CN117447575B - 深根蛋白在特异性调控玉米根夹角中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及深根蛋白在特异性调控玉米根夹角中的应用。本发明利用ZmUbiquitin‑1启动子驱动ZmDRO1La的表达，首次发现ZmDRO1La超表达后可以增强玉米根系的向重力性，进而使玉米根夹角显著减小。同时降低了玉米株高和穗位高。进一步的，本发明利用OsRCc3根系特异性启动子驱动ZmDRO1La的表达，首次发现可以特异性的调控玉米根夹角，使玉米根夹角显著减小，但不影响玉米地上部其他性状。为未来基于根系改良提高玉米产量与水肥利用效率提供了重要的基因资源。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及深根蛋白在特异性调控玉米根夹角中的应用。
背景技术
粮食生产过程中化肥投入量高、养分效率低，减肥增效已成为重大需求！为了满足全球人口增长对粮食的需求，提高作物单产是第一选择。但在获得高产的同时，过量施用农药和化肥也极大增加了环境负担，导致土壤酸化、大气污染、水体富营养化等一系列环境问题，不利于农业的可持续发展。如何在减少化肥投入的前提下继续提高作物产量，已经成为农业科学家们急需解决的重要问题。
根系是作物吸收养分、水分的重要器官，并且在自然界中存在着丰富的遗传变异。根系构型作为根系性状的重要组成部分，在植物生长发育过程中发挥重要的作用。根系构型包括根夹角，根面积，根宽等相关性状。在玉米中，根夹角被认为是一个重要的农艺性状，它决定了根系在土壤中的分布深度和宽度【He K, Zhao Z, Ren W, Chen Z, Chen L,Chen F, Mi G, Pan Q, Yuan L. Mining genes regulating root system architecturein maize based on data integration analysis. Theor Appl Genet. 2023 May 15;136(6):127. Doi: 10.1007/s00122-023-04376-0. PMID: 37188973.】。大的根夹角往往具有更多浅层的根系，分布在土壤表层，有利于吸收分布在土壤表层难以移动的养分，比如磷。而陡峭的根夹角意味着根系有更加深层的分布，能够更好的吸收土壤深层的氮素和水分等【Schneider HM, Yang JT, Brown KM, Lynch JP. Nodal root diameter and nodenumber in maize (Zea mays L.) interact to influence plant growth undernitrogen stress. Plant Direct. 2021 Mar 16;5(3):e00310. doi: 10.1002/pld3.310. PMID: 33748655; PMCID: PMC7963125.】。特别是在高密度种植条件下，陡峭的根夹角能够减少玉米根与根之间的竞争，提高玉米养分吸收利用效率。因此，挖掘调控玉米根夹角的关键基因，对于创建高产养分高效玉米新品种具有重要意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了深根蛋白在特异性调控玉米根夹角中的应用。本发明发现深根蛋白ZmDRO1La的编码基因ZmDRO1La超表达后可以增强玉米根系的向重力性，进而使玉米根夹角显著减小。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种调控玉米根夹角的ZmDRO1La蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明提供了编码上述技术方案所述ZmDRO1La蛋白的ZmDRO1La基因，所述ZmDRO1La基因的CDS序列如SEQ ID NO.15所示。
本发明提供了上述技术方案所述的ZmDRO1La蛋白或上述技术方案所述的ZmDRO1La基因在调控玉米性状中的应用，所述性状包括根夹角大小、株高和穗位高中的一种或多种。
优选的，所述调控包括1）~3）中的一种或多种：
1）ZmDRO1La蛋白表达量增加或ZmDRO1La基因过表达减小玉米根夹角；
2）ZmDRO1La蛋白表达量增加或ZmDRO1La基因过表达降低玉米株高；
3）ZmDRO1La蛋白表达量增加或ZmDRO1La基因过表达降低玉米穗位高。
本发明提供了水稻RCc3基因启动子驱动上述技术方案所述的ZmDRO1La基因表达在减小玉米根夹角中的应用。
优选的，所述水稻RCc3基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明提供了一种减小玉米根夹角的重组载体，包括重组基因和原始载体；所述重组基因包括水稻RCc3基因启动子和上述技术方案所述的ZmDRO1La基因。
优选的，所述原始载体包括pCXUN载体。
本发明提供了一种构建减小玉米根夹角重组载体的试剂盒，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和pCXUN载体；所述第一引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述第二引物对的序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；所述第三引物对的序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；所述第四引物对的序列如SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14所示。
本发明提供了上述技术方案所述重组载体或上述技术方案所述的试剂盒在减小玉米根夹角或培育玉米根夹角降低的玉米品种中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种调控玉米根夹角的ZmDRO1La蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。本发明利用ZmUbiquitin-1启动子驱动ZmDRO1La蛋白的编码基因ZmDRO1La的表达，首次发现ZmDRO1La超表达后可以增强玉米根系的向重力性，进而使玉米根夹角显著减小。同时降低了玉米株高和穗位高。
进一步的，本发明利用OsRCc3根系特异性启动子驱动ZmDRO1La的表达，首次发现可以特异性的调控玉米根夹角，使玉米根夹角显著减小，但不影响玉米地上部其他性状，仅特异性的调控玉米根夹角的改变。为未来基于根系改良提高玉米产量与水肥利用效率提供了重要的基因资源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为ZmDRO1La超表达载体骨架；
图2为实施例1中OE-ZmDRO1La不同超表达转化事件表达量的鉴定结果；
图3为实施例2中ZmDRO1La时空表达模式分析及调控模式结果；
图4为实施例3中超表达ZmDRO1La后根系重力反应结果；
图5为实施例4中ZmDRO1La的表型结果；
图6为实施例5中RCc3-ZmDRO1La不同转化事件表达量的鉴定结果；
图7为实施例6中RCc3-ZmDRO1La的表型结果。
具体实施方式
本发明提供了一种调控玉米根夹角的ZmDRO1La蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，具体为：MGIINWMQDRFNGKHDKRRPEAINSGSARESCRQDDRAREGKSRNDGGDWPAPQHGLLSIGTLGDDDPPPPRASSQADDVLDFTIEEVKKLQDALNKLLRRAKSKSSSSSSSSRGSGASATDEDRRASHSQLPLDRFLNCPSSLEVDRRVSLIRHDGGGESGEFSPDTQIILSKARDLLVHSNGTAIRKKSFKFLLKKMFVCHGGFAPAPSLKDPVESRMEKLFRTMLQKKMNARPSNAAVSSRKYYLDDKPSGRMMTRDGRRRHDGEDDDEKGSDRIKWDKTDTDCNSLLVLKFCGGLIFISQLTSGGDDLESEEKSTTIIRIKGVFS。
本发明还提供了编码上述技术方案所述ZmDRO1La蛋白的ZmDRO1La基因，所述ZmDRO1La基因的CDS序列如SEQ ID NO.15所示，具体为：5'-ATGGGGATCATTAACTGGATGCAGGATCGCTTCAACGGTAAACACGATAAGAGGCGACCCGAGGCCATTAACTCGGGATCAGCTCGCGAAAGCTGCCGCCAAGACGACCGCGCGCGCGAGGGCAAGAGCCGCAACGACGGCGGCGACTGGCCGGCGCCACAGCACGGCCTCCTGTCGATCGGGACGCTGGGAGACGACGACCCGCCGCCGCCGCGCGCGTCGTCGCAGGCCGACGACGTGCTGGACTTCACCATCGAGGAGGTGAAAAAGCTCCAGGACGCGCTGAACAAGCTGCTCCGGCGCGCCAAGTCCAAGTCCAGCTCCAGCTCCAGCTCCTCCCGCGGGTCGGGCGCCAGCGCCACCGACGAGGACCGCCGCGCCAGCCACAGCCAGCTGCCGCTCGACAGGTTCCTCAACTGCCCCTCCAGCCTCGAGGTCGACCGGAGGGTCTCGCTGATCAGGCACGACGGTGGTGGCGAGAGCGGCGAGTTCTCGCCGGACACGCAGATCATACTCAGCAAGGCCAGGGATCTCCTCGTCCACAGCAACGGCACCGCCATCAGGAAGAAGTCGTTCAAGTTCCTCCTGAAGAAGATGTTCGTCTGCCATGGCGGCTTCGCCCCCGCGCCGAGCTTGAAGGATCCAGTTGAATCGAGAATGGAGAAGTTGTTCAGAACGATGCTTCAGAAGAAGATGAATGCTCGCCCGAGCAACGCTGCAGTGTCATCCAGGAAGTACTACCTCGACGACAAGCCGAGCGGGAGGATGATGACACGGGATGGTCGTCGTCGTCACGATGGAGAGGACGATGACGAGAAGGGCTCTGACAGAATCAAGTGGGATAAAACTGATACTGACTGCAATTCGTTGCTGGTGCTAAAATTTTGTGGTGGTTTGATCTTTATTTCGCAGCTTACGAGTGGTGGTGATGACCTTGAGTCAGAGGAGAAATCCACTACAATAATCCGTATTAAAGGAGTGTTCAGTTGA-3'。
本发明利用ZmUbiquitin-1启动子驱动ZmDRO1La蛋白的编码基因ZmDRO1La的表达，首次发现ZmDRO1La超表达后可以增强玉米根系的向重力性，进而使玉米根夹角显著减小。同时降低了玉米株高和穗位高。
本发明还提供了上述技术方案所述的ZmDRO1La蛋白或上述技术方案所述的ZmDRO1La基因在调控玉米性状中的应用，所述性状包括根夹角大小、株高和穗位高中的一种或多种。在本发明中，所述调控优选包括1）~3）中的一种或多种：
1）ZmDRO1La蛋白表达量增加或ZmDRO1La基因过表达减小玉米根夹角；
2）ZmDRO1La蛋白表达量增加或ZmDRO1La基因过表达降低玉米株高；
3）ZmDRO1La蛋白表达量增加或ZmDRO1La基因过表达降低玉米穗位高。
本发明还提供了水稻RCc3基因启动子（启动子OsRCc3）驱动上述技术方案所述ZmDRO1La基因表达在减小玉米根夹角中的应用。在本发明中，所述启动子OsRCc3的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.16所示，具体为：5'-TTAGAAGCAGTACGATCTTATTTGGTGGAGTTGAAAATTATAAGAAACAACTGACAAGCAATCAACCAACATATACTGAATATGGGAAAGTTTCTTTTAGCTTTTCTAAATTAAGTACTGATTCTTAAACTTAAGTGAGAATCTAGCCTGTTCAGGGGCGACGGCTAAAGGACATAGCACCACTAGTCTACGCGATTGCAAAAAAGAAGAATGCAAGCCTGCAACAAGTATCGCTTTCCCGACCAATGGTTGGTTGACCTCGGTTTGCCGGTAACCTCAGGCTGGACGACAGAACTAATTAGCCAACTTGTCAATGTCTAGGGTGCTGTTCATAGCCTGCAGTTGACAGAGTACGAAAAGGACAAGATCACATGGAAGCTAACTAGTCACGGCGAATACATGACGACATCGGCCTACAACGCACAACTTCTTGGCATAAAAGCTTCAATTTCAATGCCCCTATCTGGAAGCCCTAGGCGCCGCGCAAATGTAAAACATTCGCTTCGCTTGGCTTGTTATCCAAAATAGAGTATGGACCTCCGACAGATTGGCAACCCGTGGGTAATCGAAAATGGCTCCATCTGCCCCTTTGTCGAAGGAATCAGGAAACGGCCCTCACCTCCTGGCGGAGTGTAGATATGTGAAAGAATCTAGGCGACACTTGCAGACTGGACAACATGTGAACAAATAAGACCAACGTTATGGCAACAAGCCTCGACGCTACTCAAGTGGTGGGAGGCCACCGCATGTTCCAACGAAGCGCCAAAGAAAGCCTTGCAGACTCTAATGCTATTAGTCGCCTAGGATATTTGGAATGAAAGGAACCGCAGAGTTTTTCAGCACCAAGAGCTTCCGGTGGCTAGTCTGATAGCCAAAATTAAGGAGGATGCCAAAACATGGGTCTTGGCGGGCGCGAAACACCTTGATAGGTGGCTTACCTTTTAACATGTTCGGGCCAAAGGCCTTGAGACGGTAAAGTTTTCTATTTGCGCTTGCGCATGTACAATTTTATTCCTCTATTCAATGAAATTGGTGGCTCACTGGTTCATTAAAAAAAAAAGAATCTAGCCTGTTCGGGAAGAAGAGGATTTTGTTCGTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAGGAGGAGGAGGATTTTCAGGCTTCGCATTGCCCAACCTCTGCTTCTGTTGGCCCAAGAAGAATCCCAGGCGCCCATGGGCTGGCAGTTTACCACGGACCTACCTAGCCTACCTTAGCTATCTAAGCGGGCCGACCTAGTAGCCACGTGCCTAGTGTAGATTAAAGTTGCCGGGCCAGCAGGAAGCCACGCTGCAATGGCATCTTCCCCTGTCCTTCGCGTACGTGAAAACAAACCCAGGTAAGCTTAGAATCTTCTTGCCCGTTGGACTGGGACACCCACCAATCCCACCATGCCCCGATATTCCTCCGGTCTCGGTTCATGTGATGTCCTCTCTTGTGTGATCACGGAGCAAGCATTCTTAAACGGCAAAAGAAAATCACCAACTTGCTCACGCAGTCACGCTGCACCGCGCGAAGCGACGCCCGATAGGCCAAGATCGCGAGATAAAATAACAACCAATGATCATAAGGAAACAAGCCCGCGATGTGTCGTGTGCAGCAATCTTGGTCATTTGCGGGATCGAGTGCTTCACAGCTAACCAAATATTCGGCCGATGATTTAACACATTATCAGCGTAGATGTACGTACGATTTGTTAATTAATCTACGAGCCTTGCTAGGGCAGGTGTTCTGCCAGCCAATCCAGATCGCCCTCGTATGCACGCTCACATGATGGCAGGGCAGGGTTCACATGAGCTCTAACGGTCGATTAATTAATCCCGGGGCTCGACTATAAATACCTCCCTAATCCCATGATCAAAACCATCTCAAGCAGCCTAATCATCTCCAGCTGATCAAGAGCTCTTAATTAGCTAGCTAGTGATTAGCTGCGCTTGTGATCGATCGATCTCGGGTACGTAGCA-3'。
本发明利用OsRCc3根系特异性启动子驱动ZmDRO1La的表达，首次发现可以特异性的调控玉米根夹角，使玉米根夹角显著减小，但不影响玉米地上部其他性状，仅特异性的调控玉米根夹角的改变。
本发明还提供了一种减小玉米根夹角的重组载体，包括重组基因和原始载体；所述重组基因包括水稻RCc3基因启动子和上述技术方案所述的ZmDRO1La基因。在本发明中，所述水稻RCc3基因启动子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.16所示；所述重组基因优选为水稻RCc3基因启动子和上述技术方案所述的ZmDRO1La基因直接连接，即SEQ ID NO.16所示的序列后连接SEQ ID NO.15所示的序列；所述原始载体优选包括pCXUN载体；所述重组基因位于pCXUN载体的Hind III酶切位点之间。本发明对所述pCXUN载体的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售产品即可。本发明实施例所用pCXUN载体优选由中国农业大学作物功能基因组与分子育种研究中心提供，公开于文献【Song W, Yan S, Li Y, FengS, Zhang JJ, Li JR. Functional characterization of squalene epoxidase andNADPH-cytochrome P450 reductase in Dioscorea zingiberensis. Biochem BiophysRes Commun. 2019 Feb 12;509(3):822-827. doi: 10.1016/j.bbrc.2019.01.010. Epub2019 Jan 9. PMID: 30638657.】。
本发明优选还提供了上述技术方案所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：
以玉米B73的cDNA为模板，利用第一引物对进行第一轮PCR扩增，得到扩增产物ZmDRO1La CDS；所述第一引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
以水稻ZH11的DNA为模板，利用第二引物对进行第二轮PCR扩增，得到扩增产物OsRCc3启动子序列；所述第二引物对的序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
以所述扩增产物ZmDRO1La CDS为模板利用第三引物对进行第三轮PCR扩增，得到插入片段ZmDRO1La；所述第三引物对的序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；
以所述扩增产物OsRCc3启动子序列为模板，利用第四引物对进行第四轮PCR扩增，得到插入片段RCc3；所述第四引物对的序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；
将pCXUN载体经Hind III酶切后得到线性载体；
将所述线性载体、插入片段RCc3和插入片段ZmDRO1La进行同源重组，得到所述重组载体。
在本发明中，所述第一轮PCR扩增、第二轮PCR扩增、第三轮PCR扩增和第四轮PCR扩增的反应程序均优选为：94℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸60s，共38个循环；68℃终延伸5min。
本发明还提供了一种构建减小玉米根夹角重组载体的试剂盒，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和pCXUN载体；所述第一引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述第二引物对的序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；所述第三引物对的序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；所述第四引物对的序列如SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14所示。
本发明还提供了上述技术方案所述重组载体或上述技术方案所述的试剂盒在减小玉米根夹角或培育玉米根夹角降低的玉米品种中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的深根蛋白在特异性调控玉米根夹角中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
ZmDRO1La超表达转基因材料构建
本实施例用到的载体为pBCXUN载体，载体骨架如图1所示，其中，启动子为ZmUbiquitin1的启动子，后面带有Myc标签，终止子为Tnos终止子，ZmDRO1La处于启动子与终止子之间，该载体由中国农业大学作物功能基因组与分子育种研究中心提供，公开于文献【Qin YJ, Wu WH, Wang Y. ZmHAK5 and ZmHAK1 function in K+ uptake anddistribution in maize under low K+ conditions. J Integr Plant Biol. 2019 Jun;61(6):691-705. doi: 10.1111/jipb.12756. Epub 2019 Feb 1. PMID: 30548401.】。载体使用Xcm I单酶切，PCR产物连接于酶切位点之间。
1、目的基因CDS的克隆。
设计引物：扩增 ZmDRO1La 的引物对由上游引物 ZmDRO1La-F 和下游引物ZmDRO1La-R 组成。其中 ZmDRO1La-F 和 ZmDRO1La-R 均恰好包含翻译起始密码子ATG 和翻译终止密码子 TGA 反向互补的序列，具体如下：
ZmDRO1La-F：5'-ATGGGGATCATTAACTGGAT-3'，SEQ ID NO.1；
ZmDRO1La-R：5'-TCAACTGAACACTCCTTTAA-3'，SEQ ID NO.2；
以玉米B73根总RNA反转录的cDNA为模板，使用高保真酶KOD（KOD 高保真酶购自NEB有限公司）扩增，分别获得包含完整开放阅读框架的ZmDRO1La基因片段。
扩增体系：2×PCR Buffer for KOD FX 25μL，2mM dNTPs 10μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM) 1μL，KOD酶1μL，cDNA 1μL，灭菌ddH2O补足至50μL。
扩增程序：94℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸60s，共38个循环；68℃终延伸5min。
2、PCR产物回收。
取 5 μl PCR 产物，于 1.0% 琼脂糖凝胶上电泳检测，选择目的条带大小正确且单一的条带直接利用回收试剂盒（E.Z.N.A. Cycle Pure Kit, OMEGA）进行回收纯化，试验方法参考该试剂盒所带说明书。
3、植物表达载体的构建。
以 ZmDRO1La CDS 回收产物为模板利用带有载体同源臂的新引物再次进行 PCR扩增，扩增引物由上游引物 Infusion-ZmDRO1La-F 和下游引物 Infusion-ZmDRO1La-R 组成。利用 in-fusion（infusion 试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，SE 无缝克隆和组装试剂盒 目录号：ZC231）的方法构建载体，具体方法如下：
引物序列：
Infusion-ZmDRO1La-F：5'-AGATCTTCCAATACTAATGGGGATCATTAACTGGATGCAG-3'，SEQ ID NO.3；
Infusion-ZmDRO1La-R：5'-CGGATCCCCAATACTTCAACTGAACACTCCTTTAATACGG-3'，SEQ ID NO.4；
反应体系：5×SE Cloning Buffer 2μL，pBCXUN 线性载体（10~50ng）1μL，插入片段2μL，SE Recombinase 1μL，ddH2O补充到10μL；混匀后在37℃水浴锅或PCR仪中反应15分钟，然后转移到冰上或-20℃保存；
4、玉米遗传转化
将测序正确的重组质粒采用电击法转化EHA105农杆菌，在含有利福平和卡那霉素抗性培养基上培养，菌落 PCR 鉴定获得阳性单克隆菌株。用携带目的基因的农杆菌转化菌株转化玉米自交系 B73-329 幼胚，经过涂抹草丁膦筛选获得单拷贝纯合阳性苗。
5、ZmDRO1La 超表达不同转化事件（即转基因株系）表达量鉴定
将玉米自交系 B73-329 及 OE-ZmDRO1La 两个不同的转化事件（OE-ZmDRO1La-1和OE-ZmDRO1La-2）先用 1/2 霍格兰营养液培养 3 天，然后移至霍格兰营养液中培养 14天，每隔 3 天换一次培养液，取玉米整株根系，每 3 棵植株混一个样，设置 3 个重复。用液氮收取玉米根系。
用 Trizol 法提取玉米根部总 RNA。所得总 RNA 用反转录试剂盒经过去除总RNA 中的 DNA 后，再反转录成 cDNA。利用Quantitative Real-time PCR 的方法，以引物qPCR-ZmDRO1La-F 和 qPCR-ZmDRO1La-R 扩增玉米 ZmDRO1La 基因，以引物 qPCR-ZmTUB4-F 和 qPCR-ZmTUB4-R 扩增玉米 ZmTUB4 基因作为内参对照，用同一样品中的 ZmDRO1La基因的表达量除以 ZmTUB4 基因的表达量作为 ZmDRO1La 基因的相对表达量，检测ZmDRO1La 基因在不同转化事件中的表达量情况。引物序列如下：
qPCR-ZmDRO1La-F：5'-GCGCCAAGTCCAAGTCCA-3'，SEQ ID NO.5；
qPCR-ZmDRO1La-R：5'-CACCACCGTCGTGCCTGAT-3'，SEQ ID NO.6；
qPCR-ZmTUB4-F：5'-GCTATCCTGTGATCTGCCCTGA-3'，SEQ ID NO.7；
qPCR-ZmTUB4-F：5'-CGCCAAACTTAATAACCCAGTA-3'，SEQ ID NO.8；
mRNA 反转录的方法参考 PrimeScript TM RT reagent kit with gDNA Eraser试剂盒（Takara）说明书。
qPCR的反应体系：SYBR Premix Ex Taq II 12.5 μL、正向引物 （10 μM）1 μL、反向引物 （10 μM）1 μL、cDNA 1 μL和灭菌ddH2O 9.5 μL。
qPCR 反应程序如表1所示。
表1 qPCR 反应程序
结果如图 2 所示，图中显示数据为：平均值±标准差，T检验：* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。可以看出相比于野生型，OE-ZmDRO1La 两个转化事件表达量都有不同程度的显著增加，其中 OE-ZmDRO1La-1 相比于野生型表达量提高196倍，OE-ZmDRO1La-2相比于野生型表达量提高203倍。这说明 ZmDRO1La 的两个超表达转化事件都超表达成功，可以进一步用于后续功能研究。
实施例2
ZmDRO1La 时空表达模式分析及调控模式
1. ZmDRO1La 时空表达模式分析
为了进一步明确 ZmDRO1La 的功能，本发明以自交系 B73-329 为试验材料对ZmDRO1La 进行了时空表达模式分析。试验设置苗期（出苗后14天）、拔节期（出苗后30天）、吐丝期（出苗后60天）、授粉后15天四个时期，每时期取根尖、地下节根、气生根、基部、茎和叶，取样后用锡箔纸包住，迅速放入液氮中保存，利用研钵将各组织磨碎，利用 Trizol 法提取玉米总 RNA。所得总 RNA 用反转录试剂盒经过去除总 RNA 中的 DNA 后，再反转录成cDNA。利用实施例1中的Quantitative Real-time PCR 的方法，检测ZmDRO1La 基因在不同组织的表达量情况。
结果如图3中的A所示，图中显示数据为：平均值±标准差，One-way ANOVA统计检验：不同小写字母代表P<0.05。发现 ZmDRO1La 在玉米苗期、拔节期的根尖及基部特异性表达，玉米基部是节根发生的关键部位。其他时期地上部均没有检测到 ZmDRO1La 的表达。说明 ZmDRO1La 在调控玉米根系生长发育过程中起着关键的作用。
2. ZmDRO1La 光调控模式
为了进一步明确 ZmDRO1La 受外界环境因子的调控模式，本发明以自交系 B73-329 为试验材料对 ZmDRO1La 进行了光表达调控模式的研究。试验以水培体系，模拟根系生长在黑暗环境下，设置地上部长期黑暗和光照两个处理，分别在地上部黑暗和光照持续培养一周后，取地上部及根系样品，取样后用锡箔纸包住，迅速放入液氮中保存，利用研钵将各组织磨碎，利用 Trizol 法提取玉米总 RNA。所得总 RNA 用反转录试剂盒经过去除总RNA 中的 DNA 后，再反转录成 cDNA。利用实施例1中的Quantitative Real-time PCR 的方法，检测ZmDRO1La 基因在不同组织的表达量情况。
结果如图3中的B所示，图中显示数据为：平均值±标准差，One-way ANOVA统计检验：不同小写字母代表P<0.05。可以发现，相比于黑暗条件，光照条件下 ZmDRO1La 在根中的表达量显著提高，而地上部无显著差异。这说明 ZmDRO1La 特异性受地上部光的调控且仅在根中发挥作用。
实施例3
ZmDRO1La 根系向重力性测定
配置含1.5 %植物凝胶的1/2MS固体培养基（pH=5.8），组分如下：MS 基础盐（phytotech） 2.165 g、植物凝胶15 g、蔗糖15 g、灭菌 ddH2O定容到1 L；
将各组分充分溶解后用5 M NaOH 溶液调 pH 值至 5.8。121℃ 高压灭菌20 min。
实验材料为 B73-329（野生型）及实施例1中的OE-ZmDRO1La 两个不同转化事件，实验材料用 2% 次氯酸钠消毒 30 分钟后，用 70% 酒精快速漂洗 5~10 s，再用灭菌的ddH2O 涡旋震荡漂洗 6 次，每次 1 min。消毒后的种子种于 1/2MS 固体培养基中，28℃培养生长至胚芽鞘和主胚根共长约 10 厘米左右，将竖直生长的幼苗水平放置，放置 12小时后测定主胚根弯曲角度。实验重复3次，每次重复每个株系30株。根系弯曲频率计算方法参见【Yang P, Wen Q, Yu R, Han X, Deng XW, Chen H. Light modulates thegravitropic responses through organ-specific PIFs and HY5 regulation of LAZY4expression in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Aug 4;117(31):18840-18848. doi: 10.1073/pnas.2005871117. Epub 2020 Jul 20. PMID: 32690706;PMCID: PMC7414047.】
结果如图4所示，图中显示数据为：根系弯曲频率分布位置，T检验：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，其中图4中的A为根系重力处理12小时后的表型图片；图4中的B为根系重力处理12小时后的统计结果。
由图4可知，OE-ZmDRO1La 两个转化事件其重力弯曲角度显著大于野生型，相比于野生型，重力弯曲角度平均增加10°。这说明 ZmDRO1La 能够影响玉米根系的向重力性。
实施例4
ZmDRO1La 田间表型功能验证
田间表型试验设计：本实验于2023年在中国北京进行，实验材料为野生型 B73-329 和实施例1中的OE-ZmDRO1La 两个不同转化事件。试验设计采用随机区组试验，设置 3个重复，单行种植，每行长 4 米，宽 50 厘米，株距 25 厘米，双粒播种，待出苗后长至两叶一心开始间苗，间苗后每行留 17 株。采用标准的栽培管理方法。在吐丝期取样，分析地上部及根系构型等相关性状，根系开放夹角的测定方法参见【Ren W, Zhao L, Liang J,Wang L, Chen L, Li P, Liu Z, Li X, Zhang Z, Li J, He K, Zhao Z, Ali F, Mi G,Yan J, Zhang F, Chen F, Yuan L, Pan Q. Genome-wide dissection of changes inmaize root system architecture during modern breeding. Nat Plants. 2022 Dec;8(12):1408-1422. doi: 10.1038/s41477-022-01274-z. Epub 2022 Nov 17. PMID:36396706.】。结果如图5所示，其中图5中的A为野生型与 OE-ZmDRO1La不同转化事件根系表型图片；图5中的B为野生型与 OE-ZmDRO1La 不同转化事件根夹角表型统计结果；图5中的C为野生型与OE-ZmDRO1La 不同转化事件地上部表型图片；图5中的D为野生型与 OE-ZmDRO1La 不同转化事件株高表型统计结果；图5中的E为野生型与OE-ZmDRO1La不同转化事件穗位高表型统计结果。ns为与对照组相比没有显著性差异。图中显示数据为：平均值±标准差，T检验：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
由图5可知，相比于野生型，超表达 ZmDRO1La 根夹角显著减小。野生型平均角度为77.59°，OE-ZmDRO1La-1 平均角度为66.77°，OE-ZmDRO1La-2 平均角度为70.33°，相比于野生型，角度分别降低了 13.94%、9.36%。同时本发明也发现超表达ZmDRO1La 后，相比于野生型，其株高，穗位高也显著降低，因此，本发明证明 ZmDRO1La 具有调控玉米根夹角的功能，同时也影响玉米的株高穗位高。
实施例5
根系特异性启动子 RCc3-ZmDRO1La 超表达转基因材料构建
为了消除超表达转基因株系对玉米产生的株高穗位高影响，本发明利用一个根系特异性启动子 RCc3驱动了 ZmDRO1La 的表达，希望可以特异性调控玉米根夹角的改变。
1. 植物总DNA提取
（1）将水稻ZH11植物样品在液氮中充分研磨所需样品，并将约 200 mg 左右样品加入 2 mL 离心管中。
（2）吸取 600 μL 65℃预热的CTAB溶液加入离心管中，混匀样品。
（3）将离心管放于 65℃金属浴中，热浴 30 min，期间轻柔颠倒混匀数次。
（4）取出离心管，冷却至室温后加入 600 μL 三氯甲烷，震荡 3 min。室温，12,000rpm 离心 5 min。
（5）小心吸取上层溶液，移至 1.5 mL 离心管中，并加入同等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置 10 min。
（6）室温，12,000 rpm 离心 10 min。去上清，加入 1 mL 75%乙醇，颠倒数次清洗沉淀。
（7）重复步骤（6）。
（8）室温，12,000 rpm 离心 2 min。去上清，室温晾干沉淀后加入 50 μL 无菌水溶解沉淀。
2.特异性启动子的克隆
以水稻 ZH11 gDNA为模板进行PCR 扩增，扩增引物由上游引物 Pro-OsRCc3-F 和下游引物Pro-OsRCc3-R 组成。
引物序列如下：
Pro-OsRCc3-F：5'-TTAGAAGCAGTACGATCTTATTTGGTGGAGTTG-3'，SEQ ID NO.9；
Pro-OsRCc3-R：5'-TGCTACGTACCCGAGATCGATCGATCACAA-3'，SEQ ID NO.10；
扩增体系、扩增程序和PCR 产物回收的方法同实施例1.
3.特异性启动子与 ZmDRO1La 同源重组载体构建
试验用到的载体为pCXUN载体，该载体由中国农业大学作物功能基因组与分子育种研究中心提供。
以步骤2扩增出来的OsRCc3启动子序列为模板，用引物 infusion-OsRCc3-F 和infusion-OsRCc3-R 扩增，得到插入片段1（RCc3）；
以实施例1中扩增出来的ZmDRO1La CDS为模板，用引物 infusion2-ZmDRO1La-F和infusion2-ZmDRO1La-R 扩增得到插入片段2（ZmDRO1La）；扩增的反应体系和反应程序同实施例1。将所述插入片段1（RCc3）、插入片段2（ZmDRO1La）和线性化载体进行同源重组，得到重组质粒；所述线性化载体为pCXUN载体经Hind III酶切后得到。
引物序列如下：
infusion2-ZmDRO1La-F：5'-CTCGGGTACGTAGCAATGGGGATCATTAACTGGATG-3'，SEQID NO.11；
infusion2-ZmDRO1La-R：5'-CGCGCCTACTAGTGAAGCTTTCAACTGAACACTCCTTTAATAC-3'，SEQ ID NO.12；
infusion-OsRCc3-F：5'-CGACGGCCAGTGCCAAGCTTTTAGAAGCAGTACGATCTTATTTG-3'，SEQ ID NO.13；
infusion-OsRCc3-R：5'-TGCTACGTACCCGAGATCGATCGATCACAA-3'，SEQ ID NO.14；
同源重组的反应体系：5×SE Cloning Buffer 2 μL，线性化载体（10~50ng）1μL，插入片段1（RCc3）1 μL，插入片段2（ZmDRO1La）1 μL，SE Recombinase 1μL，ddH2O补充到10μL。
将构建的重组质粒进行玉米遗传转化，方法同实施例1。
4.RCc3-ZmDRO1La 转基因株系不同转化事件表达量鉴定
将玉米自交系 B73-329 及 RCc3-ZmDRO1La 两个不同的转化事件（RCc3-ZmDRO1La-1和RCc3-ZmDRO1La-2）先用 1/2 营养液（同实施例1）培养 3 天，然后移至正常营养液中培养 14 天，每隔 3 天换一次培养液，取玉米整株根系，每 3 棵植株混一个样，设置 3 个重复。用液氮收取玉米根系。
用 Trizol 法分别提取玉米根部和地上部总 RNA。所得总 RNA 用反转录试剂盒经过去除总 RNA 中的 DNA 后，再反转录成 cDNA。利用实施例1中的Quantitative Real-time PCR 的方法，检测ZmDRO1La 基因在不同转化事件中的相对表达量。
实验结果如图6所示，ND为未检测出表达量。图中显示数据为：平均值±标准差，T检验：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。可以看出相比于野生型，RCc3-ZmDRO1La 两个转化事件根系内表达量都有不同程度的显著增加，其中 RCc3-ZmDRO1La-1 相比于野生型根系表达量提高403倍，RCc3-ZmDRO1La-2 相比于野生型根系表达量提高353倍。并且 RCc3-ZmDRO1La 地上部表达量相比于野生型没有显著差异。这说明利用 RCc3 特异性启动子，仅驱动了 ZmDRO1La 在根系的特异性表达，并不影响地上部表达量的改变。
实施例6
根系特异性启动子 RCc3-ZmDRO1La 田间功能验证
为了进一步明确根系特异性启动子 RCc3 驱动 ZmDRO1La 表达后的功能，本发明在田间进行了功能验证。田间表型试验设计：本实验于 2023 年中国北京进行，实验材料为野生型 B73-329 和实施例5筛选的超表达 RCc3-ZmDRO1La 两个不同转化事件（RCc3-ZmDRO1La-1和RCc3-ZmDRO1La-2）。试验设计采用随机区组试验，设置 3 个重复，单行种植，每行长 4 米，宽 50 厘米，株距 25 厘米，双粒播种，待出苗后长至两叶一心开始间苗，间苗后每行留 17 株。采用标准的栽培管理方法。在吐丝期取样，分析地上部及根系构型等相关性状，根系开放夹角的测定方法参见【Ren W, Zhao L, Liang J, Wang L, Chen L, LiP, Liu Z, Li X, Zhang Z, Li J, He K, Zhao Z, Ali F, Mi G, Yan J, Zhang F,Chen F, Yuan L, Pan Q. Genome-wide dissection of changes in maize root systemarchitecture during modern breeding. Nat Plants. 2022 Dec;8(12):1408-1422.doi: 10.1038/s41477-022-01274-z. Epub 2022 Nov 17. PMID: 36396706.】，叶夹角的测定方法参见【Tian J, Wang C, Xia J, Wu L, Xu G, Wu W, Li D, Qin W, Han X,Chen Q, Jin W, Tian F. Teosinte ligule allele narrows plant architecture andenhances high-density maize yields. Science. 2019 Aug 16;365(6454):658-664.doi: 10.1126/science.aax5482. PMID: 31416957.】，结果如图7所示，其中图7中的A为野生型与RCc3-ZmDRO1La 不同转化事件根系表型图片；图7中的B为野生型与 RCc3-ZmDRO1La不同转化事件根夹角表型统计结果；图7中的C为野生型与 RCc3-ZmDRO1La 不同转化事件地上部表型图片；图7中的D为野生型与RCc3-ZmDRO1La不同转化事件株高表型统计结果；图7中的E为野生型与 RCc3-ZmDRO1La 不同转化事件穗位高表型统计结果；图7中的F为野生型与 RCc3-ZmDRO1La 不同转化事件叶面积表型统计结果；图7中的G为野生型与 RCc3-ZmDRO1La 不同转化事件叶夹角表型统计结果，ns为相对于对照组无显著性差异。图中显示数据为：平均值±标准差，T检验：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
由图7可知，相比于野生型，RCc3-ZmDRO1La相比于野生型，根夹角显著减小，RCc3-ZmDRO1La 其角度平均减小15°（图7中的A，图7中的B），同时，本发明发现，RCc3-ZmDRO1La在株高（图7中的C，图7中的D）、穗位高（图7中的E）、叶面积（图7中的F）以及叶夹角（图7中的G）性状上，与野生型相比均没有显著差异。这说明利用 RCc3 驱动 ZmDRO1La 表达，可以特异性的调控玉米根夹角，但不影响玉米地上部其他性状。这将为以后评价根夹角的改变对玉米产量形成养分效率利用提供优异的基因资源。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (9)
1.一种调控玉米根夹角的ZmDRO1La蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
2.编码权利要求1所述ZmDRO1La蛋白的ZmDRO1La基因，其特征在于，所述ZmDRO1La基因的CDS序列如SEQ ID NO.15所示。
3.权利要求1所述的ZmDRO1La蛋白或权利要求2所述的ZmDRO1La基因在调控玉米性状中的应用，所述性状包括根夹角大小、株高和穗位高中的一种或多种；所述调控为1）~3）中的一种或多种：
1）ZmDRO1La蛋白表达量增加或ZmDRO1La基因过表达减小玉米根夹角；
2）ZmDRO1La蛋白表达量增加或ZmDRO1La基因过表达降低玉米株高；
3）ZmDRO1La蛋白表达量增加或ZmDRO1La基因过表达降低玉米穗位高。
4.水稻RCc3基因启动子驱动权利要求2所述的ZmDRO1La基因过表达在减小玉米根夹角中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述水稻RCc3基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
6.一种减小玉米根夹角的重组载体，其特征在于，包括重组基因和原始载体；所述重组基因包括水稻RCc3基因启动子和权利要求2所述的ZmDRO1La基因。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述原始载体包括pCXUN载体。
8.一种构建减小玉米根夹角重组载体的试剂盒，其特征在于，包括第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和pCXUN载体；所述第一引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示；所述第二引物对的序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；所述第三引物对的序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；所述第四引物对的序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。
9.权利要求6或7所述重组载体或权利要求8所述的试剂盒在减小玉米根夹角或培育玉米根夹角降低的玉米品种中的应用。
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