CN107236744A - 可调控植物早花的早实枳PtAGL24基因的分离及应用 - Google Patents

可调控植物早花的早实枳PtAGL24基因的分离及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及可调控植物早花的早实枳PtAGL24基因的分离及应用。PtAGL24基因的核苷酸序如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白质的序列如SEQ ID NO:2所示；启动子PtAGL24P的核苷酸序列SEQ ID NO：3所示。该基因异位超表达后可明显缩短植物的童期，促使植物早花，本发明的基因和启动子为多年生木本果树的育种和缩短开花的进程提供了生物资源。通过启动子的空间表达进一步揭示PtAGL24在植物整个发育过程中的作用，显示本发明克隆的基因还受到环境低温的诱导，对外界的环境胁迫上有一定的响应。本发明的基因和启动子可在调控植物开花期和低温胁迫中的应用。

Description

可调控植物早花的早实枳PtAGL24基因的分离及应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及可调控植物早花的早实枳PtAGL24基因的分离及应用。
背景技术
开花结实是开花植物生命周期中重要的生物学过程，是植物自身发育过程的中心环节，亦是果树生产及果业产品加工的基础。柑橘是一种在热带、亚热带地区广泛栽培的常绿果树，也是居于世界第一位的水果，其产量和经济效益决定了它在整个果树生产中的地位。由于柑橘有着相对较长的童期，再加上传统的柑橘育种中存在着珠心胚干预、部分生殖器官败育、在遗传方面极度杂合等问题，使得柑橘的杂交育种比较困难，育种周期延长，柑橘新品种的选育工作进展缓慢，短时期内难以满足市场对优质柑橘的需求。因此探索柑橘成花转变的内在机理，缩短童期，进而实现对柑橘花期的调控，改变果实的成熟期，对于加速柑橘遗传改良、提高柑橘经济效益有着潜在的重大意义。
植物成花发育过程受众多转录因子的调控，MADS‐box家族是其中一个重要的转录因子家族，它的成员几乎遍及所有真核生物(Shore et al.1995)。在拟南芥中，绝大多数控制成花转变和花器官发育的基因都属于MADS‐box家族，如两个关系密切的成员AGL24和SVP，它们在植物发育的各阶段都起着重要作用(Gregis et al.2008)。尽管AGL24和SVP同属MADS‐box基因家族，有着很高的序列相似性，且都在成花转变前的营养组织中有表达，但它们在调控成花方面却起着相反的作用(Hartmann et al.2000；Yu et al.2002)。AGL24是一个成花促进因子，它的表达受到光周期、春化作用的诱导，在成花转变期的花序顶端被逐步上调；SVP则在营养发育时期的茎端分生组织中表达，以维持茎端营养生长特性，SVP能够感受环境温度的变化并影响microRNA172的表达(Lee et al.2010；Michaels et al.2003)。SVP通过与FLC形成复合体直接作用于成花整合因子SOC1、FT的DNA序列并下调它们的表达，进而起到抑制成花的作用。相反，AGL24与SOC1形成一个相互调控的反馈环，通过直接互作形成复合体直接激活下游LFY的表达。同时，它还参与植物开花的表观调控过程，AGL24、SOC1通过与组蛋白去乙酰化酶SAP1的互作，抑制SEP3组蛋白H3的乙酰化，促进成花转变(Liu et al.2009)。
目前，AGL24/SVP的同源基因在各物种中相继被分离，在功能上存在着一定差别。例如，金鱼草的INCOMPOSITA(INCO)基因控制先出叶的发育及花分生组织的特征(Masiero et al.2004)；洋酸浆的MPF1影响植株结构及种子的发育(He et al.2010)；大麦的BM1在节间和节点部位具有高水平的转录(Schmitz etal.2000)；水稻中OsMADS55和OsMADS22协同参与油菜素内酯的响应调控(Lee et al.2008)。然而，这些基因的过表达均表现出类似35S::AGL24或35S::SVP的表型(Liu et al.2007)，说明STMADS亚家族成员在控制成花方面可能存在共有的机制。因此，研究与拟南芥关系较远的物种，尤其是多年生木本植物中成花相关基因的功能，对于了解其成花机制具有重要意义。
发明内容
本发明的目的就是从早实枳(梁遂权等，1999；Zhang et al.2011)中分离出拟南芥AGL24的同源基因及调控其表达的启动子，并对其同源序列进行比对、时空表达模式、亚细胞定位、异位表达等进行了分析。并通过对其启动子的空间表达分析，证实了该基因在早实枳成花发育过程中充当重要角色，为进一步揭示柑橘及多年生植物的早花机制奠定了一定基础。
申请人将分离克隆的基因命名为PtAGL24基因(orange1.1g027190m)；把分离出来的PtAGL24基因的启动子命名为PtAGL24P。早实枳中PtAGL24基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，序列长度为825bp。遗传转化拟南芥后，可以明显提早植物的成花时间，对于缩短多年生果树的童期及作物的遗传改良有重要意义。同时分离并克隆了该基因的启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，序列长度为1996bp。启动子的空间表达进一步表明PtAGL24基因可调控植物的整个发育过程，也参与到植物响应低温胁迫的途径中。
具体地，本发明通过以下技术方案实现：
申请人通过基因克隆技术从早实枳中分离得到AGL24的同源基因PtAGL24(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)。同时参照柑橘基因组数据库并结合染色体步移技术分离得到该基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，序列长度为1996bp。RT‐PCR显示PtAGL24在各组织中都有表达，在成熟的花器官中相对表达高一些；亚细胞定位显示PtAGL24蛋白主要定位于细胞核中，表明PtAGL24是作为转录因子起作用的；通过在拟南芥中超表达该基因发现，转基因株系根据其花器官形态特征可分为两类，I类转基因株系不仅表现为早花，而且在叶片及生殖器官的形态上也发生了改变；II类转基因株系只表现为早花，生殖组织在形态上则与野生型相似。
对构建的PtAGL24P融合GUS基因载体的异位转化发现，在整个发育过程中都能检测到GUS基因不同强度的表达，PtAGL24的启动子在胚根突破种皮时开始表达，并且在幼苗期活性较强一些。通过对启动子序列分析发现具有响应低温的元件，因此对转PtAGL24P的拟南芥进行低温处理，表明PtAGL24的启动子是可以受到环境低温诱导的。启动子的分析从侧面也反映了PtAGL24基因除了调控植物的生殖生长外，可能还对植物的营养生长有一定的调控作用。
获得本发明所示基因及启动子的主要步骤如下：
(1)参考柑橘基因组搜索AGL24的同源基因，获得PtAGL24的基因序列。
(2)通过荧光定量PCR和半定量PCR检测PtAGL24的时空表达。
(3)融合GFP蛋白对洋葱表皮细胞进行瞬时表达转化。
(4)参考柑橘基因组克隆PtAGL24启动子的核苷酸序列。
(5)利用生物信息学方法分析该启动子结构。
(6)构建PtAGL24超表达载体和PtAGL24启动子融合GUS基因的载体分别转化拟南芥。
(7)对转基因拟南芥进行抗性筛选及移栽。
(8)对超表达阳性植株进行表型观察及数据统计。
(9)对启动子阳性植株进行GUS染色分析。
(10)低温处理条件下转基因拟南芥中GUS活性定量检测。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明得到可使植物早花的PtAGL24基因，利用该基因构建了超表达载体pCAMBIA1301+PtAGL24，该表达载体上含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，通过转化植物，获得了转PtAGL24基因的超表达转化植株。该PtAGL24基因可用于调控植物的开花，缩短植物的开花时间，使童期明显变短，可应用于果树的花期调控和品种改良。
(2)本发明得到调控PtAGL24基因的特异启动子PtAGL24P，利用PtAGL24基因的启动子融合GUS基因得到的重组载体pCAMBIA1391+PtAGL24P，该重组载体含有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，可受到环境低温的诱导。获得的PtAGL24P转基因植株在胚根突破种皮后就能检测到GUS活性，从侧面反映PtAGL24基因在整个发育过程中的调控作用。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明分离克隆的PtAGL24基因的核苷酸序列。序列长度为825bp。其中该序列的49‐732碱基处所述的序列是该基因的编码框(CDS)。
序列表SEQ ID NO：2是PtAGL24基因编码的蛋白序列。序列长度为227aa。
序列表SEQ ID NO：3是本发明分离克隆的PtAGL24基因启动子的核苷酸序列。序列长度为1996bp。
图1：是本发明的技术路线图。
图2：是PtAGL24基因序列及结构分析结果。附图标记说明：图2中的A图是PtAGL24与MADS蛋白亚家族其它成员的氨基酸序列比对的结果；图2中的B图是PtAGL24及其同源基因的基因结构示意图；图2中的C图是PtAGL24蛋白MADS‐box区三维结构预测。
图3：是成年早实枳中PtAGL24的表达分析。附图标记说明：图3中的A图是PtAGL24在不同组织根、茎、叶、花、果、顶芽和侧芽的表达量；图3中的B图是PtAGL24在花不同部位即花托、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊和心皮中的表达量；图3中的C图是在花发育不同阶段PtAGL24的表达。标尺为5mm。
图4：是PtAGL24亚细胞定位的结果。附图标记说明：图4中的A图是35S::PtAGL24‐GFP融合载体及35S::GFP载体示意图；图4中的B图是PtAGL24蛋白在洋葱表皮细胞中的定位。
图5：是在长日照条件下PtAGL24转基因拟南芥的表型分析结果。附图标记说明：图5中的A图是I型转PtAGL24植株(右)与野生型(左)相比加速成花；图5中的B图是野生型及转基因植株花序出现前叶片形态(倒三角代表童期向成年期的转变)；图5中的C图是开花期野生型的花序；图5中的D图和E图是野生型(左)、具有苞片状萼片结构的I型转基因植株(中)及与野生型相似的II型转基因植株花和角果的比较；图5中的F图和G图是I型转基因植株授粉后的单花及成熟的花；图5中的H图和I图是I型PtAGL24转基因植株花序及成熟花的电镜结构；图5中的J图是PtAGL24转基因株系萼片茸毛富集的电镜结构；图5中的K图和L图是野生型植株及I型转基因植株萼片表面细胞结构；图5中的M图和N图是野生型植株及I型转基因植株心皮表面细胞结构。标尺：A‐G为1mm；H‐N为50μm。
图6：采用PLACE软件(公开使用软件)分析早实枳PtAGL24基因启动子侧翼序列结构。
图7：是转PtAGL24P基因拟南芥中GUS蛋白的化学组织染色。附图标记说明：图7中的A图至H图是转基因拟南芥在萌发后1、2、3、5、7、14、21及28d的组织化学染色；图7中的I图和J图是在主根和侧根中的GUS表达；图7中的K图至O图是在莲座叶、茎生叶、花和角果中均能检测到GUS染色，但在成熟的种子中未能检测到。标尺＝500μm(A,B,J,O)，1mm(C‐I,K‐N)。
图8：是PtAGL24P转基因拟南芥中GUS活性定量检测。附图标记说明：图8中的A图是正常生长(NV)和低温处理(V)条件下不同发育时期转基因植株中的GUS活性；图8中的B图是生长40d的转基因植株不同组织根、莲座叶、茎生叶、茎、花和角果中的GUS表达。
图9：是原始载体pCAMBIA1302的图谱。
图10：是原始载体pCAMBIA1301图谱和本发明构建的重组载体pCAMBIA1301+PtAGL24的图谱。附图标记说明：图10中的A图是原始载体pCAMBIA1301的图谱；图10中的B图是构建的重组载体pCAMBIA1301+PtAGL24的图谱。
图11：是原始载体pCAMBIA1391图谱和本发明构建的重组载体pCAMBIA1391+PtAGL24P的图谱。附图标记说明：图11中的A图是原始载体pCAMBIA1391的图谱；图11中的B图是构建的重组载体pCAMBIA1391+PtAGL24P的图谱。
具体实施方式
实施例1 早实枳PtAGL24基因的分离与序列分析
本实施例为了获得柑橘中AGL24的同源基因，利用拟南芥AGL24基因(Gene ID为AT4G24540)的CDS序列在甜橙的数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝Org_Csinensis)中进行Blast搜索，获得同源性最高的序列即为柑橘中AGL24基因(Gene ID为orange1.1g027190m)的核苷酸序列，并用Primer 5.0软件按照一般设计引物的原则在该基因的5'‐UTR区和3'‐UTR区设计引物进行全长cDNA序列的扩增。
以早实枳(取材于华中农业大学标本园，文献来源：梁遂权等，1999；Zhang et al.2011)为材料抽提RNA及反转录，所得的第一链cDNA用于扩增PtAGL24基因的全长。RNA的抽提使用Trizol试剂盒(购自Invitrogen公司；按照该试剂盒提供的操作说明书操作)。抽提的3μg总RNA样品经1U的DNaseI(购自Invitrogen公司)室温处理15min后，加入1μl EDTA(25mM)，于65℃温育10min。第一链cDNA的合成用MBI反转录试剂盒(购自Fermentas公司，按照试剂盒说明书操作)。扩增基因PtAGL24引物对为：正向引物：5'‐GGCTTTAGGTTACTGTGATC‐3'；反向引物：5'‐TCCATAAACACAACAGCATCT‐3'。25μl的反应体系中包括100ng cDNA，1×缓冲液，2.5mM MgCl2,0.25mM dNTP，0.5U Taq聚合酶(前述缓冲液和Taq聚合酶均购自Fermentas公司)，加0.5μM上述的正向和反向引物。PCR反应在ABI 9700(Applied Biosystem)扩增仪上按以下程序完成：94℃,5min；94℃变性30s，60℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环；循环完成后72℃延伸15min。产生一条单一PCR条带产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒(购自Omega公司，美国)回收特异带，提取步骤参照试剂盒使用说明。回收纯化的DNA溶液与pMD18‐T载体(购自宝生物工程大连有限公司)进行连接反应，按说明书操作。连接反应体系中插入PtAGL24基因与pMD18‐T载体的摩尔比为3:1。连接反应总体积是10μl，其中包括5μl的2×缓冲液(购自宝生物工程大连有限公司)，4.5μl纯化的PCR产物，0.5μl pMD18‐T载体。16℃过夜连接。取10μl连接产物，采用热击法(Sambrook et al.1989)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序(由华大基因武汉分公司完成)。测序结果表明，本发明克隆PtAGL24基因全长为825bp(见SEQID NO：1所示)，命名为PtAGL24或PtAGL24基因。
采用NCBI中的ORF Finder通过对该基因的编码序列进行预测分析，发现其开放阅读框包含684bp(如序列表SEQ ID NO：1中所示)，编码227个氨基酸(如序列表SEQ ID NO：2所示)。如图2中的A图所示，与其它MADS‐box蛋白(在NCBI中的序列号：PtrMADS9为XP_002301093.1；PhMADS20为GU129907.1；AGL24为NM_118587.5；PtSVP为FJ373210.1；VvSVP为XM_002285651.2；SVP为NM_127820.3.)相似，PtAGL24同样包含高度保守的MADS‐box区域和中度保守K‐box结构。cDNA与DNA比对结果表明，PtAGL24基因同样具有结构的保守性，在一致的位点存在8个外显子和7个内含子(图2中的B图)。PtAGL24蛋白MADS‐box区的三级结构包含一个螺旋和两个折叠区域(图2中的C图)。这些结果表明PtAGL24基因在序列上是很保守的。
实施例2 PtAGL24启动子的克隆和生物信息学分析
参照甜橙基因组，找出PtAGL24基因的上游启动子序列，采用软件Primer5.0按照一般设计引物的原则设计引物，并用CTAB法提取早实枳叶片的基因组DNA，DNA提取的方法参照程运江报道的方法(Cheng etal.2003)。以此DNA为模板，采用高保真性的Taq酶进行启动子的扩增，所采用的扩增PtAGL24启动子的引物对的序列如下所示：
正向引物：5'‐GATAAGATAAATCGGAAAT‐3'
反向引物：5'‐AATAATATATAATAAGCAGA‐3'
扩增到的启动子片段用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，目的片段按琼脂糖凝胶回收试剂盒(购于上海捷瑞生物工程有限公司)操作说明书进行回收纯化，再进行AT克隆，并转化大肠杆菌DH5α，同时对阳性菌落进行PCR检测，然后再送样并进行测序(由华大基因武汉分公司完成))。随后将测序结果与已知数据库里面的DNA序列进行对比，以保证序列的一致性。本发明得到的启动子的序列如SEQ ID NO：3所示，并采用在线分析软件PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/index.html)对PtAGL24基因的启动子序列中的顺式作用元件进行预测；启动子转录起始位点用Neural Network Promoter Predicition(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)进行预测。如图6所示，是分离到的起始密码子ATG上游约1.6Kb的侧翼序列，并预测到一些与胁迫相关的调控元件和一些组织特异性表达的元件(对图6部分汇总的结果见表1)。
表1 PtAGL24启动子上的顺式作用元件
实施例3 PtAGL24蛋白的亚细胞定位
(1)载体的准备：通过使用PSORT程序预测到PtAGL24蛋白可能定位于细胞核中，为验证这一预测结果，就构建了PtAGL24的编码序列与GFP蛋白融合的载体。根据pCAMBIA1302载体(购自澳大利亚的CAMBIA实验室)的多克隆位点和PtAGL24序列，用Primer Premier 5.0软件按照一般设计引物的原则设计出扩增PtAGL24的引物，在正向引物和反向引物的5'端分别加入Nco I的酶切位点(见表3)。引物序列为：
正向引物：5'‐ccatggGGCTTTAGGTTACTGTGATC‐3'；
反向引物：5'‐ccatggGCTGGAGTAGGGAAGCCCTA‐3'(注：小写字母为加入的酶切位点)。
以实施案例1获取的PtAGL24连pMD18‐T(购自宝生物工程大连有限公司)的菌液为模板进行PtAGL24的扩增。PCR反应条件为：95℃，5min；95℃，30s；56℃，30s；72℃，90s；72℃，10min。35个循环。扩增的片段重新连接pMD18‐T并提取质粒。对载体pCAMBIA1302和片段连接pMD18‐T的质粒分别进行酶切，酶切体系：反应总体积为20μl，其中含有PCR的纯化产物10μl，10×M缓冲液(购自MBI公司)2μl，NcoI内切酶2μl，双蒸水6μl。在37℃酶切3h后分别纯化回收。连接反应体系中插入PtAGL24的片段与载体pCAMBIA1302的摩尔比为3:1，反应总体积为10μl，其中含有10×Buffer 1μl，T4DNA连接酶1μl，PtAGL24的双酶切回收产物4μl，pCAMBIA1302载体的双酶切回收产物2μl，双蒸水2μl。在16℃反应14‐16小时。连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序确定没有突变，获得含有插入目的片段的中间载体，将其命名为pCAMBIA1302+PtAGL24‐GFP，提取质粒并置于‐20℃备用。
(2)洋葱表达材料的制备：将新鲜洋葱的鳞茎切成1cm2左右的小块，75％酒精消毒8‐10min，取出后在灭菌超纯水中清洗2‐3次，用镊子小心撕下内表皮，置于MS固体培养基上暗培养备用。
(3)金粉处理及微弹的制备：称取60mg金粉置于1.5ml离心管中，加入1ml 75％酒精振荡悬浮两次，高速离心后弃去酒精，用灭菌超纯水清洗2‐3次，并悬浮于灭菌水中；取10μl金粉悬浮液，向其中加入1‐2μg目的质粒pCAMBIA1302+PtAGL24‐GFP，混匀后再依次加入2.5M CaCl2 10μl、0.1M亚精胺4μl，振荡混匀后冰上静置5min，短暂离心后弃净上清；加入60μl预冷的无水乙醇，振荡悬浮后离心并弃上清；最后加入10‐20μl无水乙醇，充分悬浮备用。
(4)基因枪介导的转化及荧光检测：轰击前首先对基因枪阻挡网、微弹载体等装置进行灭菌处理，并开机预热；将包被质粒的金粉悬浮液均匀点布于微弹载体上，并在超净台上晾干；将载有洋葱表皮的培养皿置于样品室内，调整射程并抽真空；当压力达到一定值时进行轰击；排气后取出样品，封皿。转化后的表皮细胞置于MS固体培养基上，25℃暗培养24h，用4,6‐二脒基‐2‐苯基吲哚(DAPI)染色10min，在荧光显微镜下对GFP及DAPI荧光进行观察拍照。
结果分析：如图4所示，GFP荧光图片表明，和预测结果一致，35S::PtAGL24‐GFP融合蛋白主要定位于细胞核中；而空载对照的GFP信号则在细胞质和细胞核中都存在。这表明PtAGL24蛋白主要作为转录因子参与转录调控过程。
实施例4 PtAGL24基因的表达分析
为进一步了解PtAGL24的潜在作用，利用定量和半定量检测了该基因在不同组织及不同阶段的表达模式。取早实枳的根、茎、叶、不同时期发育的花、果、顶芽及侧芽，花不同部位的分离外植体在冰上操作。RNA的提取及反转录步骤见实施例1。为进行实时荧光定量检测(为常规方法)，取2‐3μg总RNA进行反转录，然后按照体积比为1:5的比例对PCR产物稀释，取1μl作为模板，采用LightCycleTM480荧光定量PCR仪进行定量分析，每个样品作4个重复，所有结果用β‐actin(Ciclev10025866m)进行内参校正。
由图3结果所示，PtAGL24的表达几乎在所有被检测的组织中都有表达(包括根、茎、叶、花、果、顶芽和侧芽)，在完全开放的花、茎及叶中的表达要比其它组织中高一些(见图3中的A图)。而且PtAGL24在成熟花的各轮器官中都有表达，尽管表达水平不同(见图3中的B图)。另外对PtAGL24在花器官发育不同时期检测，如图3中的C图所示，PtAGL24在花发育成熟时的转录水平比前期高一些。这些结果暗示了早实枳PtAGL24基因可能同时参与了营养和生殖生长过程。
实施例5 PtAGL24对拟南芥进行遗传转化
(1)载体的构建：为了揭示PtAGL24基因在植物生长和发育过程中的生物学功能，对该基因进行了异位表达分析。载体的构建同实施例3所示，不同之处见表3，所用的表达载体是pCAMBIA1301(购自澳大利亚的CAMBIA实验室)，酶切位点为Nco I和BstE II。把构建好的重组载体命名为pCAMBIA1301+PtAGL24。应用冻融法将重组载体pCAMBIA1301+PtAGL24导入农杆菌菌株EHA105，并将农杆菌菌液置于‐80℃下保存备用，以便应用于后续的转化。
(2)拟南芥的遗传转化：播种前将灭菌的营养土和蛭石按体积比为3:1进行混合拌土，用营养液(按常规方法)泡湿并分装于营养钵中。将打破休眠的Col拟南芥种子用枪头点播在营养土上面，每角点播2‐3个种子，同时用薄膜进行覆盖保湿。3‐4d后揭膜后，在正常长日照条件(16h光照/8h黑暗)培养，室温23℃左右。拟南芥植株的转化采用花序浸染法(Zhang et al.2006)，在主枝抽苔4‐5cm时剪去主枝顶端，促进更多侧枝的生长且生长一致，约4‐5d后可进行转化，在转化的前一天浇足水。将保存的农杆菌(EHA105)菌种进行活化，28℃，250r/min摇24h。再将活化的菌种接种到50mL含有50mg/L的卡那霉素和25mg/L的利福平的LB液体培养基中，28℃，250r/min过夜，至菌液为金黄色时取出。5000r/min离心10min弃上清，收集细胞，加入5％蔗糖溶液悬浮菌体使OD600＝0.8～1.0，再向菌液中加入0.05％Sliwet L‐77以提高转化的效率，混匀后开放的花序在菌液中浸泡30s‐1min。将转化后的拟南芥植株浇少量水，并置于黑暗条件下培养24h，后转入正常条件下。之后再用上述同样的方法浸染2‐3次，待种子成熟后37℃烘干，并4℃保存。
(3)转基因拟南芥的抗性筛选：将转基因的拟南芥种子在4℃下放置3天后即可筛选，拟南芥种子先用75％酒精进行表面消毒3min，再用2％次氯酸钠溶液消毒8min，无菌水冲洗3次，最后一次用无菌水浸泡种子1‐2小时以促进种子的萌发。然后用灭菌的0.1％的琼脂糖溶液悬浮种子，使种子均匀的铺在含有50mg/L羧苄霉素和25mg/L潮霉素的1/2MS培养基平板上筛选。当幼苗长到15天左右时即可看到筛选出来的苗子，长势好、健壮且根系发达的一般是阳性苗。当幼苗长出4‐5片叶子时，用清水洗掉根上的培养基并移栽于培养土中，待苗子长到一定大小时，对T1代苗进行PCR鉴定。T1代种子会由于染色体的自由组合出现性状分离，故用相同的筛选方法筛选T2代可去除非抗性苗，再对T2代苗进行DNA和RNA水平上的验证，最后用T3代阳性苗进行表型观察及统计。
(4)结果分析：通过拟南芥的转化筛选，在T1代获得了16株阳性株系，从中随机选取了8个稳定的转基因株系播种，并对其后代进行表型统计。与野生型相比，几乎所有转基因株系的成花转变都明显提前(见表2)。如图5中的B图所示：转基因植株莲座叶的叶型相对于野生型要偏圆、偏小一些。根据各转基因株系花器官形态的变化，将其分为两种类型(如表2所示)：I型转基因植株表现为明显早花且花器官形态发育异常(表2；图5中的A图)；II型的转基因植株只表现为明显的早花，没有花器官的变异。野生型拟南芥的花蕾或花的萼片表面通常没有或附着较少的茸毛(图5中的B图,C图)；而I型转基因植株花器官的萼片则发育成类似叶片状的结构且表面着生较多的茸毛(图5中的D‐F图)，并且这种叶状萼片在完成授粉后不脱落，而是随着花的发育继续伸展(图5中的F图,G图)。尽管II型35S::PtAGL24转基因植株在花的形态上没有明显变化，但它们同样表现为早花且萼片附着有轻微的茸毛(表2；图5中的D图)。
通过电镜扫描能更真实地反应细胞的表面结构，对I型转基因植株及野生型花器官结构进行了电镜分析。扫描结果同样证实了该类型转基因植株花器官发育的异常及萼片表面茸毛的富集(图5中的H‐J图)。野生型植株萼片的表皮通常是规则的细胞类型(图5中的K图)，而I型转基因植株的萼片表面则没有这种规则形状的细胞，主要呈现出弯曲和波浪状的表皮细胞结构(图5中的M图)。而且，它们心皮的表面形态也和野生型有所不同(图5中的L图,N图)。
表2 异位表达PtAGL24转基因拟南芥的表型统计
实施例6 利用PtAGL24启动子对拟南芥进行遗传转化及GUS的活性定量检测
(1)载体构建：为了验证PtAGL24启动子的空间表达，本发明构建了PtAGL24启动子启动GUS基因的载体。载体的构建参照实施例3。不同的是本实施例所用的载体是pCAMBIA1391(购自澳大利亚的CAMBIA实验室)，双酶切位点是BamH I和EcoR I。获得了含有插入目的片段的重组载体，将其命名为重组载体pCAMBIA1391+PtAGL24P，应用冻融法将重组载体pCAMBIA1391+PtAGL24P导入到农杆菌EHA105中。
(2)拟南芥的转化及筛选参考实施例5。
(3)结果分析：通过对T2代阳性苗进行GUS组织染色。如图7所示在转基因植株发育过程中，萌发期间吸水膨胀的种子未检测到GUS染色，一旦胚根突破种皮，便在胚根和内部子叶中均能看到GUS染色，而且较强的GUS表达主要集中在根毛区(图7中A图,B图)。在两片子叶期的幼苗中，根和下胚轴呈现出较深的GUS染色，而子叶和上胚轴染色较浅一些(图7中的C图,D图)。随着幼苗的生长，萌发后7到14d幼苗在子叶和真叶中的GUS染色逐渐加深(图7中的E图,F图)；随后GUS信号贯穿整个成年期的植株(图7中的G图,H图)。在成年各组织中，除成熟的种子未发现GUS染色外，其它各部位均能检测到GUS染色(图7中的I‐O图)。在根中，较强的GUS表达主要局限于主根和侧根的维管组织，根毛和根冠上无GUS表达(图7中的J图)；莲座叶和茎生叶的叶脉中的GUS表达较其它区域高一些(图7中的K图,L图)；生殖组织中的GUS染色也呈现不均匀的分布，成熟花中的GUS染色主要集中在萼片、雄蕊和柱头，而幼果中的GUS染色主要出现在果柄离层区和柱头顶部，并随着角果的生长在果柄和果荚上的染色有所扩展(图7中的M图,N图)。表明PtAGL24启动子在胚根突破种皮时便开始表达，随后贯穿植株发育的整个过程，且在幼苗期的表达活性相对高一些。
表3 本发明所用的引物、载体和酶切位点信息汇总表
注：表3中的引物序列的前面几个小写字母分别是对应的酶切位点的序列。
为更准确地反映转基因拟南芥中GUS表达的强度，对转基因植株的GUS活性进行了荧光分析，首先对不同发育阶段样品提取蛋白后进行活性检测。根据这一结果，发现在萌发后7d和14d的幼苗中GUS活性相对较高，随后下降到一个相似的水平(图8中的A图)。在成年植株各组织中，花中的GUS活性最高，大约是茎生叶的2.6倍；并且根中的GUS表达相对其它营养组织要高一些(图8中的B图)。实施例2在对PtAGL24启动子分析时注意到其序列含有低温或胁迫响应相关的元件(见表1和图6)，接着又进一步调查了转基因植株对低温的响应情况。将萌发后的幼苗置于4℃长日照条件下处理4周，然后转入正常条件生长，同时在不同时间点进行取样检测其GUS活性变化。如图8中的A图所示，在处理的早期阶段，GUS活性相比对照有所下调，而随着处理时间的延长活性明显升高，处理28d时的GUS活性比对照高出近1倍，这表明PtAGL24的启动子可能与低温响应有关。
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Claims (10)

1.一个从早实枳中分离克隆的AGL24家族的同源基因PtAGL24，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一个从早实枳中分离克隆的AGL24家族的同源基因PtAGL24，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。(已经在序列表中定义CDS区。)
3.一个从早实枳中分离的PtAGL24基因的启动子PtAGL24P，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.权利要求1或2所述的基因在调控植物成花中的应用。
5.权利要求1或2所述的基因在调控柑橘成花中的应用。
6.如权利要求4所述应用，其中包括在拟南芥中的应用。
7.权利要求3所述的启动子在在调控植物成花中的应用。
8.权利要求3所述的启动子在在调控柑橘成花中的应用。
9.权利要求3所述的启动子在植物响应低温胁迫中的应用。
10.权利要求8所述的应用，其中包括在柑橘响应低温胁迫中的应用。
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