CN114395570A - 一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法 - Google Patents

一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114395570A
CN114395570A CN202111646354.XA CN202111646354A CN114395570A CN 114395570 A CN114395570 A CN 114395570A CN 202111646354 A CN202111646354 A CN 202111646354A CN 114395570 A CN114395570 A CN 114395570A
Authority
CN
China
Prior art keywords
csnced3
citrus
gene
seq
canker
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111646354.XA
Other languages
English (en)
Inventor
龙琴
陈善春
何永睿
邹修平
李强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southwest University
Original Assignee
Southwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southwest University filed Critical Southwest University
Priority to CN202111646354.XA priority Critical patent/CN114395570A/zh
Publication of CN114395570A publication Critical patent/CN114395570A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11051—9-Cis-epoxycarotenoid dioxygenase (1.13.11.51)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法，包括以下步骤：(1)克隆柑橘CsNCED3基因片段；(2)构建CsNCED3基因片段的干扰表达载体；(3)干扰表达载体转化柑橘，得到转基因植株。本发明利用CsNCED3基因沉默，通过克隆柑橘CsNCED3基因片段，进行干扰表达载体构建，然后转化柑橘，得到的转基因植株CsNCED3的表达量显著下调至现有柑橘的29％，溃疡病发病程度可降低至现有柑橘的47％，因而该方法可一定程度上提高植株对溃疡病的抗性。

Description

一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法。
背景技术
柑橘是世界第一大水果，总面积约1.42亿亩，总产量达1.46亿吨。柑橘是仅次于小麦、大豆、棉花和玉米的世界第五大国际贸易农产品。截至2017年底，我国柑橘栽培面积3939 万亩，年产量3839万吨，均列世界第一位。
柑橘溃疡病(Citrus bacterial canker disease)是由地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种 (Xanthomonas axonopodis pv.citri)所引起的一种细菌性病害，是柑橘检疫性病害之一，其为危害包括枝条、皮刺、叶片和果实在内的几乎所有组织，严重时会造成落叶和落果，进一步发展将会导致枝梢枯死和幼树死亡等。果实染病后，也会引起外观和品质变差，产量下降。
柑橘产业中大部分栽培品种属于溃疡病易感品种。全球发生溃疡病的柑橘产区有三分之一左右。近年来，世界范围内主要柑橘产区溃疡病的发生情况日益严峻，对柑橘产业造成了巨大的威胁及经济损失，但该种病害迄今为止无法根治，目前控制柑橘溃疡病的主要措施就是化学防治，不但成本高，而且造成严重的环境污染。因此，随着柑橘溃疡病发生情况的日益严峻，对其进行有效地防治显得尤为重要。
柑橘为无性繁殖植物，遗传背景复杂，并存在珠心胚干扰，柑橘杂交育种效率低下。基因工程育种能高效地对植物进行定向改良，因此成为柑橘定向改良育种的重要手段。
脱落酸(Abscisic acid，ABA)在植物的发育、响应非生物和生物胁迫中起重要作用。 ABA对于植物的生物胁迫应答作用是多方面的。ABA在病原菌感染初期通过关闭气孔以及在细胞壁诱导胼胝质沉积，进而增强植物的抗病性；然而在病原菌入侵植物体内后，ABA通过拮抗其他激素途径(如水杨酸或乙烯的合成途径)来阻碍植物防御。
9–顺式环氧类胡萝卜素裂解双加氧酶(9-cisepoxycarotenoid dioxygenase，NCED)是高等植物ABA生物合成途径中的关键酶和限速酶，其作用是在质体内催化C40的9–顺新黄质和 9–顺紫黄质发生裂解形成ABA的前体物质黄质醛(C15)。ABA合成关键酶基因NCED3的启动被认为是操纵ABA信号产生的关键。目前研究发现，柑橘溃疡病菌侵染‘晚锦橙’后，通过诱导NCED基因的表达来提高ABA生物合成，从而使SA介导的有效防御受到抑制，推测ABA合成基因NCED在柑橘溃疡病发病过程中扮演重要角色。
发明内容
本发明为提高柑橘对溃疡病的抗性，提供一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法，该方法能够显著提高柑橘对溃疡病的抗性。
本发明通过下述技术方案实现：
一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)克隆柑橘CsNCED3基因片段；
(2)构建CsNCED3基因片段的干扰表达载体；
(3)干扰表达载体转化柑橘，得到转基因植株。
具体的：
步骤(1)中，柑橘CsNCED3基因片段的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增得到CsNCED3基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示；PCR扩增所采用的引物为RNAi-CsNCED3-F和RNAi-CsNCED3-R，其核苷酸序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
步骤(2)中，干扰表达载体构建方法为：(2.1)将步骤(1)得到的CsNCED3基因片段分两组，第一组用SwaⅠ和AscⅠ双酶切，第二组用SalⅠ和XbaⅠ双酶切；(2.2)将酶切回收的两组片段同时连接到pUCr干扰载体的相应部位上，得到中间载体pUCr-CsNCED3-RNAi； (2.3)然后将中间载体pUCr-CsNCED3-RNAi和pLGNe表达载体用KpnⅠ和SalⅠ分别进行双酶切；(2.4)将中间载体含有干扰片段的酶切产物连接到pLGNe表达载体的酶切产物上； (2.5)将连接转化至感受态细胞，提取质粒，得到干扰表达载体pLGNe-CsNCED3-RNAi。
pLGNe表达载体带有CaMV 35S启动子和GUS::NPTⅡ融合基因，CaMV 35S启动子为花菜花叶病毒启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，GUS::NPTⅡ用作转基因植株筛选检测，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
步骤(3)中，干扰表达载体转化柑橘的方法为：通过电击法将干扰表达载体质粒导入农杆菌，再用农杆菌介导转化柑橘外植体，遗传转化后的外植体细胞再经离体培养、染色鉴定、嫁接后得到转基因植株。
进一步的，步骤(2)得到转基因植株后，对转基因植株进行抗性评价，判定CsNCED3基因沉默与柑橘溃疡病抗性的相关性。
进一步的，对转基因植株进行抗性评价前，通过PCR验证转基因植株，采用的引物为 ID-CsNCED3-F和ID-CsNCED3-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
进一步的，PCR验证后，用qRT-PCR再次验证转基因植株，目的基因检测采用的引物为RT-CsNCED3-F和RT-CsNCED3-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；内参Actin基因检测采用的引物为RT-CsActin-F和RT-CsActin-R，核苷酸序列分别如SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11所示。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明实施例提供的一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法，通过克隆柑橘CsNCED3基因片段，进行干扰表达载体构建，然后转化柑橘，得到的转基因植株CsNCED3的表达量显著下调至现有柑橘的29％，溃疡病发病程度可降低至现有柑橘的47％，因而得出沉默CsNCED3基因可一定程度上提高植株对溃疡病的抗性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明干扰表达载体的构建流程图；
图2为本发明转基因植株的PCR验证图：R1、R2分别代表2个转基因植株；WT代表野生型对照植株(下同)；
图3为本发明转基因植株的GUS染色验证图；
图4为本发明转基因植株的表型；
图5为本发明转基因植株中CsNCED3的相对表达量：**表示同野生型比较差异极显著 (P＝0.01)(下同)；
图6为本发明转基因植株叶片接种溃疡病菌10天后的发病情况；
图7为本发明转基因植株接种溃疡病菌10天后的病斑面积统计；
图8为本发明转基因植株接种溃疡病菌10天后的发病程度统计。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本发明，未具体描述公知的结构、电路、材料或方法。
在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和、或子组合将特定的特征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘制的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。
在本发明的描述中，术语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”、“竖直”、“水平”、“高”、“低”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1
克隆CsNCED3基因片段
1.RNA提取及cDNA合成
选取柑橘(晚锦橙)叶片0.1g用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(艾德莱，CAT：RN09)提取叶片总RNA，用非变性琼脂糖凝胶电泳验证RNA质量，用浓度计测定其浓度。使用Recombinant DNase I合成cDNA(宝生物)，cDNA于-20℃保存备用。
2.CsNCED3基因片段的PCR扩增
使用引物RNAi-CsNCED3-F和RNAi-CsNCED3-R从柑橘cDNA中扩增获得CsNCED3 片段，片段长度为387bp；
其核苷酸序列如下，SEQ ID NO.3：
AATTTTGTGGTGATCCCGGACCAACAAGTCGTTTTCAAGCTCCAAGAAATGATAAC GGGTGGCTCTCCGGTGATTTATGACAAGAACAAGAAGTCCCGGTTCGGGATTCTTGCAA AGAATGCTAAAGATTCTAACGACATCATCTGGATTGAATCACCGGACACGTTCTGCTTTC ACTTGTGGAACGCTTGGGAGGAGCCGGAAACTGATGAAATTGTTGTCATTGGATCATGC ATGACACCTGCTGACTCAATTTTCAACGAGTGTGACGAGAGTCTGAAGAGTGTTTTATCCGAAATTCGGCTCAATTTAAAGACTGGTGAGTCCACGCGCCGCCAGATTCTCTCGGAGT CTGATCAAGTGAACTTGGAGGCTGGGATGGTGAAT。
引物RNAi-CsNCED3-F的核苷酸序列如下，SEQ ID NO.1：
GCGTCGACGGCGCGCCAATTTTGTGGTGATCCCG；
引物RNAi-CsNCED3-R的核苷酸序列如下，SEQ ID NO.2：
GCTCTAGAATTTAAATATTCACCATCCCAGCCTC；
PCR试剂盒采用Prime STAR master mix(宝生物)。
扩增体系：10X PCR mix：2.5μL；引物RNAi-CsNCED3-F(5μmol/L)：1μL；引物 RNAi-CsNCED3-R(5μmol/L)：1μL；cDNA约60ng；加ddH2O至25μL。
扩增程序：94℃，5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，0.5min，30个循环；72℃延伸10min。
3.DNA片段回收
紫外灯下，用洁净的刀片切下含有目的片段的琼脂糖凝胶块。回收方法参照试剂盒的使用说明进行(艾德莱)，回收片段在浓度测试仪上进行定量。
实施例2
构建CsNCED3干扰表达载体并转化农杆菌
载体构建流程图如图1，其中，GUS::NPTⅡ：β-葡萄糖酸苷酶和新霉素磷酸转移酶的融合基因；CaMV 35S：来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；NOS：冠瘿碱合成酶基因终止子；载体pLGNe具有CaMV 35S启动子调控下的GUS::NPTⅡ融合基因，，便于在植物遗传转化过程中对转化子进行卡那霉素筛选和GUS染色鉴定；T7 promoter：质粒在大肠杆菌内启动转录使用的启动子；T7 transcription start：T7启动子启动转录的起点；所有限制性内切酶购自(THERMO)公司，按照使用说明操作。
其中CaMV 35S启动子的核苷酸序列如下，SEQ ID NO.4：
GTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAG TGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCCACTTGCTTTGAA GACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTG GGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTCAACGATGGCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCAT TTGTAGGAGCCACCTTCCTTTTCCACTATCTTCACAATAAAGTGACAGATAGCTGGGCAA TGGAATCCGAGGAGGTTTCCGGATATTACCCTTTGTTGAAAAGTCTCA
GUS::NPTⅡ融合基因的核苷酸序列如下，SEQ ID NO.5：
ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGAAATCAAAAAACTCGACGGCCTGTG GGCATTCAGTCTGGATCGCGAAAACTGTGGAATTGATCAGCGTTGGTGGGAAAGCGCGT TACAAGAAAGCCGGGCAATTGCTGTGCCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGCCGATGCA GATATTCGTAATTATGCGGGCAACGTCTGGTATCAGCGCGAAGTCTTTATACCGAAAGGT TGGGCAGGCCAGCGTATCGTGCTGCGTTTCGATGCGGTCACTCATTACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCAGGAAGTGATGGAGCATCAGGGCGGCTATACGCCATTTGAAGCCGATG TCACGCCGTATGTTATTGCCGGGAAAAGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAACAACGAA CTGAACTGGCAGACTATCCCGCCGGGAATGGTGATTACCGACGAAAACGGCAAGAAAA AGCAGTCTTACTTCCATGATTTCTTTAACTATGCCGGAATCCATCGCAGCGTAATGCTCTA CACCACGCCGAACACCTGGGTGGACGATATCACCGTGGTGACGCATGTCGCGCAAGACT GTAACCACGCGTCTGTTGACTGGCAGGTGGTGGCCAATGGTGATGTCAGCGTTGAACTG CGTGATGCGGATCAACAGGTGGTTGCAACTGGACAAGGCACTAGCGGGACTTTGCAAG TGGTGAATCCGCACCTCTGGCAACCGGGTGAAGGTTATCTCTATGAACTGTGCGTCACA GCCAAAAGCCAGACAGAGTGTGATATCTACCCGCTTCGCGTCGGCATCCGGTCAGTGGC AGTGAAGGGCCAACAGTTCCTGATTAACCACAAACCGTTCTACTTTACTGGCTTTGGTC GTCATGAAGATGCGGACTTACGTGGCAAAGGATTCGATAACGTGCTGATGGTGCACGAC CACGCATTAATGGACTGGATTGGGGCCAACTCCTACCGTACCTCGCATTACCCTTACGCT GAAGAGATGCTCGACTGGGCAGATGAACATGGCATCGTGGTGATTGATGAAACTGCTGC TGTCGGCTTTAACCTCTCTTTAGGCATTGGTTTCGAAGCGGGCAACAAGCCGAAAGAAC TGTACAGCGAAGAGGCAGTCAACGGGGAAACTCAGCAAGCGCACTTACAGGCGATTAA AGAGCTGATAGCGCGTGACAAAAACCACCCAAGCGTGGTGATGTGGAGTATTGCCAAC GAACCGGATACCCGTCCGCAAGTGCACGGGAATATTTCGCCACTGGCGGAAGCAACGC GTAAACTCGACCCGACGCGTCCGATCACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGCGACGCTCAC ACCGATACCATCAGCGATCTCTTTGATGTGCTGTGCCTGAACCGTTATTACGGATGGTATGTCCAAAGCGGCGATTTGGAAACGGCAGAGAAGGTACTGGAAAAAGAACTTCTGGCCTG GCAGGAGAAACTGCATCAGCCGATTATCATCACCGAATACGGCGTGGATACGTTAGCCG GGCTGCACTCAATGTACACCGACATGTGGAGTGAAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGGAT ATGTATCACCGCGTCTTTGATCGCGTCAGCGCCGTCGTCGGTGAACAGGTATGGAATTTC GCCGATTTTGCGACCTCGCAAGGCATATTGCGCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGGATCTT CACTCGCGACCGCAAACCGAAGTCGGCGGCTTTTCTGCTGCAAAAACGCTGGACTGGC ATGAACTTCGGTGAAAAACCGCGCAGGGAGGCAAACAATGAATCAACAACTCTCCTGG CGCACCATCGTCGGCTACAGCCTCGGGAATTGCTACCGAGCTCGAGCTTGGATGGATTG CACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACA GACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTC TTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCG GCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTG AAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCT CACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACG TACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGC TCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCT CGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTC TGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGG CTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTT ACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCT TCTGA
具体操作如下：实施例1中获得的CsNCED3基因片段的PCR产物回收后分两组，第一组用SwaⅠ和AscⅠ双酶切，第二组用SalⅠ和XbaⅠ双酶切，酶切回收的两组片段同时连接到pUCr干扰载体的相应部位上，得到中间载体pUCr-CsNCED3-RNAi进行测序验证，然后将测序正确的产物和pLGNe超量表达载体用KpnⅠ和SalⅠ分别双酶切，将含有干扰片段的酶切产物连接到pLGNe表达载体上，构建出最终的干扰表达载体pLGNe-CsNCED3-RNAi。质粒提取采用试剂盒(艾德莱)。
用电激法将构建的超量表达载体质粒导入根癌农杆菌EHA105。预先取冻存的EHA105 农杆菌感受态细胞(50μL)，于冰上融化。加入2μL所构建的超量表达载体的质粒于感受态细胞中，吹打混匀后，冰上放置5min。将混合液转入事先吹干的电击杯底(注意避免产生气泡)，并将电击杯放入卡槽调整到正确位点。将电击装置调节为“Agr”档，按下电击按钮，检查电击数据确保电击成功。加入1mL LB液体培养基至电击杯中，移液枪吹打混匀，移至无菌离心管中，260r/min，28℃摇床振荡培养40min。10000r/min将菌液离心1min，弃上清液(剩约100μL重悬菌体)，重悬后用移液枪打到LK固体培养基上(表达载体含有卡那抗性)，涂布均匀，28℃倒置暗培养2d。待菌斑长出后，挑取单菌落至LK液体培养基中，恒温摇床上(28℃)振荡过夜，菌液用于进行PCR验证。
实施例3
遗传转化柑橘(晚锦橙)
1.柑橘实生苗上胚轴的获得
取新鲜柑橘(晚锦橙)洗净，用70％酒精表面消毒，在无菌的条件下取出种子，剥掉种皮，接种在种子萌发培养基上萌发，28℃下暗培养2周，然后在16h光照/8h黑暗的光周期下培养1周。无菌条件下取萌发幼苗上胚轴切成1cm左右的茎段，用于根癌农杆菌的遗传转化。
2.根癌农杆菌的制备
用于转染的农杆菌菌液(含CsNCED3干扰表达载体)加入30％的无菌甘油保存于-70℃的超低温培养箱中。转染前，在含50mg/L卡那霉素的LK固体培养基上划线培养。挑农杆菌单菌落，接种于25ml含有相同抗生素的LK液体培养基中，28℃震荡培养过夜。次日，测浓度后将菌液稀释成OD值0.1的菌液进行二摇，3h后，待菌液处于对数生长期(OD值为 0.5左右)时，于5000r/min离心10min，弃上清，用PH 5.4的MS液体培养基重悬后用于转染。
3.柑橘上胚轴茎段的转化
将切成1cm左右的柑橘(晚锦橙)上胚轴茎段在农杆菌中浸泡13min，期间轻微晃动。取出茎段后将表面的菌液吸干；将茎段转移到共培养培养基中，28℃暗培养2d。
4.转化子的筛选
共培养完成后，将上胚轴转移到筛选培养基中，28℃暗培养7d，外植体在28℃、16h光照/8h黑暗培养，每两周继代一次。
5.转化子的成苗培养
待幼苗长到1cm以上时，将其切下后嫁接到无菌试管晚锦橙苗，在成苗培养基中进行培养；待幼苗长到5cm左右时将其嫁接到枳实生苗上，在温室中进行培养。
其中，根癌农杆菌转化所用培养基如下：
种子萌发培养基：MS+30g/L蔗糖+2.5g/L Gelrite，PH 5.8。
共培养培养基：MS+2mg/L BA+0.5mg/L IAA+1mg/L 2，4–D+100μmol AS+30g/L 蔗糖+2.5g/L Gelrite，PH 5.8。
筛选培养基：MS+2mg/L BA+0.5mg/L IAA+500mg/L Cef+50mg/L Kan+30g/L蔗糖 +2.5g/L Gelrite，PH 5.8。
成苗培养基：MS+30g/L蔗糖，PH 5.8。
实施例4
转基因植株验证
1.外源基因整合的PCR检测
待长到足够大的时候取初筛得到的植株叶片100mg，使用艾德莱公司试剂盒(CAT：DN15)提取基因组DNA，PCR检测CsNCED3干扰片段的整合。PCR反应条件：94℃3min； 94℃30s，58℃30s，72℃30s，30次循环；72℃10min。检测引物为ID-CsNCED3-F和 ID-CsNCED3-R。PCR结果见图2，阳性植株可以得到1072bp的扩增片段对照植株无扩增。经验证得到2个抑制表达转基因植株。
引物ID-CsNCED3-F的核苷酸序列如下，SEQ ID NO.6：
AGTATCTATGAGCCTGTTTGG
引物ID-CsNCED3-R的核苷酸序列如下，SEQ ID NO.7：
GGATGGTGAATTCTAGACTCA
2.转基因植株GUS染色鉴定
将转基因植株叶片，进行GUS组织化学染色，如图3所示，阳性植株叶片显蓝色，野生型植株叶片为白色。
3.转基因植株表型观察
观察分析2株转基因植株童期表型，与野生型对照无明显差异，干扰表达CsNCED3基因并未对植株的表型和发育产生直接的明显的变化。
实施例5
CsNCED3基因表达的qRT-PCR分析
提取柑橘叶片，使用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(艾德莱，CAT NO.RN09)提取叶片总RNA，用非变性琼脂糖凝胶电泳验证RNA质量，用浓度计测定其浓度。使用Recombinant DNase I合成cDNA(宝生物)。目的基因的检测引物为RT-CsNCED3-F和 RT-CsNCED3-R；内参基因Actin的检测引物为RT-CsActin-F和RT-CsActin-R。
引物RT-CsNCED3-F的核苷酸序列如下，SEQ ID NO.8：
ATAGGCGAATTACACGGACACA
引物RT-CsNCED3-R的核苷酸序列如下，SEQ ID NO.9：
GATCATCTTCGGACATTGCTAAAA
引物RT-CsActin-F的核苷酸序列如下，SEQ ID NO.10：
CATCCCTCAGCACCTTCC
引物RT-CsActin-R的核苷酸序列如下，SEQ ID NO.11：
CCAACCTTAGCACTTCTCC
反应体积20μL，反应条件：95℃3min，94℃10s；56℃10s，72℃10s，40次循环；72℃10min。实验重复三次。采用2-△△Ct法计算转基因植株中CsNCED3基因的相对表达量：定义水处理的样本为参照因子，即其CsNCED3的表达水平为1，然后计算转基因柑橘中相对参照因子基因表达的倍数2-△△Ct，为其相对表达量。检测结果见图5。结果显示，CsNCED3 基因在转基因植株中相比野生型植株被较大程度沉默，表达量最高下调至现有柑橘的29％。
实施例6
转基因植株的抗性评价
采集成熟叶片清洗后用75％的酒精消毒后置于超纯水中冲洗，置于超净台；以叶脉为中心进行针刺，六针为一组，每侧两组；用移液器点样溃疡病菌液，每针孔点样1μL(1X105 CFU/mL)。然后将柑橘叶片的叶柄用浸湿的脱脂棉包裹，石蜡带密封于培养皿，于28℃恒温光照培养箱中培养(16h光照/8h黑暗)。对照组用LB代替溃疡病菌菌液，其他操作保持一致。叶片点菌后培养10天拍照，用Image J V1.47软件统计病斑大小(Lesion sizes,LS,mm2)。根据病情指数公式计算发病程度(Disease index,DI)。按照病斑面积将病情分为0-7共8级，以字母R表示病斑面积，0级(R≤0.25mm2)，1级(0.25mm2＜R≤0.5mm2)，2级(0.5mm2＜R≤0.75mm2)，3级(0.75mm2＜R≤1mm2)，4级(1.0mm2＜R≤1.25mm2)，5级(1.25mm2＜R≤1.5mm2)，6级(1.5mm2＜R≤1.75mm2)，7级(R＞1.75mm2)；根据公式计算发病程度：DI＝100XΣ【各级病斑数X相应级数值】/(病斑总数X最大级数)。
接种溃疡病菌10天后，转基因植株叶片上病斑大小与野生型柑橘叶片上存在大小差异 (图6)。对柑橘叶片上的病斑大小和病情指数进行统计后，发现转基因植株叶片上的病斑面积(图7)和发病程度(图8)均小于野生型柑橘叶片，尤其是R2，病情指数仅为野生型柑橘叶片的47％。
由此可见，CsNCED3的沉默可一定程度上降低溃疡病的病斑面积，减轻溃疡病的发病程度。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)克隆柑橘CsNCED3基因片段；
(2)构建CsNCED3基因片段的干扰表达载体；
(3)干扰表达载体转化柑橘，得到转基因植株。
2.根据权利要求1所述的一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤(1)中，柑橘CsNCED3基因片段的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增得到CsNCED3基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR扩增所采用的引物为RNAi-CsNCED3-F和RNAi-CsNCED3-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤(2)中，干扰表达载体构建方法为：(2.1)将步骤(1)得到的CsNCED3基因片段分两组，第一组用SwaⅠ和AscⅠ双酶切，第二组用SalⅠ和XbaⅠ双酶切；(2.2)将酶切回收的两组片段同时连接到pUCr干扰载体的相应部位上，得到中间载体pUCr-CsNCED3-RNAi；(2.3)然后将中间载体pUCr-CsNCED3-RNAi和pLGNe表达载体用KpnⅠ和SalⅠ分别进行双酶切；(2.4)将中间载体含有干扰片段的酶切产物连接到pLGNe表达载体的酶切产物上；(2.5)将连接转化至感受态细胞，提取质粒，得到干扰表达载体pLGNe-CsNCED3-RNAi。
5.根据权利要求4所述的一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，pLGNe表达载体带有CaMV 35S启动子和GUS::NPTⅡ融合基因，CaMV 35S启动子为花菜花叶病毒启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，GUS::NPTⅡ用作转基因植株筛选检测，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
6.根据权利要求1所述的一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤(3)中，干扰表达载体转化柑橘的方法为：通过电击法将干扰表达载体质粒导入农杆菌，再用农杆菌介导转化柑橘外植体，遗传转化后的外植体细胞再经离体培养、染色鉴定、嫁接后得到转基因植株。
7.根据权利要求1所述的一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤(2)得到转基因植株后，对转基因植株进行抗性评价，判定CsNCED3基因沉默与柑橘溃疡病抗性的相关性。
8.根据权利要求7所述的一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，对转基因植株进行抗性评价前，通过PCR验证转基因植株，采用的引物为ID-CsNCED3-F和ID-CsNCED3-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
9.根据权利要求8所述的一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，PCR验证后，用qRT-PCR再次验证转基因植株，目的基因检测采用的引物为RT-CsNCED3-F和RT-CsNCED3-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
10.根据权利要求9所述的一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，内参Actin基因检测采用的引物为RT-CsActin-F和RT-CsActin-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。
CN202111646354.XA 2021-12-29 2021-12-29 一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法 Pending CN114395570A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111646354.XA CN114395570A (zh) 2021-12-29 2021-12-29 一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111646354.XA CN114395570A (zh) 2021-12-29 2021-12-29 一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114395570A true CN114395570A (zh) 2022-04-26

Family

ID=81229378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111646354.XA Pending CN114395570A (zh) 2021-12-29 2021-12-29 一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114395570A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110295183A (zh) * 2019-07-29 2019-10-01 西南大学 一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法
CN114990115A (zh) * 2022-05-23 2022-09-02 赣南师范大学 优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子和CsUAP56小内含子构建的载体和应用
CN115820685A (zh) * 2022-08-22 2023-03-21 西南大学 一种柑橘CsGSTF1基因及其应用
CN116355955A (zh) * 2023-04-25 2023-06-30 西南大学 一种利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2564807A1 (en) * 2004-04-23 2005-11-10 Ceres Inc. Methods and materials for improving plant drought tolerance
CN102747093A (zh) * 2012-07-24 2012-10-24 华中农业大学 一种柑橘CrNCED1基因及其在植物抗非生物胁迫中的应用
WO2013137490A1 (ja) * 2012-03-15 2013-09-19 独立行政法人理化学研究所 植物の形態形成および／または環境ストレス耐性に関与するポリペプチド
CA3022345A1 (en) * 2016-04-27 2017-11-02 Nexgen Plants Pty Ltd Construct and vector for intragenic plant transformation
CN107828805A (zh) * 2017-11-18 2018-03-23 复旦大学 水稻环氧类胡萝卜素双加氧酶OsNCED3基因编码序列及其应用
CN110283824A (zh) * 2019-07-25 2019-09-27 西南大学 一种利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2564807A1 (en) * 2004-04-23 2005-11-10 Ceres Inc. Methods and materials for improving plant drought tolerance
CN1973044A (zh) * 2004-04-23 2007-05-30 塞雷斯公司 用于提高植物耐旱性的方法和材料
WO2013137490A1 (ja) * 2012-03-15 2013-09-19 独立行政法人理化学研究所 植物の形態形成および／または環境ストレス耐性に関与するポリペプチド
CN102747093A (zh) * 2012-07-24 2012-10-24 华中农业大学 一种柑橘CrNCED1基因及其在植物抗非生物胁迫中的应用
CA3022345A1 (en) * 2016-04-27 2017-11-02 Nexgen Plants Pty Ltd Construct and vector for intragenic plant transformation
CN107828805A (zh) * 2017-11-18 2018-03-23 复旦大学 水稻环氧类胡萝卜素双加氧酶OsNCED3基因编码序列及其应用
CN110283824A (zh) * 2019-07-25 2019-09-27 西南大学 一种利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEE SU 等: "Drought Stress-Mediated Transcriptome Profile Reveals NCED as a Key Player Modulating Drought Tolerance in Populus davidiana", 《FRONT PLANT SCI》 *
LONG Q 等: "Abscisic Acid Promotes Jasmonic Acid Accumulation and Plays a Key Role in Citrus Canker Development", 《FRONT PLANT SCI》 *
武军艳 等: "白菜型冬油菜NCED3基因、启动子的克隆及其表达分析", 《干旱地区农业研究》 *
谢宇等: "柑橘 CsNCED3-2 的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析", 《园艺学报》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110295183A (zh) * 2019-07-29 2019-10-01 西南大学 一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法
CN110295183B (zh) * 2019-07-29 2023-05-02 西南大学 一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法
CN114990115A (zh) * 2022-05-23 2022-09-02 赣南师范大学 优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子和CsUAP56小内含子构建的载体和应用
CN114990115B (zh) * 2022-05-23 2023-08-18 赣南师范大学 优化的柑橘Ccl-eEF1a启动子和CsUAP56小内含子构建的载体和应用
CN115820685A (zh) * 2022-08-22 2023-03-21 西南大学 一种柑橘CsGSTF1基因及其应用
CN115820685B (zh) * 2022-08-22 2023-09-12 西南大学 一种柑橘CsGSTF1基因及其应用
CN116355955A (zh) * 2023-04-25 2023-06-30 西南大学 一种利用CsEXPA8基因表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7321477B2 (ja) 植物のゲノム編集方法
CN106957855B (zh) 使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻矮杆基因SD1的方法
Manickavasagam et al. Agrobacterium-mediated genetic transformation and development of herbicide-resistant sugarcane (Saccharum species hybrids) using axillary buds
CN114395570A (zh) 一种利用CsNCED3基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法
CN110819607B (zh) CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用
CN110283824B (zh) 一种利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法
JP2017205103A (ja) 形質転換植物の作製方法
CN110295183B (zh) 一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法
CN115058449B (zh) 一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法
WO2000012735A9 (en) Transgene assay using stable agrobacterium rhizogenes transformation
Tyagi et al. Regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of a popular indica rice variety, ADT39
Wang et al. Transgenic wheat plants derived from Agrobacterium-mediated transformation of mature embryo tissues
Krasnyanski et al. Effect of an enhanced CaMV 35S promoter and a fruit-specific promoter on uida gene expression in transgenic tomato plants
CN112322631B (zh) 一种抗草甘膦转基因大豆的培育方法
EP1915453B1 (en) Marker-free plant transformation
US11499158B2 (en) Method for modifying plant
El-Siddig et al. Agrobacterium-mediated transformation of tomato plants expressing defensin gene
CN106086063B (zh) 一种基于同尾酶构建的RNAi载体及其应用
CN107475174B (zh) 转化油菜的方法
KR101918590B1 (ko) 식물의 가뭄 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도
KR100496029B1 (ko) 들깨 형질전환 방법과 그에 의해 생산된 제초제 저항성들깨
CN113136388B (zh) 水稻OsMAPKKK5基因在改良水稻的株高和粒型方面的应用
CN114958866B (zh) 调控大豆分枝数的基因及其用途
CN110194791B (zh) Spl3蛋白在调控植物花序或果柄发育中的用途
WO2021070549A1 (ja) コムギのゲノム編集方法、及びその利用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20220426

RJ01 Rejection of invention patent application after publication