MX2012007855A - Identificacion de ritmos diurnos en tejidos fotosinteticos del zea mays y uso en el mejoramiento de plantas de cultivo. - Google Patents

Identificacion de ritmos diurnos en tejidos fotosinteticos del zea mays y uso en el mejoramiento de plantas de cultivo.

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Abstract

La presente descripción proporciona secuencias de polinucleótido relacionadas con el ciclado diurno en tejidos de hoja y mazorca del maíz. La descripción proporciona secuencias de polinucleótido y el uso de polipéptidos codificados asociados con la oscilación. Las secuencias divulgadas son responsables para controlar el crecimiento de la planta, las relaciones de fuente-receptor y el rendimiento en plantas de cultivo.

Description

IDENTIFICACIÓN DE RITMOS DIURNOS EN TEJIDOS FOTOSINTETICOS Y NO FOTOSINTETICOS DEL ZEA MAYS Y USO EN EL MEJORAMIENTO DE PLANTAS DE CULTIVO CAMPO DE LA INVENCIÓN La descripción se relaciona, generalmente, con el campo de la biología molecular.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El ciclo día-noche es un señal ambiental importante que controla los ritmos diarios y estacionales en las plantas. Las transiciones diurnas de luz-oscuridad modifican el periodo del reloj circadiano interno que genera ritmos autónomos (de curso libre) en condiciones de luz constantes. Un modelo simplificado del reloj comprende tres componentes básicos: una vía de entrada que detecta la luz; un oscilador central que es la maquinaria de transcripción que genera los ritmos; y vías de salida que controlan los diversos procesos metabólicos y de desarrollo, que resultan en las adaptaciones fisiológicas adecuadas al ciclo de día-noche (Barak, et al., (2000) Trends Plant Sci 5:517-522; Harmer, (2009) Annu Rev Plant Biol 60:357-377). La sincronización adecuada del reloj interno y los ciclos externos de luz/oscuridad dan como resultado una mejor adecuación, supervivencia, ventaja competitiva (Dodd, et al., (2005) Science 309:630-633) y vigor de crecimiento de la planta (Ni, et al., (2009) Nature 457:327-331).
La arquitectura genética del sistema circadiano de la planta se ha explicado mayormente, hasta ahora, en Arabidopsis (Mas, (2008) Trends Cell Biol 18:273-281). Las vías de entrada están compuestas por dos conjuntos de fotorreceptores, los fitocromos detectores de luz roja/roja lejana (PHYA-E) y los criptocromos detectores de luz UV-A/azul (CRYl y CRY2), que perciben la luz durante el día y envían señales al oscilador central (Nemhauser, (2008) Curr Opin Plant Biol 11:4-8). Los genes del oscilador central forman circuitos de retroalimentación transcripcional entrelazados (Harmer y McClung, (2009) Science 323:1440-1441). El circuito matutino consiste en los factores de transcripción CCAl ( CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED) y LHY (LATE ELONGATED HYPOCOTYL) , similares a MYB, que participan en la regulación de dos circuitos diferentes. En el circuito matutino, CCA1/LHY regulan negativamente la transcripción del regulador de pseudo-respuesta TOCl {TIMING OF CAB EXPRESSION 1) y el factor de transcripción CHE (CCAl HIKING EXPEDITION) similar a TCP. TOCl /CHE forman un complejo que regula positivamente la transcripción de CCA1/LHY ( Pruneda-Paz, et al., (2009) Science 323:1481-1485). En el circuito diurno, CCA1/LHY regulan positivamente la transcripción de PRR7 y PRR9 (PSEUDO-RESPONSE REGULATORS) , los cuales regulan negativamente CCA1/LHY. En el circuito vespertino, T0C1/CHE actúan como un regulador negativo de GI (GIGANTIA) , que es, en sí mismo, un regulador positivo de T0C1. El gen vespertino ZTL (ZEITLUPE, una proteína F-box de degradación de proteínas), involucrado en la degradación de las proteínas T0C1 y PRR3, proporciona regulación de los componentes centrales del reloj a nivel de las proteínas (Mas, et al., (2003) Nature 426:567-570). Los circuitos de transcripción entrelazados mantienen una maquinaria genética robusta, aunque flexible (Harmer (2009) ) .
El reloj circadiano genera salidas rítmicas que regulan los procesos fisiológicos y de desarrollo de muchas plantas, que incluyen: crecimiento (Nozue, et al., (2007) Nature 448:358-361; Nozue y Maloof, (2006) Plant Cell Environ 29:396-408), tiempo de floración, tuberización en plantas anuales, cese del crecimiento y brotadura en plantas perennes (Lagercrantz, (2009) J Exp Bot 60:2501-2515), fotosíntesis (Sun, et al., (2003) Plant Mol Biol 53:467-478), absorción de nitrógeno (Gutiérrez, et al., (2008) Proc Nati Acad Sci USA 105:4939-4944) y señalización hormonal y respuesta al estrés (Covington y Harmer, (2007) PLoS Biol 5: e222) . No obstante, el conocimiento de los nodos moleculares que unen el reloj circadiano con las vías de salida recién está en surgimiento actualmente. Hasta el momento, la conexión que mejor se entiende es la regulación de fotoperiodo del tiempo de floración en Arabidopsis y arroz. El gen GI del reloj de Arabidopsis y su homólogo de arroz, OsGI, promueven la expresión de los factores de transcripción CO (CONSTANS) y OsCO {Hdl, HEADING1) , que controlan la transcripción del activador floral descendente FT {FLONERING LOCUS T) en Arabidopsis y su gen homólogo, Hd3a (HEADING 3a) en el arroz (Michaels, (2009) Curr Opin Plant Biol 12:75-80, Tsuji y Komiya, (2008) Rice 1:25-35). Las vias sensibles al fotoperiodo garantizan la floración en condiciones favorables.
Varias publicaciones identificaron conexiones moleculares entre los osciladores centrales de Arabidopsis y una amplia variedad de procesos fisiológicos de las plantas. El crecimiento rítmico del hipocotilo se promueve mediante la acción positiva de dos factores de transcripción básicos de hélice-circuito-hélice, PIF4 y PIF5 ( PHYTOCHROM-INERACTING FACTOR) , cuyos niveles de transcripción son regulados por CCA1 (Nozue, et al., (2007) Nature 448:358-361). Además, el crecimiento del hipocotilo se regula independientemente mediante niveles libres de la fitohormona auxina, producida por el gen biosintético de auxina YUCCA8, que está directamente controlado por el factor de transcripción RVE1 (REVEILLE 1) similar a Myb dependiente del reloj (Rawat, et al., (2009) Proc Nati Acad Sel, USA 106:16883-16888). Este es el enlace directo entre los osciladores circadianos y las redes de auxina que coordinan el crecimiento de las plántulas en Arabidopsis. Las vías de salida de los genes PPR9/7/5 están relacionadas con el mantenimiento del metabolismo central, principalmente en la mitocondria y, particularmente, el ciclo del ácido tricarboxilico (TCA) (Fukushima, et al., ( 2009 ) Proc Nati Acad Sci, USA 106:7251-7256). El TOC1 también está unido con la hormona ABA relacionada con el estrés, que conecta los relojes circadianos con las respuestas de la planta a la sequía (Legnaioli, et al., (2009) The EMBO Journal 28:3745-3757).
El uso de la tecnología de micromatrices ha revelado la influencia generalizada de los ritmos circadianos en la transcripción génica en Arabidopsis. Estos estudios se han concentrado, principalmente, en tejidos sensibles a la luz, tales como las rosetas de Arabidopsis. Hasta un 35 % de los genes de Arabidopsis tienen regulación circadiana en los tejidos verdes (Covington, et al., (2008) Genome Biol 9: R130; Harmer, et al., ( 2000 ) Science 290:2110-2113; Ptitsyn, ( 2008 ) BMC Bioinformatics¦ 9 ( 9) : S18 ) . Si bien los modelos animales han demostrado que casi todos los tejidos tienen un componente circadiano grande en su programa transcripcional, los diversos tejidos vegetales aún no se han evaluado sistemáticamente respecto de la contribución relativa de los ciclos de luz diurna en la transcripción (Ptitsyn, et al., ( 2006 ) PLoS Comput Biol 2: el6) . En la era previa al genoma, se observaron cambios diurnos en las tasas de fotosíntesis de la hoja y de elongación foliar del maíz, que alcanzaban su punto máximo al mediodía (Kalt-Torres y Huber, (1987) Plant Physiol 83:294-298, Kalt-Torres, et al., (1987) Plant Physiol 83:283-288, Usuda, et al., (1987) Plant Physiol 83:289-293). La oscilación diurna del factor de transcripción específico de endosperma 02 (Opaque 2) también fue detectada en granos no fotosintéticos , y se propuso que la actividad de 02 es controlada por el flujo de metabolito diurno (Ciceri, et al., (1999) Plant Physiol 121:1321-1328) . Se demostraron los ritmos diurnos y circadianos para los homólogos de maíz de GI (gigzl) y CO (conzl) , que son salidas directas del reloj circadiano en la vía del fotoperíodo que controla el tiempo de floración de Arabidopsis ( iller, et al., (2008) Planta 227:1377-1388), aunque el maíz de clima templado es una planta neutral al día cuya floración no está regulada por la duración del día.
Este estudio identificó dos homólogos de TOC1, ZmTOCa y ZmTOCb, que se asignaron al cromosoma 5 y 4, respectivamente. La transcripción de ambos genes alcanza su punto máximo a las 6 p.m., de manera consistente con la expresión génica de TOC1 en Arabidopsis. El TOC1 es un miembro de la familia de reguladores de pseudo-respuesta (PRR) , compuesta de cinco genes PRR de evolución conservada en Arabidopsis y arroz (Murakami, et al., (2007) Biosci Biotechnol Biochem 71:1107-1110; Murakami, et al., (2003) Plant Cell Physiol 44:1229-1236). Además de los dos homólogos de ZmTOCl, el estudio identificó, además, a ZmPRR73, ZmPRR37 y ZmPRR59, que fueron denominados según los genes PRR del arroz con base en el nivel de similitud de secuencia (Murakami, et al., (2003)). Además, se identificaron dos homólogos de ZEITLUPE (Kim, et al., (2007) Nature 449:356-360), ZmZTLa y ZmZTLb, que se asignaron al cromosoma 2 y 4. Dos ortólogos de GIGANTIA de maíz, gigzlA y gigzlB, fueron descritos previamente (Miller, et al., (2008) Planta 227:1377-1388) y aquí se confirma su oscilación tanto en las espigas como en las hojas. La mayoría de los componentes centrales conocidos ciclan en los análisis de Agilent (Agilent Technologies, Inc., Life Sciences and Chemical Analysis, 2850 Centerville Road, ilmington, DE 19808-1610, EE . UU.) e Illumina (Illumina, Inc., 9885 Towne Centre Drive, San Diego, CA 92121, EE. UU.). Los ciclos de los componentes centrales ZmCCA, ZmLHY, ZmTOCla y ZmTOClb se confirmaron adicionalmente mediante el análisis de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) . La amplitud de los componentes centrales disminuye en la espiga en desarrollo cuando se la compara con el tejido foliar, pero aún es robusta. Estos datos demuestran que la mayor parte del sistema oscilador central de la planta funciona en tejidos no fotosintéticos, tal como la espiga, pero la salida del oscilador está, evidentemente, muy aislada de la maquinaria de transcripción que afecta los cambios de expresión diurna descendente .
Los componentes del mecanismo central de reloj y del mecanismo de señalización proximal que se deriva de este se podrían modificar de manera que afecten positivamente el rendimiento del cultivo, por ejemplo, al cambiar o extender la relación entre fuentes y sumideros, tales como las hojas y las espigas. La complementación genética masiva de los patrones diurnos de diferentes fuentes de germoplasma ha demostrado que aumenta los patrones diurnos y la adecuación aparente combinados (Ni, (2009)).
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: Componentes diurnos del reloj central que funcionan en el maíz, ubicación en el cromosoma y hora de máxima expresión.
Figura 2: Validación de la expresión diurna para ZmCCAl, ZmLHY, ZmTOCla y ZmTOClb mediante qRT-PCR.
Figura 3: Genes de expresión diurna en las espigas, ubicación en el cromosoma y hora de máxima expresión.
Figura 4: Estructura de exones/intrones de los genes ZmCCAl y ZmLHY Figura 5: Patrones diurnos para los términos funcionales de genes enriquecidos temporalmente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Aún no se han llevado a cabo estudios sistemáticos de los patrones transcripcionales diurnos/circadianos en el maíz. El presente estudio se inició para examinar la función que desempeña el ciclo diurno en cuanto a la regulación de la transcripción génica en el maíz mediante tecnologías modernas de perfiles genómicos completos. Los experimentos en campo fueron diseñados en condiciones naturales no alteradas y se obtuvieron muestras tanto de tejido fotosintético, tejido foliar y tejido no fotosintético, y espiga en desarrollo. Se identificaron miles de transcripciones con ciclos marcados en las hojas del maíz. No obstante, en las espigas no fotosintéticas, solo un reducido conjunto de genes, tan solo 45, eran claramente de ciclo diurno. Muchos de estos son homólogos del maíz de genes del oscilador central de Arabidopsis, lo que indica que los genes circadianos centrales se conservan en el maíz y se expresan en forma diurna tanto en los tejidos fotosintéticos como no fotosintéticos .
Se identificaron numerosos genes de regulación diurna de maíz durante los análisis. Un total de 471 secuencias, incluidas aquellas de espigas inmaduras, aquellas con ciclos de alta amplitud/magnitud en el tejido foliar, y diversas secuencias asociadas con funciones NUE y Carbono :: itrógeno . Las secuencias contienen marcos abiertos de lectura (ORF) , polipéptidos codificados y sus promotores asociados .
La siguiente lista incluye algunas de las modalidades de la invención: 1. Un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en: a. un polinucleótido con al menos 90 % de identidad de secuencia, según se determina mediante el algoritmo GAP con el uso de los parámetros predeterminados, con la secuencia de longitud completa de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 20, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468 y 470; en donde el polinucleótido codifica a un polipéptido que funciona como un modificador de la actividad diurna; un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 20, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324 , 326 , 328 , 330, 332, 334 , 336 , 338 , 340 , 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468 y 470 un polinucléotido que es totalmente complementario con el polinucleótido de (a) o (b) ; un polipéptido codificado por el polinucléotido de (a) o (b) ; y e. un polipéptido con al menos 90 % de identidad de secuencia, según se determina mediante el algoritmo GAP con el uso de los parámetros predeterminados, con la secuencia de longitud completa de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOS; 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239 , 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257 r 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275 r 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293 r 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311 r 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329 r 331, 333, 335, 357, 359, 361, 363, 365, 367 , 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385 , 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403 r 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421 , 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439 , 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457 , 459, 461, 463, 465, 467, 467, 469 y 471.
Un cásete de expresión recombinante , que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, en donde el polinucleotido está unido operativamente, en orientación codificante o no codificante, a un promotor. 3. Una célula huésped que comprende el cásete de 5 expresión de conformidad con la reivindicación 2. 4. Una planta transgénica que comprende el cásete de expresión recombinante de conformidad con la reivindicación 2. 5. La planta transgénica de conformidad con la 10 reivindicación 4, en donde la planta es una planta monocotiledónea . 6. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, en donde la planta es una planta dicotiledónea. 15 7. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en: maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, cacahuate, caña de azúcar y 20 cacao. 8. Una semilla transgénica de la planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4. 9. Un método para modular el ritmo diurno en las plantas; el método comprende: a. introducir en una célula vegetal un cásete de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 unido operativamente a un promotor; y b. cultivar la planta en condiciones de crecimiento de la célula vegetal; en donde el ciclo diurno en dicha célula vegetal está modulado .
El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde la célula vegetal es de una planta seleccionada del grupo que consiste en: maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, cacahuate, caña de azúcar y cacao.
Un método para modular la planta completa o el ritmo diurno en una planta; el método comprende: a. introducir en una célula vegetal un cásete de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 unido operativamente a un promotor; b. cultivar la célula vegetal en condiciones de crecimiento de la célula vegetal; y c. regenerar una planta a partir de dicha célula vegetal; en donde el ritmo diurno en dicha planta está modulado.
El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste en: maíz, soja, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, cacahuate y cacao.
Un producto derivado del método que consiste en procesar los tejidos de la planta transgénica que expresan un polinucleótido aislado que codifica un gen de funcionamiento diurno; el método comprende : a. transformar una célula vegetal con un cásete de expresión recombinante que comprende un polinucleótido con al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de longitud completa de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 20, 40, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268 , 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286 , 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304 , 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322 , 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340 , 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358 , 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376 , 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394 , 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412 , 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430 , 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448 , 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468 y 470; unido operativamente a un promotor ; y cultivar la célula vegetal transformada en condiciones de crecimiento de la célula vegetal; en donde el crecimiento en dicha célula vegetal transformada está modulado; cultivar la célula vegetal en condiciones de formación de planta para expresar el polinucleotido en el tejido vegetal; y procesar el tejido vegetal para obtener un producto .
La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 13, en donde la planta es una planta monocotiledónea .
La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 13, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste en: maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, caña de azúcar y mijo. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, donde la sobreexpresion del polinucleótido conduce a lo que ha mejorado el crecimiento de la planta en comparación con las plantas no transformadas.
La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, en donde la planta muestra relaciones fuente-sumidero mejoradas en comparación con las plantas no transformadas. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, en donde la planta tiene un rendimiento mejorado en comparación con las plantas no transformadas.
Una molécula reguladora de polinucléotido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOS: 31-183; (b) un fragmento de ácido nucleico que comprende al menos 50-100 nucleótidos contiguos de una de las SEQ ID NOS: 31-183 y en donde el fragmento comprende uno o más de los elementos reguladores diurnos enumerados en la Tabla 2, y (c) una secuencia de ácidos nucleicos que comprende al menos 90 % de identidad con aproximadamente 500-1000 nucleótidos contiguos de una de las SEQ ID NOS: 31-183, según se determina mediante el algoritmo GAP con el uso de los parámetros predeterminados.
Una molécula quimérica de polinucleótido que comprende el fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19.
La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 20, que comprende el elemento regulador diurno y un elemento de expresión especifico del tejido.
La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 21, en donde el elemento de expresión especifico del tejido se selecciona del grupo que consiste en especifico de la raiz, especifico de la célula de la vaina, especifico de la hoja y especifico del embrión. 3. La molécula reguladora de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 19, en donde dicha molécula de polinucleótido es un promotor. 24. Una construcción que comprende la molécula reguladora de conformidad con la reivindicación 19, unida operativamente a una molécula heteróloga de polinucléotido, en donde la molécula heteróloga confiere un rasgo de interés . 25. La construcción de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el rasgo de interés se selecciona del grupo que consiste en la tolerancia a la sequía, tolerancia a la congelación, tolerancia al enfriamiento o al frío, resistencia a enfermedades y resistencia a insectos . 26. La construcción de conformidad con la reivindicación 24, en donde la molécula heteróloga funciona en un metabolismo de fuente- sumidero. 27. Una planta transgénica transformada con la molécula reguladora de conformidad con la reivindicación 19.
La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 27 es monocotiledónea .
La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 27 se selecciona del grupo que consiste en maíz, soja, cañóla, algodón, girasol, alfalfa, remolacha, trigo, centeno, arroz, caña de azúcar, avena, cebada, césped, sorgo, mijo, tomate, guandul, vegetales, árboles frutales y pasto forrajero.
Un método para aumentar el rendimiento de una planta; el método comprende expresar un polinucleótido heterólogo de interés bajo el control de la molécula reguladora de conformidad con la reivindicación 19.
El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde el polinucléotido heterólogo es un gen vegetal de regulación diurna.
Un método para aumentar la tolerancia al estrés abiótico en una planta; el método comprende expresar uno o más polinucleótidos que confieren tolerancia al estrés abiótico en plantas bajo el control de la molécula reguladora de la reivindicación 19.
El método de conformidad con la reivindicación 32, en donde la tolerancia al estrés abiótico se selecciona del grupo que consiste en tolerancia a la sequía, tolerancia a la congelación y tolerancia al enfriamiento o al frío.
El método de conformidad con la reivindicación 33, en donde el polinucleótido que confiere tolerancia a la sequía se expresa bajo el control de un elemento regulador cuya máxima expresión ocurre alrededor del mediodía o en las últimas horas de la tarde.
El método de conformidad con la reivindicación 33, en donde el polinucleótido que confiere tolerancia a la congelación o al frío se expresa bajo el control de un elemento regulador cuya máxima expresión ocurre al amanecer o a media mañana .
Un método para reducir el rezago en el rendimiento de la expresión del gen transgénico; el método comprende expresar un transgén unido operativamente a una molécula reguladora de polinucleótido, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOS: 31-183; (b) un fragmento de ácido nucleico que comprende al menos 50-100 nucleótidos contiguos de una de las SEQ ID NOS: 31-183, y en donde el fragmento comprende uno o más de los elementos reguladores diurnos enumerados en la Tabla 2, y (c) una secuencia de ácidos nucleicos que comprende al menos 90 % de identidad con aproximadamente 500-1000 nucleótidos contiguos de una de las SEQ ID NOS: 31-183, según se determina mediante el algoritmo GAP con el uso de los parámetros predeterminados. Un método de selección de candidatos génicos involucrados en la tolerancia al estrés abiótico; el método comprende (a) identificar uno o más candidatos génicos que exhiban un rezago en el rendimiento en una expresión constitutiva o especifica del tejido y (b) expresar los candidatos génicos bajo el control de la molécula reguladora que dirige el patrón de expresión diurno.
El método de conformidad con la reivindicación 37, en donde la molécula reguladora comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOS: 31-183; (b) un fragmento de ácido nucleico que comprende al menos 50-100 nucleótidos contiguos de una de las SEQ ID NOS: 31-183, y en donde el fragmento comprende uno o más de los elementos reguladores diurnos enumerados en la Tabla 2, y (c) una secuencia de 5 ácidos nucleicos que comprende al menos 90 % de identidad con aproximadamente 500-1000 nucleótidos contiguos de una de las SEQ ID NOS: 31-183, según se determina mediante el algoritmo GAP con el uso de los parámetros predeterminados. 10 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN ? menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que comprende comúnmente una persona con experiencia en la técnica a la cual pertenece la presente descripción. A menos que se mencione de cualquier otra manera, las técnicas usadas o contempladas en la presente descripción son metodologías estándar muy conocidas para un experto en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no limitantes. Lo siguiente se presenta en forma de ilustración y no pretende limitar el alcance de la descripción.
Ahora, de aquí en adelante, se describirán las presentes descripciones en su totalidad con referencia a las figuras anexas, en las cuales se muestran algunas pero no todas las modalidades de la descripción. De hecho, estas descripciones se pueden realizar de muchas formas diferentes y • no debe interpretarse que se limitan a las modalidades establecidas en la presente descripción; sin embargo, se proporcionan estas modalidades de manera que esta descripción cumpla con los requisitos legales aplicables. Los números similares se refieren a elementos similares en todas partes.
Una persona experimentada en la técnica puede pensar en cualquier modificación y otras modalidades de las descripciones expuestas en la presente relacionadas con estas descripciones con la utilidad de las enseñanzas presentadas en las descripciones precedentes y las figuras asociadas. Por lo tanto, se entiende que las descripciones no se limitan a las modalidades especificas descritas y esas modificaciones y otras modalidades están incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque en la presente descripción se usa términos específicos, estos se usan únicamente en un sentido genérico y descriptivo y no con propósitos de limitación .
La práctica de la presente descripción usará, a menos que se indique de cualquier otra manera, técnicas convencionales de botánica, microbiología, cultivo de tejido, biología molecular, química, bioquímica y de ingeniería genética, las cuales están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Langenheim y Thimann, BOTANY: PLANT BIOLOGY AND ITS RELATION TO HUMAN AFFAIRS, John iley (1982); CELL CULTURE AND SOMATIC CELL GENETICS OF PLANTS, vol. 1, Vasil, ed. (1984); Stanier, et al., THE MICROBIAL WORLD, 5.a ed., Prentice-Hall (1986); Dhringra y Sinclair, BASIC PLANT PATHOLOGY METHODS, CRC Press (1985); Maniatis, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (1982); DNA Cloning, vols. I y II, Glover, ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, ed. (1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, Hames y Higgins, eds. (1984) y la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, Colowick y Kaplan, eds, Academic Press, Inc., San Diego, CA.
Las unidades, los prefijos y los símbolos pueden indicarse en su forma aceptada en el SI (Sistema Internacional de Unidades) . A menos que se indique de cualquier otra manera, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación de 5' a 3' ; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación del extremo amino al carboxi, respectivamente. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. En la presente descripción, los aminoácidos se pueden indicar con sus símbolos de tres letras conocidos o con los símbolos de una letra que recomienda la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Además, los nucleótidos se pueden indicar con sus códigos de única letra generalmente aceptados. Los términos definidos a continuación se definen en mayor detalle en referencia a la especificación como un todo.
Se usarán los siguientes términos para describir la presente descripción, y se pretende que se definan tal como se indica a continuación.
"Microbio" se refiere a cualquier microorganismo (incluso microorganismos eucariotas y procariotas), tal como hongos, levadura, bacterias, actinomicetos , algas y protozoarios, asi como otras estructuras unicelulares.
Por "amplificado" se entiende la construcción de copias múltiples de una secuencia de ácido nucleico o copias múltiples complementarias a la secuencia de ácido nucleico con el uso de por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico como una plantilla. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , el sistema de reacción en cadena de la ligasa (LCR) , la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario) , los sistemas de la Q-Beta replicasa, el sistema amplificación basado en la transcripción (TAS) y la amplificación por ' desplazamiento de la hebra (SDA). Ver, por ejemplo, Diagnostic Molecular Microbiology : Principies and Applications, Persing, et al., eds . , American Society for Microbiology, Washington, DC (1993) . El producto de la amplificación se denomina amplicón.
El término "variantes conservativamente modificadas" aplica tanto al aminoácido como a las secuencias de ácido nucleico. Con respecto a las secuencias particulares de ácido nucleico, las variantes conservativamente modificadas se refiere a los ácido nucleicos que codifican variantes conservativamente modificadas o idénticas de las secuencias de aminoácidos. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteina dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Asi, en cada posición en donde se especifica una alanina por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silentes" y representan una especie de la variación conserva ivamente modificada. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente descripción que codifica un polipéptido describe, además, cada variación silente posible del ácido nucleico. Una persona con experiencia en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es normalmente el único codón para metionina; una excepción es Micrococcus rubens, para el cual GTG es el codón de metionina (Ishizuka, et al., (1993) J. Gen. Microbiol. 139:425-32) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico, que codifica un polipéptido de la presente descripción, está implícita en cada secuencia de polipéptidos descrita e incorporada en la presente descripción como referencia.
Como para las secuencias de aminoácidos, una persona con experiencia reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales en una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteina que altera, adiciona o elimina un solo aminoácido o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia codificada son una "variante conservativamente modificada" cuando la alteración produce la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Así, puede alterarse cualquier número de residuos de aminoácidos seleccionado del grupo de enteros que consisten de 1 a 15. Así, por ejemplo, se puede hacer 1, 2, 3, 4, 5, 7 o 10 alteraciones. Las variantes conservativamente modificadas proporcionan, típicamente, una actividad biológica similar que las secuencias de polipéptidos sin modificar a partir de la que se derivan. Por ejemplo, la especificidad del sustrato, la actividad de la enzima o la unión al ligando/receptor es, generalmente, por lo menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, preferentemente, 60-90 % de la proteína natural para su sustrato natural Las tablas de la sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien en la técnica.
Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas de uno a otro: 1) alanina (A), serina (S) , treonina (T) ; 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E) ; 3) asparagina (N) , glutamina (Q) ; 4) arginina (R) , lisina (K) ; 5) isoleucina (I), leucina (L) , metionina (M) , valina (V) ; y 6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano ( ) . Ver, además, Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Co. (1984) .
Como se usa en la presente descripción, "que consiste prácticamente en" significa la inclusión de secuencias adicionales a un polinucleótido objetivo, en donde las secuencias adicionales no hibridan selectivamente, en condiciones de hibridación rigurosas, al mismo ADNc como el polinucleótido, y en donde las condiciones de hibridación incluyen una etapa de lavado en 0. IX SSC y 0.1 % dodecil sulfato de sodio a 65 °C.
La frase "que codifica" o "codificado" con respecto a un ácido nucleico especifico se refiere a que comprende la información para la traducción en la proteina especificada. Un ácido nucleico que codifica una proteina puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico o puede carecer de tales secuencias no traducidas intermedias (por ejemplo, como en ADNc) . La información por la cual se codifica una proteina se especifica con el uso de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos se encuentra codificada por el ácido nucleico mediante el uso del código genético "universal". Sin embargo, las variantes del código universal, tales como las presentes en la mitocondria de algunas plantas, animales y hongos, la bacteria Mycoplasma capricolum (Yamao, et al., (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:2306-9) o el Macronucleo ciliar, se pueden usar cuando el ácido nucleico se expresa por medio del uso de esos organismos.
Cuando el ácido nucleico se prepara o altera sinté icamente, se puede tomar ventaja de las preferencias del codón conocidas de los huéspedes deseados en donde el ácido nucleico se va a expresar. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácido nucleico de la presente descripción pueden expresarse en especies de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, las secuencias pueden modificarse para responder a las preferencias del codón especificas y preferencias del contenido de GC de plantas monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas, ya que se demostró que estas preferencias difieren (Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-98 que se incorpora en la presente descripción como referencia) . Asi, el codón preferido de maiz para un aminoácido particular podría derivarse de secuencias de genes conocidas de maiz. El uso de codones en maiz para los 28 genes de plantas de maíz se enumera en la Tabla 4 de Murray, et al., más arriba.
Como se usa en la presente descripción, "heterologo", con referencia a un ácido nucleico, es un ácido nucleico que se origina de una especie extraña o, si es de la misma especie, se encuentra sustancialmente modificada de su forma natural en la composición y/o locus genómico mediante intervención humana intencional. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a un gen estructural heterologo es de una especie distinta a la especie de la cual se derivó el gen estructural o, si es de la misma especie, uno o ambos están sustancialmente modificados de su forma original. Una proteina heteróloga se puede originar de una especie extraña o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma original mediante intervención humana intencional.
"Célula huésped" se refiere a una célula que contiene un vector y soporta la replicación y/o expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células procariotas, tales como E. coli, o células eucariotas, tales como células de levadura, insectos, planta, anfibios o mamíferos. Preferentemente, las células huésped son células de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas que incluyen, pero no se limitan a, maíz, sorgo, girasol, frijol de soya, trigo, alfalfa, arroz, algodón, cañóla, cebada, mijo y tomate. Una célula huésped monocotiledónea particularmente preferida es una célula huésped de maíz.
El término "complejo de hibridación" incluye la referencia a una estructura de ácido nucleico híbrida formada por dos secuencias de ácido nucleico monocatenarias hibridizadas selectivamente entre sí.
El término "introducido" en el contexto de insertar un ácido nucleico en una célula significa "transíección", "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, en donde el ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, ADN cromosómico, plasmídico, plástido o mitocondrial ) , convertido en un replicón autónomo o expresado temporalmente (por ejemplo, ARNm transfectado) .
Los términos "aislado" se refiere al material, tal como un ácido nucleico o una proteína, que se encuentra sustancialmente o prácticamente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con este tal como se encuentra en su medio natural. El material aislado comprende, opcionalmente, material que no se encuentra con el material en su medio natural. Los ácidos nucleicos que están "aislados", tal como se define en la presente descripción, se denominan, además, ácidos nucleicos "heterólogos". A menos que se indique de otra manera, el término "ácido nucleico diurno" hace referencia a un ácido nucleico que comprende un polinucleótido ("polinucleótido diurno") que codifica un polipéptido diurno.
Como se usa en la presente descripción, "ácido nucleico" incluye la referencia a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma monocatenaria o bicatenaria y, a menos que se limite de cualquier otra manera, abarca los análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales en que se hibridizan a ácidos nucleicos monocatenarios de una manera similar a los nucleótidos de origen natural (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos ) .
"Genoteca de ácidos nucleicos" se refiere a una recolección de moléculas aisladas de ADN o ARN que comprenden y representan sustancialmente la fracción completa transcrita de un genoma de un organismo específico. La creación de genotecas de ácidos nucleicos ilustrativas, tales como genotecas de ADN genómico y de ADNc, se enseña en referencias de biología molecular estándar, tales como Berger y Kimmel, GUI DE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, de la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, vol . 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1987); Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A Laboratory Manual, 2.° ed., vols. 1-3 (1989) y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, et al., eds, Current Protocols, un emprendimiento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc. (Suplemento de 1994).
Como se usa en la presente descripción, "operativamente unido" incluye una referencia a un enlace funcional entre una primera secuencia, tal como un promotor, y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, operativamente unido significa que las secuencias de ácido nucleico que están unidas son contiguas y, en donde sea necesario, se unen a dos regiones codificantes de proteina, contiguas y en el mismo marco de lectura.
Como se usa en la presente descripción, el término "planta" incluye la referencia a las plantas completas, órganos de las plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raices, etc.), semillas y células vegetales, asi como progenie de estas. Célula vegetal, como se usa en la presente descripción, incluye, pero no se limita a, cultivos en suspensión de semillas, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raices, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas . La clase de plantas que pueden usarse en los métodos de la descripción es, generalmente, tan amplia como la clase de plantas superiores sensibles a las técnicas de transformación, que incluyen tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas que incluyen especies de los géneros: Cucúrbita , Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria , Lotus, Medicago, Onobrychis , Trifolium, Trigonella , Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica , Raphanus , Sinapis, Atropa, Capsicum , Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon , Nicotiana , Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus , Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis , Cucumis, Browaalia , Glycine, Pisum, Phaseolus , Lolium, Oryza, Avena, Hordeum, Sécale, Allium y Triticum. Una planta particularmente preferida es Zea mays.
Como se usa en la presente descripción, "producción" incluye la referencia a las fanegas por acre de un cultivo de granos en la cosecha, que se ajusta para la humedad de granos (típicamente, 15 %) . La humedad del grano se mide en el grano en la cosecha. El peso de prueba ajustado del grano se determina como el peso en libras por fanega, ajustado según el nivel de humedad del grano en la cosecha. Como se usa en la presente descripción, la relación "fuente-sumidero" mejorada hace referencia a un rasgo asociado con una mejora de la relación de oferta (es decir, fuente) y demanda (es decir, sumidero) asimiladas durante el llenado del grano.
Como se usa en la presente descripción, "polinucleótido" incluye la referencia a un desoxirribopolinucleótido, ribopolinucleótido o análogos de estos que tienen la naturaleza esencial de un ribonucleótido natural en que se hibridizan, en condiciones rigurosas de hibridación, para prácticamente la misma secuencia de nucleótidos que los nucleótidos de origen natural y/o permiten la traducción en el (los) mismo(s) aminoácido (s) que el (los) nucleótido ( s ) de origen natural. Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de un gen estructural o regulador natural o heterólogo. A menos que se indique de cualquier otra forma, el término incluye referencia a la secuencia especificada asi como la secuencia complementaria de esta. Por lo tanto, los ADN o ARN con esqueletos modificados para la estabilidad o por otras razones son "polinucleótidos" como se entiende ese término en la presente descripción. Además, los ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como las bases tritiladas, para nombrar justo dos ejemplos, son los polinucleótidos como se usa el término en la presente descripción. Se apreciará que una gran variedad de modificaciones se realizaron al ADN y ARN que sirve para muchos propósitos útiles conocidos por las personas con experiencia en la técnica. El término polinucleótido, como se usa en la presente descripción, abarca esas formas químicamente, enzimáticamente o metabolicamente modificadas de polinucleótidos , asi como las formas químicas de ADN y ARN características de los virus y células, incluso entre otros, células simples y complejas.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente descripción para hacer referencia a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos, en donde uno o más residuos de aminoácidos es o son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como polímeros de aminoácidos de origen natural.
Como se usa en la presente descripción, "promotor" incluye una referencia a una región de ADN corriente arriba del inicio de la transcripción e involucrada en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa y otras proteínas (por ejemplo, factores de transcripción) para iniciar la transcripción. Un "promotor vegetal" es un promotor con la capacidad de iniciar la transcripción en células vegetales. Los promotores de plantas ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se obtienen de plantas, virus de plantas y bacterias los cuales comprenden genes expresados en células vegetales, tales como Agrobacterium o Rhizobium. Los ejemplos son promotores que inician, preferentemente, la transcripción en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, semillas, fibras, vasos del xilema, traqueidas o esclerénquima . Tales promotores se mencionan como "específicos del tejido". Un promotor específico de "tipos celulares" dirige, principalmente, la expresión en ciertos tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares de raíces u hojas. Un promotor "inducible" o "regulable" es un promotor que está bajo control del ambiente. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden efectuar la transcripción por los promotores inducibles incluyen condiciones anerobias o la presencia de luz. Otro tipo de promotor es un promotor regulado por el desarrollo, por ejemplo, un promotor que conduce la expresión durante el desarrollo del polen. Los promotores específicos de tejidos, específicos de tipos celulares, regulados por el desarrollo e inducibles constituyen la clase de promotores "no constitutivos". Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo bajo la mayoría de condiciones ambientales.
Como se usa en la presente descripción, "elemento regulador" o "polinucleótido regulador" se refiere al fragmento de ácido nucleico que modula la expresión de un polinucleótido transcribible que está asociado con el elemento regulador. Dicha asociación puede ocurrir en cis. Además, se puede usar un promotor vegetal como un elemento regulador para modular la expresión de un gen o genes particulares que están operativamente asociados a los promotores. Cuando está asociado a una molécula de polinucleótido transcribible, un elemento regulador afecta el patrón transcripcional de la molécula de polinucleótido transcribible . "Elemento cis" o "elemento de acción cis" se refiere a un elemento regulador transcripcional de acción cis que afecta la expresión génica. Un elemento cis puede funcionar para unir factores de transcripción, proteínas de acción trans que modulan la transcripción. Los promotores diurnos descritos en la presente pueden contener uno o más elementos cis que proporcionan un patrón diurno de expresión génica .
Los promotores vegetales y los elementos reguladores descritos en la presente descripción pueden incluir secuencias de nucleótidos generadas mediante la modificación genética del promotor, es decir, una combinación de promotores y/o elementos reguladores conocidos para producir promotores quiméricos o híbridos artificiales/sintéticos. Dichos promotores pueden, además, combinar elementos cis de uno o más promotores, por ejemplo, al añadir un elemento regulador específico del tejido heterólogo en un promotor que contiene elementos reguladores de expresión diurna. Por lo tanto, se contempla el diseño, la construcción y el uso de promotores quiméricos o híbridos que comprenden al menos un elemento cis de los promotores descritos en la presente descripción para modular la expresión de las secuencias de polinucleotidos unidas operativamente.
Las secuencias promotoras descritas en la presente, que incluyen las SEQ ID NOS: 31-183 y fragmentos de estas que incluyen, por ejemplo, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 y hasta 2500 nucleótidos contiguos de estos, y aproximadamente 80 % o 85 % o 90 % o 95 % o 99 % de identidad con esos fragmentos se contemplan para usarse para modular el patrón de expresión de uno o más genes heterólogos. El término "heterólogo" en este contexto significa que la expresión del nucleótido de interés está modulada por una secuencia promotora o un fragmento de esta que no es el promotor propio del nucleótido. Las construcciones de deleción de las diversas secuencias promotoras descritas en la presente descripción se elaboran fácilmente por las personas con experiencia en la técnica al seguir las pautas descritas en la presente descripción. Aproximadamente 25-50 nucleótidos contiguos que flanquean los extremos 3' o 5' de los elementos reguladores descritos se seleccionan para la modulación de la expresión génica. Además, se realizan análisis mutacionales para mejorar la especificidad de la regulación diurna.
El término "polipéptido diurno" se refiere a una o más secuencias de aminoácidos. El término incluye, además, los fragmentos, variantes, homólogos, alelos o precursores (por ejemplo, preproproteinas o proproteinas ) de estos. Un "proteina diurna" comprende un polipéptido diurno. A menos que se indique de otra manera, el término "ácido nucleico diurno" hace referencia a un ácido nucleico que comprende un polinucleótido ("polinucleótido diurno") que codifica un polipéptido diurno.
Como se usa en la presente descripción, "recombinante" incluye la referencia a una célula o vector que se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o que la célula se deriva de una célula modificada de esa manera. Por lo tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran de forma idéntica dentro de la forma natural (no recombinante) de la célula o expresan genes naturales que se expresan anormalmente de cualquier otra manera, poco expresados o nada expresados como resultado de la intervención humana intencional. El término "recombinante", como se usa en la presente descripción, no abarca la alteración de la célula o vector por eventos de origen natural (por ejemplo, mutación espontánea, transformación/transducción/transposición natural), tales como los que ocurren sin intervención humana intencional.
Como se usa en la presente descripción, un "cásete de expresión recombinante" es una construcción de ácido nucleico generada de manera recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula objetivo. El cásete de expresión recombinante puede incorporarse en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial , ADN plastidio, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción del cásete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, un ácido nucleico a transcribirse y un promotor.
Los términos "residuo", "residuo de aminoácido" o "aminoácido" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a un aminoácido que se incorpora en una proteina, un polipéptido o péptido (colectivamente "proteína") . El aminoácido puede ser un aminoácido de origen natural y, a menos que se limite de cualquier otra forma, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar de una manera similar que los aminoácidos de origen natural.
El término "se hibridiza selectivamente" incluye la referencia a la hibridación, en condiciones rigurosas de hibridación, de una secuencia de ácido nucleico a una secuencia objetivo específica de ácido nucleico en un grado detectable mayor (por ejemplo, por lo menos el doble por encima del base) que su hibridación en secuencias de ácido nucleico no objetivo y con la exclusión sustancial de ácidos nucleicos no objetivo. Las secuencias de hibridación selectiva tienen, típicamente, aproximadamente al menos 40 % de identidad de secuencia, preferentemente, 60-90 % de identidad de secuencia y, con la máxima preferencia, 100 % de identidad de secuencia (es decir, complementarias) entre si.
Los términos "condiciones rigurosas" y "condiciones rigurosas de hibridación" se refieren a las condiciones bajo las cuales una sonda se hibridiza a su secuencia objetivo a un grado detectable mayor que otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces el valor de base) . Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al controlar el rigor de las condiciones de hibridación y/o lavado, pueden identificarse las secuencias objetivo que pueden ser hasta 100 % complementarias de la sonda (sonda homologa) . Alternativamente, pueden ajustarse las condiciones de rigor para permitir cierta falta de coincidencia de las secuencias con el fin de detectar grados más bajos de similitud (sonda heteróloga) . Óptimamente, la sonda es de una longitud de aproximadamente 500 nucleótidos, pero puede variar grandemente en longitud de menor que 500 nucleótidos a igual a toda la longitud de la secuencia objetivo.
Típicamente, serán condiciones rigurosas aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M de iones Na, típicamente, una concentración de aproximadamente 0.01 a 1.0 M de iones Na (u otras sales) con un pH 7.0 a 8.3, y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30 °C para las sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60 °C para las sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos) . Las condiciones rigurosas se pueden obtener, además, con la adición de agentes desestabilizadores, tales como formamida o solución de Denhardt . Las condiciones de rigurosidad baja ilustrativas incluyen la hibridación con una solución amortiguadora de formamida al 30-35 %, NaCl 1 M, SDS (dodecil sulfato de sodio) al 1 % a 37 °C y un lavado en SSC IX a 2X (SSC 20X = NaCl 3.0 M/citrato trisódico 0.3 M) a 50 a 55 °C. Las condiciones de rigor moderadas ilustrativas incluyen la hibridación en 40 a 45 % formamida, 1 M NaCl, 1 % SDS a 37 °C y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55 a 60 °C. Las condiciones de rigurosidad alta ilustrativas incluyen hibridación en formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C y un lavado en SSC 0. IX a 60 hasta 65 °C. La especificidad es, típicamente, la función de los lavados posteriores a la hibridación; los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para ADN-híbridos de ADN, la Tm se puede calcular con la ecuación de Meinkoth y Wahl, (1984) Anal. Biochem. 138:267-84: Tm = 81.5 °C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; en donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Tm es la temperatura (con la fuerza iónica y el pH definidos a continuación) a la cual se hibridiza el 50 % a una secuencia objetivo complementaria con una sonda perfectamente apareada. Tm se reduce aproximadamente 1 °C por cada 1 % de falta de coincidencia; por lo tanto, la Tm, las condiciones de hibridación y/o lavado pueden ajustarse para hibridizarse con las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se busca secuencias con =90 % de identidad, la Tm se puede disminuir 10 °C. Generalmente, se seleccionan las condiciones rigurosas para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complemento, con una fuerza iónica y un pH definidos. No obstante, las condiciones muy rigurosas pueden usar una hibridación y/o un lavado a l, 2, 3 o 4 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm) ; las condiciones moderadamente rigurosas pueden usar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm) ; las condiciones de baja rigurosidad pueden usar una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20 °C menos que el punto de fusión térmica (Tm) . Al usar la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado, y la Tm deseada, las personas con conocimiento ordinario en la técnica comprenderán que se describen esencialmente variaciones en el rigor de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado de falta de coincidencia deseado resulta en una Tm menor que 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida) se prefiere aumentar la concentración del SSC de manera tal que pueda usarse una temperatura más alta. Una guia extensa sobre la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY--HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, parte I, capitulo 2, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé essays", Elsevier, New York (1993) y en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, capitulo 2, Ausubel, et al., eds, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) . A menos que se indique de cualquier otra manera, en la presente solicitud "alta rigurosidad" se define como la hibridación en SSC 4X, solución de Denhardt 5X (5 g de Ficoll, 5 g de polivinilpirrolidona, 5 g de albúmina sérica bovina en 500 mi de agua) , ADN de esperma de salmón hervido a 0.1 mg/ml y 25 mM de fosfato de Na a 65 °C y un lavado en SSC 0.1X, SDS al 0.1 % a 65 °C.
Como se usa en la presente descripción, "planta transgénica" incluye lo referente a una planta que comprende en su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo está integrado de manera estable dentro del genoma de manera tal que el polinucleótido se transmita a las generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede integrarse en el genoma solo o como parte de un cásete de expresión recombinante . El término "transgénico" se usa en la presente descripción para incluir cualquier célula, linea celular, callo, tejido, parte de una planta o planta cuyo genotipo ha sido alterado con la presencia de ácidos nucleicos heterólogos que incluyen los transgénicos alterados inicialmente, asi como los creados por cruces sexuales o propagación asexual a partir del transgénico inicial. Como se usa en la presente descripción, el término "transgénico" no abarca la alteración del genoma (cromosómico o ex racromosómico ) por métodos convencionales de cultivo vegetal o por eventos de origen natural, tales como ertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea.
Como se usa en la presente descripción, "vector" incluye la referencia a un ácido nucleico que se usa en la transfeccion de una célula huésped y en la cual puede insertarse un polinucleótido . Los vectores son frecuentemente replicones. Los vectores de expresión permiten la transcripción de un ácido nucleico insertado allí.
Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos o polipéptidos : (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia" y (e) "identidad sustancial".
Como se usa en la presente descripción, "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se usa como base para la comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de ADNc de longitud completa o secuencia génica o el ADNc completo o secuencia génica.
Como se usa en la presente descripción, "ventana de comparación" significa que incluye la referencia a un segmento contiguo y especifico de una secuencia de polinucleótidos , en donde la secuencia de polinucleótidos puede compararse con una secuencia de referencia y en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación tiene por lo menos 20 nucleótidos contiguos de longitud y, opcionalmente, puede tener 30, 40, 50, 100 o más. Los expertos en la técnica comprenden que para evitar una alta similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de interrupciones, se introduce en la secuencia de polinucleótidos , típicamente, una penalización de interrupción y se sustrae de la cantidad de coincidencias.
Los métodos de alineamiento de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos para la comparación se conocen bien en la técnica. El algoritmo de homología local (BESTFIT) de Smith y Waterman, (1981) Adv. Appl. Math 2:482, puede realizar un alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación; por el algoritmo de alineamiento de homología (GAP) de Needleman y unsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443-53; por la búsqueda del método de similitud (Tfasta y Fasta) de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444; por implementaciones computarizadas de estos algoritmos que incluyen, sin limitarse a: CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el isconsin Genetics Software Package®, versión 8 (disponible de Genetics Computer Group (programas GCG® (Accelrys, Inc., San Diego, CA) ) . Higgins and Sharp describen en detalle el programa CLUSTAL, (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp, (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet, et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang, et al., (1992) Computer Applications in the Biosciences 8:155-65 y Pearson, et al., (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-31. El programa preferido para usar para el alineamiento global óptimo de múltiples secuencias es PileUp (Feng and Doolittle, (1987) J. Mol. Evol., 25:351-60 que es similar al método descrito por Higgins y Sharp, (1989) CABIOS 5:151-53 y que se incorpora en la presente descripción como referencia) . La familia de programas de BLAST que puede usarse para búsquedas de similitud en la base de datos incluye: BLASTN para búsquedas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de nucleótidos; BLASTX para búsquedas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de proteínas; BLASTP para búsquedas de secuencias de proteínas en bases de datos de secuencias de proteínas; TBLASTN para búsquedas de secuencias de proteínas en bases de datos de secuencias de nucleótidos y TBLASTX para búsquedas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de nucleótidos. Ver CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, capítulo 19, Ausubel, et al., eds . , Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) .
El GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch, más arriba, para buscar el alineamiento de dos secuencias completas que maximizan el número de coincidencias y minimiza el número de interrupciones. GAP toma en consideración todos los alineamientos posibles, así como las posiciones de interrupción y crea el alineamiento con la mayor cantidad de bases coincidentes y la menor cantidad de interrupciones. Permite proporcionar la penalización de creación de interrupciones y una penalización de extensión de interrupciones en unidades de bases coincidentes. GAP debe beneficiarse de la cantidad de penalizaciones de creación de interrupciones de coincidencias para cada interrupción que inserta. Si se selecciona una penalización de extensión de interrupciones mayor que cero, GAP debe, adicionalmente, obtener beneficios para cada interrupción insertada de la longitud por la penalización de extensión de interrupción. Los valores predeterminados de penalización de creación de interrupciones y de penalización de extensión de interrupciones en la versión 10 del paquete de programas de Wisconsin Genetics Software Package® son 8 y 2, respectivamente. La creación de interrupciones y las penalizaciones de creación de interrupciones pueden expresarse como un entero seleccionado del grupo de enteros que consisten en 0 a 100. Asi, por ejemplo, la creación de interrupciones y las penalizaciones de creación de interrupciones pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o mayores.
GAP presenta un miembro de la familia de los mejores alineamientos. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene mejor calidad. GAP muestra cuatro figuras de mérito para alineamientos: calidad, relación, identidad y similitud. La calidad es la medida maximizada para alinear las secuencias. La relación es la calidad dividida por la cantidad de bases en el segmento más corto. La identidad porcentual es el porcentaje de los símbolos que realmente coinciden. La similitud porcentual es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los símbolos que están en las interrupciones se ignoran. Una similitud se determina cuando el valor de la matriz de puntajes para un par de símbolos es mayor o igual que 0.50, el umbral de similitud. La matriz de puntajes que se usa en la versión 10 del paquete de programas Wisconsin Genetics Software Package® es BLOSU 62 (Ver, Henikoff y Henikoff, (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915) .
A menos que se indique de otra manera, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente descripción se refieren al valor obtenido por medio del uso del paquete BLAST 2.0 de programas que usa parámetros por defecto (Altschul, et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402) .
Como entenderán las personas de habilidad ordinaria en la técnica, las búsquedas BLAST asumen que las proteínas pueden modelarse como secuencias aleatorias. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencias no aleatorias, las que pueden ser tractos homopoliméricos, repeticiones de período corto, o regiones enriquecidas en uno o más aminoácidos. Tales regiones de baja complejidad pueden alinearse entre proteínas no reguladas aunque otras regiones de la proteína son completamente disímiles. Un número de programas filtro de baja complejidad pueden usarse para reducir esos alineamientos de baja complejidad. Por ejemplo, los filtros SEG (Wooten y Federhen, (1993) Comput . Chem. 17:149-63) y XNU (Claverie and States, (1993) Comput. Chem. 17:191-201) de baja complejidad pueden usarse solos o en combinación .
Como se usa en la presente descripción, "identidad de secuencias" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o de polipéptidos incluyen la referencia a los residuos en las dos secuencias, que son. iguales cuando se alinean para la máxima correspondencia en una ventana de comparación específica. Cuando el porcentaje de identidad de secuencias se usa en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren, frecuentemente, por sustituciones de aminoácidos conservadoras, en donde los residuos de aminoácidos se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y, por lo tanto, no alteran las propiedades funcionales de la molécula. En donde las secuencias difieren de sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencias se puede ajustar ascendentemente para lograr la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias, que difieren por tales sustituciones conservadoras, tienen "similitud de secuencias" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son muy conocidos para los expertos en la técnica. Típicamente, esto requiere el puntaje de una sustitución conservadora como una falta de coincidencia parcial y no completa; así, se incrementa el porcentaje de identidad de secuencias. Por lo tanto, por ejemplo, en donde a un aminoácido idéntico se le da un puntaje de 1 y a una sustitución no conservadora se le da un puntaje de 0, a una sustitución conservadora se le da un puntaje entre 0 y 1. Los puntajes de las sustituciones conservadoras se calculan, por ejemplo, de acuerdo con el algoritmo de Meyers and Miller, (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17, por ejemplo, como se implemento en el programa PC/GENE ( Intelligenetics , Mountain View, California, USA) .
Como se usa en la presente descripción, "porcentaje de identidad de secuencias" se refiere al valor determinado por la comparación de dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, interrupciones) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Para calcular el porcentaje se determina la cantidad de posiciones en las cuales se produce la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácido idéntico en las dos secuencias para obtener la cantidad de posiciones emparejadas, se divide la cantidad total de posiciones emparejadas por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y el resultado se multiplica por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia .
El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidos se refiere a que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene entre 50-100 % de identidad de secuencias, preferentemente, por lo menos 50 % de identidad de secuencias, preferentemente, por lo menos 60 % de identidad de secuencias, preferentemente, por lo menos 70 %, con mayor preferencia, por lo menos 80 %, con mayor preferencia, por lo menos 90 % y, con la máxima preferencia, por lo menos 95 %, en comparación con una secuencia de referencia mediante el uso de uno de los programas de alineamiento descritos con el uso de parámetros estándar. Una persona con experiencia reconocerá que esos valores pueden ajustarse adecuadamente para determinar la identidad de proteínas correspondiente codificada por dos secuencias de nucleótidos al tener en cuenta la degeneración del codón, la similitud del aminoácido, el posicionamiento del marco de lectura y similares. La identidad sustancial de la secuencia de aminoácidos para estos propósitos normalmente significa una identidad de secuencia de entre 55-100 %, preferentemente, al menos 55 %, preferentemente, al menos 60 %, con mayor preferencia, al menos 70 %, 80 %, 90 % y, con la máxima preferencia, al menos 95 %.
Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas consiste en que dos moléculas se hibridizan entre si bajo condiciones rigurosas. La degeneración del código genético permite muchas sustituciones de ácidos nucleicos que producen una variedad en la secuencia de nucleótidos que codifica para el mismo aminoácido; por lo tanto, es posible que la secuencia de ADN pueda codificar para el mismo polipéptido pero no se hibridizan entre si en condiciones rigurosas. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico mediante el uso de la máxima degeneración del codón permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas consiste en que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo al cruce con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico.
Los términos "identidad sustancial" en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con entre 55-100 % de identidad de secuencias con una secuencia de referencia, preferentemente, por lo menos 55 % de identidad de secuencias, preferentemente, 60 %, preferentemente, 70 %, con mayor preferencia, 80 %, con la máxima preferencia, por lo menos 90 % o 95 % de identidad de secuencias con la secuencia de referencia en una ventana de comparación específica. Preferentemente, el alineamiento óptimo se realiza con el uso del algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, supra. Una indicación de que dos secuencias de péptidos son prácticamente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos obtenidos contra el segundo péptido. Así, un péptido es prácticamente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, en donde los dos péptidos difieren solamente en una sustitución conservadora. Adicionalmente, un péptido puede ser prácticamente idéntico a un segundo péptido cuando difiere en un cambio no conservador si el epítopo que reconoce el anticuerpo es prácticamente idéntico. Los péptidos que son "sustancialmente similares" comparten secuencias, como se denotó anteriormente, excepto que las posiciones de residuos, que no son idénticas, pueden diferir por cambios conservadores de aminoácidos.
La descripción describe polinucleótidos y polipéptidos diurnos. Los nucleótidos y las proteínas nuevos de la descripción tienen un patrón de expresión que indica que regulan el número celular y, por lo tanto, desempeñan una función importante en el desarrollo de las plantas. Los polinucleótidos se expresan en varios tejidos vegetales. Por lo tanto, los polinucleótidos y polipéptidos proporcionan una oportunidad para manipular el desarrollo de las plantas para alterar el desarrollo de semillas y de tejidos vegetales, el tiempo o la composición. Esto puede usarse para crear una planta estéril, una planta sin semillas o una planta con una composición de endosperma alterada.
Los ortólogos de maíz de los genes circadianos de Arabidopsis y arroz se identificaron mediante búsquedas recíprocas en BLAST, además de la evaluación de si las relaciones de proteínas inferidas se ajustan al patrón de especiación y, después, se buscaron patrones de oscilación en los tejidos foliares y de la espiga. Al usar estos criterios, se identificó que los homólogos de maíz contenían varios componentes centrales importantes, que incluyen CCA1/LHY, TOC1, PRR7/3, GI y ZTL (Figura 1).
Este estudio identificó dos homólogos de TOC1, ZmTOCa y ZmTOCb, que se asignaron al cromosoma 5 y 4, respectivamente. La transcripción de ambos genes alcanza su punto máximo a las 6 p.m., de manera consistente con la expresión génica de TOCl en Arabidopsis. TOCl es un miembro de la familia de reguladores de pseudo-respuesta (PRR) , compuesta de cinco genes PRR de evolución conservada en Arabidopsis y arroz ( urakami, et al., (2007) Biosci Biotechnol Biochem 71:1107-1110; Murakami, et al., (2003) Plant Cell Physiol 44:1229-1236). Además de los dos homólogos de ZmTOCl, el estudio también identificó a ZmPRR73, ZmPRR37 y ZmPRR59, que fueron denominados según los genes PRR del arroz con base en el nivel de similitud de secuencia (Murakami, et al., (2003)). Además, se identificaron dos homólogos de ZEITLUPE (Kim, et al., (2007) Nature 449:356-360), ZmZTLa y ZmZTLb, que se asignaron al cromosoma 2 y 4. Se describieron previamente dos ortólogos de maíz de GIGANTIA, gigzlA y gigzlB (Miller, et al., (2008) Planta 227:1377-1388) y, en la presente descripción, se confirma su oscilación tanto en las espigas como en las hojas. Los ciclos de los componentes centrales ZmCCA, ZmLHY, ZmTOCla y ZmTOClb se confirmaron adicionalmente mediante el análisis de RT-PCR (Figura 2). La amplitud de los componentes centrales disminuye en la espiga en desarrollo cuando se la compara con el tejido foliar, pero aún es robusta. Estos datos demuestran que la mayor parte del sistema oscilador central de la planta funciona en tejidos no fotosintéticos, tal como la espiga, pero la salida del oscilador está, evidentemente, muy aislada de la maquinaria de transcripción que afecta los cambios de expresión diurna descendente .
Se determinó que las transcripciones de regulación diurna se extienden por la mayoría de las funciones de las células foliares de maíz. Las 6674 transcripciones (de 10,037 sondas de matrices Agilent) que, en la presente descripción, se determinan como de regulación diurna representan más del 22 % de las transcripciones totales detectadas expresadas y estas 6674 transcripciones se podrían asignar a 1716 términos de Ontología Génica (GO) y a 22 categorías funcionales de KOG diferentes .
Generalmente, los genes individuales tienen solo un pico en su ciclo diurno. Cuando estos genes se asignaron a términos funcionales y el enriquecimiento relativo de esos términos funcionales se gráfico a lo largo del día, la mayoría de las funciones tuvo un. enriquecimiento marcado durante un patrón temporal particular en el día. No obstante, también se observó una clara tendencia de algunos términos funcionales a tener un patrón bimodal, en donde había un pico a media mañana a las 10 a.m. y un pico secundario en las últimas horas de la tarde o la noche a las 6 p.m. o a las 10 p.m. Más del 18 % de los términos funcionales se clasificaron como con regulación bimodal, con subdivisiones adicionales realizadas de conformidad con el enriquecimiento relativo del pico matutino o vespertino. Junto con las funciones a las que se asignó como con un solo pico en el día, el 94.5 % de las 1738 funciones se asignaron a uno de estos patrones, con solo 95 restantes que se asignarán al patrón "Otro".
Frecuentemente, los términos funcionales de patrón bimodal representan clasificaciones funcionales ricas en genes más amplias, tales como actividad de proteina cinasa, mecanismo de transducción de señal, o transporte y metabolismo de aminoácidos. (Figura 5) En consecuencia, estos patrones bimodales tienden a alcanzar una representación justa durante el día y no solo a las 10 a.m. y a las 6/10 p.m. Sin embargo, es una característica principal del patrón diurno que los picos de enriquecimiento génicos y funcionales ocurran, típicamente, a media mañana y, posteriormente, de nuevo a la tarde/noche. En este experimento, el amanecer tuvo lugar a las 6:02 a.m. y el atardecer a las 8:40 p.m. Por lo tanto, el amanecer se produce 4 horas antes del pico funcional de las 10 a.m., pero el atardecer tiene lugar 2.45 horas después de las 6 p.m. y 1.25 horas antes de las 10 p.m. Los horarios adicionales pueden proporcionar una mayor resolución, pero el hecho de que entre los patrones bimodales, los patrones de 10 a.m. y > 6/10 p.m. tengan índices de enriquecimiento funcional de más del 70 % que los patrones de 6 p.m. y >10 a.m., puede estar relacionado con esta ubicación asimétrica de los horarios en relación con el amanecer y el atardecer. Alternativamente, algunas clases funcionales pueden estar inherentemente enriquecidas para la fase matutina, lo que refleja tendencias biológicas subyacentes.
El hecho de que 1643 términos funcionales o 94.5 % de estos fueron asignados a un patrón de pico temporal indica una progresión bastante definida de las funciones durante el día. Los grupos funcionales no están, por lo tanto, distribuidos uniformemente en las diferentes fases del día, sino que exhiben distintos patrones y sesgos. Las categorías funcionales enriquecidas al amanecer incluyen, por ejemplo: respuesta al frío, catabolismo de lípidos y señalización hormonal. Esto continúa hasta media mañana con múltiples funciones de respuesta hormonal que se enriquecen. El mediodía está dominado, según se prevé, por los sistemas de fotosíntesis I y II, síntesis de clorofila y monodehidroascorbato reductasa (MDAR) , que participan en la generación de antioxidantes. Las últimas horas de la tarde y la noche revelan un marcado enriquecimiento para la reparación de daños ribosómicos y de ADN, que incluyen actividad helicasa, telomerasa y endonucleasa, lo que sugiere que los sistemas de reparación cromosómicos y ribosómicos están activados. Además, el transporte de sacarosa y la desviación de pentosa-fosfato alcanzan su punto máximo en las últimas horas de la tarde/la noche, lo que sugiere la dinámica del metabolismo de carbohidratos del cloroplasto. Los picos en las últimas horas de la tarde incluyen fototransducción de luz roja/roja lejana, mencionada en la introducción como reguladora del reloj central, pero también el metabolismo de peróxido de hidrógeno. En la noche, la actividad (similar a) caspasa, a menudo asociada a la muerte celular, el catabolismo del fotosistema II, el transporte y el metabolismo de nucleótidos y las funciones de unión acil-CoA alcanzan su punto máximo. Otros patrones con picos irregulares pero interesantes son el punto máximo de la glicosilación de aminoácidos a las 6 p.m. y a las 2 a.m., y las uniones de enzima mélica y calmodulina con picos a las 10 a.m. y las 2 a.m. Estos son solo algunos ejemplos de una historia muy compleja que aborda toda la fisiología celular de las plantas.
Particularmente, a pesar de la gran variedad de genes y funciones con regulación diurna, la mayoría de las categorías funcionales solo tiene una minoría de miembros con regulación diurna. Entre las 1738 categorías funcionales, la cobertura media fue de 28.2 % con la mediana de 20 % y la moda de aproximadamente 15 %. Las categorías funcionales que contienen múltiples genes no estuvieron completamente representadas por transcripciones de regulación diurna, y pocas categorías funcionales fueron excepcionalmente enriquecidas para las transcripciones de regulación diurna. La actividad fosfoglucomutasa GO: 0004614 tuvo cinco de seis y el transporte polar de auxinas GO: 0009926 tuvo tres de cuatro transcripciones en el conjunto diurno. Los hallazgos indican que las transcripciones de regulación diurna se encuentran incluidas pero no dominan estas distintas funciones.
Se identificaron numerosos genes de regulación diurna de maíz durante los análisis. Un total de 471 secuencias, incluidas aquellas de espigas inmaduras, aquellas con ciclos de alta amplitud/magnitud en el tejido foliar, y diversas secuencias asociadas con funciones NUE y Carbono :: itrógeno . Las secuencias contienen marcos abiertos de lectura (ORF) , polipéptidos codificados y sus promotores asociados . Ácidos nucleicos La presente descripción proporciona, entre otros, ácidos nucleicos asilados de ARN, ADN y análogos y/o quimeras de estos, que comprenden un polinucleótido diurno.
La presente descripción incluye, además, polinucleótidos optimizados para la expresión en diferentes organismos. Por ejemplo, para la expresión del polinucleótido en una planta de maíz, la secuencia se puede alterar para tener en cuenta las preferencias del codón especifico y alterar el contenido de GC de de acuerdo con Murray, et al, más arriba. El uso de codones en maíz para los 28 genes de plantas de maíz se enumera en la Tabla 4 de Murray, et al., más arriba.
Los ácidos nucleicos diurnos de la presente descripción comprenden polinucleótidos diurnos aislados que incluyen : (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido diurno y variantes polimórficas de este conservadoramente modificadas; (b) un polinucleótido que tiene por lo menos 70 % de identidad de secuencias con los polinucleótidos de (a) o (b) ; (c) secuencias complementarias de los polinucleótidos de (a) o (b) .
La siguiente tabla, Tabla 1, enumera las identidades específicas de los polinucleótidos y polipéptidos descritos en la presente.
Tabla 1.
Construcción de ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente descripción se pueden elaborar con el uso de: (a) métodos recombinantes estándar, (b) técnicas sintéticas o combinaciones de estos. En algunas modalidades, los polinucleótidos de la presente descripción se clonarán, amplificarán o de cualquier otra forma se construirán a partir de un hongo o una bacteria.
Los ácidos nucleicos pueden comprender, convenientemente, secuencias además de un polinucleótido de la presente descripción. Por ejemplo, un sitio de multi-clonación que comprende uno o más sitios de restricción de la endonucleasa pueden insertarse en el ácido nucleico para auxiliar en el aislamiento del polinucleótido. Además, es posible insertar secuencias traducibles para auxiliar en el aislamiento del polinucleótido traducido de la presente descripción. Por ejemplo, una secuencia de marcadores de hexahistidina proporciona un medio adecuado para purificar las proteínas de la presente descripción. El ácido nucleico de la presente descripción, sin incluir la secuencia de polinucleótidos es, opcionalmente, un vector, adaptador o conector para la clonación y/o expresión de un polinucleótido de la presente descripción. Las secuencias adicionales pueden añadirse a esas secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o expresión para auxiliar en el aislamiento del polinucleótido o mejorar la introducción del polinucleótido en una célula. Típicamente, la longitud de un ácido nucleico de la presente descripción menos la longitud de su polinucleótido de la presente descripción es menor que 20 pares de kilobases, frecuentemente, menor que 15 kb y, frecuentemente, menor que 10 kb. El uso de los vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y enlazadores se conoce bien en la técnica. Los ácidos nucleicos ilustrativos incluyen esos vectores, tales como: M13, lambda ZAP Express, lambda ZAP II, lambda gtlO, lambda gtll, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II, lambda DASH II, lambda EMBL 3, lambda EMBL 4, pWE15, SuperCos 1, SurfZap, Uni-ZAP, pBC, pBS+/-, pSG5, pBK, pCR-Script, pET, pSPUTK, p3'SS, pGEM, pSK+/-, pGEX, pSPORTI y II, pOPRSVI CAT, POPI3 CAT, pXTl, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo, pOG44, pOG45, pFRI^GAL, pNEG GAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, lambda MOSSlox y lambda MOSElox. Los vectores opcionales para la presente descripción incluyen, sin limitarse a, lambda ZAP II y pGEX. Para una descripción de diversos ácidos nucleicos véanse, por ejemplo, Stratagene Cloning Systems, catálogos 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA) y Amersham Life Sciences, Inc, catálogo de 1997 (Arlington Heights, IL) .
Métodos sintéticos para construir ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente descripción se pueden preparar, además, por síntesis química directa mediante métodos, tales como el método del fosfotriéster de Narang, et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:90-9; el método del fosfodiéster de Brown, et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:109-51; el método del dietilfosforamidita de Beaucage et al., (1981) Tetra. Letts. 22 (20) : 1859-62; el método del fosforamidita triéster de fase sólida descrito por Beaucage, et al., más arriba, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador automático, por ejemplo, como se describe en Needham-VanDevanter, et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-68 y el método del soporte sólido de la patente de los EE. UU. núm. 4,458,066. La síntesis química produce, generalmente, un oligonucleótido de una sola cadena. Este puede convertirse en un ADN de cadena doble por hibridación con una secuencia complementaria o por polimerización con una ADN polimerasa por medio del uso de la cadena sencilla como una plantilla. Una persona con experiencia reconocerá que mientras la síntesis química del ADN se limita a secuencias de aproximadamente 100 bases, se pueden obtener secuencias más largas por la ligadura de secuencias más cortas.
UTR y preferencia codónica Generalmente, se encontró que la eficiencia de la traducción se regula por medio de elementos específicos de la secuencia en la región no codificante o la región sin traducir 5' (5' UTR) del AR . Los motivos secuenciales positivos incluyen secuencias consenso de iniciación traduccional (Kozak, (1987) Nucleic Acids Res. 15:8125) y las estructuras 5<G> 7 metil GpppG (Drummond, et al., (1985) Nucleic Acids Res. 13:7375). Los elementos negativos incluyen estructuras de tallo-lazo intramolecular 5' UTR estables (Muesing, et al., (1987) Cell 48:691) y secuencias AUG o marcos de lectura abiertos cortos precedidos por una AUG adecuada en el 5' UTR (Kozak, más arriba, Rao, et al., (1988) Mol. and Cell. Biol. 8:284). Por lo tanto, la presente descripción proporciona regiones UTR 5' y/o 3' para modular la traducción de las secuencias codificantes heterologas.
Además, los segmentos codificadores de polipéptidos de los polinucleótidos de la presente descripción pueden modificarse para alterar el uso de codones. El uso alterado de codones puede usarse para alterar la eficiencia traduccional y/o para optimizar la secuencia codificante para la expresión en un huésped deseado o para optimizar el uso de codones en una secuencia heterologa para la expresión en maíz. El uso de codones en las regiones codificantes de los polinucleótidos de la presente descripción puede analizarse estadísticamente con el uso de paquetes de programas disponibles comercialmente, tales como el de "preferencia codónica" disponible de la University of Wisconsin Genetics Computer Group. Ver, Devereaux, et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:387-395; o MacVector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.). Por lo tanto, la presente descripción proporciona una frecuencia del uso de codones característica de la región codificante de por lo menos uno de los polinucleótidos de la presente descripción. El número de polinucleótidos (3 nucleótidos por aminoácido) que pueden usarse para determinar una frecuencia del uso de codones puede ser cualquier entero desde 3 hasta el número de polinucleótidos de la presente descripción que se proporciona en la presente. Opcionalmente, los polinucleótidos serán secuencias de longitud completa. Un número ilustrativo de secuencias para el análisis estadístico puede ser al menos 1, 5, 10, 20, 50 o 100.
Barajado de secuencias La presente descripción proporciona métodos para el barajado de secuencias con el uso de polinucleótidos de la presente descripción y composiciones resultantes de estos. La permutación de secuencias se describe en publicación PCT número 96/19256. Ver además, Zhang, et al., (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94 : 4504-9 y Zhao, et al., (1998) Nature Biotech 16:258-61. Generalmente, la permutación de secuencias proporciona un medio para generar genotecas de polinucleótidos que tienen una característica deseada, que puede seleccionarse o ensayarse. Las genotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas, que comprenden regiones de secuencias que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden recombinarse homólogamente in vitro o in vivo. La población polinucleótidos de secuencias recombinadas comprende una subpoblación de polinucleótidos que poseen características deseables o ventajosas y las que pueden seleccionarse por un método de selección o ensayo adecuado. Las características pueden ser cualquier propiedad o atributo que se pueda seleccionar o detectar en un sistema de selección, y pueden incluir las propiedades de: una proteina codificada, un elemento transcripcional, una secuencia de control de la transcripción, procesamiento de ARN, estabilidad del ARN, conformación de cromatina, traducción u otra propiedad de expresión de un gen o transgén, un elemento replicador, un elemento de unión a la proteína o similares, tales como cualquier característica que confiera una propiedad seleccionable o detectable. En algunas modalidades, la característica seleccionada será una Km y/o Kcat alterada sobre la proteína silvestre como se proporciona en la presente descripción. En otras modalidades, una proteína o polinucleótido generado a partir de la permutación de secuencias tendrá una afinidad de unión del ligando mayor que el polinucleótido silvestre sin permutar. En aún otras modalidades, una proteina o polinucleótido generado a partir de la permutación de secuencias tendrá un pH óptimo alterado cuando se compara con el polinucleótido silvestre sin permutar. El incremento en esas propiedades puede ser al menos 110 %, 120 %, 130 %, 140 % o mayor que 150 % del valor silvestre .
Casetes de expresión recombinante La presente descripción proporciona, además, casetes de expresión recombinante que comprenden un ácido nucleico de la presente descripción. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polinucleótido deseado de la presente descripción, por ejemplo, un ADNc o una secuencia genómica que codifica un Polipéptido con la longitud suficiente para codificar una proteina activa de la presente descripción, puede usarse para construir un cásete de expresión recombinante que puede introducirse en la célula hospedera deseada. Un cásete de expresión recombinante comprende, típicamente, un polinucleótido de la presente descripción unido operativamente a secuencias reguladoras de la iniciación transcripcional que dirigen la transcripción del polinucleótido en la célula hospedera deseada, tales como tejidos de una planta transformada.
Por ejemplo, los vectores de expresión de la planta pueden incluir: (1) un gen de la planta clonado bajo el control transcripcional de las secuencias reguladoras 5' y 3' , y (2) un marcador seleccionable dominante. Tales vectores de expresión de la planta pueden contener, además, si se desea, una región reguladora promotora (por ejemplo, una que otorgue una expresión selectiva/especifica de una célula o tejido, que sea inducible o constitutiva, regulada por el medio ambiente o por el desarrollo) , un sitios de iniciación de la transcripción, un sitio de unión con el ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación .
Puede usarse un fragmento promotor de la planta para dirigir la expresión de un polinucleótido de la presente descripción en todos los tejidos de una planta regenerada. Tales promotores se mencionan en la presente descripción como promotores "constitutivos" y se encuentran activos en la mayoría de condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor 1' o 2' derivado de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, el promotor Smas, el promotor de alcohol cinamílico deshidrogenasa (patente de los EE. UU. núm. 5,683,439), el promotor Nos, el promotor rubisco, el promotor GRP1-8, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) , tal como se describe en Odell, et al., (1985) Nature 313:810-2; actina de arroz (McElroy, et al., (1990) Plant Cell 163-171); ubiquitina (Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-89); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-8); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3:2723-30) e histona H3 del maíz (Lepetit, et al., (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-85 y Atanassvoa, et al., (1992) Plant Journal 2(3):291-300) ; el promotor ALS, tal como se describe en la publicación de solicitud de patente PCT núm. WO 96/30530; GOS2 (patente de los EE . UU núm. 6, 504, 083) y otras regiones de iniciación de transcripción de diversos genes vegetales conocidos por las personas con experiencia en la técnica. Para la presente descripción, la ubiquitina es el promotor preferido para la expresión en plantas monocotiledóneas .
Alternativamente, el promotor de la planta puede dirigir la expresión de un polinucleótido de la presente descripción en un tejido especifico o puede estar de cualquier otra manera bajo un control del desarrollo o medioambiental más preciso. Tales promotores se denominan en la presente invención promotores "inducibles" (Rabl7, RAD29) . Las condiciones ambientales que pueden efectuar la transcripción por los promotores inducibles incluyen ataque de patógenos, condiciones anerobias o la presencia de luz. Los ejemplos de promotores inducibles son el promotor Adhl, que es inducible por hipoxia o estrés por frío, el promotor Hsp70, que es inducible por estrés al calor y el promotor PPDK, que es inducible por la luz.
Como ejemplos de promotores bajo control de desarrollo se incluyen aquellos que inician la transcripción solamente o, preferentemente, en ciertos tejidos tales como hojas, raíces, frutos, semillas o flores. La operación de un promotor puede variar, además, en dependencia de su lugar en el genoma . Así, un promotor inducible puede hacerse completamente o parcialmente constitutivo en ciertos lugares.
Si se desea la expresión del polipéptido, se prefiere, generalmente, incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región codificante del polinucleótido . La región de poliadenilación puede derivarse de una variedad de genes de las plantas, o de T-ADN. La secuencia del extremo 3' que se añadirá puede obtenerse, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa o de octopina sintasa o, alternativamente, de otro gen vegetal o, con menor preferencia, de cualquier otro gen eucariota. Los ejemplos de tales elementos reguladores incluyen, pero no se limitan a, la terminación 3' y/o regiones de poliadenilación tales como los del gen de nopalina sintasa de Agrobacterium turnefaciens (nos) (Bevan, et al., (1983) Nucleic Acids Res. 12:369-85); el gen inhibitor de proteinasa de papa II (PINII) (Keil, et al., (1986) Nucleic Acids Res. 14:5641-50 y An, et al., (1989) Plant Cell 1:115-22) y el gen CaMV 19S (Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1261-72) .
Se puede agregar una secuencia de intrones a la región 5' no traducida o la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para incrementar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón divisible en la unidad de transcripción en las construcciones de expresión, tanto de plantas como de animales demostró que aumenta la expresión génica tanto en los niveles de ARNm y proteína hasta 1000 veces (Buchman y Berg, (1988) Mol. Cell Biol. 8:4395-4405; Callis, et al., (1987) Genes Dev. 1:1183-200) . Dicho mejoramiento de intrones de expresión genética es, típicamente, mayor cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. Se conoce en la materia el uso de intrones de maíz Adhl-S intrón 1, 2 y 6, el intrón Bronze-1. Ver, generalmente, The Maize Handbook, capítulo 116, Freeling and Walbot, eds . , Springer, Nueva York (1994) .
Las secuencias señales de la planta, que incluyen, pero no se limitan al, péptido señal que codifica para las secuencias de ADN/ARN que dirige las proteínas a la matriz extracelular de la célula vegetal (Dratewka-Kos, et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:4896-900), tal como el gen de extensión de Nicotiana plumbaginifolia (DeLoose, et al.r (1991) Gene 99:95-100) ; los péptidos señal que orientan las proteínas a la vacuola, tal como el gen de la esporamina de boniato (Matsuka, et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:834) y el gen de la lectina de la cebada (Wilkins, et al., (1990) Plant Cell, 2:301-13) ; los péptidos señal que permiten la secreción de proteínas, tales como PRIb (Lind, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:47-53) o la alfa amilasa de cebada (BAA) (Rahmatullah, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:119 y de este modo incorporada como referencia) o los péptidos señal que dirigen las proteínas a los plástidos, tales como el de enoil-Acp reductasa de semilla de colza (Verwaert, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 26:189-202) son útiles en la presente descripción. La secuencia señal de alfa amilasa de la cebada fusionada al polinucleótido diurno es la construcción preferida para la expresión en el maiz para la presente descripción.
El vector que comprende las secuencias de un polinucleótido de la presente descripción comprende, típicamente, un gen marcador, que confiere un fenotipo seleccionable en las células vegetales. Usualmente, el gen marcador seleccionable codifica la resistencia a los antibióticos con los genes adecuados que incluyen los genes que codifican para la resistencia al antibiótico espectinomicina (por ejemplo, el gen aada) , el gen de estreptomicina fosfotransferasa (SPT) que codifica para la resistencia a la estreptomicina, el gen de neomicina fosfotransferasa (NPTII) que codifica para la resistencia a la canamicina o geneticina, el gen higromicina fosfotransferasa (HPT) que codifica para la resistencia a la higromicina, genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la acetolactato sintasa (ALS) , particularmente, los herbicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a esa resistencia particular las mutaciones S4 y/o Hra) , genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar) , u otros de tales genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica para la resistencia al herbicida basta, y el gen ALS codifica para la resistencia al herbicida clorsulfurón.
Los vectores típicos útiles para la expresión de genes en las plantas superiores se conocen bien en la técnica e incluyen los vectores derivados del plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers, et al. (1987), Meth. Enzymol. 153:253-77. Estos vectores son vectores integrantes de plantas en que en la transformación, los vectores integran una porción del vector ADN en el genoma de la planta huésped. Los vectores de A. tumefaciens ilustrativos útiles en la presente descripción son los plásmidos pKYLX6 y pKYLX7 de Schardl, et al., (1987) Gene 61:1-11 y Berger, et al., (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86:8402-6. Otro vector útil en la presente descripción es el plásmido pBI101.2 disponible de CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) .
Expresión de proteínas en células huésped Con el uso de los ácidos nucleicos de la presente descripción se puede expresar una proteína de la presente descripción en una célula modificada de manera recombinante, tales como células bacterianas, de levadura, insectos, mamíferos o, preferentemente, células vegetales. Las células producen la proteína en una condición no natural (por ejemplo, en cantidad, composición, lugar y/o tiempo) , debido a que se alteraron genéticamente a través de la intervención humana para hacerlo.
Se espera que las personas con experiencia en la técnica conozcan los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína de la presente descripción. No se hará ningún intento para describir en detalle los diversos métodos conocidos para la expresión de proteínas en procariotas o eucariotas .
En resumen, la expresión de ácidos nucleicos aislados que codifican una proteina de la presente descripción se alcanza, típicamente, al unir operativamente, por ejemplo, el ADN o ADNc a un promotor (que es constitutivo o inducible) , seguido por la incorporación en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración en procariotas o eucariotas . Los vectores de expresión típicos contienen terminadores de transcripción y de traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para regular la expresión del ADN que codifica una proteína de la presente descripción. Para obtener un alto nivel de expresión de un gen clonado, se prefiere construir vectores de expresión que contengan, como mínimo, un promotor fuerte, tal como ubiquitina, para dirigir la transcripción, un sitio de unión al ribosoma para la iniciación traduccional y un terminador de la transcripción/traducción. Los promotores constitutivos se clasifican para facilitar un intervalo de expresión constitutiva. Así, algunos son promotores constitutivos débiles y otros son promotores constitutivos fuertes. Generalmente, "promotor débil" se refiere a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. "Nivel bajo" se refiere a niveles de aproximadamente 1/10,000 transcripciones a aproximadamente 1/100,000 transcripciones a aproximadamente 1/500,000 transcripciones.
Contrariamente, un "promotor fuerte" conduce la expresión de una secuencia codificante a un "nivel alto" o aproximadamente 1/10 transcripciones a aproximadamente 1/100 transcripciones a aproximadamente 1/1,000 transcripciones.
Un experto reconocería que es posible hacer modificaciones a una proteína de la presente descripción sin disminuir su actividad biológica. Algunas modificaciones pueden realizarse para facilitar la clonación, expresión o incorporación de la molécula objetivo en una proteína de fusión. Las personas con experiencia en la técnica conocen bien tales modificaciones e incluyen, por ejemplo, una metionina añadida en el terminal amino para proporcionar un sitio de iniciación o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poli His) situados en cada terminal para crear sitios de restricción convenientemente localizados o codones de terminación o secuencias de purificación.
Expresión en procariotas Las células procariotas pueden usarse como huéspedes para la expresión. Con mayor frecuencia, las procariotas están representadas por diversas cepas de E. coli; no obstante, también se pueden usar otras cepas microbianas. Las secuencias control procariotas usadas comúnmente que se definen en la presente descripción para incluir los promotores para la iniciación de la transcripción, opcionalmente con un operador, conjuntamente con las secuencias del sitio de unión al ribosoma, incluyen esos promotores usados comúnmente como los sistemas promotores de beta lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Chang, et al., (1977) Nature 198:1056), el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057) y el promotor P L derivado de lambda y el sitio de unión al ribosoma del gen N (Shimatake, et al., (1981) Nature 292:128). Además, es útil la inclusión de marcadores de selección en los vectores de ADN transfectados en E. coli. Los ejemplos de tales marcadores incluyen genes de resistencia especifica a la ampicilina, tetraciclina o cloranfenicol .
El vector se selecciona para permitir la introducción del gen de interés en la célula huésped adecuada. Los vectores bacterianos son, típicamente, de origen plásmido o fago. Las células bacterianas adecuadas se infectan con las partículas del vector fago o transfectadas con ADN del vector fago desnudo. Si se usa un vector plásmido, las células bacterianas se transfectan con el ADN del vector plásmido. Los sistemas de expresión para expresar una proteína de la presente descripción están disponibles con el uso de Bacillus sp. y Salmonella (Palva, et al., (1983) Gene 22:229-35; Mosbach, et al., (1983) Nature 302:543-5). El vector plasmídico pGEX-4T-l de Pharmacia es el vector de expresión de E. coli preferido para la presente descripción.
Expresión en eucariotas Una variedad de sistemas de expresión eucariotas tales como levadura, lineas celulares de insectos, células vegetales y de mamífero, son del conocimiento de las personas con experiencia en la técnica. Como se explica brevemente a continuación, la presente descripción puede expresarse en estos sistemas eucariotas. En algunas modalidades, las células vegetales transformadas/transfectadas, como se menciona más abajo, se usan como sistemas de expresión para la producción de proteínas de la presente descripción.
La síntesis de proteínas heterólogas en levadura es muy conocida. Sherman, et al., (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory es un trabajo de reconocimiento que describe varios métodos disponibles para producir la proteína en levadura. Dos levaduras ampliamente usadas para la producción de proteínas eucariotas son Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris . Los vectores, cepas y protocolos de expresión en Saccharomyces y Pichia se conocen en la técnica y están disponibles de suministradores comerciales (por ejemplo, Invitrogen) . Los vectores adecuados tienen, generalmente, secuencias control de expresión, tales como los promotores, que incluyen 3-fosfoglicerato quinasa o alcohol oxidasa y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee.
Una proteína de la presente descripción, una vez expresada, puede aislarse de la levadura mediante el lisado de las células y la aplicación de técnicas estándar de aislamiento de proteínas a los lisados o microesferas . El monitoreo del proceso de purificación puede llevarse a cabo mediante el uso de técnicas de Membrana de Western o por radioinmunoensayo de otras técnicas de inmunoensayo estándar.
Las secuencias que codifican proteínas de la presente descripción pueden ligarse, además, a diversos vectores de expresión para usar en cultivos de células transfectadas, por ejemplo, de mamíferos, de insectos o de plantas. Los sistemas de células de mamíferos estarán, frecuentemente, en forma de monocapas de células, aunque se pueden usar, además, suspensiones de células de mamíferos. Un número de líneas de células huésped adecuadas capaces de expresar las proteínas intactas se desarrollaron en la técnica, e incluyen las líneas celulares HEK293, BHK21 y CHO. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir las secuencias control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor (por ejemplo, el promotor CMV, un promotor HSV tk o el promotor pgk (fosfoglicerato quinasa) ) , un potenciador (Queen, et al., (1986) Immunol . Rev. 89:49) y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como los sitios de unión al ribosoma, los sitios de empalme ARN, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de adición poli A SV40 largo T Ag) y secuencias terminadoras transcripcionales . Otras células animales útiles para la producción de proteínas de la presente descripción se encuentran disponibles, por ejemplo, del catálogo Cell Lines and Hybridomas de la Colección americana de cultivos tipo (7.a ed., 1992).
Los vectores adecuados para expresar las proteínas de la presente descripción en células de insectos se derivan, usualmente, del baculovirus SF9. Las líneas celulares de insectos adecuadas incluyen las líneas celulares de larvas de mosquito, gusano de seda, gusano soldado, polilla y Drosophila tales como una línea celular Schneider (Ver, por ejemplo, Schneider, (1987) J. Embryol. Esp. Morphol. 27:353-65).
Al igual que con la levadura, cuando se usan células vegetales huésped o de animal superiores, las secuencias terminadoras de la transcripción o de poliadenilación se incorporan, típicamente, en el vector. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilación del gen de la hormona del crecimiento bovino. Pueden incluirse, además, las secuencias para un empalme preciso de la transcripción. Un ejemplo de una secuencia de empalme es el intrón VP1 de SV40 (Sprague, et al., (1983) J. Virol. 45:773-81). Además, las secuencias de genes para controlar la replicación en la célula huésped se pueden incorporar en el vector, tales como las que se encuentran en los vectores tipo virus del papiloma bovino (Saveria-Campo, "Bovine Papxlloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector" en DNA Cloning: A PRACTICAL APPROACH, vol. II, Glover, ed., IRL Press, Arlington, VA, págs. 213-38 (1985)).
Además, el gen para la expresión diurna ubicado en el vector de expresión de la planta adecuado puede usarse para transformar las células vegetales. El polipéptido puede aislarse después del callo de la planta o las células transformadas pueden usarse para regenerar las plantas transgénicas . Tales plantas transgénicas pueden recolectarse y los tejidos adecuados (semilla u hojas, por ejemplo) pueden someterse a técnicas de purificación y extracción de proteina a gran escala.
Métodos de transformación de las plantas Se conocen numerosos métodos para introducir genes extraños en las plantas y pueden usarse para insertar un polinucleótido diurno en un huésped vegetal, que incluyen los protocolos biológicos y físicos de transformación de la planta. Ver, por ejemplo, Miki, et al., "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants", en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick and Thompson, eds . , CRC Press, Inc., Boca Ratón, págs . 67-88 (1993). Los métodos escogidos varían con la planta huésped e incluyen métodos de transfección química, tales como fosfato cálcico, transferencia de genes mediada por microorganismos, tales como Agrobacterium (Horsch, et al., Science 227:1229-31 (1985)), electroporación, microinyección y bombardeo biolístico.
Los casetes de expresión y vectores y los métodos de cultivo in vitro para la transformación y regeneración de tejido o célula vegetal de plantas se conocen y se encuentran disponibles. Ver, por ejemplo, Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation" en ETHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, supra, págs. 89-119.
Los polinucleótidos o polipéptidos aislados pueden introducirse en la planta por una o más técnicas usadas, típicamente, para el suministro directo en las células. Tales protocolos pueden variar según el tipo de organismo, célula, planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea que se selecciona para la modificación génica. Los métodos adecuados para transformar las células vegetales incluyen la microinyección (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320-334 y la patente de los EE. UU. núm. 6,300,543), electroporación (Riggs, et al., (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, transferencia directa de genes (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3:2717-2722) y aceleración balística de partículas (véase, por ejemplo, Sanford, et al., patente de los EE. UU. núm. 4,945,050; patente núm. O 91/10725 y McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923-926). Ver, además, Tomes, et al., Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment, págs. 197-213 en Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods eds . Gamborg y Phillips, Springer-Verlag Berlín Heidelberg New York, 1995; patente de los EE. UU. núm. 5,736,369 (meristema) ; Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla) ; Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (frijol de soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); patente núm. WO 91/10725 (maíz); Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833-839 y Gordon-Kamm, et al., (1990) Plant Cell 2:603-618 (maíz); Hooydaas-Van Slogteren y Hooykaas (1984) Nature (Londres) 311:763-764; Bytebier, et al., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet, et al., (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman, et al., págs. 197-209; Longman, NY (polen); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; y Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl.
Genet. 84:560-566 (transformación mediada por triquitas) ; patente de los EE. UU. núm. 5,693,512 (sonicación) ; D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación) ; Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotech. 14:745-750; Transformación del maíz mediada por Agrobacterium (patente de los EE. UU . núm. 5,981,840); métodos con filamentos de carburo de silicio (Frame, et al., (1994) Plant J. 6:941-948); métodos con láser (Guo, et al., (1995) Physiologia Plantarum 93:19-24); métodos de sonicación (Bao, et al., (1997) Ultrasound in Medicine & Biology 23:953-959; Finer and Finer, (2000) Lett Appl Microbiol. 30:406-10; Amoah, et al., (2001) J Exp Bot 52:1135-42); métodos con polietilenglicol (Krens, et al., (1982) Nature 296:72-77); los protoplastos de células monocotiledóneas y dicotiledóneas se pueden transformar mediante electroporación (Fromm, et al., (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:5824-5828) y microinyección (Crossway, et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202:179-185), todos los cuales se incorporan en la presente descripción como referencia.
Transformación mediada por Agrobacterium El método más ampliamente usado para introducir un vector de expresión en las plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrojac erium. A. turnefaciens y A. rhizogenes son bacterias del suelo patogénicas de las plantas, que transforman genéticamente las células vegetales. Los plásmidos Ti y Ri de A. turnefaciens y A. rhizogenes portan, respectivamente, los genes responsables de la transformación genética de plantas. Ver, por ejemplo, Kado, (1991) Crit. Rev. Plant Sci. 10:1. Las descripciones de los sistemas de vectores de Agrobacterium y métodos para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium se proporcionan en Gruber, et al., supra; Miki, et al., más arriba y Moloney, et al., (1989) Plant Cell Reports 8:238.
Igualmente, el gen puede insertarse en la región T-ADN de un plásmido Ti o Ri derivado de A. turnefaciens o A. rhizogenes, respectivamente. Asi, los casetes de expresión pueden construirse como anteriormente, mediante el uso de estos plásmidos. Se conocen muchas secuencias que al acoplarse a una secuencia codificante heteróloga y transformarse en un organismo huésped muestran fidelidad en la expresión del gen con respecto a la especificidad al tejido/órgano de su secuencia codificante original. Ver, por ejemplo, Benfey and Chua, (1989) Science 244:174-81. Las secuencias control particularmente adecuadas para usar en estos plásmidos son promotores para la expresión constitutiva especifica de las hojas del gen en varias plantas objetivo. Otras secuencias control útiles incluyen un promotor y terminador del gen de la nopalina sintasa (NOS) . El promotor y terminador NOS están presentes en el plásmido pARC2, disponible de la Colección estadounidense de cultivos tipo y designados ATCC 67238. Si se usa tal sistema, el gen de la virulencia (vir) de cada plásmido Ti o Ri debe estar presente, además, conjuntamente con la porción T-ADN o a través de un sistema binario en donde el gen vir está presente en un vector separado. Tales sistemas, los vectores para usar en ellos y los métodos para transformar células vegetales se describen en la patente de los EE. UU. núm. 4,658,082; la solicitud de patente de los EE. UU . serie núm. 913,914, presentada el 1.° de octubre de 1986, tal como se hace referencia en la patente de los EE . UU. núm. 5,262, 306, publicada el 16 de noviembre de 1993 y Simpson, et al., (1986) Plant Mol. Biol. 6:403-15 (incluida, además, como referencia en la patente ?306) , todas incorporadas como referencia en su totalidad.
Una vez que se construyen, estos plásmidos pueden colocarse en un A. rhizogenes o A. tumefaciens y estos vectores se usan para transformar las células de las especies de plantas que son, normalmente, susceptibles a la infección por Fusarium o Alternaría. Varias otras plantas transgénicas se contemplan, además, en la presente descripción e incluyen, sin limitarse a, soja, maíz, sorgo, alfalfa, arroz, trébol, col, banana, café, apio, tabaco, caupí, algodón, melón y pimienta. La selección de A. tumefaciens o A. rhizogenes dependerá de la planta que se transforme de ese modo. Generalmente, A. tumefaciens es el organismo preferido para la transformación. La mayoría de las plantas dicotiledóneas, algunas gimnospermas y unas cuantas plantas monocotiledóneas (por ejemplo, ciertos miembros de las Liliales y Arales) son susceptibles a la infección con A. tumefaciens. La A. rhizogenes tiene, además, un amplio intervalo de huéspedes, que abarca la mayoría de las dicotiledóneas y algunas gimnospermas, que incluyen miembros de la Leguminosae, Compositae y Chenopodiaceae. Las plantas monocotiledóneas pueden transformarse actualmente con algún éxito. La solicitud de patente de europea EP núm. 604 662 Al describe un método para transformar monocotiledóneas mediante el uso de Agrobacterium. La solicitud de patente de europea EP núm. 672 752 Al describe un método para transformar monocotiledóneas con Agrobacterium mediante el uso del escutelo de embriones inmaduros. Ishida, et al., discuten un método para transformar el maíz al exponer los embriones inmaduros a A. tumefaciens [Nature Biotechnology 14:745-50 (1996)).
Una vez transformadas, estas células pueden usarse para regenerar plantas transgénicas . Por ejemplo, las plantas completas pueden infectarse con estos vectores mediante heridas en la planta y después por la introducción del vector en el sitio de la herida. Cualquier parte de la planta puede herirse, e incluye hojas, tallos y raices. Alternativamente, el tejido de la planta en forma de un explanto, tales como los tejidos cotiledonares o discos de la hoja, puede inocularse con estos vectores y cultivarse bajo condiciones que estimulen la regeneración de la planta. Las raices o brotes transformados por inoculación del tejido de la planta con A. rhizogenes o A. turnefaciens, que contienen el gen que codifica para la enzima de degradación de fumonisina, puede usarse como una fuente de tejido de la planta para regenerar plantas transgénicas resistentes a la fumonisina, a través de la organogénesis o embriogénesis somática. Ejemplos de tales métodos para regenerar el tejido de la planta se describen en Shahin, Theor. Appl. Genet. 69:235-40 (1985); patente de los Estados Unidos núm. 4,658,082; Simpson, et al., más arriba, y las solicitudes de patente de los EE . UU. serie núm. 913,913 y 913,914, ambas presentadas el 1.° de octubre de 1986, a las que se hace referencia en la patente de los EE. UU. núm. 5,262,306, publicada el 16 de noviembre de 1993, cuyas descripciones completas se incorporan en la presente descripción como referencia.
Transferencia directa de genes ? pesar del hecho de que el intervalo de huéspedes para la transformación mediada por Agrobacterium es amplio, algunas especies principales de cultivo de cereal y gimnospermas se muestran, generalmente, resistentes a este modo de transferencia génica, aunque recientemente se ha alcanzado algún éxito en el arroz (Hiei, et al., (1994) The Plant Journal 6:271-82) . Varios métodos de transformación de la planta, mencionados colectivamente como transferencia directa de genes, se desarrollaron como una alternativa a la transformación mediada por Agrobacterium.
Un método de transformación de la planta generalmente aplicable es la transformación mediada por microproyectiles , en donde el ADN se porta en la superficie de los microproyectiles y mide aproximadamente 1 a 4 µp? El vector de expresión se introduce en los tejidos de la planta con un dispositivo biolistico que acelera los microproyectiles a velocidades de 300 a 600 m/s que es suficiente para penetrar las paredes y membranas de la célula vegetal (Sanford, et al., (1987) Part. Sci. Technol. 5:27; Sanford, (1988) Trends Biotech 6:299; Sanford, (1990) Physiol. Plant 79:206 y Klein, et al., (1992) Biotechnology 10 : 268 ) .
Otro método para el suministro físico de ADN a las plantas es la sonicación de las células objetivo como se describe en Zang, et al., (1991) BioTechnology 9:996. Alternativamente, las fusiones de esferoplasto o liposomas se han usado para introducir vectores de expresión en las plantas. Ver, por ejemplo, Deshayes, et al., (1985) EMBO J. 4:2731 y Christou, et al., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3962. Se ha reportado, además, la captación directa de ADN en los protoplastos mediante el uso de precipitación de CaCl2, alcohol polivinilico, o poli-L-ornitina . Ver, por ejemplo, Hain, et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 199:161 y Draper, et al., (1982) Plant Cell Physiol. 23:451.
La electroporacion de protoplastos y células completas y tejidos también se ha descrito. Ver, por ejemplo, Donn, et al., (1990) en Abstracts of the Vllth Int'l. Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, pág . 53; D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495-505 y Spencer, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 24:51-61.
Aumento de la actividad y/o el nivel de un polipéptido diurno codificado por polinucleótidos diurnos Los métodos se proporcionan para aumentar la actividad y/o el nivel de los polipéptidos diurnos codificados por los polinucleótidos diurnos de la descripción. Un aumento en el nivel y/o la actividad del polipéptido diurno de la descripción se puede lograr al proporcionar a la planta un polipéptido diurno. El polipéptido diurno se puede proporcionar al introducir la secuencia de aminoácidos que codifica al polipéptido diurno en la planta, introducir en la planta una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido diurno o, alternativamente, al modificar un locus genómico que codifica el polipéptido diurno de la descripción.
Como se menciona en otra sección de la presente descripción, muchos métodos se conocen en la técnica para proporcionar un polipéptido a una planta que incluyen, sin limitarse a, la introducción directa del polipéptido en la planta, introducir en la planta (de manera temporal o estable) una construcción de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad reguladora del número celular. Además, se sabe que los métodos de la descripción pueden usar un polinucleótido sin la capacidad de dirigir, en la planta transformada, la expresión de una proteina o un ARN . Por lo tanto, el nivel y/o la actividad de un polipéptido diurno se puede aumentar por medio de la alteración del gen que codifica el polipéptido diurno o su promotor. Ver, por ejemplo, Kmiec, patente de los EE . UU . núm. 5,565,350; Zarling, et al., patente de los Estados Unidos del PCT núm. 93/03868. Por lo tanto, se proporcionan plantas mutagenizadas que presentan mutaciones en los genes diurnos, en donde las mutaciones aumentan la expresión del gen diurno o aumentan la actividad de crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico del polipéptido diurno codificado.
Reducción de la actividad y/o el nivel de un polipéptido diurno Se proporcionan métodos para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido diurno de la descripción mediante la transformación de una célula vegetal con un cásete de expresión, que expresa un polinucleótido que inhibe la expresión del polipéptido diurno. El polinucleótido puede inhibir la expresión del polipéptido diurno directamente al evitar la traducción del ARN mensajero diurno, o bien indirectamente, al codificar un polipéptido que inhibe la transcripción o traducción de un gen diurno que codifica un polipéptido diurno. Los métodos para inhibir o eliminar la expresión de un gen en una planta son muy conocidos en la técnica y cualquiera de estos métodos se puede usar en la presente descripción para inhibir la expresión de un polipéptido diurno.
De conformidad con la presente descripción, la expresión del polipéptido diurno se inhibe si el nivel de proteina del polipéptido diurno es menor que 70 % del nivel de proteina del mismo polipéptido diurno en una planta que no se ha modificado genéticamente o mutagenizado para inhibir la expresión de ese polipéptido diurno. En modalidades particulares de la descripción, el nivel de proteina del polipéptido diurno en una planta modificada de conformidad con la presente descripción es menor que 60 %, menor que 50 %, menor que 40 %, menor que 30 %, menor que 20 %, menor que 10 %, menor que 5 % o menor que 2 % del nivel de proteína del mismo polipéptido diurno en una planta que no es un mutante ni ha sido modificada genéticamente para inhibir la expresión de ese polipéptido diurno. El nivel de expresión del polipéptido diurno se puede medir directamente, por ejemplo, al realizar ensayos para determinar el nivel de polipéptido diurno expresado en la célula vegetal o la planta, o indirectamente, por ejemplo, al medir la actividad de crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico del polipéptido diurno en la célula vegetal o la planta, o al medir la biomasa en la planta. Los métodos para realizar tales ensayos se describen en otra sección de la presente invención.
En otras modalidades de la descripción, la actividad de los polipéptidos diurnos se reduce o se elimina al transformar una célula vegetal con un cásete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que inhibe la actividad de un polipéptido diurno. La actividad de crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico de un polipéptido diurno se inhibe de conformidad con la presente descripción si esta actividad del polipéptido diurno es menor que 70 % respecto de la actividad de crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico del mismo polipéptido diurno en una planta que no ha sido modificada para inhibir la actividad mencionada de dicho polipéptido diurno. En modalidades particulares de la descripción, la actividad de crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico del polipéptido diurno en una planta modificada de conformidad con la presente descripción es menor que 60 %, menor que 50 %, menor que 40 %, menor que 30 %, menor que 20 %, menor que 10 % o menor que 5 % de la actividad de crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico del mismo polipéptido diurno en una planta que no se ha modificado para inhibir la expresión de ese polipéptido diurno. La actividad de crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico de un polipéptido diurno se "elimina" de conformidad con la descripción cuando no es detectable por los métodos de ensayo descritos en otra sección de la presente descripción. Los métodos para determinar la actividad de crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico de un polipéptido diurno se describen en otra sección de la presente descripción.
En otras modalidades, la actividad de un polipéptido diurno se puede reducir o eliminar mediante la alteración del gen que codifica el polipéptido diurno. La descripción abarca plantas mutagenizadas que presentan mutaciones en genes diurnos, en donde las mutaciones reducen la expresión del gen diurno o inhiben la actividad de crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico del polipéptido diurno codificado.
Por lo tanto, muchos métodos se pueden usar para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido diurno. Adicionalmente, se puede usar más de un método para reducir la actividad de un solo polipéptido diurno. Los ejemplos no limitantes de métodos para reducir o eliminar la expresión de los polipéptidos diurnos se presentan a continuación. 1. Métodos a base de polinucleótidos : En algunas modalidades de la presente descripción, una planta se transforma con un cásete de expresión con la capacidad de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de un polipéptido diurno de la descripción. El término "expresión", como se usa en la presente descripción, se refiere a la biosintesis de un producto génico, que incluye la transcripción y/o traducción de dicho producto génico. Por ejemplo, para los propósitos de la presente invención, un cásete de expresión capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de al menos un polipéptido diurno es un cásete de expresión capaz de producir una molécula de ARN que inhibe la transcripción y/o traducción de al menos un polipéptido diurno de la invención. La "expresión" o "producción" de una proteina o polipéptido a partir de una molécula de ADN se refiere a la transcripción y traducción de la secuencia codificante para producir la proteina o polipéptido, mientras que la "expresión" o "producción" de una proteina o polipéptido a partir de una molécula de ARN se refiere a la traducción de la secuencia codificante de ARN para producir la proteina o polipéptido.
Los ejemplos de polinucleótidos que inhiben la expresión de un polipéptido diurno se presentan a continuación . i . Supresión codificante/cosupresión En algunas modalidades de la descripción, la inhibición de la expresión de un polipéptido diurno se puede lograr con la supresión codificante o cosupresión. Para la cosupresión, se designa un cásete de expresión para expresar una molécula de ARN correspondiente a la totalidad o parte de un ARN mensajero que codifica un polipéptido diurno en la orientación "codificante". La sobre expresión de la molécula de ARN puede resultar en una expresión reducida del gen natural. En consecuencia, múltiples lineas de plantas transformadas con el cásete de expresión de cosupresión se analizaron para identificar aquellas que muestran la mayor inhibición de la expresión del polipéptido diurno.
El polinucleótido usado para la cosupresión puede corresponder a la totalidad o parte de la secuencia que codifica el polipéptido diurno, la totalidad o parte de la región 5' y/o 3' no traducida de una transcripción del polipéptido diurno, o la totalidad o parte tanto de la secuencia codificante como de las regiones no traducidas de una transcripción que codifica un polipéptido diurno. En algunas modalidades, en donde el polinucleótido comprende la totalidad o parte de la región codificante para el polipéptido diurno, el cásete de expresión está diseñado para eliminar el codón de inicio del polinucleótido de manera que ningún producto de proteina se traduzca.
La cosupresión se pueden usar para inhibir la expresión de los genes de las plantas para producir plantas que tienen niveles indetectables de proteina para las proteínas codificadas por estos genes. Ver, por ejemplo, Broin, et al., (2002) Plant Cell 14:1417-1432. La cosupresión puede usarse, además, para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Ver, por ejemplo, la patente de los EE . UU . núm. 5, 942, 657. Los métodos para usar la cosupresión para inhibir la expresión de genes endógenos en las plantas se describen en Flavell, et al., (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:3490-3496; Jorgensen, et al., (1996) Plant Mol. Biol. 31:957-973; Johansen y Carrington (2001) Plant Physiol. 126:930-938; Broin, et al., (2002) Plant Cell 14:1417-1432; Stoutj esdij k, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Yu, et al., (2003) Phytochemistry 63:753-763 y las patentes de los EE. UU. núms . 5,034,323, 5,283,184 and 5, 942, 657, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. La eficacia de la cosupresión puede aumentarse al incluir una región poli-dT en el cásete de expresión en una posición 3' a la secuencia codificante y 5' de la señal de poliadenilación . Ver, la publicación de la solicitud de patente de los EE. UU. núm. 2002/0048814, incorporada en la presente descripción como referencia. Típicamente, tal secuencia de nucleótidos tiene la similitud sustancial de secuencias para la secuencia de la transcripción del gen endógeno, óp imamente, mayor que aproximadamente 65 % de identidad de secuencias, de manera más óptima, mayor que aproximadamente 85 % de identidad de secuencias y, más óptimamente, mayor que aproximadamente 95 % de identidad de secuencias. Ver las patentes de los EE. UU. núm. 5,283,184 y 5,034,323, incorporadas en la presente descripción como referencia . ii. Supresión no codificante En algunas modalidades de la descripción, la inhibición de la expresión del polipéptido diurno se puede obtener por supresión no codificante. Para la supresión no codificante, el cásete de expresión se designa para expresar una molécula de ARN complementario a la totalidad o parte de un ARN mensajero que codifica el polipéptido diurno. La sobre expresión de la molécula de ARN no codificante puede resultar en una expresión reducida del gen natural. En consecuencia, ' múltiples líneas de plantas transformadas con el cásete de expresión no codificante se analizaron para identificar aquellas que muestran la mayor inhibición de la expresión del polipéptido diurno.
El polinucleótido a ser usado en la supresión no codificante puede corresponder a la totalidad o parte del complemento de la secuencia que codifica el polipéptido diurno, la totalidad o parte del complemento de la región 5' y/o 3' no traducida de la transcripción diurna, o la totalidad o parte del complemento tanto de la secuencia codificante como de las regiones no traducidas de una transcripción que codifica el polipéptido diurno. Adicionalmente, el polinucleótido no codificante puede ser completamente complementario (es decir, 100 % idéntico al complemento de la secuencia diana) o parcialmente complementario (es decir, menos de 100 % de identidad con el complemento de la secuencia diana) a la secuencia diana. La supresión no codificante se puede usar para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Ver, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm. 5,942, 657. Además, se puede usar porciones de los nucleótidos no codificantes para alterar la expresión del gen objetivo. Generalmente, se puede usar secuencias de por lo menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucléotidos, 300, 400, 450, 500, 550 o más. Los métodos para usar la supresión no codificante para inhibir la expresión de genes endógenos en las plantas se describen, por ejemplo, en Liu, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 y patente de los Estados Unidos núm. 5,759,829 y 5,942,657, que se incorporan en la presente descripción como referencia. La eficacia de la supresión no codificante puede aumentarse al incluir una región poli-dT en el cásete de expresión en una posición 3' a la secuencia no codificante y 5' de la señal de poliadenilación . Ver, la publicación de la solicitud de patente de los EE. UU . núm. 2002/0048814, incorporada en la presente descripción como referencia . iii. Interferencia por ARN bicatenario En algunas modalidades de la descripción, la inhibición de la expresión de un polipéptido diurno se puede obtener mediante interferencia por ARN bicatenario (ARNbc) . Para la interferencia de ARNbc, una molécula de ARN codificante como la descrita anteriormente para la cosupresion y una molécula de ARN no codificante que es completa o parcialmente complementaria a la molécula de ARN codificante se expresan en la misma célula, lo que resulta en la inhibición de la expresión del ARN mensajero endógeno correspondiente .
La expresión de moléculas codificantes y no codificantes puede llevarse a cabo mediante el diseño del cásete de expresión para comprender la secuencia codificante y una secuencia no codificante. Alternativamente, se pueden usar casetes de expresión separados para las secuencias codificantes y no codificantes. Múltiples lineas de plantas transformadas con el cásete o casetes de expresión de interferencia ARNbc se examinaron después para identificar lineas de plantas que muestran la mayor inhibición de la expresión del polipéptido diurno. Los métodos para usar la interferencia de ARNbc para inhibir la expresión de genes endógenos de las plantas se describen en Waterhouse, et al., (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95:13959-13964, Liu, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 y WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631 y O 00/49035, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. iv. Interferencia por ARN en horquilla e interferencia por ARN en horquilla con intrones En algunas modalidades de la descripción, la inhibición de la expresión de un polipéptido diurno se puede obtener mediante interferencia por ARN en horquilla (ARNhp) o interferencia por ARN en horquilla con intrones (ARNhpi) . Estos métodos son muy eficientes para inhibir la expresión de los genes endógenos. Ver, Waterhouse and Helliwell, (2003) Wat. Rev. Genet. 4:29-38 y las referencias mencionadas en la presente descripción.
Para la interferencia ARNhp, el cásete de expresión se designa para expresar una molécula de ARN que híbrida consigo misma para formar una estructura de horquilla que comprende una región lazo de cadena simple y un tallo de base pareada. La región del tallo de base pareada comprende una secuencia codificante que corresponde a todo o parte del ARN mensajero endógeno que codifica el gen cuya expresión se inhibe y una secuencia no codificante completa o parcialmente complementaria a la secuencia codificante. Por lo tanto, la región del tallo de base pareada de la molécula determina, generalmente, la especificidad de la interferencia por ARN. Las moléculas de ARNhp son altamente eficientes para inhibir la expresión de los genes endógenos y la interferencia por ARN que inducen se hereda por generaciones posteriores de las plantas. Ver, por ejemplo, Chuang and eyerowitz , (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutj esdij k, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731 y Waterhouse and Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Los métodos para usar la interferencia del ARNhp para inhibir o silenciar la expresión de genes se describen, por ejemplo, en Chuang and Meyerowitz, (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Waterhouse y Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini, et al., BMC Biotechnology 3:7 y la publicación de solicitud de patente de los EE. UU. núm. 2003/0175965, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. Un ensayo transitorio para la eficacia de las construcciones ARNhp para silenciar la expresión del gen in vivo se describió por Panstruga, et al., (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140, incorporada en la presente descripción como referencia .
Para el ARNhpi, las moléculas interferentes tienen la misma estructura general que para el ARNhp, pero la molécula de ARN comprende, adicionalmente , un intrón capaz de dividirse en la célula en la cual se expresa el ARNhpi. El uso de un intrón minimiza el tamaño del lazo en la molécula de ARN horquilla después de la división, y esto aumenta la eficacia de la interferencia. Ver, por ejemplo, Smith, et al., (2000) Nature 407:319-320. De hecho, Smith, et al., demuestran la supresión del 100 % de la expresión del gen endógeno mediante el uso de la interferencia mediada por ARNhpi. Los métodos para usar la interferencia de ARNhpi para inhibir la expresión de los genes endógenos dé las plantas se describen, por ejemplo, en Smith, et al., (2000) Nature 407:319-320; Wesley, et al., (2001) Plant J. 27:581-590; ang y Waterhouse, (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 5:146-150; Waterhouse y Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell y Waterhouse, (2003) Methods 30:289-295 y la publicación de la solicitud de patente de los EE. UU. núm. 2003/0180945, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia .
El cásete de expresión para la interferencia del ARNhp puede diseñarse, además, para que la secuencia codificante y la secuencia no codificante no correspondan a un ARN endógeno. En esta modalidad, la secuencia codificante y no codificante flanquean una secuencia lazo que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a todo o parte del ARN mensajero endógeno del gen objetivo. Asi, la región lazo es la que determina la especificidad de la interferencia del ARN. Ver, por ejemplo, la patente núm. WO 02/00904, que se incorpora en la presente descripción como referencia. v. Interferencia mediada por amplicones Los casetes de expresión del amplicón comprenden una secuencia derivada de virus de plantas que contiene todo o parte del gen objetivo pero generalmente no todos los genes del virus natural. Las secuencias virales presentes en el producto de transcripción del cásete de expresión permite que el producto de transcripción dirija su propia replicación. Las transcripciones producidas por el amplicón pueden ser codificantes o no codificantes en relación con la secuencia objetivo (es decir, el ARN mensajero para el polipéptido diurno) . Los métodos de usar amplicones para inhibir la expresión de los genes endógenos de las plantas se describen, por ejemplo, en Angelí and Baulcombe, (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angelí and Baulcombe, (1999) Plant J. 20:357-362 y la patente de los Estados Unidos núm. 6, 646, 805, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia . vi. Ribozimas En algunas modalidades, el polinucleótido expresado por el cásete de expresión de la descripción es ARN catalítico o tiene actividad ribozima específica para el ARN mensajero del polipéptido diurno. Por lo tanto, el polinucleótido causa la degradación del ARN mensajero endógeno, lo que resulta en una expresión reducida del polipéptido diurno. Este método se describe, por ejemplo, en la patente de los EE. UU . núm. 4,987,071, incorporada en la presente descripción como referencia . vii. ARN pequeño de interferencia o micro ARN En algunas modalidades de la descripción, la inhibición de la expresión de un polipéptido diurno se puede obtener por interferencia del ARN por expresión de un gen que codifica un micro ARN (miARN) . Los miARN son agentes reguladores que consisten en aproximadamente 22 ribonucleótidos . Los miARN son altamente eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos. Ver, por ejemplo, Javier, et al., (2003) Nature 425:257-263, que se incorpora en la presente descripción como referencia.
Para la interferencia del ARNmi, el cásete de expresión se diseña para expresar una molécula de ARN que se modela en un gen ARNmi endógeno. El gen ARNmi codifica un ARN que forma una estructura de horquilla que contiene una secuencia de 22 nucleótidos que es complementaria con otros genes endógenos (secuencia objetivo) . Para la supresión de la expresión diurna, la secuencia de 22 nucleótidos se selecciona de una secuencia de transcripción diurna y contiene 22 nucleótidos de dicha secuencia diurna de orientación codificante y 21 nucleótidos de una secuencia no codificante correspondiente que es complementaria a la secuencia codificante. Las moléculas de ARNmi son muy eficientes para inhibir la expresión de los genes endógenos, y la interferencia del ARN que inducen se hereda por generaciones de plantas posteriores. 2_. Inhibición a base de polipéptidos de expresión génica En una modalidad, el polinucleótido codifica una proteina con dedos de zinc que se une a un gen que codifica un polipéptido diurno, lo que resulta en la expresión reducida del gen. En modalidades particulares, la proteina con dedos de zinc se une a una región reguladora de un gen diurno. En otras modalidades, la proteina con dedos de zinc se une a un ARN mensajero que codifica un polipéptido diurno y evita su traducción. Los métodos para seleccionar sitios para el mareaje por las proteínas de dedo de cinc se describieron, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. núm. 6, 453, 242, y los métodos para usar las proteínas de dedo de cinc para inhibir la expresión de los genes en las plantas se describen, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los EE. UU. núm. 2003/0037355, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. 3. Inhibición a base de polipéptidos de la actividad proteica En algunas modalidades de la descripción, el polinucleótido codifica un anticuerpo que se une a, al menos, un polipéptido diurno y reduce la actividad del polipéptido diurno. En otra modalidad, la unión del anticuerpo resulta en un aumento del movimiento del anticuerpo-complejo diurno por mecanismos celulares de control de calidad. La expresión de los anticuerpos en las célula vegetales y la inhibición de las rutas moleculares por la expresión y unión de los anticuerpos a las proteínas en las células vegetales se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Conrad and Sonnewald, (2003) Nature Biotech. 21:35-36, incorporada en la presente descripción como referencia . 4_. Interrupción genética En algunas modalidades de la presente descripción, la actividad de un polipéptido diurno se reduce o elimina al alterar el gen que codifica el polipéptido diurno. El gen que codifica al polipéptido diurno se puede alterar mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad, el gen se interrumpe por etiquetado del transposón. En otra modalidad, el gen se altera por la mutagénesis de las plantas con el uso de mutagénesis aleatoria o dirigida y la selección de las plantas que tienen una actividad reguladora del número celular reducida. i . Etiquetado de transposones En una modalidad de la descripción, el etiquetado de transposones se usa para reducir o eliminar la actividad diurna de uno o más polipéptidos diurnos. El etiquetado de transposones comprende insertar un transposón en un gen diurno endógeno para reducir o eliminar la expresión del polipéptido diurno. "Gen diurno" se refiere al gen que codifica un polipéptido diurno de conformidad con la presente descripción.
En esta modalidad, la expresión de uno o más polipéptidos diurnos se reduce o elimina al insertar un transposón dentro de una región reguladora o región codificante del gen que codifica el polipéptido diurno. Un transposón que está dentro de un exón, intrón, secuencia no traducida 5' o 3', un promotor o cualquier otra secuencia reguladora, de un gen diurno se puede usar para reducir o eliminar la expresión y/o actividad del polipéptido diurno codificado.
Los métodos para el etiquetado del transposón de genes específicos en plantas se conoce bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Maes, et al., (1999) Trends Plant Sci. 4:90-96; Dharmapuri y Sonti, (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179:53-59; Meissner, et al., (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat, et al. , (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot, (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 2:103-107; Gai, et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28:94-96; Fitzmaurice, et al., (1999) Genetics 153:1919-1928). Además, el proceso TUSC para seleccionar las inserciones Mu en genes seleccionados ha sido descrito en Bensen, et al., (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena, et al., (1996) Science 274:1537-1540 y la patente de los EE. UU. núm. 5,962,764, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. ii . Plantas imitantes con actividad reducida Los métodos adicionales para reducir o eliminar la expresión de genes endógenos en plantas se conocen, además, en la técnica y pueden aplicarse de la misma manera a la presente descripción. Estos métodos incluyen otras formas de mutagénesis, tales como mutagénesis inducida por etil metanosulfonato, mutagénesis de deleción y mutagénesis por deleción de neutrones rápidos que se usan en un sentido genético inverso (con PCR) para identificar lineas de plantas en las cuales el gen endógeno se eliminó. Para conocer ejemplos de estos métodos, véase Ohshima, et al., (1998) Virology 243:472-481; Okubara, et al., (1994) Genetics 137:867-874 y Quesada, et al., (2000) Genetics 154:421-436, cada una de los cuales se incorpora en la presente descripción como referencia.
Adicionalmente, un método rápido y automatizable de análisis de las mutaciones químicamente inducidas, TILLING (detección de lesiones locales inducidas en genomas) , por medio del uso de HPLC desnaturalizante o por digestión selectiva de endonucleasa de productos PCR seleccionados se aplica, además, a la presente descripción. Ver, McCallum, et al., (2000) Wat. Biotechnol. 18:455-457, incorporada en la presente descripción como referencia .
Las mutaciones que impactan la expresión de los genes o que interfiere con la función de la proteína codificada se conocen bien en la técnica. Las mutaciones insercionales en los exones del gen resultan generalmente en mutantes nulos. Las mutaciones en los residuos conservados son particularmente efectivas para inhibir la actividad reguladora del número celular de la proteína codificada. Se han descrito los residuos conservados de los polipéptidos diurnos de la planta adecuados para la mutagénesis con el objetivo de eliminar la actividad reguladora del número celular. Tales mutantes pueden aislarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos, y las mutaciones en diferentes loci diurnos pueden combinarse por cruzamiento genético. Ver, por ejemplo, Gruis, et ai., (2002) Plant Cell 14:2863-2882.
En otra modalidad de la presente descripción, es posible usar mutantes dominantes para desencadenar el silenciamiento del ARN debido a la inversión y recombinación de genes de un locus del gen duplicado. Ver, por ejemplo, Kusaba, et al., (2003) Plant Cell 15:1455-1467.
La presente descripción abarca métodos adicionales para reducir o eliminar la actividad de uno o más polipéptidos diurnos. Los ejemplos de otros métodos para alterar o mutar una secuencia genómica de nucleótidos en una planta se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el uso de vectores ARN:ADN, vectores de mutación ARN:ADN, vectores reparadores ARN:ADN, oligonucleótidos bicatenarios mezclados, oligonucleótidos de ARNrADN auto-complementarios y oligonucleobases recombinógenas . Esos vectores y los métodos de uso se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. núms. 5,565,350; 5,731,181; 5,756,325; 5,760,012; 5,795,972 y 5, 871, 984, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. Ver, además, las patentes núm. WO 98/49350, WO 99/07865, O 99/25821 y Beetham, et al., (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 96:8774-8778, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. iii. Modulación de la actividad de crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico En métodos específicos, el nivel y/o la actividad del desarrollo de tejido en una planta se incrementa al aumentar el nivel o la actividad del polipéptido diurno en la planta. Los métodos para incrementar el nivel y/o la actividad de los polipéptidos diurnos en una planta se describen en otra sección de la presente descripción. En resumen, tales métodos comprenden proporcionar un polipéptido diurno de la descripción a una planta y, de ese modo, aumentar el nivel y/o la actividad del polipéptido diurno. En otras modalidades, se puede proporcionar una secuencia de nucleótidos diurnos que codifica un polipéptido diurno por medio de la introducción en la planta de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos diurnos de la descripción, la expresión de la secuencia diurna, el incremento de la actividad del polipéptido diurno y, en consecuencia, la reducción del número de células del tejido en la planta o parte de la planta. En otras modalidades, la construcción de nucleótidos diurnos introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.
En otros métodos, la cantidad de células y biomasa del tejido de una planta se incrementa al aumentar el nivel y/o la actividad del polipéptido diurno en la planta. Tales métodos se describen detalladamente en otra sección de la presente descripción. En un método de estas características, se introduce una secuencia de nucleótidos diurnos en la planta y la expresión de dicha secuencia de nucleótidos diurnos reduce la actividad del polipéptido diurno y, en consecuencia, aumenta el crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico en la planta o parte de esta. En otras modalidades, la construcción de nucleótidos diurnos introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.
Como se mencionó anteriormente, un experto reconocerá el promotor adecuado para su uso en la modulación del nivel/la actividad de un polinucléotido y polipéptido de crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico. Los promotores ilustrativos para esta modalidad se describen en otra sección de la presente descripción.
Por lo tanto, la presente descripción proporciona, además, plantas con un crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico modificado en comparación con el crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico de un tejido de una planta control. En una modalidad, la planta de la descripción tiene mayor nivel/actividad del polipéptido diurno de la descripción y, por lo tanto, presenta un mayor crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico en el tejido de la planta. En otras modalidades, el nivel de polipéptido diurno en la planta de la descripción se ha reducido o eliminado y, por lo tanto, presenta un menor crecimiento vegetal y/o desarrollo orgánico en el tejido de la planta. En otras modalidades, tales plantas tienen incorporada de manera estable en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos diurnos de la descripción unidos operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. iv. Modulación del desarrollo radicular Se proporciona los métodos para modular el desarrollo radicular en una planta. "Modulación del desarrollo radicular" se refiere a cualquier alteración en el desarrollo de la raíz de la planta en comparación con una planta control. Esas alteraciones en el desarrollo radicular incluyen, pero no se limitan a, alteraciones en el índice de crecimiento de la raíz primaria, el peso de la raíz fresca, la extensión de la formación lateral y espontánea de la raíz, el sistema de vasculatura, el desarrollo del meristemo o la expansión radial .
Se proporciona los métodos para modular el desarrollo radicular en una planta. Los métodos comprenden modular el nivel y/o la actividad del polipéptido diurno en la planta. En un método, se proporciona una secuencia diurna de la descripción a la planta. En otro método, se proporciona la secuencia de nucleótidos diurna al introducir en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos diurna de la descripción, expresar la secuencia diurna y, asi, modificar el desarrollo radicular. En otros métodos adicionales, la construcción de nucleótidos diurna introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.
En otros métodos, el desarrollo radicular se modula al alterar el nivel o la actividad del polipéptido diurno en la planta. Un incremento en la actividad diurna puede provocar por lo menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo radicular, que incluyen, sin limitarse a, meristemas radiculares más grandes, un aumento en el crecimiento de la raíz, una mejora en la expansión radial, un sistema de vasculatura mejorado, ramificación radicular aumentada, más raices adventicias y/o un incremento en el peso fresco de la raíz en comparación con una planta control.
Como se usa en la presente descripción, "crecimiento de la raíz" abarca todos los aspectos del crecimiento de las diferentes partes que conforman el sistema radicular en diferentes etapas de su desarrollo en las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Se entenderá que el crecimiento mejorado de la raíz puede derivarse del aumento del crecimiento de una o más de sus partes que incluyen la raíz primaria, las raices laterales, las raices espontáneas, etc.
Los métodos de medir esas alteraciones en el desarrollo del sistema radicular se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente de los EE. UU. núm. 2003/0074698 y Werner, et al., (2001) PNAS 18:10487-10492, las que se incorporan en la presente descripción como referencia.
Como se mencionó anteriormente, un experto reconocerá el promotor adecuado para usar para modular el desarrollo radicular en la planta. Los promotores ilustrativos para esta modalidad incluyen los promotores constitutivos y los promotores preferidos de raíz. Los promotores ilustrativos preferidos de raíz se describen en otras partes en la presente descripción .
La estimulación del crecimiento radicular y el incremento de la masa radicular mediante el aumento de la actividad y/o el nivel del polipéptido diurno es útil, además, para mejorar la erectabilidad de una planta. El término "resistencia al encamado" o "crecimiento erguido" se refiere a la capacidad de una planta para fijarse por si misma al suelo. Para las plantas con un patrón de crecimiento erecto o semierecto, este término se refiere, además, a la capacidad para mantener una posición derecha en condiciones (medio ambientales) adversas. Este rasgo se relaciona con el tamaño, profundidad y morfología del sistema radicular. Adicionalmente, la estimulación del crecimiento radicular y el incremento de la masa radicular mediante el incremento del nivel y/o la actividad del polipéptido diurno es útil, además, para estimular la propagación de explantos in vitro.
Además, una producción mayor de biomasa radicular por un nivel y/o una actividad mayor de la actividad diurna tiene un efecto directo en el rendimiento y un efecto indirecto en la producción de compuestos producidos por células radiculares o células radiculares transgénicas o cultivos celulares de esas células radiculares transgénicas. Un ejemplo de un compuesto interesante producido en cultivos celulares es shikonin, cuya producción se puede mejorar favorablemente mediante tales métodos.
Por lo tanto, la presente descripción proporciona, además, plantas con un desarrollo radicular modulado en comparación con el desarrollo radicular de una planta control. En algunas modalidades, la planta de la descripción tiene un nivel/una actividad mayor del polipéptido diurno de la descripción y tiene mayor crecimiento radicular y/o biomasa radicular. En otras modalidades, tales plantas tienen incorporada de manera estable en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos diurnos de la descripción unidos operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. v . Modulación del desarrollo de brotes y hojas Se proporciona, además, métodos para modular el desarrollo de brotes y hojas en una planta. Por "modular el desarrollo de brotes y/u hojas" se entiende cualquier alteración en el desarrollo de brotes y/u hojas de la planta. Esas alteraciones en desarrollo del brote y/o la hoja incluyen, pero no se limitan a, alteraciones en el desarrollo del meristema del brote, en el número de hojas, tamaño de la hoja, vasculatura del tallo y la hoja, longitud del internodo y senescencia de la hoja. Como se usa en la presente descripción, "desarrollo de la hoja" y "desarrollo del brote" abarca todos los aspectos del crecimiento de las diferentes partes que conforman el sistema de las hojas y el sistema de los brotes, respectivamente, en diferentes etapas de su desarrollo, en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los métodos para medir esas alteraciones del desarrollo en el sistema de hojas y brotes se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Werner, et al., (2001) PNAS 98:10487-10492 y la publicación de la solicitud de patente de los EE. UU. núm. 2003/0074698, cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia.
El método para modular el desarrollo de brotes y/u hojas en una planta comprende modular la actividad y/o el nivel de un polipéptido diurno de la descripción. En una modalidad, se proporciona una secuencia diurna de la descripción. En otras modalidades, la secuencia de nucleótidos diurna se puede proporcionar al introducir en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos diurna de la descripción, expresar la secuencia diurna y, de este modo, modificar el desarrollo de brotes y/u hojas. En otras modalidades, la construcción de nucleótidos diurnos introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.
En modalidades especificas, el desarrollo de brotes u hojas se modula al reducir el nivel y/o la actividad del polipéptido diurno en la planta. Una disminución en la actividad diurna puede producir por lo menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo de brotes y/u hojas, que incluyen, sin limitarse a, cantidad reducida de hojas, superficie reducida de hojas, internodos vasculares cortos reducidos y crecimiento impedido y senectud retardada de hojas en comparación con una planta control.
Como se describió anteriormente, una persona experimentada reconocerá el promotor adecuado para usar para modular el desarrollo de brotes y hojas de la planta. Los promotores ilustrativos para esta modalidad incluyen promotores constitutivos, promotores preferidos de raíz, promotores preferidos del meristema de la raíz y promotores preferidos de las hojas. Los promotores ilustrativos se describen en otras partes en la presente descripción.
La disminución de la actividad y/o el nivel diurno en una planta produce internodos más cortos y crecimiento impedido. Por lo tanto, los métodos de la descripción son útiles para producir plantas enanas. Adicionalmente, como se mencionó anteriormente, la modulación de la actividad diurna en la planta modula el crecimiento tanto de la raíz como de los brotes. Por lo tanto, la presente descripción proporciona, además, métodos para alterar la relación raíz/brotes. El desarrollo de brotes u hojas se puede modular, además, al disminuir el nivel y/o la actividad del polipéptido diurno en la planta.
Por lo tanto, la presente descripción proporciona, además, plantas con un desarrollo modulado de brotes y/u hojas en comparación con una planta control. En algunas modalidades, la planta de la descripción tiene mayor nivel/actividad del polipéptido diurno de la descripción al alterar el desarrollo de brotes y/u hojas. Tales alteraciones incluyen, pero no se limitan a, cantidad incrementada de hojas, superficie incrementada de hojas, vascularidad incrementada, internodos más largos y estatura incrementada de las plantas, asi como alteraciones en la senectud de las hojas, en comparación con una planta control. En otras modalidades, la planta de la descripción tiene menor nivel/actividad del polipéptido diurno de la descripción. vi Modulación del desarrollo de tejidos reproductivos Se proporciona métodos para modular desarrollo de tejidos reproductivos. En una modalidad se proporcionan métodos para modular el desarrollo floral en una planta. "Modular el desarrollo floral" hace referencia a cualquier alteración en la estructura del tejido reproductivo de una planta en comparación con una planta control, en donde la actividad o el nivel del polipéptido diurno no se ha modulado. "Modular el desarrollo floral" incluye, además, cualquier alteración en el tiempo de desarrollo del tejido reproductivo de una planta (es decir, una demora o aceleración en el tiempo de desarrollo floral) en comparación con una planta control, en donde la actividad o el nivel del polipéptido diurno no se ha modulado. Las alteraciones macroscópicas pueden incluir cambios en tamaño, forma, número o lugar de los órganos reproductivos, el periodo de tiempo de desarrollo en que se forman estas estructuras o la capacidad para mantener o proceder a través del proceso de floración en momentos de estrés ambiental. Las alteraciones microscópicas pueden incluir cambios en los tipos o formas de las células que conforman los órganos reproductivos.
El método para modular el desarrollo floral en una planta comprende modular la actividad diurna en una planta. En un método, se proporciona una secuencia diurna de la descripción. Una secuencia de nucleótidos diurna se puede proporcionar al introducir en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos diurna de la descripción, expresar la secuencia diurna y, de este modo, modificar el desarrollo floral. En otras modalidades, la construcción de nucleótidos diurnos introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.
En métodos específicos, el desarrollo floral se modula al reducir el nivel o la actividad del polipéptido diurno en la planta. Una reducción en la actividad diurna puede producir por lo menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo floral, que incluyen, sin limitarse a, floración retardada, cantidad reducida de flores, esterilidad parcial de machos y grupo reducido de semillas, en comparación con una planta control. La inducción de la floración retardada o la inhibición de la floración se puede usar para mejorar la producción en los cultivos de forraje, tales como alfalfa. Los métodos para determinar tales alteraciones de desarrollo en el desarrollo floral son muy conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Mouradov, et al., (2002) The Plant Cell S111-S130, que se incorpora en la presente descripción como referencia.
Como se mencionó anteriormente, un experto reconocerá el promotor adecuado para usar para modular el desarrollo floral de la planta. Los promotores ilustrativos para esta modalidad incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores específicos de los brotes y promotores específicos de la inflorescencia.
En otros métodos, el desarrollo floral se modula al aumentar el nivel y/o la actividad de la secuencia diurna de la descripción. Tales métodos pueden comprender introducir una secuencia de nucleótidos diurna en la planta y aumentar la actividad del polipéptido diurno. En otros métodos, la construcción de nucleótidos diurna introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta. El incremento en la expresión de la secuencia diurna de la descripción puede modular el desarrollo floral durante períodos de estrés. Esos métodos se describen en otras partes en la presente descripción. Por lo tanto, la presente descripción proporciona, además, plantas que tienen desarrollo floral modulado en comparación con el desarrollo floral de una planta control. Las composiciones incluyen plantas que tienen mayor nivel/actividad del polipéptido diurno de la descripción y que tienen un desarrollo floral alterado. Las composiciones incluyen, además, plantas que tienen mayor nivel/actividad del polipéptido diurno de la descripción, en donde la planta mantiene o continúa el proceso de floración en tiempos de estrés .
Se proporcionan, además, métodos para usar las secuencias diurnas de la descripción para incrementar el tamaño y/o peso de las semillas. El método comprende incrementar la actividad de las secuencias diurnas en una planta o parte de una planta, tal como la semilla. Un incremento en el tamaño y/o peso de las semillas comprende un tamaño o peso reducido de la semilla y/o un incremento en el tamaño o peso de una o más partes de la semilla que incluyen, por ejemplo, el embrión, endosperma, cáscara, aleurona o cotiledón.
Como se mencionó anteriormente, un experto reconocerá el promotor adecuado para usar para incrementar el tamaño y/o peso de las semillas. Los promotores ilustrativos de esta modalidad incluyen los promotores constitutivos, los promotores inducibles, los promotores preferidos de semilla, los promotores preferidos del embrión y los promotores preferidos de endosperma.
El método para reducir el tamaño y/o peso de las semillas en una planta comprende reducir la actividad diurna en la planta. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos diurna se puede proporcionar al introducir en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos diurna de la descripción, expresar la secuencia diurna y, de este modo, reducir el peso y/o tamaño de las semillas. En otras modalidades, la construcción de nucleótidos diurnos introducida en la planta se incorpora de manera estable en el genoma de la planta.
Se reconoce, además, que el incremento del tamaño y/o peso de las semillas puede estar acompañado, además, por el incremento en la velocidad de crecimiento de las plántulas o un incremento en el vigor temprano. Como se usa en la presente descripción, el término "vigor temprano" se refiere a la capacidad de una planta para crecer rápidamente durante el desarrollo prematuro y se relaciona con el establecimiento exitoso, después de la germinación, de un sistema radicular bien desarrollado y un aparato fotosintético bien desarrollado. Adicionalmente, un incremento en el tamaño y/o peso de las semillas puede producir, además, un incremento en la producción de la planta en comparación con una planta control.
Por lo tanto, la presente descripción proporciona, además, plantas que tienen un mayor peso y/o tamaño de semillas en comparación con una planta control. En otras modalidades se proporciona, además, plantas que tienen mayor vigor y producción de la planta. En algunas modalidades, la planta de la descripción tiene mayor nivel/actividad del polipéptido diurno de la descripción y tiene un mayor peso y/o tamaño de las semillas. En otras modalidades, tales plantas tienen incorporada de manera estable en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos diurnos de la descripción unidos operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. vii. Método de uso para polinucleotidos promotores diurnos Los polinucleotidos que comprenden los promotores diurnos descritos en la presente descripción, asi como variantes y fragmentos de estos, son útiles en la manipulación genética de cualquier célula hospedera, preferentemente, célula vegetal, cuando se ensambla con una construcción de ADN de tal manera que la secuencia promotora esté unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que comprende un polinucleótido de interés. De esta manera, los polinucleotidos promotores diurnos de la descripción se proporcionan en casetes de expresión junto con una secuencia de polinucleotidos de interés para la expresión en la célula hospedera de interés. Como se analiza en la sección Ejemplos de la descripción, las secuencias promotoras diurnas de la descripción se expresan en una variedad de tejidos y, por lo tanto, las secuencias promotoras pueden usarse para regular la expresión temporal y/o espacial de los polinucleotidos de interés .
Las regiones promotoras híbridas sintéticas son muy conocidas en la técnica. Tales regiones comprenden elementos promotores corriente arriba de un polinucleótido unido operativamente al elemento promotor de otro polinucleótido. En una modalidad de la descripción, la expresión de las secuencias heterólogas se controla mediante un promotor híbrido sintético que comprende las secuencias promotoras diurnas de la descripción, o una variante o fragmento de estas, unido operativamente a un elemento o elementos promotores ascendentes a partir de un promotor heterólogo. Los elementos promotores corriente arriba que participan en el sistema de defensa de la planta se han identificado y se pueden usar para generar un promotor sintético. Ver, por ejemplo, Rushton, et al., (1998) Curr. Opin. Plant Biol. 1:311-315. Alternativamente, una secuencia promotora diurna sintética puede comprender duplicados de los elementos promotores ascendentes encontrados dentro de las secuencias promotoras diurnas.
Se reconoce que la secuencia promotora de la descripción puede usarse con sus secuencias codificantes diurnas nativas. Una construcción de ADN que comprende el promotor diurno operativamente unido con su gen diurno nativo puede usarse para transformar cualquier planta de interés para producir el cambio fenotípico deseado, tal como modulación de la cantidad de células, modulación del desarrollo de la raíz, brotes, hojas, desarrollo floral y de embriones, tolerancia al estrés y cualquier otro fenotipo descrito en otra sección de la presente descripción.
Las secuencias promotoras de nucleótidos y los métodos descritos en la presente descripción son útiles para regular la expresión de cualquier secuencia heteróloga de nucleótidos en una planta huésped para variar el fenotipo de una planta. Varios cambios en el fenotipo son de interés e incluyen modificar la composición de ácido graso en una planta, alterar el contenido de aminoácidos de una planta, alterar un mecanismo de defensa contra un patógeno de una planta y similares. Estos resultados pueden lograrse al proporcionar la expresión de productos heterólogos o el aumento de la expresión de productos endógenos en las plantas. Alternativamente, los resultados pueden lograrse al proporcionar una reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, particularmente, enzimas o cofactores en la planta. Estos cambios resultan en un cambio en el fenotipo de la planta transformada.
Los genes de interés son el reflejo de los mercados comerciales y el interés de aquellos involucrados en el desarrollo del cultivo. Los cultivos y mercados de interés cambian y, como las naciones en desarrollo se abren a los mercados mundiales, emergerán también nuevos cultivos y tecnologías. Adicionalraente, ya que el conocimiento de los rasgos y características agronómicas tales como rendimiento y heterosis aumenta, la selección de los genes para la transformación cambiará en correspondencia. Las categorías generales de genes de interés incluyen, por ejemplo, los genes involucrados en la información, tales como dedos de zinc, los involucrados en la comunicación, tales como las quinasas, y los involucrados en todas las células, tales como proteínas de choque térmico. Las categorías más específicas de transgenes, por ejemplo, incluyen genes que codifican rasgos importantes para la agronomía, resistencia a los insectos, resistencia a las enfermedades, resistencia a los herbicidas, esterilidad, características del grano y productos comerciales. Los genes de interés incluyen, generalmente, aquellos involucrados en el metabolismo del aceite, almidón, carbohidratos o nutrientes, así como los que afectan el tamaño del grano, la carga de sacarosa y similares.
En ciertas modalidades, las secuencias de ácidos nucleicos de la presente descripción pueden usarse en conjunto ("agrupadas") con otras secuencias de polinucleótidos de interés para crear plantas con un fenotipo deseado. Las combinaciones generadas pueden incluir múltiples copias de uno cualquiera o más de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de la presente descripción se pueden agrupar con cualquier gen o combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de rasgos deseados, que incluyen, sin limitarse a, rasgos deseables para alimento de animales, tales como genes con alto contenido oleico (por ejemplo, la patente de los EE . UU . núm. 6,232,529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordotioninas (patentes de los EE. UU. núms . 5,990,389; 5,885,801; 5,885,802 y 5,703,409); cebada con alto contenido de lisina ( illiamson, et al., (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106 y O 98/20122) y proteínas con alto contenido de metionina (Pedersen, et al., (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara, et al., (1988) Gene 71:359 y Musumura, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digestibilidad aumentada (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (solicitud de patente de los EE. UU. serie núm. 10/053,410, presentada el 7 de noviembre de 2001) y tiorredoxinas (solicitud de patente de los EE. UU. serie núm. 10/005,429, presentada el 3 de diciembre de 2001)), cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia. Los polinucleotidos de la presente descripción se pueden agrupar, además, con rasgos deseables para la resistencia a insectos, enfermedades o herbicidas (por ejemplo, proteínas tóxicas de Bacíllus thuringiensis (patentes de los EE. UU. núms. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5723,756; 5,593,881; Geiser, et al., (1986) Gene 48:109); lectinas (Van Damme, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); genes de desintoxicación de fumonisinas (patente de los EE. UU. núm. 5,792,931); genes de avirulencia y de resistencia a enfermedades (Jones, et al., (1994) Science 266:789; Martin, et al., (1993) Science 262:1432; Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintasa (ALS) que conducen a resistencia a herbicidas, tales como mutaciones de S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, gen bar) y resistencia al glifosato (gen EPSPS) ) y rasgos deseables para procesamiento o productos de procesamiento, tales como alto oleico (por ejemplo, patente de los EE. UU. núm. 6,232,529); aceites modificados (por ejemplo, genes desaturasa de ácidos grasos (patente de los EE. UU. núm. 5,952,544; la patente núm. WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, pirofosforilasas ADPG (AGPase) , sintasas de almidón (SS) , enzimas de ramificación del almidón (SBE) y enzimas de desramificación del almidón (SDBE) ) y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm. 5,602,321; beta-cetotiolasa, polihidroxibutirata sintasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA)), cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia. Se pueden combinar, además, los polinucleótidos de la presente descripción con polinucleótidos que afectan los rasgos agronómicos, tales como esterilidad de los machos (por ejemplo, véase la patente de los EE. UU . núm 5,583,210), resistencia del tallo, tiempo de floración o rasgos de la tecnología de transformación, tales como regulación del ciclo celular o selección de genes (por ejemplo, las patentes núm. O 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821) cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia.
En una modalidad, las secuencias de interés mejoran el crecimiento de la planta y/o los rendimientos del cultivo. Por ejemplo, las secuencias de interés incluyen genes agronómicamente importantes que resultan en sistemas mejorados de la raíz primaria o lateral. Tales genes incluyen, pero no se limitan a, transportadores de nutrientes/agua e inductores del crecimiento. Los ejemplos de tales genes incluyen, pero no se limitan a, membrana plasmática del maíz H+-ATPasa ( HA2) (Frías, et al., (1996) Plant Cell 8:1533-44); AKT1, un componente del aparato de captación de potasio en Arabidopsis, (Spalding, et al., (1999) J Gen Physiol 113:909-18); genes RML que activan el ciclo de división · celular en las células apicales de la raíz (Cheng, et al., (1995) Plant Physiol 108:881); genes de glutamina sintetasa de maíz (Sukanya, et al., (1994) Plant Mol Biol 26:1935-46) y hemoglobina (Duff, et al., (1997) J. Biol. Chem 27:16749-16752, Arredondo-Peter, et al., (1997) Plant Physiol. 115:1259-1266; Arredondo-Peter, et al., (1997) Plant Physiol 114:493-500 y referencias citadas allí) . La secuencia de interés puede ser útil, además, para expresar las secuencias nucleotídicas no codificantes de genes que afectan negativamente el desarrollo de la raíz.
Los rasgos adicionales agronómicamente importantes, tales como contenido de aceite, almidón y proteina, pueden alterarse genéticamente, adicionalmente, mediante el uso de métodos de cultivo tradicionales. Las modificaciones incluyen aumentar el contenido de ácido oléico, aceites saturados e insaturados, aumentar los niveles de lisina y azufre, proporcionar aminoácidos esenciales y además la modificación del almidón. Las modificaciones a la proteina hordotionina se describen en las patentes de los EE . UU. núm. 5, 703, 049, 5,885,801, 5,885,802 y 5,990,389, incorporadas en la presente descripción como referencia. Otro ejemplo es la proteina de la semilla rica en lisina y/o azufre codificada por la albúmina del frijol de soja 2S descrita en la patente de los Estados Unidos núm. 5,850,016 y el inhibidor de quimotripsina de cebada, descrito en Williamson, et al., (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, cuyas descripciones se incorporan en la presente descripción como referencia.
Los derivados de las secuencias codificantes pueden realizarse por mutagénesis dirigida al sitio para aumentar el nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipéptido codificado. Por ejemplo, el gen que codifica el polipéptido de alto contenido de lisina en cebada (BHL) se deriva del inhibidor de quimotripsina de cebada, solicitud de patente de los EE. UU. núm. de serie 08/740, 682, presentada el 1 de noviembre de 1996 y núm. WO 98/20133, cuya descripción se incorpora en la presente descripción como referencia. Otras proteínas incluyen las proteínas de plantas ricas en metionina, tales como de semilla de girasol (Lilley, et al., (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, ed. Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), págs. 497-502, incorporada en la presente descripción como referencia); maíz (Pedersen, et al., (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara, et al., (1988) Gene 71:359, las cuales se incorporan en la presente descripción como referencia) y arroz (Musumura, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:123, incorporada en la presente descripción como referencia) . Otros genes agronómicamente importantes codifican para el látex, Floury 2, factores de crecimiento, factores de almacenamiento de semilla y factores de transcripción.
Los genes de resistencia a los insectos pueden codificar la resistencia a las plagas que tienen una gran capacidad de adherencia, tales como gusano de la raíz, gusano cortador, taladro europeo del maíz y similares. Tales genes incluyen, por ejemplo, los genes de proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (patentes de los EE. UU . núms . 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881 y Geiser, et al., (1986) Gene 48:109), y similares.
Los genes que codifican los rasgos de resistencia a enfermedades incluyen genes de detoxificación, tales como anti-fumonosina (patente de los EE. UU . núm. 5,792,931); genes de avirulencia (avr) y resistencia a enfermedades (R) (Jones, et al., (1994) Science 266:789; Martin, et al., (1993) Science 262:1432 y indrinos, et al., (1994) Cell 78:1089), y similares .
Los rasgos de resistencia a los herbicidas pueden incluir genes que codifican para la resistencia a los herbicidas que actúan para inhibir la acción de la acetolactato sintasa (ALS) , particularmente los herbicidas tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de la acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a tal resistencia, particularmente las mutaciones S4 y/o Hra) , genes que codifican para la resistencia a los herbicidas que actúan para inhibir la acción de la glutamina sintasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar) u otros genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica para la resistencia al herbicida basta, el gen nptll codifica para la resistencia a los antibióticos canamicina y geneticina y los mutantes del gen ALS codifican para la resistencia al herbicida clorsulfurón .
Los genes de esterilidad pueden codificarse, además, en un cásete de expresión y proporcionan una alternativa al desespigamiento físico. Los ejemplos de genes usados de esa manera incluyen genes preferidos del tejido masculino y genes con fenotipos de esterilidad masculina tales como QM, descritos en la patente de los EE. UU. núm. 5, 583,210. Otros genes incluyen las quinasas y los que codifican compuestos tóxicos para el desarrollo gametofítico masculino o femenino.
La calidad del grano se refleja en rasgos tales como los niveles y tipos de aceites, si son saturados e insaturados, la calidad y cantidad de aminoácidos esenciales y los niveles de celulosa. En el maíz, las proteínas de hordotionina modificadas se describen en la patente de los EE. UU. núm. 5,703,049, 5,885,801, 5,885,802 y 5,990,389.
Los rasgos comerciales pueden codificarse, además, en un gen o genes que pudieran aumentar, por ejemplo, el almidón para la producción de etanol o proporcionar la expresión de proteínas. Otro uso comercial importante de las plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos tales como los descritos en la patente de los EE. UU. núm. 5,602,321. Los genes tales como ß-cetotiolasa, PHBasa (polihidroxiburirato sintasa) y acetoacetil-CoA reductasa (ver, Schubert, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA) .
Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales así como de otras fuentes que incluyen procariotas y otros eucariotas. Tales productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas, y similares. Puede incrementarse el nivel de proteínas, particularmente las proteínas modificadas que tienen una distribución mejorada de aminoácidos para mejorar el valor nutriente de la planta. Esto se logra por la expresión de tales proteínas que tienen un contenido mejorado de aminoácidos. viii. Identificación de elementos de acción cis adicionales Los elementos cis adicionales para los promotores diurnos descritos en la presente descripción se pueden identificar mediante un número de técnicas estándar, que incluyen, por ejemplo, análisis de deleción de nucleótidos, es decir, eliminar uno o más nucleótidos del extremo 5' o en el interior de un promotor y evaluar la actividad reguladora; análisis de proteínas de unión a ADN que usan footprinting de ADNasa I, interferencia por metilación, ensayos de cambio de movilidad electroforética, footprinting genómico in vivo por PCR mediada por ligación, y otros ensayos convencionales, o mediante análisis de similitud de secuencias de ADN con otros motivos de elementos cis conocidos por métodos de comparación de secuencias de ADN convencionales o por métodos estadísticos, tales como el modelo oculto de arkov (HM ) . Los elementos cis se pueden analizar, además, mediante el análisis mutacional de uno o más nucleótidos o mediante otros métodos convencionales. ix. Promotores quiméricos Los promotores quiméricos que combinan uno o más elementos cis son conocidos (véase Venter, et al., (2008), Trends in Plant Science, 12 ( 3) : 118-12 ) . Los promotores quiméricos que contienen elementos cis de los promotores descritos en la presente descripción junto con secuencias flanqueantes se pueden introducir en otros promotores que son, por ejemplo, específicos del tejido. Por ejemplo, un promotor quimérico se puede generar al fusionar un primer fragmento de un promotor que contiene un elemento cis activador (diurno) de un promotor con un segundo fragmento de un promotor que contiene el elemento cis activador (específico del tejido) de otro promotor; el promotor quimérico resultante puede aumentar la expresión génica de la molécula de polinucleótido transcribible unida tanto en forma diurna como específica del tejido. Los elementos reguladores descritos en la presente descripción se usan para modificar promotores quiméricos, por ejemplo, al colocar dicho elemento en dirección ascendente de un promotor mínimo.
La presente descripción puede comprenderse mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Aquellos con experiencia en la técnica apreciarán que se pueden practicar otras modalidades de la descripción sin apartarse del espíritu y alcance de la descripción como se describe y se reivindica en la presente.
Ejemplos Ejemplo 1. Estudios diurnos en maíz Las plantas de maíz (genotipo B73) se cultivaron en condiciones de campo y se tomaron muestras en la etapa reproductiva V14-15. Las condiciones de luz en el muestreo fueron de aproximadamente 14.75 horas de luz solar de conformidad con los registros del Observatorio Naval de los Estados Unidos (Materiales y Métodos) . Al amanecer del día 1, se tomaron muestras de las hojas superiores y las espigas inmaduras en intervalos de 4 horas durante tres días consecutivos. Se realizaron los perfiles de ARN en matrices de maíz Agilent personalizados diseñados para investigar los patrones de expresión génica globales en sondas de cerca de 105K. Se recolectaron las muestras para la plataforma de expresión génica digital (DGE) de Illumina con 3 grupos replicados de 3 plantas cada 4 horas durante un periodo de 1 día. Las tres muestran se dividieron, posteriormente, en tres grupos para el análisis.
Se aplicó la metodología GeneTS a los datos para determinar la periodicidad (Wichert, et al., (2004) Bioinformatics 20:5-20). Primero, este método crea un periodograma para las secuencias de Fourier. Las secuencias de Fourier significativas se evalúan, posteriormente, para determinar su importancia mediante la estadística de G de Fisher. Dado el diseño experimental, este método muestra un mayor poder para detectar la ritmicidad circadiana que otros métodos usados comúnmente (Hughes, et al., (2007) Cold Spring Harb Symp Quant Biol 72:381-386; Hughes, et al., (2009) PLoS Genet 5: el000442). Los valores de significancia de la prueba de G de Fisher se corrigieron luego para realizar múltiples comparaciones de medidas mediante la conversión de los valores q a fin de evaluar las tasas de falso descubrimiento (FDR) (Storey y Tibshirani, (2003) Proc Nati Acad Scí, USA 100:9440- 9445) . Las transcripciones de -regulación diurna se determinaron como aquellas que presentaban una expresión significativa al menos una vez por día y que, además, eran significativas a una tasa FDR del 10 %.
Análisis de micromatrices diurnas de las hojas Los ritmos diurnos de la expresión génica fueron fácilmente detectables dentro del tejido foliar fotosintético. De las 44,187 sondas con expresión detectable, 10,037 o 22.7 % fueron identificadas como cíclicas mediante el algoritmo GeneTS. Esta proporción de transcripciones cíclicas coincide con la proporción que se informó para Arabidopsis (Hazen, et al., (2009) Genome Biol 10: R17). Las transcripciones significativamente cíclicas presentan un período mediano de 24.1 horas, tal como se esperaría en condiciones naturales. La amplitud de las transcripciones cíclicas es robusta, con una relación pico/valle mediana de ~5 veces, en donde muchas de ellas presentan relaciones pico/valle mayores que 20 veces. La expresión máxima para estas transcripciones cíclicas muestra una amplia distribución, con puntos máximos en todas las fases del día .
Análisis de micromatrices diurnas de la espiga En contraste con los resultados de la hoja, muy pocas transcripciones dentro de la espiga en desarrollo mostraron ritmos diurnos. Solo 149 de las 38,445 sondas de transcripción expresadas (1.7 %) se identificaron positivamente como cíclicas. A pesar del número reducido de transcripciones cíclicas, existe un enriquecimiento a comienzos de la tarde, en donde casi la mitad de las transcripciones cíclicas alcanzan su punto máximo en esta fase. De las 149 transcripciones, 100 (67.1 %) fueron también de ciclo diurno en el tejido foliar. Entre aquellas con ciclos tanto en los tejidos de las hojas como de las espigas, las amplitudes de los ritmos están muy reducidas en la espiga en desarrollo. Esta lista se redujo a 45 genes putativos cíclicos de la espiga luego de la consolidación de sondas redundantes y una anotación génica más precisa (Figura 3) . Muchos de estos genes parecían ser homólogos de maíz de los osciladores de Arabidopsis adecuadamente descritos CCA1/LHY, TOC1 , PRR7/3, GI, ZTL {ZEITLUPE, conocida como proteína tipo Adagio 3 en el arroz) . Por lo tanto, el oscilador central del tejido de la espiga de maíz parece estar intacto, aunque desvinculado de la mayoría de los sistemas de salida transcripcional .
Sin embargo, se detectaron unos pocos genes de salida en el conjunto de genes que ciclan en las espigas. La lista de transcripciones cíclicas robustas incluyen hasta 13 transcripciones de recolección diurna de maíz CAB (proteína de unión a clorofila a-b) , que es un subconjunto de la familia génica de CAB de maíz de mayor tamaño. El gen tipo CONSTANS (tipo ZmCO) , asignado al cromosoma 1, presenta ciclos en las espigas y las hojas con un pico de expresión en las primeras horas de la noche (6 p.m.). Sin embargo, es un homólogo de CO diferente que ha sido previamente identificado como conzl en el cromosoma 9 (Miller, et al., (2008) Planta 227:1377-1388). Se detectaron ciclos robustos para el factor de transcripción tipo MYB (ZmMyb.L), con un pico al amanecer (6 a.m.). Este gen es un homólogo de REVEILLE1, un factor de transcripción yb que integra el reloj circadiano y la vía de la auxina en Arabidopsis (Rawat, et al., (2009)). Dos genes específicos de la espiga tienen funciones putativas intrigantes, una proteína con dedos de zinc (ZmZF-5) que alcanza su punto máximo a las 10 a.m. y una proteína cinasa de serina/treonina activada por ácido abscísico/estrés osmótico (ZmSAPK9) con un pico a las 6 p.m. Entre otros genes cíclicos, existen tres transportadores codificantes, dos proteínas de choque de calor, varias enzimas y proteínas hipotéticas.
Análisis digital de la expresión génica Se tomaron muestran independientes específicamente para la plataforma de expresión DGE de Illumina (Illumina, Inc., 9885 Towne Centre Drive, San Diego, CA 92121, USA), las cuales también se analizaron para determinar su ritmicidad. Esto representa el primer esfuerzo de secuenciación profundo al estilo NexGen para determinar los patrones rítmicos de expresión diurna. Tres réplicas de cada uno de seis puntos temporales (ZTO, ZT4 , ZT8, ZT12, ZT16 y ZT20) se secuenciaron fuera de los puntos de anclaje para dos sitios de corte de enzimas de restricción, DPNII y NLAIII. Se analizó cada muestra multiplexada en carriles de flujo de células separados. Las secuencias de salida se evaluaron para determinar la calidad y se las alineó en contraste con Dana Farber Gene Index Maize 19.0 (disponible en Internet en compbio.dfci.harvard.edu/tgi/). Un total de 4.7xl09 pares de bases aprobaron todos los controles de calidad y medidas de alineación de las series de secuenciación, que es de aproximadamente 1.3xl08 bp por carril. Se presentaron etiquetas de más de 1.89xl08 para el análisis de expresión génica del comportamiento rítmico, o casi 5.25 millones de etiquetas por muestra. Se dividieron artificialmente las tres réplicas en tres días consecutivos. Después, se evaluaron los datos para determinar la periodicidad del mismo modo que los datos de micromatrices . Estos datos se usan, principalmente, como una confirmación independiente para aquellas transcripciones cíclicas identificadas mediante la estrategia de micromatrices más sólida en términos estadísticos y, por lo tanto, no se usa en la presente descripción como un experimento de descubrimiento autónomo .
Los resultados muestran una amplia concordancia con el análisis de Agilent. En el tejido foliar, 2559 transcripciones se identificaron como cíclicas. Todos los componentes centrales identificados como cíclicos por Agilent también se determinaron como tales según I Ilumina. Hubo 1378 transcripciones identificadas como cíclicas por ambas tecnologías. Como estas transcripciones fueron detectadas independientemente por cada plataforma de perfiles, estas transcripciones sirven como el conjunto básico más confiable para las transcripciones cíclicas en los tejidos (foliares) fotosintéticos del maíz.
Los perfiles de Illumina de la espiga en desarrollo mostraron más del doble de la cantidad de transcripciones cíclicas que Agilent, en donde 362 mostraron ritmos significativos. No obstante, si bien la cantidad de genes cíclicos en la espiga en desarrollo aumentó, siguió siendo bajo en comparación con el tejido foliar fotosintético . Aunque la concordancia entre estas dos tecnologías distintas fue más baja, aun así se identificaron 48 transcripciones de las espigas como cíclicas en ambas plataformas. De estas 48 transcripciones que presentaron ciclos, 23 fueron identificadas por las tecnologías Agilent e Illumina tanto en los tejidos foliares como de la espiga. De las 25 restantes, 24 se identificaron como cíclicas en tres de cuatro pruebas posibles (hoja en Agilent, hoja en' Illumina, espiga en Agilent y espiga en Illumina) . Estos resultados independientes confirman que el oscilador central está funcionando en el tejido de la espiga.
Análisis de expresión diurna Los perfiles transcripcionales diurnos del maíz son robustos y similares a aquellos de la planta modelo de Arabidopsis en tejidos biológicos y plataformas técnicas independientes. Los resultados del tejido foliar fotosintético receptor de luz identificaron ritmos diurnos para 22.7 % (sondas de 10K/44K) de las transcripciones expresadas con el uso de la tecnología Agilen . Al usar dos plataformas de análisis de todo el transcriptoma independientes, Agilent Microarrays e Illumina Tag Sequencing, se compensan los sesgos inherentes a cada tecnología y se determina un conjunto central mínimo de gran certeza de 1400 transcripciones con regulación diurna.
En la espiga en desarrollo no fotosintética, los ritmos diurnos no contribuyeron significativamente al programa transcripcional . Solo 45 genes se identificaron como cíclicos ya sea en la espiga solamente o tanto en la espiga como en las hojas. Entre ellos, se detectaron 13 CAB (transcripciones de clorofila A/B) , actualmente marcadores bien establecidos de patrones de expresión diurna en plantas (Millar y Kay, (1991) Plant Cell 3:541-550). No obstante, sus amplitudes se vieron muy atenuadas en las espigas en comparación con las hojas. Once ortólogos del sistema oscilador central aparecen en este conjunto de hoja-espiga de tejido cruzado. Por lo tanto, parece que el oscilador central está activo en las espigas. El oscilador central de las plantas se ha descrito como un proceso de tres o cuatro circuitos entrelazados (Harmer, (2009) ; Ueda, (2006) Mol Syst Biol 2:60). Los resultados indican que el circuito de retroalimentación central, que consiste en ZmCCAl/ZmLHY y ZmTOCla,b, se conserva en el maíz. Este circuito muestra ondas de amplitud extremas en el tejido foliar y, posiblemente, actúe como el principal impulsor de la salida transcripcional . En el tejido de la espiga, la amplitud de estas ondas está atenuada, con una reducción del 83 % y 94 %, respectivamente, principalmente por una disminución en los niveles transcripcionales máximos. La altura reducida del patrón de onda del tejido de la espiga apunta fuertemente a ciclos diurnos persistentes pero de menor amplitud. No parece haber una desincronización del patrón diurno que pudiera generar desviaciones en los patrones cíclicos de manera que muten o compliquen el patrón de ondas de pico-valle. Si el circuito ZmCCAl/ZmTOCl actúa como el sincronizador (zeitgeber) central, con su patrón de onda atenuado, su contribución relativa a la señalización de los genes de salida diurnos se vería seriamente reducida. Estos dos circuitos exteriores, que contienen genes tales como ZmPRR73/ZmPRR37, gigzl/gigz2 y ZmZTLa/ZmZTLb, también presentan reducciones significativas en la amplitud de onda.
Una explicación para la desvinculación de la maquinaria central de las vías de salida en las espigas podría atribuirse a la baja intensidad lumínica que penetra en las espigas en desarrollo a través de las cascarillas (brácteas) que envuelven las espigas. El fortalecimiento transcripcional del patrón de expresión diurno puede ocurrir mediante proteínas fotosensibles, tales como fitocromos y criptocromos y, por lo tanto, este fortalecimiento se reducirla, en consecuencia, en las espigas que experimentan una ausencia relativa de luz. Como se muestra en Arabidopsis, los genes reloj del oscilador central, tales como CCA1 y LEY, son activados por luz y median la activación de los genes CAB de salida ( ang, et al., (1997)). La baja amplitud de los osciladores centrales puede, por lo tanto, generar suficientes proteínas para desencadenar la transcripción de las vías de salida o hacerlo débilmente. Pocos genes de salida cuyos promotores pueden ser sensibles a menores niveles de productos osciladores centrales están activados, pero las salidas transcripcionales totales se han desvinculado eficazmente.
En las espigas, existen pocos genes cíclicos que pueden ser nodos traduccionales proximales que conectan el oscilador central con las vias de salida. Uno de ellos es ZmMyb.L, que tiene un pico de expresión a las 6 a.m. en las hojas y las espigas. La proteina ZmMYB.L muestra un alto grado de identidad con el dominio MYB de los genes de la fase matutina CCA/LHY tanto de Arabidopsis como de maiz, que se extienden hasta incluir el motivo de la proteina SHAQKYFF distintivo. ZmMyb.L puede tener la función ortóloga de REVEILLE1 de Arabidopsis, que integra el reloj circadiano con la vía de la auxina (Rawat, (2009)).
El análisis de micromatrices del tejido cultivado de raices y brotes de Arabidopsis ha demostrado que una versión simplificada del oscilador central cicla en el tejido no fotosintético (James, et al., (2008) Science 322:1832-1835). De conformidad con ese estudio de expresión por micromatrices, 6518 transcripciones se identifican como cíclicas en el tejido del brote en comparación con 335 en el tejido radicular. Dichos resultados coinciden ampliamente con los hallazgos descritos en la presente descripción; es decir, en los tejidos mayormente no fotosintéticos, ya sean radiculares o de la espiga, funcionan muchos componentes del oscilador central, pero su salida transcripcional está ampliamente atenuada.
Funciones fisiológicas diurnas Los ritmos diurnos de expresión génica fueron estudiados a fin de comprender mejor el alcance de la biología de regulación diurna a nivel molecular que pudiera conducir a oportunidades de mejoras en el rendimiento de los cultivos. (Figura 5) Estos- resultados revelan muchos aspectos del mecanismo diurno del maíz, desde genes reloj centrales, genes de señalización y genes efectores descendentes. La oscilación diurna en la expresión génica de la hoja de maíz es generalizada, con miles de genes y sus funciones auxiliares que ciclan en una marea diurna. La aparente sucesión de roles fisiológicos durante el transcurso del día es interesante y sugiere un control específicamente escalonado de la expresión, pero también puede tratarse de una progresión natural de los eventos fisiológicos que ocurren en respuesta a eventos proximales y distales en el ritmo diurno. Se reconoce que una mejor resolución del punto temporal producirá más transcripciones de regulación diurna y, además, delineará mejor la sucesión de focos funcionales durante el día. Este estudio de perfiles diurnos de todo el genoma, el primero para el maíz, junto con las asignaciones a más de 1700 términos funcionales, ha relevado un diagrama duradero de la sucesión de los eventos funcionales en el día. Es evidente que los ritmos diurnos son complejos y están profundamente vinculados con la biología de la célula y, probablemente, sean adaptables a tener una expresión coincidente o coordinada de la maquinaria celular.
La presencia del patrón de enriquecimiento funcional bimodal en la mañana y la tarde/noche es interesante y casi seguramente refleje una actividad fundamental en el régimen diario de las plantas. Más genes presentan picos a las 10 a.m. y 6 p.m. y esto causará, en si mismo, que más características funcionales a las que pertenecen estos genes alcancen sus picos en esos momentos, lo que resultará en un patrón funcional bimodal. Aunque los genes de regulación diurna individuales presentan picos en un solo momento durante el día, el hecho de que las categorías funcionales sean bimodales significa que diferentes genes en esos grupos funcionales alcanzan picos en diferentes momentos. Una posible conexión al recientemente descrito "reloj solar" que se calibra al mediodía también se puede considerar actualmente (Yeang, (2009) Bioessays 31:1211-1218). Los picos matutinos y nocturnos podrían significar que existe una comunicación entre los genes de regulación diurna y los genes regulados por el reloj solar.
Los patrones diurnos son fuertes en las hojas, pero más débiles en las espigas en desarrollo. Las espigas en desarrollo son, además, el principal sumidero para los órganos de fuente fotosintética que experimentan los movimientos de las oscilaciones diurnas. Incluso si las espigas inmaduras no tienen en sí mismas un impulso diurno interno marcado, es posible que se reciba de los órganos fuente, como mediante ondas de señales móviles y carbono fijado, para agitar la acción transcripcional diurna de algunos genes desde el exterior. Aun así, esto no parece observarse. Al tener en cuenta los momentos en los cuales los pocos genes de regulación diurna de la espiga alcanzan su punto máximo durante el día, el enriquecimiento funcional sugiere una transducción y transcripción de señal a la mañana, fotosíntesis a la tarde y regulación transcripcional y del oscilador central a la noche.
Los componentes del mecanismo central del reloj y del mecanismo de señalización proximal que se deriva de este se podrían modificar de manera que afecten positivamente el rendimiento del cultivo, por ejemplo, al cambiar o extender la relación entre fuentes y sumideros, tales como las hojas y las espigas. La complementación genética masiva de los patrones diurnos de diferentes fuentes de germoplasma ha demostrado que aumenta los patrones diurnos y la adecuación aparente combinados (Ni, (2009)).
Ejemplo 2. Estructuras genómicas de ZmCCAl y ZmLHY En el transcurso de la elaboración de los modelos génicos del maíz para ZmCCAl y ZmLHY, se determinó que los genes están codificados por regiones génicas de aproximadamente 45 kb y 78 kb, respectivamente (Figura 4). Los genes de maíz de este tamaño son muy poco frecuentes, ya que el tamaño promedio de los genes es de aproximadamente 4 kb (Bruggmann, et al., (2006) Genome Res 16:1241-1251). El modelo de exon-intrón de los genes ZmCCAl y ZmLHY se dedujo a partir del alineamiento de sus secuencias genómicas y de ADNc obtenidas de las secuencias BAC. El gen ZmCCAl está compuesto de 11 exones separados por 10 intrones de diversas longitudes. Los más largos son el intrón núm. 2 (~9 kb) y el intrón núm. 6 (~15.6 kb) , que no se observan comúnmente en el genoma del maíz. El codón de inicio de traducción ATG está ubicado en el exón núm. 5. Esto significa que la UTR 5' no traducida está dividida en 5 exones pequeños, cuyo tamaño varia de 40 a 200 pb. El gen ZmLHY está compuesto de 10 exones separados por 9 intrones de diversas longitudes. (Es posible que uno de los exones pequeños no esté presente en las etiquetas de secuencias expresadas [EST] disponibles). El intrón 2 es de ~30.0 kb y el intrón 6 es de ~20.1 kb y, posiblemente, sean los intrones de mayor tamaño en el genoma del maíz. Se sabe que las secuencias reguladoras que controlan la expresión génica están, frecuentemente, ubicadas en los intrones. Los intrones inusualmente largos pueden desempeñar un rol en la regulación de ZmCCAl y ZmLHY. Tanto los genes ZmCCAl como ZmLHY son sumamente largos. Los genes excepcionalmente largos podrían retardar la transcripción y, así, ser una forma de regulación genómica de la expresión génica. Al igual que ZmCCAl , el codón de inicio de traducción ATG está ubicado en el exón 5. Las estructuras exónicas complejas de las UTR 5' sugieren que la maduración del ARN premensa ero (ARNpre-m) puede ser el otro nivel de regulación de estos genes.
Secuenciación del ADN Se secuenciaron los clones BAC con el uso del enfoque extensivo aleatorio bicatenario (Bodenteich, et al., Shotgun cloning or the strategy of choice to genérate témplate for high-throughput dideoxynucleotide sequencing, en: M.D. Adams, C. Fields, J.C. Venter (Eds.), Automated DNA Sequencing and Analysis, Academic Press, San Diego, 1994, págs. 42-50). En resumen, luego de que los clones BAC se aislaron mediante un protocolo de lisado aclarado de doble acetato, se los fragmentó por nebulización y los fragmentos resultantes fueron reparados en el extremo y subclonados en pBluescript II SK(+). Después de la transformación en células de Escherichia coli electrocompetentes DH-10B (Invitrogen) mediante electroporación, se seleccionaron las colonias con un selector de colonias Q-Bot automático (Genetix) y se las almacenó a -80 °C en un medio de congelación que contenía glicerol al 6 % y 100 pg/ml de ampicilina. Después, se aislaron los plásmidos con el uso del método del kit de amplificación de la plantilla de secuenciación del ADN Templiphi (GE Healthcare) . En resumen, el método Templiphi usa ADN polimerasa del bacteriófago f29 para amplificar el ADN circular monocatenario o bicatenario mediante amplificación isotérmica por circulo rodante (Reagin, et al., (2003) J. Biomol. Techniques 14:143-148). Después, los productos amplificados fueron desnaturalizados a 95 °C durante 10 minutos y secuenciados en el extremo en placas de 384 pocilios, con el uso de oligonucleótidos M13 cebados por vectores y el kit de secuenciación BigDye ABI Prism, versión 3.1. Después de la limpieza a base de etanol, los productos de reacción de secuenciación de ciclo se resolvieron y detectaron con secuenciadores automatizados ABI 3730x1 de Perkin-Elmer , y se ensamblaron las secuencias individuales con el paquete Phred/Phrap/Consed de dominio público (en Internet en: phrap.org/phredphrapconsed.html). Se observó y confirmó el orden de cóntigos con Exgap (A. Hua, University of Oklahoma, comunicación personal). Exgap es una herramienta gráfica local que usa información de lectura de pares para ordenar los cóntigos generados por Phred, Phrap y Consed, y confirmar la precisión del conjunto basado en Phrap. Posteriormente, se cerraron la mayoría de las brechas de secuenciación entre los cóntigos de interés al secuenciar las plantillas de ADN plasmídico previamente amplificados con el método del kit de amplificación Templiphi, en presencia de cebadores de secuenciación de diseño personalizado, y al insertar las secuencias personalizadas resultantes en los conjuntos basados en Phrap originales. Las superposiciones de secuencias con las secuencias de ADN BAC públicas (a saber, ZMMBBc0099Kll (GenBank AC211312.1) y Z MBBc0076L18 (GenBank AC213378.3) de la base de datos de nucleótidos del National Center for Biotechnology Information) también se usaron para confirmar las secuencias de brechas restantes entre los cóntigos de interés .
Ejemplo 3. Promotores de regulación diurna Los ciclos diurnos (dia/luz) de luz y temperatura son factores medioambientales a los que se adaptan todos los organismos vivos. Prácticamente todos los aspectos de la fisiología de las plantas, tal como el crecimiento, el desarrollo, la fotosíntesis y la distribución de fotoasimilados, la respiración, la respuesta al estrés, la respuesta hormonal, y la asimilación de nitrógeno son de regulación diurna.
Los promotores de momentos del día proporcionan las herramientas para manipular el proceso fisiológico o metabólico específico de una manera controlada de conformidad con el patrón diurno natural. Por ejemplo, la subregulación artificial de los genes reloj matutinos CCA1 y LHY durante el día generará la sobreregulacion de los genes que participan en la fotosíntesis y el metabolismo de carbohidratos, lo que aumentará el vigor de crecimiento y el rendimiento. Para lograr la subregulación, los promotores CCA1 y LHY deben impulsar sus propios casetes de expresión de AR i .
Los perfiles de ARN diurnos de todo el genoma proporcionan candidatos para promotores para cada fase del día con alta inducibilidad y baja luminancia de fondo. Según lo que sea necesario, los ejemplos de momentos del día específicos son pulsados (es decir, transcritos solo brevemente una vez al día) , de pico amplio (por ejemplo, transcritos 12 h, no trascritos 12 h) o cualquier punto en medio de estos.
Los genes involucrados en una variedad de rasgos agronómicos tales como, por ejemplo, tolerancia a la congelación, tolerancia al enfriamiento o al frío, tolerancia a la sequía, aumento del rendimiento por metabolismo mejorado son adecuados para la modulación por los elementos reguladores diurnos descritos en la presente descripción. Opcionalmente, estos elementos diurnos se usan en combinación con promotores específicos del tejido para optimizar el patrón de expresión deseado de los genes de interés. Por ejemplo, en una modalidad, los genes que mejoran la tolerancia a la sequía se expresan bajo el control de un elemento regulador diurno que exhibe un patrón de máxima expresión alrededor del mediodía o a últimas horas de la tarde, y en combinación con un elemento promotor específico de la raíz. Además, los genes que mejoran la tolerancia al enfriamiento y la congelación se expresan bajo el control de un elemento regulador diurno que exhibe un patrón de máxima expresión al amanecer o en la noche, y en combinación con un elemento promotor específico de la hoja. Además, los genes que participan en el metabolismo de carbohidratos y en las relaciones de fuente/sumidero durante la fotosíntesis se expresan bajo el control de los elementos promotores diurnos descritos en la presente en combinación con uno o más elementos promotores específicos del tejido. Se conoce que una variedad de genes participan en la tolerancia al estrés abiótico y la eficiencia en el uso de nitrógeno (véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente de los EE . UU . núms . 2010/0223695; 2010/0313304; 2010/0269218). Como se muestra en la Figura 5, los genes que pertenecen a diversas categorías funcionales muestran diferentes patrones de expresión diurna. Por ejemplo, la respuesta al estrés salino GO: 0009651 alcanza su punto máximo a media mañana, mientras que el transporte de carbohidratos GO: 0008643 alcanza su punto máximo a la noche.
Los genes que son corregulados de vias relacionadas con aquellos de regulación diurna también están dentro del alcance de esta descripción. La expresión de esos miembros de vias relacionadas se manipula para regularse mejor mediante el uso de uno o más de los elementos reguladores diurnos descritos en la presente descripción.
Procesos de análisis de motivos de promotores Se ha demostrado en la bibliografía que la combinación de solo unos pocos motivos, mediante interferencia constructiva o destructiva, puede producir formas de onda que alcanzan sus picos en cualquier cambio de fase, (tales como CBE: ang, et al., (1997) Plant Cell 9:491-507 y EE : Alabadi, et al., (2001) Science 293:880-883. No obstante, la medida del número de esos elementos controladores y su conservación en las especies vegetales no se ha abordado adecuadamente. Los promotores de los 144 genes de maíz se agruparon por tiempo Zeitgeber, el momento de su expresión máxima, en donde ZT0 = 6 a.m., ZT4 = 10 a.m"., ZT8 = 2 p.m., ZT12 = 6 p.m., ZT16 = 10 p.m. y ZT20 = 2 a.m. Cada grupo de promotores se analizó para determinar la existencia de motivos identificados en las especies distantes de Arabidopsis Thaliana. Los motivos fueron "CBE", "EE", "O-G-box", "Morning Element", "SORLIP1", "Refined Morning Consesnus", "Evening GATA", "Telo Box", "Starch Box" y "Protein Box". Estos motivos se identificaron mediante búsqueda bibliográfica, e incluyen motivos que han sido identificados para expresión matutina, vespertina y nocturna. Se examinaron los promotores en busca de coincidencias exactas de los motivos tanto en orientación directa como inversa dentro de 2000 pb del sitio de inicio de la transcripción (TSS) .
Tabla 2 Los motivos circadianos se obtuvieron de una búsqueda bibliográfica extensiva, que incluyó: CBE: Carré y Kay, (1995) Plant Cell 7 2039-2051. EE: Harmer y Kay, (2005) Plant Cell 17 1926-1940.
G-BOX, TELO, STARCH, PROTEIN y GATA: Michael, et al., (2008). PLoS Genet . 4el4. SORLIP y Refined Morning Consensus : Hudson y Quail, (2003) Plant Physiol. 133 1605-1616. Morning Element: Harmer y Kay, (2005) Plant Cell 17 1926-1940.
Los modelos ocultos de arkov (HMM) se construyeron para los motivos EE y CBE de varios genes que contenían los motivos con ciclos significativos y en la misma fase adecuada que su ortólogo de Arabidopsis. Estos HMM no mostraron preferencia por ninguna base circundante, por lo tanto, se usaron los motivos centrales exactos para el análisis adicional. Las coincidencias exactas tanto para el motivo como el complemento inverso se extrajeron de secuencias en donde estaban presentes. Tanto el número de genes como la suma total de motivos encontrados se compararon con una probabilidad aleatoria y con el resto del conjunto para buscar el enriquecimiento .
Resultados del análisis de motivos El "motivo CBE", un motivo de 8 pb conocido, además, como el elemento de unión CCA1, debe aparecer al azar 13 veces en un conjunto del tamaño del análisis actual; el motivo CBE exacto fue encontrado 40 veces en los 144 promotores. El CBE estaba enriquecido en los genes encontrados durante las horas de luz diurna, que sigue el patrón de expresión del ortólogo de maíz de Arabidopsis thaliana CCA1 (incluido en esta descripción) .
El "motivo EE", un motivo de 8 pb conocido, además, como el elemento vespertino (Evening Element), debe aparecer al azar 13 veces en un conjunto del tamaño del análisis actual; el motivo EE exacto fue encontrado 34 veces en los 144 promotores. Además, la prevalencia del motivo se concentró en aquellos promotores que correspondían a los genes con picos vespertinos y nocturnos, con >40 % de los motivos en los promotores del grupo ZT12 y >70 % de los casos entre las 6 p.m.-2 a.m. Entre los genes con la máxima expresión a ZT12, los genes 12/23 contenían al menos un EE.
El "O-G-Box" ha sido identificado como un motivo de impulso matutino y los datos en la presente muestran que el 50 % de todos los motivos O-G-Box encontrados fueron para el primer punto temporal después de la aparición de la luz, ZT4. Otros elementos matutinos, "Morning Element", "SORLIP1" y "Refined Morning Element", mostraron patrones similares, con un enriquecimiento máximo en los puntos temporales , inmediatamente posteriores a la aparición de la luz (28 %, 33 % y 31 %, respectivamente) , consistente con la teoría de que estos promotores son impulsados por la luz. Además, coincide con el hecho de que, debido al período diurno largo en el que se cultivaron las plantas para generar los datos iniciales, la presencia de estos promotores se selecciona en función de los dos puntos temporales de verdadera oscuridad, ZT16 y ZT20.
Los motivos "Evening GATA", "Telo Box", "Starch Box" y "Protein Box" se han identificado como motivos vespertinos a nocturnos tardíos. En este caso, hay un subenriquecimiento de estos motivos en esos puntos temporales definidos como de mediodía, cuando la luz es más brillante. El espectro relativamente amplio de estos elementos en todos los puntos vespertinos y nocturnos es consistente con la teoría de múltiples motivos que se combinan para producir las diferentes fases de la máxima expresión.
Es importante destacar que muchos de los 144 promotores identificados tenían más de un motivo, que el número mediano de motivos encontrados por promotor fue de 4, y que el número máximo de motivos encontrados fue de 12. Doce de los promotores no contienen ninguno de los motivos, que abarcan cada punto temporal. En el conjunto con el pico a ZT12, que incluye el motivo EE de alta prevalencia, los genes 11/23 no contenían EE canónicos y, como se mencionó anteriormente, varios no contenían ningún motivo conocido, lo que indica que otros factores y motivos están en juego y causan las formas de onda de alta amplitud observadas, las cuales, sin embargo, pueden estar incluidas en las secuencias promotoras descritas en la presente.
Análisis de expresión del promotor Preparación de la plántula Las semillas GS3 se esterilizaron y prepararon para la germinación mediante lavado con 70 % de etanol durante cinco minutos, seguido de un lavado de 15 minutos en una solución de blanqueador al 50 % con dos gotas de Tween® 20. Después, se realizaron tres lavados en agua estéril durante 5, 15 y 5 minutos. Las semillas se lavaron, posteriormente, en peróxido de hidrógeno al 30 % durante 5 minutos y, después, 3 veces con agua estéril. Se dejaron las semillas en remojo en agua estéril durante 5 horas.
El papel de germinación estéril se humedeció con 15 mi de agua estéril y se lo colocó en bandejas estériles Q. Se colocaron dieciséis semillas por bandeja a intervalos regulares y se las cubrió con otro papel de germinación estéril, que luego se humedeció con 9 mi de agua estéril. La bandeja Q se selló con cinta Austraseal, y se colocó en una cámara de crecimiento con luz a 22 °C, y se dejó crecer durante 3 días.
Se extrajo el material de pericarpio que cubre la semilla en desarrollo y se colocaron las semillas germinadas, 2 por placa, en un medio que contenia 4.3 % de sales básales MS, 0.1 % de mioinositol, 0.5 % de solución madre de vitaminas MS y 40 % de sacarosa, a un pH de 5.6.
Preparación de la hoja y bombardeo Se aislaron secciones transversales de 2.54 era (una pulgada) de ancho de las hojas más jóvenes (que habían emergido parcialmente) de una plántula GS3 de 2 ½ a 3 semanas de maduración y se las colocó en un mediopara bombardeo, que contenía 4.3 % de sales básales MS, 0.1 % de mioinositol, 0.5 % de solución madre de vitaminas MS y 40 % de sacarosa, a un pH de 5.6.
Preparación de embriones Los embriones de maíz inmaduro de las plantas donantes de invernadero se bombardean con un plásmido que contiene el gen GUS operativamente unido a un promotor de prueba. La transformación se realiza de la siguiente manera.
Las espigas de maiz GS3 se cosechan 8-14 días después de la polinización y se esterilizan superficialmente en 30 % de blanqueador Chlorox® más 0.5 % de detergente Micro durante 20 minutos y, después, se enjuagan dos veces con agua estéril. Se extirpan los embriones inmaduros y se colocan con el eje del embrión hacia abajo (escutelo hacia arriba) , 25 embriones por placa. Estos se cultivan en un medio 560L durante 4 días antes del bombardeo en la oscuridad. El medio 560L es un medio basado en N6 que contiene vitaminas de Eriksson, tiamina, sacarosa, 2.4-D y nitrato de plata. El dia del bombardeo, los embriones se transfieren a un medio 560Y durante 4 horas y se los coloca en una zona objetivo de 2.5 cm. El medio 560Y es un medio osmótico alto (560L con una alta concentración de sacarosa). Después del bombardeo, se mantienen los embriones en el medio 560Y, un medio basado en N6, durante 1 dia, y luego se los tiñe para la expresión de GUS.
Bombardeo Las mezclas de ADN/partículas doradas se prepararon para el bombardeo según el siguiente método: se lavaron previamente 60 mg de partículas doradas de 0.6 - 1.0 mieras con etanol, se enjuagaron con H20 destilada estéril y se resuspendieron en un total de 1 ral de H20 estéril. Se precipitó el ADN hacia la superficie de las partículas doradas mediante la sonicación de 25 µ? de partículas doradas de 0.6 µ? y la adición en 20 µ? del plásmido de la prueba a 100 ng/µ?. Se sonificó esta mezcla una vez más y se añadieron 2.5 µ? de TFX. Se colocó esa solución en un agitador tipo vórtice durante 10 minutos a un parámetro bajo. Después, se centrifugó la solución durante 1 minuto a 10K RPM, y se extrajo el líquido del tubo. Se añadió 60 µ? de etanol y, posteriormente, se sonificó la solución una vez más. Después, se colocaron 10 µ? de la mezcla de ADN/particulas doradas en cada macroportador y se la dejó secar antes del bombardeo.
Se bombardearon las semillas con el uso de la pistola PDS-1000/He a 7.58 MPa (1100 psi) para el tejido foliar y de la semilla, y 3.10 MPa (450 psi) para los embriones, en 91.4-94.8 kPa (27-28 pulgadas de Hg) de vacío. La distancia entre el macroportador y la pantalla de detención era de entre 6 y 8 cm. Se incubaron las placas en recipientes sellados durante 18-24 horas a 27-28 °C luego del bombardeo. Se incubaron dos placas de cada construcción en la oscuridad, mientras que dos placas se incubaron bajo la luz.
Los tejidos bombardeados se evaluaron para la expresión transitoria de GUS al introducir las semillas en el amortiguador de prueba GUS, que contenía 100 mM de NaH2P04-H20 (pH 7.0), 10 mM de EDTA, 0.5 mM de K4Fe (CN) 6-3H20, 0.1 % de Tritón X-100 y 2 mM de 5-bromo-4-cloro-3-indoil glucurónido. Se incubaron los tejidos en la oscuridad durante 24 horas a 37 °C. Al reemplazar la solución de tinción de GUS con etanol al 70 %, se detuvo el ensayo. La expresión/tinción de GUS se visualizó con un miscroscopio .
Transformación de BMS Las células de BMS (maíz dulce mexicano negro) se cultivaron en matraces de 250 mi que contenían 40 mi del medio núm. 237 (4.3 % de sales básales MS, 0.1 % de mioinositol, 0.5 % de solución madre de vitaminas MS, 0.002 % de 2.4-D y 40 % de sacarosa, a un pH de 5.6) en la oscuridad a 28 °C, y se las agitó a -150 RPM durante 3 días. En ese momento, se añadieron 25 mi del medio líquido núm. 237 y se dejó crecer el cultivo durante otros 3 días, momento en el cual podía producirse la agro-transformación. Un día antes, los cultivos de Agrohacterium que contenían un plásmido que contenía un gen GUS operativamente unido a un promotor de prueba se colocaron en un cultivo de 10 mi que contenía el antibiótico adecuado y se los dejó crecer a 28 °C durante una noche.
Cada matraz de 250 mi se colocó en la cabina de flujo laminar durante 10 minutos para permitir que las células se asienten. Se eliminaron 20 mi del sobrenadante. La mezcla restante se trasladó a un tubo de 50 mi y se la centrifugó a 3200 RPM durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se reemplazó con 40 mi del medio liquido 561Q. 561Q es un medio basado en N6 al 4 % que contiene vitaminas de Eriksson (IX), 0.005 % de tiamina, 68.5 % de sacarosa, 0.0015 % de 2.4-D, 0.69 % de L-Prolina y 36 % de glucosa, a un pH de 5.2. Se centrifugaron nuevamente las células a 3200 RPM durante 5 minutos. Se volvieron a suspender las células a un volumen final de 15 mi en 561Q y se dividieron en alícuotas de 7.5 mi en matraces de 125 mi.
El agro-cultivo se centrifugó, posteriormente, a 3200 RPM durante 5 minutos, se extrajo el sobrenadante mediante vertido, y se resuspendieron las microesferas en 2 mi de 561Q + acetosiringona (AS) . La solución de acetosiringona se preparó al elaborar una solución de 100 mM en DMSO. Se añadió esta solución en 561Q a 1 ul de A.S./l mi de núm. 561Q. Se midió la capacidad de absorción a OD 550 para determinar la concentración de células para usar para la transformación. A una OD 550 de 0.75, 1 mi de la agro-solución se añadió a 5 mi de 561Q + AS, y se cocultivó con los 7.5 mi de células de BMS durante 3 horas en la oscuridad a 28 °C mientras se agitaba a 150 RPM.
Después de la incubación de 3 horas, se añadió más medio 561Q en los 13.5 mi de cultivo para aumentar el volumen a -48 mi en un tubo de 50 mi. Se aplicó 12 mi de cultivo en un disco de filtro estéril y, después, se lo colocó en una placa del medio 562U en la oscuridad a 28 °C durante 4 días. 562U es un medio basado en ?ß al 4 % que contiene las vitaminas de Eriksson (IX), 0.005 % de tiamina, 30 % de sacarosa, 0.002 % de 2.4-D y 0.69 % L-Prolina, a un pH de 5.8. Los filtros se trasladaron, después, a placas 563N y se colocaron en la oscuridad a 28 °C durante otros 2 días. 563N es un medio basado en N6 al 4 % que contiene vitaminas de Eriksson (IX), 0.005 % de tiamina, 30 % de sacarosa, 0.0015 % de 2.4-D, 0.69 % de L-Prolina y 0.5 % de amortiguador MES a un pH de 5.8.
Se crearon cuatro placas para cada construcción de prueba. Se extrajeron dos placas de BMS de cada una de la oscuridad y se tiñieron para determinar GUS, mientras que las otras dos se colocaron a la luz durante 5 horas antes de teñirlas para GUS. Las células de BMS fueron extraídas del filtro mediante raspado y se introdujeron en un nuevo tubo. Después, se evaluó su expresión transitoria de GUS al introducir las células en el amortiguador del ensayo GUS que contenía 100 mM de NaH2P04-H20 (pH 7.0), 10 mM de EDTA, 0.5 inM de K4Fe (CN) 6-3H20, 0.1 % de Tritón X-100 y 2 mM de 5-bromo-4-cloro-3-indoil glucurónido. Se incubaron los tejidos en la oscuridad durante 24 horas a 37 °C. Al reemplazar la solución de tinción de GUS con etanol al 70 %, se detuvo el ensayo. La expresión/tinción de GUS se visualizó con un miscroscopio .
Resultados de la expresión de promotores representativos Zm-SARK PRO (PC0646468) Se detectó expresión con la construcción ZM-SARK PRO, en el bombardeo de semillas en germinación, pero no en el bombardeo de la hoja o los embriones ni en las transformaciones de BMS .
Zm-CCA PRO (PCQ651594) Se detectó expresión con la construcción ZM-CCA PRO en cada tipo de tejido que se sometió a prueba.
ZM-LHY PR0:ADH1 INTRON (PC0639678) Se detectó expresión con la construcción ZM-LHY PRO, en el bombardeo de embriones, pero no en el bombardeo de la hoja o la semilla ni en las transformaciones de BMS.
ZM-LHY PRO (ALT1) (PC0639678) Se detectó expresión con la construcción ZM-LHY PRO(ALTl), en todos los experimentos de bombardeo, pero no en las transformaciones de BMS.
Z -NIGHT2 PRO (PCQ643174) Se detectó expresión con la construcción ZM-NIGHT2 PRO, en el bombardeo de embriones y hojas, pero no en el bombardeo de embriones ni en las transformaciones de BMS .
Z -NIGHT1 PRO (PCO503721) No se encontró expresión detectable con la construcción Z -NIGHTl PRO en el tejido sometido a prueba. Es posible que el patrón de expresión, al ser diurno, no haya sido captado en las condiciones de la prueba.
ZM-LICH2 PRO (PC0642613) Se detectó expresión con la construcción Z -LICH2 PRO en cada tejido que se sometió a prueba.
Ejemplo 4. Transformación y regeneración de plantas transgénicas Los embriones inmaduros de maíz de las plantas donantes de invernadero se bombardean con un plásmido que contiene la secuencia de transformación unido operativamente al promotor inducible por sequia RABI7 (Vilardell, et al., (1990) Plant Mol Biol 14:423-432) y el gen marcador seleccionable PAT, que confiere resistencia al herbicida bialafos. Alternativamente, el gen marcador seleccionable se proporciona en un plásraido separado. La transformación se realiza de la siguiente manera. Las recetas de los medios siguen a continuación.
Preparación del tejido objetivo: Las espigas se descascaran y la superficie se esteriliza en blanqueador Clorox® al 30 % más detergente Micro al 0.5 % durante 20 minutos y se enjuagan dos veces con agua esterilizada. Los embriones inmaduros se extirpan y se colocan con el eje del embrión hacia abajo (escutelo hacia arriba) , 25 embriones por placa, en medio 560Y durante 4 horas y, después, se alinean dentro de la zona objetivo de 2.5 cm en preparación para el bombardeo.
Preparación de ADN: Se elabora un vector plasmidico que comprende la secuencia de transformación operativamente unida a un promotor de ubiquitina. Este ADN de plásmidos más el ADN de plásmidos que contiene un marcador de selección PAT se precipita en microesferas de tungsteno de 1.1 pm (diámetro promedio) con el uso de un procedimiento de precipitación con CaCl2 de la siguiente manera : 100 µ? de partículas de tungsteno preparadas en agua 10 µ? (1 q) de ADN en amortiguador Tris EDTA (1 g de ADN total) 100 µ? de CaCl2 2.5 M 10 µ? de espermidina 0.1 M Cada reactivo se añade de forma secuencial en la suspensión de partículas de tungsteno, mientras se mantiene en el agitador vibrador de tubos. La mezcla final se sometió brevemente a ultrasonido y se dejó incubar con agitación constante durante 10 minutos. Después del período de precipitación, los tubos se centrifugaron brevemente, se eliminó el líquido y se lavaron con 500 mi de etanol al 100 % y se centrifugaron durante 30 segundos. El líquido se eliminó otra vez y se agregó 105 µ? de etanol al 100 % a la microesfera de partículas de tungsteno final. Para el bombardeo de partículas, las partículas de tungsteno/ADN se someten brevemente a ultrasonido y se motean 10 µ? en el centro de cada macroportador y se dejan secar aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo.
Tratamiento de pistola de partículas: Las placas de muestras se bombardean en el nivel núm. 4 en la pistola de partículas núm. HE34-1 o núm. HE34-2.
Todas las muestras reciben un solo disparo a 4.48 MPa (650 PSI) con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de las partículas/ADN que se preparó.
Tratamiento posterior: Después del bombardeo, los embriones se mantienen en medio 560Y durante 2 días, después, se transfieren a un medio de selección 560R que contiene 3 mg/litro de Bialaphos y se subcultivan cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones callosos resistentes a la selección se trasladan a un medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración de los embriones somáticos (2-4 semanas) , los embriones somáticos bien desarrollados se trasladan a un medio para germinación y se colocan en el cuarto de cultivo iluminado. Aproximadamente 7-10 días después, las plántulas en desarrollo se colocan en un medio 272V libre de hormonas en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas están bien establecidas. Después, las plantas se trasladan a insertos en recipientes (equivalentes a macetas de 6.4 cm (2.5")) que contienen tierra de abono y se cultivan durante 1 semana en una cámara de crecimiento, posteriormente, se cultivan de 1-2 semanas más en el invernadero, después, se trasladan a 600 macetas clásicas (6.1 1 (1.6 galones)) y se cultivan hasta la madurez. Las plantas se monitorean y se califican según el incremento de la tolerancia a la sequía. Los ensayos para determinar la mejora en la tolerancia a la sequía son rutinarios en la técnica e incluyen, por ejemplo, producciones con una capacidad incrementada de granos-espigas en condiciones de sequía en comparación con las plantas control de maíz en condiciones ambientales idénticas. Alternativamente, las plantas transformadas pueden monitorearse para detectar una modulación en el desarrollo del meristemo (es decir, una reducción en la formación de espiguillas en la mazorca). Ver, por ejemplo, Bruce, et al., (2002) Journal of Experimental Botany 53:1-13.
Bombardeo y medios de cultivo: El medio de bombardeo (560Y) comprende 4.0 g/1 de sales básales N6 (SIGMA C-1416) , 1.0 ml/1 de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0.5 mg/1 de HC1 de tiamina, 120.0 g/1 de sacarosa, 1.0 mg/1 de 2.4-D y 2.88 g/1 de L-prolina (hasta un volumen con D-I H20, seguido del ajuste a un pH de 5.8 con KOH) ; 2.0 g/1 de Gelrite® (que se añadió después de llevar a volumen con D-I H20) y 8.5 mg/1 de nitrato de plata (que se añadió después de esterilizar el medio y enfriar hasta alcanzar temperatura ambiente). El medio de selección (560R) comprende 4.0 g/1 de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1.0 ml/1 de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0.5 mg/1 de HC1 de tiamina, 30.0 g/1 de sacarosa y 2.0 mg/1 de 2.4-D (llevado a volumen con D-I ¾0 seguido del ajuste a un pH de 5.8 con KOH) ; 3.0 g/1 de Gelrite® (que se añadió después de llevar a volumen con D-I H20) y 0.85 mg/1 de nitrato de plata y 3.0 mg/1 de bialafos (ambos añadidos después de esterilizar el medio y enfriar hasta alcanzar temperatura ambiente) .
El medio de regeneración de plantas (288J) comprende 4.3 g/1 de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/1 de solución de vitaminas MS (0.100 g de ácido nicotinico, 0.02 g/1 de HC1 de tiamina, 0.10 g/1 de HCL de piridoxina y 0.40 g/1 de glicina que se llevó a volumen con D-I H20 pulido) (Murashige and Skoog, (1962) Physiol. Plant . 15:473), 100 mg/1 de mio-inositol, 0.5 mg/1 de zeatina, 60 g/1 de sacarosa y 1.0 ml/1 de ácido abscisico 0.1 mM (que se llevó a volumen con D-I H20 pulido después de ajustar hasta un pH de 5.6); 3.0 g/1 de Gelrite® (que se agregó después de llevar a volumen con D-I H20) y 1.0 mg/1 de ácido indolacético y 3.0 mg/1 de bialafos (añadidos después de esterilizar el medio y enfriar a 60 °C) . El medio libre de hormonas (272V) comprende 4.3 g/1 de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 ml/1 de solución de vitaminas MS (0.100 g/1 de ácido nicotinico, 0.02 g/1 de HC1 de tiamina, 0.10 g/1 de HCL de piridoxina y 0.40 g/1 de glicina que se llevó a volumen con D-I H20 pulido), 0.1 g/1 de mio-inositol y 40.0 g/1 de sacarosa (que se llevó a volumen con D-I H20 pulido después de ajustar el pH a 5.6) y 6 g/1 de agar bacto™ (que se agregó después de llevar a volumen con D-I H20 pulido) , esterilizado y enfriado hasta 60 °C.
Ejemplo 5. Transformación mediada por Agrobacterium Para la transformación mediada por Agrobacterium del maíz con una secuencia no codificante de la secuencia de transformación de la presente descripción se usa, preferentemente, el método de Zhao (la patente de los EE. UU. núm. 5,981,840 y publicación de patente de PCT núm. W098/32326, cuyo contenido se incorpora en la presente descripción como referencia) . En resumen, los embriones inmaduros se aislan del maíz y los embriones se ponen en contacto con una suspensión de Agrobacterium, en donde las bacterias pueden transferir la secuencia de transformación a por lo menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infección) . En esta etapa, los embriones inmaduros se sumergen, preferentemente, en una suspensión de Agrobacterium para iniciar la inoculación. Los embriones se cocultivan por un periodo con el Agrobacterium (etapa 2: la etapa de cocultivo) . Preferentemente, los embriones inmaduros se cultivan en un medio sólido después de la etapa de infección. Después del periodo de cocultivo, se contempla una etapa "de reposo" opcional. En esta etapa de reposo, los embriones se incuban en presencia de por lo menos un antibiótico conocido que inhibe el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para los transformantes de la planta (etapa 3: etapa de reposo) . Preferentemente, los embriones inmaduros se cultivan en un medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para eliminar el Agrobacterium y proporcionar una fase de reposo para las células infectadas. A continuación, los embriones inoculados se cultivan en un medio que contiene un agente selectivo y se recupera el callo transformado en crecimiento (etapa 4: la etapa de selección). Preferentemente, los embriones inmaduros se cultivan en un medio sólido con un agente selectivo que produce el crecimiento selectivo de las células transformadas. Después, el callo se regenera en plantas (etapa 5: la etapa de regeneración) y los callos cultivados en medio selectivo se cultivan, preferentemente, en medio sólido para regenerar las plantas. Las plantas se monitorean y se califican según la modulación en el desarrollo del meristemo. Por ejemplo, las alteraciones en el tamaño y el aspecto del brote y de los meristemas florales y/o las producciones incrementadas de hojas, flores y/o frutos.
Ejemplo 6. La sobreexpresión de los genes diurnos del maíz afecta el tamaño y el crecimiento de la planta Se evalúa la función del gen diurno al usar plantas transgénicas que expresan el transgén. La expresión transgénica se confirma mediante el uso del cebador RT-PCR especifico del transgén .
Crecimiento vegetativo y acumulación de biomasa: En comparación con los hermanos no transgénicos , se podría esperar que las plantas transgénicas (en generación TI) muestren un aumento en la altura. El tallo de las plantas transgénicas se mide al comparar los valores del diámetro del tallo con aquellos de las plantas control no transformadas. El aumento en la altura de la planta y del grosor del tallo resultaría en una planta de mayor estatura y en mayor biomasa para las plantas transgénicas.
Se ha determinado que los genes diurnos afectan el crecimiento de la planta, principalmente, al acelerar la tasa de crecimiento, pero sin extender el período de crecimiento. El crecimiento mejorado, es decir, mayor tamaño de la planta y acumulación de biomasa, parece deberse mayormente a una tasa de crecimiento acelerado y no a un período extendido de crecimiento, ya que las plantas transgénicas no presentaron retrasos en la floración según las fechas de floración femenina y antesis. Por lo tanto, la sobreexpresión del gen diurno podría acelerar la tasa de crecimiento de la planta. La tasa de crecimiento acelerado parece estar asociada con un aumento en la tasa diurna.
La mejora en el crecimiento vegetativo, la acumulación de biomasa en las plantas transgénicas y la tasa de crecimiento acelerado podrían ser evaluados adicionalmente con experimentos extensivos en campo tanto en líneas híbridas como endógamas en la generación avanzada (T3) . Podría esperarse que las plantas transgénicas muestren uno o más de los siguientes: mayor altura de la planta, aumentos en el diámetro del tallo, aumento de la masa seca del tallo, aumento del área foliar, aumentos en la masa seca total de la planta.
Crecimiento reproductivo y rendimiento de granos: La sobreexpresión de los genes diurnos podría asociarse con una mejora en el crecimiento del tejido reproductivo. TI Podría esperarse que las plantas transgénicas presenten uno o más de los siguientes rasgos: mayor longitud de la espiga, mayor peso total del grano por espiga, mayor cantidad de granos por espiga y mayor tamaño de grano. El cambio positivo en las características de los granos y las espigas se asocia con el aumento en el rendimiento de granos.
La mejora en el crecimiento reproductivo y el rendimiento de granos de las plantas transgénicas se confirma en experimentos extensivos en campo en la generación avanzada (T3). Se observan mejoras tanto en líneas endógamas como híbridas. En comparación con los hermanos no transgénicos como controles, se esperaría que las plantas transgénicas presenten un aumento significativo en uno o más de los siguientes: masa seca de la espiga principal, masa seca de la espiga secundaria, masa seca de la panoja y masa seca de la cascarilla.
Las plantas transgénicas se clasifican, además, según los parámetros de tolerancia al estrés, que incluyen: ASI reducido, menor esterilidad y menor cantidad de granos abortados. La reducción podría ser mayor cuando las plantas se cultivan en una condición de estrés con alta densidad de plantas. Una medición reducida de estos parámetros se relaciona, frecuentemente, con la tolerancia al estrés biótico .
Ejemplo 7. Variantes de secuencias diurnas A. Variantes de secuencias de nucleótidos diurnas que no alteran la secuencia de aminoácidos codificados Las secuencias de nucleótidos diurnas se usan para generar variantes de secuencias de nucleótidos que tienen la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto (ORF) con aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % y 95 % de identidad de secuencia de nucleótidos cuando se compara con la secuencia de nucleótidos ORF de inicio no alterada de la SEQ ID NO correspondiente. Estas variantes funcionales se generan por medio del uso de una tabla de codón estándar. Aunque la secuencia de nucleótidos de las variantes se altera, la secuencia de aminoácidos codificada por el marco de lectura abierta no cambia.
B. Secuencias variantes de aminoácidos de los polipéptidos diurnos Se generan variantes de secuencias de aminoácidos de los polipéptidos diurnos. En este ejemplo se altera un aminoácido. Específicamente, se revisa los marcos de lectura abierta para determinar la alteración apropiada de los aminoácidos. La selección del aminoácido que cambiará se realiza al consultar el alineamiento de proteínas (con los otros ortólogos y otros miembros de la familia de genes de varias especies) . Se selecciona un aminoácido que se considera que no está bajo alta presión de selección (que no está altamente conservado) y que es más bien fácilmente sustituible por un aminoácido con características químicas similares (es decir, de cadena lateral funcional similar) . Puede cambiarse un aminoácido adecuado mediante el uso de un alineamiento de proteína. Una vez que se identifica el aminoácido objetivo se sigue el procedimiento descrito en la sección 11 siguiente. Con el uso de este método se genera variantes que tienen aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % y 95 % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos.
C. Variantes de secuencias de aminoácidos adicionales de polipéptidos diurnos En este ejemplo se crea secuencias proteicas artificiales con 80 %, 85 %, 90 % y 95 % de identidad en comparación con la secuencia proteica de referencia. Este último esfuerzo requiere identificar las regiones conservadas y variables del alineamiento y, después, la aplicación acertada de una tabla de sustituciones de aminoácidos. Estas partes se describirán detalladamente a continuación.
En gran medida, las secuencias de aminoácidos que se alteran se determinan con base en las regiones conservadas dentro de cada proteina diurna o dentro de los otros polipéptidos. Con base en el alineamiento de la secuencia, las múltiples regiones del polipéptido que potencialmente se pueden alterar se representan con letras minúsculas, mientras que las regiones conservadas se representan con letras mayúsculas. Se conoce que es posible hacer sustituciones conservadoras en las regiones conservadas a continuación sin alterar la función. Además, un experto comprenderá que las variantes funcionales de la secuencia de la descripción pueden tener alteraciones menores no conservadas de aminoácidos en el dominio conservado.
Posteriormente, se crea secuencias proteicas artificiales que son distintas a las originales con intervalos de identidad de 80-85 %, 85-90 %, 90-95 % y 95-100 %. El objetivo es alcanzar los puntos intermedios de estos intervalos con una flexibilidad de más o menos 1 %, por ejemplo. Las sustituciones de aminoácidos se realizarán por una programación Perl personalizada. La tabla de sustituciones se proporciona a continuación en la Tabla 3.
Tabla 3. Tabla de sustituciones Primero, se identifica cualquier aminoácido conservado en la proteina que no se debe cambiar y se "señala" para el aislamiento de la sustitución. Naturalmente, la metionina inicial se agregará automáticamente a la lista. Después, se realiza los cambios.
H, C y P no se cambian bajo ninguna circunstancia. Los cambios ocurrirán, primero, con isoleucina desde el N-terminal hasta el C-terminal. Después, la leucina, y asi sucesivamente por toda la lista hacia abajo hasta alcanzar el objetivo deseado. Es posible realizar una cantidad parcial de sustituciones a manera de que no se inviertan los cambios. La lista se ordena de 1 a 17, para empezar con los cambios de isoleucina que sean necesarios antes que empezar con la leucina y sucesivamente hasta la metionina. Claramente, de esta manera, muchos aminoácidos no necesitarán cambios. L, I y V implican una sustitución 50:50 de las 2 sustituciones óptimas alternas.
Las variantes de secuencias de aminoácidos aparece escritas como impresión. Se usa la programación Perl para calcular las similitudes porcentuales. Mediante el uso de este procedimiento, las variantes de los polipéptidos que se generan tienen aproximadamente 80 % , 85 %, 90 % y 95 % de identidad de aminoácidos con la secuencia de nucleótidos ORF inicial no alternada de las SEQ ID NOS: 1, 3, 5 y 40-71.
Ejemplo 8. Alteración de los rasgos en las plantas con el uso de elementos reguladores y polipéptidos descritos en la presente descripción.
Los diversos elementos reguladores que incluyen promotores diurnos y polipéptidos diurnos descritos en la presente descripción son útiles para el desarrollo de diversos rasgos para los cultivos. Estos incluyen introducir modificaciones que brinden tolerancia a la congelación o escarcha, tolerancia al enfriamiento o al frió, tolerancia a la sequía o al calor, tolerancia al estrés salino, fotorrespiración reducida, regulación de la apertura estomatal, eficiencia fotosintética para aumento del rendimiento, metabolismo y transporte de carbohidratos, uso mejorado de nitrógeno, biosíntesis de metabolitos selectiva, mejor asimilación de nutrientes, modulación de fuente/sumidero, resistencia a enfermedades, resistencia a insectos y resistencia a plagas. Uno o más de los elementos reguladores descritos en la presente descripción se combinan con otros elementos reguladores que incluyen diversos motivos inducibles de estrés o específicos del tejido para optimizar la expresión del transgén.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente en esta descripción son indicativas del nivel de conocimiento del experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente descripción como referencia en la misma medida que si cada publicación o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada como referencia .
La presente descripción se ha descrito con referencia a varias modalidades y técnicas específicas y preferidas. Sin embargo, se debe comprender que es posible realizar muchas variaciones y modificaciones, siempre y cuando se conserve el espíritu y el alcance de la descripción.

Claims (38)

REIVINDICACIONES :
1. Un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en: a. un polinucléotido con al menos 90 % de identidad de secuencia, según se determina mediante el algoritmo GAP con el uso de los parámetros predeterminados, con la secuencia de longitud completa de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 20 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468 y 70; caracterizado porque el polinucleótido codifica a un polipéptido que funciona como un modificador de la actividad diurna; un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEO ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 20, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 10 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 15 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 20 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468 y 470; un polinucléotido que es totalmente complementario con el polinucléotido de (a) o (b) ; un polipéptido codificado por el polinucléotido de (a) o (b) ; y un polipéptido con al menos 90 % de identidad de secuencia, según se determina mediante el algoritmo GAP con el uso de los parámetros predeterminados, con la secuencia de longitud completa de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOS; 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 467, 469 y 471.
2. Un cásete de expresión recombinante , que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido está unido operativamente, en orientación codificante o no codificante, a un promotor.
3. Una célula huésped que comprende el cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 2.
4. Una planta transgénica que comprende el cásete de expresión recombinante de conformidad con la reivindicación 2.
5. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la planta es una planta monocotiledónea .
6. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la planta es una planta dicotiledónea .
7. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste en: maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, cacahuate, caña de azúcar y cacao.
8. Una semilla transgénica de la planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4.
9. Un método para modular el ritmo diurno en las plantas; el método comprende: a. introducir en una célula vegetal un cásete de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 unido operativamente a un promotor; y b. cultivar la planta en condiciones de crecimiento de la célula vegetal; caracterizado porque el ciclo diurno en la célula vegetal está modulado.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la célula vegetal es de una planta seleccionada del grupo que consiste en: maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, cacahuate, caña de azúcar y cacao.
11. Un método para modular la planta completa o el ritmo diurno en una planta; el método comprende: a. introducir en una célula vegetal un cásete de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 unido operativamente a un promotor; b. cultivar la célula vegetal en condiciones de crecimiento de la célula vegetal; y c. regenerar una planta a partir de dicha célula vegetal; caracterizado porque el ritmo diurno en la planta está modulado.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la planta se selecciona del grupo que consiste en: maíz, soja, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, cacahuate y cacao.
13. Un producto derivado del método que consiste en procesar los tejidos de la planta transgénica que expresan un polinucleótido aislado que codifica un gen de funcionamiento diurno; el método comprende: a. transformar una célula vegetal con un cásete de expresión recombinante que comprende un polinucleótido con al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de longitud completa de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 20, 40, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468 y 470; unido operativamente a un promotor; y cultivar la célula vegetal transformada en condiciones de crecimiento de la célula vegetal; caracterizado porque el crecimiento en dicha célula vegetal transformada está modulado; cultivar la célula vegetal en condiciones de formación de planta para expresar el polinucleótido en el tejido vegetal; y d. procesar el tejido vegetal para obtener un producto .
14. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la planta es una planta monocotiledónea .
15. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste en: maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, caña de azúcar y mijo.
16. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la sobreexpresión del polinucleótido conduce a lo que ha mejorado el crecimiento de la planta en comparación con las plantas no transformadas.
17. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la planta muestra relaciones fuente-sumidero mejoradas en comparación con las plantas no transformadas.
18. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la planta tiene un rendimiento mejorado en comparación con las plantas no transformadas .
19. Una molécula reguladora de polinucléotido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOS: 31-183; (b) un fragmento de ácido nucleico que comprende al menos 50-100 nucleótidos contiguos de una de las SEQ ID NOS: 31-183 y caracterizada porque el fragmento comprende uno o más de los elementos reguladores diurnos enumerados en la Tabla 2, y (c) una secuencia de ácidos nucleicos que comprende al menos 90 % de identidad con aproximadamente 500-1000 nucleótidos contiguos de una de las SEQ ID NOS: 31-183, según se determina mediante el algoritmo GAP con el uso de los parámetros predeterminados.
20. Una molécula quimérica de polinucleótido que comprende el fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19.
21. La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 20, que comprende el elemento regulador diurno y un elemento de expresión específico del tejido.
22. La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el elemento de expresión específico del tejido se selecciona del grupo que consiste en específico de la raíz, específico de la célula de la vaina, específico de la hoja y específico del embrión.
23. La molécula reguladora de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la molécula de polinucleótido es un promotor.
24. Una construcción que comprende la molécula reguladora de conformidad con la reivindicación 19, unida operativamente a una molécula heterologa de polinucléotido, caracterizada porque la molécula heterologa confiere un rasgo de interés.
25. La construcción de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el rasgo de interés se selecciona del grupo que consiste en tolerancia a la sequía, tolerancia a la congelación, tolerancia al enfriamiento o al frío, resistencia a enfermedades y resistencia a insectos.
26. La construcción de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la molécula heterologa funciona en un metabolismo de fuente-sumidero.
27. Una planta transgénica transformada con la molécula reguladora de conformidad con la reivindicación 19.
28. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 27 es monocotiledónea .
29. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 27 se selecciona del grupo que consiste en maíz, soja, cañóla, algodón, girasol, alfalfa, remolacha, trigo, centeno, arroz, caña de azúcar, avena, cebada, césped, sorgo, mijo, tomate, guandul, vegetales, árboles frutales y pasto forrajero.
30. Un método para aumentar el rendimiento de una planta; el método comprende expresar un polinucleótido heterólogo de interés bajo el control de la molécula reguladora de conformidad con la reivindicación 19.
31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el polinucléotido heterólogo es un gen vegetal de regulación diurna.
32. Un método para aumentar la tolerancia al estrés abiótico en una planta; el método comprende expresar uno o más polinucleótidos que confieren tolerancia al estrés abiótico en plantas bajo el control de la molécula reguladora de la reivindicación 19.
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la tolerancia al estrés abiótico se selecciona del grupo que consiste en tolerancia a la sequía, tolerancia a la congelación y tolerancia al enfriamiento o al frío.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el polinucleótido que confiere tolerancia a la sequía se expresa bajo el control de un elemento regulador cuya máxima expresión ocurre alrededor del mediodía o en las últimas horas de la tarde.
35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el polinucleótido que confiere tolerancia a la congelación o al frió se expresa bajo el control de un elemento regulador cuya máxima expresión ocurre al amanecer o a media mañana.
36. Un método para reducir el rezago en el rendimiento de la expresión del gen transgénico; el método comprende expresar un transgén unido operativamente a una molécula reguladora de polinucleótido, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOS: 31-183; (b) un fragmento de ácido nucleico que comprende al menos 50-100 nucleótidos contiguos de una de las SEQ ID NOS: 31-183 y caracterizada porque el fragmento comprende uno o más de los elementos reguladores diurnos enumerados en la Tabla 2, y (c) una secuencia de ácidos nucleicos que comprende al menos 90 % de identidad con aproximadamente 500-1000 nucleótidos contiguos de una de las SEQ ID NOS: 31-183, según se determina mediante el algoritmo GAP con el uso de los parámetros predeterminados.
37. Un método de selección de candidatos génicos involucrados en la tolerancia al estrés abiótico; el método comprende (a) identificar uno o más candidatos génicos que exhiban un rezago en el rendimiento en una expresión constitutiva o especifica del tejido y (b) expresar los candidatos génicos bajo el control de la molécula reguladora que dirige el patrón de expresión diurno.
38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la molécula reguladora comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOS: 31-183; (b) un fragmento de ácido nucleico que comprende al menos 50-100 nucleótidos contiguos de una de las SEQ ID NOS: 31-183 y caracterizada porque el fragmento comprende uno o más de los elementos reguladores diurnos enumerados en la Tabla 2, y (c) una secuencia de ácidos nucleicos que comprende al menos 90 % de identidad con aproximadamente 500-1000 nucleótidos contiguos de una de las SEQ ID NOS: 31-183, según se determina mediante el algoritmo GAP con el uso de los parámetros predeterminados.
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