CN110862985B - 克里曼丁花特异性表达启动子CcPIpro及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了克里曼丁花特异性表达启动子CcPIpro及其应用。本发明从克里曼丁基因组中分离出CcPI基因的启动子CcPIpro，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，长度为2242bp，能在花中特异性表达，可将该启动子应用于构建花特异表达的转基因植物，为柑橘的遗传改良提供新的基因资源。

Description

克里曼丁花特异性表达启动子CcPIpro及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及克里曼丁花特异性表达启动子CcPIpro及其应用。

背景技术

植物能根据外界环境变化调控特定基因的表达，以适应复杂多变的生长环境。真核生物中的TATA和CAAT框，它们决定了转录的起始位点和效率，负责和RNA聚合酶结合，启动基因转录过程。其中，转录水平受特异的顺式作用元件和转录因子协调作用，是表达水平的关键环节。因此，对植物特异诱导的启动子进行研究有助于了解基因转录调控表达模式及调控机制，并应用于基因工程中提高或改进外源目的基因的表达。目前已经通过分子生物学的手段验证很多在组织中特异性表达和诱导表达的启动子，如FT/TF1基因家族中MFT通过与ABA信号途径中的ABI3和ABI5蛋白形成负反馈环调控拟南芥种子的萌发(Xi et al2010)。ABA在植物的逆境胁迫如干旱、低温、高盐条件下通过伴随着大量的物理变化和发育的改变来增强对逆境的抗性(Mansfieid et al 1987)。

开花是一个在一定的遗传背景控制下生理生化及形态发生高度复杂的过程。植物接受环境因子(如光周期、温度)等诱导后，经一系列信号传导过程(Ca-CaM系统)，启动开花决定过程中的控制基因，并在诸多关键基因的相互作用以及诸多代谢途径的相互制约下，引起花芽分化，进而导致花器官发生。这些过程由许多特异性基因按一定的时间顺序性和空间特异性程序启动和关闭表达所控制，各个基因既具有独立功能，又相互影响、相互制约。

花是种子植物中最为重要的器官，在进化过程中最为丰富，花发育一直是发育生物学上研究的重点。经典的ABC模型揭示了花器官发育的分子机理(Coen and Meyerowitz1991)。两个含有MADS-box盒的B类基因AP3和PI特异地调控花瓣和雄蕊的发育(Schwarz-Sommer et al 1992,Yao et al 2008)，它们的表达受到上游花分生组织特异基因LFY和AP1激活。AP3和PI主要以异源二聚体的形式存在，在靶基因结合、核定位和调节下游基因的转录上有重要作用(McGonigle et al 1996,Yang et al 2003)。随着研究的深入，AP3/PI二聚体与其它的MADS-box基因形成更高级的蛋白复合物，调控器官的的特异性分化，与AP1和SEP组成四聚体复合物调控花瓣的形成，与AG和SEP蛋白一起调控雄蕊的发育。因此，开发一种新的花特异性表达启动子将能为创建花特异表达的植物及植物遗传改良提供新的基因资源。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，从克里曼丁基因组上分离出一个在花中特异性表达的启动子，利用该启动子的特异性转化拟南芥可获得转基因株系。

本发明利用植物基因克隆技术，从克里曼丁(Citrus clementina)基因组中克隆得到一个在花中特异表达的启动子，其核苷酸序列如表SEQ ID NO.1所示，序列的长度为2242bp。申请人将该启动子命名为CcPIpro。首先利用实时荧光定量PCR验证CcPI基因表达的特异性，同时将启动子CcPIpro与标记基因GUS融合，通过花序浸染法转入拟南芥植株中，验证了启动子CcPIpro在花中表达的特异性。本发明获得了重组载体pBI101+CcPIpro及携带该载体的转基因植株，为利用该启动子来创建花特异表达的植物提供新的基因资源。

因此，本发明的第一个目的是提供克里曼丁花特异性表达启动子CcPIpro，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供所述的克里曼丁花特异性表达启动子CcPIpro在植物遗传改良中的应用。

优选，所述的应用为在柑橘遗传改良中的应用。

本发明还提供含有所述的克里曼丁花特异性表达启动子CcPIpro的表达载体。

优选，所述的表达载体为重组表达载体pBI101+CcPIpro，是用内切酶Hind III和BamH I酶切载体pBI101和上下游含有内切酶Hind III和BamH I位点的克里曼丁花特异性表达启动子CcPIpro，再进行连接反应，使克里曼丁花特异性表达启动子CcPIpro插入到酶切位点Hind III和BamH I之间，得到重组表达载体pBI101+CcPIpro。

本发明还提供所述的表达载体在植物遗传改良中的应用。

优选，所述的应用为在柑橘遗传改良中的应用。

本发明通过分离柑橘品种克里曼丁(Citrus clementina)中PI基因(CcPI基因)验证其表达模式，同时分离了其上游的启动子CcPIpro序列，将该启动子融合GUS基因后通过花序浸染法转入拟南芥中，验证该启动子表达的特异性。可利用本发明基因启动子的特异性构建花特异性表达的转基因植物，为柑橘的遗传改良提供新的基因资源。

附图说明

图1是本发明的技术路线。

图2是CcPI基因在不同组织和花不同部位的表达模式；上图为定量检测的结果，下图为半定量检测的结果。附图标记说明：图中标注的是CcPI基因在克里曼丁根(R)、茎(S)、叶(L)、花(Fl)、果(Fr)、萼片(se)、花瓣(pe)、雄蕊(st)、雌蕊(car)中的表达情况。

图3是CcPIpro启动子上预测的顺式作用元件示意图。

图4是本发明的原始载体pBI101和构建的重组载体pBI101+CcPIpro的物理图谱；A图是原始载体pBI101的物理图谱；B图是构建的重组载体pBI101+CcPIpro的物理图谱。

图5是CcPIpro启动子驱动GUS基因在拟南芥中的染色情况；A图是转CcPIpro::GUS植株花全开放时的染色情况，CcPIpro启动子特异性地在花瓣(pe)和雄蕊(st)中表达，在萼片(se)和雌蕊(car)中没有检测到GUS蛋白的表达；B图是转CcPIpro::GUS植株花苞的染色情况，只在花苞(fb)中能观察到染色，而在叶片(L)中检测不到GUS蛋白的表达。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：CcPI基因的表达分析

本发明的技术路线如图1所示。

为了寻找克里曼丁(Citrus clementina)中的PI基因，在拟南芥基因组数据库中搜索AtPI基因(AT5G20240)，找到AtPI的CDS序列后，在克里曼丁基因组数据库v1.0(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)中进行Blast，根据同源性比对的结果找出分值最高的基因。同时结合我们前期对克里曼丁MADS-box基因家族的分析(Hou etal 2014)，对该基因验证其同源性结果，我们将该基因命名为CcPI，其具体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

为了确定CcPI基因(Ciclev10002422m，position＝scaffold_5:37803934..37806103 forward)在柑橘中的表达模式，就先对这个基因的表达模式进行定量和半定量检测，所采用的引物对序列如下：

CcPI基因定量引物：正向引物:5-GAGCAATAGGCAGGTGACTTA-3，

反向引物:5-CTTCCCAGACTGCTTGTGATA-3；

内参基因β-actin引物：正向引物:5-CCGACCGTATGAGCAAGGAAA-3，

反向引物:5-TTCCTGTGGACAATGGATGGA-3。

1.组织总RNA的提取：分别对华中农业大学国家柑橘育种中心种质资源圃克里曼丁不同组织根、茎、叶、花、果进行液氮速冻，并保存于-80℃冰箱，备用。根、茎、叶为成年态植株的组织，花是全开放的花，果是盛花期后一个月的幼果。花不同部位的分离在冰上进行操作。RNA的提取采用Trizol法，参照RNAiso Plus试剂盒说明书(宝生物工程(大连)有限公司产品，Code No.9108)进行，并用RNase-Free DNaseⅠ(宝生物工程(大连)有限公司产品，Code No.2270A)消化15min以去除基因组DNA。对提取的RNA进行质量检测，可通过琼脂糖凝胶进行完整性检测。核酸的浓度用Nano Drop2000分光光度计测定。A_260/230值为大于2.0，A_260/280值为介于1.8-2.0之间，达到这样要求的表明RNA的质量是好的。

2.第一条链cDNA的合成：cDNA第一条链的合成采用ReverTra Ace qPCR RT Kit反转录试剂盒(购自TOYOBO公司,Code No.FSQ-101)。具体操作方法参考试剂盒说明书进行。反转录后的cDNA为模板，用β-actin引物进行PCR检测cDNA质量，-20℃保存备用。

3.定量PCR和半定量PCR：以反转录后200ng的cDNA为模板，在LightCycler480荧光定量仪上进行实时荧光定量PCR。定量引物的设计尽量避免在保守结构域，且扩增片段大小在150-200bp之间，引物退火温度为55-60℃。反应程序为：95℃预变性2min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，循环次数为45。每个样品设置4个重复，以柑橘β-actin基因为内参基因，反应体系如表1：

表1实时定量PCR反应体系

半定量PCR：反应程序为95℃预变性5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，循环次数为28；72℃10min，16℃10min，反应体系如表2：

表2半定量PCR反应体系

结果分析：CcPI基因在克里曼丁的花中特异性表达，在营养组织根、茎和叶片及生殖器官果实中几乎检测不到CcPI基因的表达(图2)。通过检测CcPI基因在花不同部位中的表达表明CcPI在花瓣和雄蕊中特异性表达。由此表明CcPI基因行使B类基因的功能，在花瓣和雄蕊中特异性表达，从而调控第二轮和第三轮花器官的发育。

实施例2：CcPI启动子的获得

参考克里曼丁基因组数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝Org_Cclementina)，找出CcPI基因的上游启动子序列，本发明将该基因的启动子命名为CcPIpro，并采用在线分析网站PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对CcPI启动子序列中的顺式作用元件进行预测；启动子转录起始位点用Neural Network Promoter Predicition网站(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)进行预测。

按照一般设计引物的原则采用软件Primer 5.0设计引物，并用常规CTAB法提取克里曼丁叶片的基因组DNA，DNA提取的方法参照前期的方法(Cheng et al 2003)。以此DNA为模板，采用保真性高的Taq酶进行启动子的扩增，所采用的扩增CcPIpro引物对的序列如下所示：

正向引物：5-GTAGCTCGTTAATCTTCCAT-3，

反向引物：5-TTTTAGTAAGCTGAGAATAAT-3。

扩增的启动子片段用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，目的片段按琼脂糖凝胶回收试剂盒(购于上海捷瑞生物工程有限公司，Code No.GK2042)操作说明书进行回收纯化，再进行AT克隆，并转化大肠杆菌DH5α，同时对阳性菌落先进行PCR检测，然后再送样并进行测序(武汉昆泰锐生物技术有限责任公司)。随后将测序结果与已知数据库里面的DNA序列进行对比，以保证序列的一致性。

结果分析：分离并克隆了CcPI基因ATG上游2242bp的启动子CcPIpro序列，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并对该启动子上的顺式作用元件进行预测(图3)。图3中标记说明如表3所示：

表3 CcPI启动子顺式作用元件的预测

注：以起始密码子(ATG)上游第一个碱基为-1来标记启动子的位置。TSS表示转录起始位点。

以起始密码子ATG上游第一个碱基为-1，根据软件预测的结果，CcPI启动子的转录起始位点(TSS)位于-254bp处，且上游30bp处(-183bp)有一个典型的在TATA-box。根据PlanCEAR网站对CcPI基因的2242bp启动子序列中的顺式调控元件进行了预测分析，除了一些基本元件CAAT-box是启动子和增强子共有的区域外，我们还发现响应外界环境因子的元件。四个响应光调控的元件位于-142bp到-319bp之间和-1231bp上；在-1479bp和-2057bp上分别有一个响应高温的元件HSE；响应低温胁迫的元件LTR位于-1539bp上；在-38bp、-1074bp和-1734bp处各一个MYB基因的结合位点，涉及到对干旱的胁迫响应。此外还有一个响应生物钟调控的元件位于-1365bp处。除含有响应环境因子的元件外，还有一些响应激素的元件，两个响应茉莉酸内酯(MeJA)的元件TGACG-motif位于-937bp和-1827bp处；在-2193bp有一个响应乙烯的元件ERE；在-124bp含有一个P-box元件，对赤霉素产生响应。我们还发现3个调控植物胚乳相关的元件Skn-1，分别位于-358bp、-1686bp和-2138bp处。

实施例3：启动子CcPIpro驱动GUS在拟南芥中进行遗传转化

1.载体的构建：根据表达载体pBI101上面的多克隆位点来设计重组引物，同时为了避免翻译起始位点ATG产生的影响，将3’端的反向引物设计在起始密码子ATG上游第一个碱基处，通过GUS基因的表达来验证启动子CcPIpro的空间表达模式。载体的构建严格参照南京诺唯赞技术有限公司的一步重组法进行构建，具体方法参考ClonExpress^TM II OneStep Cloning Kit说明书进行。合成含有酶切位点Hind III和BamH I的重组引物来构建载体(如图4所示)。构建重组pBI101载体的启动子引物序列为：

正向引物：5-gagatctacagcgctaagcttGTAGCTCGTTAATCTTCCAT-3(大写字母(碱基)是引物序列，小写字母是重组位点序列，带下划线小写字母(碱基)是酶切位点)；

反向引物：5-ggactgaccacccggggatccTTCACAAACAGCCCAGTTGG-3(大写字母(碱基)是引物序列，小写字母是重组位点序列，带下划线小写字母(碱基)是酶切位点)。

具体制备过程：以实施例2中测序获得的与数据库一致的启动子CcPIpro序列的菌液作为模板，用上述构建重组pBI101载体的正向引物、反向引物进行重组片段的扩增。PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。同时对pBI101载体进行酶切。酶切体系40μl：pBI101载体10μl，10×H Buffer 4μl，Hind III和BamH I各1μl，双蒸水24μl。在37℃培养箱中酶切2h。采用天根生化科技(北京)有限公司的DNA纯化回收试剂盒对扩增的重组片段及酶切后的pBI101进行纯化回收。回收后的片段用1％的琼脂糖凝胶检测其完整性并同时用NANODROP 2000超微量分光光度计仪检测回收片段的浓度及纯度。连接体系20μl：线性化的pBI101载体(50ng/μl)4μl，启动子CcPIpro序列扩增产物(50ng/μl)1μl，5×CE II Buffer 4μl，Exnase^TM II 2μl，加ddH₂O至20μl。37℃放置30min，转化大肠杆菌菌株DH5α。在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑选单克隆进行PCR检测并测序，以确定序列的正确性。将构建好的重组质粒命名为pBI101+CcPIpro，采用冻融法将其转入农杆菌菌株GV3101中，并在含有终浓度为50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的LB平板上进行筛选，2-3d后挑取单菌落进行PCR检测并按培养基和甘油体积比5:1保存菌液于-80℃超低温冰箱中，备用。

2.拟南芥的遗传转化：将带有目的基因的超表达载体转入哥伦比亚型拟南芥中。具体步骤如下：

(1)拟南芥的种植：在2ml离心管中加入适量的拟南芥种子，加入1ml水浸泡，置于4℃三天，打破种子的休眠；用枪头吸取种子并点播到营养基质的表面，一般每盆点播10棵种子左右，避免有的种子活力差不能发芽；盖上薄膜保湿，同时戳几个孔保持透气；3d后揭膜，在23℃的培养室(16h光照/8h黑暗)中生长约30d，期间进行疏苗保持每盆4株苗子；待花序抽出约1cm时即可进行农杆菌浸染。

(2)农杆菌的准备：将鉴定为阳性的农杆菌在含有50mg/L Rif和50mg/L Kan的固体LB平板上划线，28℃倒置培养2d；用勺子轻轻在表面刮取农杆菌于50ml的5％蔗糖(现用现配)溶液中，避免刮入培养基，置于28℃摇床中振荡分散菌体约30min。测定并用蔗糖溶液调至菌液的OD₆₀₀为0.8左右，加入少量的Sliwet L-77表面活化剂至终浓度为0.02％，混匀后即可进行拟南芥的转化。

(3)拟南芥的转化：拟南芥植株的转化采用花序浸染法(Zhang et al 2006)。将待转的拟南芥苗倾斜，花序在农杆菌菌液中浸染1min，期间不断转动菌液保证花序与菌液充分接触；转化完之后用黑色的塑料袋避光保湿24h，提高转化的效率；然后置于正常条件下生长，每5d转化一次，约转化2-3次即可。待种子成熟后收种即T₀代种子置于37℃干燥箱中干燥7d，后置于4℃保存。

(4)转基因拟南芥的抗性筛选：将转基因的拟南芥种子4℃放置3d后即可筛选，在无菌条件下，每管中加入1.5ml 75％酒精，上下颠倒5min。吸出75％酒精，加入1ml 100％酒精，用剪过的枪头吸取种子至灭菌滤纸上，风干5min。消毒完毕后，用镊子夹取滤纸使种子均匀地散在含有50mg/L Kan和100mg/L Tim的1/2MS筛选培养基上进行筛选。当幼苗长到10d左右时即可看到筛选出来的苗子，一般长势好，健壮且根系发达的苗子一般是阳性苗。当幼苗长到4-5片叶子时，用清水洗掉根上的培养基并移栽于培养土中后，待苗子长到一定大小时，对T₁代苗进行PCR鉴定(鉴定方法为常规方法)。T₁代种子会由于染色体的自由组合出现性状分离，故用相同的筛选方法筛选T₂代可去除非抗性苗，再对T₂代苗进行DNA和RNA水平上的验证，最后用T₃代阳性苗进行启动子表达模式分析。

(5)转基因植物的GUS染色：将转CcPIpro::GUS基因的T₃代植株的花序用GUS染色液进行染色，保证组织全部浸入溶液中。然后将离心管放到37℃培养箱中避光染色24小时，再把GUS染色液再进行保存于4℃进行回收使用。用70％酒精脱色3次，再用100％浓度的酒精脱色数次，直至组织呈现白色为止。用肉眼或者在借助体式显微镜下观察GUS基因的表达情况，然后在体式显微镜或者用相机进行拍照，保存实验结果。GUS基因的表达情况从侧面反映出CcPIpro的空间表达模式。

其中所用的GUS染色液的配方：

(1)制备方法：A液：称取NaH₂PO₄·2H₂O 3.12g溶于蒸馏水中，定容至100mL；

B液：称取Na₂HPO₄·12H₂O 7.17g溶于蒸馏水中，定容至100mL；

(2)磷酸缓冲液(PBS)的准备：取100mL上述B液与40mL A液混合(混合后pH值约7.03),用NaH₂PO₄·2H₂O调至pH值为7.0。

(3)染色液的配制

结果分析：图5中的A图是转CcPIpro::GUS植株花全开放时的染色情况，只能在花瓣(pe)和雄蕊(st)中检测到有GUS基因的表达，在萼片(se)和雌蕊(car)中没有检测到GUS基因的表达；图5中的B图是转CcPIpro::GUS植株花苞时的染色情况，只在花苞(fb)中能观察到染色，在叶片(L)中检测不到GUS基因的表达。结果说明，CcPI启动子特异性地在花瓣(pe)和雄蕊(st)中表达，花萼、雌蕊及其它组织中都检测不到GUS基因的表达，表明CcPI启动子是特异性地调控CcPI基因在花瓣和雄蕊中发挥作用，与CcPI基因的组织表达模式相同。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 克里曼丁花特异性表达启动子CcPIpro及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2242

<212> DNA

<213> 克里曼丁(Citrus clementina)

<400> 1

gtagctcgtt aatcttccat taaaactaat tgagatgagt ggaagaagaa tttcaaattt 60

ttacatgagt atatatatgt gaagtgaggc atttaattta tcatgtcata tgaaaacaag 120

aattagaaaa tattgatagg aatcaacgtt tgagatacac acacacacat tcattcactt 180

tactaaaaaa attttaatga gtgttcaaca tgggtgttaa gagtataaat cgtccttgat 240

agtaaattaa gttatggatt tttaagtaat ataaaatttt atttaatcaa gagtgttcat 300

agtagaattt atagtgcaaa taatcccacc ataacataaa atgaatttga gatttgcatc 360

cgtgaaaagc aaagtaaggg acggttggct aaataaaatt aatcaattaa ttaaatgacg 420

ctacatatta ttattactat tagttatctt ttttatttta agcatacatg ttttatgagc 480

atccacatga tgctacatta gttgtaatca actgataata ttatacacta attataaaac 540

aataagcagt gatctagtca tgtaaaagca aatataaaca tgaaaagaaa ttcaatagat 600

gaaaattggg agcacttaag gtttttcaaa ttagaatgct cattgtataa aaatctctta 660

ttgaatatgt aaattttctt tttttcttct aatttttttt cccccgaaag attgttgatt 720

tcaatgcatt ggaattttaa ctctacactt aaaaaccaaa aaaaaaaatt taataatttg 780

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aaagagctaa gacaacacta aacgggaatg tgcaactcca gaaacataat tgtttaatat 1740

gctaagtata tttaaaagaa gagactgatt acccagccgt ttaacaatat atattataat 1800

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tggagtaata tacgataaaa tcagtcatag atagtcagac agagagaatc aatgagacca 1920

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aaaaaaaaaa taaaaaacaa ag 2242

<210> 2

<211> 660

<212> DNA

<213> 克里曼丁(Citrus clementina)

<400> 2

atggggagag gaaagattga gatcaagagg attgagaact tgagcaatag gcaggtgact 60

tattcaaaga gaagaaatgg gttgattaag aaagctaagg agattgcagt tctttgtgat 120

gctaaagttt ctctcatcat tttcgccact tctggcaaga tgcatgacta ctcgagtgct 180

ccgatgtttg agattttaga agcgtatcac aagcagtctg ggaagaaact ctgggatgct 240

aagcatgaga acctctacaa tgaaattgat agaatcaaga aagagaatga cagcatgcag 300

atcaagctcc ggcacctcaa gggagaggat gtcacatctt tgaaccacaa agagctcatg 360

gccttagagg atgcccttga aaatggcctc accggtattc gcgacaaaca gagtgaggtg 420

atggagagga tgaggaaaaa tggaaaaatg ctggaggagg agcataatta cctcaaatat 480

gttctgcggc aacaggagat agctaagcag caacaacaac aacagatggc tttggagaac 540

aacgtgagag agattgatcc caacggatat catcagcgag agaatgacgg gtacagttca 600

catatgcctc tcgccttccg cgtgcagccc attcagccaa atctccagga gaggatctga 660

Claims (5)

1.克里曼丁花特异性表达启动子CcPIpro，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的克里曼丁花特异性表达启动子CcPIpro在植物遗传改良中的应用，所述的植物为柑橘和拟南芥。

3.含有权利要求1所述的克里曼丁花特异性表达启动子CcPIpro的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为重组表达载体pBI101+CcPIpro。

5.权利要求3所述的表达载体在植物遗传改良中的应用，所述的植物为柑橘和拟南芥。

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