CN104388432B - 甜橙根特异性启动子CsBFTP的分离及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一个启动子的分离与鉴定。从柑橘类果树甜橙品种“锦橙”中分离的CsBFT基因中，得到一个基于该基因的特异启动子序列，该启动子被命名为CsBFTP，其能在柑橘类果树的根中特异性表达。所述的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其核苷酸的核心序列长度为1,575bp，该启动子还可以受到激素和非生物胁迫的诱导。

Description

甜橙根特异性启动子CsBFTP的分离及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一个甜橙根特异启动子CsBFTP的分离及应用，本发明的启动子可用于构建根特异表达的转基因植物；在植物响应激素和非生物胁迫等途径中有重要的作用；为植物的发育和生长提供必要的基础。

背景技术

植物能根据外界环境变化调控特定基因的表达，以适应复杂多变的生长环境。真核生物的基因表达调控包括转录前调控、转录调控、转录后调控、翻译调控和翻译后调控。基因的成功转录是在上游启动子、RNA聚合酶、转录因子等一系列因素一起参与。真核生物中的TATA和CAAT框，它们决定了转录的起始位点和效率，负责和RNA聚合酶结合，启动基本转录过程。其中，转录水平受顺式作用元件和转录因子协调作用，是表达水平的关键环节。植物基因启动子中包括多种重要的顺式作用元件，在转录水平上参与调控下游相应基因表达，从而使植物能够抵御外界环境胁迫。驱动基因能够特异性表达的顺式作用元件由于功能的不同而各不相同，无法给出一个统一的结构，这些元件的结构可能有其自身的特点，它们对基因的特异性表达起到了决定性的作用。因此，对植物特异诱导的启动子进行研究有助于了解基因转录调控表达模式及调控机制，并应用于基因工程中提高或改进外源目的基因的表达。目前已经通过分子生物学的手段验证很多在组织中特异性表达和诱导表达的启动子，如FT/TF1基因家族中MFT通过与ABA信号途径中的ABI3和ABI5蛋白形成负反馈环调控拟南芥种子的萌发(Xi et al.,2010)。ABA在植物的逆境胁迫如干旱、低温、高盐条件下通过伴随着大量的物理变化和发育的改变来增强对逆境的抗性(Mansfieid et al.,1987)。

BFT(BROTHER OF FT AND TFL1)基因作为FT/TF1基因家族中的一员，在植物的成花转变过程中有重要的作用。BFT在高盐胁迫下可通过与FD蛋白互作，抑制了FD蛋白与FT的互作引起植物的晚花(Jae et al.,2014)。除了接受植物发育信号在植物成花方面有重要作用以外，也有研究表明BFT在胁迫条件下可诱导表达(Minida et al.,2001；Chung etal.,2010)。150mM NaCl处理后可明显增强BFT基因的表达，并且高盐胁迫对BFT基因的诱导表达是依赖于ABA(Jae et al.,2011；Jae et al.,2014)

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，从甜橙品种锦橙中分离出一个在根中特异性表达启动子CsBFTP，利用该启动子的特异性转化拟南芥可获得转基因株系，该启动子上含有与些激素和非生物胁迫相关的元件，表明该启动子在植物响应激素和非生物胁迫等途径中有重要的作用。

本发明的技术方案如下所述：

本发明利用植物基因克隆技术，从甜橙品种锦橙(Citrus sinensis)基因组中克隆得到一个在根中特异表达的启动子，它的核苷酸序列如表SEQ ID NO：1所示，序列的长度为1,575bp。申请人将该启动子命名为CsBFTP，申请人将该启动子与标记基因GUS融合，通过花序浸染法转入拟南芥中，验证了该启动子表达的特异性；通过对启动子序列进行预测发现该启动子上含有一些与激素和非生物胁迫诱导相关的元件，并对这些元件进行了验证，表明这个启动子在响应激素和非生物胁迫方面有重要的作用。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的在甜橙品种锦橙根中特异性表达的启动子CsBFTP的核苷酸序列。

图1：是本发明的技术路线。

图2：是CsBFT基因的表达分析。

图3：是从锦橙基因组DNA中扩增CsBFT启动子的电泳图谱。图中标记说明：图左为DL2000marker。

图中标注的是CsBFT基因在甜橙品种“锦橙”的不同部位根、茎、叶、花、果、花托、花瓣、雄蕊、子房中的表达情况。在基地取完后的材料马上在液氮中进行速冻，并在超低温冰箱中保存，备用。花是全开放的花，果是盛花期后一个月的幼果，花不同部位的分离是在冰上进行操作。

图4：是原载体pCAMBIA1391Z和本发明构建的(重组)表达载体pCAMBIA1391+CsBFTP的物理图谱。

图4标记说明：图4中的A图为原载体pCAMBIA1391Z的物理图谱；图4中的B图为本发明构建的表达载体pCAMBIA1391+CsBFTP的物理图谱。

图5：是CsBFT启动子驱动GUS基因在拟南芥中的表达情况。是在T₃代苗中进行检测。图中标记说明：图5中的(A)图是3天时CsBFTP主要在根中表达；图5中的(B)图是7天时CsBFTP主要在根中表达；图5中的(C)图是14天时CsBFTP主要是根部和子叶的叶柄及叶脉中表达；图5中的(D)图是在花中没有检测到CsBFTP的表达；图5中的(E)图是在果中也没有检测到CsBFTP的表达；表明CsBFTP是在根中是特异性表达的。

图6：采用PLACE在线网站对CsBFTP的分析结果。

图中标记说明如表1所示：

表1 启动子CsBFTP的顺式作用元件的预测

注：表1中的R为碱基A或G；N为碱基A或T或G或C。

根据CsBFTP上的这些元件进行相应的处理，进一步验证这些元件的功能。

图7：是不同处理条件下启动子CsBFTP转化拟南芥的GUS组织化学染色检测结果。

图7标记说明：图7中的A图：为对照(CK)；图7中的B图:在18℃下处理6小时；图7中的C图:在28℃下处理6小时；图7中的D图：为100μM脱落酸(ABA)处理3小时；图7中的E图：为50mg/L赤霉素(GA)处理3小时；F：为150mM NaCl处理6小时。

具体实施方式

实施例1：CsBFT基因的表达分析

为了寻找甜橙中的BFT基因，在NCBI中搜索拟南芥的BFT基因(AT5G62040)，找到AtBFT的CDS序列后，在华中农业大学的甜橙数据库(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)中进行Blast，找出在甜橙中的BFT基因，其序列为SEQ NO:2所示的序列

为了确定CsBFT基因(Cs9g16990.1，position＝chr9:16392909..16394285(+strand))在植物中的表达模式，就先对这个基因的表达模式进行定量检测，所采用的引物对序列如下：

RT-PCR：Forward:5-TCCTGGAACCACTGACGCTT-3

Reverse:5-AAGTAAACGGCAGCAACAGG-3

扩增内参基因的引物β-actin：Forward:5-CCGACCGTATGAGCAAGGAAA-3

Reverse:5-TTCCTGTGGACAATGGATGGA-3

1.组织总RNA的提取：分别对华中农业大学柑橘基地的甜橙品种“锦橙”的不同组织如根、茎、叶、花、果进行液氮速冻，并保存于-80℃冰箱，备用。RNA的提取采用Trizol法，参照RNAiso Plus试剂盒说明书(宝生物工程(大连)有限公司产品，Code No.9108)进行，并用RNase-Free DNaseⅠ(宝生物工程(大连)有限公司产品，Code No.2270A)消化15min以去除基因组DNA。对提取的RNA进行质量检测，可通过琼脂糖凝胶进行完整性检测。核酸的浓度用Nano Drop分光光度计测定。A_260/230值为大于2.0，A_260/280值为介于1.8-2.0之间，达到这样要求的表明RNA的质量是好的。

2.第一条链cDNA的合成：cDNA第一条链的合成采用ReverTra Ace qPCR RT Kit反转录试剂盒(购自TOYOBO公司,Code No.FSQ-101)。在RNase-free的0.2ml离心管中加入5μl(约1μg)总RNA，1μl Oligo(dT)₁₈，混匀后70℃变性5min，取出后迅速置于冰上冷却2min；再依次加入dNTP 2μl，5×RT Buffer 4μl，42℃放置2min；最后加入Rever Tra Ace反转录酶1μl，充分混匀后42℃孵育60min，70℃加热10min以终止反应。反转录后的cDNA为模板，用β-actin引物进行PCR检测cDNA质量，-20℃保存备用。

3.RT-PCR和半定量PCR：

在Light Cycler 480PCR仪上进行实时荧光定量PCR，反应程序为：95℃预变性2min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，循环次数为45。每个样品4个重复，以β-actin基因为内参，反应体系如表1。

表1 RT-PCR反应体系

从定量结果结果来看，CsBFT基因在“锦橙”的根中表达量很高，而在营养组织(茎、叶)及幼果中的表达量较低，说明CsBFT基因在根中有特异的表达模式(见图2)。

实施例2：CsBFTP启动子的获得

参照华中农业大学甜橙基因组(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)，找出BFT基因的上游启动子序列，并采用在线分析软件PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/index.html)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对BFT启动子序列中的顺式作用元件进行预测；启动子转录起始位点用Neural Network Promoter Predicition(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)进行预测，发现该启动子上具有相应的相应激素和环境胁迫相关的元件。

按照一般设计引物的原则采用软件Primer 5.0设计引物，并用常规CTAB法提取甜橙叶片的基因组DNA，DNA提取的方法参照程等的方法(Cheng et al.,2003)。以此DNA为模板，采用保真性高的Taq酶进行启动子的扩增，所采用的扩增CsBFTP的引物对的序列如下所示：

Forward：5-ATGAACTGCCCTCTGACGAA-3

Reverse：5-TTTTAGTAAGCTGAGAATAAT-3

扩增的启动子片段用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测(如图3所示)，目的片段按琼脂糖凝胶回收试剂盒(购于上海捷瑞生物工程有限公司，Code No.GK2042)操作说明书进行回收纯化，再进行AT克隆，并转化大肠杆菌DH5α，同时对阳性菌落先进行PCR检测，然后再送样并进行测序(深圳华大基因科技服务有限公司)。随后将测序结果与已知数据库里面的DNA序列进行对比，以保证序列的一致性。

实施例3：启动子CsBFTP驱动GUS在拟南芥中进行遗传转化

(1)载体的构建：根据载体pCAMBIA1391Z(澳大利亚Cambia实验室)上面的多克隆位点来设计引物，同时为了避免翻译起始位点ATG产生的影响，将3’端的反向引物设计在起始密码子ATG的上游，通过GUS基因的表达来验证CsBFTP的空间表达模式。载体的构建严格参照ClonExpress^TM II One Step Cloning Kit操作说明进行(Vazyme^TM,Code No.C112-1)，合成含有酶切位点HindⅢ和BamHⅠ的引物(TSINGKE合成，PAGE纯化)来构建载体(如图4所示)。构建连接pCAMBIA1391Z载体的启动子序列的引物序列为：

Forward：5-tgggcccggcgcgccaagcttATGAACTGCCCTCTGACGAA-3(大写字母(碱基)是引物序列，小写字母是重组位点序列，带下划线小写字母(碱基)是酶切位点)

Reverse：5-gcgctgaattcccggggatccTTTTAGTAAGCTGAGAATAAT-3(大写字母(碱基)是引物序列，小写字母是重组位点序列，带下划线小写字母(碱基)是酶切位点)

具体制备过程：以测序获得的与数据库里面一致的启动子序列的菌液作为模板，用上述引物(Forward、Reverse)进行PCR扩增，为了保证扩增无错配，一般退火温度比设计时的温度高2-3℃，扩增的退火温度为55℃。PCR扩增程序：95℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；72℃，10min。36个循环。同时对pCAMBIA1391的空载用HindⅢ和BamHⅠ进行酶切。酶切体系：反应总体积为40μl，其中含有pCAMBIA1391载体10μl，10×H Buffer 4μl，HindⅢ和BamHⅠ各1μl，双蒸水24μl。在37℃培养箱中酶切过夜。然后对扩增的目的片段及酶切后的pCAMBIA1391进行纯化回收，在1.5mL离心管中加水至500μl，加入等体积的24:1的氯仿，震荡混匀后室温静置5min，12000r/min离心15min，将上清液转移到新的1.5mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，上下轻轻颠倒混匀，-20℃放置30min。12000r/min离心20min，用75％酒精洗涤两次，加入双蒸水20μl。回收后的片段用1％的琼脂糖凝胶检测其完整性并同时用U-0080D紫外分光光度计其浓度。连接的总体积为20μl，连接体系：线性化的pCAMBIA1391载体(50ng/μl)4μl，扩增产物(50ng/μl)1μl，5×CE II Buffer 4μl，Exnase^TM II 2μl，加ddH₂O至20μl。37℃放置30min，进行转化大肠杆菌菌株DH5α。在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，抽提质粒进行酶切检测，PCR检测，再进行测序，确定序列的正确性。将构建好的重组质粒命名为pCAMBIA1391-CsBFTP，采用冻融法将其转入农杆菌菌株EHA105中，并在含有终浓度为50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的LB平板上进行筛选，2-3d后对农杆菌菌落进行PCR检测并按培养基和甘油体积比5:1保存菌液于-80℃超低温冰箱中，备用。

(2)拟南芥的遗传转化：播种前将灭菌的营养土和蛭石按体积比3:1进行混合拌土，用营养液(按常规方法)泡湿并分装于营养钵中。将打破休眠的Col拟南芥种子用枪头点播在营养土上面，每角点播2-3个种子，同时用薄膜进行覆盖保湿。3-4d后待苗子揭膜后，在正常长日照条件(16h光照/8h黑暗)培养，室温23℃左右。

拟南芥植株的转化采用花序浸染法(Zhang et al.,2006)，在主枝抽苔4-5cm时剪去主枝顶端，促进更多侧枝的生产且生长一致，约4-5d后可进行转化，在转化的前一天浇足水。将保存的农杆菌(EHA105)菌种进行活化，28℃，250r/min摇24h。再将活化的菌种接种到50mL含有50mg/L的卡那霉素和25mg/L的利福平的液体培养基中，28℃，250r/min过夜，至菌液为金黄色时取出。5000r/min离心10min收集细胞，弃上清，加入5％蔗糖溶液悬浮菌体使OD₆₀₀＝0.8～1.0，再在菌液中加入0.05％Sliwet L-77以提高转化的效率，混匀后开放的花序在菌液中浸泡30s-1min。将转化后的拟南芥植株浇少量水，并置于黑暗条件下培养24h，后转入正常条件下。之后再用上述同样的方法浸染2-3次，待种子成熟后37℃烘干，并4℃保存。

(3)转基因拟南芥的抗性筛选：将转基因的拟南芥种子4℃放置3天后即可筛选，拟南芥种子先用75％酒精进行表面消毒3min，再用2％次氯酸钠溶液消毒8min，无菌水冲洗3次，最后一次用无菌水浸泡种子1-2小时以促进种子的萌发。然后用灭菌的0.1％的琼脂糖溶液悬浮种子，使种子均匀的铺在含有50mg/L羧苄霉素和25mg/L潮霉素的1/2MS培养基平板上筛选。当幼苗长到15天左右时即可看到筛选出来的苗子，一般长势好，健壮且根系发达的苗子一般是阳性苗。当幼苗长到4-5片叶子时，用清水洗掉根上的培养基并移栽于培养土中后，待苗子长到一定大小时，对T₁代苗进行PCR鉴定(鉴定方法为常规方法)。T₁代种子会由于染色体的自由组合出现性状分离，故用相同的筛选方法筛选T₂代可去除非抗性苗，再对T₂代苗进行DNA和RNA水平上的验证，最后用T₃代阳性苗进行启动子表达模式分析(Zhang etal.,2011)。

实施例4：激素和非生物胁迫对CsBFTP转基因苗的诱导表达

使用PLACE在线网站对CsBFTP序列进行在线预测其顺式作用元件，结果如图6所示，并对这些元件进行相应的处理进行验证。具体实验方法：将获得的纯合T₃代转化拟南芥在1/2MS培养基上培养14天，并进行激素和非生物胁迫的处理。

具体做法：用镊子小心的取出培养14d的拟南芥苗，并置于含有脱落酸(ABA)、赤霉素(GA₃)和NaCl的水溶液中，并以清水来作为对照，定时取样。温度处理是置于光照培养箱中进行。取样时用水清洗一下，并用滤纸吸干上面的水分，迅速将植株置于2mL含有新配制的GUS染色液的离心管中，GUS染色液的配置见附录，保证组织全部浸入溶液中。然后将离心管放到37℃培养箱中避光染色24小时。然后把GUS染色液再进行保存于4℃进行回收使用。用70％酒精脱色3次，再用100％浓度的酒精脱色数次，至对照的叶片呈白色为止。最后保存于福尔马林-醋酸-洒精混合液固定保存，用肉眼或者在借助体式显微镜下观察GUS基因的表达情况，然后在体式显微镜或者用相机进行拍照，保存实验结果。GUS基因的表达情况从侧面反映出CsBFTP的表达模式。从图5可以看出，CsBFTP在根中是特异表达的，在果和花中都没有表达。从图7的结果可以看出，无论是高温(28℃)还是低温(18℃)都可诱导CsBFT基因在根中的表达明显升高；激素ABA和GA处理处理3小时后CsBFT表达也明显升高；盐胁迫对CsBFTP的诱导表达也是很明显的。这些结果表明CsBFTP在响应激素和非生物胁迫等途径中有重要的作用。

附录：1.GUS染色液的配方：

(1)制备方法：A液：称取NaH₂PO₄·2H₂O 3.12g溶于蒸馏水中，定容至100mL；

B液：称取Na₂HPO₄·12H₂O 7.17g溶于蒸馏水中，定容至100mL；

(2)磷酸缓冲液(PBS)的准备：取100mL上述B液与40mL A液混合(混合后pH值约7.03),用NaH₂PO₄·2H₂O调至pH值为7.0。

(3)染色液的配制

2..MS培养基母液配制：

一.大量元素(10倍液)：称取下列药品分别溶解定容到1升后，加到5升存储瓶中。

注意事项：

1配置母液前要仔细清洗存储容器

2.应按照顺序分别彻底溶解后混合，每加完一种药品，摇动存储瓶使其混合均匀；

3.溶解时最好加热，以便充分溶解，避免沉淀的产生；

4.夏季要用新制的蒸馏水，并加热，这样可以避免因为水中带菌量过大而产生沉淀，同时可以减缓绿藻的生成；

5.沉淀的产生一是由于溶解不充分就混合造成的(浑浊型沉淀)，所以配置时一定不要急；二是由于菌类的生长而产生絮状沉淀，所以要用新制的蒸馏水并加热。

二.微量元素母液的配制(100倍)：取少量(200-300mL)温水依次加入下列药品，每加一种药品后搅拌溶解，最后定容到1L：

注意：配好后在室温下放置10h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易产生结晶沉淀。配制过程中产生沉淀的原因有：1.前一个没彻底溶解就加入了后一个药品；2.蒸馏水pH值过高，可加几滴盐酸校正。

三.甘氨酸和肌醇的配制(100倍):

甘氨酸:0.2g溶解定容到一升；肌醇:10g溶解定容到一升。

四.铁盐的配制(100倍):

称取EDTA 3.73g,FeSO₄·7H₂O 2.78g,分别溶解后混合定容到1L,放入棕色细口瓶中,室温放置10h以上(防止结晶沉淀)，然后放入4℃冰箱。

五.维生素B的配制(100倍)：

VB₁(盐酸硫氨素) 10mg

VB₆(盐酸吡哆素) 50mg

VB₅(烟酸) 50mg

分别称取顺序溶解在温热的蒸馏水中，定容到1升。

注:需要溶解完一个再加另一个。VB₅不易溶解,需要搅拌,必要时可以加热。

蔗糖30g/L，PH调至5.8～6.0，琼脂粉7.0g/L。

主要参考文献：

1.Mimida,N.,Goto,K.,Kobayashi,Y.,Araki,T.,Ahn,J.H.,Weigel,D.,Murata,M.,Motoyoshi,F.,and Sakamoto,W.(2001).Functional divergence of the TFL1-likegene family in Arabidopsis revealed by characterization of a novelhomologue.Genes to Cells 6:327-336.

2.Chung,K.S.,Yoo,S.Y.,Yoo,S.J.,Lee,J.S.,and Ahn,J.H.(2010).BROTHER OFFT AND TFL1(BFT),a member of the FT/TFL1family,shows distinct pattern ofexpression during the vegetative growth of Arabidopsis.Plant signaling&behavior 5:1102-1104.

3.Xi,W.,Liu,C.,Hou,X.,and Yu,H.(2010).MOTHER OF FT AND TFL1regulatesseed germination through a negative feedback loop modulating ABA signaling inArabidopsis.Plant Cell 22:1733-1748.

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5.Cheng YJ,Guo WW,Yi HL,Pang XM,Deng X(2003)An efficient protocol forgenomic DNA extraction from Citrus species.Plant Molecular Biology Reporter21:177a-177g

6.Jae Yong Ryu,Chung-Mo Park,and Pil Joon Seo(2011)The floralrepressor BROTHER OF FT AND TFL1(BFT)modulates flowering initiation underhigh salinity in Arabidopsis.Molecular Cell 32:295-303

7.Jae Yong Ryu,Hyo-Jun Lee,Pil Joon Seo,Jae-Hoon Jung,Ji Hoon Ahn,andChung-Mo Park(2014)The Arabidopsis floral repressor BFT delays flowering bycompeting with FT for FD binding under high salinity.Molecular Plant 7:377-387

8.Nemhauser J,Hong F,Chory J(2006)Different plant hormones regulatesimilar processes through largely nonoverlapping transcriptionalresponses.Cell 126(3):467–475.

9.Zhang JZ,Ai XY,Sun LM,Guo WW,Deng XX,Hu CG(2011).Molecular cloningand functional characterization of genes associated with flowering in citrususing an early-flowering trifoliate orange mutant(Poncirus trifoliataL.Raf.).Plant Molecular Biology,76:187–204.

Claims (1)

1.一种分离的甜橙根特异启动子CsBFTP在调控拟南芥根发育过程中的应用，其特征在于，所述的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。