CN110373425B - NOR-like1基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实采后失水中的应用 - Google Patents

NOR-like1基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实采后失水中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了NOR‑like1基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实采后失水中的应用。本发明公开的NOR‑like1基因编码的蛋白质为氨基酸序列是序列3的蛋白质。本发明利用CRISPR/Cas9方法突变了植物中的NOR‑like1基因，得到了NOR‑like1基因突变体，该突变体的果实采后失水率是野生型的约4.6倍，通过甲苯胺蓝染色分析发现，NOR‑like1基因编辑的植物果实角质层存在明显缺陷，所得植物可以用于果实失水模型或角质层发育缺陷模型。以上结果说明NOR‑like1参与调控植物果实失水率及角质层发育。

Description

NOR-like1基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实采后失水 中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，NOR-like1基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实采后失水中的应用。
背景技术
果实作为植物的重要繁殖器官，是种子发育和传播的载体。同时，果实因含有碳水化合物、维生素、微量元素、膳食纤维等丰富的营养成分，也是人类和动物不可或缺的食物来源。因此，提高果实产量以及对采后失水的研究具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物果实采后失水。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了调控NOR-like1蛋白质活性的物质或调控植物NOR-like1蛋白质含量的物质在D1)-D8)任一种中的应用：
D1)调控植物果实采后失水；
D2)培育果实采后失水植物模型；
D3)调控植物果实角质层发育；
D4)培育果实角质层发育缺陷植物模型；
D5)制备调控植物果实采后失水产品；
D6)制备培育果实采后失水植物模型产品；
D7)制备调控植物果实角质层发育产品；
D8)制备培育果实角质层发育缺陷植物模型产品。
上述应用中，所述NOR-like1蛋白质可为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；
A2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述调控植物NOR-like1蛋白质含量的物质为NOR-like1蛋白质或其相关生物材料；所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码所述NOR-like1蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)抑制NOR-like1蛋白质编码基因表达的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
上述A2)中的NOR-like1蛋白质，为与序列3所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
上述A2)中的NOR-like1蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)中的NOR-like1蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上常用蛋白标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列3所示的NOR-like1蛋白质。
上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b1)-b5)中的任一种：
b1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
b2)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；
b3)序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；
b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述NOR-like1蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述NOR-like1蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码NOR-like1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的NOR-like1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码NOR-like1蛋白质且具有NOR-like1蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述应用中，B2)所述的含有编码NOR-like1蛋白质的核酸分子的表达盒(NOR-like1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达NOR-like1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动NOR-like1基因转录的启动子，还可包括终止NOR-like1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述NOR-like1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
B9)所述重组载体可为利用CRISPR/Cas9方法制备的可以降低NOR-like1含量的重组载体。所述重组载体可表达靶向B1)所述核酸分子的sgRNA。所述sgRNA的靶序列可为T1、T2、T3和/或T4，所述T1为序列1的第1262-1281位，所述T2为序列1的第1224-1205位的反向互补序列，所述T3为序列1的第1327-1346位，所述T4为序列1的第285-266位的反向互补序列。
所述重组载体具体可为pYLCRISPR/Cas9-NOR-like1基因编辑载体。所述
pYLCRISPR/Cas9-NOR-like1基因编辑载体为利用Bsa I在pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H的多克隆位点间依次插入LacZ-AtU3d-T1-gRNA、AtU3b-T2-gRNA、AtU6-1-T3-gRNA和AtU6-29-T4-gRNA得到的重组载体。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌GV3101。
上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
上述应用中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：
M1)双子叶植物或单子叶植物；
M2)茄科植物；
M3)番茄。
本发明还提供了下述M1或M2或M3的方法：
M1、培育果实采后失水植物模型的方法，包括：降低受体植物中NOR-like1蛋白质的活性、降低受体植物中NOR-like1蛋白质的含量、抑制受体植物中NOR-like1蛋白质的编码基因的表达或敲除受体植物中NOR-like1蛋白质的编码基因，得到与所述受体植物相比果实采后失水增加的目的植物，所述目的植物即为果实采后失水植物模型；
M2、提高植物果实采后失水的方法，包括：降低受体植物中NOR-like1蛋白质的活性、降低受体植物中NOR-like1蛋白质的含量、抑制受体植物中NOR-like1蛋白质的编码基因的表达或敲除受体植物中NOR-like1蛋白质的编码基因，得到与所述受体植物相比果实采后失水增加的目的植物，实现果实采后失水的提高；
M3、培育果实角质层发育缺陷植物模型的方法，包括：降低受体植物中NOR-like1蛋白质的活性、降低受体植物中NOR-like1蛋白质的含量、抑制受体植物中NOR-like1蛋白质的编码基因的表达或敲除受体植物中NOR-like1蛋白质的编码基因，得到果实角质层发育缺陷的目的植物，所述目的植物即为果实角质层发育缺陷植物模型。
所述受体植物角质层发育正常。
上述方法中，所述敲除受体植物中NOR-like1蛋白质的编码基因可利用CRISPR/Cas9方法实现。
所述CRISPR/Cas9方法中sgRNA的靶序列可为T1、T2、T3和/或T4，所述T1为序列1的第1262-1281位，所述T2为序列1的第1224-1205位的反向互补序列，所述T3为序列1的第1327-1346位，所述T4为序列1的第285-266位的反向互补序列。
在本发明的一个实施例中，所述受体植物为nor-like1#1或nor-like1#11。
与野生型植物相比，所述nor-like1#1的两条染色体的NOR-like1基因的T4序列处中发生1个核苷酸的插入，即序列1的第268-269位核苷酸间插入了一个核苷酸T。与野生型植物相比，所述nor-like1#11的两条染色体的NOR-like1基因的T2序列处缺失了11个核苷酸，即缺失了序列1的第1200-1210位核苷酸。
所述受体植物可为M1)或M2)或M3)：
M1)双子叶植物或单子叶植物；
M2)茄科植物；
M3)番茄。
本发明还提供了具有D1)-D4)中任一功能的产品，所述产品含有所述NOR-like1蛋白质或所述生物材料：
D1)调控植物果实采后失水；
D2)培育果实采后失水植物模型；
D3)调控植物果实角质层发育；
D4)培育果实角质层发育缺陷植物模型。
所述产品可以所述NOR-like1蛋白质或所述生物材料作为其活性成分，还可将所述NOR-like1蛋白质或所述生物材料与具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。
上述产品中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：
M1)双子叶植物或单子叶植物；
M2)茄科植物；
M3)番茄。
本发明利用CRISPR/Cas9方法突变了植物中的NOR-like1基因，得到了NOR-like1基因突变体，该突变体的果实采后失水率是野生型的约4.6倍，通过甲苯胺蓝染色分析发现，NOR-like1基因编辑的植物果实角质层存在明显缺陷，所得植物可以用于果实失水模型或角质层发育缺陷模型。以上结果说明NOR-like1参与调控植物果实失水率及角质层发育。
附图说明
图1为四个靶序列及其在NOR-like1基因上的位置。
图2为通过重叠PCR制备含有靶序列的sgRNA表达盒的DNA片段的步骤。
图3为CR-NOR-like1 T0代靶点编辑方式分析。a：PCR扩增靶点片段的琼脂糖凝胶电泳分析。b：CR-NOR-like1#1和CR-NOR-like1#11基因编辑方式分析，CR-NOR-like1#1-T2、CR-NOR-like1#1-T3和CR-NOR#1-like1-T4分别表示CR-NOR-like1#1的T2、T3和T4上下游序列，CR-NOR-like1#11-T1、CR-NOR-like1#11-T2和CR-NOR-like1#11-T3分别表示CR-NOR#3的T1、T2和T3上下游序列。b图中，括号中“×n*”中的n代表随机测定的12条序列中相应编辑方式出现的次数。
图4为nor-like1#1和nor-like1#11两个株系靶点编辑方式分析及蛋白表达检测。a：nor-like1#1和nor-like1#11基因编辑方式分析；b：nor-like1#1和nor-like1#11中缺失NOR-like1蛋白。#1和#11分别表示nor-like1#1和nor-like1#11。
图5为nor-like1#1和nor-like1#11两个株系果实的大小和果重分析。a：WT，nor-like1#1和nor-like1#11果实大小比较图，标尺代表2cm。b：WT，nor-like1#1和nor-like1#11果实的直径以及单果重比较图，**表示p<0.01。
图6为nor-like1#1和nor-like1#11两个株系果实采后失重率分析。a：WT、nor-like1#1和nor-like1#11果实采后贮藏10天的表型图。b：nor-like1#1和nor-like1#11突变体果实采后失重率明显高于WT，**代表p<0.01。
图7为nor-like1#1和nor-like1#11两个株系果实甲苯胺蓝染色结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的野生型番茄品种Solanum lycopersicum cv Ailsa Craig(Marian Bemer et al.,The Tomato FRUITFULL Homologs TDR4/FUL1and MBP7/FUL2Regulate Ethylene-Independent Aspects of Fruit Ripening,The Plant Cell,Vol.24:4437–4451)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、NOR-like1基因调控番茄果实的产量以及采后失水
本实施例突变番茄中的NOR-like1基因，发现该基因突变后番茄果实大小增加，且采后易于失水，NOR-like1基因的基因组序列为序列表中序列1，其CDS序列为序列表中序列2，编码序列表中序列3所示的NOR-like1蛋白质。具体步骤如下：
一、重组载体的构建
1、靶序列的选择：所选靶序列为T1(序列1的第1262-1281位)、T2(序列1的第1224-1205位的反向互补序列)、T3(序列1的第1327-1346位)和T4(序列1的第285-266位的反向互补序列)，具体见图1。
2、启动子的选择：使用拟南芥来源的4个small nuclear RNA启动子：AtU3d、AtU3b、AtU6-1、AtU6-29，启动子的排列顺序为：AtU3d，AtU3b，AtU6-1，AtU6-29。
3、含有靶序列的sgRNA表达盒的DNA片段的制备：
按照图2的原理，经过两轮PCR，获得四个DNA片段，分别为LacZ-AtU3d-T1-gRNA、AtU3b-T2-gRNA、AtU6-1-T3-gRNA和AtU6-29-T4-gRNA，LacZ-AtU3d-T1-gRNA中包含靶向T1的sgRNA(将该sgRNA记为sgRNA1)的表达盒，且sgRNA1的表达由AtU3d驱动；AtU3b-T2-gRNA中包含靶向T2的sgRNA(将该sgRNA记为sgRNA2)的表达盒，且sgRNA2的表达由AtU3b驱动；AtU6-1-T3-gRNA中包含靶向T3的sgRNA(将该sgRNA记为sgRNA3)的表达盒，且sgRNA3的表达由AtU6-1驱动；AtU6-29-T4-gRNA中包含靶向T3的sgRNA(将该sgRNA记为sgRNA3)的表达盒，且sgRNA3的表达由AtU6-29驱动。这四个DNA片段的制备方法如下：
(1)第一轮PCR
按照表1在冰上配制第一轮PCR反应体系。其中，KOD酶和10×KOD Plus Buffer为TOYOBO公司产品，各引物的序列见表2。
表1、第一轮PCR反应体系
Figure BDA0002143285940000081
制备LacZ-AtU3d-T1-gRNA时第一轮PCR所用gRT#+为gR-NOR-like1 T1，所用U#T#-为U3d-NOR-like1 T1，所用PYLgRNA-AtU#质粒为PYLgRNA-AtU3d质粒；制备AtU3b-T2-gRNA时第一轮PCR所用gRT#+为gR-NOR-like1 T2，所用U#T#-为U3b-NOR-like1 T2，所用PYLgRNA-AtU#质粒为PYLgRNA-AtU3b质粒；制备AtU6-1-T3-gRNA时第一轮PCR所用gRT#+为gR-NOR-like1 T3，所用U#T#-为U6-1-NOR-like1 T3，所用PYLgRNA-AtU#质粒为PYLgRNA-AtU6-1质粒；制备AtU6-29-T4-gRNA时第一轮PCR所用gRT#+为gR-NOR-like1 T4，所用U#T#-为U6-29-NOR-like1 T4，所用PYLgRNA-AtU#质粒为PYLgRNA-AtU6-29质粒。PYLgRNA-AtU3d质粒、PYLgRNA-AtU3b质粒、PYLgRNA-AtU6-1质粒和PYLgRNA-AtU6-29质粒均记载在文献(MaX,Zhang Q,Zhu Q,Liu W,Chen Y,Qiu R,Wang B,Yang Z,Li H,Lin Y,Xie Y,Shen R,ChenS,Wang Z,Chen Y,Guo J,Chen L,Zhao X,Dong Z,Liu Y G.A Robust CRISPR/Cas9Systemfor Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and DicotPlants[J].Molecular Plant,2015,8(8):1274-1284)中。
表2、引物序列
U-F CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG
gR-R CGGAGGAAAATTCCATCCAC
U3d-NOR-like1 T1 GCGGTGAGCACCGGCTTGTCTGACCAATGGTGCTTTG
gR-NOR-like1 T1 GACAAGCCGGTGCTCACCGCGTTTTAGAGCTAGAAAT
U3b-NOR-like1 T2 AACGGGGCGCGCCCAAATAGTGACCAATGTTGCTCC
gR-NOR-like1 T2 CTATTTGGGCGCGCCCCGTTGTTTTAGAGCTAGAAAT
U6-1NOR-like1 T3 CTTTGGGTGGTTTGCCACCACAATCACTACTTCGTCT
gR-NOR-like1 T3 TGGTGGCAAACCACCCAAAGGTTTTAGAGCTAGAAAT
U6-29NOR-like1 T4 CAATTGCCACCTGGATTTCGCAATCTCTTAGTCGACT
gR-NOR-like1 T4 CGAAATCCAGGTGGCAATTGGTTTTAGAGCTAGAAAT
配置好反应体系后，按照表3的条件进行第一轮PCR。
表3、第一轮PCR反应程序
Figure BDA0002143285940000091
PCR反应结束后，得到四种PCR产物。
(2)第二轮PCR
按照表4在冰上配制第二轮PCR反应体系，模板为稀释10倍的相应第一轮PCR反应产物。特异性引物对为如下四对引物，每个反应体系中一对引物：
Pps-GGL和Pgs-GG2组成的引物对，用于扩增LacZ-AtU3d-T1-gRNA；Pps-GG2和Pgs-GG3组成的引物对，用于扩增AtU3b-T2-gRNA；Pps-GG3和Pgs-GG4组成的引物对，用于扩增AtU6-1-T3-gRNA；Pps-GG4和Pgs-GGR组成的引物对，用于扩增AtU6-29-T4-gRNA。各引物见表5。
表4、第二轮PCR反应体系
Figure BDA0002143285940000101
表4中，特异性引物对的浓度是指该引物对中每条引物的浓度。
表5、引物序列
引物名称 序列(5’-3’)
Pps-GGL TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG
Pgs-GG2 AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC
Pps-GG2 TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG
Pgs-GG3 AGCGTGGGTCTCGTCTTCACTCCATCCACTCCAAGCTC
Pps-GG3 TTCAGAGGTCTCTAAGACTTTGGAATCGGCAGCAAAGG
Pgs-GG4 AGCGTGGGTCTCGAGTCCTTTCCATCCACTCCAAGCTC
Pps-GG4 TTCAGAGGTCTCTGACTACATGGAATCGGCAGCAAAGG
Pgs-GGR AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCT
配置好反应体系后，按照表6的条件进行第二轮PCR。
表6、第二轮PCR反应程序
Figure BDA0002143285940000102
反应完成后，将四种PCR产物等量混合后进行纯化，得到如下四个DNA片段的混合物：LacZ-AtU3d-T1-gRNA、AtU3b-T2-gRNA、AtU6-1-T3-gRNA和AtU6-29-T4-gRNA。
4、重组载体的制备
采用Golden Gate cloning方法完成目的DNA片段与pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H载体(Ma X,Zhang Q,Zhu Q,Liu W,Chen Y,Qiu R,Wang B,Yang Z,Li H,Lin Y,Xie Y,Shen R,Chen S,Wang Z,Chen Y,Guo J,Chen L,Zhao X,Dong Z,Liu Y G.A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocotand Dicot Plants[J].Molecular Plant,2015,8(8):1274-1284)的酶切连接反应，反应结束后，将序列正确的重组载体记为pYLCRISPR/Cas9-NOR-like1基因编辑载体。反应体系见表7，反应条件见表8。
pYLCRISPR/Cas9-NOR-like1基因编辑载体：pYLCRISPR/Cas9-NOR-like1基因编辑载体为利用BsaI在pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H的多克隆位点间依次插入LacZ-AtU3d-T1-gRNA、AtU3b-T2-gRNA、AtU6-1-T3-gRNA和AtU6-29-T4-gRNA得到的重组载体。
表7、sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H载体的酶切-连接体系
Figure BDA0002143285940000111
表7中，10×CutSmart Buffer为NEB公司产品，T4DNA ligase和10×T4DNA ligaseBuffer为Promaga公司产品，BsaI-HF为NEB公司产品。
表8、Golden Gate cloning反应条件
Figure BDA0002143285940000112
二、番茄遗传转化
采用农杆菌介导的叶盘转化法将pYLCRISPR/Cas9-NOR-like1基因编辑载体转化野生型番茄品种AC。所有操作均在无菌操作台中进行，具体步骤如下：
(1)播种：取适量番茄种子于无菌培养皿中，用75％的乙醇浸泡(晃动使接触均匀)消毒5min，倒掉乙醇溶液，再用4％次氯酸钠溶液浸泡(晃动使接触均匀)8min，最后用无菌水清洗7-8次，每次浸泡1min。之后将种子播种于种子萌发培养基T0。
(2)种子萌发：步骤(1)完成后，将播种好的种子置于暗室培养3-4d左右，出芽后置于光下培养2-4d，待子叶完全展开后用于下一步操作。
(3)预培养：步骤(2)完成后，将番茄小苗根部置于无菌水中，剪去子叶叶尖，将每片子叶的剩余部分剪成两个5×5mm的方块，背面向上放置于铺有一层滤纸的T1预培养培养基上，培养两天，得到预培养的外植体。
(4)制备侵染液：将pYLCRISPR/Cas9-NOR-like1基因编辑载体导入农杆菌GV3101中，得到重组菌，挑取重组菌单菌落于3mL LB培养基(含有50μg/mL卡那霉素、50μg/mL庆大霉素以及50μg/mL利福平)中，28℃过夜震荡培养16h。次日取300μl菌液于20mL LB(含有50μg/mL卡那霉素、50μg/mL庆大霉素以及50μg/mL利福平)培养基中，28℃震荡培养6-7h至OD600达到0.5-0.6。5000rpm离心10min收集菌体，用无菌水重悬菌体至0D600＝0.1-0.2，得到侵染液。
(5)共培养：将步骤(3)预培养的外植体浸泡到步骤(4)的侵染液中，轻轻震荡5min后倒掉侵染液，吸干多余侵染液后将外植体重新放回预培养培养基T1中，放置于暗室中共培养2d。
(6)芽诱导培养：步骤(5)完成后，将共培养2d的外植体从暗室取出，背面向下置于芽诱导培养基T21中，25℃16h光照/8h黑暗条件下培养7d，之后转入新鲜的芽诱导培养基T21继代培养，每隔2周更换新的培养基，直至外植体长出愈伤组织并长出小叶。
(7)芽伸长培养：步骤(6)完成后，待外植体长出小叶后转入芽伸长培养基T22中，每两周更换新鲜的培养基，直至茎伸长至4-5cm。
(8)生根培养：步骤(7)完成后，茎伸长后剪去愈伤组织，转入生根培养基T3中，培养3-4周，直至根系发达。
(9)土培：步骤(8)完成后，小心将小苗从培养基中移出，用清水将根上残留的培养基洗净，将小苗转入湿润的土盆中，培养获得14株T0代NOR-like1基因编辑植株。
种子萌发培养基T0(800mL)：MS盐1.77g，蔗糖12g，完全溶解后用1mol/L NaOH调节pH至5.8，加琼脂5.33g，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却到55℃左右倒入培养瓶中；
T1预培养培养基(800mL)：MS盐3.55g，蔗糖24g，完全溶解后用1mol/L NaOH调节pH至5.8，加琼脂5.33g，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却到55℃左右加入6-BA至浓度为1mg/L、IAA至浓度为0.1mg/L，混匀后制备平板；
芽诱导培养基T21(800mL)：MS盐3.55g，蔗糖24g，完全溶解后用1mol/L NaOH调节pH至5.8，加琼脂5.33g，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却到55℃左右加入潮霉素至浓度为10mg/L、特美汀至浓度为200mg/L、ZT至浓度为1mg/L、IAA至浓度为0.1mg/L，混匀后制备平板；
芽伸长培养基T22(800mL)：MS盐3.55g，蔗糖24g，完全溶解后用1mol/L NaOH调节pH至5.8，加琼脂5.33g，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却到55℃左右加入潮霉素至浓度为10mg/L、特美汀至浓度为200mg/L、ZT至浓度为0.5mg/L、GA至浓度为1mg/L，混匀后倒入培养瓶中；
生根培养基T3(800mL)：MS盐1.77g，蔗糖24g，完全溶解后用1mol/L NaOH调节pH至5.8，加琼脂5.33g，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却到55℃左右加入潮霉素至浓度为5mg/L、特美汀至浓度为150mg/L、IBA至浓度为2mg/L，混匀后倒入培养瓶中。
三、NOR-like1基因编辑植株的检测
以步骤二所得NOR-like1基因编辑植株的基因组DNA为模板，分别利用每个靶序列上下游约300bp附近设计的PCR引物扩增靶序列附近的600bp左右的DNA序列，并进行测序，用于基因组编辑方式检测，PCR引物序列见表9。
表9、NOR-like1基因靶点突变检测引物
Figure BDA0002143285940000131
表9中，引物For与Rev均用于扩增目的片段，Seq1、Seq2和Seq均为测序引物。
测序成功后通过靶点编辑方式分析网站DSDecode(http:// dsdecode.scgene.com/)并结合人工读峰图与基因标准序列比对分析的方法对各个靶序列及其上下游的编辑方式进行分析。
按照等位基因编辑方式的不同，可将获得的转基因分为以下几种，如表10所示：
表10、CRISPR/Cas9基因编辑方式列表
Figure BDA0002143285940000132
16株T0代NOR-like1基因编辑植株各个靶序列及其上下游的PCR扩增结果如图3中a所示，分析各靶点PCR产物测序结果后发现，在这16个株系中，选择2个代表性的发生NOR-like1基因编辑的株系CR-NOR-like1#1和CR-NOR-like1#11进行后续实验，这两个株系的基因编辑方式如图3中b所示。
由于CRISPR/Cas9基因编辑系统具有脱靶的风险，因此需要对目的基因发生编辑的阳性转基因株系进行脱靶分析，以确定只有目的基因发生基因编辑。首先，获取CRISPR-P网站预测的可能脱靶的位置信息，每个靶点筛选最可能脱靶的两条基因序列(脱靶信息见表12)；然后在SGN网站下载可能脱靶基因的DNA序列，找到可能脱靶的位置，设计PCR引物扩增并测序(脱靶检测PCR引物及测序引物见表11)；最后通过与标准序列比对确定该位置是否出现脱靶现象。结果显示，CR-NOR-like1#1和CR-NOR-like1#11中均未发生脱靶现象。
表11、脱靶位点检测引物
Figure BDA0002143285940000141
表11中，引物For与Rev均用于扩增目的片段，Seq为测序引物。
表12、潜在脱靶位点检测结果
Figure BDA0002143285940000142
随后，收集NOR-like1基因编辑的T0代转基因株系CR-NOR-like1#1和CR-NOR-like1#11的番茄种子，催芽后播种于湿润的土盆内。3周后，将植株分别编号，取真叶提取DNA，并以此DNA为模板PCR扩增各靶点序列，测序分析后，筛选出纯合突变体用于后续实验。通过上述方法，从CR-NOR-like1#1和CR-NOR-like1#11两个T0代株系中分别筛选出纯合的转基因株系，分别命名为nor-like1#1和nor-like1#11。这两个纯合株系的基因突变方式如图4所示，在这两个株系中，NOR-like1基因均发生移码突变，蛋白翻译提前终止，获得的截短蛋白分别剩余22个氨基酸和85个氨基酸，NAC结构域被破坏。具体的，nor-like1#1的两条染色体的NOR-like1基因的T4序列处中发生1个核苷酸的插入，即序列1的第268-269位核苷酸间插入了一个核苷酸T。nor-like1#11的两条染色体的NOR-like1基因的T2序列处缺失了11个核苷酸，即缺失了序列1的第1200-1210位核苷酸。
为证实nor-like1#1和nor-like1#11中NOR-like1蛋白功能缺失，合成NOR-like1蛋白特异性抗体(c-PIDHERDDLNIDMM)，用westernblot方法检测了nor-like1#1、nor-like1#11和WT番茄破色期果实中NOR-like1蛋白的表达水平。结果表明：与野生型相比，nor-like1#1和nor-like1#11中缺失完整的NOR-like1蛋白，如图4中b所示，证明nor-like1#1和nor-like1#11中NOR-like1蛋白翻译提前终止，NOR-like1蛋白功能缺失。
c-PIDHERDDLNIDMM的制备方法如下：所用抗体为委托上海艾比玛特生物技术有限公司制备的兔多抗。
对nor-like1#1和nor-like1#11进行脱靶分析后显示，这两个株系均未发生脱靶现象，脱靶检测结果见表12。此外，发明人还对NOR-like1的同源基因NOR(Solyc10g006880)基因的DNA序列进行测定，未发现脱靶。除此之外，还检测了另外两个已报道的参与番茄果实成熟的SlNAC4(Solyc11g017470)和SlNAC1(Solyc04g009440)的DNA序列，也并未发现脱靶。这些结果说明，nor-like1#1和nor-like1#11两个株系中，只有NOR-like1基因发生突变的单基因突变体，并且突变体的表型是由NOR-like1基因突变造成的。
四、表型分析
待测植株：野生型番茄品种AC(WT)、nor-like1#1和nor-like1#11。
1、番茄果实大小及种子重量的测量
采摘红熟期果实，采摘后使用游标卡尺测量其横向最大直径和最小直径，取二者的平均值作为番茄的直径；并用天平称量果实的重量。每种测量至少包含15个生物学重复。
结果(图5)显示，WT、nor-like1#1和nor-like1#11的直径分别为42.21±1.95、49.08±3.22、48.18±3.82mm，nor-like1#1和nor-like1#11的直径均显著大于WT；WT、nor-like1#1和nor-like1#11的果实重量分别为42.65±3.75、58.65±8.69、57.63±5.40g，nor-like1#1和nor-like1#11的果实重量均显著大于WT。表明，NOR-like1基因突变可提高果实大小和重量。
2、番茄果实采后失水实验
摘取各待测植株红熟期番茄果实，用蜡封好果柄伤口处以防止果实从采摘伤口处失水，立即称重，记录果重M0，并拍照。之后每天称重，待失水表型明显时，记录果重Mn，拍照并计算果实失重率，果实失重率＝(M0-Mn)/M0×100％。
通过红熟期番茄果实采后储藏实验发现，与WT相比，NOR-like1基因突变后番茄果实更容易失水。如图6所示，室温储藏10天以后，WT番茄果实表面光滑平整，但NOR-like1基因突变番茄果实却已经失水皱缩。计算果实的失重率后发现，WT果实的平均失重率为2.72％，而nor-like1#1和nor-like1#11果实的平均失重率分别高达12.68％和12.54％，显著高于野生型。即，与野生型相比，nor-like1#1和nor-like1#11果实的失水率显著增加。
甲苯胺蓝染色实验：
摘取待测植株破色期番茄果实进行甲苯胺蓝染色实验，具体操作如下：
将新鲜摘取的果实浸泡在5％的甲苯胺蓝溶液中(浸没果实的1/4)，4h后取出，用清水冲洗，观察果实的染色情况并拍照记录。
如图7所示，用5％的甲苯胺蓝染色4h后，WT果实表面出现轻微的甲苯胺蓝渗透现象，但是nor-like1#1和nor-like1#11番茄果实表面出现严重的甲苯胺蓝渗入现象，说明NOR-like1基因突变后番茄果实的角质层确实存在缺陷。
上述结果说明：NOR-like1基因编辑不利于番茄果实的采后贮藏，可通过NOR-like1基因突变制备番茄果实采后失水模型和角质层发育缺陷模型。
<110> 中国农业大学
<120> NOR-like1基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实采后失水中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2811
<212> DNA
<213> 番茄
<400> 1
caaatattat taaccaaacc aatttccagc tgattttctg tatttttgta ctactaactc 60
acagcacaca caccatttct ctctctcttc taagctgaat tttcgtatca tacaatttac 120
tctttctttc ttttttttta ttattatttt tattatatag ttttataatc aggtcgctct 180
gattaaatat atttgaaaat ttttatcaaa taatattgtg gtcatggaga gtaccgattc 240
atcaaccggc tctcatcatc aaccacaatt gccacctgga tttcgatttc atccaactga 300
tgaagagctt gtggttcatt atcttaagaa aagagttgcc tctgttcctc ttcctgtttc 360
tattattgct gaagttgatc tttacaaatt tgatccttgg gaactacctg gtatgtaatt 420
aatttttatc gcgctttata ttctgctggt attgatcgat cactaaaaaa aattgtgaga 480
tttttttcga gaatatgaaa attcacagga actttaatct ttcgtggagt tttaagtgtt 540
ttgagagggt tttcatataa taagtgtgaa tttgattctt ttgatttttt ttatttttta 600
ttttattgtt gttcaacttt tttatttctt cttccatctt cttttttatt ttgcgaattt 660
ttaagtgtga gaggattttt catataacaa gtataattct ctggttgttc cacctttttt 720
atttctcctc cttttcttcc tctcctcata ataaaatgat aatttggatt tttttttgat 780
gattctttat aagtgtttga aaaattttta ctcgataagt ttgtgtttga ttctcttttt 840
ttaaaaaaaa aaaaaatcct cctcttgttc ttcttcttct tgaggtaaca taattagcgt 900
gaattctatt ctcgtcaatt tcctttttat tttcctttcc ttcttctctc acgtcataaa 960
tgacgactca aaaatttgat aaccttttga gtgtttgaga attttccagc atgcaataag 1020
tgtgaattcg attctcgtta ttctctcttt ttatattttc cttttccttc tcccatggaa 1080
tagagttccc aggggtaatt ttgaaatttt gataacacgc gtttttcaat ttttattttc 1140
agctaaggcg acatttggag aacaagaatg gtatttcttc agtccaagag atagaaaata 1200
tcctaacggg gcgcgcccaa atagggcggc aacttccggt tattggaagg ctaccggaac 1260
cgacaagccg gtgctcaccg ccggcgggac ccaaaaagta ggtgtcaaaa aggcattggt 1320
gttttatggt ggcaaaccac ccaaaggggt gaagacaaat tggattatgc atgaatatag 1380
gcttgctgat aataaaacaa ataataagcc ccctggttgt gaccttgcca ataaaaaatc 1440
actaagggta agtacttctt tattttatta taatgtcatt ttcatacttt atttttaaat 1500
tttaatattt tcacagcaca ccatttgttg gaatagtaag tattcctttt ttgtgataat 1560
cacattagca aatacttcta tattgctaat gtttgtttca atattttata tatgacataa 1620
tgcattttgt aactcattta tgtttttttt ttaaaaataa agtaataaat agatacaatc 1680
aaatcgttga ttatatatta tattttcctt tgatacagat gtattcagtg gcataattat 1740
ataaaatgat aaataatagt caatttgaca tatacatata tcataaatct taaatacccg 1800
taataaaata tttgacctta gatattacct acctgatata gccgcctagt tagcaaaaag 1860
aaaaagatgt aataaaattg actattaaaa ggattacatt tgattggcta atggtttttt 1920
attttttaaa atatgcagct agatgattgg gttttatgta ggatttacaa gaagaataat 1980
actcaaaggc caattgatca tgaaagagat gatttgaata ttgatatgat gatgggatca 2040
tcatcaattc atccatcatg tataccaaat tcaatgtcaa tgccaaatat atttggtcaa 2100
ccaaaaatac cacaactaaa atcttcaaat tttggcacta cattaattca tgatcaaaat 2160
gaccaaaatt tatatgaagg tggatcacaa tattcttcaa aaaggccact agcaaatttg 2220
tattggaatg atcaagatgg aggagctagt aacgataatt ctcaatcaac aaaaaggttt 2280
ttgacagaaa atatggaaga tggattaaat atgaatgctc gagcagatga acaaaatgga 2340
tctatcgtaa gtcttctcag tcaacaacaa gttcttgggt ctctaagtga aggagttttt 2400
cgacaacctt attcaggcat gaattggtac tcttaaaata tcgaattata atataaaaaa 2460
aatatacgat attattatac catacaaatt aaaggtgttt gattattaca ggatcctaac 2520
taattaagat tgattaacga gtgtgttaaa attagattag tgggattgct ggatttgggt 2580
atttgagatt ttgttggttt taaattagat gatttataga tttagtgaaa aaataataat 2640
aataataatt aggtgaggga catgtatatt tttgttttat taactgttta tttttacatt 2700
atagttttat tatatatata tatatatata taaaaataca tacatctcag gaggtttgtc 2760
tgtgaataga gatgcatagg aacaaatatt gtaattaatc atatatattt t 2811
<210> 2
<211> 990
<212> DNA
<213> 番茄
<400> 2
atggagagta ccgattcatc aaccggctct catcatcaac cacaattgcc acctggattt 60
cgatttcatc caactgatga agagcttgtg gttcattatc ttaagaaaag agttgcctct 120
gttcctcttc ctgtttctat tattgctgaa gttgatcttt acaaatttga tccttgggaa 180
ctacctgcta aggcgacatt tggagaacaa gaatggtatt tcttcagtcc aagagataga 240
aaatatccta acggggcgcg cccaaatagg gcggcaactt ccggttattg gaaggctacc 300
ggaaccgaca agccggtgct caccgccggc gggacccaaa aagtaggtgt caaaaaggca 360
ttggtgtttt atggtggcaa accacccaaa ggggtgaaga caaattggat tatgcatgaa 420
tataggcttg ctgataataa aacaaataat aagccccctg gttgtgacct tgccaataaa 480
aaatcactaa ggctagatga ttgggtttta tgtaggattt acaagaagaa taatactcaa 540
aggccaattg atcatgaaag agatgatttg aatattgata tgatgatggg atcatcatca 600
attcatccat catgtatacc aaattcaatg tcaatgccaa atatatttgg tcaaccaaaa 660
ataccacaac taaaatcttc aaattttggc actacattaa ttcatgatca aaatgaccaa 720
aatttatatg aaggtggatc acaatattct tcaaaaaggc cactagcaaa tttgtattgg 780
aatgatcaag atggaggagc tagtaacgat aattctcaat caacaaaaag gtttttgaca 840
gaaaatatgg aagatggatt aaatatgaat gctcgagcag atgaacaaaa tggatctatc 900
gtaagtcttc tcagtcaaca acaagttctt gggtctctaa gtgaaggagt ttttcgacaa 960
ccttattcag gcatgaattg gtactcttaa 990
<210> 3
<211> 329
<212> PRT
<213> 番茄
<400> 3
Met Glu Ser Thr Asp Ser Ser Thr Gly Ser His His Gln Pro Gln Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Val His
20 25 30
Tyr Leu Lys Lys Arg Val Ala Ser Val Pro Leu Pro Val Ser Ile Ile
35 40 45
Ala Glu Val Asp Leu Tyr Lys Phe Asp Pro Trp Glu Leu Pro Ala Lys
50 55 60
Ala Thr Phe Gly Glu Gln Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg
65 70 75 80
Lys Tyr Pro Asn Gly Ala Arg Pro Asn Arg Ala Ala Thr Ser Gly Tyr
85 90 95
Trp Lys Ala Thr Gly Thr Asp Lys Pro Val Leu Thr Ala Gly Gly Thr
100 105 110
Gln Lys Val Gly Val Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Gly Gly Lys Pro
115 120 125
Pro Lys Gly Val Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Ala
130 135 140
Asp Asn Lys Thr Asn Asn Lys Pro Pro Gly Cys Asp Leu Ala Asn Lys
145 150 155 160
Lys Ser Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Lys Lys
165 170 175
Asn Asn Thr Gln Arg Pro Ile Asp His Glu Arg Asp Asp Leu Asn Ile
180 185 190
Asp Met Met Met Gly Ser Ser Ser Ile His Pro Ser Cys Ile Pro Asn
195 200 205
Ser Met Ser Met Pro Asn Ile Phe Gly Gln Pro Lys Ile Pro Gln Leu
210 215 220
Lys Ser Ser Asn Phe Gly Thr Thr Leu Ile His Asp Gln Asn Asp Gln
225 230 235 240
Asn Leu Tyr Glu Gly Gly Ser Gln Tyr Ser Ser Lys Arg Pro Leu Ala
245 250 255
Asn Leu Tyr Trp Asn Asp Gln Asp Gly Gly Ala Ser Asn Asp Asn Ser
260 265 270
Gln Ser Thr Lys Arg Phe Leu Thr Glu Asn Met Glu Asp Gly Leu Asn
275 280 285
Met Asn Ala Arg Ala Asp Glu Gln Asn Gly Ser Ile Val Ser Leu Leu
290 295 300
Ser Gln Gln Gln Val Leu Gly Ser Leu Ser Glu Gly Val Phe Arg Gln
305 310 315 320
Pro Tyr Ser Gly Met Asn Trp Tyr Ser
325

Claims (12)

1.调控植物NOR-like1蛋白质含量的物质在D1）-D8）任一种中的应用：
D1）调控植物果实采后失水；
D2）培育果实采后失水植物模型；
D3）调控植物果实角质层发育；
D4）培育果实角质层发育缺陷植物模型；
D5）制备调控植物果实采后失水产品；
D6）制备培育果实采后失水植物模型产品；
D7）制备调控植物果实角质层发育产品；
D8）制备培育果实角质层发育缺陷植物模型产品。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述NOR-like1蛋白质为氨基酸序列是序列3的蛋白质；
所述调控植物NOR-like1蛋白质含量的物质为NOR-like1蛋白质相关生物材料；所述生物材料为下述B1）至B9）中的任一种：
B1）编码所述NOR-like1蛋白质的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6）含有B1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2）所述表达盒的转基因植物组织；
B7）含有B1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2）所述表达盒的转基因植物器官；
B8）抑制NOR-like1蛋白质编码基因表达的核酸分子；
B9）含有B8）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b1）-b3）中的任一种：
b1）编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
b2）序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；
b3）序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为茄科植物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述茄科植物为番茄。
7.下述M1或M2或M3的方法：
M1、培育果实采后失水植物模型的方法，包括：降低受体植物中NOR-like1蛋白质的活性、降低受体植物中NOR-like1蛋白质的含量、抑制受体植物中NOR-like1蛋白质的编码基因的表达或敲除受体植物中NOR-like1蛋白质的编码基因，得到与所述受体植物相比果实采后失水增加的目的植物，所述目的植物即为果实采后失水植物模型；
M2、提高植物果实采后失水的方法，包括：降低受体植物中NOR-like1蛋白质的活性、降低受体植物中NOR-like1蛋白质的含量、抑制受体植物中NOR-like1蛋白质的编码基因的表达或敲除受体植物中NOR-like1蛋白质的编码基因，得到与所述受体植物相比果实采后失水增加的目的植物，实现果实采后失水的提高；
M3、培育果实角质层发育缺陷植物模型的方法，包括：降低受体植物中NOR-like1蛋白质的活性、降低受体植物中NOR-like1蛋白质的含量、抑制受体植物中NOR-like1蛋白质的编码基因的表达或敲除受体植物中NOR-like1蛋白质的编码基因，得到果实角质层发育缺陷的目的植物，所述目的植物即为果实角质层发育缺陷植物模型。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述敲除受体植物中NOR-like1蛋白质的编码基因利用CRISPR/Cas9方法实现。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：CRISPR/Cas9方法中sgRNA的靶序列为T1、T2、T3和/或T4，所述T1为序列1的第1262-1281位，所述T2为序列1的第1224-1205位的反向互补序列，所述T3为序列1的第1327-1346位，所述T4为序列1的第285-266位的反向互补序列。
10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为茄科植物。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述茄科植物为番茄。
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