CN110295185B - 一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，包括以下步骤：(1)克隆柑橘CsWAKL08基因编码序列，然后进行超量表达载体构建；(2)超量表达载体转化柑橘，得到转基因植株。该方法通过将一个与编码细胞壁关联的类受体激酶的基因过表达载体整合到柑橘中，有效提高柑橘对溃疡病的抗性。

Description

一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法。

背景技术

柑橘是我国南方重要的果树作物，因其具有较高的食用价值和药用价值而受到人们的喜爱。柑橘是全球重要经济作物，主要种植在非洲(16.60％)，亚洲(52.90％)、美洲(24.50％)、欧洲和大洋洲(6％)(魏方林等，2008)。然而柑橘产业发展却饱受各种病害的困扰，其中柑橘溃疡病(Citrus bacterial canker，CBC)是阻碍柑橘产业发展最为严重的病害之一(胡军华等，2015)。我国广东、广西、福建、湖南等柑橘主产区受柑橘溃疡病侵害较为严重。全世界有30多个国家和地区将柑橘溃疡病列为重要的植物检疫对象。柑橘溃疡病是由黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp.citri，Xcc)引起，起源于印度、爪哇等地(胡军华等，2015)。

溃疡病菌主要侵染柑橘叶片、枝梢、果实等，其中苗木、幼树受害较为严重。病树会出现落叶、枯梢、树势衰弱以及落果等现象，严重的影响了柑橘的产量和品质。病树的叶片发病初期表层出现浓黄色小圆斑，后期病变成淡褐色或褐色，最终形成火山口状灰白色凸起(何秀玲等，2007)。受到柑橘溃疡病危害的芸香科植物有几十种，其中绝大部分为经济栽培品种。有研究发现甜橙最易感病，其次是酸橙和柚类(袁承东等，1997；李敏等，2013)。

目前为控制柑橘溃疡病危害通常采取化学防治为主，生物防治为辅的综合防治策略。由于以上防治措施对环境不友好，且需要投入大量的人力、物力，亟待通过培育抗病新品种来减少溃疡病带来的损失(陈力等，2008；朱雪梅等，2017)。在抗病育种方面一代代柑橘人进行了长期杂交育种，但由于杂交育种周期长使得育种效率低。随着分子生物学的兴起，人们开始从抗病基因工程方向对病原菌本身和植物的抗病防卫反应进行研究。基因工程手段也在抗溃疡病研究中进行了尝试(贾瑞瑞等，2017；段敏杰等，2016)，获得了一些对溃疡病有抗性的转基因材料。陈善春等获得了对柑橘溃疡病有抗性的转柞蚕抗菌肽D基因的锦橙、新会橙、脐橙株系(陈善春等，1996)。外源基因NLS，chit42，Xa21和PthA在转移至冰糖橙，椪柑和甜橙后对柑橘溃疡病具有抗性(Mendes et al，2010；Yang et al，2011)。贾瑞瑞的研究发现CsBZIP40是响应柑橘溃疡病侵染的一个重要的转录因子，并且猜测是通过SA途径影响柑橘品种的抗性(贾瑞瑞等，2017)。CsLOB1基因作为溃疡病病原基因PthA的靶蛋白，被认为是是柑橘溃疡菌的感病因子，使得植物对溃疡病更为敏感(Li et al，2014)。Fuqua等发现由N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)可作为诱导细菌群体感应系统的信号分子，并且参与到各种病原体的发病机制中(Fuqua et al，1994；Withers et al，2001)，之后他们将细菌中的水解酶转基因进入植物，发现植物对溃疡病的抵抗力更强(Zan et al，2011)。近年来，出现了使用基因敲除技术来防御溃疡病病原菌的方法，Peng等对柑橘溃疡病感病基因CsLOB1启动子进行CRISPR/Cas9靶向敲除从而获得了对柑橘溃疡病抗性提高的植株。

有大量的研究发现细胞壁关联的类受体激酶(WAKL)参与了植物体内抵御病原菌反应。组成性表达OsWAKl后发现转基因水稻对稻瘟病具有抗性(Li et al，2009)。水稻WAKL基因Xa4可提高水稻对白叶枯病的抗性，并且还能够提高水稻产量，Xa4基因通过加速合成纤维素和降低细胞壁的松弛来加固细胞壁，从而增强植株抗病性，并且还减少植株株高提高了水稻的抗倒伏能力(Hu et al，2017)。玉米中的ZmWAK对玉米丝黑穗病具有抵抗作用，当ZmWAK在中胚轴中超量表达时，能够引起植株抗病相关反应的应答，从而使丝轴黑粉菌(Sporisorium reiliana)向上生长受到抑制，从而完成抵御玉米丝黑穗病(Zuo et al，2014)。由此可见WAKL可能是一个病原菌相关基因，可能参与了植物抵御病原侵害的过程。利用WAKL基因进行抗病分子育种具有重大的潜力。

发明内容

本发明为提高柑橘对溃疡病的抗性提供一种新的选择，公开一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘溃疡病抗性的分子育种方法。该方法是将一个与编码细胞壁关联的类受体激酶的基因过表达载体整合到柑橘中，有效提高柑橘对溃疡病的抗性。

本发明通过下述技术方案实现：

一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，包括以下步骤：

(1)克隆柑橘CsWAKL08基因编码序列，然后进行超量表达载体构建；

(2)超量表达载体转化柑橘，得到转基因植株。

其中，步骤(1)中，克隆CsWAKL08基因编码序列所采用的引物为OE-CsWAKL08-F和OE-CsWAKL08-R，分别具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。

本发明中，CsWAKL08基因和CsWAKL08(CDS)分别具有如SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12所示核苷酸序列。

进一步的，步骤(1)中，柑橘CsWAKL08基因的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，最后采用高保真酶PCR扩增CsWAKL08基因编码序列，长度为2148bp。

进一步的，步骤(1)中，超量表达载体构建方法为：以pLGNe为载体，利用EcoRⅠ和KpnⅠ酶切目的片段后连接到同样酶切的载体上，构建出超量表达载体。

进一步的，pLGNe载体带有CaMV 35S启动子，CaMV 35S启动子为花菜花叶病毒启动子，具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

进一步的，步骤(2)中，超量表达载体转化柑橘的方法为：超量表达载体通过电击法转化根癌农杆菌，再用根癌农杆菌介导转化柑橘外植体。

进一步的，遗传转化后的外植体细胞经离体培养、染色鉴定、嫁接后得到转基因植株。

进一步的，步骤(2)得到转基因植株后，对转基因植株进行抗性评价，判定CsWAKL08基因超量表达与柑橘溃疡病的相关性。

进一步的，对转基因植株进行抗性评价前，通过PCR验证转基因植株，采用的引物为ID-CsWAKL08-F和ID-CsWAKL08-R，ID-CsWAKL08-F是取自载体上CaMV 35S的一段序列，ID-CsWAKL08-R是根据基因尾部一段序列设计而成，分别具有如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，阳性植株可以得到2688bp的扩增片段。

进一步的，其特征在于，PCR验证后，利用实时荧光定量PCR进行CsWAKL08基因表达量检测，采用的引物为RT-CsWAKL08-F和RT-CsWAKL08-R，分别具有如SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8所示核苷酸序列，定量PCR内参为柑橘Actin基因，采用引物为RT-CsActin-F和RT-CsActin-R，分别具有如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示核苷酸序列。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

本发明为一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，通过克隆柑橘CsWAKL08基因编码序列，进行超量表达载体构建，然后转化柑橘，得到的转基因植株溃疡病发病程度可降低至现有柑橘的43％，能够显著的减轻溃疡病的发病程度，减小病斑面积，因而得出超量表达CsWAKL08可一定程度上提高植株对溃疡病的抗性。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明CsWAKL08基因克隆的PCR扩增图谱：M为DNA分子量标准。

图2为本发明CsWAKL08植物超量表达载体构建流程图：GUS，β-葡萄糖酸苷酶基因；CaMV 35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；NOS，冠瘿碱合成酶基因终止子；载体pLGNe具有CaMV 35S启动子调控下的GUS基因，便于在植物遗传转化过程中对转化子进行GUS染色筛选。

图3为本发明CsWAKL08基因在柑橘基因组中重组验证：OE1、OE2、OE3分别代表3个转基因植株，CK为转空载体的晚锦橙植株，(下同)。

图4为本发明转基因植株表型图。

图5为本发明转基因植株GUS染色图。

图6为本发明转基因植株中CsWAKL08基因相对表达量分析图：**表示同野生型比较差异极显著(P＝0.01)，(下同)。

图7为本发明超量表达植株叶片接种溃疡病菌的10天后症状图：Mock：接种LB液体培养基为对照。

图8为本发明转基因柑橘叶片病斑大小统计图。

图9为本发明转基因柑橘叶片发病程度统计图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

经发明人研究发现：CsWAKL08基因在溃疡病抗性柑橘品种中受溃疡病菌侵染后表达量明显上调，而在溃疡病易感柑橘品种中受溃疡病菌侵染后明显下调表达，基于此，本发明开发出一种基于CsWAKL08基因超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法。

本发明实施例以晚锦橙为试验对象，在实际应用中，该方法也能够用于提高其他柑橘品种对溃疡病的抗性。

实施例1

柑橘CsWAKL08基因编码序列的克隆

1.RNA提取及cDNA合成

选取柑橘(晚锦橙)叶片0.1g用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(艾德莱，CAT：RN09)提取叶片总RNA，用非变性琼脂糖凝胶电泳验证RNA质量，用浓度计测定其浓度。使用Recombinant DNase I合成cDNA(宝生物)，cDNA于-20℃保存备用。

2.CsWAKL08基因编码序列的PCR扩增

使用引物OE-CsWAKL08-F和OE-CsWAKL08-R从柑橘cDNA中扩增获得CsWAKL08片段(图1)，片段长度为2148bp。扩增的DNA片段经测序分析为柑橘CsWAKL08基因编码序列，碱基无突变、缺失。PCR试剂盒采用PrimeSTAR master mix(宝生物)。

扩增体系：10X PCR mix：2.5μL；引物OE-CsWAKL08-F(5μmol/L)：1μL；引物OE-CsWAKL08-R(5μmol/L)：1μL；cDNA约60ng；加ddH₂O至25μL。

扩增程序：94℃，5min；94℃，30s，56℃，30s，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。

3.DNA片段回收

紫外灯下，用洁净的刀片切下含有目的片段的琼脂糖凝胶块。回收方法参照试剂盒的使用说明进行(艾德莱)，回收片段在浓度测试仪上进行定量。

实施例2

超量表达载体的构建并转化农杆菌

载体构建流程图如图2，所有限制性内切酶购自(THERMO)公司，按照使用说明操作。

具体操作如下：将CsWAKL08基因编码序列的PCR产物和超表达载体pLGNe用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切后回收进行连接过夜，连接采用T4DNA Ligase kit(宝生物)。连接产物转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆提取质粒即得到CsWAKL08的超量表达载体pLGNe-CsWAKL08。质粒提取采用试剂盒(艾德莱)。

用电激法将构建的超量表达载体质粒导入根癌农杆菌EHA105。预先取冻存的EHA105农杆菌感受态细胞(50μL)，于冰上融化。加入2μL所构建的超量表达载体的质粒于感受态细胞中，吹打混匀后，冰上放置5min。将混合液转入事先吹干的电击杯底(注意避免产生气泡)，并将电击杯放入卡槽调整到正确位点。将电击装置调节为“Agr”档，按下电击按钮，检查电击数据确保电击成功。加入1mL LB液体培养基至电击杯中，移液枪吹打混匀，移至无菌离心管中，260r/min，28℃摇床振荡培养40min。10000r/min将菌液离心1min，弃上清液(剩约100μL重悬菌体)，重悬后用移液枪打到LK固体培养基上(表达载体含有卡那抗性)，涂布均匀，28℃倒置暗培养2d。待菌斑长出后，挑取单菌落至LK液体培养基中，恒温摇床上(28℃)振荡过夜，菌液用于进行PCR验证。

实施例3

遗传转化柑橘(晚锦橙)

1.柑橘实生苗上胚轴的获得

取新鲜柑橘(晚锦橙)洗净，用70％酒精表面消毒，在无菌的条件下取出种子，剥掉种皮，接种在种子萌发培养基上萌发，28℃下暗培养2周，然后在16h光照/8h黑暗的光周期下培养1周。无菌条件下取萌发幼苗上胚轴切成1cm左右的茎段，用于根癌农杆菌的遗传转化。

2.根癌农杆菌的制备

用于转染的农杆菌菌液(含CsWAKL08超量表达载体)加入30％的无菌甘油保存于-70℃的超低温培养箱中。转染前，在含50mg/L卡那霉素的LK固体培养基上划线培养。挑农杆菌单菌落，接种于25ml含有相同抗生素的LK液体培养基中，28℃震荡培养过夜。次日，测浓度后将菌液稀释成OD值0.1的菌液进行二摇，3h后，待菌液处于对数生长期(OD值为0.5左右)时，于5000r/min离心10min，弃上清，用PH 5.4的MS液体培养基重悬后用于转染。

3.柑橘上胚轴茎段的转化

将切成1cm左右的柑橘(晚锦橙)上胚轴茎段在农杆菌中浸泡13min，期间轻微晃动。取出茎段后将表面的菌液吸干；将茎段转移到共培养培养基中，26℃按培养2d。

4.转化子的筛选

共培养完成后，将上胚轴转移到筛选培养基中，28℃暗培养7d，外植体在28℃，16h光照/8h黑暗培养，每两周继代一次。

5.转化子的成苗培养

待幼苗长到1cm以上时，将其切下后嫁接到无菌试管晚锦橙苗，在成苗培养基中进行培养；待幼苗长到5cm左右时将其嫁接到枳实生苗上，在温室中进行培养。

实施例4

转基因植株验证

1.外源基因整合的PCR检测

待长到足够大的时候取初筛得到的植株叶片100mg，使用DNA提取试剂盒(艾德莱，CAT：DN15)提取基因组DNA，PCR检测CsWAKL08基因的整合。PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，30次循环；72℃10min。检测引物为ID-CsWAKL08-F和ID-CsWAKL08-R。PCR结果见图3，阳性植株可以得到2688bp的扩增片段CK植株无扩增。经验证得到3个超量表达转基因植株。观察分析3株转基因植株表型，发现外观上看并无明显差异(图4)。说明超量表达CsWAKL08基因并未对植株的表型和发育产生直接的明显的变化。

2.转基因植株GUS染色鉴定

将转基因植株叶片切成叶圆片(直径7mm)，进行GUS组织化学染色，如图5所示，阳性植株叶圆片边缘显蓝色，野生型植株叶圆片为白色。

实施例5

CsWAKL08基因表达量分析

提取柑橘叶片，使用EAS Yspin植物RNA快速提取试剂盒(艾德莱，CAT No：RN09)提取叶片总RNA，用非变性琼脂糖凝胶电泳验证RNA质量，用浓度计测定其浓度。使用Recombinant DNase I合成cDNA(宝生物)。目的基因的检测引物为RT-CsWAKL08-F和RT-CsWAKL08-R；内参基因Actin的检测引物为RT-CsActin-F和RT-CsActin-R。

反应体积20μL，反应条件：95℃3min，94℃10s；56℃10s，72℃10s，40次循环；72℃10min。实验重复三次。采用2^-△△Ct法计算转基因植株中CsWAKL08基因的相对表达量：定义水处理的样本为参照因子，即其CsWAKL08的表达水平为1，然后计算转基因柑橘中相对参照因子基因表达的倍数2^-△△Ct，为其相对表达量。检测结果见图6。结果显示，CsWAKL08基因在转基因植株中相比野生型植株有高水平表达。

实施例6

转基因植株的抗性评价

采集成熟叶片清洗后用75％的酒精消毒后置于超纯水中冲洗，置于超净台；以叶脉为中心进行针刺，六针为一组，每侧两组；用移液器点样溃疡病菌液，每针孔点样1μL(1X10⁵CFU/mL)。然后将柑橘叶片的叶柄用浸湿的脱脂棉包裹，石蜡带密封于培养皿，于28℃恒温光照培养箱中培养(16h光照/8h黑暗)。对照组用LB代替溃疡病菌菌液，其他操作保持一致。叶片点菌后培养10天拍照，用Image J V1.47软件统计病斑面积(LesionArea,LA,mm²)。根据病情指数公式计算发病程度(Disease Index,DI)。按照病斑面积将病情分为0-7共8级，以字母R表示病斑面积，0级(R≤0.25mm²)，1级(0.25mm²＜R≤0.5mm²)，2级(0.5mm²＜R≤0.75mm²)，3级(0.75mm²＜R≤1mm²)，4级(1.0mm²＜R≤1.25mm²)，5级(1.25mm²＜R≤1.5mm²)，6级(1.5mm²＜R≤1.75mm²)，7级(R＞1.75mm²)；根据公式计算发病程度：DI＝100X Σ【各级病斑数X相应级数值】/(病斑总数X最大级数)。

超量表达植株和同时期的转空载体植株，选取发育较为一致的叶片接种溃疡病菌，同时以接种LB培养基的叶片作为阴性对照。离体接种溃疡病菌10天后，观察发现接种LB培养基的叶片均未发病，而接种溃疡病菌的植株均不同程度发病，病斑大小存在一定的差异(图7)。上述实验重复三次以确保结果的准确性。

对离体接种溃疡病菌的叶片的病斑大小进行统计。分析发现转基因植株病斑面积均显著小于转空载体对照组，其中OE1最小(图8)。转基因植株的发病程度统计发现转基因植株发病程度显著小于转空载体对照组，尤其是OE1，仅为对照组的43％(图9)。

由此可见，CsWAKL08的超量表达能够减小溃疡病的病斑面积，减轻溃疡病的发病程度。

本发明中，根癌农杆菌转化所用培养基：

种子萌发培养基：MS+30g/L蔗糖+2.5g/L Gelrite，PH 5.8。

共培养培养基：MS+2mg/L BA+0.5mg/L IAA+1mg/L2，4–D+100μmol AS+30g/L蔗糖+2.5g/L Gelrite，PH 5.8。

筛选培养基：MS+2mg/L BA+0.5mg/L IAA+500mg/L Cef+50mg/L Kan+30g/L蔗糖+2.5g/L Gelrite，PH 5.8。

成苗培养基：MS+30g/L蔗糖，PH 5.8。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(1)

<400> 1

cggggtacca tggctgttca tcaacattat ctgg 34

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(2)

<400> 2

cggaattctc actggtttga aattaaagga tct 33

<210> 3

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(3)

<400> 3

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aatccgagga ggtttccgga tattaccctt tgttgaaaag tctca 345

<210> 4

<211> 1812

<212> DNA

<213> 人工序列(4)

<400> 4

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gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga 1800

ggcaaacaat ga 1812

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(5)

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cgacacgctt gtctactcca 20

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(6)

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<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(7)

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<212> DNA

<213> 人工序列(8)

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catccctcag caccttcc 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(10)

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ccaaccttag cacttctcc 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(11)

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atggctgttc atcaacatta tctggtgttg ttgcagatta ttgttttgct tctcggaccg 60

atcgaagcat cagaaaaatt tctctgtcca tctgaatgtg gaaatgtcag catcatctac 120

cccttcggaa tcggaaaagg gtgctacttt gacaagggtt atgaagtaat ctgtgataac 180

tcttctggct ctcccaaagc ttttcttcct agtataaaga cggaactatt ggactcttac 240

tccgatacta ctattagagt caacattcct gtaatatttt tacacaatag aattgcgacg 300

aggaatcaca tggctagaga agtcaatcta tcaggtagcg cttttacctt tccctggagg 360

ctcaataaat ttacagccat aggttgtgac aattatgcaa ttgacctggg gaatgattca 420

actatttctg gtgggtgctt gtctgtttgc acttgtgatc ctactcagaa atccggttgc 480

tacgatttct tatgctccat tcctccaatt agtaaggttt tgaatgcaaa tttatcttac 540

ttttattctc aaagtatcct ccagaactgc cggtctgttt ctttggttca aggggattgg 600

ctcgactcaa gttacctgtc aaatcctcaa gttttgaaag aaagagatca agttcctgcg 660

atgttggagt ggggagaaaa aataggcact tgtattgaag aatacagctc aaatccgact 720

tcttgtaatt tgaatcaaga atgtttaatg caactaagtt caggctacgt atgtctttgt 780

gattcattag tagacggacg atattgccca ggtactgatt cgactattat ttaacaatct 840

gctgcaatcc caaacatgtg attttccttt tgctatatat tctggcttta caggtcgctt 900

gatttgtaat acctcaaacg gctacaattg ctctggatgt ccccaaggct attactcaga 960

tcgttacggt agttgccagc caattttgga gattttcttc cacaaatctc gggtcaaata 1020

tattgttata ggtatgcaaa ttgcttctat ttttaccata tatttcggat aaaaatatta 1080

aaattttctg cggagccctt ttctacacat tttgtttaac acggaccaac aaaaagatta 1140

acccaatata tatgcttttt tttttttaat tcagaaaagt catcaggcca tcaggatacc 1200

taagattttc tcaaccaccc cacaaattct gtaaatccac ttcacttcta gaaaataatt 1260

ataacattat ttcaaaaaat ttcaaataaa gaaatttttt taagaactag ttaattaaat 1320

ctatcttaat ttattttttt gtaacttaaa ttttttaatt atatttgact actaaaatcg 1380

ctttagccta aatttaaatt gactatttta cccttaaaag attaaaaaaa ataccaaaat 1440

ttactttaac ttcaacatat atttttttat tttatacaaa atttattgtt tctaaatggt 1500

caattctact ttattagtat gattattaac ctttaattga actaacataa tatctttata 1560

ggacaatact catataaatt aatagattgt caatttatgt cattcagatg taaaatattg 1620

aaaattatta gacttaatta aaaagttaga ttataagtca taaaattaaa tacctgtagt 1680

attagataca aaaacacata tttctttaag caattggtca ttttatgtca taaagaaata 1740

ttgaagcaac cttaatagta aaaaaaccta agtaagaaaa aatattaaaa aagattaatt 1800

atacaaatat ttttgttgat ttttatttat caaaaataat gtaaacttct tgtaaatatt 1860

ttttaaaagt ggggtgaatt tacacaaata atggggtgga aatatcccca cccaaaaaga 1920

aaaaaaattg tgtgtgtttt tttttttgta attcggaaaa gcctccagga ccctaaggtt 1980

ttcttaatgt acagatagac cccaatgatt taaaatatgg tcacataaac gacgtatccc 2040

tttatggaca attatgaaca aatggaatat gtttgggacc accatagtca aaggacataa 2100

ttatcttcaa agggtctgta taatataaaa aggagtttgt gtgtctattt taaaattaat 2160

ggatatgtgt acatttacat atactctaac cagaaattat aatcttactt gttcaaaatt 2220

ttaaaaatgt acacattaat tttaaaattt atagactcta actagaattt ataatcttac 2280

tattttacaa ttgtacacat taattttagg ctatattcat agtagttcga tatgataatt 2340

aaataatctc aaggatatgg tagtaatcct tgtccccaag tgctgcaggt tgcagtggtg 2400

ggcttgtact attgttccta ctcattggaa tatggtggct gtacaagttt gtaaaaagga 2460

agaggcaaat caagctcaag caaaaattct ttaaaagaaa tggtggttta attttgcaac 2520

aagagttgtc tttaagtgaa ggaaatattg agaaaacaaa actgtttact tcatatgatt 2580

tggaaaaggc cactgataac tataatacca atcgaatcct tggccaagga ggccaaggca 2640

ctgtgtacaa aggaatgttg acaaatggta gaattgtggc tgttaaaaaa tccaaattag 2700

tggatgaaag taatgttgag caatttataa atgaggtggt aattttatct caacttaacc 2760

atagaaatgt tgttaagtta ttgggatgct gcttagaaac agaagttcct cttttagtct 2820

atgaatttat tccgaatgga actctctatc agtacgtaca tgatccaata gaggagttcc 2880

cactcacatg ggaaatgcgt ttacgcatcg ctgttgaagt ttcgggtgct ctatcctatt 2940

tgcattcggc tgcttctatc ccaatttatc atcgagacat taagtctgca aacatccttt 3000

tggatgataa atttcgagcc aaagtttcag attttggggc ttctagatct attacggttg 3060

atcaaactca cttgaccact caagtacaag gaacttttgg atatctagat ccagagtatt 3120

ttcggtcaag tcaatttaca gagaaaagtg acgtttacag ttttggagta gttcttgttg 3180

agcttttaac tggacagaag cctattcgtt ctactgacgg tgaagaagat aaaagtttag 3240

caggatattt tctccaagca atgaaagaga accgtttgtt tgaagtattt gatgcgcaat 3300

ttcttaagga agctaaggaa gaagaaattg ttactgttgc tgtgcttgcg aaaaaatgct 3360

tgaacttgaa tgggaagaag agacctacaa tgaaagaagt agcattggaa ttagggggga 3420

ttagagcatc aaccggagct tccgttttgc agcatagccg tgaagagatt gattttgtgg 3480

gtggtaacga tactagacat tctgaaacta gttcatctcc gacttggtca atttcaaata 3540

gtgttgcttt ttctgtagat gtagatcctt taatttcaaa ccagtga 3587

<210> 12

<211> 2148

<212> DNA

<213> 人工序列(12)

<400> 12

atggctgttc atcaacatta tctggtgttg ttgcagatta ttgttttgct tctcggaccg 60

atcgaagcat cagaaaaatt tctctgtcca tctgaatgtg gaaatgtcag catcatctac 120

cccttcggaa tcggaaaagg gtgctacttt gacaagggtt atgaagtaat ctgtgataac 180

tcttctggct ctcccaaagc ttttcttcct agtataaaga cggaactatt ggactcttac 240

tccgatacta ctattagagt caacattcct gtaatatttt tacacaatag aattgcgacg 300

aggaatcaca tggctagaga agtcaatcta tcaggtagcg cttttacctt tccctggagg 360

ctcaataaat ttacagccat aggttgtgac aattatgcaa ttgacctggg gaatgattca 420

actatttctg gtgggtgctt gtctgtttgc acttgtgatc ctactcagaa atccggttgc 480

tacgatttct tatgctccat tcctccaatt agtaaggttt tgaatgcaaa tttatcttac 540

ttttattctc aaagtatcct ccagaactgc cggtctgttt ctttggttca aggggattgg 600

ctcgactcaa gttacctgtc aaatcctcaa gttttgaaag aaagagatca agttcctgcg 660

atgttggagt ggggagaaaa aataggcact tgtattgaag aatacagctc aaatccgact 720

tcttgtaatt tgaatcaaga atgtttaatg caactaagtt caggctacgt atgtctttgt 780

gattcattag tagacggacg atattgccca ggtcgcttga tttgtaatac ctcaaacggc 840

tacaattgct ctggatgtcc ccaaggctat tactcagatc gttacggtag ttgccagcca 900

attttggaga ttttcttcca caaatctcgg gtcaaatata ttgttatagg ttgcagtggt 960

gggcttgtac tattgttcct actcattgga atatggtggc tgtacaagtt tgtaaaaagg 1020

aagaggcaaa tcaagctcaa gcaaaaattc tttaaaagaa atggtggttt aattttgcaa 1080

caagagttgt ctttaagtga aggaaatatt gagaaaacaa aactgtttac ttcatatgat 1140

ttggaaaagg ccactgataa ctataatacc aatcgaatcc ttggccaagg aggccaaggc 1200

actgtgtaca aaggaatgtt gacaaatggt agaattgtgg ctgttaaaaa atccaaatta 1260

gtggatgaaa gtaatgttga gcaatttata aatgaggtgg taattttatc tcaacttaac 1320

catagaaatg ttgttaagtt attgggatgc tgcttagaaa cagaagttcc tcttttagtc 1380

tatgaattta ttccgaatgg aactctctat cagtacgtac atgatccaat agaggagttc 1440

ccactcacat gggaaatgcg tttacgcatc gctgttgaag tttcgggtgc tctatcctat 1500

ttgcattcgg ctgcttctat cccaatttat catcgagaca ttaagtctgc aaacatcctt 1560

ttggatgata aatttcgagc caaagtttca gattttgggg cttctagatc tattacggtt 1620

gatcaaactc acttgaccac tcaagtacaa ggaacttttg gatatctaga tccagagtat 1680

tttcggtcaa gtcaatttac agagaaaagt gacgtttaca gttttggagt agttcttgtt 1740

gagcttttaa ctggacagaa gcctattcgt tctactgacg gtgaagaaga taaaagttta 1800

gcaggatatt ttctccaagc aatgaaagag aaccgtttgt ttgaagtatt tgatgcgcaa 1860

tttcttaagg aagctaagga agaagaaatt gttactgttg ctgtgcttgc gaaaaaatgc 1920

ttgaacttga atgggaagaa gagacctaca atgaaagaag tagcattgga attagggggg 1980

attagagcat caaccggagc ttccgttttg cagcatagcc gtgaagagat tgattttgtg 2040

ggtggtaacg atactagaca ttctgaaact agttcatctc cgacttggtc aatttcaaat 2100

agtgttgctt tttctgtaga tgtagatcct ttaatttcaa accagtga 2148

Claims (10)

1.一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）克隆柑橘CsWAKL08基因编码序列，然后进行超量表达载体构建；

（2）超量表达载体转化柑橘，得到转基因植株；

CsWAKL08基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

2.根据权利要求1所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（1）中，克隆CsWAKL08基因编码序列所采用的引物为OE-CsWAKL08-F和OE-CsWAKL08-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（1）中，柑橘CsWAKL08基因编码序列的克隆方法为：提取柑橘总RNA，然后反转录为cDNA，最后采用高保真酶PCR扩增CsWAKL08基因编码序列DNA片段。

4.根据权利要求1所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（1）中，超量表达载体构建方法为：以pLGNe为载体，利用EcoRI和KpnⅠ酶切目的片段后连接到同样酶切的载体上，构建出超量表达载体pLGNe-CsWAKL08。

5. 根据权利要求4所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，pLGNe载体带有CaMV35S启动子和β-葡萄糖酸苷酶基因，分别具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（2）中，超量表达载体转化柑橘的方法为：超量表达载体通过电击法转化根癌农杆菌，再用根癌农杆菌介导转化柑橘外植体。

7.根据权利要求6所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，遗传转化后的外植体细胞经离体培养、染色鉴定、嫁接后得到转基因植株。

8.根据权利要求1所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，步骤（2）得到转基因植株后，对转基因植株进行抗性评价，判定CsWAKL08基因超量表达与柑橘溃疡病的相关性。

9.根据权利要求8所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，对转基因植株进行抗性评价前，通过PCR验证转基因植株，采用的引物为ID-CsWAKL08-F和ID-CsWAKL08-R，ID-CsWAKL08-F是取自载体上CaMV 35S的一段序列，ID-CsWAKL08-R是根据基因尾部一段序列设计而成，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示，阳性植株可以得到2688 bp的扩增片段。

10.根据权利要求9所述的一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于，PCR验证后，利用实时荧光定量PCR进行CsWAKL08基因表达量检测，采用的引物为RT-CsWAKL08-F和RT-CsWAKL08-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，实时荧光定量PCR内参为柑橘Actin基因，采用引物为RT-CsActin-F和RT-CsActin-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。

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