CN113430213A - 一种调控番茄侧枝的基因及方法 - Google Patents

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Abstract

一种调控番茄侧枝的基因及方法，所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。本发明得到的转基因番茄与未转化的番茄相比，通过对植株分枝、叶夹角、花序形态观察，DCD1基因编辑番茄植株具有较少的分支、叶夹角也较野生型更小，花序更加紧凑；侧枝数目平均减少82.14%，叶夹角平均减少35%，花枝长度平均减少67%；所得的转基因番茄，具有适合密植和机械化收割的特性。

Description

一种调控番茄侧枝的基因及方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种调控番茄侧枝的基因及方法。
背景技术
番茄(学名：Solanum lycopersicum)，即西红柿，是管状花目、茄科、番茄属的一种一年生或多年生草本植物。番茄原产南美洲，中国南北方广泛栽培。番茄的果实营养丰富，具特殊风味。
在番茄育种过程中，现代番茄商业化的兴起，主要是由于番茄植株形态的改变，通过培育出多种适合不同种植条件的番茄株型，以满足商业化需要。随着科技的发展，利用转基因技术，实现植物株型的改变，已经成为创制“理想株型”的重要方法。
CRISPR-Cas9基因编辑技术，是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术目前已经广泛的用于动物、植物和微生物的基因编辑领域。CRISPR/Cas9系统由两部分构成：成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)。该系统发挥作用需要sgRNA(small guide RNA)和基因序列上的PAM结构(5′-NGG)指引Cas蛋白发挥核酸内切酶作用。已知的Cas蛋白种类繁多，目前应用最广的Cas9属于Ⅱ型系统：Cas9与sgRNA结合形成复合体，构象发生改变，在sgRNA的引导下，该复合体能够识别基因序列上的PAM位点并锚定到靶位点。在Cas蛋白核酸内切酶的作用下，靶位点产生精确的双链断裂，启动细胞的自我修复机制，导致双链断裂处碱基的缺失插入或错配，进而导致基因突变。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适合密植和机械化收割的转基因番茄的培育方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种调控番茄侧枝的基因，所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种调控番茄侧枝的方法，包括下列步骤：
步骤1：将接头正向引物F1、接头反向引物R1、接头正向引物F2、接头反向引物R2分别用无菌ddH2O溶解稀释成10μM母液，各取10μL加入到80μL无菌ddH2O中，混合稀释到1μM，然后置于PCR仪中，在85-90℃条件下处理20-40s，然后在室温条件下冷却完成靶点引物退火，得到靶点引物退火产物；
接头正向引物F1：5'-GTCAGAAGCGAAGCCCATGGAGG-3'；
接头反向引物R1：5'-AAACCCTCCATGGGCTTCGCTTC-3'；
接头正向引物F2：5'-GTCACCAGCAACCGTACCCCCAC-3'；
接头反向引物R2：5'-AAACGTGGGGGTACGGTTGCTGG-3'；
步骤2：将1μL的pYLgRNA-AtU#质粒混合液、0.5μL步骤1获得的靶点引物退火产物、35U的T4 DNA连接酶、0.5μL的10×T4 DNA连接酶反应液和5U的BsaI核酸内切酶混匀，用ddH2O补至10μL体系；PCR条件：37℃，5min；20℃，5min，PCR仪反应5个循环，使靶点引物与gRNA表达盒连接，扩增gRNA表达盒；
步骤3：以1μL步骤2反应产物为模板，加入0.2μM的引物U-F和0.2μM的接头反向引物R1与接头反向引物R2组成的混合物，1μL的dNTPs，1μL的高保真DNA聚合酶，10μL的5×高保真DNA聚合酶反应液和33μL dd H2O，获得第一扩增反应体系，PCR扩增后得到第一扩增产物；以1μL步骤2反应产物为模板，加入0.2μM的引物gRNA-R和0.2μM的接头正向引物F1或接头正向引物F2组成的混合物，1μL的dNTPs，1μL的高保真DNA聚合酶，10μL的5×高保真DNA聚合酶反应液和33μL dd H2O，获得第二扩增反应体系，PCR扩增后得到第二扩增产物；
引物U-F：5'-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3'；
步骤4：将位置特异引物B1’与位置特异引物B2混合得到PT1特异引物工作液；将位置特异引物B2’与位置特异引物BL混合得到PT2L特异引物工作液；将第一扩增产物和第二扩增产物分别稀释，然后各取1μL，混合后得到2μL模板；2μL模板、3μL 10×PT1特异引物工作液、0.6μL dNTPs、0.6μL高保真DNA聚合酶、6μL 5×高保真DNA聚合酶和17.8μL dd H2O，获得第三扩增反应体系，PCR扩增后得到第三扩增产物；2μL模板；3μL 10×PT2L特异引物工作液、0.6μL dNTPs、0.6μL高保真DNA聚合酶、6μL 5×高保真DNA聚合酶和17.8μL dd H2O，获得第四扩增反应体系，PCR扩增后得到第四扩增产物；
位置特异引物B1’：5'-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3'；
位置特异引物B2：5'-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'；
位置特异引物B2’：5'-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3'；
位置特异引物BL：5'-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'；
步骤5：将第三扩增产物和第四扩增产物混合，用普通DNA产物纯化试剂盒纯化，最后用无菌ddH2O洗脱，得到纯化后的扩增产物；
步骤6：向纯化后的扩增产物加入未切割的pYLCRISPR/Cas9-DN质粒，在15μL BsaI内切酶反应液中用10U BsaI内切酶，在37℃条件下酶切，然后再向加入0.4μL的10×NEB T4DNA ligase buffer和35U T4 DNA ligase进行PCR扩增，得到连接产物；然后将连接产物通过化学热激法转化大肠杆菌DH5α，37℃条件下200rpm培养12h后通过质粒小提试剂盒提取质粒并由生工生物工程有限公司测序检测，获得测序正确的CRIPSR-Cas9-DCD1载体；
步骤7：EHA105农杆菌感受态细胞在冰浴中融化；每100μL的EHA105农杆菌感受态细胞加3μL步骤6中测序正确的CRIPSR-Cas9-DCD1载体，用手拨打离心管底部，混匀，依次在冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；然后加入至700μL的LB液体培养基，于28℃振荡培养2～3h；6000rpm离心1min收菌，留取100μL上清，来回吹打重悬菌体，涂布于LB-Kana/Rif固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天；
步骤8：挑取含CRIPSR-Cas9-DCD1载体的农杆菌单菌落于3mL的LB-Kana/Rif液体培养基中，200rpm，28℃培养12-16h后取300μL于20mL的LB-Kana/Rif液体培养基中扩大培养，200rpm，28℃震荡培养6-7h，用分光光度计检测菌液OD600为0.5-0.6，5000rpm室温离心10min收集菌体，菌体用无菌水稀释至OD600＝0.1-0.2，得到农杆菌侵染液；
步骤9：将番茄子叶和茎段黑暗预培养2d后浸泡于所述农杆菌侵染液中，震荡、侵染5min后倒掉侵染液，移除多余侵染液；侵染后的番茄子叶和茎段再经过植物组织培养，得到转化的番茄植株。
优选的技术方案为：步骤3中，第一扩增反应体系和第二扩增反应体系的PCR扩增反应条件均为：95℃，1min；95℃，10s；60℃，15s；72℃，15s；22个循环；72℃，10min；4℃，∞。
优选的技术方案为：步骤4中，第三扩增反应体系和第四扩增反应体系的PCR扩增反应条件均为：PCR条件：95℃，1min；95℃，10s；60℃，15s；72℃，15s；18个循环；72℃，10min；4℃，∞。
优选的技术方案为：步骤6中，PCR条件：37℃，2min；10℃，3min；20℃，5min；15个循环；37℃，2min。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明得到的转基因番茄与未转化的番茄相比，通过对植株分枝、叶夹角、花序形态观察，DCD1基因编辑番茄植株具有较少的分支、叶夹角也较野生型更小，花序更加紧凑；侧枝数目平均减少82.14％，叶夹角平均减少35％，花枝长度平均减少67％；所得的转基因番茄，具有适合密植和机械化收割的特性。
附图说明
图1为CRIPSR-Cas9-DCD1质粒的测序鉴定图。黄色部分为靶点序列，表明基因编辑载体构建成功。
图2为番茄DCD1基因编辑植株靶点位置的测序鉴定图，显示等位基因均发生突变，证明已经获得DCD1基因编辑植株。
图3为DCD1基因编辑番茄植株侧枝明显比野生型番茄植株侧枝少的表型图，侧枝数目明显变少。
图4为DCD1基因编辑番茄植株花序明显比野生型番茄植株花序紧凑的表型图。
图5为DCD1基因编辑番茄植株明显比野生型番茄植株侧枝数目少的测量统计分析图。
图6为DCD1基因编辑番茄植株比野生型番茄植株花枝长度短的测量统计分析图。表明DCD1基因编辑番茄植株具有更短的花枝，进而有助于形成密集的果实，以利于番茄的机械化收割。
图7为DCD1基因编辑番茄植株比野生型番茄植株叶夹角更小的测量统计分析图。DCD1基因编辑番茄植株叶夹角较小，有助于进行番茄密植。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-7。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整。提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。
实施例1：一种调控番茄侧枝的基因及方法
一种适合密植和机械化收割的番茄基因构建方法，其特征在于，获取番茄D-半胱氨酸脱巯基酶基因DCD的基因组序列并设计靶点，将靶点连接到载体CRIPSR-Cas9上得到载体CRIPSR-Cas9-DCD1，利用农杆菌侵染法转化植物，获得基因编辑植株，对基因编辑植株进行了分析，结果表明该基因编辑后能够减少番茄侧枝数目，使花序更加紧凑，此基因编辑后适用于番茄密植和机械化收割。
一种适合密植和机械化收割的番茄基因构建方法，其特征在于，具体实施方法，包括以下步骤。
(1)获取番茄半胱氨酸脱巯基酶基因序列和gRNA候选靶点
从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中查得番茄D-半胱氨酸脱巯基酶基因DCD1的基因组序列，使用CRISPR direct(http://crispr.dbcls.jp/)网址进行gRNA候选靶点的筛选，选择两个靶点，设计两对靶点接头引物如下表。
Figure BDA0003210818150000041
Figure BDA0003210818150000051
(2)基因扩增
将接头引物F1、R1、F2、R2用无菌ddH2O溶解稀释成10μM母液，各取10μL加入到80μL无菌ddH2O中，混合稀释到1μM。置于PCR仪中约90℃30s，移至室温冷却完成退火。
配制10μL 1×BsaI内切酶切连接反应液：在1×Bsa I内切酶反应液中加入约20ngpYLgRNA-AtU#质粒(gRNA表达盒，由华南农业大学生命科学学院刘耀光实验室馈赠)，0.5μL上述靶点接头，35U T4 DNA ligase(T4 DNA连接酶)，0.5μL10×NEB T4 DNA ligasebuffer(T4 DNA连接酶反应液)，5U BsaI内切酶。用PCR仪循环反应5循环：37℃5min，20℃5min。利用此边切边连的方法，使靶点接头与gRNA表达盒连接，扩增gRNA表达盒。
第一轮扩增(每个gRNA表达盒2个PCR反应)：取1μL边切边连产物为模板，加入引物U-F/接头反向引物(反应1)，或接头正向引物/gRNA-R(反应2)各0.2μM，1μL dNTPs，1μLSuper-Fidelity DNA Polymerase(高保真DNA聚合酶)，10μL 5×SF Buffer(高保真DNA聚合酶反应液)，33μL dd H2O。PCR体系：95℃1min；95℃10s，60℃15s，72℃15s，22个循环；72℃10min；4℃∞。取2μL产物用2％琼脂糖胶电泳验证第一轮扩增产物长度是否符合。
第二轮PCR：由于有两个靶点，所以位置特异引物对为PT1，PT2L。预先将位置特异引物对混合成10×工作液，每种1.5μM：B1’+B2(PT1)，B2’+BL(PT2L)。取第一轮PCR反应1，2产物1μL用ddH2O稀释10倍，各取1μL混合为模板。各gRNA表达盒30μL PCR总体系：2μL模板；3μL 10×PT1(靶点1)/PT2L(靶点2)特异引物工作液；0.6μL dNTPs；0.6μL Super-FidelityDNA Polymerase；6μL 5×SF Buffer；17.8μL dd H2O。PCR条件：95℃1min；95℃10s，60℃15s，72℃15s，18个循环；72℃10min；4℃∞。取2μL电泳检查产物长度是否符合，并估计样品的大致浓度。
(3)扩增产物纯化
根据各样品产物估算的量，把二轮PCR产物大致等量混合，用普通DNA产物纯化试剂盒纯化，最后用50μL无菌ddH2O洗脱。取2μL样品通过琼脂糖凝胶电泳检查纯化产物是否有目的条带，条带浓度不低于5ng/μL即可进行下一步实验。
(4)获得载体CRIPSR-Cas9-DCD1
取上一步纯化后的扩增产物20-70ng，加入80-100ng未切割的pYLCRISPR/Cas9-DN质粒(由华南农业大学生命科学学院刘耀光实验室馈赠)，在15μL BsaI内切酶反应液中用10U BsaI内切酶37℃酶切10min。再向上述反应液中加0.4μL 10×NEB T4 DNA ligasebuffer和35U T4 DNA ligase进行PCR。PCR条件：37℃2min，10℃3min，20℃5min，15个循环；37℃2min。将连接产物通过化学热激法转化大肠杆菌DH5α，37℃，200rpm培养12h后通过质粒小提试剂盒提取质粒并由生工生物工程有限公司测序检测，获得测序正确的CRIPSR-Cas9-DCD1载体。
(5)获得转入CRIPSR-Cas9-DCD1的农杆菌
EHA105农杆菌感受态细胞在冰浴中融化；每100μL感受态细胞加3μL步骤(3)中测序正确的Cas9质粒，用手轻轻拨打离心管底部，混匀，依次在冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；加入700μL LB液体培养基，于28℃振荡培养2～3h；6000rpm离心1min收菌，留取100μL左右上清，来回吹打重悬菌体，涂布于LB-Kana/Rif固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。
(6)DCD1基因编辑番茄植株的获得
为了获得具有Cas9编辑的转化植株，挑取含CRIPSR-Cas9-DCD1载体的农杆菌单菌落于3mL LB-Kana/Rif液体培养基中，200rpm，28℃培养12-16h后取300μL于20mL含LB-Kana/Rif液体培养基中扩大培养，200rpm，28℃震荡培养6-7h，用分光光度计检测菌液OD600为0.5-0.6。5000rpm室温离心10min收集菌体，菌体用无菌水稀释至OD600＝0.1-0.2，现配现用。
将番茄子叶和茎段黑暗预培养2d后浸泡于上述农杆菌侵染液中，震荡，侵染5min后倒掉侵染液，用枪头吸掉多余侵染液，将子叶和茎段再经过一系列的植物组织培养过程，最终得到转化的番茄植株。
随后通过设计靶点上下游引物，提取转基因番茄植株DNA，进行PCR扩增，并进行测序鉴定，分析DCD1基因是否发生编辑。
发明方法得到的转基因番茄与未转化的番茄相比，通过对植株分枝、叶夹角、花序形态观察，DCD1基因编辑番茄植株具有较少的分支、叶夹角也较野生型更小，花序更加紧凑；具体的，侧枝数目平均减少82.14％，叶夹角平均减少35％，花枝长度平均减少67％；所得的转基因番茄，具有适合密植和机械化收割的特性。
本发明使用的试剂和材料：
Figure BDA0003210818150000061
Figure BDA0003210818150000071
本发明使用的培养基：
Figure BDA0003210818150000072
实施例2：一种调控番茄侧枝的基因及方法
一种调控番茄侧枝的基因，所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。
一种调控番茄侧枝的方法，包括下列步骤：
步骤1：将接头正向引物F1(5'-GTCAGAAGCGAAGCCCATGGAGG-3')、接头反向引物R1(5'-AAACCCTCCATGGGCTTCGCTTC-3')、接头正向引物F2(5'-GTCACCAGCAACCGTACCCCCAC-3')和接头反向引物R2(5'-AAACGTGGGGGTACGGTTGCTGG-3')分别用无菌ddH2O溶解稀释成10μM母液，各取10μL加入到80μL无菌ddH2O中，混合稀释到1μM，然后置于PCR仪中，在85-90℃条件下处理20-40s，然后在室温条件下冷却完成靶点引物退火；
步骤2：将1μL pYLgRNA-AtU#质粒混合液、0.5μL步骤1获得的靶点引物退火产物、35U的T4 DNA连接酶、0.5μL的10×T4 DNA连接酶反应液和5U的BsaI核酸内切酶混匀，用ddH2O补至10μL体系。PCR条件：37℃，5min；20℃，5min，PCR仪反应5个循环，使靶点引物与gRNA表达盒连接，扩增gRNA表达盒；
步骤3：以1μL步骤2反应产物为模板，加入0.2μM引物U-F(5'-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3')和0.2μM接头反向引物(即步骤2中的R1和R2引物)，1μL的dNTPs，1μL的高保真DNA聚合酶，10μL的5×高保真DNA聚合酶缓冲液和33μL dd H2O，获得第一扩增反应体系，PCR扩增后得到第一扩增产物；以1μL步骤2反应产物为模板，加入0.2μM的接头正向引物(即步骤2中的F1和F2引物)/gRNA-R(5'-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3')，1μL的dNTPs，1μL的高保真DNA聚合酶，10μL的5×高保真DNA聚合酶缓冲液和33μL dd H2O，获得第二扩增反应体系，PCR扩增后得到第二扩增产物；
步骤4：预先将位置特异引物对混合，即每种1.5μM：B1’(5'-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3')+B2(5'-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3')(称为PT1)，B2’(5'-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3')+BL(5'-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3')(称为PT2L)。将第一扩增产物和第二扩增产物分别稀释，然后各取1μL，混合后得到2μL模板；2μL模板、3μL 10×PT1特异引物工作液、0.6μLdNTPs、0.6μL高保真DNA聚合酶、6μL 5×高保真DNA聚合酶缓冲液和17.8μL dd H2O，获得第三扩增反应体系，PCR扩增后得到第三扩增产物；2μL模板；3μL 10×PT2L特异引物工作液、0.6μL dNTPs、0.6μL高保真DNA聚合酶、6μL 5×高保真DNA聚合酶和17.8μL dd H2O，获得第四扩增反应体系，PCR扩增后得到第四扩增产物；PCR条件：95℃1min；95℃10s，60℃15s，72℃15s，18个循环；72℃10min；4℃∞。取2μL电泳检查产物长度是否符合，并估计样品的大致浓度；
步骤5：将第三扩增产物和第四扩增产物混合，用普通DNA产物纯化试剂盒纯化，最后用无菌ddH2O洗脱，得到纯化后的扩增产物；
步骤6：向纯化后的扩增产物加入未切割的pYLCRISPR/Cas9-DN质粒，在15μL BsaI内切酶反应液中用10U BsaI内切酶37℃酶切10min，再向上述反应液中加0.4μL 10×NEBT4 DNA ligase buffer和35U T4 DNA ligase进行PCR，PCR条件：37℃2min，10℃3min，20℃5min，15个循环；37℃2min，得到连接产物；然后将连接产物通过化学热激法转化大肠杆菌DH5α，37℃，200rpm培养12h后通过质粒小提试剂盒提取质粒并由生工生物工程有限公司测序检测，获得测序正确的CRIPSR-Cas9-DCD1载体；
步骤7：EHA105农杆菌感受态细胞在冰浴中融化；每100μL EHA105农杆菌感受态细胞加3μL步骤6中测序正确的CRIPSR-Cas9-DCD1载体，用手轻轻拨打离心管底部，混匀，依次在冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；加入700μL LB液体培养基，于28℃振荡培养2～3h；6000rpm离心1min收菌，留取100μL上清，来回吹打重悬菌体，涂布于LB-Kana/Rif固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天；
步骤8：挑取含CRIPSR-Cas9-DCD1载体的农杆菌单菌落于3mL LB-Kana/Rif液体培养基中，200rpm，28℃培养12-16h后取300μL于20mL含LB-Kana/Rif液体培养基中扩大培养，200rpm，28℃震荡培养6-7h，用分光光度计检测菌液OD600为0.5-0.6；5000rpm室温离心10min收集菌体，菌体用无菌水稀释至OD600＝0.1-0.2，得到农杆菌侵染液；
步骤9：将番茄子叶和茎段黑暗预培养2d后浸泡于所述农杆菌侵染液中，震荡、侵染5min后倒掉侵染液，移除多余侵染液，将子叶和茎段再经过含不同植物激素的培养基上分别发芽、芽伸长、生根的过程，将生根的外植体转移至营养土中，进而得到转化的番茄植株。
芽诱导培养基T21：MS盐3.33g，蔗糖22.5g，琼脂5g，121℃灭菌20min；灭菌后冷却至60℃左右，加900μL 50mg/mL卡那霉素，937.5μL 160mg/mL特美汀，激素(750μL 1mg/mL玉米素，75μL 1mg/mL吲哚-3-乙酸)，混合均匀，倒平板待用。侵染后的番茄子叶和茎段在T21培养基培养30d，随后转入T22培养基培养3-4周。当芽伸长至4-5cm时，剪去根部的愈伤组织，转入生根培养基T3中，培养3-4周，进而获得转基因幼苗。培养条件为25℃，16h光照，8h黑暗。
芽伸长培养基T22：MS盐3.33g，蔗糖22.5g，琼脂5g，121℃灭菌20min；灭菌后冷却至60℃左右，加900μL 50mg/mL卡那霉素，937.5μL 160mg/mL特美汀，激素(375μL 1mg/mL玉米素，750μL 1mg/mL赤霉素)，混合均匀，倒瓶待用。
生根培养基T3：MS盐3.33g，蔗糖22.5g，琼脂5g，121℃灭菌20min；灭菌后冷却至60℃左右，加900μL 50mg/mL卡那霉素，705μL 160mg/mL特美汀，激素(750μL 2mg/mL玉米素，)，混合均匀，倒瓶待用。
利用Primer Premier 5.0软件，设计靶点上游区域和下游区域的引物，上游引物：5'-CGAGTTGCCAATGGAGTAG-3'，下游引物：5'-CAAGCAGACACACACAAACC-3'。提取转基因番茄植株DNA，进行PCR扩增，并进行测序鉴定，分析DCD1基因是否发生编辑。
PCR扩增条件：25μL反应体系，包含1μL基因组DNA，0.5μL引物对F/R，5μL DNA聚合酶缓冲液，2μL dNTPs，0.5μL DNA聚合酶，15.5μL ddH2O。PCR条件：95℃2min；95℃20s，52℃20s，72℃15s，32个循环；72℃5min；4℃∞。由图2可以看出，DCD1基因发生了基因编辑。
培养得到的转基因番茄与未转化的番茄相比，通过对植株分枝、叶夹角、花序形态观察，DCD1基因编辑番茄植株具有较少的分支、叶夹角也较野生型更小，花序更加紧凑；具体的，侧枝数目平均减少82.14％，叶夹角平均减少35％，花枝长度平均减少67％；所得的转基因番茄，具有适合密植和机械化收割的特性。
步骤3中，第一扩增反应体系和第二扩增反应体系的PCR扩增反应条件均为：95℃，1min；95℃，10s；60℃，15s；72℃，15s；22个循环；72℃，10min；4℃，∞。
实施例3：一种调控番茄侧枝的基因及方法
一种调控番茄侧枝的基因，所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。
一种调控番茄侧枝的方法，包括下列步骤：
步骤1：将接头正向引物F1、接头反向引物R1、接头正向引物F2、接头反向引物R2分别用无菌ddH2O溶解稀释成10μM母液，各取10μL加入到80μL无菌ddH2O中，混合稀释到1μM，然后置于PCR仪中，在85℃条件下处理20s，然后在室温条件下冷却完成靶点引物退火，得到靶点引物退火产物；
接头正向引物F1：5'-GTCAGAAGCGAAGCCCATGGAGG-3'；
接头反向引物R1：5'-AAACCCTCCATGGGCTTCGCTTC-3'；
接头正向引物F2：5'-GTCACCAGCAACCGTACCCCCAC-3'；
接头反向引物R2：5'-AAACGTGGGGGTACGGTTGCTGG-3'；
步骤2：将1μL的pYLgRNA-AtU#质粒混合液、0.5μL步骤1获得的靶点引物退火产物、35U的T4 DNA 连接酶、0.5μL的10×T4 DNA连接酶反应液和5U的BsaI核酸内切酶混匀，用ddH2O补至10μL体系；PCR条件：37℃，5min；20℃，5min，PCR仪反应5个循环，使靶点引物与gRNA表达盒连接，扩增gRNA表达盒；
步骤3：以1μL步骤2反应产物为模板，加入0.2μM的引物U-F和0.2μM的接头反向引物R1与接头反向引物R2组成的混合物，1μL的dNTPs，1μL的高保真DNA聚合酶，10μL的5×高保真DNA聚合酶反应液和33μL dd H2O，获得第一扩增反应体系，PCR扩增后得到第一扩增产物；以1μL步骤2反应产物为模板，加入0.2μM的引物gRNA-R和0.2μM的接头正向引物F1或接头正向引物F2组成的混合物，1μL的dNTPs，1μL的高保真DNA聚合酶，10μL的5×高保真DNA聚合酶反应液和33μL dd H2O，获得第二扩增反应体系，PCR扩增后得到第二扩增产物；
引物U-F：5'-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3'；
步骤4：将位置特异引物B1’与位置特异引物B2混合得到PT1特异引物工作液；将位置特异引物B2’与位置特异引物BL混合得到PT2L特异引物工作液；将第一扩增产物和第二扩增产物分别稀释，然后各取1μL，混合后得到2μL模板；2μL模板、3μL 10×PT1特异引物工作液、0.6μL dNTPs、0.6μL高保真DNA聚合酶、6μL 5×高保真DNA聚合酶和17.8μL dd H2O，获得第三扩增反应体系，PCR扩增后得到第三扩增产物；2μL模板；3μL 10×PT2L特异引物工作液、0.6μL dNTPs、0.6μL高保真DNA聚合酶、6μL 5×高保真DNA聚合酶和17.8μL dd H2O，获得第四扩增反应体系，PCR扩增后得到第四扩增产物；
位置特异引物B1’：5'-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3'；
位置特异引物B2：5'-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'；
位置特异引物B2’：5'-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3'；
位置特异引物BL：5'-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'；
步骤5：将第三扩增产物和第四扩增产物混合，用普通DNA产物纯化试剂盒纯化，最后用无菌ddH2O洗脱，得到纯化后的扩增产物；
步骤6：向纯化后的扩增产物加入未切割的pYLCRISPR/Cas9-DN质粒，在15μL BsaI内切酶反应液中用10U BsaI内切酶，在37℃条件下酶切，然后再向加入0.4μL的10×NEB T4DNA ligase buffer和35U T4 DNA ligase进行PCR扩增，得到连接产物；然后将连接产物通过化学热激法转化大肠杆菌DH5α，37℃条件下200rpm培养12h后通过质粒小提试剂盒提取质粒并由生工生物工程有限公司测序检测，获得测序正确的CRIPSR-Cas9-DCD1载体；
步骤7：EHA105农杆菌感受态细胞在冰浴中融化；每100μL的EHA105农杆菌感受态细胞加3μL步骤6中测序正确的CRIPSR-Cas9-DCD1载体，用手拨打离心管底部，混匀，依次在冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；然后加入至700μL的LB液体培养基，于28℃振荡培养2～3h；6000rpm离心1min收菌，留取100μL上清，来回吹打重悬菌体，涂布于LB-Kana/Rif固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2天；
步骤8：挑取含CRIPSR-Cas9-DCD1载体的农杆菌单菌落于3mL的LB-Kana/Rif液体培养基中，200rpm，28℃培养12-16h后取300μL于20mL的LB-Kana/Rif液体培养基中扩大培养，200rpm，28℃震荡培养6h，用分光光度计检测菌液OD600为0.5，5000rpm室温离心10min收集菌体，菌体用无菌水稀释至OD600＝0.1，得到农杆菌侵染液；
步骤9：将番茄子叶和茎段黑暗预培养2d后浸泡于所述农杆菌侵染液中，震荡、侵染5min后倒掉侵染液，移除多余侵染液；侵染后的番茄子叶和茎段再经过植物组织培养，得到转化的番茄植株。
优选的实施方式为：步骤3中，第一扩增反应体系和第二扩增反应体系的PCR扩增反应条件均为：95℃，1min；95℃，10s；60℃，15s；72℃，15s；22个循环；72℃，10min；4℃，∞。
优选的实施方式为：步骤4中，第三扩增反应体系和第四扩增反应体系的PCR扩增反应条件均为：PCR条件：95℃，1min；95℃，10s；60℃，15s；72℃，15s；18个循环；72℃，10min；4℃，∞。
优选的实施方式为：步骤6中，PCR条件：37℃，2min；10℃，3min；20℃，5min；15个循环；37℃，2min。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
序列表
<110> 合肥工业大学
<120> 一种调控番茄侧枝的基因及方法
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1167
<212> DNA
<213> 调控番茄侧枝的基因
<400> 1
atgtcgagtt gccaatggag tagcttcact agagtatcac tatctccatt tcccttgcag 60
ccagcacaac tcaatacggc attaaacttg aagaaacagt gttgctttac caaatcatcg 120
atggaggatt ccagttccca gggtcaccaa tcggcctttc agtttctgac gaagaagcct 180
tacgagcctc ctccatgggc ttcgcttctt agcccaattc cctctcacac cttttcgctt 240
ggtcattttc cgactccaat tcacaagtgg aacctgccta atttaccgaa gaacaccgag 300
gtttggttaa agcgtgatga tatgtcagga atgcaattaa gtggaaacaa ggtcagaaag 360
ctggagttct tgttggcaga tgctgtagca cagggtgctg actgcatagt gactataggt 420
ggcatacaaa gtaatcactg tcgtgctact gctgtcgctg ccaagtactt gaaccttgac 480
tgctatctca tcttacgcac ttcaaaggct cttaccaaaa tattgaaaga aaagctgtta 540
aatgaaggga gaaagccata tgtcatccct gttggtggat ccaattctct aggaacctgg 600
ggctatattg aggcaattag ggaattggag caacaacttc agcacttgag cattgaacag 660
aaattcgacg acattgttgt agcttgtggc agtgggggta cggttgctgg tttgtcaatt 720
gcatccatgc tcagtggctt gaaagcaaag attaatgcat tttgtgtctg cgacgatcca 780
gattactttt atgaatatgt tcaaggccta cttgacggaa tcactgctgg agttagctcc 840
cgtgatattg ttagcatcaa aactgcaaaa ggccttgggt atgctttgag caccactgat 900
gagcttaaat ttgtgaagca agttgctgaa accacaggtg ttattcttga ccctgtctac 960
agtggtaaag cagcttatgg aatgatgaaa gacatgggcg agaatccaac aaagtgggag 1020
ggaagaaaga ttctgttcat acacacaggt gggctactag gtttgtatga caaagctgat 1080
gaaatagggt cactaatggg caaatggcgt aaaatggata tcaatgaatc tatccctaga 1140
caagatggca tcggcaaaat gttctga 1167
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 接头正向引物F1
<400> 2
gtcagaagcg aagcccatgg agg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 接头反向引物R1
<400> 3
aaaccctcca tgggcttcgc ttc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 接头正向引物F2
<400> 4
gtcaccagca accgtacccc cac 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 接头反向引物R2
<400> 5
aaacgtgggg gtacggttgc tgg 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物U-F
<400> 6
ctccgtttta cctgtggaat cg 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> gRNA-R
<400> 7
cggaggaaaa ttccatccac 20
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 位置特异引物B1'
<400> 8
ttcagaggtc tctctcgact agtggaatcg gcagcaaagg 40
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 位置特异引物B2
<400> 9
agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 位置特异引物B2'
<400> 10
ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 位置特异引物BL
<400> 11
agcgtgggtc tcgaccgacg cgtccatcca ctccaagctc 40
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 上游引物
<400> 12
cgagttgcca atggagtag 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 下游引物
<400> 13
caagcagaca cacacaaacc 20

Claims (5)

1.一种调控番茄侧枝的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。
2.一种调控番茄侧枝的方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1：将接头正向引物F1、接头反向引物R1、接头正向引物F2、接头反向引物R2分别用无菌ddH2O溶解稀释成10μM母液，各取10 μL加入到80 μL无菌ddH2O中，混合稀释到1μM，然后置于PCR仪中，在85-90℃条件下处理20-40s，然后在室温条件下冷却完成靶点引物退火，得到靶点引物退火产物；
接头正向引物F1：5'-GTCAGAAGCGAAGCCCATGGAGG-3'；
接头反向引物R1：5'-AAACCCTCCATGGGCTTCGCTTC-3'；
接头正向引物F2：5'-GTCACCAGCAACCGTACCCCCAC-3'；
接头反向引物R2：5'-AAACGTGGGGGTACGGTTGCTGG-3'；
步骤2：将1μL的pYLgRNA-AtU#质粒混合液、0.5μL步骤1获得的靶点引物退火产物、35U的T4 DNA 连接酶、0.5μL的10×T4 DNA连接酶反应液和5U的BsaI核酸内切酶混匀，用ddH2O补至10μL体系；PCR条件：37℃，5min；20℃，5min，PCR仪反应5个循环，使靶点引物与gRNA表达盒连接，扩增gRNA表达盒；
步骤3：以1μL步骤2反应产物为模板，加入0.2 μM的引物U-F和0.2 μM的接头反向引物R1与接头反向引物R2组成的混合物，1μL的dNTPs，1μL的高保真DNA聚合酶，10μL的5×高保真DNA聚合酶反应液和33μL dd H2O，获得第一扩增反应体系，PCR扩增后得到第一扩增产物；以1μL步骤2反应产物为模板，加入0.2 μM的引物gRNA-R和0.2 μM的接头正向引物F1或接头正向引物F2组成的混合物，1μL的dNTPs，1μL 的高保真DNA聚合酶，10μL的5×高保真DNA聚合酶反应液和33μL dd H2O，获得第二扩增反应体系，PCR扩增后得到第二扩增产物；
引物U-F：5'-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3'；
gRNA-R：5'- CGGAGGAAAATTCCATCCAC -3'；
步骤4：将位置特异引物B1’与位置特异引物B2混合得到PT1特异引物工作液；将位置特异引物B2’与位置特异引物BL混合得到PT2L特异引物工作液；将第一扩增产物和第二扩增产物分别稀释，然后各取1μL，混合后得到2μL模板；2μL模板、3μL 10×PT1特异引物工作液、0.6μL dNTPs、0.6μL高保真DNA聚合酶、6μL 5×高保真DNA聚合酶和17.8μL dd H2O，获得第三扩增反应体系，PCR扩增后得到第三扩增产物；2μL模板；3μL 10×PT2L特异引物工作液、0.6μL dNTPs、0.6μL高保真DNA聚合酶、6μL 5×高保真DNA聚合酶和17.8μL dd H2O，获得第四扩增反应体系，PCR扩增后得到第四扩增产物；
位置特异引物B1’：5'-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3'；
位置特异引物B2：5'-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'；
位置特异引物B2’：5'-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3'；
位置特异引物BL：5'-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'；
步骤5：将第三扩增产物和第四扩增产物混合，用普通DNA产物纯化试剂盒纯化，最后用无菌ddH2O洗脱，得到纯化后的扩增产物；
步骤6：向纯化后的扩增产物加入未切割的pYLCRISPR/Cas9-DN质粒，在15μL BsaI内切酶反应液中用10U BsaI 内切酶，在37℃条件下酶切，然后再向加入0.4μL的10×NEB T4DNA ligase buffer和35 U T4 DNA ligase进行PCR扩增，得到连接产物；然后将连接产物通过化学热激法转化大肠杆菌DH5α，37℃条件下200rpm培养12h后通过质粒小提试剂盒提取质粒并由生工生物工程有限公司测序检测，获得测序正确的CRIPSR-Cas9-DCD1载体；
步骤7：EHA105农杆菌感受态细胞在冰浴中融化；每100μL的EHA105农杆菌感受态细胞加3μL步骤6中测序正确的CRIPSR-Cas9-DCD1载体，用手拨打离心管底部，混匀，依次在冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；然后加入至700μL的LB液体培养基，于28℃振荡培养2~3h；6000rpm离心1min收菌，留取100μL上清，来回吹打重悬菌体，涂布于LB-Kana/Rif固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天；
步骤8：挑取含CRIPSR-Cas9-DCD1载体的农杆菌单菌落于3mL的LB-Kana/Rif液体培养基中，200rpm，28℃培养12-16h后取300µL于20 mL的LB-Kana/Rif液体培养基中扩大培养，200rpm，28℃震荡培养6-7 h，用分光光度计检测菌液OD600为0.5-0.6，5000 rpm室温离心10 min收集菌体，菌体用无菌水稀释至OD600=0.1-0.2，得到农杆菌侵染液；
步骤9：将番茄子叶和茎段黑暗预培养2d后浸泡于所述农杆菌侵染液中，震荡、侵染5min后倒掉侵染液，移除多余侵染液；侵染后的番茄子叶和茎段再经过植物组织培养，得到转化的番茄植株。
3.根据权利要求2所述的调控番茄侧枝的方法，其特征在于：步骤3中，第一扩增反应体系和第二扩增反应体系的PCR扩增反应条件均为：95℃，1min；95℃，10s；60℃，15s；72℃，15s；22个循环；72℃，10min；4℃，∞。
4.根据权利要求2所述的调控番茄侧枝的方法，其特征在于：步骤4中，第三扩增反应体系和第四扩增反应体系的PCR扩增反应条件均为：PCR条件：95℃，1min； 95℃，10s；60℃，15s ；72℃，15s；18个循环；72℃，10min；4℃，∞。
5.根据权利要求2所述的调控番茄侧枝的方法，其特征在于：步骤6中，PCR条件：37℃，2min；10℃，3 min；20℃，5 min；15个循环；37℃，2min。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113736808A (zh) * 2021-09-27 2021-12-03 合肥工业大学 一种提高番茄植株抗病性的基因及其方法
CN114277179A (zh) * 2022-01-04 2022-04-05 东北农业大学 与番茄叶夹角大小紧密连锁的scar标记及其应用
CN114540383A (zh) * 2022-04-21 2022-05-27 浙江大学 SlSRT1基因在调控番茄侧枝发育中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101385465A (zh) * 2008-10-15 2009-03-18 合肥工业大学 一种硫氢化钠促进植物根形态建成的新用途
US20090226984A1 (en) * 2008-03-06 2009-09-10 Gen Nonaka L-cysteine producing bacterium and a method for producing l-cysteine
CN105753956A (zh) * 2016-05-13 2016-07-13 中国农业科学院植物保护研究所 陆地棉GhB2蛋白及其编码基因与应用
CN107254478A (zh) * 2017-06-23 2017-10-17 山西大学 番茄sllcd基因及其应用
CN108893481A (zh) * 2018-06-21 2018-11-27 山西大学 番茄SlOAS7基因及其应用
CN110373425A (zh) * 2019-07-25 2019-10-25 中国农业大学 NOR-like1基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实采后失水中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090226984A1 (en) * 2008-03-06 2009-09-10 Gen Nonaka L-cysteine producing bacterium and a method for producing l-cysteine
CN101385465A (zh) * 2008-10-15 2009-03-18 合肥工业大学 一种硫氢化钠促进植物根形态建成的新用途
CN105753956A (zh) * 2016-05-13 2016-07-13 中国农业科学院植物保护研究所 陆地棉GhB2蛋白及其编码基因与应用
CN107254478A (zh) * 2017-06-23 2017-10-17 山西大学 番茄sllcd基因及其应用
CN108893481A (zh) * 2018-06-21 2018-11-27 山西大学 番茄SlOAS7基因及其应用
CN110373425A (zh) * 2019-07-25 2019-10-25 中国农业大学 NOR-like1基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实采后失水中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BILJANA TODOROVIC ET AL.: "The interconversion of ACC deaminase and D-cysteine desulfhydrase by directed mutagenesis", 《PLANTA》 *
GENBANK: "PREDICTED: Solanum lycopersicum D-cysteine desulfhydrase (LOC100191113), transcript variant X1, mRNA，XM_019212580.2", 《GENBANK》 *
王沙沙: "H_2S和D/L-CD调节番茄果实成熟衰老的生理机制研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 农业科技辑》 *
许艳等: "半胱氨酸脱硫酶结构与功能研究进展", 《生命的化学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113736808A (zh) * 2021-09-27 2021-12-03 合肥工业大学 一种提高番茄植株抗病性的基因及其方法
CN113736808B (zh) * 2021-09-27 2024-04-26 合肥工业大学 一种提高番茄植株抗病性的基因及其方法
CN114277179A (zh) * 2022-01-04 2022-04-05 东北农业大学 与番茄叶夹角大小紧密连锁的scar标记及其应用
CN114540383A (zh) * 2022-04-21 2022-05-27 浙江大学 SlSRT1基因在调控番茄侧枝发育中的应用

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