CN114736280B - ZmROA1蛋白在调控植物耐密性中的应用 - Google Patents

ZmROA1蛋白在调控植物耐密性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了ZmROA1蛋白或调控所述ZmROA1蛋白含量或活性的物质的应用。所述ZmROA1蛋白质具体可为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：A1、氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的蛋白质；A2、将序列表中SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物根系角度相关的蛋白质；A3、在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。ZmROA1蛋白质及其相关生物材料可用于调控植物的耐密性和/或根系角度，可用于耐密玉米新品种的培育，有利于玉米高产稳产提高玉米收获指数。

Description

ZmROA1蛋白在调控植物耐密性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中ZmROA1蛋白在调控植物耐密性中的应用。
背景技术
玉米是世界主要农作物之一，在很多国家被广泛种植。作为关键农作物之一，玉米长期以来都是人类生存的基本食物来源和主要的动物饲料原料；作为主要的粮食和饲料作物，玉米总产量达全球谷物总产量38％(FAO.,2019)。品种改良、田间管理措施优化共同促进玉米籽粒产量提升(Duvick et al.,2005；Lee et al.,2007)。其中，种植密度的不断增加成为推动玉米产量增加的主要因素(Lashkari et al.,2011)。选育耐密品种、合理密植成为玉米产量提升的关键措施。
根系在植物生长过程中起着重要的作用，如机械支撑、水分和营养物质的吸收和转移。根系结构决定了根系在特定土壤区域的时空分布及其获取流动和固定资源的能力(Lynch,2019)。根系生长角度会影响根系分布和深度，从而影响玉米的密植空间。陡峭的生长角度往往具有较深层次的根系，根系下扎有利于捕获土壤深处的养分，提高固着能力，减少横向竞争空间(Trachsel et al.,2013；Dathe et al.,2016)。因此，在资源有限的条件下，玉米根系深度和角度对玉米养分的利用和产量的形成起着重要作用。Hammer(Hammeret al.,2009)等通过对玉米冠根关系、籽粒产量的研究发现，近年来美国玉米产量增加，耐密植能力提高主要得益于根系构型的不断优化。与此同时，育种家们也将关注点转向根系研究，改良根系性状、增加耐密性是实现产量提升的关键，通过改善根系构型促进籽粒产量进一步提升亦被称作“地下革命”、“第二次绿色革命”(Lynch et al.,2007；Hochholdingeret al.,2016)。探究高密度群体下根系构型变化及其对籽粒产量的影响具有更深远的意义。
密度增加，光合作用减弱、光合产物由冠层向根系分配下降、根系生长及构型发生显著变化(Poorter et al.,2016)，研究发现，在育种过程中，随着密度的增加，根系扩展角度降低，水平方向根系分布范围缩小；垂直方向，耕层0-20cm根长密度增加，即增密加剧表层土壤根系竞争。York等认为这是根系适应群体数量增加的一种表现(York et al.,2015)。李等研究发现，根系分布与植株地上部株型密切相关，表现出显著基因型差异：平展大穗型玉米品种，其根系分布较浅、对增密导致个体生长空间受限的响应更为敏感；而紧凑中穗型玉米品种，则通过缩小根系水平扩展范围、增加深层土壤根系生长、缓解耕层根系集聚。在玉米中针对调控根夹角相关蛋白的研究相对较少，而将其应用到增加耐密性提高产量的作物改良中还未见报道。因此，挖掘根系构型关键基因，调控根系角度，增加玉米耐密性，对玉米产量的提升至关重要(Mi et al.,2016)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的耐密性。
为了解决以上技术问题，本发明提供了ZmROA1蛋白或调控所述ZmROA1蛋白含量或活性的物质的如下任一应用：
U1调控植物根系夹角中的应用；
U2制备调控植物根系夹角产品中的应用；
U3调控植物耐密性中的应用；
U4制备调控植物耐密性产品中的应用；
U5在植物育种中的应用；
所述ZmROA1蛋白是如下A1、A2或A3的蛋白质：
A1、氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的蛋白质；
A2、将序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物根系角度相关的蛋白质；
A3、在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
所述根系夹角是指玉米地下节根伸展形成的角度(如图10中的∠ABC)。
上述应用中，序列表中的SEQ ID NO.3由255个氨基酸残基组成。
上述应用中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少81％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述应用中，所述ZmROA1蛋白可来源于玉米。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；进一步的，所述单子叶植物为禾本科植物；更进一步，所述禾本科植物为玉米。
上述应用中，所述调控所述ZmROA1蛋白含量或活性的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：B1)在所述基因转录水平上进行的调控；B2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；B3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；B4)对所述基因的翻译进行的调控；B5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；B6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述应用中，所述调控所述ZmROA1蛋白含量或活性的物质为与所述的ZmROA1蛋白相关的生物材料；所述生物材料为下述C1-C3中的任一种：
C1、编码所述ZmROA1蛋白的核酸分子；
C2、提高所述ZmROA1蛋白表达的核酸分子；
C3、含有C1或C2所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
上述应用中，C1或C2所述的核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述应用中，C1所述核酸分子具体可为如下D1或D2所示的基因：
D1、编码链的编码序列是序列表中SEQ ID NO.2第91-858位的核酸分子；
D2、核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1的核酸分子。
上述应用中，所述调控所述ZmROA1蛋白含量或活性的物质可为提高所述ZmROA1蛋白含量或活性，具体可通过提高所述ZmROA1蛋白的编码基因表达量实现，具体可通过W1或W2的方法实现：
W1使植物包含ZmROA1基因；
W2使植物超表达ZmROA1基因。
所述方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
上述应用中，超表达ZmROA1基因的方法选自以下X1～X4的一种或多种的组合：
X1、向植物中导入具有所述ZmROA1基因的质粒；
X2、增加植物染色体上所述ZmROA1基因的拷贝数；
X3、以强启动子替换所述基因ZmROA1基因的启动子。本发明的一个实施例中超表达ZmROA1基因采用玉米组成型启动子Ubiquitin1。
上述导入和替换可通过同源重组实现。
本发明还提供蛋白质，为ZmROA1蛋白，是如下A1、A2或A3的蛋白质：
A1、氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的蛋白质；
A2、将序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物根系角度相关的蛋白质；
A3、在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
本发明还提供与所述的ZmROA1蛋白相关的生物材料；所述生物材料为下述C1-C3中的任一种：
C1、编码所述ZmROA1蛋白的核酸分子；
C2、提高所述ZmROA1蛋白表达的核酸分子；
C3、含有C1或C2所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
为了解决上述技术问题，本发明提供了增加耐密性和/或降低根系夹角的植物试剂，所述植物试剂的活性成分为促进编码所述ZmROA1蛋白的基因的表达、提高所述ZmROA1蛋白的丰度的物质。所述活性成分具体可为所述ZmROA1蛋白和/或ZmROA1蛋白相关的生物材料。
上述增加耐密性和/或降低根系夹角的植物试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述植物试剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物的耐密性和/或根系夹角效果确定。
为了解决上述技术问题，本发明的还提供一种提高植物耐密性和/或降低植物根系夹角的方法，包括如下步骤：促进受体植物中所述ZmROA1蛋白的表达或提高所述ZmROA1蛋白的丰度，得到耐密性高于和/或根系夹角小于所述受体植物的目的植物。
其中，促进受体植物中所述ZmROA1蛋白的表达或提高所述ZmROA1蛋白的丰度具体可通过提高所述ZmROA1蛋白的编码基因表达量实现，具体可通过W1或W2的方法实现：
W1使植物包含ZmROA1基因；
W2使植物超表达ZmROA1基因。
所述方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。
上述方法中，超表达ZmROA1基因的方法选自以下X1～X4的一种或多种的组合：
X1、向植物中导入具有所述ZmROA1基因的质粒；
X2、增加植物染色体上所述ZmROA1基因的拷贝数；
X3、以强启动子替换所述基因ZmROA1基因的启动子。本发明的一个实施例中超表达ZmROA1基因采用玉米组成型启动子Ubiquitin1。
上述导入和替换可通过同源重组实现。
本文中，所述植物可为下述任一种植物：
E1)单子叶植物纲植物，
E2)莎草目植物，
E3)禾本科植物，
E4)玉蜀黍属植物，
E5)玉米。
本发明中，所述调控可为上调或增强或提高。
本发明中，所述植物育种的目的可包括培育耐密性和/或降低根系夹角的植物。
本发明构建了ZmROA1的玉米超表达载体。在优选的实施方案中，玉米表达载体的主要骨架是由来自玉米的Ubiquitin1基因的启动子和来自胭脂碱合成酶(Tnos)基因的3’转录终止区域构成，选择标记基因为草丁膦基因(phosphinothricin)。所述表达载体为pBCXUN载体，构建得到重组质粒pBCXUN-ZmROA1，其中ZmROA1基因正向插入，并且由玉米Ubiquitin1启动子驱动表达。本发明将含有ZmROA1的超表达载体转化玉米自交系B73-329，获得了根夹角减小，单株产量不受影响的转基因玉米。本发明利用超表达ZmROA1基因的转基因玉米，开展不同密度试验。超表达ZmROA1基因的转基因玉米，根夹角显著降低，耐密能力增强，在高密下产量增加。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：本发明首次发现ZmROA1基因具有调控玉米根夹角及耐密的生物学功能。在玉米中调控ZmROA1的表达可以调控玉米根夹角，超表达ZmROA1基因可以减小玉米根夹角，提高玉米耐密能力。本发明提供一种利用ZmROA1基因降低玉米根夹角的新方法，可用于耐密玉米新品种的培育，有利于玉米高产稳产提高玉米收获指数。
附图说明
图1为本发明实施例1中构建的ZmROA1超表达载体骨架。其中，启动子为ZmUbiquitin1的启动子，启动子之后带有Myc标签，终止子为Tnos终止子，ZmROA1处于Myc标签与终止子之间。
图2为本发明实施例2中分析ZmROA1的组织时空表达模式结果。时间设置苗期(Seedling，图2的A图)、拔节期(Jointing，图2的B图)、吐丝期(Silking，图2的C图)、授粉后15天(DAP15，图2的D图)四个时期，取根尖(Tip)、地下节根(Root)、地上节根(Above Root)、基部(Basal)、茎(Stem)、叶(Leaf)等部位，以ZmTUB1作为内参基因。
图3为本发明实施例3中ZmROA1不同超表达转化事件表达量的鉴定结果。图中，***代表差异显著性分析结果为P<0.001。
图4为本发明实施例4中超表达材料OE-ZmROA1(OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4)重力反应试验结果。图4的A图为根系重力反应24小时后的图片，图4的B图为根系重力反应24小时后的统计结果(Root curvature angle after 24h)。图中，***代表差异显著性分析结果为P<0.001。
图5为本实施例5中超表达ZmROA1后(OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4)田间表型结果。其中图5的A图为超表达ZmROA1(OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4均标为OE-ZmROA1)2020年海南三亚根系表型图片；图5的B图为超表达ZmROA1(OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4)2020年海南三亚根系表型结果；图5的C图为超表达ZmROA1(OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4均标为OE-ZmROA1)2021年北京上庄根系表型图片；图5的D图为超表达ZmROA1(OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4)2021年北京上庄根系表型结果。图中，**代表差异显著性分析结果为P<0.01，***代表差异显著性分析结果为P<0.001。
图6为本实施例6中超表达ZmROA1基因(OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4)的密度试验根系表型结果。其中LD指低密80000株/公顷、MD指中密120000株/公顷、HD指高密160000株/公顷。图6的A图为不同密度下根夹角在株间和行间的结果图片；图6的B图为不同密度下根夹角在行间的结果；图6的C图为不同密度下根夹角在株间的结果。图中，ns代表不存在显著差异，*代表差异显著性分析结果为P<0.05，**代表差异显著性分析结果为P<0.01，***代表差异显著性分析结果为P<0.001。
图7为本发明实施例6中超表达ZmROA1基因(OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4)的密度试验株高和穗位高结果。其中图7的A图为不同密度下株高；图7的B图为不同密度下穗位高结果。图中，*代表差异显著性分析结果为P<0.05，**代表差异显著性分析结果为P<0.01，***代表差异显著性分析结果为P<0.001。
图8为本发明本实施例6中超表达ZmROA1(OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4)密度试验考种结果图。
图9为本发明实施例6中超表达ZmROA1基因(OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4)的密度试验产量结果。其中图9的A图为不同密度下玉米植株单株产量；图9的B图为不同密度下产量。
图10为本发明根系夹角的示意图。图中的∠ABC即为根系夹角。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的pBCXUN载体记载于非专利文献“Ya-Juan Qin,Wei-Hua Wu,YiWang.ZmHAK5 and ZmHAK1 function in K+uptake and distribution in maize underlow K+conditions.Journal of Integrative Plant Biology.June 2019,Volume61,Issue 6,691-705”，公众可以从中国农业大学(即申请人处)获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的玉米品种B73和B73-329均记载于非专利文献“Ya-Juan Qin,Wei-Hua Wu,Yi Wang.ZmHAK5 and ZmHAK1 function in K+uptake and distribution inmaize under low K+conditions.Journal of Integrative Plant Biology.June 2019,Volume 61,Issue 6,691-705”，公众可以从中国农业大学(即申请人处)获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中，采用SPSS18.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用T检验、Duncan检验，*表示显著性分析结果为P＜0.05，**表示显著性分析结果为P＜0.01，***表示显著性分析结果为P＜0.001，ns表示无显著差异。
实施例1 ZmROA1表达载体的构建及遗传转化
1.目的基因CDS的克隆
根据生物信息学得到的ZmROA1的基因组序列，如SEQ ID No.1所示，其中第90-96位为第一外显子，第216-282位为第二外显子，第2037-2536位为第三外显子，第2634-2808位为第四外显子，第2926-2945位为第五外显子。ZmROA1的cDNA序列如SEQ ID No.2所示(其中，第1-90位为5`UTR区，第91-858位为CDS区，第859-1014位为3`UTR区)，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
设计引物：扩增ZmROA1的引物对由上游引物ZmROA1-F和下游引物ZmROA1-R组成。其中ZmROA1-F包含翻译起始密码子ATG，下游引物ZmROA1-R包含翻译终止密码子TAA反向互补的序列。
上游引物：ZmROA1-F:5’-ATGAAGATTTTCAGTTGGGT-3’(下划线指示的序列为起始密码子ATG)；
下游引物：ZmROA1-R:5’-TTACATTTCGAGCACAATAA-3’(下划线指示的序列为翻译终止密码子TAA反向互补的序列)。
以B73玉米根总RNA反转录的cDNA为模板，使用高保真酶KOD(KOD高保真酶购自NEB有限公司)，以上游引物ZmROA1-F和下游引物ZmROA1-R扩增，获得包含完整开放阅读框架的ZmROA1基因片段。
扩增体系见表1：
表1扩增体系
试剂名称 体积
2×PCR Buffer for KOD FX 25μL
2mM dNTPs 10μL
正向引物(10μM) 1μL
反向引物(10μM) 1μL
KOD酶 1μL
cDNA 1μL
灭菌ddH<sub>2</sub>O 11μL
Total 50μL
PCR反应程序见表2:
表2 PCR反应程序
温度 时间 循环数
94℃ 2min
98℃ 10sec.
60℃ 30sec. 25-40cycles
68℃ 30sec./kb
68℃ 7min
PCR产物回收：取5μl PCR产物，于1.0％琼脂糖凝胶上电泳检测，选择目的条带大小正确(约768bp)且单一的条带直接利用回收试剂盒(E.Z.N.A.Cycle Pure Kit,OMEGA)进行回收纯化，试验方法参考该试剂盒所带说明书，所得回收产物含有如SEQ ID No.2第91-858位所示的序列。
2、植物表达载体的构建
试验用到的表达载体为pBCXUN，载体骨架如图1所示，主要骨架是由来自玉米的Ubiquitin1基因的启动子和来自胭脂碱合成酶(Tnos)基因的3’转录终止区域构成，选择标记基因为草丁膦基因(phosphinothricin)，该载体由中国农业大学作物功能基因组与分子育种研究中心提供。
利用XcmI工具酶(购自北京友谊中联生物技术有限公司)单酶切pBCXUN载体得到线性化载体，酶切体系为：10×NEB buffer 5μL；载体：2μL；XcmI Restriction Enzyme 1μL；ddH2O 42μL；Incubation Temperature:37℃；Incubation Time：6小时。
以步骤1中得到的回收产物为模板利用带有pBCXUN载体同源臂的新引物(所用连接载体上游引为ZmROA1-infusion-F，连接载体下游引物为ZmROA1-infusion-R)再次进行PCR扩增，利用in-fusion(infusion试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，SE无缝克隆和组装试剂盒目录号：ZC231)的方法构建载体。具体引物和方法如下：
ZmROA1-infusion-F：5’-AGATCTTCCAATACTAATGAAGATTTTCAGTTGGGT-3’(下划线指示的序列为pBCXUN载体同源臂序列)；
ZmROA1-infusion-R：5’-CGGATCCCCAATACTTTACATTTCGAGCACAATAA-3’(下划线指示的序列为pBCXUN载体同源臂序列)。
反应体系见表3。
表3反应体系
试剂名称 体积
5×SE Cloning Buffer 2μL
线性化载体 3μL
插入片段 2μL
SE Recombinase 1μL
ddH<sub>2</sub>O 补充到总体积10μL
混匀后在37℃水浴锅或PCR仪中反应5～30分钟，然后转移到冰上或-20℃保存。
构建得到的植物表达载体为含有ZmROA1基因(核苷酸如SEQ ID No.2第91-858位所示)的重组表达载体pBCXUN-ZmROA1，其中ZmROA1基因正向插入于XcmI酶切位点之间，并且由玉米Ubiquitin1启动子驱动表达。
在重组表达载体pBCXUN-ZmROA1的构建过程中，也可以人工合成SEQ ID No.2第91-858位所示的ZmROA1基因CDS区。
3、感受态转化：
将步骤2得到的重组表达载体pBCXUN-ZmROA1转化感受态细胞TOP10(购自北京博迈德基因技术有限公司)，之后以含有卡那霉素(Kanamycin)的LB板子筛选，挑3～5个克隆进行测序检验，得到测序正确的重组质粒(含有如SEQ ID No.2第91-858位所示的核苷酸序列)。
4、玉米遗传转化
将测序正确的重组质粒采用电击法转化农杆菌EHA105，菌落PCR鉴定获得阳性单克隆菌株为重组农杆菌EHA105-ZmROA1。用携带目的基因的重组农杆菌EHA105-ZmROA1转化玉米自交系B73-329幼胚，经过筛选获得若干株单拷贝纯合阳性苗，该步骤由中国农业大学作物功能基因组与分子育种研究中心协助完成。
所述单拷贝纯合阳性苗，即为以强启动子Ubiquitin1超表达ZmROA1基因的转基因植物(T0代)。每株转基因植物(T0代)分别自交繁育得到株系，其中的4个株系分别命名为OE-ZmROA1-1、OE-ZmROA1-2、OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4。
实施例2 ZmROA1组织时空表达模式研究
以自交系B73-329为试验材料。
试验设置苗期、拔节期、吐丝期、授粉后15天四个时期，每时期取根尖、地下节根、地上节根、基部、茎、叶等部位，取样后用锡箔纸包住，迅速放入液氮中保存，利用研钵将各组织磨碎，利用Trizol法提取玉米总RNA。所得总RNA 用反转录试剂盒经过去除总RNA中的DNA后，再反转录成cDNA。利用Real-time PCR的方法，以引物ZmROA1 qPCR-F和ZmROA1qPCR-R扩增玉米ZmROA1基因，以引物ZmTUB1 qPCR-F和ZmTUB1 qPCR-R扩增玉米ZmTUB1基因作为内参对照，用同一样品中的ZmROA1基因的表达量除以ZmTUB1基因的表达量作为ZmROA1基因的相对表达量，研究ZmROA1基因在不同组织的表达量情况。
ZmROA1qPCR-F：5’-GGAAAGAGCATGACGGTGAA-3’；
ZmROA1qPCR-R：5’-GCAGTCTAAGGAGCGAGGC-3’。
ZmTUB1qPCR-F：5’-GCTATCCTGTGATCTGCCCTGA-3’；
ZmTUB1qPCR-F：5’-CGCCAAACTTAATAACCCAGTA-3’。
结果如图2所示，可以发现ZmROA1在玉米的苗期(图2的A图)、拔节期(图2的B图)、吐丝期(图2的C图)、授粉后15天(图2的D图)4个时期及各个组织中均有表达，其表达模式为组成型表达，相比于其他部位，在根系中大量表达，其中在苗期(图2的A图)和拔节期(图2的B图)基部表达量最高，该部位是玉米节根发生的关键部位。说明ZmROA1在调控节根开放夹角的过程中起着关键的作用。
实施例3 ZmROA1超表达不同转化事件表达量鉴定
将玉米自交系B73-329(野生型)及OE-ZmROA1四个不同的转化事件(实施例1得到的OE-ZmROA1-1、OE-ZmROA1-2、OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4共4个株系的T2代植株)先用1/2霍格兰营养液培养3天，然后移至正常营养液中培养14天，每隔3天换一次培养液，取玉米整株根系，每3棵植株混一个样，设置3个重复。用液氮收取玉米根系。
用Trizol法提取玉米根部总RNA。所得总RNA用反转录试剂盒经过去除总RNA中的DNA后，再反转录成cDNA。利用Real-time PCR的方法，以引物ZmROA1 qPCR-F和ZmROA1qPCR-R扩增玉米ZmROA1基因，以引物ZmTUB1 qPCR-F和ZmTUB1 qPCR-R扩增玉米ZmTUB1基因作为内参对照，用同一样品中的ZmROA1基因的表达量除以ZmTUB1基因的表达量作为ZmROA1基因的相对表达量，研究ZmROA1基因在不同转化事件中的表达量情况。以玉米ZmTUB1基因作为内参对照，确定ZmROA1基因在不同转化事件中的表达。
基因上游引物：ZmROA1qPCR-F:5’-GGAAAGAGCATGACGGTGAA-3’
基因下游引物：ZmROA1qPCR-R:5’-GCAGTCTAAGGAGCGAGGC-3’
内参上游引物：ZmTUB1qPCR-F:5’-GCTATCCTGTGATCTGCCCTGA-3’
内参下游引物：ZmTUB1qPCR-F:5’-CGCCAAACTTAATAACCCAGTA-3’
结果如图3所示，相比于野生型B73-329，OE-ZmROA1四个转化事件表达量都有不同程度的显著增加，其中株系OE-ZmROA1-3表达量最高，株系OE-Zm-DRO1-4次之，根据表达量排序，选取OE-ZmROA1-3、OE-ZmDRO1-4两个株系做为后续的研究对象开展试验。
实施例4 ZmROA1的重力反应试验
配置含1％植物凝胶的1/2MS固体培养基(pH＝5.8)，组分如下：
表4 1/2MS固体培养基配方
试剂名称 量
MS基础盐(phytotech) 2.165g
植物凝胶 10g
蔗糖 15g
灭菌ddH<sub>2</sub>O 1L
Total 1L
按照表4将各组分充分溶解后用5M NaOH溶液调pH值至5.8。121℃高压灭菌20min。
将玉米自交系B73-329(野生型)及实施例1的OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4的T2代种子用2％次氯酸钠消毒30分钟后，用70％酒精快速漂洗5-10秒，再用灭菌的ddH2O涡旋震荡漂洗6次，每次1分钟。消毒后的种子种于1/2MS固体培养基中，28℃黑暗生长至胚芽鞘和主胚根共长约10厘米左右，将竖直生长的幼苗水平放置，放置24小时后测定主胚根弯曲角度。实验重复3次，每次重复每个株系30株。
结果如图4所示，OE-ZmROA1(OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4)重力弯曲角度在弯曲24小时后显著高于野生型，说明ZmROA1通过重力反应影响玉米根夹角的改变。
实施例5 ZmROA1田间表型功能验证
田间表型试验设计：本实验于2020年在中国海南三亚和2021中国北京进行，实验材料为野生型B73-329和超表达OE-ZmROA1两个不同转化事件(实施例1的OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4株系的T2代植株)。试验设计采用随机区组试验，设置3个重复，单行种植，每行长4米，宽50厘米，株距25厘米，双粒播种，待出苗后长至两叶一心开始间苗，间苗后每行留17株。采用标准的栽培管理方法。在吐丝期取样，分析根系构型相关性状。
试验结果如图5所示：2020～2021年，在田间针对ZmROA1的功能研究开展了两年两点试验。研究发现，相比于野生型，超表达ZmROA1根夹角显著减小，且两年的结果高度保持一致。2020年，野生型B73-329平均角度为87.42°，OE-ZmROA1-3平均角度为72.78°，OE-ZmROA1-4平均角度为72.33°，相比于野生型，角度分别降低了16.76％、17.27％(图5的A图、图5的B图)。2021年，野生型平均角度为79.58°，OE-ZmROA1-3平均角度为66.22°，OE-ZmROA1-4平均角度为57.42°，相比于野生型，角度分别降低了16.79％、27.84％(图5的C图、图5的D图)。因此，证明ZmROA1具有调控玉米根系夹角的功能。
实施例6超表达ZmROA1田间密度试验
田间密度试验设计：本实验于2021年在中国北京进行，实验材料为野生型B73-329和超表达OE-ZmROA1两个转化事件(实施例1的OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4株系的T2代植株)。试验设计采用随机区组试验，分取样区和测产区，设置三个密度，分别是LD(低密)80000株/公顷、MD(中密)120000株/公顷、HD(高密)160000株/公顷。行长4米，行距50厘米，双行双粒播种，待出苗后长至两叶一心开始间苗。采用标准的栽培管理方法。在吐丝期取样，测定地上部株高、穗位高、茎秆强度等性状以及地下根系构型相关性状，成熟期测定产量。
试验结果如图6所示：研究发现，在同一密度下，超表达(OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4)相比于野生型，无论是低密还是高密，无论是株间还是行间的根夹角，都显著低于野生型B73-329(图6的A图)，且行间密度和基因型之间有显著的互作(图6的B图)，在株间密度和基因型之间没有互作(图6的C图)。同一密度同一基因型下，低密条件下无论是野生型还是超表达，株间和行间没有显著性差异，但随着密度的增加，野生型行间夹角显著大于株间，但超表达没有差异，说明超表达根系构型生存空间充足，不需要做出适应性的改变。根夹角减小，根系下扎，这有利于植株在高密条件下减小横向养分竞争压力，吸取土壤深层养分。
对于株高(图7的A图)，不同密度之间，基因型与密度有显著的互作，随着密度的增加，相比于低密条件下，高密与中密株高显著增加。并且在高密下，相比于低密和中密，野生型株高受到抑制，而超表达ZmROA1后，株高在高密下增加。在同一密度不同基因型之间，OE-ZmROA1-3和OE-ZmROA1-4相比于野生型株高显著降低；其穗位高与株高表现一致但基因型与密度之间没有互作(图7的B图)。在高密度下，株高穗位高适当降低，能够增加作物的抗倒伏能力，对作物提高耐密能力具有重要作用。
如图8所示，数据分析结果显示，在低密(LD)下，相比于野生型B73-329(WT)，超表达ZmROA1后OE-ZmROA1-3雌穗的穗长和穗宽略有降低，但籽粒重、百粒重、穗行数、穗粒数和突尖长均没有显著性差异，OE-ZmROA1-4的穗长、穗宽、籽粒重、百粒重、穗行数、穗粒数和突尖长相比于野生型B73-329均没有显著性差异，说明超表达ZmROA1后根夹角变小但不影响玉米的单株产量。在中密(MD)条件下，OE-ZmROA1-4穗长显著高于野生型B73-329，但容重显著低于野生型B73-329，穗宽、籽粒重、百粒重、穗行数、穗粒数和突尖长与野生型B73-329相比均没有显著差异，OE-ZmROA1-3的穗长、穗宽、籽粒重、百粒重、穗行数、穗粒数和突尖长相比于野生型B73-329均没有显著性差异。在高密(HD)条件下，OE-ZmROA1-4穗行数相比于野生型显著增加，OE-ZmROA1-3突尖长明显降低，OE-ZmROA1-3的穗长、穗宽、籽粒重、百粒重、穗行数、穗粒数和突尖长相比于野生型B73-329均没有显著性差异，OE-ZmROA1-4的穗长、穗宽、籽粒重、百粒重、穗行数、穗粒数和突尖长相比于野生型B73-329均没有显著性差异。图中显示数据为：平均值±标准差，T检验：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
进一步通过对单株产量及总体产量(图9)计算可得，虽然超表达ZmROA1能够减小根夹角，降低株高，但单株产量不受影响(图9的A图)。同时随着密度的增加，相比于野生型，超表达单株产量减产幅度降低，野生型减产幅度为15％～30％，而超表达ZmROA1减产幅度仅为5％～20％。在高密下，相比于野生型B73-329，OE-ZmROA1-3、OE-ZmROA1-4总体产量平均增加22.92％(图9的B图)。综合来看，随着密度的增加，超表达ZmROA1后，产量相比于野生型有增加的趋势，说明利用ZmROA1调控根夹角的改变在玉米耐密增产中有较好的应用前景。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> ZmROA1蛋白在调控植物耐密性中的应用
<130> GNCSY221103
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3101
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays)
<400> 1
gtaggctagg ctcgcgctcc ctcatcccac tcccacgcac gtgtactact ttacttactg 60
gtggggggcc ggtctccagt tccgcaggat atgaaggtgt gtgtgtgtgt gtgtctgaaa 120
ggcatagcat agcaagagta ctcctccttc gcctgacggc ggttggttgt ttcttcgatc 180
ctgacagcga attccctctc ttctccctcc cgcagatttt cagttgggta gccaacaaga 240
tcggcgggaa gcaagaaccg aagcgatctg ccgcgcatta tcgtaagcct acttcgcgcc 300
aatatttcac ttcattcctt ggcctgtgaa ttcagggtca aggttttata tttcaagttg 360
aactttcttt ttttttctct ctctctcgtg aatctctctg tcctttgtat caactcctta 420
gtctctctat actactatct ccttgcatgc atgaatgtac ataaatatct ctgataagta 480
ctgtatccta gtattgatta ctttttgcat ggctgaggcg catcaaaatc accgcttttt 540
ctcggaggtg aatgatgccc cactccaccc cctcccctta atgagtgcag gtgaatagga 600
gggtctcgtt tgtttgggat aggtctagct ttttagcttc tccgaagaga atcacttcaa 660
ttccaacccg cagccaacac actcaactga tccaccctgt tttcgttcta ctatatattg 720
tggtgcgaat cacgagggaa tcaattctca tcagctcgta actctgctcc cctcctaaaa 780
atctactgga aacactccat caaagagcac agttgaagga ttaggaagcg gaggtctcca 840
aacggtgcct aaggtcgtgt ttgtttccct ccttggatta tggtaaaaaa gtaagatagt 900
caaatactct cttcgttttt ttatagttga cgatggttag tgtaaaattg cactagctaa 960
cctcaattta aaaaaataga ggtagtatca cttttcaaat tacaaatagg ctgaaataac 1020
ttaccccaac aatgcttata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatatg 1080
gtgtcaaagt gatattttat cctcgtatct ttcatcacaa tccaacttat ataatatatg 1140
agagaaacaa gcacacccta agatgataga cctgggactt tgagtctgct tcttgcattc 1200
acgttctgct tcagtactct attcttcgtt tcagcatatc tttaactcta tatgctcctc 1260
ggaagggtgt gattatttag caagttctta taagttctct ttttgaagca aaagaaaagg 1320
agaagatagt tcttttcggc aatgcttgta tcagtttgga tggttcagtc ctactctcct 1380
atctgtcaac actgatatgt tcacaaatat ctttcaataa tctgctaagg aaatatgttt 1440
attatatcgc attttgatgc atgagagcac tacagtatcc cttcattttt ctttgcatat 1500
actgtacacg gtgtttttca atgactaaaa accttttctt tcagcccctt gaacgagagt 1560
gtggtgaggt tcttatatga cacaaactgt ccagcggccg agttacattt gtaacgcaga 1620
atcgtaacct cggacggttc cgtactggat catcagatct gaagcacagt agatcatttc 1680
tctgtgttct ttattgttct tagaaaggct agaggggtag ggtggtaaca aacatcttcg 1740
gatgccgttg tgcgatagat taggtgatta tcagcatgat gtttcaggtt ggcgcgaaac 1800
atcgtggtgt ggagcaagca tgggcaaaca tgtttctcgt cagtgatagg ctgcaggctg 1860
ctgcatgcat gctcgatcat gaaaagcagc agcgatttaa aactgccaaa aattagtggt 1920
ccatacggcc gccgatttat gctaatatat tcacgtagta ggagtagggc catggatttt 1980
ttttttgttt ctttgtactg atttggccaa ctaattaatt tacttgcaac gcgcaggtgg 2040
caacgtatca gaatgtcgca acgacgagtt cagtgattgg ccccaatcat tgctggcaat 2100
cgggacgttt gggaacaggc agctggagga aggggtggtg gagacgtctt ctgggaacgt 2160
ccaggccgcg caagaccccg ccaagttcac agaggaagaa gaggcggaca gcatacggag 2220
agaactcgag gtgctgctgc tgcaaggcaa taataataat ggcggccaag cagaggcgca 2280
gggctctcgt ggagacgaac gacgacaggt agcttggaaa gagcatgacg gtgaatgtag 2340
caaggagaag cagccgacga gcggggagat ggtcacgagc aaggcgagag cgagagaaat 2400
ggtagcaggg aagaaaagga gcacgctgaa gccaaggtcg gtggcctcgc tccttagact 2460
gctcgcgtgc aagggcggct ttgccacccc ggttctggaa ccgaggagcc ctttccccca 2520
gtcgagaatg gagaaggtac agtttcttgt actatagatt cgcacggctt cttctttctc 2580
tgcatctcgt tcacgtactt tgcgcgtggt tggtttggtc accgctgctg cagctgctca 2640
aggcgatact ggagaagaag atacacccgc agaaccccag cacggctgca gcgaggcggc 2700
accagctgga ctggaagcta gacgagaaag agatcgacga gtgccttgac gacgcgctgc 2760
gtgacctcga cgacgacggc gccaagtggg tcaaaactga ctcggactgt aagtactact 2820
gtagaatgta gatcggcagc gaaactgcat gcacttcgtg tctatctatc tgacatgaga 2880
ctgaattcgt gtcctctttc ttgtttttct tttcttttct ttcagttatt gtgctcgaaa 2940
tgtaaaggcc cgcgcgtgtg tggttatgtt tgtttctttg aggccaggta cgcacttctc 3000
gcctcttctg aacccctgga actttcaggt tcatatcatc agttgatctc agcgcgggta 3060
cgtctttcgt ttgatcagtt gttggtttat tggatgctca g 3101
<210> 2
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtaggctagg ctcgcgctcc ctcatcccac tcccacgcac gtgtactact ttacttactg 60
gtggggggcc ggtctccagt tccgcaggat atgaagattt tcagttgggt agccaacaag 120
atcggcggga agcaagaacc gaagcgatct gccgcgcatt atcgtggcaa cgtatcagaa 180
tgtcgcaacg acgagttcag tgattggccc caatcattgc tggcaatcgg gacgtttggg 240
aacaggcagc tggaggaagg ggtggtggag acgtcttctg ggaacgtcca ggccgcgcaa 300
gaccccgcca agttcacaga ggaagaagag gcggacagca tacggagaga actcgaggtg 360
ctgctgctgc aaggcaataa taataatggc ggccaagcag aggcgcaggg ctctcgtgga 420
gacgaacgac gacaggtagc ttggaaagag catgacggtg aatgtagcaa ggagaagcag 480
ccgacgagcg gggagatggt cacgagcaag gcgagagcga gagaaatggt agcagggaag 540
aaaaggagca cgctgaagcc aaggtcggtg gcctcgctcc ttagactgct cgcgtgcaag 600
ggcggctttg ccaccccggt tctggaaccg aggagccctt tcccccagtc gagaatggag 660
aagctgctca aggcgatact ggagaagaag atacacccgc agaaccccag cacggctgca 720
gcgaggcggc accagctgga ctggaagcta gacgagaaag agatcgacga gtgccttgac 780
gacgcgctgc gtgacctcga cgacgacggc gccaagtggg tcaaaactga ctcggacttt 840
attgtgctcg aaatgtaaag gcccgcgcgt gtgtggttat gtttgtttct ttgaggccag 900
gtacgcactt ctcgcctctt ctgaacccct ggaactttca ggttcatatc atcagttgat 960
ctcagcgcgg gtacgtcttt cgtttgatca gttgttggtt tattggatgc tcag 1014
<210> 3
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Lys Ile Phe Ser Trp Val Ala Asn Lys Ile Gly Gly Lys Gln Glu
1 5 10 15
Pro Lys Arg Ser Ala Ala His Tyr Arg Gly Asn Val Ser Glu Cys Arg
20 25 30
Asn Asp Glu Phe Ser Asp Trp Pro Gln Ser Leu Leu Ala Ile Gly Thr
35 40 45
Phe Gly Asn Arg Gln Leu Glu Glu Gly Val Val Glu Thr Ser Ser Gly
50 55 60
Asn Val Gln Ala Ala Gln Asp Pro Ala Lys Phe Thr Glu Glu Glu Glu
65 70 75 80
Ala Asp Ser Ile Arg Arg Glu Leu Glu Val Leu Leu Leu Gln Gly Asn
85 90 95
Asn Asn Asn Gly Gly Gln Ala Glu Ala Gln Gly Ser Arg Gly Asp Glu
100 105 110
Arg Arg Gln Val Ala Trp Lys Glu His Asp Gly Glu Cys Ser Lys Glu
115 120 125
Lys Gln Pro Thr Ser Gly Glu Met Val Thr Ser Lys Ala Arg Ala Arg
130 135 140
Glu Met Val Ala Gly Lys Lys Arg Ser Thr Leu Lys Pro Arg Ser Val
145 150 155 160
Ala Ser Leu Leu Arg Leu Leu Ala Cys Lys Gly Gly Phe Ala Thr Pro
165 170 175
Val Leu Glu Pro Arg Ser Pro Phe Pro Gln Ser Arg Met Glu Lys Leu
180 185 190
Leu Lys Ala Ile Leu Glu Lys Lys Ile His Pro Gln Asn Pro Ser Thr
195 200 205
Ala Ala Ala Arg Arg His Gln Leu Asp Trp Lys Leu Asp Glu Lys Glu
210 215 220
Ile Asp Glu Cys Leu Asp Asp Ala Leu Arg Asp Leu Asp Asp Asp Gly
225 230 235 240
Ala Lys Trp Val Lys Thr Asp Ser Asp Phe Ile Val Leu Glu Met
245 250 255

Claims (1)

1.ZmROA1蛋白或调控所述ZmROA1蛋白含量或活性的物质的如下任一应用：
U1调控玉米耐密性中的应用；
U2制备调控玉米耐密性产品中的应用；
所述ZmROA1蛋白是如下A1或A2的蛋白质：
A1、氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的蛋白质；
A2、在A1的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；
所述调控所述ZmROA1蛋白含量或活性的物质为与所述的ZmROA1蛋白相关的生物材料；所述生物材料为下述C1-C3中的任一种：
C1、编码所述蛋白的核酸分子；
C2、提高所述蛋白表达的核酸分子；
C3、含有C1或C2所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官；
C1所述核酸分子为如下D1或D2所示的基因：
D1、编码链的编码序列是序列表中SEQ ID NO.2第91-858位的核酸分子；
D2、核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1的核酸分子；
所述ZmROA1蛋白来源于玉米；
所述调控为促进编码所述ZmROA1蛋白的基因的表达或提高所述ZmROA1蛋白的丰度的物质提高玉米的耐密性。
CN202210569763.2A 2022-05-24 2022-05-24 ZmROA1蛋白在调控植物耐密性中的应用 Active CN114736280B (zh)

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