CN102776201B

CN102776201B - OsELF3基因在控制水稻抽穗期中的应用

Info

Publication number: CN102776201B
Application number: CN201110118001.2A
Authority: CN
Inventors: 吴昌银; 杨莹
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2011-05-09
Filing date: 2011-05-09
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2031-05-09
Also published as: CN102776201A

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及一种控制水稻抽穗期的基因OsELF3的分离克隆及应用。通过基因功能互补实验证明，OsELF3基因具有控制水稻抽穗期的功能，利用基因工程技术提高或减弱OsELF3基因的表达量能够调控植物抽穗期，从而改良品种的抽穗期，达到适应不同区域和季节的目的。本发明克隆的基因及其编码蛋白可广泛应用于调控植物的开花特性、改良植物品种的生育期，具有重要的应用价值。

Description

OsELF3基因在控制水稻抽穗期中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种控制水稻抽穗期的基因OsELF3的克隆、功能验证，同时涉及该基因在转基因水稻中的应用。本发明采用反向遗传学的方法，在水稻突变体库中，寻找与开花调控相关的候选基因的突变体，经插入突变体表型鉴定，克隆到控制水稻抽穗期基因OsELF3。利用基因功能互补实验，证实OsELF3基因具有在长日条件下促进水稻抽穗的功能。利用基因工程的手段超量表达OsELF3，使水稻出现早抽穗的表型，从而证实调控基因OsELF3的表达量，能够改变水稻的抽穗期。本发明涉及利用该基因或其功能类似物调控植株的抽穗期从而提高农作物地区适应性、杂交亲本的花期调节和提高作物产量。

背景技术

水稻是三大主要粮食作物之一，全世界有近二分之一的人口以其为主食，对其生长发育相关功能基因的研究具有重要的理论和应用意义。在水稻从营养生长向生殖生长转换过程中涉及了一系列的关键基因。同时，由于水稻具有基因组小、精细的遗传和物理图谱、相对容易的转基因技术及与其它禾本科作物的共线性，而被作为禾本科作物的模式植物。随着包括水稻在内的多种生物基因组测序的完成，人类开始进入后基因组时代。全面开展功能基因组研究已成为生命科学的前沿领域。因此水稻功能基因的研究对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。

水稻是我国主要的粮食作物，在水稻的众多农艺性状中，抽穗期是重要的农艺性状之一，它决定着水稻品种地区与季节的适应性。水稻的抽穗期受许多因素的影响，分为外在因素和内在因素。外在因素包括光周期(日照长度)、光质(光的光谱组成)、光照强度(光子流密度)、温度(低温，如：拟南芥和冬小麦的春化作用)、群体密度和营养等，而内在因素是指激素(赤霉素等)和控制植物发育阶段的各种基因调控机制。近几年来拟南芥开花时间的调控研究有了很大的进展，并获得了多种晚开花和早开花的突变体，与这些突变性状相关的基因得到克隆和鉴定，人们认为控制拟南芥开花时间主要是通过4个途径：即光周期途径(photoperiod pathway)、春化途径(vernalization pathway)、自主途径(autonomous pathway)和赤霉素途径(GApathway)。在这四个途径中，研究得最深入的是光周期途径。同时，在开花信号中，最重要的一个决定因素是植物对于光周期的反应。光周期指一日之内昼夜长度的相对变化，也即日长根据植物对光周期的反应不同，可以将植物分为以下3类：光照长于一定时数才能促进开花的长日植物(LDP：long-dayplant)、光照短于一定时数才能促进开花的短日植物(SDP：short-day plant)以及对光照长短不敏感的日中性植物(DNP：day-neutral plant)。水稻和拟南芥分别是短日照植物和长日照植物的模式植物，对它们开花分子机制的研究，学者们一直给予高度关注，如果可以克隆到更多开花途径中的基因，了解更详细的信号传导途径和机制，将会更加完整地阐释植物开花的分子机制，同时对指导育种实践、品种改良以及品种推广均具有重大意义，比如在水稻杂交制种过程中解决父母本花期不遇问题等。此外，越来越频繁的自然灾害使得选育合适生育期以及抽穗期，受环境影响较小的品种在避害利用中显得十分重要。

通过遗传突变体来研究一些与植物生长、发育和其他性状相关的基因已成为一种重要的基因功能研究手段。通过传统的化学诱变、辐射诱变以及新近采用的转座子和T-DNA标签法均已分离到一批与植物发育调节相关的重要基因。随着水稻突变体资源及相关的功能基因组建设平台的完善，水稻抽穗期基因的分离克隆日益增多，许多分离克隆的基因被证实可以用于水稻抽穗期的调节。如Lee等在水稻T-DNA插入系中分离到了一个推迟开花的突变体，研究表明T-DNA整合入水稻OsMADS50基因的K-box区域，OsMADS50基因与拟南芥MADS-box基因SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1/AGAMOUS-LIKE20(SOC1/AGL20)的氨基酸一致性达到了50.6％。OsMADS50基因的超量表达导致水稻在愈伤阶段就极早开花，而OsMADS50基因的干涉突变体则表现出晚开花的表型，同时伴有伸长节间数目增加。OsMADS50控制着水稻中众多的成花调控因子，是水稻开花重要的促进因子(Lee等，Functional analyses of the floweringtime gene OsMADS50，the putative SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1/AGAMOUS-LIKE 20(SOC1/AGL20)ortholog in rice，Plant Journal，2004，38：754-764)。再如Yang-Seok Lee等在2010年利用T-DNA插入标签法分离到水稻中的一个组成型开花抑制因子OsCOL4(Lee等，OsCOL4 is a constitutive floweringrepressor upstream of Ehd1 and downstream of OsphyB，Plant Journal，2010，63：18-30)。这两个基因都是利用了插入突变体库对功能基因组的研究提供的研究材料和信息平台。近些年来，Shoko Kojima等(2002)和ReinaKomiya等(2009)分别发现了水稻中的短日和长日条件下的成花素：Hd3a和RFT1，这两个基因都是FT-like基因并与拟南芥的成花素FT同源(Kojima等，Hd3a，a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene，promotes transition to flowering downstream of Hd1 under short-day conditions，Plant and Cell Physiology，2002，43：1096-1105；Komiya等，A gene network for long-day flowering activates RFT1 encoding a mobile floweringsignal in rice，Development，2009，136：3443-3450)。这些基因都是基于拟南芥中同源基因克隆到的水稻开花基因。作为双子叶植物拟南芥，目前已克隆到大批的控制开花时间的基因，并对拟南芥开花机理的调控模式有了较为深刻的认识，可以作为其他植物的开花时间研究的参照。但是对作为重要的禾本科作物水稻来说，由于它是短日照植物，它的开花调控应该与拟南芥存在较大的差异，现阶段的研究尚不深入。由于世界上许多国家都相继创建了各种标签插入突变体库，及相应的插入标签侧翼序列数据库平台。利用水稻功能基因研究平台克隆基因是一种快捷、有效的基因功能研究方法，因此更多的水稻抽穗基因有望通过此方法被分离克隆。

拟南芥的抽穗期基因AtELF3已经有较为深入的研究，研究证明AtELF3在光信号向生物节律钟传递和调节生物节律中起重要作用。AtELF3基因突变后，其突变体在长短日照条件下都表现为早抽穗表型。AtELF3编码一个起转录调控作用的核蛋白，它的mRNA和蛋白都表现出昼夜节律性，在体外AtELF3可以与PHYB相互作用，它作为连接蛋白可使E3泛素连接酶COP1与GI结合，最后促进GI降解，AtELF3在光信号向生物节律钟的输入中起阀门作用(Liu等，ELF3 encodes a circadian clock-regulated nuclear protein thatfunctions in an Arabidopsis PHYB signal transduction pathway，Plant Cell，2001，13：1293-1304；Yu等，COP 1 and ELF3 control circadian function and photoperiodic flowering by regulating GI stability，MolecularCell，2008，32：617-630)。对拟南芥中的抽穗期基因AtELF3在功能和作用机制上已有深入的研究，我们可基于拟南芥中同源性克隆水稻中与基因AtELF3对应同源的基因，从而深入研究水稻的开花调控基因。

本发明是利用水稻插入突变体库，采用反向遗传学的方法，依据生物信息学分析，在本室插入突变体库中，筛选到与拟南芥抽穗期基因AtELF3同源的水稻基因OsELF3有插入突变的家系，经过田间种植和生物技术克隆到控制水稻抽穗期性状的基因OsELF3。该基因的克隆，为人们在分子水平上了解水稻的光周期开花决定机制提供了基因资源。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，采用反向遗传学的方法，在水稻突变体库中，寻找与开花调控相关的候选基因的突变体，经插入突变体表型鉴定，克隆到控制水稻抽穗期基因OsELF3。利用基因功能互补实验，证实OsELF3基因具有在长日条件下促进水稻抽穗的功能。利用基因工程的手段超量表达OsELF3，使水稻出现早抽穗的表型，从而证实调控基因OsELF3的表达量，能够改变水稻的抽穗期。本发明涉及利用该基因或其功能类似物调控植株的抽穗期从而提高农作物地区适应性、杂交亲本的花期调节和提高作物产量。

本发明的技术方案是：

本发明克隆了一种控制水稻抽穗期的基因OsELF3，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，它编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

本发明的还提供了一种利用OsELF3基因调控水稻抽穗期的方法。该方法包括利用含有和SEQ IDNO：1或2所示的基因或该基因的部分类似功能片段构建植物表达载体，该载体可以表达由上述核苷酸序列编码的多肽或同源类似物。利用上述表达载体转化宿主细胞。所述的宿主细胞包括大肠杆菌、农杆菌和植物细胞。本发明克隆的OsELF3基因可用于与其它调控元件，如组成型启动子(如ubiquintin启动子)融合构建基因表达载体，通过转基因技术、反义RNA或RNAi等技术，通过控制OsELF3基因在水稻中的表达量来调节水稻抽穗，从而控制水稻的抽穗期，达到水稻品种适应不同地域和不同季节的目的。

本发明克隆的水稻OsELF3基因，在Tos17插入失活的突变体中表现为在长日照条件下晚抽穗，在短日照条件下抽穗期没有变化(见实施例1)，正常功能的OsELF3基因转化该突变体后植株恢复正常的表型(见实施例3)。

本发明克隆的基因的应用对阐明了OsELF3基因的生物学功能具有重要意义，对以水稻为代表的短日照植物光周期途径控制开花的分子机理研究将起到很大的推动作用。

本发明的具体技术方案如下：

1、利用水稻插入突变体库和标签侧翼序列数据库获得OsELF3基因的突变体

利用农杆菌介导方法并通过组织培养创建的水稻T-DNA插入突变体库(突变体库的创建方法已经公开发表论文，见Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome，PlantJournal，2003，35：418-427；Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of thegenome hierarchy as revealed by analyzing 13,804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutantlibrary，Plant Journal，2007，49：947-959)。Tos17为水稻基因组内源性反转录转座子，它的转座活性在水稻愈伤组织培养过程中发生，在再生植株中没有活性。由于在构建水稻T-DNA插入突变体过程中涉及组织培养过程，因此在突变体库中很多突变表型为Tos17插入所致。华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室在从T-DNA插入突变体库中分离T-DNA的侧翼序列同时也分离Tos17的侧翼序列，从而创建了标签侧翼序列数据库(http://rmd.ncpgr.cn/)。本发明利用华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室构建的水稻T-DNA插入突变体库及标签侧翼序列数据库，针对水稻OsELF3基因筛选鉴定其对应的遗传突变体材料，从而鉴定OsELF3基因的功能。

2.oself3突变体等开花相关基因突变体的表型鉴定

根据侧翼序列数据分析，结合生物信息学的功能预测，从T₀代突变体库中选出377份种子(T₁代)，其中每份种子对应的是有预测基因被插入失活，其中的失活基因被预测参与水稻的开花调控。在武汉的夏天即长日条件下，将这些种子于正常大田条件下种植，每份种植30株(称为1个家系)。观察突变体抽穗期，共观察到约23个家系有明显的抽穗期变化。其中一个突变家系(其在水稻T-DNA插入突变体库中的原始编号为：04Z11ED48)因为插入失活的基因与拟南芥基因AtELF3同源，所以将该突变体称为oself3(本发明所述的突变体在突变体数据库http://rmd.ncpgr.cn/中的编号为04Z11ED48，该突变体可向华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室索取，索取流程请参照上述网站提供的说明，该突变体为一种公开对外发放的生物材料)，水稻中对应的基因命名为OsELF3。该突变体有明显的晚抽穗表型。

3.确定突变位点，分析候选基因

本发明鉴定的OsELF3基因的突变体为Tos17插入导致。水稻OsELF3基因位于第6染色体，TIGR核苷酸数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中对应的基因：LOC_Os06g05060，插入该基因第二个内含子中，距离该基因起始编码位点ATG有2,825bp，生物信息学分析表明该基因与拟南芥抽穗期基因AtELF3有75％的同源性，如图3(A)。同源基因AtELF3，在拟南芥中是影响拟南芥开花时间的一个基因，它在影响开花的光周期路径中，属于光输入路径，该基因在拟南芥中开花调控路径中位于GI的上游。

4.oself3突变体晚抽穗的表型和Tos17的插入共分离

根据侧翼序列设计引物做共分离验证。在插入位点的两边设计一对引物P1和P2(引物的序列见后所述)，及Tos17上设计一条引物P3(引物的序列见后所述)，如图3，P1表示在插入位点上游设计的引物，P2表示在插入位点下游设计的引物，P3表示根据Tos17内部序列设计的引物。在T1代植株中，Tos17纯合植株只有P1和P3配对可以扩增的出，因为有Tos17插入P1与P2配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有Tos17的插入，只有P1和P2配对可以得到产物，杂合植株则P1和P3配对以及P1和P2配对时都可以扩增得到产物。本发明中所有oself3突变体用引物P1和P2配对均扩不出条带，表明该位点为纯和Tos17插入，且表现为晚抽穗表型，是隐性突变体。

5.T₂代遗传分析进一步验证表型与基因型共分离

为了验证该突变体的遗传稳定性及进一步验证共分离情况，本发明又对T₂代遗传表型进行了检测。T₁代纯合突变体，它的子代全部是晚抽穗表型；OsELF3位点不带有Tos17插入的野生型单株的下一代没有出现分离，仍然表现正常抽穗期；对于T₁代中的杂合子(即Tos17只是在同源染色体中的一条上插入)，子代出现晚抽穗的突变表型，且符合3∶1分离，同时PCR检测表明Tos17的插入与突变表型共分离。由此证明，这个突变体是由于这个Tos17插入造成的单位点隐性突变。以上表型都是在武汉夏天长日照自然条件下观测到的。

6.oself3突变体的光周期表现

为了进一步鉴定OsELF3基因突变后，突变体oself3的表型。把野生型和突变体分别在长日照条件(14L/10D，光/暗)，短日照条件(10L/14D，光/暗)条件下生长，观察抽穗期，结果如表1。发现在长日照条件下，突变体比野生型抽穗晚18天；在短日照条件下，突变体和野生型之间的抽穗期没有明显的变化。

表1 野生型和突变体分别在长日照短日照条件下的抽穗期结果

7.OsELF3基因的功能遗传互补遗传验证

将OsELF3基因转入OsELF3基因得到纯合突变体，互补OsELF3基因纯合突变体的表型，并且恢复的表型是可以稳定遗传给下一代，且表型与OsELF3基因共分离，从遗传上证明OsELF3具有调控水稻抽穗时间的功能。将含有OsELF3基因的片段构建在互补载体pCAMBIA2301上，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将互补载体导入OsELF3基因纯合突变体，最后获得互补的组培苗13株，作为对照的由空载体转化苗10株，都种于大田，结果转基因阳性株都比对照株早抽穗，恢复了表型。说明是OsELF3基因的突变导致了水稻晚抽穗的表型，OsELF3基因可以使突变体恢复正常抽穗期的表型。以上表型都是在武汉夏天长日自然条件下考察的。

8.超量表达OsELF3基因改变水稻的抽穗期

超量表达OsELF3基因验证其功能。将OsELF3基因片段构建在超表达载体pU1301(图7A)上，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11号(中国农业科学院作物科学研究培育的常规水稻品种)，最后获得超表达的组培苗30株，作为对照的由正常粳稻品种中花11愈伤分化的苗子10株，都种于大田，结果约有80％的超表达组培苗出现早抽穗表型。说明OsELF3基因具有控制水稻抽穗期的功能，同时还具有促进水稻抽穗的功能。以上表型都是在武汉夏天长日自然条件下考察的。

9.OsELF3基因调控抽穗期的应用

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，它养育了全球近半数的人口，如何提高水稻的产量是关系到国计民生的重要问题。抽穗期是水稻的重要农艺性状之一，阐释水稻开花的分子机制，对指导育种实践、品种改良以及品种推广均具有重大意义，如解决在杂交制种过程中常常遇到的花期不遇问题。另外，越来越频繁的自然灾害使得选育合适生育期以及抽穗期，受环境影响较小的品种在避害利用中显得十分重要。控制水稻抽穗期基因OsELF3可以在转基因水稻中应用也可以在转基因水稻种子中应用，培育具有适应不同季节和地域的抽穗期的品种。

本发明的优点和效果：

1.虽然拟南芥的基因AtELF3已被克隆，该基因的突变表现为拟南芥的早开花，它的同源基因尚未在作物上开展研究。本项发明分离克隆了水稻OsELF3基因并阐明其调控水稻抽穗期的分子机理，通过比较AtELF3和OsELF3基因之间功能的异同处，对于利用基因调控操作作物开花时间有重要的实践价值。

2.虽然水稻上已克隆到了一些控制抽穗期的基因，但对阐明控制抽穗期的路径和分子机理仍不清楚。而本发明克隆的OsELF3基因能够控制水稻的抽穗期，进一步完善了水稻开花路径的分子网络，为更好的利用水稻基因的分子网络调控抽穗期奠定了基础。

3.OsELF3基因仅在长日照条件下影响水稻抽穗期，同时不影响水稻的其它农艺性状，该基因的功能研究对于水稻长日条件的抽穗期的路径研究和培育适应不同季节和地域的品种的水稻具有重要作用。

4.该突变体使水稻在长日照条件下晚抽穗18天，说明OsELF3基因对改变抽穗期很明显，通过基因工程技术提高或减弱OsELF3基因的表达量能够控制水稻在长日照条件下的抽穗期，从而有利于形成适应不同地域和季节的水稻品种。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的调控水稻抽穗期的基因的编码区，序列全长为2283bp。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆调控水稻抽穗期的基因编码的蛋白质的氨基酸序列，它编码750个氨基酸。

图1.是本发明的OsELF3基因的鉴定和功能验证的技术流程图。

图2.水稻抽穗期突变体表型图。图2(A)，植株在长日(14L/10D)照，室温30℃处理条件下，第65天野生型和突变体的表型；图2(B)，植株在短日(10L/14D)照，室温30℃处理条件下，第65天野生型和突变体的表型；图2(C)，长日(14L/10D)照和短日(10L/14D)照条件下，野生型和oself3突变体植株的抽穗期统计结果，植株从浸种到稻穗抽出1cm的时间计为抽穗期，n＝15。图片中，左：正常野生型表型；右：Tos17插入纯合突变体表型。

图3.根据插入位点设计引物验证共分离图。图3(A)，OsELF3基因结构及被Tos17插入的位置，并根据插入位点设计引物验证共分离示意图。P1表示在插入位点上游设计的引物，P2表示在插入位点下游设计的引物，P3表示根据Tos17内部序列设计的引物。在T1代植株中，纯合突变体只有P1和P3配对可以扩增的出，因为有Tos17插入P1与P2配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有Tos17的插入，只有P1和P2配对可以得到产物，杂合植株则P1和P3配对以及P1和P2配对时都可以扩增得到产物。图3(B)，上一行引物：P1+P3，下一行引物：P1+P2，M表示Tos17插入純合突变体，W表示野生型，H表示杂合型。以田间表型为参照，Tos17插入纯合植株表型晚抽穗；其它植株表型正常，表型出现1∶3分离。|

图4.T₂代验证共分离的PCR结果。上一行引物：P1+P2，下一行引物：P1+P3，L表示2KB Maker，W表示野生型，H表示杂合型。以田间表型为参照，Tos17插入纯合植株表型晚抽穗；其它植株表型正常，表型出现1∶3分离。

图5.OsELF3基因的表达谱检测。从左到右依次为：根，茎，叶鞘，叶，顶端分生组织，穗。

图6.互补实验结果。图中：(A)pCAMBIA2301载体示意图。(B)转化苗表型。左为转化阴性株，右为转化阳性株。

图7.超表达实验结果。图中：(A)所用pU1301载体图。(B)转化苗表型。左为转化阴性株，右为转化阳性株。

具体实施方式

本发明是利用本申请人所在作物遗传改良国家重点实验室构建的水稻T-DNA随机插入的突变体库(http://rmd.ncpgr.cn/)，通过反向遗传学的方法分离并克隆影响水稻抽穗期的基因OsELF3(图1)。本发明中的oself3突变体来自于本实验室构建的突变体库(http://rmd.ncpgr.cn/)(Wu等，Development of enhancertrap lines for functional analysis of the rice genome.Plant Journal，2003，35：418-427)，该突变体在水稻T-DNA插入突变体库中的原始编号为：04Z11ED48。为进一步理解本发明的内容与目的，下面就以实施例详细介绍本发明的具体技术实施步骤。

实施例1：分离克隆OsELF3基因

1.检索水稻突变体库(T₀代)

本发明获得的oself3突变体(在水稻T-DNA插入突变体库中的原始编号为：04Z11ED48)来自于华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室构建的突变体库(Wu等，Development of enhancertrap lines for functionalanalysis of the rice genome，Plant Journal，2003，35：418-427；Zhang等，Non-random distribution of T-DNAinsertions at various levels of the genome hierarchy as revealed by analyzing 13,804 T-DNA flanking sequencesfrom an enhancer-trap mutant library，Plant Journal，2007，49：947-959)。因为在组培的过程中，水稻中的反转录转座子如被激活而发生转座，产生插入突变。oself3突变体为Tos17标签插入突变体。

2.检索标签侧翼序列数据库

对有T-DNA或者Tos17插入的转化苗，抽提DNA(按照常规报道的方法)后，分别用Inverse-PCR，Adaptor-PCR，TAIL-PCR(Liu等，Thermal asymmetric interlaced PCR：Automatable amplification andsequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking，Genomics，1995，25：674-681)等方法分离侧翼序列，并建立了侧翼序列数据库(http://rmd.ncpgr.cn/)，通过检索突变体库资源，获得含有Tos17插入的突变体，在水稻T-DNA插入突变体库中的原始编号为：04Z11ED48。

3.根据侧翼序列设计引物做共分离检测

根据侧翼序列与水稻基因组的匹配情况，可以确定插入位点，在插入位点的两边设计一对引物P1和P2，及Tos17上设计一条引物P3，如图3，P1表示在插入位点上游设计的引物，P2表示在插入位点下游设计的引物，P3表示根据Tos17内部序列设计的引物。在T1代植株中，Tos17纯合植株只有P1和P3配对可以扩增的出，因为有Tos17插入P1与P2配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有Tos17的插入，只有P1和P2配对可以得到产物，杂合植株则P1和P3配对以及P1和P2配对时都可以扩增得到产物。如果突变性状是隐性的，那所有突变株用P1和P2配对扩不出的为共分离。最后分析结果，OsELF3基因突变的家系是共分离的。该共分离家系突变表型如图2，其对应的侧翼序列全长108bp如下：tccgggggtaaaacgacacaaatcctatagcactatgagaactgtaaccgtcgctttacccacctactgtatgattccctccccctgttttacactctaatcttcttt

采用BLAST分析方法(Altschul等，Basic local alignment search tool，Journal of Molecular Biology，1990，215：403-410)发现侧翼序列与GenBank核苷酸数据库中的克隆：NC_008399.2能够很好的匹配，侧翼序列的53-108分别和NC_008399.2的2234798-2234744匹配，一致性高达88％，对应位点的基因为OsELF3。根据插入位点设计的引物序列为P1(引物)：5′GGTGGGCTGTCTTCAGTGTT 3′。P2(引物)：5′ATAATTTACCGCAAGGAGGC 3′。P3(引物)：5′CGGTTACATCTTCTCAAACT CAATGTG 3′。PCR反应体系的总体积为20μl，DNA模板1μl(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL₂ 1.2μl、2mM dNTP1.5μl、10μM引物0.2μl、0.3单位Taq酶，加ddH₂O至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min 30cycles，72℃延伸5min。PCR结果，如图3，H表示杂合型，M表示Tos17纯合型，W表示野生型。与植株表型相对应，Tos17纯合植株表型为晚抽穗；Tos17杂合植株，Tos17阴性植株表型为正常，表现出1∶3分离。说明该突变表型确实是Tos17插入造成的。

4.T₂代进一步做共分离验证

为了验证该突变体的遗传稳定性及进一步验证共分离情况，又繁殖了一代即T₂代。将T₁代收获的种子播种得到T₂代。T₁代中Tos17纯合突变体子代全表现为晚抽穗，杂合型的子代，出现预期的表型，即晚抽穗的表型，而且符合孟德尔1∶3分离。而表现正常的野生型单株的下一代没有出现分离，仍然表现正常。同时PCR检测表明Tos17的插入与突变表型共分离，如图4，H表示杂合型，M表示Tos17纯合型，W表示野生型。与田间表型对照，Tos17纯合植株表型为晚抽穗；Tos17杂合植株，Tos17阴性植株表型为正常，表现出13∶31分离。由此证明，这个突变体是由于Tos17插入造成的单位点隐性突变。

5.根据候选基因，进行功能分析

采用BLAST分析方法发现，该突变体中Tos17插入水稻第6染色体，TIGR核苷酸数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中对应的基因：LOC_Os06g05060，插入该基因第二个内含子中，距离该基因起始编码位点ATG有2,825bp，生物信息学分析表明该基因与拟南芥抽穗期基因AtELF3有75％的同源性，如图3。同源基因AtELF3，在拟南芥中是影响拟南芥开花时间的一个基因，它在影响开花的光周期路径中，属于光输入路径。拟南芥中，该基因在GI的上游。虽然在拟南芥中已克隆到基因AtELF3，但OsELF3基因在水稻中的功能没有证实。本发明克隆的OsELF3基因在长日照条件下对水稻抽穗期有显著的影响，这对阐明水稻光周期路径的调控机理有重要意义。

6.对oself3突变体的光周期反应的鉴定

对家系中的野生型和纯合突变体，各选取200粒种子，按照常规报道的方法浸种催芽后，播于苗床，10天后挑选长势一致的秧苗，分别种植于红桶内，各基因型种植30株，然后分别放在不同光照条件下处理。长日照(14L/10D)照，室温30℃处理条件下，处理野生型，纯合突变型各15株；短日照(14D/10L)照，室温30℃处理条件下，处理野生型，纯合突变型各15株。从浸种开始记录为第一天，直到水稻穗从叶鞘中抽出1cm，记录为水稻的抽穗期。数据统计结果如下，在长日照条件，突变体抽穗期为81.47±1.85天，野生型抽穗期为63.64±2.34天，统计学上说明突变体比野生型晚抽穗18天；在短日照条件，突变体抽穗期为56.47±1.59天，野生型抽穗期为54.33±3.05天，统计学证明突变体与野生型抽穗期之间没有明显不同。因此，水稻OsELF3基因为长日照条件下有调控抽穗期的功能。

实施例2：RT-PCR验证OsELF3基因的表达模式

本发明采用报道的半定量RT-PCR(Reverse-transcript PCR)的方法分析该基因的表达模式，RT-PCR所用引物ELF3-F(5′GTGGAAATAGTGGGCATCA 3′)位于第1个外显子(Exon)上，引物ELF3-R(5′AGGCGGGAAGTAGTTCATAG 3′)位于第3个外显子上。其中ELF3-F+ELF3-R扩增反转录产物的产物大小为994bp。分别取于抽穗期的根、茎、叶、叶鞘、茎尖和幼穗等组织的RNA样品。RT-PCR的程序如下：94℃变性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min 28-30cycles，72℃延伸5min，RT-PCR的检测结果如图5所示。由图5可见，抽穗期时OsELF3基因在水稻的根、茎、叶、叶鞘中表达量都很高，在穗中表达量很低，在茎尖组织里几乎不表达。

实施例3：OsELF3基因的功能验证和应用

1.互补载体的构建

互补载体pC2301-OsELF3的构建方法如下：以pCAMBIA2301载体为骨架载体(购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)。用SacI酶切得到一系列酶切片段，其中包括目的片段：含整个OsELF3基因编码区日本晴BAC克隆OSJNBa0014H10，及5′端前约1,591kb和3′端后约370bp。将酶切片段与SacI酶切的去磷酸化的的载体质粒pCAMBIA2301连接(所使用的内切酶、碱性磷酸酶均购自Takara公司，连接酶购自Promega公司，具体用法与用量参考该产品的说明书)。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，加800μl LB复苏45分钟，取250μl涂于含卡那霉素、X-gal及IPTG的LA平板，37℃温箱培养14-16小时(LA与LB培养基的配方参照：萨姆布鲁克著，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)。挑白色单克隆，扩大培养并抽提质粒，通过PCR筛选阳性克隆、酶切验证及测序验证后得到目的克隆。把构建好的载体电转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(购自CAMBIA公司)菌株中。

2.遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant Journal，1994，6：271-282)通过互补菌株将互补基因导入到oself3突变体的愈伤，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有G418(购自北京原平皓生物技术有限公司)抗性的愈伤、分化、生根及炼苗移栽大田得到转基因植株(农杆菌介导的遗传转化试剂及配方见申请人已经公开的专利，专利名称为：水稻木质素合成基因FC1及应用，申请号：200610018105.5；公开号：CN1995346)。按照相同的遗传转化方法将空载体pCAMBIA2301导入上述oself3突变体(原始编号为：04Z11ED48)的愈伤，得到的转基因植株作为阴性对照。

本发明研究结果显示，将互补菌株EHA105-pC2301-OsELF3导入oself3突变体的愈伤，共获得互补转化苗13株，其中3株阴性，为突变表型，10株为阳性，全部恢复正常表型；获得空载体转化子10株，均为突变表型，如图6(B)。以上结果表明晚抽穗突变表型确实是由于OsELF3基因突变而造成。为了检测互补后代的遗传稳定性，本发明随机选取8份T₀代互补转基因植株，利用Southern杂交(具体操作参考：Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome，Plant Journal，2003，35：418-427)分析了这些互补转基因植株的拷贝数。结果显示，其中有2份互补转基因植株为单拷贝。大田种植单拷贝家系的T₁代，其中恢复正常表型植株为转基因阳性植株，而未恢复正常表型的植株均为转基因阴性植株。这些研究结果进一步表明oself3突变体的突变表型确实是由于OsELF3基因的突变而造成的。

3.超表达遗传转化载体的构建

所用载体是华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室构建的pU1301。pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA 1301(Sun等，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzaein rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein，Plant Journal，2004，37：517-527)基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素启动子的农杆菌介导的遗传转化载体(图7)。pCAMBIA1301载体由澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)惠赠。用PCR方法，直接从水稻基因组扩目标基因SEQ ID NO：1，PCR反应体系的总体积为20μl，水稻基因组DNA模板1μl(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL₂ 1.2μl、2mM dNTP 1.5μl、10μM引物各0.2μl、50％甘油2μl、0.3单位rTaq酶(T宝生物工程大连有限公司)，加ddH₂O至20μl。反应程序为：94℃变性3min，94℃45s、55℃45s、72℃1min、35个循环，72℃延伸5min，扩10管，收集PCR产物于1.5ml离心管纯化，加等体积24∶1氯仿异戊醇，轻摇5分钟，12000rpm离心15分钟，吸上清，加2倍体积95％乙醇，1/10体积3M醋酸钠(PH5.2)，-20℃放置30分钟，12000rpm离心20分钟，弃上清，加500μl 75％乙醇放置5min，12000rpm离心5分钟，弃上清，晾干，加75μl ddH₂O溶解。把纯化的PCR产物及pU1301载体酶切，体系：总体积100μl，PCR产物或载体质粒75μl，限制性内切酶BamH1 30U，限制性内切酶Kpn1 30U，10X K buffer 5μl，ddH₂O 16μl，37℃酶切5小时。纯化酶切产物，方法同上，最后加10μl ddH₂O溶解。连接反应：10μl PCR产物全部用于连接反应，载体0.5μl，2U T4 ligase，5X buffer3μl，总15μl体积，连接24小时。取1μl连接产物，电压18000V，电转到大肠杆菌DH10B，加800μl LB，复苏45分钟，取200μl涂于含卡那霉素的LA平板，37℃，过夜。挑单克隆，扩大培养抽质粒，酶切验证，酶切方法同上。PCR验证，体系程序与从水稻基因组扩目标基因相同。挑阳性克隆，把构建好的载体电转农杆菌EHA105，抽质粒，PCR验证，取750μl含构建好载体的农杆菌菌液加等体积的50％甘油混匀，-70℃保存。构建好的载体命名为pU1301-OsELF3。

4.遗传转化

采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant Journal，1994，6：271-282)将超表达载体导入野生型水稻品种中花11号(为中国农业科学院作物科学研究培育的常规水稻品种)中。

5.OsELF3基因超表达结果和应用

最后获得超表达的组培苗30株，作为对照的由正常中花11愈伤分化的苗10株，都种于大田，结果约有80％的超表达组培苗出现早抽穗的突变表型。说明OsELF3基因具有控制水稻抽穗期的功能。

本实验所涉及的农杆菌介导的遗传转化的步骤及培养基如下：

1)愈伤诱导

(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)15分钟；

(2)灭菌水洗种子4-5次；

(3)将种子放在诱导培养基上；

(4)置于黑暗处培养5周，温度25-27℃。

2)愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25-27℃。

3)预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度25-27℃。

4)农杆菌培养

(1)在带有卡那霉素的LA培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA105两天，温度28℃；

(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

5)农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；

(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

6)愈伤洗涤和选择培养

(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

(2)浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30分钟；

(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)

7)分化

(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天；

(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(2000lx)下培养，温度26℃，5-7周。

8)生根

(1)拔出分化好的苗子，剪掉分化时产生的根；

(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

9)移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

附：农杆菌介导的遗传转化试剂和配方

(1)试剂和溶液缩写

6-BA(6-BenzylaminoPu，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2，4-D(，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；HN(潮霉素)；DMSO(二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)

(2)组织培养的溶液配方

1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]

逐一溶解，然后在20-25℃下定容至1000ml。

2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]

碘化钾(KI) 0.08g

硼酸(H₃BO₃) 0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O) 0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 0.15g

在20-25℃下溶解并定容至1000ml。

3)Fe₂EDTA贮存液(100X)

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g。

在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g。

在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MSmax母液(10X)

在20-25℃下溶解并定容至1000ml。

6)MSmin母液(100X)

在20-25℃下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)

2，4-D 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃下保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)

6-BA 100mg.

9)NAA贮存液(1mg/ml)

NAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)IAA贮存液(1mg/ml)

IAA 100mg.

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)

葡萄糖 125g

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液

AS 0.392g

DMSO 10ml

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

氢氧化钾 5.6g

蒸馏水溶解定容至100ml，在20-25℃下保存备用。

14)KT贮存液(1mg/ml)

KT 100mg.

(3)培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

10)LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)

蛋白胨 2.5g

酵母粉 1.25g

氯化钠 2.5g

琼脂粉 3.2g

蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后20-25℃保存备用。

Claims

1.OsELF3基因在调控水稻抽穗期中的应用，其特征在于，所述的OsELF3基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。