CN103266112B - 控制水稻开花的OsAGP13基因及其RNA干扰片段的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种控制水稻开花的OsAGP13基因及其RNA干扰片段的应用，属于植物基因工程领域。OsAGP13基因的RNA干扰片段的核苷酸序列SEQIDNO：1所示；利用基因工程技术构建了OsAGP13-RNAi载体并通过转基因技术获得了抽穗开花期提前的OsAGP13-RNAi转基因植株；本发明还证实了OsFTL1基因的表达则受到OsAGP13基因的抑制；OsAGP13-RNAi植株中由于OsAGP13基因表达的抑制导致OsFTL1基因的高量表达从而促进水稻提前开花，表明OsAGP13基因能够控制水稻开花。OsAGP13基因及其干扰片段可用于研究影响水稻开花的分子生物学机制和控制水稻开花。

Description

控制水稻开花的OsAGP13基因及其RNA干扰片段的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种控制水稻开花的OsAGP13基因及其RNA干扰片段的应用。

背景技术

光周期是影响植物开花的一个决定因素，水稻是典型的短日照植物，短日照条件下生长的水稻将提早开花。目前已从水稻中克隆了一系列影响水稻开花的基因：（1）OsGI（Oryzasativa Gigantea）基因的表达模式受到昼夜节律的控制。过量表达OsGI基因，无论是处于长日照还是短日照条件下，水稻开花均被延迟，说明OsGI可以抑制水稻开花（Hayama等，Adaptation of photoperiodic control pathways produces short-day flowering in rice.Nature,422:719-722.）。（2）Hd1（Heading date1）基因的表达受到昼夜节律的调控，水稻通过调节Hd1编码蛋白的稳定性使光信号与昼夜节律同步。Hd1在长日照条件下抑制水稻开花，而在短日照条件下促进水稻开花（Yano等，2000.Hd1,a major photoperiod sensitivity quantitative traitlocus in rice,is closely related to the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS.Plant Cell,12:2473-2483.）。（3）Hd3a/RFT1（Heading date3a/Rice flowering locus T1）基因编码水稻中的成花素，它的表达受到Hd1的调控；Hd3a通过韧皮部从叶片中运输到茎顶端分生组织，启动一系列花器官基因的表达并诱导水稻开花。RFT1和Hd3a是分布于同一条染色体上的同源基因，RFT1是长日照条件下促进水稻开花的主效基因；在短日照条件下这两个基因的作用冗余，但是短日照条件下水稻的开花主要由Hd3a来激活（Komiya等，2008.Hd3a and RFT1are essentialfor flowering in rice.Development,135:767-774.）。Hd3a/RFT1作用于OsMADS14和OsMADS15基因的上游，OsMADS14和OsMADS15的表达激活了位于其下游的一系列决定花器官特征基因的表达从而启动拟南芥花原基的发生（Komiya等，2009.A gene network for long-dayflowering activates RFT1encoding a mobile flowering signal in rice.Development,136:3443-3450.）。（4）此外，过量表达OsFTL1（Rice flowering locus T-like1）基因的导致抗性愈伤组织在分化成苗时就形成了花器官，在阳性愈伤组织中检测到OsMADS14基因的表达（Izawa等，2002.Phytochrome mediates the external light signal to repress FT orthologs inphotoperiodic flowering of rice.Genes Dev.,16:2006-2020.）。（5）Ehd1（Early heading date1）基因编码一类B型的反应调节控制因子，它独立于Hd1信号通路外控制水稻开花，通过作用于Hd3a/RFT1和部分MADS-box基因的上游而促进水稻开花（Doi等，2004.Ehd1,a B-typeresponse regulator in rice,confers short-day promotion of flowering and controls FT-like geneexpression independently of Hd1.Genes Dev.,18:926-936.）。（6）RID1（Rice Indeterminate1）也被称作OsID1（Rice Indeterminate1）或Ehd2（Early heading date2），编码一种属于锌指蛋白的转录因子，通过上调Ehd1的表达促进水稻开花（Wu等，2008.RID1,encoding aCys2/His2-type zinc finger transcription factor,acts as a master switch from vegetative to floraldevelopment in rice.Proc.Natl Acad.Sci.USA,35:12915-12920.）。（7）Ghd7（Grains Height Date7）基因编码1类含有CCT结构域的蛋白质，在长日照条件下，Ehd1和Hd3a的表达受到Ghd7的抑制，然而Hd1的表达却不受影响，因Ehd1和Hd3a的表达下调从而推迟水稻开花（Xue等，2008.Natural variation in Ghd7is an important regulator of heading date and yield potential inrice.Nat.Genet.,40:761-767.）。（8）Hd6编码一种蛋白激酶CK2的一个亚基，这个基因可延长水稻的抽穗期（Takahashi等，2001.Hd6,a rice quantitative trait locus involved in photoperiodsensitivity,encodes theαsubmit of protein kinase CK2.Proc.Natl Acad.Sci.USA,98:7922-7927.）。

目前已报道的控制水稻开花时间基因大多通过控制成花素基因Hd3a/RFT1的表达而发挥作用，但尚未分离或克隆到通过调控OsFTL1的表达从而影响水稻开花的基因，且该途径相关的分子生物学机制还不清楚。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种OsAGP13基因的RNA干扰片段，OsAGP13基因在RGAP（Rice Genome Annotation Project）和RAP-DB（Rice Annotation Project Database）中的位点分别是LOC_Os07g40130和Os07g0590700。在水稻的两个亚种粳稻和籼稻中，该基因全长cDNA在Genebank中的获取号分别是AK062359.1和CT830020.1。

本发明的另一目的在于提供一种含上述RNA干扰片段的载体。

本发明的再一目的在于提供OsAGP13基因、上述RNA干扰片段或载体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种OsAGP13基因的RNA干扰片段（OsAGP13-RNAi片段），其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

一种含有上述RNA干扰片段的载体，以pC35SGN为骨架载体，包含OsAGP13基因的RNA干扰片段的反向插入片段和正向插入片段；所述的骨架载体pC35SGN是将双元载体pBI121m（pBI121m由pBI121改造而来，具体过程参见Hua等，2004.A tobaccocalcium/calmodulin-binding protein kinase functions as a negative regulator of flowering.J.Biol.Chem.279:31483–31494）用内切酶Hind III和EcoR I进行双酶切，回收包含CaMV35Spro::MCS::Nos ter片段（pro指启动子，MCS指多克隆位点，ter指终止子），然后连接到双元载体pCAMBIA1300（CAMBIA）上，得到载体pC35SN；之后通过扩增pCAMBIA1301（CAMBIA）载体上的一段约200bp的GUS报告基因内含子区，然后将其插入至pC35SN载体BglII和SalI酶切位点之间得到。

OsAGP13基因、上述RNA干扰片段或载体在研究影响水稻开花的分子生物学机制中的应用。

OsAGP13基因、上述RNA干扰片段或载体在控制水稻开花中的应用。

本发明具有如下优点及效果：

本发明的利用基因工程技术构建了OsAGP13-RNAi载体并通过转基因技术获得了抽穗开花期提前的OsAGP13-RNAi转基因植株，本发明的实施程序简单成熟，可操作性强，所获得的OsAGP13-RNAi转基因材料遗传稳定，抽穗开花期提前的特点可以直接应用于缩短遗传育种和功能研究过程中的操作时间。与野生型品种“日本晴”（85.6±5.4天）相比，OsAGP13-RNAi转基因植株抽穗开花期大大提前（统计四个株系结果分别为45.2±3.1天，27.1±2.0天，28.4±1.4天和28.1±1.5天）。

本发明还证实OsFTL1基因的表达则受到OsAGP13基因的抑制；OsAGP13-RNAi植株中由于OsAGP13基因表达的抑制导致OsFTL1基因的高量表达从而促进水稻提前开花，说明OsAGP13基因能够控制水稻开花，这是对目前水稻开花通路研究的一个新发现。

附图说明

图1是pC35SGN载体T-DNA区域结构示意图。

图2是OsAGP13-RNAi载体构建的电泳图；A：pC35SGN质粒载体经BamHI和XbalI双酶切和纯化后电泳图，M为DL2000（片段从大到小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp），1为经BamHI和XbalI双酶切后的pC35SGN载体（10267bp）；B：OsAGP13-RNAi片段经BamHI和XbalI双酶切后的RNAi片段，M为DL2000，1为OsAGP13-RNAi片段（376bp）；C：反向片段插入的OsAGP13-RNAi载体的PCR鉴定电泳图，所用引物为OsAGP13-RNAi RP和35S FP，M为DL2000，1-4为PCR产物（466bp）；D：OsAGP13-RNAi片段和反向片段插入的OsAGP13-RNAi载体经SalI和SacI双酶切和纯化后电泳图，M为DL2000，1为OsAGP13-RNAi片段（386bp），2为反向片段插入的OsAGP13-RNAi载体（10655bp）；E：正反向插入的OsAGP13-RNAi载体的PCR鉴定电泳图，M为DL2000，1-4为PCR产物（455bp）。

图3是水稻T1代OsAGP13-RNAi植株基因组水平的鉴定电泳图，M为DL2000，Nip，野生型品种“日本晴”的简写；Ri，OsAGP13-RNAi的简写。

图4是水稻OsAGP13-RNAi植株RNA水平的鉴定结果图，A：实时荧光定量PCR检测野生型（日本晴）和T1代OsAGP13-RNAi植株中OsAGP13的表达水平（取高度为10cm的新生分蘖抽提RNA）；B：半定量RT-PCR检测T2代OsAGP13-RNAi植株中OsAGP13的表达水平（取高度为10cm的新生分蘖抽提RNA）。

图5是水稻野生型和T3代OsAGP13-RNAi植株表型特征图，A：水稻45天日本晴野生型（Nip）、表型中等的T3代OsAGP13-RNAi株系（Ri-27-2）和表型强烈的T3代OsAGP13-RNAi株系（Ri-21-3）；B：从左至右分别为水稻124天和75天日本晴野生型（Nip），75天Ri-21-3植株；图中标尺=10cm。

图6是定量RT-PCR检测水稻野生型和OsAGP13-RNAi植株生长发育中开花决定相关基因的表达结果图；长日照：14小时光照，10小时黑暗；短日照，10小时光照，14小时黑暗。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1RNA提取和逆转录

RNA提取过程中需要的研钵、研棒和不锈钢药匙等用具于180℃烤箱中烘烤18h后方可使用。用液氮对研棒和研钵进行速冻，将幼嫩水稻花穗（<3cm）放置于研钵中，用研棒将材料研磨成粉末状（需反复加液氮2-3次）；用液氮对不锈钢药匙进行速冻，将50-100mg粉末状材料转移至装有1mL RNA-solv提取液（OMEGA）的1.5mL RNase-free的EP管中，颠倒混匀，室温静置5min；加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，冰上静置10min；12000g4℃离心10min，将80%上清转移至新的1.5mL RNase-free的EP管中；加入500μL异丙醇，颠倒混匀后室温放置10min；12000g4℃离心10min；弃上清，加入1mL75%乙醇洗涤沉淀，7500g4℃离心10min；弃上清，并用枪头将残液吸干，放置于无菌操作台中风干后加20μL DEPC处理水溶解RNA沉淀。

总RNA1μg经无RNase的DNaseI（Fermentas）消化去除污染的基因组DNA后，使用ReverTraAce-α-TM试剂盒（TOYOBO）进行体外反转录，从而获得单链cDNA。

DNaseI消化体系：RNA xμL，DEPC处理水8-xμL，10×buffer with MgCl₂1μL，DNaseI（RNase-free）1μL；37℃消化30min后，加入1μL EDTA（25mM），65℃孵育10min以终止消化反应。

反转录体系：DEPC处理水0.75μL，5×RT buffer4μL，dNTPs2μL，RNase inhibitor（40U/μL）0.25μL，Oligo dT1μL，ReverTra Ace1μL；42℃孵育45min，99℃5min终止反应，反转录产物零下20℃保存备用。

实施例2OsAGP13-RNAi载体的构建

实施例2中所用到的引物序列如表1所示，引物均有南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1引物列表

（1）OsAGP13-RNAi片段（OsAGP13基因的RNA干扰片段）的获得：

以<3cm水稻花穗cDNA为模板，使用南京金斯瑞生物科技有限公司合成的引物OsAGP13-RNAi FP和OsAGP13-RNAi RP进行PCR反应。

PCR反应体系：dd H₂O34μL，10×Taq buffer5μL，MgCl₂（25mM）4μL，dNTPs（10mM）1μL，OsAGP13-RNAi FP（10μM）2μL，OsAGP13-RNAi RP（10μM）2μL，cDNA1μL，Taq DNA polymerase（1U/μL）1μL；总体积50μL，PCR反应体系中的各组分来自Fermentas。

PCR反应程序：94℃2min；94℃20sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃5min；4℃保存。反应结束后用PCR产物回收试剂盒（Tiangen）纯化OsAGP13-RNAi片段。

（2）OsAGP13-RNAi反向片段的插入：本发明中所使用的pC35SGN载体是将双元载体pBI121m（pBI121m由pBI121改造而来，具体过程参见Hua等，2004.A tobaccocalcium/calmodulin-binding protein kinase functions as a negative regulator of flowering.J.Biol.Chem.279:31483–31494）用内切酶Hind III和EcoR I进行双酶切，回收包含CaMV35Spro::MCS::Nos ter片段（pro指启动子，MCS指多克隆位点，ter指终止子），然后连接到双元载体pCAMBIA1300（CAMBIA）上，得到载体pC35SN；之后通过扩增pCAMBIA1301（CAMBIA）载体上的一段约200bp的GUS报告基因内含子区，然后将其插入至pC35SN载体BglII和SalI酶切位点之间从而得到pC35SGN载体，pC35SGN载体T-DNA区域结构示意图如图1所示。OsAGP13-RNAi片段和pC35SGN载体分别经BamHI（Fermentas）和XbalI（Fermentas）于37℃酶切1h，然后分别使用PCR产物回收试剂盒（Tiangen）进行纯化得到双酶切后的OsAGP13-RNAi片段和pC35SGN载体（图2A和B）；使用T4DNA连接酶（Fermentas）将双酶切后的OsAGP13-RNAi片段和pC35SGN载体于22℃连接1h后，转化大肠杆菌DH5α，并涂布到含有卡拉霉素（50mg/L）的LB固体培养基上，于37℃倒置培养16h；用灭菌枪头挑取5个阳性单克隆菌落至LB液体培养基中，250rpm37℃剧烈震荡培养12h；通过菌液PCR和质粒酶切鉴定获得阳性克隆，即得到反向片段插入的OsAGP13-RNAi载体（图2C，用引物OsAGP13-RNAi RP和35S FP进行PCR鉴定）。

（3）OsAGP13-RNAi正向片段的插入：之后在反向片段插入的OsAGP13-RNAi载体的基础上进行OsAGP13-RNAi正向片段的插入，操作步骤与反向片段插入相同，双酶切时使用的内切酶是SalI（Fermentas）和SacI（Fermentas），最后得到正反向插入的OsAGP13-RNAi载体（图2D和E，正向插入用引物OsAGP13-RNAi RP和NosT RP进行PCR鉴定）。

实施例3农杆菌介导的水稻愈伤组织遗传转化

（1）水稻种子诱导愈伤与继代：将水稻蜡熟期的“日本晴”种子剥去颖壳，放置于37℃恒温箱烘干12h；放入超净台上中进行无菌操作，用无菌水清洗4遍后，将水沥干；使用70%（v/v）的酒精以100rpm的速度振荡洗涤1min之后，迅速倒掉酒精；用无菌水清洗4遍之后，将水沥干；加入浓度为0.1%（m/v）的升汞（种子浸沫在升汞中即可），置于摇床上以90rpm的速度振荡清洗20min，漂洗完之后使用无菌水清洗4-5次；倒掉无菌水，将水稻种子均匀铺放在无菌滤纸上以除去其表面残留的水分，吹干30分钟之后，将干燥的种子接种到诱导培养基中，于30℃暗培养箱中培养40天左右；40天之后，将种子盾片上长出的淡黄色颗粒状愈伤组织剥离，放入继代培养基中培养，30℃暗培养2周。诱导和继代培养基：N₆基本培养基+脯氨酸（proline）250mg/L＋蔗糖（sucrose）30g/L+水解酪蛋白（caseinhydrolysate）400mg/L+2，4-D2.0mg/L+植物琼脂（Agar）8.0g/L（pH5.8）。

（2）农杆菌的培养：将构建好的OsAGP13-RNAi载体转化至农杆菌EHA105感受态细胞（中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心），在含有50mg/L硫酸链霉素（str），50mg/L卡那霉素（kana）和50mg/L利福平（rif）三种抗生素的LB固体平板上，28℃培养40-48小时；挑取单菌落接种至5mL LB三抗液体培养基中，在摇床上以200rpm速度震荡，28℃培养30-36h；取0.5-1mL菌液以1：100（v/v）的比例接种到LB三抗液体培养基中进行扩大培养，28℃震荡培养12小时左右，控制OD值范围在0.2-0.5。

（3）侵染与共培养：将扩大培养的农杆菌菌液倒入50mL离心管中，4000rpm低温（4℃）离心20min；弃去上清，加入5mL的悬浮培养基，吹打混匀之后，再用悬浮培养基加满离心管，轻微混匀之后，放置冰上20min；将继代两周的愈伤组织置于育苗盒中，倒入悬浮后的农杆菌菌液，常温置于摇床上，100rpm震荡15min；去除菌液，将愈伤组织均匀铺放于装有滤纸的大平皿中，充分摆开，晾干0.5-1.5小时；铺一层无菌滤纸在共培养培养基上，并在滤纸上滴加1mL悬浮培养基；待愈伤组织晾干之后，将愈伤组织夹入共培养培养基上，28℃暗培养3天。共培养培养基：N6基本培养基+蔗糖（sucrose）30g/L+水解酪蛋白（caseinhydrolysate）400mg/L+脯氨酸（proline）250mg/L+葡萄糖（glucose）10g/L+AS（乙酰丁香酮）100μmol/L+植物凝胶（Phytagel）4.0g/L（pH5.2）。悬浮培养基：AAM培养基+蔗糖（sucrose）30g/L+水解酪蛋白（caseinhydrolysate）400mg/L+AS（乙酰丁香酮）100μmol/L（pH5.2）。

（4）洗愈伤与筛选：将暗培养3天染有大量农杆菌的愈伤组织，置于育苗盒中，用无菌水洗涤数次，直至洗涤愈伤的水清澈透亮；在无菌水中加入500mg/L的羧苄青霉素，浸泡愈伤组织，在摇床上以100rpm的速度震荡洗涤15min；沥尽无菌水，将愈伤组织均匀铺放于含有无菌滤纸的大平皿中，晾干之后接于一筛培养基中，28℃暗培养两周；筛选两周的愈伤组织再转入二筛选培养基中，继续培养15-30天，直至观察到在褐化愈伤组织边缘重新生长出亮黄色的抗性愈伤组织。一筛培养基：N₆基本培养基+脯氨酸（proline）250mg/L＋蔗糖（sucrose）30g/L+水解酪蛋白（caseinhydrolysate）400mg/L+2，4-D2.0mg/L+潮霉素（Hyg）50mg/L+头孢霉素（Cef）250mg/L+植物琼脂（Agar）8.0g/L（pH5.8）。二筛培养基：N₆基本培养基+脯氨酸（proline）250mg/L＋蔗糖（sucrose）30g/L+水解酪蛋白（caseinhydrolysate）400mg/L+2，4-D2.0mg/L+潮霉素（Hyg）50mg/L+头孢霉素（Cef）250mg/L+植物凝胶（Phytagel）2.8g/L（pH5.8）。

（5）分化与生根：将经过筛选之后长出的淡黄色，质地紧密的抗性愈伤组织转移至分化培养基中，在16小时光照，8小时黑暗条件下培养40-60天；待分化培养基中长出的小苗达到9cm以上时，将小苗接入含有抗生素潮霉素的生根培养基中，16小时光照，8小时黑暗条件下培养2周。分化培养基:MS基本培养基+水解酪蛋白（caseinhydrolysate）0.8g/L+蔗糖（sucrose）30g/L+NAA（萘乙酸）0.2mg/L+IAA（吲哚-3-乙酸）0.2mg/L+KT（激动素）2mg/L+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)2mg/L+植物凝胶（Phytagel）2.8g/L（pH5.8）。生根培养基：1/2MS基本培养基+水解酪蛋白（caseinhydrolysate）0.8g/L+蔗糖（sucrose）30g/L+潮霉素（Hyg）50mg/L+植物凝胶（Phytagel）2.5g/L（pH5.8）。

（6）炼苗与移栽：两周之后，如果在生根培养基中生长的小苗长出粗壮的的根时，则认定该小苗为抗性转基因植株。反之，生根中的小苗并未长出根，并且生长状态较差，表明为假阳性。选择根系发达的转基因再生幼苗，用清水洗去幼苗根部残留的培养基，加入少量自来水，于16h/d光照条件下炼苗一周；一周之后，将小苗移栽至水稻温室的土壤中。种植时间下午最佳，若遇到气温很高的晴天，则需遮荫以便幼苗成活。成活的水稻即为T0代OsAGP13-RNAi转基因植株，待T0转基因水稻开花成熟后，收取种子即获得T1代OsAGP13-RNAi转基因水稻。

实施例4OsAGP13-RNAi转基因植株基因组水平鉴定

将T1代OsAGP13-RNAi转基因水稻种子浸种萌发后种植于武汉大学温室中，待T1转基因水稻开花成熟后，收取种子即获得T2代OsAGP13-RNAi转基因水稻（以次类推获得T3代OsAGP13-RNAi转基因水稻）。

取约100mg T1代OsAGP13-RNAi转基因水稻叶片于1.5mL EP管中，加入液氮并用玻璃研棒碾磨成粉末；加入700μL65℃预热的CTAB抽提液（2%CTAB，1.42M NaCl，20mMNa₂EDTA，10mM Tris-HCl，2%PVP-40，0.2%β-巯基乙醇，pH8.0），充分混匀后于65℃水浴锅中水浴30min，每隔10min上下颠倒混匀一次；加入570μL氯仿：异戊醇（24：1，v/v），剧烈颠倒混匀15s，10000rpm离心10min；取上清至新的1.5mL EP管中并加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀后室温静置30min；12000rpm离心10min，弃上清，加入1mL70%（v/v）乙醇洗涤沉淀；7500rpm离心5min，弃上清并用枪头吸干残余液体，37℃干燥箱中干燥10min；加入20μL含有RNaseA的TE缓冲液溶解基因组，零下20℃保存备用。

将55个T1代OsAGP13-RNAi株系进行种植，每个株系取3-10株观察表型，结果发现有10个株系出现早抽穗和矮化表型，其中1个有表型的株系因生长状况不佳而死亡。选取9个有表型株系和9个无表型株系抽提基因组，使用OsAGP13-RNAi FP和NosT RP对18个T1代转基因株系共120个单株进行基因组水平鉴定，结果显示Ri-4，Ri-5，Ri-8和Ri-33为野生型，转基因标签在T1代出现了丢失；Ri-12，Ri-14，Ri-18，Ri-20，Ri-21，Ri-24，Ri-26，Ri-27，Ri-31，Ri-35，Ri-42，Ri-43，Ri-52和Ri-54株系中大部分植株鉴定为基因组阳性（本发明中OsAGP13-RNAi简称为Ri）（图3）。

PCR反应体系：dd H₂O12μL，10×Taq buffer2μL，MgCl₂（25mM）2μL，dNTPs（10mM）0.5μL，OsAGP13-RNAi FP（10μM）1μL，NosT RP（10μM）1μL，基因组DNA1μL，TaqDNA polymerase（1U/μL）0.5μL；总体积20μL，PCR反应体系中的各组分来自Fermentas。

PCR反应程序：94℃2min；94℃20sec，55℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃5min；4℃保存。反应结束后电泳检测。

实施例5OsAGP13-RNAi转基因植株RNA水平鉴定及表型观察

取T1代和T2代OsAGP13-RNAi转基因植株长度约为10cm的新生分蘖抽提RNA并反转录获得cDNA（具体方法参照实施例1），利用定量RT-PCR对T1代OsAGP13-RNAi转基因植株进行了RNA水平鉴定。

按照TransStart Eco Green SuperMix（Transgen）试剂盒的操作程序配制反应体系，在Rotor-Gene定量PCR仪（Qiagen）中进行PCR反应。

PCR反应体系：ddH₂O7μL，2×SuperMix10μL，Forward Primer（10μM）1μL，ReversePrimer（10μM）1μL，cDNA1μL；反应程序：95℃1min；95℃10sec，55℃15sec，72℃20min，40个循环；72℃-95℃绘制熔解曲线；室温。

以不同稀释倍数的cDNA为模板制备定量PCR标准曲线，cDNA模板从高到低的稀释倍数为3，9，27，81，243。样本的均一化选用内参基因UBQ5，采用双标准曲线法对样品中转录本的丰度进行相对定量。每个组织或处理样本进行3-4次生物学重复，每次生物学重复进行2-3次技术性重复。

T1代OsAGP13-RNAi转基因株系RNA水平鉴定结果显示，在野生型、Ri-18和Ri-20株系中，OsAGP13的相对表达水平较高，均处于0.7-0.9之间；在Ri-12，Ri-14，Ri-21，Ri-24，Ri-26，Ri-42，Ri-43和Ri-54株系中，OsAGP13的相对表达水平极低，均处于0-0.1之间；在Ri-27株系中相对表达水平较低，处于0.15-0.25之间（图4A）。

利用半定量RT-PCR对T2代的3个OsAGP13-RNAi株系（Ri-14-5，Ri-21-3和Ri-42-2）进行鉴定。样本的均一化选用内参基因RAc1。

PCR反应体系：dd H₂O12μL，10×Taq buffer2μL，MgCl₂（25mM）2μL，dNTPs（10mM）0.5μL，OsAGP13FP或RAc1FP（10μM）1μL，OsAGP13RP或RAc1RP（10μM）1μL，cDNA1μL，Taq DNA polymerase（1U/μL）0.5μL；总体积20μL，PCR反应体系中的各组分来自Fermentas。程序：94℃2min；94℃20sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃5min；4℃保存。反应结束后电泳检测。

鉴定结果显示，在Ri-14-5，Ri-21-3和Ri-42-2株系中，与野生型相比OsAGP13的表达量明显降低（图4B）。

对水稻野生型品种“日本晴”和T3代OsAGP13-RNAi植株进行表型观察和抽穗时间的数据统计结果显示，野生型植株在85.6±5.4天开始抽穗，而Ri-27-2，Ri-14-5，Ri-21-3和Ri-42-2分别于45.2±3.1天，27.1±2.0天，28.4±1.4天和28.1±1.5天开始抽穗；45天的野生型植株处于分蘖期，而T3代Ri-27-2和Ri-21-3植株则分别处于抽穗期和开花期（图5A）；萌发后75天的野生型植株处于孕穗期，124天的野生型植株处于成熟期，此时野生型T3代Ri-21-3植株相对孕穗期和成熟期的野生型植株明显矮化（图5B）。

实施例6OsAGP13-RNAi植株提前开花的分子生物学机制

将野生型和OsAGP13-RNAi植株分别置于长日照（LD：14小时日照，10小时黑暗）和短日照（SD：10小时日照，14小时黑暗）条件下种植，并选取1-14周大小的野生型和OsAGP13-RNAi植株叶片，抽提RNA，研究相关基因的表达情况。定量RT-PCR结果显示，OsAGP13主要在1-2周的幼苗叶片中表达，LD和SD下Ri-21-3植株中OsAGP13的表达量均低于野生型；SD下OsAGP13在1-2周野生型植株中的表达量低于LD下的野生型植株（图6A）。LD下RFT1在8-12周的野生型植株中出现表达高峰，而SD下则在6-10周出现表达高峰，表明SD使野生型植株中RFT1的表达提前；LD下RFT1在10-12周的野生型植株中的表达量高于SD下野生型植株；LD下8-12周和SD下6-10周Ri-21-3植株中RFT1的表达量低于野生型（图6B）。LD下Hd3a在8-10周野生型植株中出现表达高峰，而SD下在6-8周野生型植株中出现表达高峰，表明SD使野生型植株中Hd3a的表达提前；LD下8-10周和SD下6-8周Ri-21-3植株中Hd3a的表达量低于野生型（图6C）。LD和SD下，RNAi植株中OsFTL1的表达量始终远高于野生型，4周时表达量达到最高值（图6D）。此外，LD和SD下，Ri-21-3植株中OsMADS14的表达量高于野生型，1-2周时OsMADS14的表达开始启动，4周后一直维持在较高水平（图6E）。

水稻开花过程必然有成花素的参与，通过分析发现与水稻RFT1和Hd3a同源性最高的OsFTL1可能是OsAGP13-RNAi植株中起作用的成花素基因。OsFTL1在1周Ri-21-3幼苗中已有高量表达，并且一直维持在高水平。前人研究报道，过量表达OsFTL1可以促使愈伤组织分化花器官并形成幼苗；OsFTL1通过驱动OsMADS14的表达从而诱导花原基的形成。在水稻花原基发生前后的OsAGP13-RNAi植株中，OsMADS14随着幼苗的生长而逐渐积累。以上结果表明，野生型植株中由成花素基因RFT1和Hd3a控制水稻开花，OsFTL1基因的表达则受到OsAGP13基因的抑制；OsAGP13-RNAi植株中由于OsAGP13基因表达的抑制导致OsFTL1基因的高量表达从而促进水稻提前开花，这是对目前水稻开花通路研究的一个新发现。

实施例5和6中半定量及定量RT-PCR实验中所用到的引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列如表2所示。

表2半定量及定量RT-PCR引物

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉大学

 

<120>  控制水稻开花的OsAGP13基因及其RNA干扰片段的应用

 

<130>  1

 

<160>  19

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  370

<212>  DNA

<213>  Oryza sativa

 

<400>  1

gcaacgacgt gagcaacgac gacgacgcag atggcagcgg ccggtgcgcc ccaccacatt       60

ttgcgctgta ttttgctcgt cgattctttt acgggacggg agggaggagg aggagggacc      120

ttagctttgg ctttggcttt ggctttacca ctctcccaac cacatttgat gattgagcga      180

tcgccatgcc tcggattctt ttgtttcttt cttcttcttc ttcttctctc tgctacgccc      240

acgatatgac tctgctagct gctgcctgcc cgcccttgta ctgtaccact gagatcatct      300

acttttaatt tattttatgt tgctgtcatc atcatcattg attcattgta ttattccatc      360

tttgcccgga                                                             370

 

<210>  2

<211>  34

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  OsAGP13-RNAi FP

 

<400>  2

gcagtcgacg gatccgcaac gacgtgagca acga                                   34

 

<210>  3

<211>  32

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  OsAGP13-RNAi RP

 

<400>  3

gacgagctct agatccgggc aaagatggaa ta                                     32

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  35S FP

 

<400>  4

cgcacaatcc cactatcctt cg                                                22

 

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  NosT RP

 

<400>  5

gcaagaccgg caacaggatt ca                                                22

 

<210>  6

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  UBQ5 FP

 

<400>  6

accacttcga ccgccactac t                                                 21

 

<210>  7

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  UBQ5 RP

 

<400>  7

acgcctaagc ctgctggtt                                                    19

 

<210>  8

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  RAc1 FP

 

<400>  8

gactacatac aactccatca tg                                                22

 

<210>  9

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  RAc1 RP

 

<400>  9

atcatttcct gtgcacaatg g                                                 21

 

<210>  10

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  OsAGP13 FP

 

<400>  10

tcgtcgccct cctcgcctaa                                                   20

 

<210>  11

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  OsAGP13 RP

 

<400>  11

ctccctcccg tcccgtaaaa                                                   20

 

<210>  12

<211>  23

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  Hd3a FP

 

<400>  12

gctcactatc atcatccagc atg                                               23

 

<210>  13

<211>  26

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  Hd3a RP

 

<400>  13

ccttgctcag ctatttaatt gcataa                                            26

 

<210>  14

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  RFT1 FP

 

<400>  14

cgtccatggt gacccaaca                                                    19

 

<210>  15

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  RFT1 RP

 

<400>  15

ccgggtctac catcacgagt                                                   20

 

<210>  16

<211>  18

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  OsFTL1 FP

 

<400>  16

gctggtgttc ctgctgtt                                                     18

 

<210>  17

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  OsFTL1 RP

 

<400>  17

ccctctggca gttgaagta                                                    19

 

<210>  18

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  OsMADS14 FP

 

<400>  18

gccaactaat gctcgagtcc                                                   20

 

<210>  19

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  OsMADS14 RP

 

<400>  19

cagctgctgc agggtagtta                                                   20

Claims (5)

1.一种OsAGP13基因的RNA干扰片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种含有权利要求1所述的OsAGP13基因的RNA干扰片段的载体。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：以pC35SGN为骨架载体，包含权利要求1所述的OsAGP13基因的RNA干扰片段的反向插入片段和正向插入片段。

4.权利要求1所述的RNA干扰片段或权利要求2-3任一项所述的载体在研究影响水稻开花的分子生物学机制中的应用。

5.权利要求1所述的RNA干扰片段或权利要求2-3任一项所述的载体在控制水稻开花中的应用。