CN102942623B - AtTAR2蛋白及其编码基因在调控植物侧根发育中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种AtTAR2蛋白及其编码基因在调控植物侧根发育中的应用。本发明提供了AtTAR2蛋白或其编码基因在调控植物侧根发育中的应用；所述AtTAR2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，将AtTAR2基因转入野生型拟南芥中得到转AtTAR2基因拟南芥，其株系的根系侧根数目和长度极显著高于野生型植株，可以增加转基因植株对水分以及营养元素的吸收。因而在同样的土壤肥力的条件下，特别是低氮条件下，AtTAR2转基因植株可以少施肥，减少土壤环境污染，节约资源。本发明的基因及其编码蛋白在植物中，特别是小麦，水稻和棉花等粮食和经济作物的品种改良中将发挥重要的作用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种AtTAR2蛋白及其编码基因在调控植物侧根发育中的应用。
背景技术
氮是植物生长所必需的大量营养元素之一，是植物体内含量最丰富的矿质元素，是生物体内多种有机分子的组成元素，如氨基酸、嘌呤、嘧啶等，这些分子又是蛋白质和核酸的结构单位。植物对氮素的缺乏可导致植物生长缓慢，产量下降；也可使粮食作物籽粒蛋白质含量下降，降低品质。氮肥的使用，是几十年来作物产量大幅提高的重要原因。但是90年代以来，我国氮肥使用率继续大幅提高的同时，粮食总产和单产增长却放缓甚至停滞不前。据估计，80年代至90年代初，我国氮肥利用率平均约为35%；而到了90年代中后期，氮肥利用率普遍下降，目前中国小麦和玉米的平均氮肥利用率约为27%(张福锁等.,2007)。近年对高产作物品种的研究也发现，尽管一些新的作物品种具有很好的产量，氮肥利用率却不高，高产不高效成为高产育种的一个重要问题，同时大幅度提高我国粮食单产和养分利用效率是我国农业可持续发展的关键(张福锁等,2007)。同时有多达45–50%的氮肥未被农作物吸收利用而损失进入环境，导致资源浪费和环境污染(Zhu and Chen,2002)。
发达的根系是植物高效吸收水分以及营养元素的重要生理基础之一，这已被许多生理学研究所证明。如在小麦中，氮高效小麦品种科农9204和小偃54在表层（topsoil）和底层（subsoil）土壤中的根长比京411的发达，吸氮效率也高（张丽娟等,2005;Wanget al.,2011）。小麦-黑麦1BL/1RS易位系在小麦育种中得到广泛利用，这与黑麦1RS可显著增加小麦表层和深层根系生物量、促进氮等养分吸收有关（Ehdaie et al.,2010）。鉴于根系在高效吸收水肥方面的重要性，科学家认为遗传改良农作物根系形态构型是实现第二次绿色革命、进一步提高产量的关键(de Dorlodot et al.,2007;Lynch,2007;Den Herder et al.,2010)。
植物在长期的进化过程中形成了一系列适应机制，使根系形态因土壤环境变化而发生适应性变化。在拟南芥中，缺氮可促进主根和侧根的伸长(Linkohr et al.,2002)；高氮（如高浓度硝酸盐）可显著抑制侧根伸长（Zhang et al.,1999）。在低营养条件下根系形态的这种适应性变化有效增加了根－土接触面积，以利植物从缺素土壤中尽可能多的吸收养分。如氮高效玉米自交系478根系大，在缺氮条件下侧根总长度增加幅度大；而氮低效自交系Wu312的根系小，在缺氮条件下侧根总长度基本不增加（Liu et al.,2009）。研究发现，根系对低氮响应较好（即低氮条件下根系生物量或根长增加较多）的小麦种质，耐低氮的能力也强。因此，研究供氮水平调控根系形态的分子机理具有重要的科学意义。
对模式植物拟南芥的研究结果表明，生长素信号在氮素调控拟南芥根系形态方面发挥了重要作用（Zhang et al,1999;Vidal et al.,2010;Gifford et al.,2008）。
发明内容
本发明的一个目的是提供AtTAR2蛋白或其编码基因的新用途。
本发明提供了AtTAR2蛋白或其编码基因在调控植物侧根发育中的应用；所述AtTAR2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
上述应用中，所述调控植物侧根发育为促进植物侧根发育；所述促进植物侧根发育具体在氮胁迫下进行。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明提供的方法，为将AtTAR2蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物的侧根总长度或数目多于所述目的植物；所述AtTAR2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
上述方法中，所述AtTAR2蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。
上述方法中，所述转基因植物的侧根总长度或数目多于所述目的植物是在氮胁迫下体现的。
上述方法中，所述AtTAR2蛋白的编码基因通过重组载体导入目的植物；
所述重组载体为将所述AtTAR2蛋白的编码基因导入表达载体中得到的载体；具体为将序列表中的序列1所示的核苷酸插入PRI101-6X MYC的salI和sma1酶切识别位点之间得到的载体；
所述PRI101-6X MYC为将序列表中的序列3插入载体PRI101的SmaI和BamHI位点间得到的载体。
上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
本发明的第三个目的是提供一种重组载体。
本发明提供的重组载体，为将AtTAR2蛋白的编码基因导入表达载体中得到的载体；所述AtTAR2蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。上述重组载体具体为将序列表中的序列1所示的核苷酸插入PRI101-6X MYC的salI和sma1酶切识别位点之间得到的载体。
所述PRI101-6X MYC为将序列表中的序列3插入载体PRI101的SmaI和BamHI位点间得到的载体。
含有上述重组载体的重组菌或转基因细胞系也是本发明保护的范围。
上述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。
使用AtTAR2基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素（Ubiquitin）基因启动子（pUbi）等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
本发明还保护所述基因在植物育种中的应用。
本发明的实验证明，将AtTAR2基因转入野生型拟南芥中得到转AtTAR2基因拟南芥，其株系的根系侧根数目和长度极显著高于野生型植株，可以增加转基因植株对水分以及营养元素的吸收。因而在同样的土壤肥力的条件下，特别是低氮条件下，AtTAR2转基因植株可以少施肥，减少土壤环境污染，节约资源。本发明的基因及其编码蛋白在植物中，特别是小麦，水稻和棉花等粮食和经济作物的品种改良中将发挥重要的作用，应用前景广阔。
附图说明
图1为PRI101/AtTAR2的部分结构示意图
图2为野生型、突变体及转基因拟南芥TAR2基因相对表达量
图3为野生型、突变体及转基因拟南芥在高氮(HN，6mM氮)和低氮(LN，0.2mM氮)条件下植株根系的生长情况
图4为野生型、突变体及转基因拟南芥在高氮(HN，6mM氮)和低氮(LN，0.2mM氮)条件下的侧根数
图5为野生型、突变体及转基因拟南芥在高氮(HN，6mM氮)和低氮(LN，0.2mM氮)条件下的侧根总长度
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中定量检测，实验重复三次，结果取平均值。
实施例1、突变体的鉴定
订购拟南芥tar2-c突变体SALK_143208.56.00.x种子（ABRC，http://www.arabidopsis.org，已知仅为AtTAR2突变），播种后单株提取叶片DNA并PCR鉴定T-DNA插入位点是否纯合。鉴定引物如下：LP:CTGCAACAGTGAAAAACATGG，RP:TATGTTAGCATATGGCCCGTG，LBb 1.3:ATTTTGCCGATTTCGGAAC，PCR扩增体系为共20μl，其中模板DNA 1μl，Taq酶（购自TOYOBO公司）0.5μl，10×PCR buffer2μl，dNTPs上下游引物各
再用双蒸水将反应体系补充至
95℃预变性2分钟，95℃变性30秒，58℃复性45秒，72℃延伸1分钟；40个循环。反应结束后，扩增产物经1%琼脂糖凝胶分离。获得LP+RP为阴性，LBb1.3+RP的PCR扩增产物500bp的株系，为T-DNA插入纯合的株系，后续的表型鉴定均使用此株系。
实施例2、转AtTAR2拟南芥的获得及表型鉴定
一、转AtTAR2拟南芥的获得
1、基因（AtTAR2)的获得
提取拟南芥Col-0（ABRC，以下也称为野生型拟南芥）总RNA，反转录得到拟南芥的全基因组cDNA，作为模板，以带有salI酶切位点的上游引物：5’-ACGCGTCGACATGGGACAGATTCCGAGGTTTCTTTC-3’和带有sma1酶切位点的下游引物：5’-CCCGGGCAAAGTTGAATTAAAGGAAGATGTAATCCTG-3’为引物，进行PCR扩增，PCR体系为共40μl，其中模板cDNA 4μl，KOD-plus-DNA聚合酶（购自TOYOBO公司）1μl，10×PCR buffer for KOD–plus-4μl，dNTPs（2mM each）MgSO4（25mM）
上下游引物各
再用双蒸水将反应体系补充至
PCR反应程序为：98℃2分钟，（98℃30秒，58℃30秒，68℃45秒）×35循环，72℃延伸10min。
反应结束后，1335bp扩增产物经1%琼脂糖凝胶分离，回收得到PCR产物克隆到pEASYTM-Blunt（全式金公司，产品目录号CB501-02）载体上进行测序鉴定，结果表明，该PCR产物的基因具有序列表中序列1所示的核苷酸，将该基因命名为AtTAR2,该基因编码的蛋白命名为AtTAR2，其氨基酸序列为序列表中的序列2；将含有该PCR产物载体命名为pEASYTM-Blunt-AtTAR2。
2、重组载体的构建
将上述pEASYTM-Blunt-AtTAR2用salI和smaI进行双酶切，回收AtTAR2片段，将回收AtTAR2片段与经过同样酶切的PRI101-6X MYC在多克隆位点的salI和smaI之间片段连接，得到重组载体。
PRI101-6X MYC（连有6X MYC的载体PRI101）为将序列表中的序列3插入载体PRI101（PRI101购自TAKARA，产品目录号D3262）的SamI和BamHI位点间得到的载体。
经过测序，该重组载体为将序列表中序列1所示的核苷酸插入载体PRI101-6X MYC的salI和sma1酶切识别位点之间得到的载体，将该重组载体命名为PRI101/AtTAR2；该载体中AtTAR2基因由35S启动子启动，还含有一个由NOS启动子启动表达的NPTII基因表达盒（见图1），可在后续工作中利用硫酸卡那霉素（kanamycin sulfate）筛选转化植株提供抗性。
3、转AtTAR2拟南芥的获得
将构建好的重组载体PRI101/AtTAR2转化至农杆菌GV3101（购自普如汀生物技术（北京）有限公司，产品目录号Biovector-375）中，得到重组菌GV3101/PRI101/AtTAR2；提取质粒测序，该质粒为PRI101/AtTAR2,说明含有该质粒的重组菌GV3101/PRI101/AtTAR2为阳性。
培养重组菌GV3101/PRI101/AtTAR2至OD值至0.8-1.0，得到农杆菌菌液；将上述农杆菌菌液采用拟南芥花序浸花转化法转入野生型拟南芥中，转化后22℃避光平置培养一天，一天后摆正正常培养得到转AtTAR2拟南芥植株T0代，收集种子，经1%次氯酸钠室温灭菌10分钟，无菌蒸馏水冲洗5遍后，播种于含有40mg/L硫酸卡那霉素（kanamycin sulfate）的1/2MS培养基上生长，能够生长的（kana抗性苗）即为转基因阳性苗T1代。T1代阳性苗转移至营养土中生长至收到种子即为T2代。
将不同株系的T2代种子经过上述方法灭菌，播种在含有40mg/L硫酸卡那霉素（kanamycin sulfate）的1/2MS培养基上生长，kana抗性苗与非kana抗性苗比例为3：1的株系为AtTAR2基因插入一个拷贝的株系，这些株系的kana抗性苗所的得到的种子为T3代转AtTAR2拟南芥，T3代kana抗性不分离的即为AtTAR2基因插入一个拷贝并且T3代纯合系，命名为T3代转AtTAR2拟南芥；后续的表型鉴定均使用此株系。
采用同样的方法将空载体PRI101-6XMYC转入野生型拟南芥中，得到转空载体拟南芥。
4、转AtTAR2植物的鉴定
用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit提取试剂盒提取编号为OE-22和OE-39的T3代转AtTAR2拟南芥的RNA，反转录得到cDNA作为模板，以如下AtTAR2的引物为引物进行Real-Time PCR扩增；以野生型拟南芥（col-0）、转空载体拟南芥和tar2-c突变体为对照。
AtTAR2的引物：TAR2-RT-F:5’-CATGATTTGGCTTACTATTGGCCACAG-3’；TAR2-RT-R:5’-GTCTTTCACCAAAGCCCATCCAATC-3’；
内参基因为Actin2，引物为ActinF:5'-CCTCGTCTCGACCTTGCTGGG-3'；ActinR:5'-GAGAACAAGCAGGAGGACGGC-3'；
Real-Time PCR使用的仪器是
eprealplex(Eppendorf，德国)。采用TaKaRa公司Premix Ex TaqTMII(Perfect Real Time)试剂盒。
反转录后cDNA稀释到1/10浓度作为模板。每个样品设三个重复。
结果如图2所示，
编号为OE-22的T3代转AtTAR2拟南芥中AtTAR2的相对表达量为1.718；
编号为OE-39的T3代转AtTAR2拟南芥中AtTAR2的相对表达量为2.466；
野生型拟南芥（Col-0）中AtTAR2的相对表达量为0.00853；
tar2-c突变体中AtTAR2的相对表达量为0.0000118；
上述结果表明，经过RNA水平检测，与野生型拟南芥相比编号为OE-22和OE-39的T3代转AtTAR2拟南芥中TAR2基因转录水平显著提高，突变体tar2-c中几乎检测不到AtTAR2基因转录。
野生型拟南芥（Col-0）与转空载体拟南芥结果无显著差异。
二、转AtTAR2拟南芥表型鉴定
将上述得到的编号为OE-22和OE-39的T3代转AtTAR2拟南芥、突变体tar2-c和野生型拟南芥种子按照上述方法灭菌后在4℃避光放置4天，以使种子发芽一致，然后将种子播种于1/2MS培养基，22℃竖直培养4天，挑选生长一致的野生型拟南芥、编号为OE-22和OE-39的T3代转AtTAR2拟南芥、突变体tar2-c分别转移至含有0.2mM（LN，低氮水平）和6mM氮（HN，高氮水平）的固体培养基上（不同氮浓度的培养基按照表2）竖直培养6天。以转空载体拟南芥为对照。每个株系20个单株。
观察根系表型，结果如图3所示，可以看出，在高氮培养条件下拟南芥TAR2基因突变体tar2-c的侧根数和侧根总长度与野生型差异不大，转基因拟南芥株系（OE22和OE39）的侧根数和侧根总长度明显高于野生型；而在低氮培养条件下，tar2-c的侧根数和侧根总长度显著低于野生型，与tar2-c高氮条件下的侧根数和侧根总长度差异不大，转基因拟南芥株系（OE22和OE39）的侧根数和侧根总长度仍明显高于野生型。即TAR2基因表达下调降低拟南芥在低氮条件下的根系响应，而TAR2基因表达上调在高氮和低氮条件下都会促进侧根发育。
统计侧根数目，结果如图4所示，
在LN培养基中，编号为OE-22和OE-39的T3代转AtTAR2拟南芥、突变体tar2-c和野生型拟南芥的侧根数目分别为9.9、9.4、5.8、6.4条；
在HN培养基中，编号为OE-22和OE-39的T3代转AtTAR2拟南芥、突变体tar2-c和野生型拟南芥的侧根数目分别为16.3、13.7、6.8、10.8条；
统计侧根总长度，结果如图5所示，
在LN培养基中，编号为OE-22和OE-39的T3代转AtTAR2拟南芥、突变体tar2-c和野生型拟南芥的侧根总长度分别为14.8、12.9、6.1、9.6厘米；
在HN培养基中，编号为OE-22和OE-39的T3代转AtTAR2拟南芥、突变体tar2-c和野生型拟南芥的侧根总长度分别为6.4、5.7、3.2、3.3厘米；
从上述结果可以看出，在高氮水平培养条件下，拟南芥TAR2基因突变体tar2-c的侧根数和侧根总长度与野生型差异不大；而在低氮水平培养条件下，tar2-c的侧根数和侧根总长度显著低于野生型；在不同氮浓度下，T3代转AtTAR2拟南芥株系（OE22和OE39）的侧根数和侧根总长度均明显高于野生型拟南芥。
转空载体拟南芥和野生型拟南芥的结果无显著差异。
表2为实验中氮素浓度分别为6mM和0.2mM氮的培养基配方
| 主要组分 | 6mM N | 0.2mM N |
| KNO3 | 2mM | 0.066mM |
| NH4NO3 | 2mM | 0.066mM |
| KCl | 0 | 3mM |
| KH2PO4 | 1.5mM | 1.5mM |
| K2HPO4 | 1.5mM | 1.5mM |
| CaCl2 | 4mM | 4mM |
| MgSO4 | 1mM | 1mM |
| K2SO4 | 2mM | 2mM |
| MES | 3mM | 3mM |
| 微量元素 | ||
| Na2Fe-EDTA | 40μM | 40μM |
| H3BO3 | 60μM | 60μM |
| MnSO4 | 14μM | 14μM |
| ZnSO4 | 1μM | 1μM |
| CuSO4 | 0.6μM | 0.6μM |
| NiCl2 | 0.4μM | 0.4μM |
| HMoO4 | 0.3μM | 0.3μM |
| CoCl2 | 20nM | 20nM |
| 其他组分 | ||
| 蔗糖 | 1% | 1% |
| PH | 5.8 | 5.8 |
Claims (4)
1.AtTAR2蛋白或其编码基因在调控植物侧根发育中的应用；所述AtTAR2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2；
所述调控植物侧根发育为促进植物侧根发育；
所述植物为拟南芥。
2.一种培育转基因植物的方法，为将AtTAR2蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物的侧根总长度或数目多于所述目的植物；所述AtTAR2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2；所述目的植物为拟南芥。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述AtTAR2蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述AtTAR2蛋白的编码基因通过重组载体导入目的植物；
所述重组载体为将所述AtTAR2蛋白的编码基因导入表达载体中得到的载体。
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