CN1973044A - 用于提高植物耐旱性的方法和材料 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了分离的NCED3核酸和多肽，以及应用这样的核酸和多肽制备具有增强的耐旱性的转基因植物的方法。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2004年4月23日提交的美国临时申请系列号60/565,028的优先权，其全部并入本申请作为参考。
发明领域
本发明涉及NCED3核酸和多肽，并且涉及那些核酸和多肽用于制备具有提高的耐旱性的转基因植物的应用。
发明背景
在农业和林业领域，为了供给不断增长的世界人口和保证可再生原料的供应，已经努力生产具有增加的生长潜力的植物。传统上这通过植物育种进行。然而，育种过程是耗费时间和劳动力密集型的。并且，对于每一种相关的植物种类必须进行适当的育种计划。
另外，植物不断地暴露于各种生物的(例如，病原体感染和昆虫的吞噬)和非生物的(例如，高温或低温，干旱，和盐度)胁迫。为了在这些挑战下存活，植物发育了精细的机制，以感知外界信号，并且表现出具有适当的生理和形态学变化的适应性反应(Bolmert等.，1995 Plant Cell，7：1099-1111)。暴露于低水分或干旱条件的植物典型地具有低产量的植物材料、种子、果实和其它可食用的产物。世界的一些地区持续具有非常少的降雨，并且因此存在为它们的人口而生长足够的粮食作物的问题。但是，已经观察到一些植物在缺水的环境下存活并且生长茂盛。为了避免对育种过程的依赖，鉴定赋予提高的耐旱性的基因将有效地使得能够制备具有提高的耐旱性特征的转化植物(诸如作物植物)。
发明概述
本文献涉及用于在植物中增加生长潜力和耐旱性的材料和方法，其特征在于稳定地整合到植物基因组的多聚核苷酸的表达。因此，本文献涉及分离的核酸，由其编码的多肽，和它们在转基因植物中的包含。本申请提供的转基因植物相对于对照植物可以具有必要的表型特征，诸如提高的耐旱性。本文献还涉及由于提高的耐旱性而具有增加的生长潜力的植物。
一方面，本发明着重描述一种分离的核酸，其包含编码与SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。所述分离的核酸还可以包含有效连接到编码所述多肽的核苷酸序列上的控制元件。控制元件可以是广泛表达型启动子，胁迫诱导型启动子，或干旱诱导型启动子。所述分离的核酸还可以含有可选择的标记。所述多肽可以具有同SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少98.7％的同源性，至少99％的同源性，或至少99.5％的同源性的氨基酸序列。
另一方面，本发明着重描述一种纯化的多肽，其具有同SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列。所述多肽可以具有同SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少98.7％的同源性，至少99％的同源性，或至少99.5％的同源性的氨基酸序列。
另一方面，本发明着重描述含有至少一种外源核酸的转基因植物，所述至少一种外源核酸含有编码具有同SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。相对于缺少编码所述多肽的核苷酸序列的相同遗传背景的相应植物，所述转基因植物可以在干旱条件下展现出更高的生长速率。相对于缺少编码所述多肽的核苷酸序列的相同遗传背景的相应植物，所述转基因植物可以展现出增强的干旱恢复性(drought-recovery)。相对于缺少编码所述多肽的核苷酸序列的相同遗传背景的相应植物，所述转基因植物可以展现出更低的蒸腾速率。所述至少一种外源核酸可以编码双子叶植物的9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase)。对于所述至少一种外源核酸，所述转基因植物可以是半合子的或纯合子的。所述转基因植物可以是F1代植物，F2代植物，BC1代植物，或BC2代植物。所述转基因植物可以是有繁殖能力的。转基因植物可以是双子叶的。转基因植物可以是单子叶的(例如，玉蜀黍，小麦属，黑麦属，大麦属，燕麦属，稻属，稷属，高梁属，肯塔基蓝草，须芒草属，弯叶画眉草，或羊茅属)。本发明还着重描述本文所描述的转基因植物的种子。
另一方面，本发明着重描述用于产生转基因植物的方法。所述方法包括(a)向植物细胞中引入至少一种外源核酸，以产生转化的植物细胞，其中所述至少一种外源核酸含有编码具有同SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，和(b)从所述转化的植物细胞产生转基因植物。相对于缺少编码所述多肽的核苷酸序列的相同遗传背景的相应植物，所述转基因植物可以在干旱条件下展现出更高的生长速率。相对于缺少编码所述多肽的核苷酸序列的相同遗传背景的相应植物，所述转基因植物可以展现出增强的干旱恢复性。相对于缺少编码所述多肽的核苷酸序列的相同遗传背景的相应植物，所述转基因植物可以展现出更低的蒸腾速率。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有同本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意思。尽管与本文所描述的那些相似或等价的方法和材料可以用于实施或检验本发明，但是下文描述了适当的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、和其它参考文献都全部并入作为参考。在有冲突的情形中，本说明书，包括定义，将能够控制。另外，所述材料、方法和实例仅是举例说明，并不意欲成为限制。
本发明的其它特征、目的和优点将通过详述和附图，和通过权利要求而显而易见。
附图简述
图1是ABA生物合成的图示。NCED编码9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶，其催化黄氧素(xanthoxin)，ABA生物合成中的一种关键中间物的产生。
图2A列出从拟南芥(Arabidopsis thaliana)WS生态型分离的NCED3cDNA序列(SEQ ID NO：1)。图2B列出所编码的NCED3多肽序列(SEQ IDNO：2)。
图3列出9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的共有氨基酸序列(SEQID NO：3)。符号″<>″表明氨基酸的可变数目。例如，<1>表示直到1(例如，0或1)个任何类型的氨基酸是允许的；<18>表示直到18(例如，0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，或18)个任何类型的氨基酸是允许的。
图4是举例说明在表现出存在或不存在转基因NCED3表达的证据的R2代秧苗之间蒸腾速率比较的图表。
发明详述
植物激素ABA是倍半萜类化合物激素，其在许多生理过程中起着重要的作用，包括种子发育和休眠，植物性(vegetative)生长，和对环境胁迫的反应。当植物经受干旱、盐或温度胁迫时，ABA水平增加，并且已经表明这些增加的水平对于胁迫耐受性是必要的(Xiong和Zhu(2003)Plant Physiol.133：29-36)。在胁迫发生之前调节ABA水平也给植物提供更好的胁迫耐受性。
ABA是通过分解四十碳类胡萝卜素前体接着通过ABA醛的黄氧素的两步转化而合成的(图1；Taylor等.(2000)J.Exp.Bot.51：1563-1574；和Finkelstein等.(2002)Plant Cell 14 Suppl：S15-S45)。已经鉴定了一些参与ABA生物合成的拟南芥基因。这些基因之一是NCED3，编码9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)的基因，所述9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶催化黄氧素，ABA生物合成中的一种主要中间物的产生。如本文所述，过量表达NCED3以致改变内生ABA水平的转基因植物可以更好地抵挡胁迫性(例如，干旱)条件。
多聚核苷酸和多肽
本发明提供了分离的NCED(例如，NCED3)核酸和多肽。术语“核酸”或“多聚核苷酸”在本文中可以互换地应用，并且是指RNA和DNA，包括cDNA，基因组DNA，合成的(例如，化学合成的)DNA，和含有核酸类似物的DNA(或RNA)。多聚核苷酸可以具有任何三维空间结构。核酸可以是双链的或单链的(即，有义链或反义单链)。多聚核苷酸的非限制性实例包括基因，基因片段，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转运RNA，核糖体RNA，核酶，cDNA，重组多聚核苷酸，分支多聚核苷酸，质粒，载体，分离的任何序列的DNA，分离的任何序列的RNA，核酸探针，和引物，以及核酸类似物。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分、或磷酸骨架上进行修饰，以提高，例如，核酸的稳定性、杂交性、或溶解性。对骨架的修饰包括应用不带电荷的连接(例如，磷酸甲酯，磷酸三酯，磷酰胺(phosphamidates)，或氨基甲酸)和带电荷的连接(例如，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)。对骨架的修饰还可以结合肽连接，例如，以形成PNA-型连接。在碱基部分的修饰可以包括，例如，用脱氧尿苷取代脱氧胸苷，和用5-甲基-2′-脱氧胞苷或5-溴-2′-脱氧胞苷取代脱氧胞苷。糖部分的修饰可以包括，例如，修饰核糖的2′羟基形成2′-O-甲基或2′-O-烯丙基糖。还可以修饰磷酸脱氧核糖骨架，以产生吗啉代核酸，其中每个碱基部分连接六元吗啉环，或产生肽核酸，其中脱氧磷酸骨架被假肽骨架取代，并且保留4个碱基。参见，Summerton和Weller(1997)AntisenseNucleic Acid Drug Dev.7(3)：187-195；和Hyrup等.(1996)Bioorgan.Med.Chem.4(1)：5-23。另外，例如，脱氧磷酸骨架可以被硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯骨架，磷酰胺，或烷基磷酸酯骨架取代。
当用于本文时，“分离的”，当指核酸时，是指从在基因组，例如植物基因组中存在的其它核酸分离的核酸，其包括通常侧连在所述基因组的核酸的一侧或两侧的核酸。用在本文时，关于核酸的术语“分离的”还包括任何非天然存在的序列，由于这样的非天然存在的序列没有在天然中发现，并且在天然存在的基因组中没有直接相邻的序列。
例如，分离的核酸或多聚核苷酸可以是DNA分子，条件是在天然存在的基因组中通常发现直接与所述DNA分子侧连的核酸序列之一被移除或不存在。因此，分离的核酸包括，但不限于，作为不依赖于其它序列的分离的分子(例如，化学合成的核酸，或由PCR或限制性核酸内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)而存在的DNA分子，以及结合到载体、自主复制的质粒、病毒(例如，副反转录病毒，反转录病毒，慢病毒，腺病毒，或疱疹病毒)上的DNA，或原核生物或真核生物的基因组DNA。另外，分离的核酸可以包括工程核酸，诸如作为杂合或融合核酸的部分的DNA分子。例如，在cDNA文库或基因组文库，或含有基因组DNA限制性消化液的凝胶切片上成百到上百万其它核酸中存在的核酸，不被认为是分离的核酸。
当用于本文时，术语“多肽”是指两个或多个亚基氨基酸、氨基酸类似物、或其它肽模拟物的化合物，而不管翻译后的修饰(例如，磷酸化和糖基化)。所述亚基可以通过肽键或其它键连接，例如，酯或醚键。术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括D/L光学异构体。通过这一定义包括全长的蛋白、类似物、突变体及其片段。
关于多肽的“分离的”或“纯化的”，意指在某种程度上所述多肽与其通常在天然发现的细胞成分(例如，其它多肽，脂质，碳水化合物，和核酸)分离。纯化的多肽可以在非还原多聚丙稀酰胺凝胶上产生单一的主带。纯化的多肽可以是至少约75％的纯度(例如，至少80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％，或100％纯度)。例如，纯化的多肽可以通过从天然来源提取，通过化学合成，或通过在宿主细胞或转基因植物中重组生产获得，并且可以应用，例如，亲和层析，免疫沉淀，大小排阻层析，和离子交换层析而纯化。纯化可以应用，但不限于，柱层析，聚丙烯酰胺凝胶电泳，或高效液相色谱而测定。
当本文所提供的多聚核苷酸和多肽非天然表达时(例如，关于在植物中的定位，诸如根对茎；环境条件；植物种类；发育时间；和/或以增加或减少的量)，它们可以产生对干旱条件具有改变的反应的植物。这些反应包括，例如，在干旱条件下更快的生长速率，增强的干旱恢复性，或更低的蒸腾速率，如由本文所讨论的转基因植物分析所证明的那样。这些特点可以用来应用或最大化植物产物。例如，本文所提供的核酸可以用来产生这样的转基因植物，即，其在不利环境条件下具有对生理性植物表现重要的一种或多种基因(例如，NCED3)的增加的表达。这样的转基因植物可以需要更少的水分，导致为农民减少成本并且在干旱条件下有更好的产量，如本文所讨论的那样。因此，本文所提供的多聚核苷酸和多肽可以有效用于制备在农业和林业产业具有特殊应用的转基因植物。
本发明的多聚核苷酸包括编码NCED多肽的核酸。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，图2A和2B所示，分别列出了拟南芥NCED3多聚核苷酸和多肽序列。SEQ ID NO：3，图3所示，列出了共有NCED序列。本发明包括这些序列以及与具有图2B或图3所示的氨基酸序列的多肽功能相当的蛋白(和编码这样的蛋白的核苷酸)的同系物和直向同源物。还考虑了所描述的多聚核苷酸(和所编码的多肽)的片段、融合体、补体、和反式补体。
多肽的同系物和直向同源物也可以叫作“功能相当”的多肽。“功能相当”的多肽是具有至少一种共同特征的多肽。这样的特征可以包括，例如，序列相似性或同源性，生化活性，转录模式，和表型活性。例如，具有相似生化活性的功能相当的多肽可以能够在相同的反应物上作用给出相同的产物。这样“生化相当”的多肽可以或可以不表现出相同的动力学，对反应物的亲和性，或产生所述产物的周转时间，但是，由于产生了相同的终产物，所以仍认为是功能相当的。例如，功能相当的多肽可以表现出至少60％的具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3列出的氨基酸序列的9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的生化活性，例如，至少70％，80％，90％，或95％的生化活性。用于评估生化活性的方法包括本领域普通技术人员已知的那些方法，并且包括，例如，酶促检测和放射性示踪剂摄取检测。
另一类功能相当的多肽，本文叫作“表型相当物(phenotypiccomparables)”，可以影响相同的物理特征，诸如植物大小或高度或新陈代谢模式。即使多肽影响相同的物理特征，但是到不同的程度，还是可以认为多肽是表型相当的。例如，表型相当的多肽影响相同的特征(例如，导致增加的高度)，其中由相当的多肽之一引起的定量测定是另一个的大约20％或更多；例如，约20-30％；约30-40％；约40-50％；约50-60％；约60-70％；约70-80％；约80-90％；或约90-100％。因此，尽管一种蛋白将植物高度增加10％和另一种将植物高度增加15％，但是两种多肽可以是表型相当物。
共有NCED序列氨基酸序列，诸如在图3中列出的序列，可以通过将9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶序列与各种植物种类相比对，并且确定每个位置上的最常见的氨基酸或氨基酸类型而确定。例如，共有序列可以通过比对来自下列各项的氨基酸序列而确定：拟南芥NCED3(GenBank登记号BAB01336)，鳄梨属NCED3(GenBank登记号AAK00623.1)，鳄梨属9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(GenBank登记号AAK00632.1)，拟南芥At3g14440多肽序列(GenBank登记号NP 188062.1)，拟南芥推定的9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(GenBank登记号AAL07104.1)，大豆属推定的9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(Cere克隆号528092)，菜豆属9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(GenBank登记号AAF26356.1)，豌豆属NCED2(GenBank登记号BAC10550.1)，豌豆属NCED3(GenBank登记号BAC10551.1)，豇豆属新黄质裂解酶(GenBank登记号BAB11932.1)，番茄属9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(GenBank登记号T07123)，马铃薯可能的9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(GenBank登记号T51936)，莴苣属9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(GenBank登记号AAK94454.1)，小麦属9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(Ceres克隆号704111)，玉蜀黍母体萌芽-14多肽(GenBank登记号T04351)，和来自染色体4，BAC克隆OSJNBb0080H08的稻属多肽序列(GenBank登记号CAE02392.2)。这样的比对可以用来产生诸如SEQ ID NO：3(图3)列出的共有序列。
本文所提供的分离的多肽可以展现出同SEQ ID NO：2列出的NCED3序列或SEQ ID NO：3列出的共有NCED序列的不同水平的序列同源性。如下文所描述的那样，例如，分离的核酸可以包括编码具有同图2B列出的NCED3序列(SEQ ID NO：2)，或同图3列出的共有NCED序列(SEQ IDNO：3)有至少90％同源性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。这样的多肽可以用来，例如，制备具有在干旱条件下更快的生长速率，增强的干旱恢复性，和/或更低的蒸腾速率的转基因植物。
本文所提供的多肽可以具有同SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3列出的氨基酸序列有至少90％同源性(例如，95％，96％，97％，98％，98.1％，98.2％，98.3％，98.4％，98.5％，98.6％，98.7％，98.9％，99.0％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4，99.5％，99.6％，或100％序列同源性)的氨基酸序列。类似地，本文所提供的核酸可以具有同SEQ ID NO：1列出的核苷酸序列有至少90％的序列同源性(例如，95％，96％，97％，98％，98.1％，98.2％，98.3％，98.4％，98.5％，98.6％，98.7％，98.9％，99.0％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4，99.5％，99.6％，或100％序列同源性)的核苷酸序列。序列同源性是指任何给出的查询序列(例如，NCED3序列)和目标序列(例如，SEQ ID NO：2列出的NCED3序列)之间的同源性程度。对于任何查询核酸或氨基酸序列相对于另一目标核酸或氨基酸序列的百分比同源性确定如下。
应用程序ClustalW，其允许跨越它们的全长比对DNA和蛋白序列(总体比对)，将查询核酸或氨基酸序列与一种或多种目标核酸或氨基酸序列相比较和比对。ClustalW计算所选择的序列的最佳匹配，并且将它们排列起来，以致可以检验同源性、相似性和差异性(Thompson等.(1994)Nucl.Acids Res.22：4673-4680)。可以将一个或多个残基的缺口插入到查询或目标序列中，以最大化序列比对。所述结果反映序列之间的关系。ClustalW可以在线运行，例如，应用ClustalW版本1.83，默认的参量，在BaylorCollege of Medicine Search Launcher网址(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align)和在万维网上的European Bioinformatics Institute网址上运行。对于核酸序列的快速成对比对，应用下述默认的参量：词的大小：2；窗口大小：4；得分方法：百分数；顶端对角线数目：4；和缺口罚分(penalty)：5。对于核酸序列的多重比对，应用下述参量：缺口开放罚分：10.0；缺口延伸罚分：5.0；和重量转换：是。对于蛋白序列的快速成对比对，应用下述参量：词的大小：1；窗口大小：5；得分方法：百分数；顶端对角线数目：5；缺口罚分：3。对于蛋白序列的多重比对，应用下述参量：重量基质：blosum；缺口开放罚分：10.0；缺口延伸罚分：0.05；亲水性缺口：开启；亲水性残基：Gly，Pro，Ser，Asn，Asp，Gln，Glu，Arg，和Lys；残基特异性缺口罚分：开启。
为了确定查询序列和目标序列之间的同源性百分数，将匹配的碱基或氨基酸数目除以碱基或氨基酸的全部数目，并且乘以100。例如，如果查询序列和主题序列各为500个碱基对长，并且具有200个匹配的(或相同的)碱基，那么所述目标序列将具有对于所述查询序列40％的序列同源性。如果两种比较的序列是不同的长度，那么将匹配的数目除以两种序列长度中更短的序列。例如，如果在400个氨基酸的查询多肽和500个氨基酸的目标多肽之间有100个氨基酸匹配，那么这些多肽将具有同查询多肽25％的同源性。
应该理解，与目标序列比对的查询核苷酸和氨基酸序列可以导致许多不同的长度，每一长度具有其本身的百分数同源性。另外，应该注意到，同源性百分数值可以四舍五入到最接近的十分之一。例如，将78.11，78.12，78.13，和78.14四舍五入到78.1，而将78.15，78.16，78.17，78.18，和78.19四舍五入到78.2。还应该注意到，长度值应该总是整数。
本文提供的多肽可以具有SEQ ID NO：2列出的NCED3氨基酸序列。备选地，多肽可以具有SEQ ID NO：2列出的NCED3氨基酸序列，限定条件是所述多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO：2在选自由位置18，42，83，145，184，239，271，285，447和485组成的组的1-9个(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，或9个)位置具有取代。例如，多肽可以具有SEQ ID NO：2列出的NCED3氨基酸序列，限定条件是所述多肽具有位置18的天冬酰胺，位置42的丝氨酸，位置83的苏氨酸，位置145的亮氨酸，位置184的组氨酸，位置239的天冬氨酸，位置271的谷氨酸，位置285的天冬氨酸，位置447的丝氨酸，或位置485的甲硫氨酸，或所公布的组的直到9个位置的任意其组合。
重组构建体，载体和宿主细胞
还提供了含有诸如本文所描述的那些核酸的载体。“载体”是一种复制子，诸如质粒，噬菌体，或黏端质粒，其中可以插入其它DNA片段，以便引起所插入的片段的复制。一般地，当与适当的控制元件缔合时，载体能够复制。适当的载体骨架包括，例如，本领域通常应用的那些，诸如质粒，病毒，人工染色体，BACs，YACs，或PACs。术语“载体”包括克隆和表达载体，以及病毒载体和整合载体。“表达载体”是包括一种或多种表达控制序列的载体，并且“表达控制序列”是控制并且调控另一DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。适当的表达载体包括，但不限于，质粒，和衍生于，例如，噬菌体、baculoviruses、烟草花叶病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、牛痘病毒、腺病毒以及腺相关病毒的病毒载体。许多载体和表达系统可从公司，诸如Novagen(Madison，WI)，Clontech(Palo Alto，CA)，Stratagene(La Jolla，CA)，和Invitrogen/Life Technologies(Carlsbad，CA)商购。
术语“调控序列”，“控制元件”，和“表达控制序列”是指影响转录和翻译起始和速率，和所述转录物和多肽产物的稳定性和/和迁移性的核苷酸序列。调控序列包括，但不限于，启动子，启动子控制元件，蛋白结合序列，5′和3′不翻译区(UTRs)，转录起始位点，终止序列，多聚腺苷化序列，内含子，和位于编码序列内的其它调控序列。当用于本文时，“有效连接”意指结合到遗传构建体中，以便表达控制序列有效地控制目的编码序列的表达。当RNA聚合酶能够将所述编码序列转录成mRNA时，然后mRNA可以被翻译成由所述编码序列编码的蛋白时，编码序列在细胞中被“有效地连接”并且“受控于”表达控制序列。
启动子是一种表达控制序列，其由DNA分子的一个区域组成，典型地在转录起始点上游100个核苷酸内(对于RNA聚合酶II通常在起始位点附近)。启动子参与RNA聚合酶和其它蛋白的识别和结合，以起始和调节转录。为了使得编码序列受控于启动子，典型地，有必要使得所述多肽的翻译阅读框的翻译起始位点位于启动子下游第1个和大约第50个核苷酸之间。
基本的启动子是组装转录起始所需要的转录复合物必需的最小序列。基本启动子通常包括"TATA盒"元件，其通常位于转录起始位点上游大约第15和约35个核苷酸之间。基本启动子还可以包括"CCAAT盒″元件(典型地CCAAT序列)和/或GGGCG序列，其通常位于转录起点上游大约第40和约200个核苷酸，优选地大约第60和约120个核苷酸之间。
在大多数，但不必要是全部的，环境条件和发育状态或细胞分化下，称为“组成型启动子”的启动子可以促进转录。组成型启动子的非限制性实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区域，衍生于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的1′或2′启动子，p32449(SEQ IDNO：4)，p13879(SEQ ID NO：5)，和许多植物基因的其它转录起始区域，诸如玉米泛蛋白-1启动子，是为本领域的技术人员已知的。
当它在许多，但不必是所有，植物组织中促进转录时，启动子可以称为是“广泛表达型的”。例如，广泛表达型启动子可以促进有效连接的序列在茎，枝条，茎尖(苗端)，和叶片中的一种和多种中的转录，但是可以微弱地或完全不促进在组织，诸如花和发育的种子的繁殖组织中的转录。例如，有效地连接到编码序列上的广泛表达型启动子可以以比在发育的种子中的转录水平高出至少2倍(例如，至少3，5，10，或20倍)的水平促进在植物枝条中的转录。备选地或另外，广泛表达型启动子可以以比在花的繁殖组织中的转录水平高出至少2倍(例如，至少3，5，10，或20倍)的水平促进在植物枝条中的转录。广泛表达型启动子实例包括，但不限于，p326(SEQ ID NO：6)，YP0050(SEQ ID NOS：7和8)，YP0144(SEQ IDNOS：9和10)和YP0190(SEQ ID NOS：11和12)。
“植物启动子”是能够在植物细胞中起始(促进)转录的启动子。这样的启动子不必是植物源性的。例如，衍生于植物病毒的启动子，诸如CaMV35S启动子，或衍生于根癌农杆菌的启动子，诸如T-DNA启动子，可以作为植物启动子。植物源性的植物启动子的实例是玉米泛蛋白-1(ubi-1)启动子。其它适宜的植物启动子包括本领域的普通技术人员所知的那些。植物启动子可以指导核苷酸序列在植物的所有或某些组织中的表达，例如，组成型启动子，诸如35S，或广泛表达型启动子，诸如p326(SEQID NO：6)。备选地，植物启动子可以指导核苷酸序列在特定组织中的转录(组织特异性启动子)，或可以另外受到更精确的环境控制(可诱导的启动子)。
“可诱导的启动子”是指受到具体条件调控的启动子，诸如光，厌氧条件，温度，化学药剂浓度，蛋白浓度，生物体、细胞或器官内的条件。胁迫诱导的启动子，例如，可以在胁迫条件下被激活，诸如干旱，高温或低温，缺乏适当的营养。可以与本文提供的多聚核苷酸一起应用的可诱导的启动子的一个实例是PARSK1。这一启动子来自拟南芥编码丝氨酸-苏氨酸激酶酶的基因，并且受到脱水作用，ABA，和氯化钠的诱导(Wang和Goodman(1995)Plant J.8：37)。胁迫诱导型启动子的其它实例包括PT0633和PT0688，其分别具有SEQ ID NOS：13和14列出的核苷酸序列。这些启动子在干旱条件下可以是可诱导的。
编码区3′-末端的多聚腺苷化区域也可以有效地连接到NCED3编码序列上。所述多聚腺苷化区域可以衍生于天然基因，衍生于其它植物基因，和衍生于转运DNA(T-DNA)。
本文所提供的载体还可以包括，例如，复制起点，支架附着区(SARs)，和/或标记。标记基因可以赋予植物细胞可选择的表型。例如，标记可以赋予，生物杀灭剂抗性，诸如对抗生素(例如，卡那霉素，G418，博来霉素，或潮霉素)，或对除草剂(例如，chlorosulfuron或phosphinothricin)的抗性。另外，表达载体可以包括设计成辅助所表达的多肽的操作或检测(例如，纯化或定位)的标记序列。标记序列，诸如绿色荧光蛋白(GFP)，谷胱甘肽S-转移酶(GST)，多聚组氨酸，c-myc，血凝素，或FlagTM标记(Kodak，New Haven，CT)序列，典型地作为与所编码的多肽的融合体而表达。这样的标记可以被插入多肽内的任何地方，包括在羧基或氨基末端。
本文提供的重组DNA构建体典型地包括插入到适宜转化植物细胞的载体中的NCED多聚核苷酸序列。重组载体可以应用，例如，标准的重组DNA技术(参见，例如，Sambrook等.(1989)
Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY)而制备。
转基因植物
本文提供的载体可以用来转化植物细胞并且产生转基因植物。因此，本发明还提供包括本文所描述的外源核酸的转基因植物，以及用于制备这样的转基因植物的方法。用于转化广泛种类的更高等植物种类的技术在本领域内是已知的。应用许多已知的方法的任何一种，包括电穿孔，显微注射，和生物射弹方法，可以将本文所描述的多聚核苷酸和/或重组载体引入到各种植物宿主的基因组中。备选地，所述多聚核苷酸或载体可以与适当的T-DNA侧接区域连接，并且引入到常规根癌农杆菌宿主载体中。这样的根癌农杆菌介导的转化技术，包括解除(disarming)以及二元载体的应用，在本领域内是公知的。其它基因转移和转化技术包括通过钙或PEG原生质体转化，电穿孔介导的裸DNA的摄入，植物组织的电穿孔，病毒载体介导的转化，和微粒轰击(参见，例如，美国专利5,538,880，5,204,253，5,591,616，和6,329,571)。如果细胞和组织培养物用作转化的受体组织，应用本领域的技术人员已知的技术植物可以从所转化的培养物再生。
“外源”核酸是指通过重组DNA技术引入宿主细胞或生物体的多聚核苷酸。外源核酸是原先不存在于作为所述核酸受体的植物中的，但是向所述核酸最初分离的相同种类的植物中引入一个或多个拷贝的核酸是属于本发明范围内的。典型地，外源多聚核昔酸被稳定地整合到宿主细胞或生物体的基因组内。
含有外源核酸的转基因细胞或植物在本文中对于初级转基因细胞或植物称为R1代细胞或植物，对于第一代称为R2代细胞或植物，对于第二代和后续代的细胞或植物称为R3，R4，等。R2是指R1代细胞或植物的后代。例如，R2代植物可以是R1代植物自体受精的结果。R3是指R2代细胞或植物的后代。例如，R3代植物是指转化实验的直接结果的细胞或植物的第二代后代；R3代植物可以是R2代植物自体受精的结果。转基因植物可以参与育种计划，例如，将核酸引入其它株系，将核酸转运到其它种类或用于其它必要特征的进一步选择。备选地，对于适用于这样的技术的那些种类，转基因植物可以进行无性繁殖。后代可以包括具体的植物或植物株系的后代。例如，后代可以包括F1，F2，F3，F4，F5，F6，F7，F8，F9和后续代植物形成的种子，或BC1，BC2，BC3，BC4，BC5，BC6和后续回交代植物形成的种子。转基因植物产生的种子可以生长并且然后自交(或异型杂交和自交)，以获得对于编码新型多肽的核酸纯合的种子。
本文提供的核酸的异位表达可以应用“敲入”方法实现。这里，第一成分，“活化子系(activator line)”，是含有有效连接到启动子上的转录活化子的转基因植物。第二成分含有有效连接到转录活化子的靶点结合序列/区域的需要的cDNA序列。将第二成分转化到“活化子系”或用于转化宿主植物以产生“目标”系，其与“活化子系”通过常规培养方法杂交。在每种情形中，结果是所述启动子促进转录活化子蛋白的产生，然后其结合靶点结合区域以促进需要的cDNA的表达。
任何在植物中作用的启动子都可以用于第一成分，诸如组成型启动子，组织或器官特异性启动子，或广泛表达型启动子。也可以应用可诱导的启动子，诸如胁迫-(例如，干旱-)诱导性启动子，ABA诱导性启动子，或低湿度诱导性启动子。适当的转录活化子多肽包括，但不限于，编码HAP1和GAL4的那些。由所选择的转录活化子蛋白识别并且靶向的所述结合序列用于第二成分。
可以培养所转化的植物细胞，以再生拥有所转化的表型的植物。再生技术可以取决于植物激素在组织培养生长培养基中的操纵，并且可以取决于与所述目的多聚核苷酸一起引入的生物杀灭剂和/或除草剂标记。再生还可以从植物原生质体、胼胝体、移植体、器官、花粉、胚、或其部分获得。
转化的细胞、胼胝体、组织或植物可以通过选择或筛选特殊特征或活性的工程植物物质，例如，由标记基因或抗生素抗性基因编码的那些，而鉴定和分离。这样的筛选和选择方法学是本领域的普通技术人员公知的。另外，可以应用物理和生物化学方法来鉴定转化子。这些方法包括用于多聚核苷酸的检测的DNA印迹分析和PCR扩增；用于检测RNA转录物的RNA印迹，S1 Rnase保护，引物延伸，或RT-PCR扩增；用于检测多肽和多聚核苷酸的酶或核酶活性的酶促检验；和蛋白质凝胶电泳，蛋白质印迹，免疫沉淀，和酶联免疫检测，以检测多肽。其它技术，诸如原位杂交，酶染色，和免疫染色，也可以用来检测多肽和/或多聚核苷酸的存在或表达。实行所有提及的技术的方法是公知的。当多聚核苷酸稳定地结合到转基因植物中后，它可以被引入其它植物中，例如，应用标准的育种技术。
本文所描述的多聚核苷酸和载体可以用来转化许多单子叶和双子叶植物和植物细胞系统，包括双子叶植物，诸如红蓝花属、紫苜蓿、大豆属、咖啡属、油菜籽(高芥子酸和油菜)、或向日葵属，以及单子叶植物，诸如玉蜀黍、小麦属、黑麦属、大麦属、燕麦属、稻属、稷属、苋科、或高梁属。本文提供的多聚核苷酸和多肽可以在农业和林业领域有具体的应用，并且因此用于作物，诸如谷物作物(例如，小麦属、玉蜀黍属、稻属、稷属、和大麦属)；果实作物(例如，番茄属、苹果属、梨属、草莓属、桔、葡萄、草莓属、凤梨属、瓜属(例如，西瓜和甜瓜)、桃、梨属、樱属、柠檬、葡萄柚、李属、芒果属、芭蕉属、和棕榈)；饲料植物(例如苜蓿)；蔬菜或块根作物(例如胡萝卜、马铃薯、糖萝卜、薯蓣属、葱属、花椰菜、豌豆属、大豆属、甜玉米、爆玉米花用玉米、番茄属、马铃薯、豆属(包括菜豆、利马豆、干豆(dry beans)、和青豆)、莴苣属、和菠菜属)；开花植物(例如，矮牵牛属、蔷薇属、和菊属)；针叶植物和松属树木(例如，松属、冷杉属、和云杉属)；油类作物(例如，向日葵和油菜籽)；烟草；用于实验目的的植物(例如，拟南芥)；和天然植物(例如，灰白银胶菊(Partheniurn argentatum))。
因此，本文所描述的方法可以用于属于，但不限于，下列各目的双子叶植物：Magniolales，八角目(Illiciales)，樟目(Laurales)，胡椒目(Piperales)，马兜铃目(Aristochiales)，睡莲目(Nymphaeales)，毛茛目(Ranunculales)，Papeverales，Sarraceniaceae，昆栏树目(Trochodendrales)，金缕梅目(Hamamelidales)，杜仲目(Eucomiales)，Leitneriales，杨梅目(Myricales)，壳斗目(Fagales)，木麻黄目(Casuarinales)，石竹目(Caryophyllales)，Batales，蓼目(Polygonales)，白花丹目(Plumbaginales)，五桠果目(Dilleniales)，山茶目(Theales)，锦葵目(Malvales)，荨麻目(Urticales)，玉蕊目(Lecythidales)，堇菜目(Violales)，杨柳目(Salicales)，Capparales，欧石南目(Ericales)，岩梅目(Diapensales)，柿目(Ebenales)，报春花目(Primulales)，蔷薇目(Rosales)，Fabales，川苔草目(Podostemales)，Haloragales，桃金娘目(Myrtales)，山茱萸目(Cornales)，帕洛梯目(Proteales)，檀香目(Santales)，大花草目(Rafflesiales)，卫矛目(Celastrales)，大戟目(Euphorbiales)，鼠李目(Rhamnales)，无患子目(Sapindales)，胡桃目(Juglandales)，牻牛儿苗目(Geraniales)，远志目(Polygalales)，Umbellales，龙胆目(Gentianales)，花荵目(Polemoniales)，唇形目(Lamiales)，车前目(Plantaginales)，玄参目(Scrophulariales)，风铃草目(Campanulales)，茜草目(Rubiales)，川续断目(Dipsacales)，和紫菀目(Asterales)。本文所描述的方法还可以用于属于，但不限于，下列各目的单子叶植物：Alismatales，水鳖目(Hydrocharitales)，茨藻目(Najadales)，霉草目(Triuridales)，鸭跖草目(Commelinales)，谷精草目(Eriocaulales)，帚灯草目(Restionales)，早熟禾目(Poales)，灯心草目(Juncales)，莎草目(Cyperales)，香蒲目(Typhales)，凤梨目(Bromeliales)，Zingiberales，槟榔目(Arecales)，巴拿马草目(Cyclanthales)，露兜树目(Pandanales)，Arales，Lilliales，和兰目(Orchidales)，或者用于属于Gymnospermae的植物，例如，松目(Pinales)，银杏目(Ginkgoales)，苏铁目(Cycadales)和买麻藤目(Gnetales)。
同样地，本发明对十分广泛范围的植物种类都有应用，包括来自，但不限于，下列各属的种属：葱属(Allium)，油丹属(Alseodaphne)，腰果属(Anacardium)，落花生属(Arachis)，天门冬属(Asparagus)，颠茄属(Atropa)，燕麦属(Avena)，琼楠属(Beilschmiedia)，芸苔属(Brassica)，柑桔属(Citrus)，西瓜属(Citrullus)，辣椒属(Capsicum)，长春花属(Catharanthus)，红蓝花属(Carthamus)，木防己属(Cocculus)，椰子属(Cocos)，咖啡属(Coffea)，Croton，香瓜属(Cucumis)，南瓜属(Cucurbita)，Daucus，Duguetia，油棕属(Elaeis)，花菱草属(Eschscholzia)，榕属(Ficus)，草莓属(Fragaria)，海罂粟属(Glaucium)，大豆属(Glycine)，棉属(Gossypium)，向日葵属(Helianthus)，Heterocallis，Hevea，大麦属(Hordeum)，天仙子属(Hyoscyamus)，莴苣属(Lactuca)，胶藤属(Landolphia)，亚麻属(Linum)，木姜子属(Litsea)，黑麦草属(Lolium)，羽扇豆属(Lupinus)，番茄属(Lycopersicon)，苹果属(Malus)，Manihot，Majorana，苜蓿属(Medicago)，芭蕉属(Musa)，烟草属(Nicotiana)，木犀榄属(Olea)，稻属(Oryza)，稷属(Panicum)，Pannesetum，罂粟属(Papaver)，银胶菊属(Parthenium)，鳄梨属(Persea)，碧冬茄属(Petunia)，菜豆属(Phaseolus)，松属(Pinus)，Pistachia，豌豆属(Pisum)，梨属(Pyrus)，李属(Prunus)，萝卜属(Raphanus)，Rhizocarya，蓖麻属(Ricinus)，黑麦属(Secale)，千里光属(Senecio)，防己属(Sinomenium)，白芥属(Sinapis)，茄属(Solanum)，高梁属(Sorghum)，千金藤属(Stephania)，可可树属(Theobroma)，胡卢巴属(Trigonella)，小麦属(Triticum)，野豌豆属(Vicia)，长春花属(Vinca)，葡萄属(Vitis)，豇豆属(Vigna)和玉蜀黍属(Zea)。
转基因植物可以表现出本文所描述的多肽的任何生化活性。例如，转基因植物可以表现出9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的至少一种生化活性。用于评估生化活性的方法是本领域的普通技术人员已知的。
相对于不是转基因或对于NCED核酸是转基因的但并不表达NCED多肽的相应的对照植物，本文所提供的转基因植物还可以表现出对不利环境条件增强的应答。例如，转基因植物可以在干旱条件下表现出更高的生长速率，或者在包括干旱期接着重新水化的条件下可以表现出增强的干旱恢复性。转基因植物还可以比相应的对照植物表现出更低的蒸腾速率。评估改变的生理参量，诸如植物高度和植物蒸腾速率的方法是为本领域的普通技术人员已知的，并且也是本文所讨论的。
与缺少所述转基因或不表达所述转基因的相应的对照植物相比较，转基因植物可以具有改变的表型。但在植物中表达时，例如，在适当的时间，适当的组织中，或以适当的表达水平，多肽可以影响植物(例如，转基因植物)的表型。表型效果可以相对于下列不表达目的外源多聚核苷酸的对照植物而进行评估，诸如相应的野生型植物，对于所述目的外源多聚核苷酸是非转基因的但是另外是与目的转基因植物遗传背景相同的相应的植物，或其中所述多肽的表达受到阻抑，抑制，或不被诱导(即，在表达处于可诱导性启动子控制下的情形中)的相同遗传背景的相应植物。当植物表现出低于10％(例如，低于9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.1％，0.01％，或0.001％)量的由目的植物所表现出的多肽或编码所述多肽的mRNA时，认为植物“没有表达”多肽。表达可以应用包括，例如，RT-PCR，RNA印迹，S1 RNAse保护，引物延伸，蛋白质印迹，蛋白质凝胶电泳，免疫沉淀，酶联免疫检测，芯片检测，和质谱的方法进行评估。应该注意到，如果多肽在组织特异性或广泛表达型启动子控制下表达，表达可以在整个植物或在所选择的组织中进行评估。类似地，如果多肽在特定的时间表达，例如，在发育的特定时间或诱导时，表达可以选择性地在需要的时期进行评估。
表型效果可以是在胁迫环境条件下相对于对照植物改变的生长速率。例如，转基因植物可以在干旱条件下表现出更高的生长速率。在另一个实例中，转基因植物可以在紧接着干旱之后经历重新水化作用时表现出更高的生长速率。因此，干旱条件下，或经历干旱和重新水化处理时，植物的生理状况可以是其干旱恢复能力的测定，并且可以用生理参量，诸如，例如，植物高度，新枝条数目，新叶片数目，或种子数目进行评估。
当本文所描述的多肽在转基因植物中表达时，所述转基因植物可以表现出比不表达所述多肽的植物更高出约7％-约20％(例如，约10％-约15％；约12％-约18％；约8％-约18％；或约15％-约20％更高)的高度。在另一实例中，当本文所描述的多肽在转基因植物中表达时，所述转基因植物比不表达所述多肽的植物表现出更多的新生长。新生长可以作为植物上新枝条或新叶片的数目进行测定。因此，例如，转基因植物可以具有比相应的对照植物多出1-10个(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10个更多)新枝条，或者甚至是多于10个更多的新枝条。在另一实例中，当本文所描述的多肽在转基因植物中表达时，与不表达所述多肽的植物相比较，经历干旱或干旱和重新水化处理后，所述转基因植物可以表现出更多数目的新叶片。例如，转基因植物可以具有比相应的对照植物多出1-50片(例如，2，4，6，7，8，9，10，12，15，16，18，20，25，29，30，32，35，37，40，42，45，49，或50更多)的新叶。在另一情形中，当本文所描述的多肽在转基因植物中表达时，转基因植物可以表现出比相应的对照植物多出约10％-约95％(例如，约10％-约20％；约10％-约50％；约10％-约70％；约20％-约60％；约20％-约75％；约25％-约85％；约30％-约70％；约35％-约90％；约40％-约60％；约40％-约85％；约50％-约80％；约50％-约90％；或约70％-约90％更多)的种子数目(每株植物的种子数目)。在某些情形中，当本文所描述的多肽在转基因植物中表达时，所述转基因植物可以表现出比不表达所述多肽的植物的种子重量高出约5％-约20％(例如，约5％-约10％；约8％-约12％；约10％-约15％；约8％-约18％更高)的每株植物的种子重量增加。
与相同遗传背景的对照植物相比较，转基因植物还可以表现出更低的蒸腾速率。蒸腾速率是指示植物如何良好地耐受干旱条件的另一生理参量。例如，具有低蒸腾速率的植物预计比具有高蒸腾速率的植物更缓慢地失水，并且因此将期望其更好地抵抗干旱条件(即，具有更好的耐旱性)。当本文所描述的多肽在转基因植物中表达时，所述转基因植物可以表现出与相应的对照植物的蒸腾速率相比较减少约1-100％(例如，2％，4％，6％，8％，10％，12％，15％，18％，22％，28％，35％，37％，42％，45％，47％，50％，55％，64％，68％，71％，75％，77％，80％，83％，86％，89％，90％，92％，95％，98％，或99％)。
应该注意到，表型效果典型地通过一种或多种实验分析的统计学显著性而进行评估。应该理解，当比较表型以评估多肽的作用时，在p≤0.05时，具有适当的参量或非参量统计量，例如，Chi-方检验，斯氏t-检验，Mann-Whitney检验，或F-检验，认为多肽的差异是统计学显著性的。其它表型效果可以通过本领域普通技术人员已知的方法进行评估，包括在发育的特定时间的细胞长度测量，新枝条计数，和确定新叶数目。
典型地，在p≤0.05时，具有适当的参量或非参量统计量，例如，Chi-平方检验，斯氏t-检验，Mann-Whitney检验，或F-检验，相对于相应的对照植物的种子，认为转基因植物种子的生长速率、干旱恢复性、和/或蒸腾速率之间的差异是统计学显著性的。在一些实施方案中，在p＜0.01，p＜0.005，或p＜0.001时，生长速率、干旱恢复性、和/或蒸腾速率的差异是统计学显著性的。与相应的对照植物种子的内容相比较，例如，在生长速率、干旱恢复性、和/或蒸腾速率中的统计学显著性差异表明(1)存在于转基因植物中的重组核酸改变了种子的生长速率、干旱恢复性、和/或蒸腾速率，和/或(2)重组核酸保证作为改变植物中碳含量的候选的进一步研究。
制品
本发明还提供制品，其可以包括，例如，本文所提供的转基因植物的种子混合物(例如，基本上均一的种子混合物)。所述种子混合物可以处于良好状态，并且通过本领域已知的方式包装，以形成一套产品。种子的包装可以具有标签，例如，系在包装材料上的标记或标签，打印在包装材料上的标签，或插在袋内的标签。标签可以指明，从包含在包装袋内的种子长成的植物可以产生相对于相应的对照植物具有干旱条件下更高生长速率、增强的干旱恢复性、和/或更低的蒸腾速率的作物。
本发明在下述实例中进一步描述，所述实例并没有限制在权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
实施例1-材料和方法
序列搜索：将查询核酸和氨基酸序列针对在公共或个人所有的数据库中存在的目标核酸或氨基酸序列进行搜索。应用Washington UniversityBasic Local Alignment Search Tool版本2.0(WU-Blast2)程序进行这样的搜索。WU-Blast2程序可在华盛顿大学(Washington University)blast.wustl.edu在线应用。解释怎样应用所述程序的用法指导也可以在blast.wustl.edu/blast/README在线获得。运行WU-Blast2的一列综合的和具体的序列搜索服务也可以从华盛顿大学(blast.wustl.edu)在线获得。对于拟南芥的WU-Blast2服务可以在arabidopsis.org/wublast/index2的WorldWide Web上找到。除非另外指明，应用下述WU-Blast2参量：筛选选择设定为“默认”，输出格式设定为“缺口比对”，比较矩阵设定为“BLOSUM62”，截断值(S值)设定为“默认”，期望值(E阈值)设定为10-5，要显示的最佳比对的数目设定为“10000”，和“分类输出”选择设定为通过“p值”分类输出。打开选择“-postsw”，以应用Smith-Waterman运算法则将序列比对最优化。
转化载体的构建：2种构建体用于转化。无启动子pNB4-NCED3质粒用来产生对照植物。pNB4 p35S：AtNCED3质粒，其中p35S启动子有效地连接到从生态型WS克隆的拟南芥NCED3 cDNA(图2A；SEQ ID NO：1)上，用来产生测试植物。为了制备这些构建体，应用下列引物：AtNCED3_5′(5′-CCGGAAGCTTCTGATTGAACACACTTGAAAAATGGCTT；SEQ ID NO：15)，和AtNCED3_3′(5′-GCAGTCTAGACACATAAGAACTCACACGACCTGCTT；SEQ ID NO：16)，通过PCR从WS DNA扩增NCED3 cDNA片段。将所获得的NCED3 cDNA PCR片段用Hind III和XbaI消化，并且亚克隆到pNB4-UAS-NOS载体骨架中，以产生pNB4_NCED3，对照构建体。备选地，将所获得的NCED3 cDNA PCR片段用Hind III和Xba I消化，并且亚克隆到pNB4-35S载体骨架中，以产生pNB4_P35S：NCED3，测试构建体。每一pNB4_NCED3和pNB4_P35S：NCED3构建体含有农杆菌的左和右边界(borders)，用于在细菌中选择的壮观霉素-抗性基因，和用于植物中抗性选择的BAR基因。
植物材料和转化：水稻培育种Kitaake用于所有的实验。应用能够转化的胼胝体细胞和农杆菌介导的方法进行转化。Kitaake在北海道(日本)培育耐寒性，但是不适应任何类型的潮湿或干旱环境。
应用农杆菌和能够转化的胼胝体，将pNB4 NCED3和pNB4_P35S：NCED3构建体平行引入水稻植物。对于含有每种构建体的植物材料，平行地进行胼胝体诱导，转化，转化细胞的选择和植物再生。对照，或无启动子的构建体，pNB4_NCED3，用于对照植物的转化和再生。pNB4_P35S：NCED3用于测试植物的转化和再生。
RT-PCR：为了筛选转化子和基因型植物，从转基因水稻植物收集大约120mg嫩叶材料，并且应用Qiagen RNeasy Plant袖珍型试剂盒(QiagenInc.，Valencia，CA)分离总RNA。在反转录前，将RNA样品用DNase I，MseI，和DdeI处理，以消除基因组DNA污染。在20μL，应用Superscript II反转录酶(Invitrogen Life Technology，Carlsbad，CA)，通过反转录1μg总RNA，制备cDNA第一条链。将1μL cDNA用于PCR，应用Platinum TagDNA聚合酶(Invitrogen Life Technology)。应用GeneAmp PCR System 9700thennocycler(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)，进行PCR反应，在95℃5分钟，94℃变性1分钟，52℃退火1分钟，和72℃延伸1分钟，30个循环，最后在72℃延伸7分钟。应用3’端引物NCED3Se4(5′CCGTCCGATCATCTCCAACGAA；SEQ ID NO：17)和5’端引物pNB4Seq3′(5′-GTTGCCGGTCTTGCGATGAT；SEQ ID NO：18)，扩增NCED3序列。水稻微管蛋白用作内源对照，并且应用引物5′-ACCCTATGGCCAGATCTT (rtublf；SEQ ID NO：19)和5′-CAGCTTGAGAGTCCTGAAG(rtublr；SEQ ID NO：20)进行扩增。BaR-特异性引物用来检测BaR基因的存在。pNB4_p35S：AtNCED3质粒用作阳性对照，并且将来自非转基因植物的RNA用作阴性对照。对17株测试植物(即，用pNB4_p35S：AtNCED3转化的)进行基因型分析。这些测试植物中有14株显示出含有拟南芥NCED3序列。因此，用pNB4_p35S：AtNCED3转化水稻植物是成功。
R1植物的再生：将从转化和再生直接获得的细胞和植物称为R1代植物。在这两种构建体的转化或再生频率上没有观察到显著差异。将R1代种子灭菌并且在含有15mg/L抗生素Bialaphos的Murashige & Skoog(MS)培养基(Apollo Scientific Ltd，Bredbury，United Kingdom)中萌发，以选择转化的植物。所有的植物都保存在控制在28℃和16h：8h光照：黑暗循环的Percival(Peny，IA)生长室中。
GA3处理：将R2代种子用20％漂白水表面消毒，并且在含有0.4mL/LFinale和过滤灭菌的GA3(gibberellin)至终浓度0，10，100，250，500或1,000μM的半强度MS中萌发。
蒸腾速率测定：对于株系T13，为了具有相似大小的R2代和对照秧苗，将R2代种子先于野生型种子2周进行萌发。T7和T9 R2代种子和野生型对照种子同时萌发和确定。将植物转移到含有半强度MS但是没有糖的15mL Corning管中，并将生长培养基的终体积调整到14mL。将管子用几层石蜡膜(Parafilm)紧密地包裹，以确保水分损失只通过蒸腾发生。将R2代和野生型秧苗相对于彼此随机安置，并且在28℃，16h：8h光照：黑暗循环中生长。
对每株秧苗，在95和120小时后记录水分水平。去除根部，并且将秧苗余下的绿色部分称重，以便鲜重(FW)测定可以确定。应用下述方程，计算每株秧苗的蒸腾速率，其中FW为鲜重：
实施例2-生长表型
含有pNB4_p35S：AtNCED3构建体的R1代测试植物表现出一定范围的大小。大约一半的测试植物比对照植物更小；一般地，这些测试植物比含有pNB4_AtNCED3构建体的对照更缓慢地生长。其它测试植物没有表现出明显的大小异常，并且看起来以与对照植物相似的速率生长。测试植物之间的大小差异可以是由于转基因表达的不同水平，其又可以是由于NCED3转基因在不同株系中占据的不同的基因组位置。也可能是由于NCED3过量表达引起的增加ABA水平将能够解释在正常条件下稍微减弱的生长。
实施例3-R1代植物的干旱表型
将10对R1代植物，每对由1株对照植物(含有pNB4_AtNCED3)和1株测试植物(含有pNB4_p35S：AtNCED3)组成，移植到含有土壤的花盆中。每对植物大小匹配。在经受干旱处理前，允许植物在土壤中生长18天，干旱处理通过停止浇水8天或10天而进行。对于在8天后表现出表型迹象的每对植物，添加水分以使植物恢复。对于其它的植物，在10天后加水。通过目测法评估由此获得的干旱症状恢复性。
10对植物中，在经受10天的干旱处理后，有3对植物没有表现出明显定义的症状。由于来自在单独的花盆中生长的对照和测试植物的结果可能由于花盆与花盆之间的实验性变化而被歪曲，所以，当应用在单独的花盆中并排生长的成对植物时，对照和测试植物之间关于干旱症状和干旱恢复性的比较是最优化的。
在干旱条件下观察到两种反应。第一种，携带pNB4_p35S：AtNCED构建体的植物(例如，株系T13和T16植物)表现出比携带pNB4_AtNCED3构建体的对照株系(例如，株系C12和C13的植物)更加茂盛和粗壮的生长。经受10天的干旱后，表达NCED3转基因的测试植物比对照植物更大并且更加粗壮。
第二种类型的反应，与对照植物C7，C8，C9，C10和C15相比较，经受干旱处理之后，测试植物(例如，植物株系T2，T6，T7，T9和T15)表现出更好的恢复性。干旱恢复性实验的结果在图4中显示。对于对照植物，在干旱处理过程的表型没有明显不同于测试植物的表型，并且只是当植物重新浇水并且处于恢复期时才变得明显。
综合看起来，这些数据表明，拟南芥NCED3基因可以增强水稻植物的耐旱性，并且增强的耐旱性可以采取在干旱时增强的生长或干旱后增强的恢复性的形式。这两种表型在其它作物中可以是有价值的，诸如，玉蜀黍属，小麦属，大麦属，燕麦属，或稷属，它们可以经受间歇性的干旱。
实施例4-萌芽表型
从含有pNB4_p35S：AtNCED3构建体的11株R1代株系收集种子，包括不与对照在土壤中成对评估的2株(T8和T10)，和没有表现出清楚的症状的1株(T11)。来自测试株系T13和T16的种子，其在R1代显示出提高的耐旱性，比对照株系T3(对于NCED3转基因PCR阴性株系)萌芽晚7到10天并且生长更加缓慢。来自测试株系T2，T6，T7和T9的种子，其在干旱处理后显示出提高的恢复性，比对照萌芽晚1到2天并且生长稍微缓慢一些。株系T7分离出一些白化秧苗，其可以在当植物经受组织培养条件时发生，来自株系T13和T16的种子还在不存在Bialophos时萌发，并且观察到正常和迟萌发表型的清晰的分离，这与下述观点一致，即，由转基因诱导的过量的ABA可能是造成萌发延迟的原因。来自测试株系T15的种子也在Bialophos上表现出缓慢的生长，但是在不存在Bialophos时，不存在清晰的表型分离，这表明BaR基因在这一株系中仅赋予部分的抗性。
为了检测R3代种子的萌芽能力，将株系T6和T7的纯合R3代种子在含有Finale的MS培养基上萌芽。从T6植物传下来的5组R2代植物中，T6-1和T6-4 R2代植物在R3代中没有表现出分离的迹象。从T7植物传下来的5组R2代植物中，T7-5 R2代植物在R3代中没有表现出分离的迹象。与野生型对照相比较，T6-1和T7-5 R3代群体的萌芽稍微延迟。这些结果表明增加的ABA水平可以导致萌芽的稍微延迟。
综合看起来，所述数据表明，NCED3转基因的表达在正常环境条件下可以延长种子的休眠期，并且可以消弱生长。然而，尽管一些R1代测试植物在正常条件下发展性地被消弱，但是当对照和测试植物都经受干旱处理时，它们达到和超越R1代对照植物的大小。当这两组植物经受干旱恢复性处理时，R1代测试植物还在大小上超越了R1代对照植物。
实施例5-转基因表达
用株系T3，T6，T7，T13和T16的R2代植物材料进行半定量RT-PCR。除了株系T3，其通过RT-PCR表现出十分微弱的条带，所有的R2代植物都表现出NCED3转基因的表达。当应用跨越35S的3′区和NCED3的5′区的引物时，对于T3和每一株它的后代通过RT-PCR检测NCED3转基因的存在遇到了困难。一种可能是在35S启动子的3′区存在缺失，因此导致NCED3减少的表达，如由RT-PCR所证明的那样。
对于株系T6和T7，检测到证明NCED3转基因表达的强RT-PCR条带。这些RT-PCR结果与干旱处理后株系T6和T7表现出的更好的恢复性一致。株系T13和T16也表现出强RT-PCR条带的存在与提高的耐旱性之间的一致性。综合看起来，这些数据表明，与对照植物相比较，表现出表达NCED3转基因的株系在干旱条件下具有更高的生长速率，并且在干旱处理后更能够恢复。
实施例6-GA3处理的效果
在种子萌芽中，ABA和GA3(赤霉素)可以拮抗性地作用。为了确定GA3是否能够免除NCED3转基因种子中明显延长的休眠期，将GA3添加到生长培养基中，种子置于所述培养基中萌芽。即使在低如10μM的浓度，GA3促进萌芽。尽管由此获得的秧苗更加伸长，但是更高浓度的GA3没有显著地改善种子萌芽。因此，加入外源的GA3可以，至少部分地，克服非正常型的延长的休眠期。
实施例7-蒸腾速率测定
气孔的打开和关闭以及相关的蒸腾速率是耐旱性的重要确定因素。为了测定和比较测试和对照植物的蒸腾速率，将R2代种子先于野生型种子2周萌发，以获得具有相似大小的R2代和对照秧苗。将植物转移到含有半强度的MS盐但是没有任何糖的15mL Coming管(Acton，MA)中，并且生长培养基的终浓度调整至14mL。将管子用几层石蜡膜(Parafilm M)紧密地包裹，以确保水分损失只通过蒸腾发生。将R2代和野生型秧苗相对于彼此随机安置，并且对每株秧苗，在95和120小时后记录水分水平。然后去除根部，并且将秧苗余下的绿色部分称重，以便鲜重(FW)测定可以确定，并且应用实施例1提供的方程，可以计算蒸腾速率。
对于株系T7，T9和T13，在它们的PCR阳性和PCR阴性分离体之间，和与野生型分离秧苗，比较蒸腾速率。如图4所示，表达NCED3的植物始终表现出比它们相应的PCR阴性对照更低的蒸腾速率。株系T13，其为在干旱条件下表现出更高的生长速率的株系的一种，表现出最低的蒸腾速率，相对于野生型分离体，在其R2代植物中减少达到约50％。这些数据表明表达NCED3的植物对干旱处理增强的反应至少部分是由于植物蒸腾速率的减少导致，所述减少的蒸腾速率推测起来是由表达NCED3的植物中ABA浓度的增加引起。
实施例8-R2代植物的耐旱性
为了证实由在水稻中表达拟南芥NCED3赋予的耐旱性的增加是可遗传的，在R2代植物中进行脱水实验。对于每一T13和T16株系，生长2株R2代植物。植物T13-26和T13-27是株系T13的后代，和植物T16-23和T16-24是株系T16的后代。每个花盆含有R2代表达NCED3的植物和未转化的野生型对照，以致一对植物在单一的花盆中，并且脱水条件对于2株植物是一致的。脱水处理在移植到土壤后第17天开始，通过去除任何剩余的水分并且此后停止浇水。在4个时间点拍取照片：在脱水开始时(称为D0)，第11天(D11)，脱水的末期(D15，D16，和D17)和重新浇水后4小时(D15-4h，D16-4h，和D17-4h)。重新浇水的时间取决于叶片症状的严重性。观察到含有最大的植物的花盆的水分损失是更快的。
所有的R2代植物都在脱水过程中表现出耐旱性，并且在重新浇水后表现出快速的恢复。观察到，尽管在脱水开始时(D0)，植物T13-26和T13-27在大小上比对照植物更小，在干旱处理后(D16和D17)它们同对照植物一样高。另外，当重新浇水时，转基因植物在不到4小时内完全恢复，而对照植物在这一时间阶段内表现出很少和没有恢复。综合看起来，所述数据表明，拟南芥NCED3基因增强了水稻植物对干旱胁迫的耐受性，并且这一增强的干旱胁迫耐受性是可遗传的。此外，观察到增强的耐旱性采取在干旱下增强的生长和/或干旱后增强的恢复性的形式。
还研究了测试转基因水稻植物在严重干旱处理下的表现。将株系T16的R2后代(T16-5)生长在未转化的野生型对照植物旁边。将两种植物在移植到土壤后第24天开始脱水，持续7天，然后重新浇水连续5天。T16-5转基因植物在这种极端脱水下存活，而野生型对照在5天的时间阶段内没有恢复。在对照植物中，顶端三分之一的叶片干枯了并且在90天内枯萎。在T16-5植物中，在种子规格或繁殖能力上没有减少。进一步的研究表明株系T6和T7的纯合植物具有比R1代植物甚至更好的干旱恢复性。综合看起来，这些数据证实R1代结果，并且表明表达拟南芥NCED3转基因的水稻植物具有可遗传的增强的耐旱性。
应该注意到，尽管拟南芥NCED3转基因的表达可以引起延迟的萌发和生长，但是当维持在干旱下或允许从干旱恢复时，T13和T16植物完全能够赶上并且超越野生型对照，并且植物产量不受这一延迟的影响。事实上，尽管在正常生长和灌溉条件下，T13和T16植物比野生型对照稍微更矮，但是这些转基因植物在干旱条件下具有比对照植物的产量更好的产量。
其它实施方案
应该理解，尽管本发明结合其详细的描述进行了描述，在前描述意欲举例说明，并没有限制由附上的权利要求的范围所定义的本发明的范围。其它方面、优点和改进处于下述权利要求范围内。
Claims (30)
1.一种分离的核酸，其包括编码具有与SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
2.权利要求1的分离的核酸，其还包括有效连接到编码所述多肽的核苷酸序列上的控制元件。
3.权利要求2的分离的核酸，其中所述控制元件是广泛表达型启动子。
4.权利要求2的分离的核酸，其中所述控制元件是胁迫诱导型启动子。
5.权利要求2的分离的核酸，其中所述控制元件是干旱诱导型启动子。
6.权利要求1的分离的核酸，其还包括可选择的标记。
7.权利要求1的分离的核酸，其中所述多肽具有与SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少98.7％的同源性的氨基酸序列。
8.权利要求1的分离的核酸，其中所述多肽具有与SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少99％的同源性的氨基酸序列。
9.权利要求1的分离的核酸，其中所述多肽具有与SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少99.5％的同源性的氨基酸序列。
10.一种纯化的多肽，其具有与SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列。
11.权利要求10的纯化的多肽，其中所述多肽具有与SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少98.7％的同源性的氨基酸序列。
12.权利要求10的纯化的多肽，其中所述多肽具有与SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少99％的同源性的氨基酸序列。
13.权利要求10的纯化的多肽，其中所述多肽具有与SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少99.5％的同源性的氨基酸序列。
14.一种包括至少一种外源核酸的转基因植物，所述至少一种外源核酸包括编码具有与SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
15.权利要求14的转基因植物，其中所述植物相对于缺少编码所述多肽的核苷酸序列的相同遗传背景的相应植物，在干旱条件下表现出更高的生长速率。
16.权利要求14的转基因植物，其中所述植物相对于缺少编码所述多肽的核苷酸序列的相同遗传背景的相应植物，表现出增强的干旱恢复性。
17.权利要求14的转基因植物，其中所述植物相对于缺少编码所述多肽的核苷酸序列的相同遗传背景的相应植物，表现出更低的蒸腾速率。
18.权利要求14的转基因植物，其中所述至少一种外源核酸编码双子叶植物的9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶。
19.权利要求14的转基因植物，其中所述植物对于所述至少一种外源核酸是半合子的。
20.权利要求14的转基因植物，其中所述植物对于所述至少一种外源核酸是纯合的。
21.权利要求14的转基因植物，其中所述植物是F1代植物，F2代植物，BC1代植物，或BC2代植物。
22.权利要求14的转基因植物，其中所述植物是可繁殖的。
23.权利要求14的转基因植物，其中所述植物是双子叶植物。
24.权利要求14的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。
25.权利要求24的转基因植物，其中所述植物是玉蜀黍，小麦属，黑麦属，大麦属，燕麦属，稻属，稷属，高梁属，肯塔基蓝草，须芒草属，弯叶画眉草，或羊茅属。
26.权利要求14的转基因植物的种子。
27.一种用于产生转基因植物的方法，所述方法包括
(a)向植物细胞中引入至少一种外源核酸，以产生转化的植物细胞，其中所述至少一种外源核酸含有编码具有同SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列有至少98.4％的同源性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，和
(b)从所述转化的植物细胞产生转基因植物。
28.权利要求27的方法，其中所述转基因植物相对于缺少编码所述多肽的核苷酸序列的相同遗传背景的相应植物，在干旱条件下表现出更高的生长速率。
29.权利要求27的方法，其中所述转基因植物相对于缺少编码所述多肽的核苷酸序列的相同遗传背景的相应植物，表现出增强的干旱恢复性。
30.权利要求27的方法，其中所述转基因植物相对于缺少编码所述多肽的核苷酸序列的相同遗传背景的相应植物，表现出更低的蒸腾速率。
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