CN114990115A - 优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子和CsUAP56小内含子构建的载体和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了优化的柑橘Ccl‑eEF1a启动子和CsUAP56小内含子构建的载体和应用；使用优化的Ccl‑eEF1a启动子和CsUAP56内含子，结合柑橘和豇豆密码子优化的mEGFP和tdTomato基因等共12个片段构建了适用于柑橘和豇豆瞬时转化的亚细胞定位载体，所述亚细胞定位载体为pHCi12C，该载体已优化消除了所有Golden Gate克隆常用酶切位点，可将候选基因通过双BsmBI酶切位点定向插入mEGFP基因3’端，且载体具有蓝白斑筛选功能可快速鉴定获得阳性克隆；同时载体内设计了核定位tdTomato内部参照，在进行如转录因子亚细胞定位观察时，相较于普通的亚细胞定位载体而言，可不用额外进行细胞核荧光染色步骤，直接将mEGFP‑目的基因融合蛋白定位结果与核定位tdTomato结果作叠加比较，即可准确快捷地评判候选基因是否定位在细胞核。

Description

优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子和CsUAP56小内含子构建的载体 和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子和CsUAP56小内含子构建的载体和应用。
背景技术
柑橘是全球最重要的经济果树之一，是世界第一大类水果。但由于柑橘木虱和柑橘黄龙病的蔓延，严重威胁着我国柑橘产业的发展，而分子育种是未来实现柑橘抗虫和抗病育种的主要手段。为实现这一目标，需优化或开发可用的分子工具如优化遗传转化载体等来提高柑橘的转化效率，挖掘可用的抗病基因进行遗传改造。分子工具的开发包括鉴定不同用途的启动子、内含子、终止子及开发不同用途的植物表达载体或基因编辑载体等。目前，柑橘的遗传转化所用启动子大多使用CaMV 35S和拟南芥UBQ10启动子来驱动目的基因，而鉴定新的柑橘物种特异性的启动子和内含子研究均相对较为匮乏。使用外源基因或启动子尤其是来源于病毒时，面临生物安全评估可能会存在一定的麻烦或安全隐患。因此鉴定柑橘内源启动子、内含子和终止子等用于柑橘遗传转化载体的构建将会规避一些安全风险。
在进行基因功能研究的过程中，通过对目的基因亚细胞定位情况的了解可明确该基因编码蛋白在细胞内行使功能所在的具体位置。亚细胞定位通常将目的蛋白基因与荧光蛋白基因如GFP、YFP、CFP、RFP、dsRed、tdTomato等连接形成融合蛋白，通过在激光共聚焦或荧光显微镜下观察荧光蛋白信号进而明确目的蛋白的定位情况。但常规的亚细胞定位载体通常没有内部参照，需要额外准备正对照载体或先进行荧光染色，如核定位需要DAPI进行细胞核染色后再进行观察比较。若使用额外的正对照载体，则由于组织细胞的不同而不能实现直观的图片叠加比较；若使用DAPI染色可实现图片的直接叠加比较，但其需要额外的染色步骤，且存在残留背景信号干扰的影响。无论是额外的正对照载体还是组织细胞染色，在进行批量规模鉴定的情况下，无疑增加了不少工作量。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子和CsUAP56 小内含子，及用其构建的亚细胞定位载体和应用，在进行如转录因子亚细胞定位观察时，相较于普通的亚细胞定位载体而言，可不用额外进行细胞核荧光染色步骤，直接将mEGFP-目的基因融合蛋白定位结果与核定位tdTomato结果作叠加比较，即可准确快捷地评判候选基因是否定位在细胞核。
本发明提出的优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，该启动子已消除序列中所有Golden Gate克隆常见酶切位点，可驱动基因在柑橘和豇豆叶片和嫩芽组织中大量表达。
优选地，该启动子为与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列包括其截短序列具有≥60％同源性的核苷酸序列，且具有启动子的功能。
本发明提出的优化的柑橘CsUAP56小内含子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，该内含子可添加于ATG起始密码子之前，保证表达盒不会在大肠杆菌和农杆菌中转录后开启目标蛋白的翻译，仅在植物寄主中翻译目标蛋白，防止农杆菌转化后mEGFP假阳性荧光信号的产生。
优选地，对该内含子的5’UTR进行了可变剪切位点优化，优化后的5’UTR和小内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述内含子为与SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列包括其截短序列具有≥60％同源性的核苷酸序列，且具有内含子的功能。
本发明提出的一种生物材料，包含如权利要求1所述的优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子和/ 或如权利要求2所述的优化的柑橘CsUAP56小内含子。
优选地，所述生物材料为基因表达盒、表达载体、宿主细胞或宿主菌、转基因组织或转基因苗中的一种。
本发明提出的上述优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子在植物营养器官中表达目的基因中的应用。
优选地，使用优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子驱动目的基因或植物遗传转化筛选标记构建植物表达载体，并用于遗传转化获得转基因材料。
优选地，所述目的基因或植物遗传转化筛选标记为NptⅡ基因、Hpt/HygR基因、Cat基因、Spt基因、Aada1基因、SpcN基因、Epsps基因、BlpR/Bar基因、Gox基因中的一种。
本发明提出的一种pHCi12C亚细胞定位表达载体，包含如上述所述的优化的柑橘Ccl- eEF1a启动子和优化的柑橘CsUAP56小内含子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，该载体内还含有mEGFP和tdTomato基因，其中内部核定位信号参照tdTomato-SV40 NLS基因在激光共聚焦或荧光显微镜下可通过红色荧光蛋白信号指示细胞核；将mEGFP-待测蛋白的绿色荧光信号与tdTomato-SV40 NLS蛋白红色荧光信号进行叠加，以快速评判待测基因编码的蛋白是否定位于细胞核。
优选地，内部核定位信号tdTomato-SV40 NLS基因可更换为其他定位信号连接的荧光蛋白融合基因，以方便其它类型的定位分析。
优选地，其他定位信号为细胞膜定位信号、线粒体定位信号、叶绿体定位信号、内质网定位信号、高尔基体定位信号和液泡定位信号中的一种。
优选地，用于融合定位信号的其它荧光蛋白可选择发射光波段在480-590nm范围之外的荧光蛋白。
优选地，该载体还预留有构建柑橘过表达和CRISPR/Prime editing基因编辑改造的酶切位点HpaI和ZraI，以及可用于开发Marker free载体的loxP位点，可作为柑橘遗传转化载体的基本骨架。
本发明提出上述pHCi12C亚细胞定位表达载体在柑橘和豇豆的瞬时转化和亚细胞定位中的应用。
本发明的有益技术效果：
该载体优化消除了所有Golden Gate克隆常用酶切位点，可将候选基因通过双BsmBI酶切位点定向插入mEGFP基因3’端，且载体具有蓝白斑筛选功能可快速鉴定获得阳性克隆；使用优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子驱动目的基因或植物遗传转化筛选标记构建植物表达载体，可在柑橘和豇豆叶片和嫩芽组织中大量表达，适用于遗传转化获得转基因材料；该载体内含有的内部核定位信号参照tdTomato-SV40NLS基因在激光共聚焦或荧光显微镜下可通过红色荧光蛋白信号指示细胞核；将mEGFP-待测蛋白的绿色荧光信号与tdTomato-SV40 NLS 蛋白红色荧光信号进行叠加，无需额外繁琐地进行DAPI细胞核染色，便可快速评判待测基因编码的蛋白是否定位于细胞核，且无残留背景信号干扰的影响；内部核定位信号 tdTomato-SV40 NLS基因可更换为其他定位信号连接的荧光蛋白融合基因，以方便其它类型的定位分析，其他定位信号为细胞膜定位信号、线粒体定位信号、叶绿体定位信号、内质网定位信号、高尔基体定位信号和液泡定位信号中的一种，且与定位信号融合的荧光蛋白与 mEGFP发射波段不应重合，可选择发射光波段在480-590nm范围之外的荧光蛋白；该载体还预留有构建柑橘过表达和CRISPR/Prime editing基因编辑改造的酶切位点HpaI和ZraI，以及可用于开发Marker free载体的loxP位点，可作为柑橘遗传转化载体的基本骨架。
附图说明
图1为本发明提出的pHCi12C亚细胞定位表达载体图谱；
图2为本发明提出的pHCi12C载体NGS测序结果；
图3为本发明提出的pHCi12C-CsWRKY26亚细胞定位表达载体菌液PCR鉴定；泳道1-23：不同的单克隆菌液样品；M：DL2000 DNA marker；NC：水对照；
图4为本发明提出的pHCi12C-CsWRKY26亚细胞定位表达载体图谱；
图5为本发明提出的pHCi12C-NC亚细胞定位表达载体图谱；
图6为本发明提出的空载体对照和CsWRKY26蛋白分别在豇豆和柑橘叶肉细胞内的亚细胞定位结果；空载体对照：去除LacZα基因表达盒，仅插入终止密码子的亚细胞定位载体；CsWRKY26：去除LacZα基因表达盒，插入CsWRKY26基因的亚细胞定位载体。
具体实施方式
实施例1
柑橘Ccl-eEF1a启动子序列的克隆和柑橘CsUAP56小内含子的鉴定和序列优化
S1：采用CTAB法提取克里曼丁橘成熟叶片基因组DNA，经微量紫外分光光度计测定DNA浓度，并将DNA用双蒸水稀释至100ng/μL。
S2：获取Phytozome网站克里曼丁橘Ccl-eEF1a基因并截取上游3000bp核苷酸序列，选取合适的位点设计启动子克隆引物。由于本发明所用柑橘品种与Phytozome不同，且Phytozome网站柑橘基因组序列仍存在gap或错误，因此需先进行克隆测序确认。作为优选，所述克隆引物为：
Prom_CcleEF1aF：TTGACATGATTTGAGAGTATGTACCCTTTTATCATAGA(SEQ ID NO.5)；
Prom_CcleEF1aR：CATGGCTGTTAAATTAACTGAAACTGGGGAA(SEQ ID NO.6)
S3：以克里曼丁橘DNA为模板，用克隆引物和高保真酶进行PCR扩增，PCR产物大小2170bp。
S4：将高保真酶扩增的片段加A后与pMD19T克隆载体进行连接，转化XL10-Gold大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，挑选阳性克隆进行Sanger测序。
S5：对测序获得的启动子序列进行常用Golden Gate克隆酶切位点的查找，并通过优化替换碱基消除对应的酶切位点。通过启动子调控元件分析，对比优化前和优化后启动子序列上的调控元件，保证序列优化不会影响其重要的调控元件。优化后的序列直接进行序列合成，最终序列为SEQ ID NO.1。
S6：通过Phytozome网站甜橙基因组获取CsUAP56基因第一个小内含子和5’UTR序列。
S7：为确认CsUAP56基因内含子剪切位点的准确性，使用柑橘叶片转录组(分别包含甜橙嫩叶、甜橙成熟叶、感染柑橘黄龙病的柑橘叶脉、木虱取食柑橘叶脉样品)进行比对确认CsUAP56基因5’UTR是否存在可变剪切，通过碱基替换消除多余的AG剪切位点；由于序列较短，且已经过转录组数据确认，则直接合成优化后的序列SEQ ID NO.3。
对于优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子来说，已消除序列中所有Golden Gate克隆常见酶切位点，可在柑橘和豇豆叶片和嫩芽组织中大量表达。
此外启动子还可以为与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(包括其截短序列)具有≥60％同源性的核苷酸序列，且具有启动子的功能。
对于优化的CsUAP56内含子来说，可添加于ATG起始密码子之前，保证表达盒不会在大肠杆菌和农杆菌中转录后开启目标蛋白的翻译，仅在植物寄主中翻译目标蛋白，防止农杆菌转化后mEGFP假阳性荧光信号的产生。该内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。此外，还对内含子中的5’UTR进行了可变剪切位点优化，优化的5’UTR和小内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2
Ccl-eEF1a启动子和CsUAP56小内含子在pHCi12C载体构建中的应用
本实施例中设计了一种可用于柑橘和豇豆亚细胞定位的植物表达载体pHCi12C(图 1)。载体中使用了本发明优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子和柑橘CsUAP56小内含子。且创造性的设计了一个内部对照，即连有核定位信号的tdTomato-SV40NLS正对照，可在激光共聚焦显微镜下指示细胞核的位置，显示非常强的红色荧光蛋白信号。待测基因则与mEGFP基因连接，可在激光共聚焦显微镜下显示绿色荧光信号，将绿色荧光通道与红色荧光通道进行叠加，可快速评判待测基因翻译的蛋白是否定位于细胞核。此外实施例中核定位内部正对照 tdTomato-SV40 NLS可更换为含有其它定位信号的荧光蛋白融合基因，如细胞膜定位信号、线粒体定位信号、叶绿体定位信号、内质网定位信号、高尔基体定位信号等荧光蛋白融合基因，以适用于不同定位研究判定的内部参照。用于融合定位信号的荧光蛋白可选择发射光波段在480-590nm范围之外的荧光蛋白。
对于本发明实施例提供的用于柑橘和豇豆的亚细胞定位载体的构建方法包括以下步骤：
S1：以T-Vector pMD19(Simple)载体为DNA模板，通过高保真酶PCR扩增和NEBuilder HiFi DNA Assembly连接消除BsaI、BbsI、PaqCI酶切位点，同时在LacZα基因内部加入SnaBI、EcoRV、Eco53kI酶切位点，构建pMD19B克隆载体。
S2：以新构建的pMD19B克隆载体为DNA模板，通过高保真酶PCR扩增已添加 SnaBI、EcoRV、Eco53kI酶切位点的LacZα基因表达盒。
S3：以pCAMBIA1305.1双元表达载体为DNA模板，优化除T-DNA区域以外的载体骨架，通过高保真酶PCR扩增和酶切连接消除BsaI、BbsI、BsmBI、PaqCI酶切位点。为消除这些位点，此处共需扩增6个片段进行组装。
S4：通过以本实验室之前设计优化的pHCi-Fg1-Spec_pUC57-Mini载体为DNA模板，使用高保真酶PCR扩增已优化消除BsaI、BbsI、BsmBI、PaqCI酶切位点的增强型CaMV 35S启动子和TMV Omega翻译增强子。
S5：高保真酶PCR扩增实施例1中优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子和优化的CsUAP56基因5’UTR和小内含子序列。
S6：将以上所有片段均通过EcoR V-HF或SnaBI酶切连接至新构建的克隆载体pMD19B中，通过Sanger测序保证序列全部正确后，再开展下一步。
S7：将以上所有片段与合成的柑橘和豇豆密码子优化的mEGFP基因和tdTomato-SV40 NLS基因进行BsaI Golden Gate连接，将小片段组装成大片段。以连接产物进行高保真酶 PCR扩增，筛选能够成功连接的片段，最终获得成功连接的两个大片段为pHCi12F1/R5和 pHCi12F6/R8，引物信息见表1，PCR扩增条件见表2，产物大小分别为：5435bp和3584 bp。将这两个大片段再次连接至pMD19B克隆载体进行测序确认。
表1连接产物PCR扩增引物信息
Figure BDA0003656085360000061
表2连接产物PCR扩增条件
上游引物 下游引物 DNA模板 退火温度 产物长度 延伸时间
pHCi12F1 pHCi12R5 连接产物 63℃ 5435bp 7min
pHCi12F6 pHCi12R8 连接产物 57℃ 3584bp 5min
S8：经DNA序列测序确认后，将pHCi12F1/R5和pHCi12F6/R8片段与柑橘Ccl-eEF1a启动子、tdTomato-SV40 NLS基因进行BsaI Golden Gate连接。连接产物转化XL10-Gold大肠杆菌感受态，挑选蓝色单菌落摇菌进行菌液PCR鉴定。菌液PCR鉴定所用引物见表3， PCR扩增条件见表4。
表3 pHCi12C菌液PCR鉴定引物信息
引物名称 序列(5’-3’) 专利序列编号
pHCi12deteF1 CGGGAATTAAACTATCAGTGTTTGACAGG SEQ ID NO.11
pHCi12deteR1 GCGAACACGGTCAACACCATGC SEQ ID NO.12
pHCi12deteF2 CCTTCCGTGAGGACGCATTGAC SEQ ID NO.13
pHCi12deteR2 TTGTAGCCTTCCATCCGTGACCT SEQ ID NO.14
pHCi12deteF3 CATTCGGTTAAACACCACGCACGTTG SEQ ID NO.15
pHCi12deteR3 CCCTGGTAGATTGCCTGGCCGTA SEQ ID NO.16
pHCi12deteF4 GATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC SEQ ID NO.17
pHCi12deteR4 GGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCT SEQ ID NO.18
pHCi12deteF5 GGACGCAGAAGGCAATGTCATACCAC SEQ ID NO.19
pHCi12deteR5 CAAGGAACAGTGAATTGGAGTTCGTCT SEQ ID NO.20
pHCi12deteF6 ATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTT SEQ ID NO.21
pHCi12deteR6 GTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATGTCA SEQ ID NO.22
pHCi12deteF7 CAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCC SEQ ID NO.23
pHCi12deteR7 ACAAGTGTATCGCCTTCGAATTTAACCTC SEQ ID NO.24
pHCi12deteF8 AAGGATGACGGTAACTACAAGACTAGAGC SEQ ID NO.25
pHCi12deteR8 GAGTTCTAATTCACTGGCCGTCGTT SEQ ID NO.26
pHCi12deteF9 CGCTCACAATTCCACACAACATACGAG SEQ ID NO.27
pHCi12deteR9 TAATTGGGCATCAAAGCAGCCTACGTTT SEQ ID NO.28
pHCi12deteF10 AAATTATCTTACAGCGAATATACCAACG SEQ ID NO.29
pHCi12deteR10 TGCTAAACAAATATTACTTTGAAACCGAA SEQ ID NO.30
pHCi12deteF11 TATTGTTATTTAGCGACTGTGTTACGTT SEQ ID NO.31
pHCi12deteR11 GAAGAGGTCCACCCTTTGTCAC SEQ ID NO.32
pHCi12deteF12 ATCTATATGGCTAAGAAACCAGTGCAAC SEQ ID NO.33
pHCi12deteR12 CATGCACATACAAATGGACGAACGGAT SEQ ID NO.34
表4 pHCi12C菌液PCR扩增条件
Figure BDA0003656085360000071
Figure BDA0003656085360000081
S9：挑选12对引物菌液PCR鉴定均为阳性的单克隆进行NGS二代测序，以确认最终的载体序列是否正确。NGS测序结果显示，测序reads全部覆盖本发明设计的载体序列，且序列完全一致(图2)，说明本发明所设计的pHCi12C亚细胞定位载体构建成功。
在本发明pHCi12C亚细胞定位载体中，双BsmB I酶切位点为候选基因插入位点，此克隆位点用BsmB I进行酶切后获得粘性末端，可以利用T4 DNA连接酶将含有相同粘性末端的目的基因定向连接到载体中，该载体可用于蓝白斑筛选，以排除未插入基因的pHCi12C单克隆菌落。
实施例3
柑橘CsWRKY26亚细胞定位载体构建及在豇豆和柑橘细胞内的定位分析应用
本实施例所研究的CsWRKY26基因为柑橘木虱取食所响应的柑橘WRKY转录因子，使用PrimeSTAR Max高保真DNA聚合酶以木虱取食克里曼丁橘叶脉cDNA为模板扩增 CsWRKY26基因，PCR扩增体系见表5，引物序列见表6。PCR反应程序为：95℃3min， 98℃10s，57℃5s，72℃20s(共40个循环)；16℃2min。PCR产物大小为997bp。空载体对照为移除LacZα基因表达盒并在mEGFP基因后插入TAA终止密码子，载体的构建则使用引物pH12C_NCf和pH12C_NCr直接退火，程序为：95℃变性1min；随后80℃10 s，每个循环降低1℃(共40个循环)。
表5 CsWRKY26基因高保真酶PCR扩增体系
Figure BDA0003656085360000082
Figure BDA0003656085360000091
表6亚细胞定位空载体和CsWRKY26基因PCR扩增引物信息
Figure BDA0003656085360000092
将pH12C_WRKY26F/R PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行PCR产物纯化。将纯化的pH12C_WRKY26F/R产物和退火的pH12C_NCf/r产物通过BsmBI酶切和T4 DNA连接酶进行酶切连接，连接产物热击转化XL10-Gold大肠杆菌感受态细胞，37℃复苏 1-1.5h后涂布于含有IPTG和X-Gal的Kan抗性LB平板，37℃过夜培养。挑取白色单菌落进行液体培养后进行菌液PCR鉴定，PCR条件和引物见表7和表8。PCR反应程序为： 95℃3min；98℃10s，57℃30s，72℃40s(共40个循环)；16℃2min。pHCi12C- CsWRKY26阳性克隆菌液PCR产物大小为573bp，而pHCi12C-NC单克隆则直接提取质粒进行测序鉴定。
表7亚细胞定位载体pHCi12C-CsWRKY26菌液PCR扩增体系
试剂 体积(μL)
ddH<sub>2</sub>O 6.2
Premix Taq(Ex Taq Version 2.0 plus dye) 10
10μM pHCi12deteF8 0.4
10μM WRKY26DeteR 0.4
菌液 3
合计 20
表8亚细胞定位载体pHCi12C-CsWRKY26菌液PCR鉴定引物信息
引物名称 序列(5’-3’) 专利序列编号
pHCi12deteF8 AAGGATGACGGTAACTACAAGACTAGAGC SEQ ID NO.25
WRKY26DeteR ACCCAGTAACTCCATAAACCCTAATGACC SEQ ID NO.39
结果显示，所挑选的23个单克隆菌液PCR检测结果均为阳性(图3)，Sanger测序结果显示pHCi12C-CsWRKY26载体目的基因和pHCi12C-NC空载体插入序列正确无误，载体图谱分别为图4和图5。
将测序正确的pHCi12C-CsWRKY26和pHCi12C-NC载体分别转化根癌农杆菌AGL1和EHA105。转化步骤如下：
S1：从从-80℃取出根癌农杆菌AGL1和EHA105化学感受态于冰水浴中解冻；
S2：分别取5μL质粒DNA(pHCi12C_CsWRKY26和pHCi12C_NC)加入 AGL1/EHA105农杆菌感受态中，轻轻混匀，依次在冰水中竖直静置10min，液氮冷冻5 min，37℃水浴5min，再冰水浴5min；
S3：加入800μL无抗生素的SOC培养基，于30℃100r/min培养3h；
S4：6000r/min离心1min收集菌体，去除700μL上清，然后重悬菌体，将80-200μLEHA105菌液涂布于含50μg/mL Kan和25μg/mL Rif的LB平板；将80-200μL AGL1菌液涂布于含50μg/mL Kan、25μg/mL Rif和50μg/mL Carb的LB平板30℃培养2-3天后挑取单菌落摇菌后进行菌液PCR检测，菌液PCR体系见表7，引物见表8；
S5：将鉴定的阳性样品保存甘油菌并用于柑橘或豇豆的瞬时转化。
使用pHCi12C-CsWRKY26和pHCi12C-NC鉴定阳性的AGL1/EHA105农杆菌转化豇豆/柑橘叶片，详细步骤如下：
S1：分别准备豇豆和柑橘苗，豇豆为5-7天苗龄；柑橘则可选择各龄期苗，但需选用刚刚完全展开的叶片，生长条件均为：28℃光照16h，26℃黑暗8h；
S2：农杆菌AGL1用于接种豇豆，EHA105用于接种柑橘。准备农杆菌AGL1/EHA105 平板：将100μL农杆菌菌液涂布于含有50μg/mL Kan、25μg/mL Rif和200μM乙酰丁香酮的LB平板上，30℃培养1-2天后使用；
S3：接种菌液准备：配制含有2mL AB-MES、20μL 200mM乙酰丁香酮和18mL灭菌ddH2O的接种缓冲液，使用接种缓冲液重悬平板上的农杆菌菌苔，调整接种菌液浓度至OD600＝0.5左右；
S4：用无针头的无菌注射器吸取待接种重悬菌液，直接注射叶片背面，农杆菌即可通过气孔浸润叶片组织；
S5：被接种植株于26℃黑暗处理24h，然后转入正常生长条件，豇豆3-5天后取样，用Leica TCS SP8激光共聚焦显微镜分别在mEGFP(Exλ＝488，Emλ＝507)和tdTomato (Exλ＝554，Emλ＝581)通道进行观察和拍照；柑橘7-14天后取样，用同样的参数设置进行荧光观察和拍照。
最终，亚细胞定位结果如图6所示，结果显示，CsWRKY26-mEGFP融合蛋白在豇豆和柑橘叶肉细胞中均产生非常强的绿色荧光信号，且该绿色荧光信号与载体内部的核定位正对照红色荧光信号能够完全叠加重合(tdTomato和mEGFP暗场叠加后显示黄色荧光信号)。而未连接待测基因的空载体对照，绿色荧光信号存在于细胞膜、细胞质和细胞核，不具有定位特异性。以上结果清晰地表明，CsWRKY26蛋白定位于细胞核内。至此，使用本发明所构建的pHCi12C亚细胞定位载体用于测定CsWRKY26的定位结果清晰明确，载体构建简便，定位分析评判快速准确，非常方便。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 赣南师范大学
<120> 优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子和CsUAP56小内含子构建的载体和应用
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2167
<212> DNA
<213> 克里曼丁橘延伸因子启动子(Citrus clementina Ccl-eEF1a promoter)
<400> 1
ttgacatgat ttgagagtat gtaccctttt atcatagaat tcaatgagaa aatatcaggt 60
tcaatcccat cattgaccat ttgcttgaac aaacatctaa tagtctccat atacacatga 120
tttatgtaag tattttttcc ccgactcaaa aaagctgtga agagaatatt gtatgatctg 180
attgaaggcc tacattccaa gttcctacta ttcttcatat atttaaacac atacacagct 240
ctactcaact tcctagcttc agcgaaaaaa tatattatcg tattgtaaag agcctcagta 300
ccacaaaaac aaggagttgc aagcatttga ttaaccacac catccatctc ttggtacatc 360
ttcgctgcac caagcttcct tgtcatgatg tgataagtgg ccgcgtcgtg cctaaacgta 420
ggctgctttg atgcccaatt aaatagctcc aaacacacta aaggttcctc ttgaagagtc 480
ataacattac ataactcttc attattgaat cttggcggga gttcagacac tgcgcaacga 540
aattgtgtgt catcaagtgc aggcttgctg tcagcttttg accttttacc aactcctctg 600
cccgaagtcc ttgatagagc tatagctgag taacaagaac ataaaattgc atttgaaggc 660
aatttcaaat gcgggttaat ctgggtttgg ctcaaatagt aattagacaa agttttagaa 720
ttatgagaac tgtttgtgca gcacaaatgt ttgttaaatg ttccgtgaga gaaaatttgc 780
ctcaaccaat ttctaccagc tatgatcatc atatagaaca caacggagct accccttaaa 840
cgttaattaa ataacgcata agtgattgaa aactatagag gaaatcacta acagttcttt 900
tggaattgaa attatcttac agcgaatata ccaacgaaac gaaatgaaga gctgactata 960
cagatacagc gtggcttttg actggtatcg agattaatgg attttttttt tttatttact 1020
cagtaaacaa ctgaaactat aagggtattt aggtaaactg acaaatgaag aaacagcgaa 1080
cgaatcagat gtagccctag ttagtcacgt gattggcctc tataaaaact aagcaaacct 1140
ttttcctcat cactctttgc cctccctctt ttcttgcttg ctctgcggct aggtttcaat 1200
tgtctcttcg aaggtaagcg atcaactact cagcttgatc tagtgttttg cgtctaatgc 1260
tttgttcgat tgattgattg actgtatttg ctgatttgaa atcgtatctg attgataaca 1320
tctgacggtc ttttttaatt tattgtgcat ttagatgatc cgatctgttt gtttacttgg 1380
atattcgatt gatttatatg ctatcgtata tgtactttat gtctgttttg attcacatat 1440
atttcgtgat taattcatag gtttattgaa tatataatat gatctaaatg ctttcgattt 1500
gtacttattt tagctaagct cagtctaatt ctataaatat gtagcaactc tgttttgtag 1560
atctatgtat ttatggctca tgatttcttt acaaggtgca ttggaatata atatgatcta 1620
aacgttgctg ttttgtgttt attatagtgt agctcaacca agatttattg ttatttagcg 1680
actgtgttac gttgatctat gtcaatatgt tatcaattgt tcttttattt tatgatttgt 1740
tgaatctaat ctgaattatt tgtttcattg attgagaatc tgttaatatg gccacttttt 1800
aaaattatga atatttttag cagatgtttt tgaatatttc ggtttcaaag taatatttgt 1860
ttagcaaagt ttgtatagat ttgccagtac tttccaaatt gttactgttg tgcggcatag 1920
tttcagcttg attcatggac actaaactca agaaagctgt tattagtgtc tgatgattga 1980
atgatgatta ttttgattct tatgtgtttt gtttccttct cttgattgta aatggattat 2040
gagtttttaa tttgctcgtt gctggatgtg tttgtgaatg ccctttactg tactgatttt 2100
tctatagtaa gttgtcctat taatgtgttt atgttttttt tccccagttt cagttaattt 2160
aacagcc 2167
<210> 2
<211> 157
<212> DNA
<213> 甜橙迷你内含子(Citrus sinensis CsUAP56 mini intron)
<400> 2
gtaacgcttc aaattttcaa aatccctgtt ctttctatct ctacttacgc attaaaaccc 60
caattttgaa ggtttatttg gtaatttgtc tgaatcgatg ctcaaaaccc tagttcgttg 120
aagatctaat ctaatccttt gacttcgtgt tgtgtag 157
<210> 3
<211> 315
<212> DNA
<213> 甜橙迷你内含子和非编码区(Citrus sinensis 5' UTR and CsUAP56 miniintron)
<400> 3
cccaatcctg taaccctaac aatctctctc tttctgcgaa ttctctccac tttcaaatct 60
ttttctcctt ttattttggc taattatttt catttgctgc actctctcgc caaaccctaa 120
ccctaaaacc ccaaccgttt attcgaatac tggcaggtaa cgcttcaaat tttcaaaatc 180
cctgttcttt ctatctctac ttacgcatta aaaccccaat tttgaaggtt tatttggtaa 240
tttgtctgaa tcgatgctca aaaccctagt tcgttgaaga tctaatctaa tcctttgact 300
tcgtgttgtg tagga 315
<210> 4
<211> 13049
<212> DNA
<213> pHCi12C plasmid
<400> 4
ccgcgcactt gagcgcagcg aggaagtgac gcccaccgag gccaggcggc gcggtgcctt 60
ccgtgaggac gcattgaccg aggccgacgc cctggcggcc gccgagaatg aacgccaaga 120
ggaacaagca tgaaaccgca ccaggacggc caggacgaac cgtttttcat taccgaagag 180
atcgaggcgg agatgatcgc ggccgggtac gtgttcgagc cgcccgcgca cgtcgcaacc 240
tgtgcggctg catgaaatcc tggccggttt gtctgatgcc aagctggcgg cctggccggc 300
cagcttggcc gctgaagaaa ccgagcgccg ccgtctaaaa aggtgatgtg tatttgagta 360
aaacagcttg cgtcatgcgg tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata aacaaatacg 420
caaggggaac gcatgaaggt tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc aggcaagacg 480
accatcgcaa cccatctagc ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt tctgttagtc 540
gattccgatc cccagggcag tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga tcaaccgcta 600
accgttgtcg gcatcgaccg cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat cggccggcgc 660
gacttcgtag tgatcgacgg agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc cgcgatcaag 720
gcagccgact tcgtgctgat tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg ggccaccgcc 780
gacctggtgg agctggttaa gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct acaagcggcc 840
tttgtcgtgt cgcgggcgat caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc cgaggcgctg 900
gccgggtacg agctgcccat tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag ctacccaggc 960
actgccgccg ccggcacaac cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc tgcccgcgag 1020
gtccaggcgc tggccgctga aattaaatca aaactcattt gagttaatga ggtaaagaga 1080
aaatgagcaa aagcacaaac acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc agcagcaagg 1140
ctgcaacgtt ggccagcctg gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac tttcagttgc 1200
cggcggagga tcacaccaag ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag accattaccg 1260
agctgctatc tgaatacatc gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga ataaatgagt 1320
agatgaattt tagcggctaa aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc aggcaccgac 1380
gccgtggaat gccccatgtg tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag cggctgggtt 1440
gcctgccggc cctgcaatgg cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc gtgagcggtc 1500
gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg gtggagaagt 1560
tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc agaagcacgc cccggtgaat 1620
cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg gcaaccgccg gcagccggtg 1680
cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc agattttttc gttccgatgc 1740
tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga cgtggccgtt ttccgtctgt 1800
cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga gcttccagac gggcacgtag 1860
aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga ttacgacctg gtactgatgg 1920
cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga agggaaggga gacaagcccg 1980
gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt ctgccggcga gccgatggcg 2040
gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt aaacaccacg cacgttgcca 2100
tgcagcgtac gaagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac ggtatccgag ggtgaagcct 2160
tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg gccggagtac atcgagatcg 2220
agctagctga ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa gaacccggac gtgctgacgg 2280
ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg ttttctctac cgcctggcac 2340
gccgcgccgc aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa gacgatctac gaacgcagtg 2400
gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg caagctgatc gggtcaaatg 2460
acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc tggcccgatc ctagtcatgc 2520
gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc ctaatgtacg gagcagatgc 2580
tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg tgtctttcct gtggatagca 2640
cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa cccgtacatt gggaacccaa 2700
agccgtacat tgggaaccgg tcacacatgt aagtgactga tataaaagag aaaaaaggcg 2760
atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct taaaacccgc ctggcctgtg 2820
cataactgtc tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa agcgcctacc cttcggtcgc 2880
tgcgctccct acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc ggccgctggc cgctcaaaaa 2940
tggctggcct acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca agccgcgccg tcgccactcg 3000
accgccggcg cccacatcaa ggcaccctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 3060
ctctgacaca tgcagctccc ggacacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc 3120
agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc 3180
cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 3240
tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 3300
gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 3360
ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 3420
acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 3480
cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 3540
caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 3600
gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 3660
tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 3720
aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 3780
ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 3840
cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 3900
tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 3960
tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 4020
ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 4080
aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 4140
aagggatttt ggtcatgcat tctaggtact aaaacaattc atccagtaaa atataatatt 4200
ttattttctc ccaatcaggc ttgatcccca gtaagtcaaa aaatagctcg acatactgtt 4260
cttccccgat atcctccctg atcgaccgga cgcagaaggc aatgtcatac cacttgtccg 4320
ccctgccgct tctcccaaga tcaataaagc cacttacttt gccatctttc acaaagatgt 4380
tgctgtctcc caggtcgccg tgggaaaaga caagttcctc ttcgggcttt tccgtcttta 4440
aaaaatcata cagctcgcgc ggatctttaa atggagtgtc ctcttcccag ttttcgcaat 4500
ccacatcggc cagatcgtta ttcagtaagt aatccaattc ggctaagcgg ctgtctaagc 4560
tattcgtata gggacaatcc gatatgtcga tggagtgaaa gagcctgatg cactccgcat 4620
acagctcgat aatcttttca gggctttgtt catcttcata ctcttccgag caaaggacgc 4680
catcggcctc actcatgagc agattgctcc agccatcatg ccgttcaaag tgcaggacct 4740
ttggaacagg cagctttcct tccagccata gcatcatgtc cttttcccgt tccacatcat 4800
aggtggtccc tttataccgg ctgtccgtca tttttaaata taggttttca ttttctccca 4860
ccagcttata taccttagca ggagacattc cttccgtatc ttttacgcag cggtattttt 4920
cgatcagttt tttcaattcc ggtgatattc tcattttagc catttattat ttccttcctc 4980
ttttctacag tatttaaaga taccccaaga agctaattat aacaagacga actccaattc 5040
actgttcctt gcattctaaa accttaaata ccagaaaaca gctttttcaa agttgttttc 5100
aaagttggcg tataacatag tatcgacgga gccgattttg aaaccgcggt gatcacaggc 5160
agcaacgctc tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca tccgtgtttc 5220
aaacccggca gcttagttgc cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgc 5280
cgccttacaa cggctctccc gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc tgtatcgagt 5340
ggtgattttg tgccgagctg ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg caggatatat 5400
tgtggtgtaa acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg 5460
tactgaatta acgccgaatt aattcggacg tcactacaat atccagaagg agtctacttt 5520
acatcataac ttcgtatagc atacattata cgaagttata catggtggag cacgacactc 5580
tggtctactc caaaaatgtc aaagatacag tctcagaaga tcaaagggct attgagactt 5640
ttcaacaaag gataatttcg ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact 5700
tcatcgaaag gacagtagaa aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag 5760
gaaaggctat cattcaagat ctctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca 5820
cgaggagcat cgtggaaaaa gaagaggttc caaccacgtc tacaaagcaa gtggattgat 5880
gtgataacat ggtggagcac gacactctgg tctactccaa aaatgtcaaa gatacagtct 5940
cagaagatca aagggctatt gagacttttc aacaaaggat aatttcggga aacctcctcg 6000
gattccattg cccagctatc tgtcacttca tcgaaaggac agtagaaaag gaaggtggct 6060
cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggctatcat tcaagatctc tctgccgaca 6120
gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gaggttccaa 6180
ccacgtctac aaagcaagtg gattgatgtg acatctccac tgacgtaagg gatgacgcac 6240
aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga 6300
ggacacgctc gagtataaga gctcattttt acaacaatta ccaacaacaa caaacaacaa 6360
acaacattac aattacattt acaattatcg atacacccaa tcctgtaacc ctaacaatct 6420
ctctctttct gcgaattctc tccactttca aatctttttc tccttttatt ttggctaatt 6480
attttcattt gctgcactct ctcgccaaac cctaacccta aaaccccaac cgtttattcg 6540
aatactggca ggtaacgctt caaattttca aaatccctgt tctttctatc tctacttacg 6600
cattaaaacc ccaattttga aggtttattt ggtaatttgt ctgaatcgat gctcaaaacc 6660
ctagttcgtt gaagatctaa tctaatcctt tgacttcgtg ttgtgtagga atggtgtcta 6720
agggagagga acttttcact ggtgttgtgc ctattcttgt tgagttggat ggtgacgtga 6780
acggtcataa attttctgtt tctggcgagg gagaaggcga tgctacttac ggcaaactta 6840
cattgaagtt catttgtact actggaaagt tgcctgttcc ttggcccact cttgtgacta 6900
cattgacata cggcgtgcaa tgcttttcaa gataccccga tcatatgaaa caacacgact 6960
tctttaagtc tgcaatgcct gagggatacg ttcaagaaag aacaattttc tttaaggatg 7020
acggtaacta caagactaga gctgaggtta aattcgaagg cgatacactt gtgaacagaa 7080
tcgagttgaa gggcatcgat ttcaaagagg atggcaacat tcttggacat aagttggagt 7140
acaactacaa ctctcacaac gtttacatca tggccgacaa gcaaaagaat ggcattaaag 7200
tgaacttcaa gatcagacat aacatcgaag atggatctgt tcaacttgca gaccactacc 7260
aacaaaatac tccaattggc gatggacctg tgcttttgcc agacaaccat tacctttcta 7320
cacaatctaa attgtctaaa gatcccaatg agaaaagaga tcatatggtt cttttggaat 7380
tcgtgactgc tgccggtatt acacttggca tggacgaatt gtacaagggt tctggaagag 7440
acgcggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 7500
cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 7560
tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 7620
tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct 7680
cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 7740
cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaatta gaactcggta 7800
cgcgcggatc ttccagatac gtagatatcg agctcgtcga acggcaggcg tgcaaacttg 7860
gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac 7920
aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc 7980
acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 8040
cgtctcatga taatttctcc ataataatgt gtgagtagtt cccagataag ggaattaggg 8100
ttcctatagg gtttcgctca tgtgttgagc atataagaaa cccttagtat gtatttgtat 8160
ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa accaaaatcc agtactaaaa 8220
tccagatccc tgcaggttga catgatttga gagtatgtac ccttttatca tagaattcaa 8280
tgagaaaata tcaggttcaa tcccatcatt gaccatttgc ttgaacaaac atctaatagt 8340
ctccatatac acatgattta tgtaagtatt ttttccccga ctcaaaaaag ctgtgaagag 8400
aatattgtat gatctgattg aaggcctaca ttccaagttc ctactattct tcatatattt 8460
aaacacatac acagctctac tcaacttcct agcttcagcg aaaaaatata ttatcgtatt 8520
gtaaagagcc tcagtaccac aaaaacaagg agttgcaagc atttgattaa ccacaccatc 8580
catctcttgg tacatcttcg ctgcaccaag cttccttgtc atgatgtgat aagtggccgc 8640
gtcgtgccta aacgtaggct gctttgatgc ccaattaaat agctccaaac acactaaagg 8700
ttcctcttga agagtcataa cattacataa ctcttcatta ttgaatcttg gcgggagttc 8760
agacactgcg caacgaaatt gtgtgtcatc aagtgcaggc ttgctgtcag cttttgacct 8820
tttaccaact cctctgcccg aagtccttga tagagctata gctgagtaac aagaacataa 8880
aattgcattt gaaggcaatt tcaaatgcgg gttaatctgg gtttggctca aatagtaatt 8940
agacaaagtt ttagaattat gagaactgtt tgtgcagcac aaatgtttgt taaatgttcc 9000
gtgagagaaa atttgcctca accaatttct accagctatg atcatcatat agaacacaac 9060
ggagctaccc cttaaacgtt aattaaataa cgcataagtg attgaaaact atagaggaaa 9120
tcactaacag ttcttttgga attgaaatta tcttacagcg aatataccaa cgaaacgaaa 9180
tgaagagctg actatacaga tacagcgtgg cttttgactg gtatcgagat taatggattt 9240
ttttttttta tttactcagt aaacaactga aactataagg gtatttaggt aaactgacaa 9300
atgaagaaac agcgaacgaa tcagatgtag ccctagttag tcacgtgatt ggcctctata 9360
aaaactaagc aaaccttttt cctcatcact ctttgccctc cctcttttct tgcttgctct 9420
gcggctaggt ttcaattgtc tcttcgaagg taagcgatca actactcagc ttgatctagt 9480
gttttgcgtc taatgctttg ttcgattgat tgattgactg tatttgctga tttgaaatcg 9540
tatctgattg ataacatctg acggtctttt ttaatttatt gtgcatttag atgatccgat 9600
ctgtttgttt acttggatat tcgattgatt tatatgctat cgtatatgta ctttatgtct 9660
gttttgattc acatatattt cgtgattaat tcataggttt attgaatata taatatgatc 9720
taaatgcttt cgatttgtac ttattttagc taagctcagt ctaattctat aaatatgtag 9780
caactctgtt ttgtagatct atgtatttat ggctcatgat ttctttacaa ggtgcattgg 9840
aatataatat gatctaaacg ttgctgtttt gtgtttatta tagtgtagct caaccaagat 9900
ttattgttat ttagcgactg tgttacgttg atctatgtca atatgttatc aattgttctt 9960
ttattttatg atttgttgaa tctaatctga attatttgtt tcattgattg agaatctgtt 10020
aatatggcca ctttttaaaa ttatgaatat ttttagcaga tgtttttgaa tatttcggtt 10080
tcaaagtaat atttgtttag caaagtttgt atagatttgc cagtactttc caaattgtta 10140
ctgttgtgcg gcatagtttc agcttgattc atggacacta aactcaagaa agctgttatt 10200
agtgtctgat gattgaatga tgattatttt gattcttatg tgttttgttt ccttctcttg 10260
attgtaaatg gattatgagt ttttaatttg ctcgttgctg gatgtgtttg tgaatgccct 10320
ttactgtact gatttttcta tagtaagttg tcctattaat gtgtttatgt tttttttccc 10380
cagtttcagt taatttaaca gccatggttt ctaaaggtga ggaagtgatt aaggagttta 10440
tgaggttcaa agttagaatg gaaggatcaa tgaatggcca tgagtttgaa attgagggtg 10500
aaggagaggg caggccttat gaaggcactc aaacagctaa acttaaggtg acaaagggtg 10560
gacctcttcc atttgcttgg gatattttgt ctcctcagtt catgtatggc tcaaaagctt 10620
acgttaagca ccctgctgat attccagatt acaagaagct ttcttttcca gagggtttca 10680
agtgggaaag ggtgatgaat tttgaggatg gcggtttggt tactgtgaca caagattctt 10740
cacttcagga tggtactttg atctacaagg ttaagatgag aggtacaaac ttccctccag 10800
atggacctgt gatgcaaaag aaaactatgg gatgggaggc ttcaacagaa aggctttacc 10860
caagagatgg tgttttgaag ggagaaattc atcaagctct taaattgaag gatggaggcc 10920
actatcttgt ggagttcaaa actatttaca tggctaagaa acctgttcag cttccaggat 10980
actactatgt ggatactaag ttggatatta catctcataa cgaagattac acaatcgttg 11040
agcaatacga aaggtcagag ggtagacatc acctttttct tggtcacgga actggctcta 11100
caggttcagg atcttcagga actgcttctt cagaggataa caacatggct gttatcaagg 11160
aattcatgag gttcaaagtg agaatggagg gctctatgaa cggtcatgaa ttcgagattg 11220
aaggcgaggg tgaaggaagg ccttatgaag gtactcaaac agctaaattg aaggttacta 11280
agggtggacc attgcctttc gcctgggata ttctttctcc tcagtttatg tacggatcta 11340
aggcctacgt taaacatcca gccgatattc ctgactataa aaaactttct tttccagagg 11400
gctttaaatg ggagagagtt atgaacttcg aggatggcgg tttggtgaca gttactcagg 11460
actcttcact tcaggacggc acacttattt ataaggttaa gatgagaggc actaatttcc 11520
ctccagatgg tcctgtgatg cagaagaaaa ctatgggttg ggaagcctct actgaaaggc 11580
tttatcctag agatggagtt ttgaaaggcg aaattcatca ggctcttaag cttaaagacg 11640
gaggccatta ccttgtggag tttaagacaa tctatatggc taagaaacca gtgcaacttc 11700
caggatacta ttacgtggac acaaaacttg atattacatc tcataatgaa gattacacta 11760
tcgttgaaca gtacgagagg tcagagggta ggcatcacct tttcttgtat ggcatggatg 11820
agttgtacaa gggctcaggt ccaaagaaaa agagaaaagt gtaataggtc gacatatgaa 11880
gatgaagatg aaatatttgg tgtgtcaaat aaaaaggttg tgtgcttaag tttgtgtttt 11940
tttcttggct tgttgtgtta tgaatttgtg gctttttcta atattaaatg aatgtaacat 12000
ctcattataa tgaataaaca aatgtttcta taatccattg tgaatgtttt gttggatctc 12060
ttctccagca tataactact gtatgtgcta tggtatggac tatggaatat gattaaagat 12120
aaggttaaca gatcgggaat taaactatca gtgtttgaca ggatatattg gcgggtaaac 12180
ctaagagaaa agagcgttta ttagaataat cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta 12240
tccgttcgtc catttgtatg tgcatgccaa ccacagggtt cccctcggga tcaaagtact 12300
ttgatccaac ccctccgctg ctatagtgca gtcggcttct gacgttcagt gcagccgtcg 12360
tctgaaaacg acatgtcgca caagtcctaa gttacgcgac aggctgccgc cctgcccttt 12420
tcctggcgtt ttcttgtcgc gtgttttagt cgcataaagt agaatacttg cgactagaac 12480
cggagacatt acgccatgaa caagagcgcc gccgctggcc tgctgggcta tgcccgcgtc 12540
agcaccgacg accaggactt gaccaaccaa cgggccgaac tgcacgcggc cggctgcacc 12600
aagctgtttt ccgagaagat caccggcacc aggcgcgacc gcccggagct ggccaggatg 12660
cttgaccacc tacgccctgg cgacgttgtg acagtgacca ggctagaccg cctggcccgc 12720
agcacccgcg acctactgga cattgccgag cgcatccagg aggccggcgc gggcctgcgt 12780
agcctggcag agccgtgggc cgacaccacc acgccggccg gccgcatggt gttgaccgtg 12840
ttcgccggca ttgccgagtt cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg gagcgggcgc 12900
gaggccgcca aggcccgagg cgtgaagttt ggcccccgcc ctaccctcac cccggcacag 12960
atcgcgcacg cccgcgagct gatcgaccag gaaggccgca ccgtgaaaga ggcggctgca 13020
ctgcttggcg tgcatcgctc gaccctgta 13049
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 引物(Prom_CcleEF1aF)
<400> 5
ttgacatgat ttgagagtat gtaccctttt atcataga 38
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物(Prom_CcleEF1aR)
<400> 6
catggctgtt aaattaactg aaactgggga a 31
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12F1)
<400> 7
taggtctcag ataaggttaa cagatcggga attaaactat cagtgtttga cagg 54
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12R5)
<400> 8
gtggtctcta agaggacact ccatttaaag atccgcgcga gctgtatga 49
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12F6)
<400> 9
taggtctcat cttcccagtt ttcgcaatcc acatcg 36
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12R8)
<400> 10
gtggtctctt gagacgcagc tggcacgaca ggtttcccga ct 42
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteF1)
<400> 11
cgggaattaa actatcagtg tttgacagg 29
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteR1)
<400> 12
gcgaacacgg tcaacaccat gc 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteF2)
<400> 13
ccttccgtga ggacgcattg ac 22
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteR2)
<400> 14
ttgtagcctt ccatccgtga cct 23
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteF3)
<400> 15
cattcggtta aacaccacgc acgttg 26
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteR3)
<400> 16
ccctggtaga ttgcctggcc gta 23
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteF4)
<400> 17
gatgacggtg aaaacctctg acacatgc 28
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteR4)
<400> 18
gggaaacgcc tggtatcttt atagtcct 28
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteF5)
<400> 19
ggacgcagaa ggcaatgtca taccac 26
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteR5)
<400> 20
caaggaacag tgaattggag ttcgtct 27
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteF6)
<400> 21
atattgtggt gtaaacaaat tgacgctt 28
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteR6)
<400> 22
gtcatccctt acgtcagtgg agatgtca 28
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteF7)
<400> 23
caatcccact atccttcgca agaccc 26
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteR7)
<400> 24
acaagtgtat cgccttcgaa tttaacctc 29
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteF8)
<400> 25
aaggatgacg gtaactacaa gactagagc 29
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteR8)
<400> 26
gagttctaat tcactggccg tcgtt 25
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteF9)
<400> 27
cgctcacaat tccacacaac atacgag 27
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteR9)
<400> 28
taattgggca tcaaagcagc ctacgttt 28
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteF10)
<400> 29
aaattatctt acagcgaata taccaacg 28
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteR10)
<400> 30
tgctaaacaa atattacttt gaaaccgaa 29
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteF11)
<400> 31
tattgttatt tagcgactgt gttacgtt 28
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteR11)
<400> 32
gaagaggtcc accctttgtc ac 22
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteF12)
<400> 33
atctatatgg ctaagaaacc agtgcaac 28
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物(pHCi12deteR12)
<400> 34
catgcacata caaatggacg aacggat 27
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(pH12C_NCf)
<400> 35
tggataatag tctagaactg ct 22
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(pH12C_NCr)
<400> 36
atcaagcagt tctagactat ta 22
<210> 37
<211> 45
<212> DNA
<213> 引物(pH12C_WRKY26F)
<400> 37
agacaacgtc tcatggagag aggaaggaag ttacaaagac gaaga 45
<210> 38
<211> 49
<212> DNA
<213> 引物(pH12C_WRKY26R)
<400> 38
agtcttcgtc tctatcactc ttcccttagc atatgtgaag gaacaatgt 49
<210> 39
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物(WRKY26DeteR)
<400> 39
acccagtaac tccataaacc ctaatgacc 29

Claims (10)

1.优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，该启动子已消除序列中所有Golden Gate克隆常见酶切位点，可驱动基因在柑橘和豇豆叶片和嫩芽组织中大量表达；
优选地，该启动子为与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列包括其截短序列具有≥60％同源性的核苷酸序列，且具有启动子的功能。
2.优化的柑橘CsUAP56小内含子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，该内含子可添加于ATG起始密码子之前，保证表达盒不会在大肠杆菌和农杆菌中转录后开启目标蛋白的翻译，仅在植物寄主中翻译目标蛋白，防止农杆菌转化后mEGFP假阳性荧光信号的产生；
优选地，对该内含子的5’UTR进行了可变剪切位点优化，优化后的5’UTR和小内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
优选地，所述内含子为与SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列包括其截短序列具有≥60％同源性的核苷酸序列，且具有内含子的功能。
3.一种生物材料，其特征在于，包含如权利要求1所述的优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子和/或如权利要求2所述的优化的柑橘CsUAP56小内含子；
优选地，所述生物材料为基因表达盒、表达载体、宿主细胞或宿主菌、转基因组织或转基因苗中的一种。
4.如权利要求1所述的优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子在植物营养器官中表达目的基因中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，使用优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子驱动目的基因或植物遗传转化筛选标记构建植物表达载体，并用于遗传转化获得转基因材料；
优选地，所述目的基因或植物遗传转化筛选标记为NptⅡ基因、Hpt/HygR基因、Cat基因、Spt基因、Aada1基因、SpcN基因、Epsps基因、BlpR/Bar基因、Gox基因中的一种。
6.一种pHCi12C亚细胞定位表达载体，其特征在于，包含如权利要求1所述的优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子和权利要求2所述的优化的柑橘CsUAP56小内含子，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
7.根据权利要求6所述的pHCi12C亚细胞定位表达载体，其特征在于，该载体内还含有mEGFP和tdTomato基因，其中内部核定位信号参照tdTomato-SV40 NLS基因在激光共聚焦或荧光显微镜下可通过红色荧光蛋白信号指示细胞核；将mEGFP-待测蛋白的绿色荧光信号与tdTomato-SV40 NLS蛋白红色荧光信号进行叠加，以快速评判待测基因编码的蛋白是否定位于细胞核。
8.根据权利要求7所述的pHCi12C亚细胞定位表达载体，其特征在于，内部核定位信号tdTomato-SV40 NLS基因可更换为其他定位信号连接的荧光蛋白融合基因，以方便其它类型的定位分析；
优选地，其他定位信号为细胞膜定位信号、线粒体定位信号、叶绿体定位信号、内质网定位信号、高尔基体定位信号和液泡定位信号中的一种；
优选地，用于融合定位信号的其它荧光蛋白可选择发射光波段在480-590nm范围之外的荧光蛋白。
9.根据权利要求6所述的pHCi12C亚细胞定位表达载体，其特征在于，该载体还预留有构建柑橘过表达和CRISPR/Prime editing基因编辑改造的酶切位点HpaI和ZraI，以及可用于开发Marker free载体的loxP位点，可作为柑橘遗传转化载体的基本骨架。
10.如权利要求6所述的pHCi12C亚细胞定位表达载体在柑橘和豇豆的瞬时转化和亚细胞定位中的应用。
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