis 50, wobei die erhöhte Expression durch ein oder mehrere beliebige aus: T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING oder homologe Rekombination, bewirkt wird.
• 52. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 46 bis 51, wobei die erhöhte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
• 53. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 46 bis 52, wobei die erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft eines oder mehrere ist von: (I) erhöhte Frühwuchskraft; (ii) erhöhte oberirdische Biomasse; (iii) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze; (iv) erhöhte Anzahl an gefüllten Samen; (v) erhöhte Samenfüllrate; oder (v) erhöhter Ernteindex.
• 54. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 46 bis 48, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor verbunden ist, vorzugsweise mit einem konstitutiven Pflanzen-Promotor, weiter bevorzugt mit einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, wie durch SEQ ID NR: 342 repräsentiert.
• 55. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 46 bis 54, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana ist.
• 56. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 46 bis 54, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Fabaceae, am stärksten bevorzugt aus Medicago truncatula ist.
• 57. Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen), oder Pflanzenzellen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Pflanze, der Teil oder die Zelle davon ein isoliertes Nukleinsäure-Transgen, das ein Znf A20/AN1 codiert, umfasst.
• 58. Eine isolierte Nukleinsäuresequenz umfassend: (i) eine Nukleinsäuresequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NRn: 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334 oder 336 repräsentiert; (ii) das Komplement einer Nukleinsäuresequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NRn: 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334 oder 336 repräsentiert; (iii) eine Nukleinsäuresequenz, codieren ein Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NRn: 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335 oder 337;
• 59. Ein isoliertes Polypeptid, umfassend: (i) eine Polypeptidsequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NRn: 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335 oder 337; (ii) eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Polypeptidsequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NRn: 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335 oder 337 repräsentiert; (iii) Derivate von einer beliebigen der in (i) oder (ii) oben angegebenen Polypeptidsequenzen.
• 60. Konstrukt, umfassend: (a) eine Nukleinsäuresequenz, codierend ein Znf A20/AN1-Polypeptid, wie in einem beliebigen der Punkte 46 bis 50 oder 58 definiert; (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 61. Verfahren gemäß Punkt 15, wobei die Steuerungssequenz ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, weiter bevorzugt ein GOS2-Promotor, wie er durch SEQ ID NR: 342 repräsentiert wird ist.
• 62. Verwendung eines Konstrukts gemäß den Punkten 60 oder 61 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften eines oder mehrere sind von: (i) erhöhte Frühwuchskraft; (ii) erhöhte oberirdische Biomasse; (iii) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze; (iv) erhöhte Anzahl an gefüllten Samen; (v) erhöhte Samenfüllrate; oder (vi) erhöhter Ernteindex.
• 63. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 60 oder 61 transformiert ist.
• 64. Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein Znf-A20/AN1-Polypeptid codiert, wie in einem beliebigen der Punkte 46 bis 50, oder 58 definiert, in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle; und (ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• 65. Transgene Pflanze mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche aus der erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Znf A20/AN1-Polypeptid, wie in einem beliebigen der Punkte 46 bis 50, oder 58 definiert, resultieren, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgener Pflanzenteil, welche(r) aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 66. Transgene Pflanze gemäß Punkt 57, 63 oder 65, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist, oder eine aus der transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
• 67. Erntefähige Teile, umfassend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, von einer Pflanze gemäß Punkt 66, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
• 68. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 66 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 67 abgeleitet sind.
• 69. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, wie in einem beliebigen der Punkte 46 bis 50, oder 58 definiert, bei der Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften, welche eines oder mehrere von: (i) erhöhter Frühwuchskraft; (ii) erhöhter oberirdischer Biomasse; (iii) erhöhtem Gesamt-Samenertrag pro Pflanze; (iv) erhöhter Anzahl an gefüllten Samen; (v) erhöhter Samenfüllrate; oder (vi) erhöhtem Ernteindex, umfassen.
• 70. Verfahren zur Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Pflanzen-Homeodomäne-Zinkfinger(PHD-zf)-Polypeptid, in einer Pflanze umfasst, wobei das PHD-zf-Polypeptid in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer ”Conserved Domain”, wie durch SEQ ID NR: 145 repräsentiert; und (ii) in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Pflanzen-Homeodomäne-Zinkfinger(PHD-zf)-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR001965, wie durch SEQ ID NR: 492 repräsentiert, umfasst.
• 71. Verfahren gemäß Punkt 70, wobei das PHD-zf-Polypeptid ferner eines oder mehrere von folgendem umfasst: (i) eine vorhergesagte Transmembran-Domäne; (ii) ein E/D-reiches Motiv; und (iii) einen Zinkfinger mit der Consensus-Sequenz CXXC_8-21CXXC₄HXXC_12-46CXXC.
• 72. Verfahren gemäß Punkt 70 oder 71, wobei das PHD-zf-Polypeptid in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem PHD-zf-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 348 repräsentiert, aufweist.
• 73. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 70 bis 72, wobei das PHD-zf-Polypeptid in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu beliebigen der in Tabelle A4 hierin angegebenen Polypeptidsequenzen aufweist.
• 74. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 70 bis 73, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid codiert, repräsentiert wird durch eine beliebige der in Tabelle A4 angegeben Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NRn, oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die zum Hybridisieren mit einer beliebigen der in Tabelle A4 angegebenen Nukleinsäuresequenzen-SEQ ID NRn, oder an ein Komplement davon, in der Lage ist.
• 75. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 70 bis 74, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 angegebenen Polypeptidsequenz-SEQ ID-NRn codiert.
• 76. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 70 bis 75, wobei die erhöhte Expression durch ein oder mehrere beliebige aus: T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING oder homologe Rekombination, bewirkt wird.
• 77. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 70 bis 76, wobei die erhöhte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
• 78. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 70 bis 77, wobei die erhöhte samenertragsbezogene Eigenschaft eines oder mehrere ist von: erhöhter Pflanzenhöhe, erhöhte Samenfüllrate, erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispen, und erhöhtem Tausendkerngewicht (TKW).
• 79. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 70 bis 78, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor verbunden ist.
• 80. Verfahren gemäß Punkt 79, wobei der konstitutive Promotor ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis, am stärksten bevorzugt eine GOS2-Sequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 494, ist.
• 81. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 70 bis 80, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid codiert, aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, stärker bevorzugt aus der Familie Solanaceae ist, und die Nukleinsäuresequenz am stärksten bevorzugt aus Lycopersicon esculentum ist.
• 82. Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen), oder Pflanzenzellen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Pflanze, der Teil oder die Zelle davon ein isoliertes Nukleinsäure-Transgen umfasst, das ein PHD-zf-Polypeptid codiert.
• 83. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das aus folgendem gewählt ist: (i) eine Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 475, SEQ ID NR: 477, SEQ ID NR: 479, SEQ ID NR: 481, SEQ ID NR: 483, SEQ ID NR: 485, SEQ ID NR: 487, SEQ ID NR: 489; (ii) das Komplement einer Nukleinsäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 475, SEQ ID NR: 477, SEQ ID NR: 479, SFQ ID NR: 481, SFQ ID NR: 483, SEQ ID NR: 485 SEQ ID NR: 487, SEQ ID NR: 489 repräsentiert; (iii) eine Nukleinsäuresequenz, codierend ein PHD-zf-Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu der Polypeptidsequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 348, und mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu SEQ ID NR: 491.
• 84. Ein isoliertes Polypeptid, das aus folgendem gewählt ist: (i) einer Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 476, SEQ ID NR. 478, SEQ ID NR: 480, SEQ ID NR: 482, SEQ ID NR: 484, SEQ ID NR: 486, SEQ ID NR: 488, SEQ ID NR: 490; (ii) einer Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder more Aminosäuresequenzidentität zu einer Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 476, SEQ ID NR: 478, SEQ ID NR: 480, SEQ ID NR: 482, SEQ ID NR: 484, SEQ ID NR: 486, SEQ ID NR: 488, SEQ ID NR: 490; (iii) Derivate von beliebigen der in (i) oder (ii) oben angegebenen Polypeptidsequenzen.
• 85. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäuresequenz, codierend ein PHD-zf-Polypeptid, wie definiert in einem beliebigen der Punkte 70 bis 75, oder 83; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 86. Konstrukt gemäß Punkt 85, wobei die Steuerungsequenz ein konstitutiver Promotor ist.
• 87. Konstrukt gemäß Punkt 86, wobei der konstitutive Promotor ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis, am stärksten bevorzugt eine GOS2-Sequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 494, ist.
• 88. Verwendung eines Konstrukts gemäß einem beliebigen der Punkte 85 bis 87 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei die erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften eines oder mehrere sind von: erhöhter Pflanzenhöhe, erhöhte Samenfüllrate, erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispen, und erhöhtem Tausendkerngewicht (TKW).
• 89. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß einem beliebigen der Punkte 85 bis 87 transformiert ist.
• 90. Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid codiert, wie in einem beliebigen der Punkte 1 bis 6, oder 14 definiert, in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle; und (ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• 91. Transgene Pflanze mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche aus der erhöhten Expression einer isolierten Nukleinsäuresequenz resultieren, die ein PHD-zf-Polypeptid codiert, wie in einem beliebigen der Punkte 70 bis 75, oder 83 definiert, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgener Pflanzenteil, welche(r) aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 92. Transgene Pflanze gemäß Punkt 82, 89 oder 91, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist, oder eine aus der transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
• 93. Erntefähige Teile, umfassend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid codiert, von einer Pflanze gemäß Punkt 92, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
• 94. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 92 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 93 abgeleitet sind.
• 95. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid codiert, wie es in einem beliebigen der Punkte 70 bis 75 definiert ist, bei der Erhöhung von samenertragsbezogenen Eigenschaften, welche eines oder mehrere von: erhöhter Pflanzenhöhe, erhöhte Samenfüllrate, erhöhte Anzahl an Blüten pro Rispen, und erhöhtem Tausendkerngewicht (TKW), umfassen.
• 96. Ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein REF/ALY(RNA und Export-Faktor-bindendes Protein)-Polypeptid codiert, und gegebenenfalls das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit gesteigertem Samenertrag.
• 97. Verfahren gemäß Punkt 96, wobei das REF/ALY-Polypeptid mindestens ein konserviertes Proteinmotiv umfasst, aufweisend, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einem beliebigen von: (i) Motiv 10, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 540 (SAEDLDADLDKYHS) (ii) Motiv 11, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 541 (LDMSLDDMIAKNRK) (iii) Motiv 12, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 542 (KAPESTWGHDMF) (iv) Motiv 13, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 543 (WQHDMY) (v) Motiv 14, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 544 (KLYISNLDYGV)
• 98. Verfahren gemäß Punkt 96 oder 97, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein REF/ALY-Polypeptid codiert, bewirkt wird.
• 99. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 96 bis 98, wobei die Nukleinsäure, die ein REF/ALY-Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A5 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
• 100. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 96 bis 99, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A5 angegebenen Proteine codiert.
• 101. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 96 bis 100, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
• 102. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 96 bis 101, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stress-Bedingungen erhalten werden.
• 103. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 96 bis 101, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen mit Dürrestress, Salzstress oder Stickstoffmangel erhalten werden.
• 104. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 98 bis 103, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
• 105. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 96 bis 104, wobei die Nukleinsäure, die ein REF/ALY-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana ist.
• 106. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 96 bis 105, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die ein REF/ALY-Polypeptid codiert, umfasst.
• 107. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, gewählt aus: (i) einer Nukleinsäure, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 505, 507 und 535; (ii) dem Komplement einer Nukleinsäure, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 505, 507 und 535; (iii) einer Nukleinsäure, codierend das Polypeptid, wie repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 506, 508 und 536, wobei die isolierte Nukleinsäure, vorzugsweise als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes, aus einer Polypeptidsequenz, wie durch eine beliebige von SEQ ID NR: 506, 508 und 536 repräsentiert, abgeleitet sein kann und weiter bevorzugt gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt; (iv) einer Nukleinsäure die, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu beliebigen der Nukleinsäuresequenzen von Tabelle A5 aufweist und weiter bevorzugt gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt; (v) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt; (vi) einer Nukleinsäure, codierend ein REF/ALY-Polypeptid, das, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zur Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 506, 508 und 536, und jedweden der anderen Polypeptidsequenzen in Tabelle A5, aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt.
• 108. Eine Aminosäuresequenz, repräsentiert durch ein beliebiges von: (i) SEQ ID NR: SEQ ID NR: SEQ ID NR: 506, 508 und 536; (ii) eine Aminosäuresequenz die, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz, repräsentiert durch eine beliebige von SEQ ID NR: 506, 508 und 536, und jedweden der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A5, aufweist und vorzugsweise gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vermittelt. (iii) Derivate von beliebigen der oben in (i) oder (ii) angegebenen Aminosäuresequenzen.
• 109. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, codierend ein REF/ALY-Polypeptid, wie in den Punkten 96 oder 97 und/oder Punkt 107 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
• 110. Konstrukt gemäß Punkt 109, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis ist.
• 111. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 109 oder 110 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• 112. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 109 oder 110 transformiert ist.
• 113. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) das Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein REF/ALY-Polypeptid codiert, wie in Punkt 96 oder 97 und/oder Punkt 107 definiert, in einer Pflanze; und (ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
• 114. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die ein REF/ALY-Polypeptid codiert, wie in Punkt 96 oder 97 und/oder Punkt 107 definiert resultiert oder eine transgene Pflanzenzelle die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
• 115. Transgene Pflanze gemäß Punkt 106, 112 oder 114, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
• 116. Erntfähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 115, wobei die erntfähige Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
• 117. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 115 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 116 abgeleitet sind.
• 118. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein REF/ALY-Polypeptid codiert, in der Erhöhung des Ertrags, insbesondere in der Erhöhung von Samenertrag und/oder Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
• Beschreibung der Figuren
• Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben, in denen:
• 1 ein multiples Alignment von TFL1-like-Polypeptiden repräsentiert.
• 2 zeigt zwei phylogenetische Bäume von Phosphatidylethanolamin-Bindungsproteinen:
• 2A: Baum nach Carmona et al. 2007, 2B: Baum nach Igasaki et al. 2008.
• 3 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer Arath_TFL1_LIKE_1 codierenden Nukleinsäure wie durch SEQ ID NR: 1 oder 3 representiert unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2).
• 4 repräsentiert ein multiples Alignment von R5PI-Polypeptiden.
• 5 zeigt einen phylogenetischen Baum von R5PI-Polypeptiden.
• 6 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer R5PI codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2).
• 7 repräsentiert die Domänenorganisation von Znf A20/AN1-Polypeptiden nach Vij & Tyagi (2008) Fund. Integr. Genomics). Die Autoren unterscheiden siebzehn Klassen von Znf-Polypeptiden- darunter Klasse I-Polypeptide- die mindestens eine A20-Zinkfinger-Domäne und mindestens eine AN1-Zinkfinger-Domäne umfassen. Diese Klasse ist in der Figur eingekreist und durch einen schwarzen Pfeil markiert.
• 8 repräsentiert eine Skizze eines Znf A20/AN1-Polypeptids, wie durch SEQ ID NR: 213 oder durch SEQ ID NR: 215 repräsentiert, das (i) mindestens eine A20-Typ-Zinkfinger-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR002653 (ProSite-Zugangsnummer PS51036); und (ii) mindestens eine AN1-Typ-Zinkfinger-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR000058 (ProSite-Zugangsnummer PS51039), umfasst.
• 9 zeigt ein AlignX(aus Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation)-Mehrfach-Sequenzalignment der Znf A20/AN1-Polypeptide von Tabelle A3. Die konservierten Cys-Reste der A20-Zinkfinger-Domäne sind schwarz markiert, vertikal eingekastet und sind auch an der Unterkante des Alignments angegeben, ebenso wie die konservierten Cys- und His-Reste der AN1-Zinkfinger-Domäne. Die A20-Zinkfinger-Domäne (wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 338 (enthalten in SEQ ID NR: 213) und durch SEQ ID NR: 339 (enthalten in SEQ ID NR: 215)) ist quer über die alignierten Polypeptide deutlich eingekastet. Die AN1-Zinkfinger-Domäne (wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 340 (enthalten in SEQ ID NR: 213) und durch SEQ ID NR: 341 (enthalten in SEQ ID NR: 215)) ist ebenfalls quer über die alignierten Polypeptide deutlich eingekastet.
• 10 zeigt den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, unter der Steuerung eines konstitutiven Promotors (pGOS2) aus Reis.
• 11 repräsentiert eine Skizze eines PHD-zf-Polypeptids, wie durch SEQ ID NR: 348 repräsentiert, das die folgenden Merkmale umfasst: eine 'Conserved Domain', wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 491 (enthalten in SEQ ID NR: 2), eine TMHMM-vorhergesagte Transmembrandomäne, ein E/D-reiches Motiv, einen PHD-zf mit InterPro-Zugangsnummer IPR001965, und ein KRAR-Motiv.
• 12 repräsentiert die graphische Ausgabe des Algorithmus TMHMM für SEQ ID NR: 348 zur Vorhersage von Transmembrandomänen. Aus der Algorithmus-Vorhersage unter Verwendung von SEQ ID NR: 348 wird eine Transmembrandomäne zwischen der Conserved Domain (CD) und der PHD-zf-Domäne mit der InterPro-Zugangsnummer IPR001965 vorhergesagt.
• 13 zeigt ein AlignX(aus Vektor NTI 10.3, Invitrogen Corporation)-Mehrfach-Sequenzalignment der PHD-zf-Polypeptide von Tabelle A4. Die Conserved Domain (CD) und der PHD-zf IPR001965 sind eingekastet und mit X's unter der Consensus-Sequenz-Zeile markiert. Die vorhergesagt TMHMM, das E/D-reiche Motiv und KRAR-Motiv sind ebenfalls eingekastet. Das konservierte W (Trp) innerhalb des PHD-zf ist doppelt unterstrichen.
• 14 zeigt den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa-Pflanzen, einer Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid codiert, unter der Steuerung eines Promotors, der in Pflanzen funktioniert.
• 15 repräsentiert Mehrfenh-Alignments von REF/ALY-Polypeptiden die Position der Motive 10 bis 14 und äquivalenter Motive in anderen REF/ALY-Polypeptiden ist über der Consensus-Sequenz hervorgehoben. Die RRM-Domäne in der Consensus-Sequenz ist eingekastet.
• 16 zeigt einen phylogenetischen Baum von REF/ALY-Polypeptiden.
• 17 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer REF/ALY-codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2) oder eines Reis-HMGP-Promotors (pHMGP).
• Beispiele
• Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche alleinig der Veranschaulichung dienen. Mit den folgenden Beispielen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung vollständig zu definieren oder anderweitig zu begrenzen.
• DNA-Manipulation: Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols,beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) und Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
• Beispiel 1: Identifizieren von Sequenzen, die mit der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind
• Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der Nukleinsäuresequenz verwandt sind, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) und anderen Sequenzdatenbanken bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen identifiziert, wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Das Programm wird eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. Zum Beispiel wurde das von der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet, und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg.
• 1.1. TFL1-like-Polypeptide
• Die Tabelle A1 gibt eine Liste von TFL1-like-Nukleinsäuresequenzen und davon codierten Polypeptiden an, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Tabelle A1: Beispiele von TFL1-like-Nukleinsäuren und ihren codierten Polypeptiden:

  NAME	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Polypeptid SEQ ID NR:
  Arath_TFL1_like	1	2
  Orysa_TFL1_like_1	3	4
  Orysa_TFL1_like_2	5	6
  Zeama_TFL1_like_1	7	8
  Zeama_TFL1_like_2	9	10
  Zeama_TFL1_like_3	11	12
  Glyma_TFL1_like_1	13	14
  Poptr_TFL1-like_1	15	16
  Poptr_TFL1-like_2	17	18
  Poptr_TFL1-like_3	19	20
  Triae_TFL1_like_1	21	22
  Solly_TFL1_like_1	23	24
  P.trichocarpa_575797_BFT	25	26
  A.majus_AJ802379	27	28
  A.thaliana_BFT_AT5G62040	29	30
  B.napus_BN06MC04018_42203942@4009	31	32
  C.solstitialis_EH787691	33	34
  G.max_Glyma09g26550.1	35	36
  G.max_Glyma16g32080.1	37	38
  H.annuus_DY918510	39	40
  H.tuberosus_EL460602	41	42
  M.domestica_TC3972	43	44
  M.truncatula_AC146807_6.4	45	46
  N.tabacum_TC37788	47	48
  S.tuberosum_TC184616	49	50
  T,erecta_SIN_31b-CS_SCR28-H22_b2@7054	51	57
  V.vinifera_GSVIVT00007370001	53	54
  B.napus_ES903789	55	56
  C.annuum_TC8401	57	58
  C.solstitialis_EH782629	59	60
  E.esula_DV157402	61	62
  L.saligna_DW073438	63	64
  M.domestica_TC11859	65	66
  N.tabacum_TC22106	67	68
  S.tuberosum_TC167458	69	70
  A.thaliana_TFL1_AT5G03840	71	72
  B.napus_EV057528	73	74
  B.napus_TC86085	75	76
  F.arundinacea_DT710154	77	78
  G.max_Glyma03g35250.1	79	80
  G.max_Glyma10g08340.1	81	82
  G.max_Glyma13g22030.1	83	84
  G.max_Glyma19g37890.1	85	86
  H.vulgare_TC185326	87	88
  L.japonicus_NP863984	89	90
  M.truncatula_AC147007_3.4	91	92
  O.sativa_LOC_Os02g32950.1	93	94
  O.sativa_LOC_Os04g33570.1	95	96
  O.sativa_LOC_Os11_g05470.1	97	98
  S.bicolor_Sb04g021650.1	99	100
  S.bicolor_Sb05g003200.1	101	102
  S.bicolor_Sb06g015490.1	103	104
  S.bicolor_Sb08g003210.1	105	106
  S.officinarum_CF571229	107	108
  Z.mays_NP13046728	109	110
  Z.mays_NP13046729	111	112
  Z.mays_NP13046731	113	114
  Z.mays_TC388266	115	116
  Z.mays_ZM07MCO2424_58551053@2416	117	118

• 1.2 Ribose-5-phosphat-Isomerase (R5PI)
• Die Tabelle A2 gibt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen an, die mit der Nukleinsäuresequenz, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, verwandt sind. Tabelle A2: Beispiele von R5PI-Nukleinsäuren und -Polypeptiden:

  Name	Quellen-Organismus	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Polypeptid SEQ ID NR:
  A.thaliana_AT1G71100	Arabidopsisthaliana	140	141
  A.thaliana_AT2G01290	Arabidopsisthaliana	142	143
  A.thaliana_AT3G04790	Arabidopsis thaliana	144	145
  C.reinhardtii_55838	Chlamydomonas reinhardtii	146	147
  G.arboreum_BG5822	Gossypium arboretum	148	149
  G.arboreum_TA5822	Gossypium arboretum	150	151
  G.hirsutum_TA22941	Gossypium hirsutum	152	153
  G.hirsutum_TA25911	Gossypium hirsutum	154	155
  G.hirsutum_TA26611	Gossypium hirsutum	156	157
  G.hirsutum_TA28664	Gossypium hirsutum	158	159
  G.hirsutum_TA36027	Gossypium hirsutum	160	161
  G.max_TA40887	Glycine max	162	163
  G.max_TA43617	Glycine max	164	165
  O.sativa_Os04g0306400	Oryza sativa	166	167
  O.sativa_Os07g0176900	Oryza sativa	168	169
  O.tauri_25759	Ostreococus tauri	170	171
  P.patens_133835	Physcomitrella patens	172	173
  P.patens_221767	Physcomitrella patens	174	175
  P.trichocarpa_70.79	Populus trichocarpa	176	177
  P.trichocarpa_I.1144	Populus trichocarpa	178	179
  P.trichocarpa_VIII.1184	Populus trichocarpa	180	181
  P.trichocarpa_X.1083	Populus trichocarpa	182	183
  P.trichocarpa_XIII.387	Populus trichocarpa	184	185
  S.lycopersicum_TA38172	Solanum lycopersicum	186	187
  S.lycopersicum_TA43275	Lycopersicum	188	189
  S.officinarum_TA35800	Sacharum officinarum	190	191
  S.officinarum_TA43377	Sacharum officinarum	192	193
  S.officinarum_TA48272	Sacharum officinarum	194	195
  T.aestivum_CK211981	Triticum aestivum	196	197
  Z.mays_DR791617	Zea mays	198	199
  Z.mays_TA181232	Zea mays	200	201
  Z.mays_TA182909	Zea mays	202	203

• 1.3. Zinkfinger (Znf) Domäne-haltiges A20/AN1-Polypeptid
• Die Tabelle A3 gibt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen an, welche mit der Nukleinsäuresequenz, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, verwandt sind. Tabelle A3: Beispiele von Znf A20/AN1-Polypeptidsequenzen, und codierenden Nukleinsäuresequenzen:

  Name	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Polypeptid SEQ ID NR:	Datenbank-Zugangs-Nummer
  AT3G12630.1	212	213	AT3G12630.1
  Medtr_A20_AN1	214	215	NA
  AT1G12440.1	216	217	AT1G12440.1
  AT1G51200.1	218	219	AT1G51200.1
  AT2G27580.1	220	221	AT2G27580.1
  AT2G36320.1	222	223	AT2G36320.1
  AT3G52800.1	224	225	AT3G52800.1
  AT4G12040.1	226	997	AT4G12040.1
  AT4G14225.1	228	229	AT4G14225.1
  AT4G22820.1	230	231	AT4G22820.1
  AT4G25380.1	232	233	AT4G25380.1
  Lyces_A20_AN1	234	235	BI422093
  Lyces_A20_AN1_II	236	237	BT014337
  Os01g52030.1	238	239	Os01g52030.1
  Os01g56040.1	240	241	Os01g56040.1
  Os02g10200.1	242	243	Os02g10200.1
  Os02g32840.1	244	245	Os02g32840.1
  Os03g57890.1	246	247	Os03g57890.1
  Os03g57900.1	248	249	Os03g57900.1
  Os06g41010.1	250	251	Os06g41010.1
  Os07a07350.1	252	253	Os07g0735A.1
  Os08g33880.1	254	255	Os08g33880.1
  Os08g39450.1	256	257	Os08g39450.1
  Os09g31200.1	258	259	Os09g31200.1
  Poptr_A20_AN1	260	261	EF146840
  Poptr_A20_AN 1 II	262	263	scaff IX.1013
  Poptr_A20_AN1 III	264	265	EF144544.1
  Poptr_A20_AN1 IV	266	267	EF145692.1
  Poptr_A20_AN1 V	268	269	DT510936.1
  Triae_A20_AN1 I	270	271	CK162914
  Vitvi_A20_AN 1	272	273	AM474320
  Zeama_AN110	274	275	NM_001112792
  Zeama_AN13	276	277	EF396225.1
  Zeama_AN15	278	279	NM_001112795.1
  Adoae_A20_AN1 I	280	281	N/A
  Brana_A20_AN1 I	282	283	N/A
  Brana_A20_AN1 II	284	285	N/A
  Brana_A20_AN1 III	286	287	N/A
  Brana_A20_AN1 IV	288	289	N/A
  Brana_A20_AN1 V	290	291	N/A
  Brana_A20_AN1 VI	292	293	N/A
  Brana_A20_AN1 VII	294	295	N/A
  Brana_A20_AN1 VIII	296	297	N/A
  Glyma_A20_AN1 I	298	299	N/A
  Glyma_A20_AN1 III	300	301	N/A
  Glyma_A20_AN1 IV	302	303	N/A
  Glyma_A20_AN1 V	304	305	N/A
  Glyma_A20_AN1 VI	306	307	N/A
  Glyma_A20_AN1 IX	308	309	N/A
  Glyma_A20_AN1 X	310	311	N/A
  Glyma_A20_AN1 XIV	312	313	N/A
  Glyma_A20_AN1 XV	314	315	N/A
  Glyma_A20_AN1 XVI	316	317	N/A
  Horvu_A20_AN1	318	319	N/A
  Phypa_A20_AN1 III	320	321	N/A
  Phypa_A20_AN1 IV	322	323	N/A
  Tager_A20_AN1	324	325	N/A
  Triae_A20_AN1 II	326	327	N/A
  Zeama_A20_AN1 I	328	329	N/A
  Zeama_A20_AN1 II	330	331	N/A
  Zeama_A20_AN1 III	332	333	N/A
  Zeama_A20_AN1 IV	334	335	N/A
  Zeama_A20_AN1 V	336	337	N/A

• In manchen Fällen sind verwandte Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Die Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) kann verwendet werden, um solche verwandte Sequenzen, entweder durch Stichwort-Suche oder durch Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäuresequenz oder Polypeptidsequenz von Interesse, zu identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für jeweilige Organismen erstellt worden, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”, zum Beispiel für Pappel, Physocmitrella patens und Ostreococcus tauri.
• 1.4. PHD-zf-Polypeptid
• Die Tabelle A4 gibt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen an, welche mit der Nukleinsäuresequenz, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, verwandt sind. Tabelle A4: Beispiele von PHD-zf-Polypeptidsequenzen, und codierenden Nukleinsäuresequenzen

  Name	öffentliche Datenbank-Zugangsnummer	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Polypeptid SEQ ID NR:
  Lyces_PHD-zf I	NA	347	348
  Arath_PHD-zf I	NM 101318.3	349	350
  Arath_PHD-zf II	NM 111955.2	351	352
  Arath_PHD-zf III	NM 114147.4	353	354
  Arath_PHD-zf IV	NM 122058.3	355	356
  Arath_PHD-zf V	NM 180444.2	357	358
  Chire_PHD-zf	XM 001690305.1	359	360
  Glyma_PHD-zf I	DQ973812.1	361	362
  Glyma_PHD-zf II	DQ973807.1	363	364
  Glyma_PHD-zf III	DQ973808.1	365	366
  Glyma_PHD-zf IV	DQ973809.1	367	368
  Glyma_PHD-zf V	DQ973810.1	369	370
  Glyma_PHD-zf VI	DQ973811.1	371	372
  Horvu_PHD-zf IV	AK251639	373	374
  Lyces_PHD-zf II	BT013089.1	375	376
  Lyces_PHD-zf III	BT013375.1	377	378
  Lyces_PHD-zf IV	TA45452_4081#1	379	380
  Medtr_PHD-zf I	EF025125.1	381	382
  Medtr_PHD-zf III	EF025126.1	383	384
  Medtr_PHD-zf IV	EF025127.1	385	386
  Medtr_PHD-zf V	EF025128.1	387	388
  Medtr_PHD-zf VI	EF025129.1	389	390
  Orysa_PHD-zf I 1	NM_00105157	391	392
  Orysa_PHD-zf II	NM_001053692	393	394
  Orysa_PHD-zf III	NM_001058242	395	396
  Orysa_PHD-zf IV	NM_001059432	397	398
  Orysa_PHD-zf V	NM_001061268	399	400
  Orysa_PHD-zf VI	NM_001062105	401	402
  Orysa_PHD-zf VII	NM_001065776	403	404
  Orysa_PHD-zf VIII	NM_001066777	405	406
  Orysa_PHD-zf IX	NM_001074131	407	408
  Roshy_PHD-zf	EC586603.1	409	410
  Picsi_PHD-zf I	EF085117.1	411	412
  Picsi_PHD-zf II	EF086200.1	413	414
  Picsi_PHD-zf III	EF086724.1	415	416
  Picsi_PHD-zf IV	EF086785.1	417	418
  Picsi_PHD-zf V	EF087755.1	419	420
  Pootr_PHD-zf I	scaff_X.1821	421	422
  Poptr_PHD-zf II	scaff_VI.876	423	424
  Poptr_PHD-zf III	scaff_XVI.1111	425	426
  Poptr_PHD-zf IV	scaff_VIII.629	427	428
  Poptr_PHD-zf V	scaff_VI.1571	429	430
  Poptr_PHD-zf VI	scaff_VI.983	431	432
  Poptr_PHD-zf VII	scaff_III.172	433	434
  Poptr_PHD-zf VIII	scaff_86.90	435	436
  Phypa_PHD-zf I	XM_001759621.1	437	438
  Phypa_PHD-zf II	XM_001760116.1	439	440
  Phypa_PHD-zf III	XM_001762213.1	441	442
  Phypa_PHD-zf IV	XM_001767826.1	443	444
  Phypa_PHD-zf V	XM_001769612.1	445	446
  Phypa_PHD-zf VI	XM_001779597.1	447	448
  Phypa_PHD-zf VII	XM_001783573.1	449	450
  Sacof_PHD-zf II	TA31743_4547#1	451	452
  Sacof_PHD-zf III	TA33655_4547#1	453	454
  Sacof_PHD-zf IV	TA40434_4547#1	455	456
  Sacof_PHD-zf V	TA40459_4547#1	457	458
  Vitvi_PHD-zf I	TA39483_29760#1	459	460
  Vitvi_PHD-zf II	TA36533_29760#1	461	462
  Vitvi_PHD-zf III	TA38877_29760#1	463	464
  Vitvi_PHD-zf IV	TA41896_29760#1	465	466
  Zeama_PHD-zf I	AY104993.1	467	468
  Zeama_PHD-zf II	AY108533.1	469	470
  Zeama_PHD-zf III	BT017810.1	471	472
  Zeama_PHD-zf IV	DQ245239.1	473	474
  Horvu_PHD-zf I	c62655816hv270303@#1	475	476
  Horvu_PHD-zf II	c63057121hv270303@10323#1	477	478
  Horvu_PHD-zf 111	c62719521hv270303@7303#1	479	480
  Glyma_PHD-zf VII	GM06MC25145_saa15a04@24582#1	481	482
  Glyma_PHD-zf VIII	GM06MC31284_si15e12@30563#1	483	484
  Tagel_PHD-zf	SIN_31b-CS_SCR16-N6.b1@5419#1	485	486
  Triae_PHD-zf I	c55056972@10436#1	487	488
  Triae_PHD-zf II	c54624646@16120#1	489	490

• In manchen Fällen sind verwandte Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Die Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) kann verwendet werden, um solche verwandte Sequenzen, entweder durch Stichwort-Suche oder durch Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäuresequenz oder Polypeptidsequenz von Interesse, zu identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für jeweilige Organismen erstellt worden, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”. Ferner hat der Zugriff auf Datenbanken die Identifizierung neuer Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen erlaubt.
• 1.5. REF/ALY-Polypeptide
• Die Tabelle A gibt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen an, welche mit der Nukleinsäuresequenz, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, verwandt sind. Tabelle A: Beispiele von REF/ALY-Polypeptiden:

  Name	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Protein SEQ ID NR:
  A.thaliana_At5g59950	497	498
  N.tabacum_CAG26902.1	499	500
  N.tabacum_CAJ44457.1	501	502
  A.thaliana_AT5G59950_long	503	504
  G.max_GM06MC11519	505	506
  G.max_GM06MC14759	507	508
  H.vulgare_BF262905	509	510
  H.vulgare_TA34369_45131	511	512
  M.truncatula_BG581367	513	514
  M.truncatula_TA20993_38801	515	516
  N.tabacum_CAG26903.1	517	518
  O.sativa_Os03g0278300	519	520
  P.trichocarpa_scaff_226.11	521	522
  P.trichocarpa_scaff_I.1641	523	524
  S.lycopersicum_AW928586	525	526
  S.lycopersicum_TA41256_4081	527	528
  T.aestivum_BT009294	529	530
  T.aestivum_TA72565_4565	531	532
  T.aestivum_TA72566_4565	533	534
  Z.mays_ZM07MC20365	535	536
  Z_mays_AY104617	537	538

• Beispiel 2: Alignment von Sequenzen, verwandt mit der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz
• 2.1. TFL1-like-Polypeptide
• Das Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe des AlignX-Programms aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weithin verbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876-4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497-3500). Die Vorgabewerte waren für den Lückenöffnungsstrafwert (gap open penalty) ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert (gap extension penalty) von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand vorgenommen. Die Sequenzkonservierung unter TFL1-like-Polypeptiden liegt entlang des gesamten Proteins vor. Eine Consensus-Sequenz für TFL1-like-Polypeptide ist angegeben. Die Position der konservierten Histidin- und Asparaginsäure-Aminosäurereste, jeweils gelegen an den Positionen 86 und 142 von SEQ ID NR: 2, ist mit einem Kasten über dem Rest in der Consensus-Sequenz angezeigt. Die TFL1-like-Polypeptide sind in der 1 aligniert.
• Ein phylogenetischer Baum von Phosphatidylethanolamin-Bindungsproteinen (2) ist aus der 2 von Carmona et al. 2007 reproduziert.
• 2.2. Ribose-5-phosphat-Isomerase (R5PI)
• Das Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe des AlignX-Programms aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weithin verbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876-4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497-3500). Die Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Die R5PI-Polypeptide sind in der 4 aligniert. Hochkonservierte Aminosäurereste sind in der Consensus-Sequenz angezeigt.
• Ein phylogenetischer Baum von R5PI-Polypeptiden (5) wurde mit Hilfe eines 'Neighbour Joining'-Clusterungs-Algorithmus erstellt, wie er im AlignX-Programm aus Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird. Das A.thaliana_AT1G71100-Polypeptid clustert innerhalb der Gruppe I, welche cytosolische als auch chloroplastidäre R5PI-Polypeptide umfasst.
• 2.3. Zinkfinger(Znf)-Domäne-haltiges A20/AN1-Polypeptid
• Ein Mehrfach-Sequenzalignment aller Znf A20/AN1-Polypeptidsequenzen in Tabelle A3 wurde unter Verwendung des AlignX-Algorithmus (aus Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation) durchgeführt. Die Ergebnisse des Alignments von Znf A20/AN1-Polypeptiden aus Tabelle A3 sind in 9 der vorliegenden Patentanmeldung gezeigt. Die konservierten Cys-Reste der A20-Zinkfinger-Domäne sind schwarz markiert, vertikal eingekastet und sind auch an der Unterkante des Alignments angegeben, ebenso wie die konservierten Cys- und His-Reste der AN1-Zinkfinger-Domäne. Die A20-Zinkfinger-Domäne (wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 338 (enthalten in SEQ ID NR: 213) und durch SEQ ID NR: 339 (enthalten in SEQ ID NR: 215)) ist quer über die alignierten Polypeptide deutlich eingekastet. Die AN1-Zinkfinger-Domäne (wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 340 (enthalten in SEQ ID NR: 213) und durch SEQ ID NR: 341 (enthalten in SEQ ID NR: 215)) ist ebenfalls quer über die alignierten Polypeptide deutlich eingekastet.
• 2.4. PHD-zf-Polypeptid
• Ein Mehrfach-Sequenzalignment aller PHD-zf-Polypeptidsequenzen in Tabelle A wurde unter Verwendung des AlignX-Algorithmus (aus Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation) durchgeführt. Die Ergebnisse des Alignments sind in der 13 der vorliegenden Patentanmeldung gezeigt. Die Conserved Domain (CD) und der PHD-zf IPR001965 sind eingekastet und mit X's unter der Consensus-Sequenz-Zeile markiert. Die vorhergesagt TMHMM, das E/D-reiche Motiv und KRAR-Motiv sind ebenfalls eingekastet. Das konservierte W (Trp) innerhalb des PHD-zf ist doppelt unterstrichen.
• 2.5. REF/ALY-Polypeptide
• Das Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe des AlignX-Programms aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weithin verbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) NucleiC Acids Res 25: 4876-4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497-3500). Die Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand vorgenommen. Die Sequenzkonservierung unter REF/ALY-Polypeptiden liegt im Wesentlichen entlang der RRM-Domäne und am N- und C-Terminus des Proteins, flankierend zu den GR-reichen Regionen, vor. Die REF/ALY-Polypeptide sind in der 16 aligniert.
• Ein phylogenetischer Baum von REF/ALY-Polypeptiden (16) wurde mit Hilfe eines 'Neighbour Joining'-Clusterungs-Algorithmus erstellt, wie er im AlignX-Programm aus Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird.
• Beispiel 3: Berechnung von globaler prozentualer Identität zwischen Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
• 3.1. TFL1-like-Polypeptide
• Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllänge-Polypeptidsequenzen die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
• Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

  Wertungsmatrix:	Blosum62
  Erstlücke:	12
  Lückenerweiterung:	2

• Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B1 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale in Fettdruck angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben (normal formatiert).
• Der Prozentsatz der Identität zwischen den, in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlichen, TFL1-like-Polypeptidsequenzen kann so gering wie 52,3% Aminosäureidentität, verglichen mit der SEQ ID NR: 2, sein.
• 
• 3.2. Ribose-5-Phosphat-Isomerase (R5PI)
• Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
• Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

  Wertungsmatrix:	Blosum62
  Erstlücke:	12
  Lückenerweiterung:	2

• Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle 62 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale in Fettdruck angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben (normal formatiert).
• Der Prozentsatz der Identität zwischen den in Tabelle A2 angegebenen R5PI Prozentsatz der Identität zwischen den Tabelle A2 angegebenen R5PI-Polypeptidsequenzen im Vergleich zu A.thaliana_AT1G71100-Polypeptid, variiert zwischen 38,7 und 71,2%.
• 
• 3.3. Zinkfinger (Znf) Domäne-haltiges A20/AN1-Polypeptid
• Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
• Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

  Wertungsmatrix:	Blosum62
  Erstlücke:	12
  Lückenerweiterung:	2

• Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B3 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg (unter Ausschluß der partiellen Polypeptidsequenzen) gezeigt.

  

  

  

  
• Der Prozentsatz der Identität zwischen den, in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlichen, Volllängen-Polypeptidsequenzen kann so gering wie 25% Aminosäureidentität, verglichen zu der SEQ ID NR: 213 oder zu SEQ ID NR: 215, sein.
• Der Prozentsatz der Identität kann erheblich erhöht sein, wenn die Identitätsberechnung zwischen der A20-Zinkfinger-Domäne von SEQ ID NR: 213 (wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 338) oder von SEQ ID NR: 215 (wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 339), und der A20-Zinkfinger-Domäne der Znf A20/AN1-Polypeptide von Tabelle A3, repräsentiert in 9, durchgeführt wird. In gleicher Weise kann der Prozentsatz der Identität auch erheblich erhöht sein, wenn die Identitätsberechnung zwischen der AN1-Zinkfinger-Domäne von SEQ ID NR: 213 (wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 340) oder von SEQ ID NR: 215 (wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 341), und der AN1-Zinkfinger-Domäne der Znf A20/AN1-Polypeptide von Tabelle A3, repräsentiert in 9, durchgeführt wird.
• 3.4. PHD-zf-Polypeptid
• Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4:29, MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix, Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
• Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

  Wertungsmatrix:	Blosum62
  Erstlücke:	12
  Lückenerweiterung:	2

• Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B4 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg (unter Ausschluß der partiellen Polypeptidsequenzen) gezeigt.
• Der Prozentsatz der Identität zwischen den, in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlichen, Volllängen-Polypeptidsequenzen kann so gering wie 49% Aminosäureidentität, verglichen mit der SEQ ID NR: 348, sein.

  

  

  

  

  

  

  

  

  
• Die prozentuale Aminosäureidentität kann signifikant erhöht werden, wenn die am stärksten konservierte Region(en) der Polypeptide verglichen werden. Wenn beispielsweise die Aminosäuresequenz der Conserved Domain von SEQ ID NR: 348 (wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 491) mit der Conserved Domain der Polypeptide von Tabelle A4 verglichen wird, erhöht sich der Prozentsatz der Aminosäureidentität auf bis zu 70% oder mehr.
• 3.5. REF/ALY-Polypeptide
• Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Meers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnligkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
• Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:

  Wertungsmatrix:	Blosum62
  Erstlücke:	12
  Lückenerweiterung:	2

• Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B5 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale in Fettdruck angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben (normal formatiert).
• Der Prozentsatz der Identität zwischen den REF/ALY-Polypeptidsequenzen von Tabelle A5 und der SEQ ID NR: 498 betug mindestens 31,9%.

  

  

  
• Beispiel 4: Identifizierung von Domänen, enthalten in Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
• Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites” (InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, die verschiedene Methodiken und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, welche viele häufige Proteindomänen und -familien abdeckt. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien bereitgehalten bzw. gehostet. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien bereitgehalten.
• 4.1. TFL1-like-Polypeptide
• Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 2 repräsentiert, sind in der Tabelle C1 dargestellt. Tabelle C1: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie sie durch die SEQ ID NR: 2 repräsentiert wird.

  Datenbank	Zugangsnummer	Zugangsname	Aminosäure-Koordinaten auf SEQ ID NR 2
  Interpro	InterPro:IPR008914	Phosphatidylethanolamin-Bindungs-Protein PEBP	12-170
  supertam	49777		12-169
  prodom	PD004330	Phosphatidylethanolamin-Bindungs-Protein PEBP	12-170
  prosite	PS01220	Phosphatidylethanolamin-bindend, konservierte Stelle	66-88
  pfam	PF01161	Phosphatidylethanolamin-Bindungs-Protein PEBP	20-167
  supertam	PTHR11362		21-175
  supertam	SSF49777	Phosphatidylethanolamin-Bindungs-Protein PEBP	12-170
  supertam	G3DSA:3.90.280.10	Phosphatidylethanolamin-Bindungs-Protein PEBP	6-175

• 4.2. Ribose-5-phosphat-Isomerase (R5PI)
• Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch das oben genannte Polypeptid A.thaliana_T1G71100 repräsentiert, sind in der Tabelle C2 dargestellt. Tabelle C2: Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch das A.thaliana AT1G71100-Polypeptid repräsentiert

  Datenbank	Zugangsnummer	Beschreibung	E-Wert	Aminosäurekoordinaten im Polypeptid A.thaliana_AT1G71100
  InterPro	IPR004788	Ribose-5-phosphat-Isomerase
  PRODOM	PD005813	RpiA	0,0	[35-155]
  PANTHER	PTHR11934	RpiA	1,1E-120	[1-265]
  PFAM	PF06026	Rib_5-P_isom_A	7,1E-87	[77-261]
  TIGRFAMs	TIGR00021	rpiA	5,9E-105	[32-261]
  GENE3D	G3DSA:3.40.50.1360	G3DSA:3.40.50.1360	2,1E-48	[27-177]
  SUPERFAMILY	SSF100950	SSF100950	3,3E-42	[28-179]
  SUPERFAMILY	SSF75445	SSF75445	6,5E-16	[158-246]

• 4.3. Zinkfinger(Znf)-Domäne-haltiges A20/AN1-Polypeptid
• Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 213, repräsentiert, sind in der Tabelle C3 dargestellt. Tabelle C3: InterPro-Scan-Ergebnisse der Polypeptidsequenz, wie von SEQ ID NR: 213 repräsentiert

  InterPro Zugangsnummer und -name	Name der integrierten Datenbank	Integrierte Datenbank Zugangsnummer	Integrierte Datenbank Zugangsname
  IPR000058 Zinkfinger, AN1-Typ	PFAM	PF01428	zf-AN1
  IPR000058 Zinkfinger, AN1-Typ	ProSite	PS51039	ZF_AN1
  IPR000058 Zinkfinger, AN1-Typ	SMART	SM00154	ZnF_AN1
  IPR002653 Zinkfinger, A20-Typ	PSORT	PS51036	ZF_A20

• 4.4. PHD-zf-Polypeptid
• Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 348, repräsentiert, sind in der Tabelle C4 dargestellt. Tabelle C4: InterPro-Scan-Ergebnisse der Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 348

  InterPro Zugangsnummer und -name	Name der integrierten Datenbank	Integrierte Datenbank Zugangsnummer	Integrierte Datenbank Zugangsname
  IPR001965 Zinkfinger, PHD-Typ	PFAM	PF000628	PHD
  	SMART	SM00249	PHD
  	ProSite	PS01359	ZF_PHD_1
  IPR013083 Zinkfinger, RING/FYVE/PHD-Typ		G3DSA:3,30,40,10	Ohne Beschreibung
  keinIPR, nicht integriert	Panther	PTHR23123	PHD/F-box enthaltendes Protein
  	TMHMM	Transmembran_regionen

• 4.5. REF/ALY-Polypeptide
• Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 498, repräsentiert, sind in der Tabelle C5 dargestellt. Tabelle C5: Interpro-Scan-Ergebnisse (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 498 repräsentiert. Tabelle C5. Interpro-Scan.

  Interpro-Zugangsnummer	Beschreibung: RNA-Erkennungsmotiv, RNP-1
  IPR000504	Datenbank	Zugangsnummer	Zugangsreferenz	Aminosäurekoordinaten in SEQ ID NR: 498
  	PFAM	PF00076	RRM_1	[90-160]
  	SMART	SM00360	RRM	[89-161]
  	PROFILE	PS50102	RRM	[88-165]

• Alternativ zur Interpro-Datenbank wurden konservierte Aminosäureregionen und -domänen in SEQ ID NR: 498 mittels Durchsuchung der Pfam-Datenbank Version Pfam 22.0 (Juli 2007, 9318 Familien) unter Verwendung eines eWert-Cut-off von 1,0 identifiziert. Die Datenbank Pfam enthielt eine große Sammlung von Proteinfamilien, jeweils repräsentiert durch Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modelle (HMMs).
• Die Ergebnisse der Pfam-Suche für die Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 498, sind in der Tabelle C6 dargestellt. Tabelle C6. Pfam-Suchlauf.

  Pfam-A	Beschreibung	Eintragtyp	Aminosäure koordinaten in SEQ ID NR: 498		Bits-Punktwert	E-Wert	Alignmentmodus
  			Start	Ende
  RRM_1	RNA-Erkennungsmotiv. (auch bekannt als RRM, RBD oder RNP-Domäne)	Domäne	90	160	58,2	1,78-15	fs
  GRP	Glycin-reiche Proteinfamilie	Familie	153	216	–38,9	0,8	ls

• Beispiel 5: Vorhersage der subzellulären Lokalisation der Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung the Verfahren der Erfindung nützlich sind
• 5.1. Zinkfinger(Znf)-Domäne-haltiges A20/AN1-Polvpeptid
• Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisierung bis zum Tagging von Proteinen unter Verwendung von Grün-fluoreszierendem Protein (GFP) oder Beta-Glucoronidase (GUS). Derartige Verfahren zur Identifizierung der subzellulären Kompartimentisierung von Znf A20/AN1-Polypeptiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel wurde von einem Znf A20/AN1-Polypeptid gefunden, im Cytoplasma lokalisiert zu sein (Kanneganti & Gupta (2008) siehe oben).
• Eine Computervorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten wurde durchgeführt. Unter den, einem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannten, Algorithmen sind bei den ExPASy-Proteomics-Werkzeugen, welche vom Schweizer Institut für Bioinformatik (Swiss Institute for Bioinformatics) bereitgestellt werden, beispielsweise PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale und andere verfügbar.
• TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryotischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung bzw. Orts-Zuordnung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Prä-Sequenzen: Chloroplasten-Transitpeptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität von Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
• Die Ergebnisse der Vorhersage zeigen, dass SEQ ID NR: 213 nicht zum Chloroplast (cTP) zielgelenkt wird, nicht zu Mitochondrien (mTP) zielgelenkt wird, und nicht zum sekretorischen Pfad (SP) zielgelenkt wird, wie es durch die berechneten Wahrscheinlichkeitswerte gezeigt wird. Die höchste Wahrscheinlichkeit wird bei ”sonstige” erhalten, was eine beliebige andere Lokalisierung als die drei hier oben Genannten bedeutet. Daher sind das Cytoplasma und/oder der Zellkern mögliche subzelluläre Lokalisierungen von einem Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 213 repräsentiert. Tabelle D1: Ausgabe der Ergebnisse für die subzelluläre Lokalisierung von SEQ ID NR: 213 unter Verwendung von TargetP

  Name	Länge	cTP	mTP	SP	sonstige	Loc	RC
  Sequenz	160	0,278	0,014	0,002	0,826	-	3
  Cutoff		0,000	0,000	0,000	0,000

• 5.2. PHD-zf-Polypeptid
• Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisierung bis zum Tagging von Proteinen unter Verwendung von Grün-fluoreszierendem Protein (GFP) oder Beta-Glucoronidase (GUS). Derartige Verfahren zur Identifizierung der subzellulären Kompartimentisierung von GRF-Polypeptiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
• Ein vorhergesagtes Zellkernlokalisationssignal (NLS) wurde durch Mehrfachsequenz-Alignment, gefolgt von visueller Inspektion, in den Polypeptidsequenzen von Tabelle A4 gefunden. Bei einem NLS handelt es sich um eine oder mehrere kurze Sequenzen aus positiv geladenen Lysinen oder Argininen.
• Eine Computervorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten wurde durchgeführt.
• Unter den, einem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannten, Algorithmen sind bei den ExPASy-Proteomics-Werkzeugen, welche vom Schweizer Institut für Bioinformatik bereitgestellt werden, beispielsweise PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale, TMHMM, TMpred und andere verfügbar.
• Eine Transmembrandomäne bezeichnet üblicherweise eine einzelne Transmembran-Alpha-Helix eines Transmembranproteins. Sie wird als ”Domäne” bezeichnet, weil eine Alpha-Helix in einer Membran unabhängig vom Rest des Proteins gefaltet sein kann. Noch allgemeiner ist eine Transmembrandomäne jedwede dreidimensionale Proteinstruktur, welche in einer Membran thermodynamisch stabil ist. Diese kann eine einzelne Alpha-Helix, ein stabiler Komplex von mehreren Transmembran-Alpha-Helizes, ein Transmembran-Beta-Fass, eine Beta-Helix von Gramicidin A, oder eine beliebige sonstige Struktur sein.
• Transmembran-Helizes sind üblicherweise etwa 20 Aminosäuren lang, obwohl sie viel länger oder kürzer sein können. TMHMM2.0 ist ein Algorithmus, der Transmembran-überspannende Helizes in Proteinen vorhersagen kann. Der Algorithmus wird auf dem Server der Technical University of Denmark bereitgehalten. Die nachstehende Tabelle D2 zeigt die Ausgabe von TMHMM2.0 unter Verwendung der Polypeptidsequenzinformation von SEQ ID NR: 348. Unter Verwendung dieses Algorithmus wird mindestens eine Transmembrandomäne vorhergesagt.
• Die 12 ist eine graphische Wiedergabe der Ausgabe, wie in Tabelle D2. Tabelle D2: Ausgabe von TMHMM2.0 (und TMpred) bei Verwendung der Polypeptidsequenz-Information von SEQ ID NR: 348.

  Polypeptid ID	benutzter Algorithmus	Vorhergesagte AA-Koordinaten
  SEQ ID NR: 348	TMHMM 2.0	91-111
  SEQ ID NR: 348	TMPred	94-111

• Beispiel 6: Assay bezüglich der Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung the Verfahren der Erfindung nützlich sind
• 6.1. Zinkfinger(Znf)-Domäne-haltiges A20/AN1-Polypeptid
• In den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliche Znf A20/AN1-Polypeptide weisen (zumindest in ihrer nativen Form) in der Regel, aber nicht notwendigerweise, transkriptionelle regulatorische Aktivität und das Vermögen, mit anderen Proteinen zu interagieren, auf. DNA-bindende Aktivität und Protein-Protein-Wechselwirkungen können leicht in vitro oder in vivo unter Anwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Techniken bestimmt werden (zum Beispiel, in Current Protocols in Molecular Biology, Bände 1 und 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols). Zum Beispiel sind die A20-Zinkfinger-Domäne und die AN1-Zinkfinger-Domäne von Znf A20/AN1-Polypeptiden in Hefezellen zur Wechselwirkung miteinander in vivo befähigt, während ein Hefe-Zwei-Hybrid-Protein-Protein-Wechselwirkungsassay (Kanneganti & Gupta, siehe oben) angewandt wird. Die in dieser Veröffentlichung beschriebenen Experimente sind zur Charakterisierung von Znf A20/AN1-Polypeptiden brauchbar und sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
• 6.2. PHD-zf-Polypeptid
• In den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliche PHD-zf-Polypeptide besitzen (zumindest in ihrer nativen Form) in der Regel, aber nicht notwendigerweise, transkriptionelle regulatorische Aktivität und das Vermögen, mit anderen Proteinen zu interagieren. DNA-bindende Aktivität und Protein-Protein-Wechselwirkungen können leicht in vitro oder in vivo unter Anwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Techniken bestimmt werden (zum Beispiel, in Current Protocols in Molecular Biology, Bände 1 und 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols). PHD-zf-Domänen enthalten ein C4HC3-Zinkfinger-ähnliches Motiv, das in nukleären Proteinen gefunden wird, von dem angenommen wird, an der Chromatinvermittelten Transkriptionsregulierung beteiligt zu sein, und genauer gesagt DNA an einem Kern-Hexamermotiv aus entweder GNGGTG oder GTGGNG zu binden (Bastola, et al., 1998). Die in dieser Veröffentlichung beschriebenen Experimente sind zur Charakterisierung von PHD-zf-Polypeptiden brauchbar und sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
• Beispiel 7: Klonieren der Nukleinsäuresequenz, die in den Verfahren der Erfindung verwendet wird
• 7.1. TFL1-like-Polypeptide
• 7.1.1 pGOS2::ArathTFL1-like-1
• Im Fall von ArathTFL1-like_1, wurde die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana-Setzlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hilfe von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren (SEQ ID NR: 126; Sense): 5'-ggggacaagtttgtacaaa aaagcaggcttaaacaatggccaggatttcctca-3' und SEQ ID NR: 127; rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcattcaacggcgtctagc-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon”, pArath_TFL1_like, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
• Der ”Entry”- bzw. Eintritts-Klon, der die SEQ ID NR: 1 umfasste, wurde dann in einer IR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Entry-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 128) für konstitutive spezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::ArathTFL1-like_1 (3) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• 7.1.2. pGOS2::P.trichocarpa 575797 BFT
• Im Fall von Poptr_TFL1-like_1, wurde die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Populus trichocarpa-Setzlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hilfe von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren (SEQ ID NR: 119; Sense): 5'-ggggacaagtttgt acaaaaaagcaggcttaaacaatgtcaagggccatggaa-3' und SEQ ID NR: 120; rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatgaaggaaaacccacaacac-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon”, pPoptr TFL1-like 1, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
• Der Entry-Klon, der die SEQ ID NR: 25 umfasste, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sat/va-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-/n-vivo-Rekombination mit der bereits im Entry-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 128) für konstitutive spezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::P.trichocarpa 575797 BFT gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• 7.2. Ribose-5-phosphat-Isomerase (R5PI)
• Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana-Setzlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hilfe von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren (SEQ ID NR: 209; Sense): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgggttctqcattcqa tc-3' und (SEQ ID NR: 210; rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaa agctgggtaccctaatggttttcaaatgac-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon”, pA.thaliana_AT1G71100, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
• Der Entry-Klon, der die SEQ ID NR: 140 umfasste, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Entry-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 211) für konstitutive spezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::A.thaliana_AT1G71100 (6) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• 7.3. Zinkfinger(Znf)-Domäne-haltiges A20/AN1-Polypeptid
• Die Arabidopsis thaliana-cDNA, welche die Znf A20/AN1-Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 213, codiert, wurde durch PCR amplifiziert, wobei man als Matrize eine Arabidopsis-cDNA-Bank verwendete, die aus mRNA synthetisiert wurde, welche aus gemischten Pflanzengeweben extrahiert worden war. Die folgenden Primer, welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen, wurden für die PCR-Amplifikation verwendet: prm09483 (SEQ ID NR: 343, Sense): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaa tggctcagagaacggaga-3' und prm09484 (SEQ ID NR: 344, rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaacggttgagatcgaattttt-3'. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment der erwarteten Länge (attB-Stellen beinhaltend) wurde amplifiziert und ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entry-Klon” hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, erworben.
• Die Medicago truncatula-cDNA, welche die Znf A20/AN1-Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 215 repräsentiert, codiert, wurde durch PCR unter Verwendung einer Medicago truncatula-cDNA-Bank als Matrize amplifiziert, die aus mRNA synthetisiert wurde, welche aus gemischten Pflanzengeweben extrahiert worden war. Die folgenden Primer, welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen, wurden für die PCR-Amplifikation verwendet: prm09485 (SEQ ID NR: 345, Sense): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcag gcttaaacaatggctcaaagaacagaaaat-3' und prm09486 (SEQ ID NR: 346 rückwärts, komplementär): 5'-gggaccactttgtacaagaaagctgggtttgaatttttgcttttcacac -3'. Dann wurde die gleiche Klonierungsprozedur wie für SEQ ID NR: 212 hierin oben verwendet.
• Der Entry-Klon, der die SEQ ID NR: 212 umfasste, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker, eine screenbare Marker-Expressionskassette und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Entry-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 131) für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::Znf A20/AN1 (10) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• Der Entry-Klon, der die SEQ ID NR: 214 umfasste, wurde anschließend in derselben Prozedur, wie oben, verwendet und ebenfalls stromabwärts eines Reis-GOS2-Promotors einkloniert.
• 7.4. PHD-zf-Polypeptid
• Die Lycopersicon esculentum-Nukleinsäuresequenz, die eine PHD-zf-Polypeptidsequenz wie von SEQ ID NR: 348 repräsentiert, codiert, wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine cDNA-Bank verwendet wurde, die unter Verwendung von RNA aus Tomatenpflanzen bei verschiedenen Entwicklungsstufen konstruiert worden war. Die folgenden Primer, welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen, wurden für die PCR-Amplifikation verwendet: prm 09483 (SEQ ID NR: 495, Sense): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaa gcaggcttaaacaatggctcagagaacggaga-3' und prm 02266 (SEQ ID NR: 496, rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaacggttgagatcgaattt tt-3'. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment der erwarteten Länge (attB-Stellen beinhaltend) wurde amplifiziert und ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entre-Klon” hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
• Der Entry-Klon, der die SEQ ID NR: 347 umfasste, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Entry-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 494) für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::PHD-zf (14) für konstitutive Expression gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• 7.5. REF/ALY-Polypeptide
• Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine eigens hergestellte cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana-Setzlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hilfe von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgtcgactggattagatatg-3' (SEQ ID NR: 545; Sense, Startcodon in Fettdruck); und 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctg ggtgtcacgttccttagtttgtc-3' (SEQ ID NR: 546; rückwärts, komplementär), welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, ausgeführt, während dem das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Entre-Klon”, pREF/ALY, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
• Der Entry-Klon, der die SEQ ID NR: 497 umfasste, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Entry-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. In einem Destinationsvektor war ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 547) für konstitutive spezifische Expression stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert. In einem zweiten Destinationsvektor wurde ein Reis-HMGP-Promotor (SEQ ID NR: 52) verwendet, um die konstitutive Expression anzutreiben.
• Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurden die resultierenden Expressionsvektoren pGOS2::REF/ALY und pHMGP::REF/ALY (17) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
• Beispiel 8: Pflanzentransformation
• Transformation von Reis
• Das Agrobacterium, welches den Expressionsvektor enthielt, wurde zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare wurden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wurde durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, gefolgt von sechsmaligem, 15-minütigem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser, durchgeführt. Die sterilen Samen wurden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Callus-Induktions-Medium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunklen wurden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Calli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt Nach zwei Wochen wurden die Calli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callus-Stücke wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
• Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den Expressionsvektor enthielt, wurde für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den geeigneten Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien wurden dann abgesammelt und in flüssigem Cokultivierungs-Medium zu einer Dichte (OD₆₀₀) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wurde dann in eine Petrischale überführt, und die Calli wurden 15 Minuten lang in der Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe wurden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunklen bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Calli wurden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunklen bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wurde das embryogene Potential freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse wurden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem Auxin-enthaltenden Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse wurden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
• Ungefähr 35 unabhängige TO-Reis-Transformanten wurden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen behalten. Die Samen wurden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994)
• Transformation von Mais
• Die Transformation von Mais (Zea mays) wird mit einer Abwandlung des Verfahrens durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745-50, beschrieben wird. Die Transformation in Mais ist Genotyp-abhängig, und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzucht-Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elternteil sind gute Quellen von Spendermaterial für eine Transformation, aber auch anderer Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden aus der Maispflanze ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) abgeerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Herausgeschnittene Embryos werden auf Callus-Induktionsmedium und anschließend Mais-Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, im Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C während 2 bis 3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
• Transformation von Weizen
• Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, das von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745-50, beschrieben wurde. Üblicherweise wird das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CIMMYT, Mexico) bei der Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Callus-Induktionsmedium, und dann Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C während 2-3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und während 2–3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten
• Transformation von Sojabohne
• Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens transformiert, welches in U.S.-Patent 5 164 310 von Texas A&M beschrieben ist. Mehrere kommerzielle Sojabohnenvarietäten sind einer Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) zur Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für das In-vitro-Ausäen sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Kotyledon werden aus sieben Tage alten Jung-Setzlingen herausgesnhnitten. Das Epikotyl und das verbleibende Kotyledon werden weiter wachsen gelassen, um axilläre Nodi zu entwickeln. Diese axillären Nodi werden herausgeschnitten und mit Agrobacterium tumefaciens inkubiert, welches den Expressionsvektor enthält. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien überführt. Regenerierte Sprosse werden herausgeschnitten und auf ein Sprossverlängerungsmedium gebracht. Sprosse, welche nicht länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium gebracht, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
• Transformation von Raps/Canola
• Kotyledonäre Petiolen bzw. Keimblattstiele sowie Hypokotyle von einem 5–6 Tage alten Jungsämling werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep. 17: 183-188) transformiert. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die zur Transformation verwendete Standardvarietät, aber auch andere Varietäten können verwendet werden. Canola-Samen werden für das In-vitro-Ausäen oberflächensterilisiert. Die Keimblattstiel-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden von den In-vitro-Sämlingen abgeschnitten und mit Agrobacterium (enthaltend den Expressionsvektor) durch Eintauchen des Schnittendes des Blattstiel-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 Stunden Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium werden die Blattstiel-Explantate in bzw. auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) während 7 Tagen überführt und danach auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm Länge aufweisen, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Sprosse von etwa 2 cm Länge werden auf Bewurzelungsmedium (MSO) zur Wurzelinduktion überführt. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
• Transformation von Alfalfa
• Ein sich regenerierender Klon von Alfalfa (Medicago sativa) wird unter Anwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999, Plant Physiol. 119: 839-847) transformiert. Die Regeneration und Transformation Alfalfa ist genotypabhängig, und daher wird eine sich regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Alfalfa-Varietät ausgewählt werden, wie es durch Brown, DCW, und A. Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112) beschrieben wurde. Alternativ dazu ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in der Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., 1978, Am. J. Bot. 65: 654-659). Petiolen-Explantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol. 119: 839-847) oder LBA4404, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert. Die Explantate werden drei Tage lang im Dunklen auf SH-Induktionsmedium cokultiviert, welches 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon enthält. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum zum Inhibieren des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach einigen Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika sowie 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryonen werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge wurden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-inserts enthalten.
• Transformation von Baumwolle
• Baumwolle wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens gemäß des Verfahrens transformiert, das in US 5 159 135 beschrieben ist. Baumwolle-Samen werden in 3% Natriumhypochlorit-Lösung während 20 Minuten oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann für die Keimung auf bzw. in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl überführt. Hypokotyle von 4 bis 6 Tage alten Setzlingen werden entfernt in Stücke von 0,5 cm geschnitten und auf 0,8%/igem Agar platziert. Eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, transformiert mit dem Gen von Interesse und geeigneten Selektionsmarkern) wird für die Inokulation der Hypokotyl-Explantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Beleuchtung überführt man die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige-und-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151-158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl₂, sowie mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400-500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten restlicher Bakterien. Individuelle Zellinien werden nach zwei bis drei Monaten (mit Unterkulturen alle vier bis sechs Wochen) isoliert und werden auf selektivem Medium zur Gewebevermehrung weiter kultiviert (30°C, 16 h Lichtperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend auf nicht-selektivem Medium während 2 bis 3 Monaten weiter kultiviert, was zur Entstehung von somatischen Embryonen führt. Gesund aussehende Embryonen von mindestens 4 mm Länge werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, das mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure ergänzt ist, überführt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Lichtperiode von 16 h kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Blumentöpfe mit Vermiculit und Nährstoffen überführt. Die Pflanzen werden gehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus verbracht.
• Beispiel 9: Vorgehen zur phänotypischen Auswertung
• 9.1 Auswertungsansatz
• Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Kultivieren und Ernten von T1-Samen überführt. Ereignisse, bei denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Setzlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Setzlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden an zufälligen Positionen Seite an Seite wachsen gelassen. Die Gewächshausbedingungen bestanden in kurzen Tagen (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C im Dunklen sowie einer relativen Feuchtigkeit von 70%. Pflanzen, welche unter Nicht-Stress-Bedingungen wachsen gelassen werden, werden in regelmäßigen Intervallen mit Wasser versorgt, um sicherzustellen, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend sind, so dass die Bedürfnisse der Pflanze zum Abschließen von Wachstum und Entwicklung erfüllt werden.
• Vier T1-Ereignisse wurden in der T2-Generation unter Befolgung desselben Auswertungsvorgehens, wie für die T1-Generation, aber mit mehr Individuen pro Ereignis, weiter ausgewertet. Vorn Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
• Dürre-Screen
• Pflanzen aus T2-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ahren/Rispenschiebens näherten. Sie wurden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wird. Feuchtigkeitssonden wurden in zufällig ausgewählten Blumentöpfen eingesteckt, um den Bodenwassergehalt (SWC) zu überwachen. Wenn der SWC unter bestimmte Schwellenwerte geht, wurden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wird. Die Pflanzen wurden dann wieder zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
• Screen der Stickstoffverwendungseffizienz
• Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe werden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff(N)-Gehalt enthält, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
• Salzstress-Screen
• Pflanzen werden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfaser und Argex (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wird während der ersten zwei Wochen nach dem Umpflanzen der Pflänzchen in das Gewächshaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen werden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugesetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Dann werden Samen-bezogene Parameter gemessen.
• 9.2 Statistische Analyse: F-Test
• Eine Zwei-Faktor-ANOVA (Analyse von Varianten) wurde als ein statistisches Modell für die Gesamtauswertung von phänotypischen Pflanzenmerkmalen verwendet. Ein F-Test wurde bei allen gemessenen Parametern von allen Pflanzen aller Ereignisse, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung transformiert waren, durchgeführt. Der F-Test wurde durchgeführt, um eine Prüfung hinsichtlich eines Effekts des Gens über alle Transformationsereignisse hinweg vorzunehmen und einen Gesamteffekt des Gens, ebenfalls bekannt als globaler Geneffekt, zu bestätigen. Der Schwellenwert für Signifikanz für einen echten globalen Geneffekt wurde bei einer 5%-Wahrscheinlichkeitsstufe für den F-Test festgesetzt. Ein signifikanter F-Testwert deutet auf einen Geneffekt hin, was heißt, dass es nicht nur die bloße Gegenwart oder Position des Gens ist, welche die Unterschiede beim Phänotyp verursacht.
• 9.3 Gemessene Parameter
• Messung von Biomassen-bezogenen Parametern
• Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
• Die oberirdische Pflanzenfläche (oder blattartige Biomasse) wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln heraus aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist die Fläche, welche an dem Zeitpunkt gemessen wird, an dem die Pflanze ihre maximale Blatt-Biomasse erreicht hatte. Die Frühwuchskraft ist die oberirdische Pflanzen(Setzlings)-Fläche drei Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als eine Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als das Maximum der Biomasse von Wurzeln, das während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird); oder als eine Erhöhung im Wurzel/Spross-Index (gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Periode des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
• Die Frühwuchskraft wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln von oberirdischen Pflanzenteilen, welche sich vom Hintergrund unterschieden, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
• Messungen von Samen-bezogenen Parametern
• Die reifen Hauptrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit Strichcode etikettiert und dann drei Tage lang in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Rispen wurden dann gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden von den leeren Hülsen unter Verwendung einer Luftgebläsevorrichtung getrennt. Die leeren Hülsen wurden verworfen, und die verbleibende Fraktion wurde erneut gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden auf einer Analysewaage gewonen. Die Anzahl an gefüllten Samen wurde durch Zählen der Anzahl an gefüllten Hülsen bestimmt, welche nach dem Trennungsschritt verblieb. Der Gesamtsamenertrag wurde durch Wiegen aller, von einer Pflanze abgeernteten, gefüllten Hülsen gemessen. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde durch Zählen der Anzahl der von einer Pflanze geernteten Hülsen gemessen. Das Tausendkerngewicht (TKW) wird aus der Anzahl an gezählten gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Ernteindex (HI) ist in der vorliegenden Erfindung definiert als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor 106. Die Gesamtzahl an Blüten pro Rispe, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist das Verhältnis zwischen der Gesamtzahl an Samen und der Anzahl an reifen Hauptrispen. Die Samen-Füllrate, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist der Anteil (ausgedrückt als ein %-Wert) der Anzahl gefüllter Samen gegenüber der Gesamtzahl an Samen (oder Blütchen).
• Beispiel 10: Ergebnisse der phanotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
• 10.1. TFL1-like-Polypeptide
• 10.1.1 Pflanzen-Leistung unter Nicht-Stress-Bedingungen
• 10.1.1.1. pGOS2::ArathTFL1-like 1
• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine TFL1-like-Nukleinsäure, die den längsten ORF (Offener Leserahmen) von SEQ ID NR: 1 umfasste, unter der Steuerung des GOS2-Promotors exprimieren, bei Nicht-Stress-Bedingungen sind nachstehend dargestellt. Eine Erhöhung von mindestens 5% wurde für Gesamt-Samengewicht pro Pflanze, Anzahl gefüllter Samen pro Rispe, die (Samen-)Füllrate, die Anzahl an Blüten pro Rispe und den Ernteindex beobachtet (Tabelle E1). Tabelle E1

  Ertragsbezogene Eigenschaft	% Erhöhung in den transgenen Pflanzen im Vergleich zur Nullizygot-Kontrollpflanze
  Gesamt-Samengewicht pro Pflanze	9,6
  Anzahl gefüllter Samen pro Rispe	11,7
  (Samen-)Füllrate	6,0
  Anzahl an Blüten pro Rispe	14,9
  Ernteindex	11,1

• 10.1.1.2. pGOS2::P.trichocarpa 575797 BFT
• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen T1(erste Generation)-Reispflanzen, welche eine TFL1-like-Nukleinsäure, die den längsten ORF (Offener Leserahmen) von SEQ ID NR: 25 umfasste, unter der Steuerung des GOS2-Promotors exprimieren, bei Nicht-Stress-Bedingungen sind nachstehend dargestellt (Tabelle E2). Eine Erhöhung von mindestens 5% wurde für Wurzelbiomasse (RootMax), Gesamt-Samengewicht (totalwgseeds), die Anzahl an gefüllten Samen pro Rispe (nrfilledseed), die Anzahl an Samen pro Pflanze (nrtotalseed), die (Samen-)Füllrate (fillrate), Anzahl an Blüten pro Rispe (flowerperpan) und den Ernteindex (harvestindex) (Tabelle E1); die Intensität der grünen Farbe in den Blättern (GNbfFlow), den Anteil an dicken Wurzeln (RootThickMax) und den Schwerpunkt (GravityYMax) beobachtet.
• Die grüne Farbe in den Blättern (GNbfFlow) bezieht sich auf die Grünheit einer Pflanze vor dem Blühen. Sie wird als Anteil (ausgedrückt als %) an grünen und dunkelgrünen Pixeln in den Bildern von Pflanzen ausgedrückt. Die Messung erfolgte vor dem Blühen. Die Intensität der grünen Farbe wird in der Regel als ein Maß für die photosynthetische Kapazität einer Pflanze herangezogen.
• RootThickMax ist ein Maß des Anteils an dicken Wurzeln im Vergleich zu den dünnen Wurzeln im Wurzelsystem einer Pflanze. Der Anteil an dicken Wurzeln wird typischerweise als ein Maß für die Biomasse von Wurzeln über einem gegebenen Dicken-Schwellenwert herangezogen.
• Er wird in der Regel als ein Maß zur Abschätzung der Penetration des Erdbodens, der Pflanzen-Stabilität, der Nährstoffaufnahme, Wasseraufnahme und der Toleranz gegen biotische und abiotische Stressarten herangezogen.
• GravityYMax ist ein Maß des Schwerpunkts der blattartigen Biomasse einer Pflanze. Es wird in der Regel als ein Maß zur Abschätzung der Pflanzenhöhe herangezogen. Tabelle E2

  Ertragsbezogene Eigenschaft	% Erhöhung in den transgenen Pflanzen im Vergleich zur Nullizygot-Kontrollpflanze
  totalwgseeds	34,6
  nrtotalseed	9,3
  fillrate	19,0
  harvestindex	32,8
  GNbfFlow	8,9
  nrfilledseed	30,0
  flowerperpan	17,2
  GravityYMax	5,0
  RootMax	6,0
  RootThickMax	10,6

• 10.1.2 Pflanzen-Leistung unter Stress-Bedingungen
• 10.1.2.1 pGOS2::P.trichocarpa 575797 BFT
• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen T1(erste Generation)-Reispflanzen, welche eine TFL1-like-Nukleinsäure, die den längsten ORF (Offener Leserahmen) von SEQ ID NR: 25 umfasste, unter der Steuerung des GOS2-Promotors exprimieren, im Dürre-Screen, wie oben genannt, sind nachstehend dargestellt (Tabelle E3). Eine Erhöhung von mindestens 5% wurde für die Zeit bis zum Blühen (TimetoFlower), den Wurzel-zu-Spross-Index (RootShInd), die Wurzelbiomasse (RootMax), das Gesamt-Samengewicht (totalwgseeds), die Anzahl gefüllter Samen pro Rispe (nrfilledseed), die Anzahl an Samen pro Pflanze (nrtotalseed), die (Samen)Füllrate (fillrate), Anzahl an Blüten pro Rispe (flowerperpan) und den Ernteindex (harvestindex) (Tabelle E1); die Intensität der grünen Farbe in den Blättern (GNbfFlow), den Anteil an dicken Wurzeln (RootThickMax) und den Schwerpunkt (GravityYMax) beobachtet.
• Eine Erhöhung von mindestens 3% wurde beim Tausendkerngewicht (TKW) beobachtet. Tabelle E3

  Ertragsbezogene Eigenschaft	% Erhöhung in den transgenen Pflanzen im Vergleich zur Nullizygot-Kontrollpflanze
  TimetoFlower	10,5
  RootShInd	11,2
  totalwgseeds	98,9
  Fillrate	109,0
  harvestindex	101,7
  TKW	7,9
  nrfilledseed	87,2
  owerperpan	38,8
  GravityYMax	11,0
  reaCycl	13,9

• Die Zeit bis zum Blühen ist ein Maß der Zeitspanne zwischen der Aussaat und dem Hervortreten der ersten Rispe der Pflanzen. Sie wird in der Regel als ein Maß zur Abschätzung der Blühzeit einer Pflanze herangezogen.
• Der Wurzel-zu-Spross-Index (RootShInd) ist das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Period des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross. Er wird in der Regel als ein Maß der Kohlenstoff-Partitionierung zwischen der oberirdischen und unterirdischen Biomasse herangezogen.
• AreaCycl ist ein Maß der Zeitspanne zwischen der Aussaat und dem Hervortreten der ersten Rispe einer Pflanze, d. h. der Periode der Ansammlung von Biomasse einer Pflanze. Es wird als die Zeit (in Tagen) berechnet, die zwischen dem Aussäen und dem Tag, an dem die Pflanze 90% ihrer Endbiomasse erreicht, nötig ist. Es wird in der Regel als ein Maß zur Abschätzung der Wachstumsrate einer Pflanze herangezogen.
• 10.2. Ribose-5-phosphat-Isomerase (R5PI)
• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche die R5PI-Nukleinsäure, entsprechend der codierenden Sequenz von A.thaliana_AT1G71100, unter Stickstoffmangel-Bedingungen gemäß des Stickstoff-Verwendungseffizienz-Screens exprimieren, sind nachstehend dargestellt (Tabelle E4). Eine Erhöhung von mindestens 5% wurde für Wurzelbiomasse, Gesamtgewicht der Samen pro Pflanze, Anzahl gefüllter Samen pro Pflanze, Anzahl an Blüten pro Rispe und Gesamtzahl an Samen pro Pflanze beobachtet.
• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche die R5PI-Nukleinsäure, entsprechend der codierenden Sequenz von A.thaliana_AT1G71100, unter Nichtstress-Bedingungen exprimieren, sind hier nachstehend dargestellt (Tabelle E5). Eine Erhöhung wurde für Frühwuchskraft, Anzahl primärer (erster) Rispen, Gesamtzahl an Samen pro Pflanze beobachtet. Tabelle E4. Auswertung ertragsbezogener Eigenschaften unter Stickstoffmangel (Screen der Stickstoff-Verwendungseffizienz).

  Ertrags-Eigenschaft	% Erhöhung in den transgenen gegenüber Kontrollpflanzen
  Wurzelbiomasse	3,9
  Gesamtgewicht von Samen pro Pflanze	17,9
  Anzahl gefüllter Samen pro Pflanze	16,2
  Anzahl Blüten pro Rispe	9,0
  Gesamtzahl Samen pro Pflanze	10,3

  Tabelle E5. Auswertung ertragsbezogener Eigenschaften unter Nichtstress-Bedingungen

  Ertrags-Eigenschaft	% Erhöhung in den transgenen gegenüber Kontrollpflanzen
  Frühwuchskraft	19,5
  Anzahl primärer (erster) Rispen	7,5
  Gesamtzahl Samen pro Pflanze	8,8

• 10.3. Zinkfinger(Znf)-Domäne-haltiges A20/AN1-Polypeptid
• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche die Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, wie durch SEQ ID NR: 213 repräsentiert, unter der Steuerung des GOS2-Promotors für konstitutive Expression exprimieren, sind nachstehend dargestellt.
• Es bestand eine signifikante Erhöhung bei der Frühwuchskraft, bei der oberirdischen Biomasse, beim Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, bei der Anzahl gefüllter Samen, bei der Samenfüllrate und beim Ernteindex der transgenen Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), wie es in Tabelle E6 gezeigt ist. Tabelle E6: Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche die Nukleinsäuresequenz, codierend ein Znf A20/AN1-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 213, unter der Steuerung des GOS2-Promotors für konstitutive Expression exprimieren.

  Eigenschaft	Gesamt-Durchschnitt % Erhöhung in 8 Ereignissen in der T1-Generation	Gesamt-Durchschnitt % Erhöhung in 4 Ereignissen in der T2-Generation
  Oberirdische Biomasse	9%	5%
  Frühwuchskraft	11%	10%
  Gesamtsamenertrag je Pflanze	30%	16%
  Gesamtzahl gefüllter Samen	31%	16%
  Samenfüllrate	17%	8%
  Ernteindex	21%	11%

• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche die Nukleinsäuresequenz, die ein Znf A20/AN1-Polypeptid codiert, wie durch SEQ ID NR: 215 repräsentiert, unter der Steuerung des GOS2-Promotors für konstitutive Expression exprimieren, sind nachstehend dargestellt.
• Es bestand eine signifikante Erhöhung beim Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, bei der Anzahl gefüllter Samen, bei der Samenfüllrate und beim Ernteindex der transgenen Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), wie es in Tabelle E7 gezeigt ist. Tabelle E7: Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche die Nukleinsäuresequenz, codierend ein Znf A20/AN1-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 215, unter der Steuerung des GOS2-Promotors für konstitutive Expression exprimieren.

  Eigenschaft	Gesamt-Durchschnitt% Erhöhung in 8 Ereignissen in der T1-Generation
  Gesamtsamenertrag je Pflanze	19%
  Gesamtzahl gefüllter Samen	18%
  Samenfüllrate	19%
  Ernteindex	20%

• 10.4. PHD-zf-Polypeptid
• Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen T1-Generation-Reispflanzen, welche die Nukleinsäuresequenz, die ein PHD-zf-Polypeptid codiert, wie durch SEQ ID NR: 348 repräsentiert, unter der Steuerung eines konstitutiven Promotors exprimieren und unter normalen Wachstumsbedingungen wachsen gelassen werden, sind nachstehend dargestellt.
• Es bestand eine signifikante Erhöhung bei der Pflanzenhöhe, bei der Samenfüllrate, bei der Anzahl von Blüten pro Rispe und beim Tausendkerngewicht (TKW) der transgenen Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), wie es in Tabelle E8 gezeigt ist. Tabelle E8: Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen der T1-Generation, welche die Nukleinsäuresequenz, codierend ein PHD-zf-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 348, unter der Steuerung eines Promotors für konstitutive Expression exprimieren.

  Eigenschaft	Gesamt-Durchschnitt% Erhöhung in 6 Ereignissen in der T1-Generation
  Pflanzenhöhe	4%
  Samenfüllrate	10%
  Blüten pro Rispe	10%
  Tausendkerngewicht	2%

• 10.5. REF/ALY-Polypeptide
• Die Ergebnisse der Auswertung der Nachkommen der Reispflanzen, die mit dem pGOS2::REF/ALY-Vektor transformiert wurden, unter Nichtstress-Bedingungen, sind nachstehend präsentiert. Eine Erhöhung von mindestens 5% wurde für Gesamt-Samenertrag (totalwgseeds oder Gesamtgewicht an Samen), Anzahl der gefüllten Samen (Anz.gefüllter-Samen), Samenfüllungsrate (Füllrate), Anzahl von Blüten pro Rispe (flowerperpan) und Ernteindex (Ernteindex) beobachtet.

  Parameter	% Erhöhung in der transgenen im Vergleich zur Kontrollpflanze
  totalwgseeds	20
  Anz.gefüllterSamen	19
  Füllrate	11
  flowerperpan	11
  Ernteindex	17

• Die Ergebnisse der Auswertung der Nachkommen der Reispflanzen, die mit dem pHMGP::-REF/ALY-Vektor transformiert wurden, unter Nichtstress-Bedingungen, sind nachstehend präsentiert.
• Eine Erhöhung von mindestens 5% wurde für die Frühwuchskraft (EmerVigor), den Gesamtsamenertrag (TotalGew.Samen oder Gesamtgewicht der Samen) und die Anzahl gefüllter Samen (Anz.gefüllterSamen) beobachtet.

  Parameter	%Üb.
  EmerVigor	21
  TotalGew.Samen	11
  Anz.gefüllterSamen	12

  SEQUENZLISTE

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  
• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (23)

1. Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like, Terminal Flower1-like, -Polypeptid codiert, und gegebenenfalls das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit gesteigertem Samenertrag umfasst.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das TFL1-like-Polypeptid eine Sequenz umfasst, die, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, folgendes aufweist: (i) eine Phosphatidylethanolamin-Bindungsprotein(PEBP)-Domäne (Domänen-Zugangsnummer in Pfam: PFAM01161), vorzugsweise wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden, weiter bevorzugt wie repräsentiert durch die Sequenz, die zwischen den Aminosäuren 66–88 in SEQ ID NR: 2 enthalten ist, noch weiter bevorzugt wie in SEQ ID NR: 26 (P.trichocarpa_575797_BFT) vorhanden; und (ii) einen konservierten Histidin (His oder H)- oder vorzugsweise einen Tyrosin (Tyr oder Y)-Rest an einer Stelle, äquivalent zu jener von Aminosäurerest His86 (H86) in SEQ ID NR: 2, sowie einen konservierten Asparaginsäure(D)-Aminosäure- oder vorzugsweise einen Glutaminsäure(Glu)-Aminosäurerest an einer Stelle, äquivalent zu jener von Aminosäurerest Asp142 (D142) in SEQ ID NR: 2.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
4. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A1 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
5. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von beliebigen der in Tabelle A1 angegebenen Proteine codiert.
6. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhte Biomasse, vorzugsweise Spross- und/oder Wurzelbiomasse, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaft aus der Gruppe gewählt wird, die aus Samenertrag, Anzahl an Samen pro Pflanze, Anzahl gefüllter Samen pro Rispe und Ernteindex besteht.
8. Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Dürrestress-Wachstumsbedingungen erhalten werden.
9. Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
10. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Salicaceae, am stärksten bevorzugt aus Populus tichocarpa ist.
11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein TFL1-like-Polypeptid codiert.
12. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend ein beliebiges aus folgendem: (i) eine Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 31 oder SEQ ID NR: 117 repräsentiert wird; (ii) eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, welche(s) zu (i) SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 31 oder SEQ ID NR: 117 komplementär ist; (iii) in Nukleinsäure, codierend ein TFL1-like-Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu (i) SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 31 oder SEQ ID NR: 117; (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen zum Hybridisieren an eine beliebige der oben in (i), (ii) oder (iii) angegebenen Nukleinsäuren in der Lage ist.
13. Isoliertes Polypeptid, umfassend: (i) eine Aminosäuresequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 97%, 98% 99% oder 100% Sequenzidentität zu (i) SEQ ID NR: 17 SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 32 oder SEQ ID NR: 118; und/oder (ii) Derivate von beliebigen der in (i) angegebenen Aminosäuresequenzen.
14. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, codierend ein TFL1-like-Polypeptid, wie in den Ansprüchen 1, 2 oder 13 definiert, oder eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 12; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
15. Konstrukt gemäß Anspruch 14, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis ist.
16. Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 14 oder 15 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
17. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 14 oder 15 transformiert ist.
18. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, codierend ein TFL1-like-Polypeptid, wie in Anspruch 1, 2 oder 13 definiert, oder einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 12; und (ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern; und gegebenenfalls (iii) das Selektieren hinsichtlich Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag.
19. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure resultiert, die ein TFL1-like-Polypeptid, wie in Anspruch 1, 2 oder 13 definiert, codiert, oder eine transgene Pflanze, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
20. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 11, 17 oder 19, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
21. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 20, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
22. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 20 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 21 abgeleitet sind.
23. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein TFL1-like-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Samenertrags im Vergleich zu Kontrollpflanzen.

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