MX2008010196A

MX2008010196A - Genes para mejorar la eficiencia de la utilizacion de nitrogeno en los cultivos

Info

Publication number: MX2008010196A
Application number: MXMX/A/2008/010196A
Authority: MX
Inventors: R Simmons Carl; P Hershey Howard; Loussaert Dale
Original assignee: P Hershey Howard; Loussaert Dale; Pioneer Hibred International Inc; R Simmons Carl
Priority date: 2006-02-09
Filing date: 2008-08-08
Publication date: 2008-10-03

Abstract

Ácidos nucleicos aislados de NUE (eficiencia en la utilización de nitrógeno) y sus proteínas codificadas. Se proveen métodos y composiciones relacionados con la alteración de la utilización y/o captación de nitrógeno en las plantas. También se proveen casetes de expresión recombinante, células huésped y plantas transgénicas.

Description

GENES PARA MEJORAR LA EFICIENCIA DE LA UTILIZACIÓN DE NITRÓGENO EN LOS CULTIVOS REFERENCIAS Esta solicitud de utilidad reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los EEUU N° 60/771.906, presentada el 9 de febrero de 2006, que se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona en general con el campo de la biología molecular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La domesticación de muchas plantas se ha correlacionado con incrementos dramáticos en su rendimiento. La mayor parte de las variaciones fenotípicas que ocurren en las poblaciones naturales son continuas y se ven afectadas por múltiples influencias genéticas. La identificación de genes específicos responsables de las diferencias dramáticas en el rendimiento de las plantas domesticadas se ha convertido en un objetivo importante de la investigación agrícola. Un grupo de genes que afectan el rendimiento son los genes de la utilización eficiente del nitrógeno (NUE). Estos genes resultan útiles para mejorar el uso del nitrógeno en los cultivos, especialmente en el maíz. Los genes pueden ser utilizados para modificar la composición genética de las plantas hará hacerlas más eficaces con la aplicación de las cantidades de fertilizante que se utilizan actualmente, o mantener sus tasas de productividad con una cantidad significativamente menor de fertilizante. El aumento en la eficacia del uso de nitrógeno puede originarse en una mayor captación y asimilación de fertilizante de nitrógeno y/o en su posterior removilización y reutilización de las reservas de nitrógeno acumuladas. Por lo tanto, las plantas que contienen estos genes pueden ser usadas para mejorar el rendimiento. El mejoramiento de la eficacia del uso de nitrógeno en el maíz aumentaría el rendimiento del maíz cosechable por unidad de fertilizante nitrogenado que se aplica, tanto en naciones en desarrollo en las cuales hay un acceso limitado a los fertilizantes nitrogenados como en las naciones en desarrollo en los que el nivel de uso de nitrógeno permanece elevado. El mejoramiento en la utilización de nitrógeno también permite disminuir los costos de los insumos agrícolas, reducir la utilización y dependencia de las fuentes energéticas no renovables necesarias para la producción de fertilizantes y disminuir el impacto ambiental de la fabricación de fertilizantes nitrogenados y su uso en la agricultura. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención provee polinucleótidos, polipéptidos relacionados y todas las variantes modificadas en forma conservativa de las presentes secuencias NUE. La invención provee secuencias de genes NUE. La presente invención presenta métodos para modificar la composición genética de las plantas de cultivo, especialmente el maíz, de modo que tales cultivos sean más productivos con las cantidades de fertilizante que se aplican actualmente y/o igualmente productivos pero con una aplicación significativamente menor de fertilizante. La utilidad de esta clase de invención reside entonces en un aumento en el rendimiento y una reducción en los costos de fertilizante con la consiguiente reducción de impacto ambiental. Hasta el momento los científicos no han logrado el mejoramiento genético de la estructura genética intrínseca de las plantas de cultivo de modo de aumentar la eficiencia del uso de nitrógeno de una manera comercialmente viable. Esta invención utiliza de una manera única plantas de maíz altamente seleccionadas que han demostrado diferir en aspectos relativos con la utilización de nitrógeno. Las plantas se sometieron entonces a experimentos de perfiles de ARNm y análisis de datos para obtener un conjunto de genes que son útiles para modificar plantas de cultivo, especialmente de maíz, para mejorar la eficacia del uso del nitrógeno. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se relaciona con un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un gen NUE. Una realización de la invención comprende un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 1 1 1 , 113, 115, 117, 1 19, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 169, 171 , 173, 175, 177, 179, 181 , 183, 185, 187, 189, 191 , 193, 195, 197, 199, 201 , 203, 205, 207, 209, 21 1 , 213, 215, 217, 219, 221 , 223, 225, 227, 229, 231 , 233, 235, 237, 239, 241 , 243, 245, 247, 249, 251 , 253, 255, 257, 259, 261 , 263, 265, 267, 269, 271 , 273, 275, 277, 279, 281 , 283, 285, 287, 289, 291 , 293, 295, 297, 299, 301 , 303, 305, 307, 309, 311 o 313 ; (b) la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 1 12, 114, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312 o 314; y (c) la secuencia de nucleotidos que comprende al menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 11 1 , 113, 1 15, 1 17, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 169, 171 , 173, 175, 177, 179, 181 , 183, 185, 187, 189, 191 , 193, 195, 197, 199, 201 , 203, 205, 207, 209, 21 , 213, 215, 217, 219, 221 , 223, 225, 227, 229, 231 , 233, 235, 237, 239, 241 , 243, 245, 247, 249, 251 , 253, 255, 257, 259, 261 , 263, 265, 267, 269, 271 , 273, 275, 277, 279, 281 , 283, 285, 287, 289, 291 , 293, 295, 297, 299, 301 , 303, 305, 307, 309, 311 o 313, en donde dicho polinucleotido codifica un polipéptido que tiene una actividad de eficiencia de utilización del nitrógeno mejorada. Las composiciones de la invención incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 1 12, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312 o 314; y (b) la secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 112, 114, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312 o 314, en donde dicho polipéptido tiene una actividad de eficiencia de utilización del nitrógeno mejorada.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un cásete de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico como el descripto. Adicionalmente, la presente invención se relaciona con un vector que contiene el cásete de expresión recombinante. Además, el vector que contiene el cásete de expresión recombinante puede facilitar la transcripción y la traducción del ácido nucleico en una célula huésped. La presente invención también se relaciona con las células huésped capaces de expresar el polinucleótido de la presente invención. Puede usarse una cantidad de células huésped, tales como, por ejemplo, células de microbios, mamíferos, plantas o insectos. En aún otra realización, la presente invención se relaciona con plantas o células vegetales transgénicas que contienen los ácidos nucleicos de la presente invención. Las plantas preferidas que contienen los polinucleótidos de la presente invención incluyen, sin limitaciones, maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, tomate y mijo. En otra realización, la planta transgénica es una planta o una célula vegetal de maíz. Otra realización es las semillas transgénicas del polipéptido NUE transgénico de la invención ligado en forma operativa a un promotor que conduce la expresión en la planta. Las plantas de la invención pueden tener un NUE modificado en comparación con una planta de control. En algunas plantas, el NUE está modificado en un tejido vegetativo, en un tejido reproductivo, o un tejido vegetativo y en un tejido reproductivo. Las plantas de la invención pueden tener al menos uno de los siguientes fenotipos, incluyendo, sin limitaciones: mayor en la masa radicular, mayor longitud en la raíz, mayor tamaño de hoja, mayor tamaño de espiga, mayor tamaño de endosperma, modificaciones en el tamaño relativo de los embriones y endospermas que conducen a cambios en los niveles relativos de proteína, aceite y/o almidón en las semillas, ausencia de espiguillas, ausencia de espiguillas con 'polen funcional, o mayor tamaño de la planta. Otra realización de la invención incluye plantas que han sido modificadas genéticamente en un locus genómico, donde el locus genómico codifica un polipéptido NUE de la invención. Se proporcionan métodos para incrementar la actividad de un polipéptido NUE en una planta. El método puede comprender introducir en la planta un polinucleótido NUE de la invención. Se proporcionan métodos para reducir o eliminar el nivel de un polipéptido NUE en la planta. El nivel de actividad del polipéptido podría también ser reducido o eliminado en tejidos específicos, causando la alteración de la tasa de crecimiento de la planta. La reducción del nivel y/o la actividad del polipéptido NUE puede conducir a una estatura menor o un crecimiento más lento de las plantas. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se los defina de otro modo, todos los términos científicos y técnicos usados en la presente documentación tienen el mismo significado que le dan aquellos entrenados en la técnica a los que concierne esta invención. A menos que se mencione algo diferente, los procedimientos empleados o contemplados en la presente documentación son metodologías convencionales bien conocidas por aquellos entrenados en la técnica. Los materiales, los métodos y los ejemplos se proporcionan solamente con fines ilustrativos, y no pretenden limitar la invención. La siguiente descripción se presenta a modo de ilustración, y no pretende limitar el alcance de la invención. La presente invención se describirá con mayor detalle a continuación en la presente documentación, con referencia a los dibujos, en los que se ilustran algunas, pero no todas las realizaciones de la invención. Más aún, estas invenciones pueden realizarse de formas muy diferentes y no deben interpretarse como límites a las realizaciones presentadas en la presente documentación; por el contrario, estas realizaciones se proporcionan con el objeto de que esta descripción satisfaga los requerimientos legales aplicables. Los números semejantes hacen referencia a elementos semejantes en la descripción. Aquellos entrenados en la técnica a los que concierne esta invención podrán concebir muchas modificaciones y otras realizaciones de la invención presentada en la presente documentación, y podrán beneficiarse con las enseñanzas presentadas en las descripciones precedentes y los dibujos adjuntos. Por consiguiente, debe comprenderse que la invención no se limita a las realizaciones específicas descriptas, y que se incluyen dichas modificaciones y otras realizaciones en el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque se emplean términos específicos en la presente documentación, éstos se usan solamente en un sentido genérico y descriptivo, y no con el fin de limitar la invención. A menos que se indique lo contrario, la práctica de la presente invención empleará procedimientos convencionales de botánica, microbiología, cultivo de tejidos, biología molecular, química, bioquímica y tecnología de ADN recombinante, que son conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Estos procedimientos se explican con mayor detalle en la literatura. Véanse, por ejemplo, Langenheim y Thimann, (1982) BOTANY: Plant Biology and Its Relation to Human Affairs, John Wiley; Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, vol. 1 , Vasil, ed. (1984); Stanier, et al., (1986) The Microbial World, 5th ed., Prentice-Hall; Dhringra and Sinclair, (1985) Basic Plant Pathology Methods, CRC Press; Maniatis, et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual; DNA Cloning, vol. I y II, Glover, ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames and Higgins, eds. (1984); y la serie Methods in Enzymology, Colowick and Kaplan, eds, Academic Press, Inc., San Diego, CA. Las unidades, los prefijos y los símbolos pueden interpretarse en su forma aceptada por el SI. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha y en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha y en orientación amino a carboxilo, respectivamente. Los rangos numéricos incluyen los números que definen el rango. En la presente documentación se designan los aminoácidos de acuerdo con los símbolos de tres letras comúnmente conocidos, o de acuerdo con los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Del mismo modo, pueden designarse los nucleótidos de acuerdo con sus códigos de una letra comúnmente conocidos. Los términos definidos más adelante se describen con mayor detalla en referencia a la memoria descriptiva como un todo.

Se emplearán los siguientes términos para describir la presente invención, sus definiciones son las que se indican a continuación. Un "microbio" designa cualquier microorganismo (incluyendo microorganismos procariotas y eucariotas), tal como hongos, levaduras, bacterias, actinomicetes, algas y protozoos, así como otras estructuras unicelulares. La "amplificación" denota la construcción de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico, o de múltiples copias complementarias con la secuencia de ácido nucleico, usando al menos una de las secuencias de ácidos nucleicos como molde. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el sistema de reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), los sistemas de replicases Q-Beta, el sistema de amplificación basado en transcripción (TAS), y la amplificación por desplazamiento de cadenas (SDA). Véanse, por ejemplo, Diagnostic Molecular Microbiology: Principies And Applications, Persing et al., editores, American Society for Microbiology, Washington, DC (1993). El producto de la amplificación se denomina amplicón. El término "variantes modificadas en forma conservadora" se aplica a secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos. Para secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas en forma conservadora designan aquellos ácidos nucleicos que codifican variantes de las secuencias de aminoácidos idénticas o modificadas en forma conservadora. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos idénticos desde el punto de vista funcional pueden codificar una proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por consiguiente, en cualquier posición donde un codón especifica una alanina, puede cambiarse dicho codón por cualquiera de los codones correspondientes descriptos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas" y representan una especie de variación modificada en forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente documentación que codifica polipéptido también describe cualquier variación silenciosa posible del ácido nucleico. Aquellos entrenados en la técnica reconocerán que puede modificarse cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es comúnmente el codón de metionina; una excepción es Micrococcus rubens, para el cual GTG es el codón de metionina (Ishizuka ef al., J. Gen. Microbiol. 139:425-32 (1993)) para obtener una molécula idéntica desde el punto de vista funcional. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención está implícita en cada secuencia de polipéptido descripta y se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. En lo que respecta a las secuencias de aminoácidos, aquellos entrenados en la técnica reconocerán que las sustituciones, las deleciones o las adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que alteren, agreguen o eliminen un único aminoácido o un porcentaje pequeño de los aminoácidos en la secuencia codificada serán "variantes modificadas en forma conservadora" cuando la alteración resulte en la sustitución de un aminoácido por un aminoácido similar desde el punto de vista químico. Por lo tanto, también se puede modificar de esta manera cualquier cantidad de residuos de aminoácidos seleccionados del grupo de enteros entre 1 y 15. Así, por ejemplo, se pueden efectuar 1 , 2, 3, 4, 5, 7 o 10 alteraciones. Las variantes modificadas en forma conservadora típicamente presentan una actividad biológica similar a la del polipéptido con una secuencia sin modificar del que derivan. Por ejemplo, la especificidad por el sustrato, la actividad enzimática o la unión a ligandos/receptores es generalmente al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, preferiblemente 60-90% de aquella de la proteína nativa por su sustrato nativo. En la técnica son bien conocidas las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos similares desde el punto de vista funcional. Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras unos de otros: 1 ) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparragina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W). Véase también, Creighton, PROTEINS, W.H. Freeman y Co. (1984). Como se lo usa en la presente documentación, "que consiste esencialmente en" denota la inclusión de secuencias adicionales a un polinucleótido objeto, donde las secuencias adicionales no hibridizan selectivamente, bajo condiciones de hibridización severas, con el mismo ADNc del polinucleótido, y donde las condiciones de hibridización incluyen un paso de lavado en SSC 0.1X y 0,1 % de dodecil sulfato de sodio a 65°C. "Que codifica" o "codificado", respecto de un ácido nucleico específico, denota que éste comprende información para la traducción en una proteína específica. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de regiones traducidas del ácido nucleico, o puede carecer de estas secuencias no traducidas en cuestión (por ejemplo, como en el ADNc). La información por la cual está codificada una proteína está especificada por el uso de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos está codificada por el ácido nucleico a través del código genético "universal". Sin embargo, podrán usarse variantes del código genético universal, tales como aquellas presentes en algunas mitocondrias de plantas, animales y fúngicas, la bacteria Mycoplasma capricolum (Yamao et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:2306-9 (1985)), o el ciliado Macronucleus, cuando se desee expresar el ácido nucleico usando estos organismos. Cuando se prepare o se altere el ácido nucleico por medios sintéticos, podrán aprovecharse las preferencias de codones conocidas del huésped deseado en el que se desee expresar el ácido nucleico. Por ejemplo, aunque pueden expresarse las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención en especies de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, pueden modificarse las secuencias para adaptarlas a las preferencias de codones y las preferencias de contenido de GC específicas de las plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, ya que se ha demostrado que estas preferencias son diferentes (Murray et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-98, incorporado en la presente documentación a modo de referencia). Por consiguiente, el codón preferido por el maíz para un aminoácido particular puede derivar de secuencias de genes conocidos de maíz. Se indica el uso de codones de maíz para 28 de plantas de maíz en la Tabla 4 de Murray et al., supra. Como se lo usa en la presente documentación, "heterólogo", en referencia a un ácido nucleico, es un ácido nucleico que se origina a partir de una especie extraña, o, si es de la misma especie, está sustancialmente modificada en comparación con su forma nativa, en lo referente a su composición y/o su locus genómico, merced a la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a un gen estructural heterólogo es de una especie diferente de la especie de la que deriva el gen estructura, o, si es de la misma especie, uno o ambos están sustancialmente modificados respecto de su forma original. Una proteína heteróloga puede originarse en una especie extraña, o, si es de la misma especie, está sustancialmente modificada en comparación con su forma nativa merced a la intervención humana deliberada. Una "célula huésped" designa una célula que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga de la invención, que contiene un vector y permite la replicación y/o la expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células procariotas, tales como E. coli, o células eucariotas, tales como células de levaduras, insectos, plantas, anfibios o mamíferos. Preferiblemente, las células huésped son células de plantas monocotlledóneas o dicotiledóneas, incluyendo, sin limitaciones, células de maíz, sorgo, girasol, soja, trigo, alfalfa, arroz, algodón, cañóla, cebada, mijo y tomate. Una célula huésped de una planta monocotiledónea particularmente preferida es una célula huésped de maíz. El término "complejo de hibridización" incluye referencias a una estructura doble de ácido nucleico formada por dos secuencias de ácidos nucleicos de cadena simple que hibridizan selectivamente una con otra. El término "introducción", en el contexto de la inserción de un ácido nucleico en una célula, denota "transfección", "transformación" o "transducción", e incluye referencias a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, donde el ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, los cromosomas, los plásmidos, los plástidos o el ADN mitocondrial), puede convertirse en un replicón autónomo o puede expresarse en forma transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado). El término "aislado" hace referencia a un material, tal como un ácido nucleico o una proteína, que está sustancial o esencialmente libe de los componentes que normalmente acompañan o interactúan con él, tal como se halla en su ambiente natural. El material aislado comprende opcionalmente un material que no se halla asociado al material en su ambiente natural. Los ácidos nucleicos "aislados", como se los define en la presente documentación, también se conocen como ácidos nucleicos "heterólogos". A menos que se establezca lo contrario, el término "ácido nucleico NUE" designa un ácido nucleico que comprende un polinucleótido ("polinucleótido NUE") que codifica un polipéptido NUE completo o parcial. Como se lo usa en la presente documentación, un "ácido nucleico" incluye referencias a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos con forma de cadena simple o doble, y, a menos que se lo limite de otro modo, comprende análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales, ya que hibridizan con ácidos nucleicos de cadena simple de forma similar a los nucleótidos de ocurrencia natural (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos). Una "biblioteca de ácidos nucleicos" designa una colección de moléculas aisladas de ADN o ARN que comprende y representa sustancialmente la fracción transcripta completa del genoma de un organismo determinado. La construcción de bibliotecas de ácidos nucleicos, tal como bibliotecas genómicas y de ADNc se explica en referencias de biología molecular estándar tales como Berger and Kimmel, (1987) Guide To Molecular Cloning Techniques, de la serie Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vols. 1-3; y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., eds, Current Protocols, un emprendimiento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (1994 Suplemento). Como se lo usa en la presente documentación, "unido operativamente" incluye referencias a una unión funcional entre una primera secuencia, tal como un promotor, y una segunda secuencia, donde la secuencia promotora inicia y media en la transcripción del ADN que corresponde a la segunda secuencia. En general, la unión operativa denota que las ácidos nucleicos unidas son contiguas y, cuando resulta necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, son contiguas y están en el mismo marco de lectura. Como se lo usa en la presente documentación, el término "planta" incluye referencias a plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etcétera), semillas y células vegetales, y progenie de éstas. Las células vegetales, como se las usa en la presente documentación, incluyen, sin limitaciones, semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callos, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas. La clase de plantas que se puede usar en los métodos de la invención, generalmente es tan amplia como la clase de plantas superiores pasible de técnicas de transformación entre las que se incluyen tanto las plantas monocotiledóneas como las dicotiledóneas incluyendo las especies de los géneros: Cucúrbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Avena, Hordeum, Sécale, Allium, y Triticum. Una planta particularmente preferida es Zea mays. Según se utiliza en la presente, "rendimiento" hace referencia a fanegas por acre de un cultivo de granos al cosecharse, ajustado por humedad del grano (típicamente 1 % para el maíz, por ejemplo) y el volumen de biomasa generado (para cultivos de forraje como alfalfa y tamaño de la raíz para cultivos múltiples) Se mide la humedad de los granos en el momento de la cosecha. Se determina el peso de prueba ajustado del grano como el peso en libras por fanega, ajustado de acuerdo con el nivel de humedad de los granos en el momento de la cosecha. La biomasa se mide como peso de material vegetal cosechable generado. Como se lo usa en la presente documentación, un "polinucleótido" incluye referencias a desoxirribopolinucleótidos, ribopolinucleótidos, o análogos de éstos que tienen la naturaleza esencial de un ribonucleotido natural, en el sentido de que hibridizan, bajo condiciones de hibridización severas, sustancialmente con la misma secuencia de nucleótidos que los nucleótidos de ocurrencia natural, y/o permiten la traducción de los mismos aminoácidos que los nucleótidos de ocurrencia natural. Un polinucleótido puede ser la totalidad o una subsecuencia de un gen estructural o regulador nativo o heterologo. A menos que se indique lo contrario, el término incluye referencias a la secuencia especificada, así como a la secuencia complementaria con ésta. Por consiguiente, los ADN o los ARN con esqueletos modificados por razones de estabilidad o por otros motivos son "polinucleótidos", de acuerdo con la interpretación que se da al término en la presente documentación. Más aún, los ADN o los ARN que comprenden bases inusuales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiadas, para nombrar solamente dos ejemplos, son polinucleótidos, de acuerdo con la interpretación que se da al término en la presente. Se apreciará que se ha efectuado una gran variedad de modificaciones al ADN y el ARN para que sirvan para muchos propósitos útiles conocidos por aquellos entrenados en la técnica. El término polinucleótido, como se lo usa en la presente documentación, comprende estas formas de polinucleótidos modificadas por medios químicos, enzimáticos o metabólicos, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo, entre otras, células simples y complejas. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente documentación para designar polímeros de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en que uno o más de los residuos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido de ocurrencia natural correspondiente, así como polímeros de aminoácidos de ocurrencia natural. Como se lo usa en la presente documentación, un "promotor" incluye referencias a una región de ADN río arriba del inicio de la transcripción y que participa en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "promotor vegetal" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células vegetales. Los ejemplos de promotores vegetales incluyen, sin limitaciones, aquellos que pueden obtenerse a partir de plantas, virus y bacterias que afectan plantas, que comprenden genes que se expresan en células vegetales, tales como Agrobacterium o Rhizobium. Los ejemplos comprenden promotores que inician la transcripción con preferencia en determinados tejidos, tales como hojas, raíces, semillas, fibras, vasos del xilemas, traqueidas o esclerénquima. Estos promotores se conocen como promotores "con preferencia por tejidos". Un promotor específico para un "tipo celular" dirige primariamente la expresión en determinados tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, las células vasculares en las raíces o las hojas. Un promotor "inducible" o "regulable" es un promotor que está bajo el control del ambiente. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden provocar la transcripción por promotores inducibles incluyen condiciones anaerobicas o la presencia de luz. Otro tipo de promotor es un promotor regulado por el desarrollo, por ejemplo, un promotor que dirige la expresión durante el desarrollo del polen. Los promotores con preferencia por tejidos, específicos para tipos celulares, regulados por el desarrollo e inducibles constituyen la clase de los promotores "no constitutivos". Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo bajo la mayor parte de las condiciones ambientales. El término "polipéptido NUE" hace referencia a una o más secuencias de aminoácidos. El término también incluye fragmentos, variantes, homólogos, alelos o precursores (por ejemplo, preproproteínas o proproteínas) de éstos. Una "proteína NUE" comprende un polipéptido NUE. A menos que se establezca lo contrario, el término "ácido nucleico NUE" designa un ácido nucleico que comprende un polinucleótido ("polinucleótido NUE") que codifica un polipéptido NUE. Como se lo usa en la presente documentación, "recombinante" incluye referencias a una célula o un vector que ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo, o denota que la célula deriva de una célula modificada de este modo. Por consiguiente, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se hallan en forma idéntica en la forma nativa (no recombinante) de la célula, o expresan genes nativos de una forma anormal, los expresan a niveles inferiores o no los expresan en absoluto, como resultado de la intervención humana deliberada; o pueden presentar una expresión reducida o eliminada de un gen nativo. El término "recombinante", como se lo usa en la presente documentación, no comprende la alteración de la célula o el vector por sucesos de ocurrencia natural (por ejemplo, mutación espontánea, transformación/transducción/transposición natural), tales como aquellos que ocurren sin una intervención humana deliberada. Como se lo usa en la presente documentación, un "cásete de expresión recombinante" es una construcción de ácidos nucleicos generada en forma recombinante o sintética con una serie de elementos de ácidos nucleicos específicos, que permite la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula blanco. El cásete de expresión recombinante puede incorporarse en un plásmido, un cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, un virus o un fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción del cásete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, un ácido nucleico a transcribir y un promotor. Los términos "residuo", "residuo de aminoácido" o "aminoácido" se usan indistintamente en la presente documentación para designar un aminoácido que está incorporado en una proteína, un polipéptido o un péptido (denominados colectivamente "proteínas"). El aminoácido puede ser un aminoácido de ocurrencia natural, y a menos que se lo limite de otro modo, puede comprender análogos conocidos de aminoácidos naturales que operen de forma similar que los aminoácidos de ocurrencia natural.

El término "hibridización selectiva" incluye referencias a una hibridización, bajo condiciones de hibridización severas, de una secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico blanco específica, con un grado detectablemente mayor (por ejemplo, al menos 2 veces respecto del fondo) que la hibridización de las secuencias de ácidos nucleicos distintas del blanco, y con la exclusión sustancial de los ácidos nucleicos distintos del blanco. Las secuencias que hibridizan en forma selectiva típicamente tienen aproximadamente al menos 40% de identidad de secuencia, preferiblemente 60-90% de identidad de secuencia, y más preferiblemente 100% de identidad de secuencia (es decir, son complementarias) una con otra. Los términos "condiciones severas" o "condiciones de hibridización severas" incluyen referencias a condiciones bajo las cuales una sonda hibridiza con su secuencia blanco, con un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces respecto del fondo). Las condiciones severas dependen de la secuencia y difieren bajo distintas circunstancias. Mediante el control de la severidad de la hibridización y/o las condiciones de lavado, pueden identificarse secuencias blanco que son 100% complementarias con la sonda (análisis de homólogos). Como alternativa, pueden ajustarse las condiciones de severidad para permitir un cierto grado de falta de coincidencia entre las secuencias, con el fin de detectar grados de similitud menores (análisis de heterólogos). En términos óptimos, la sonda tiene aproximadamente 500 nucleótidos de longitud, pero puede presentar una gran variación en su extensión, entre menos de 500 nucleótidos hasta la extensión completa de la secuencia blanco. Típicamente, las condiciones severas son aquellas donde la concentración de sal es menor que aproximadamente 1 ,5 M de iones Na, típicamente una concentración de entre aproximadamente 0,01 y 1 ,0 M de iones Na (o de otras sales) a un pH de entre 7,0 y 8,3, donde la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, de entre 10 y 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, de más de 50 nucleótidos). También pueden obtenerse condiciones severas agregando agentes desestabilizadores, tales como formamida o la solución de Denhardt. Los ejemplos de condiciones de severidad baja incluyen una hibridización con una solución amortiguadora con entre 30 y 35% de formamida, NaC1 1 M, 1 % de SDS (dodecil sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en SSC entre 1X y 2X (SSC 20X = NaCI 3,0 M/citrato de trisodio 0,3 M) a 50-55°C. Los ejemplos de condiciones de severidad moderada incluyen una hibridización en una solución que contiene entre 40 y 45% de formamida, NaCI 1 ,0 M, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado en SSC entre 0,5X y 1X a 55-60°C. Los ejemplos de condiciones de severidad alta incluyen una hibridización en 50% de formamida, NaCI 1 M, 1 % de SDS a 37°C, y un lavado final en SSC 0,1X a 60-65°C. La especificidad es típicamente una función de los lavados post-hibridización, donde los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, la Tm se puede aproximar a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl, (1984) Anal. Biochem., 138:267-84: Tm = 81 ,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/I; donde M es la molarídad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de guanosina y nucleótidos de citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Tm es la temperatura (a una fuerza iónica y un pH específico) a la que 50% de una secuencia blanco complementaria hibridiza con una sonda que coincide perfectamente. La Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de falta de coincidencia; por lo tanto, es posible ajusfar la Tm, las condiciones de hibridación y/o lavado para hibridizar las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, puede reducirse el Tm en 10°C. Generalmente se seleccionan condiciones severas con temperaturas aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento, a una fuerza iónica y un pH específico. Sin embargo, las condiciones muy severas pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 1 , 2, 3 ó 4°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 ó 10°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de baja severidad pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 1 1 , 12, 13, 14, 15 ó 20°C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Usando la ecuación, las condiciones de hibridización y lavado deseadas, y el Tm deseado, aquellos entrenados en la técnica comprenderán que pueden efectuarse variaciones en la severidad de las soluciones de hibridización y/o lavado. Si el grado de falta de coincidencia deseado da como resultado una Tm menor que 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) se prefiere incrementar la concentración de SSC para que se pueda usar una temperatura más alta. Se pueden consultar una guía muy extensa para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology — Hybridization with Nucleic Acids Probes, Parte I, Capítulo 2 Overview of principies of hybridation and the strategy of nucleic acid probé assays", Elsevier, Nueva York (1993); y Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York (1995). A menos que se establezca lo contrario, en la presente solicitud se define la severidad elevada como una hibridización en SSC 4X, solución de Denhardt 5X (5 g de Ficoll, 5 g de polivinipirrolidona, 5 g de albúmina de suero bovino en 500 mi de agua), 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón sometido a ebullición, y fosfato de Na 25 mM a 65°C, y un lavado en SSC 0,1X, 0,1 % de SDS a 65°C. Como se lo usa en la presente documentación, una "planta transgénica" incluye referencias a una planta que comprende un polinucleótido heterólogo en su genoma. En general, el polinucleótido heterólogo se integra en forma estable en el genoma, de modo que el polinucleótido pasa a las generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede estar integrado en el genoma solo o como parte de un cásete de expresión recombinante. El término "transgénico" se usa en la presente documentación con el objeto de abarca todas las células, las líneas celulares, los callos, los tejidos, las partes de plantas o las plantas cuyo genotipo ha sido alterado por la presencia de un ácido nucleico heterólogo, incluyendo aquellos transgénicos alterados inicialmente, así como aquellos creados por medio de cruzamientos sexuales o propagación asexual a partir del transgénico inicial. El término "transgénico", como se lo usa en la presente documentación, no comprende la alteración del genoma (cromosomico o extracromosómico) por métodos convencionales de cruzamiento de plantas o sucesos de ocurrencia natural, tales como fertilización cruzada al azar, infección por virus no recombinantes, transformación con bacterias no recombinantes, transposición no recombinante o mutación espontánea. Como se lo usa en la presente documentación, un "vector" incluye referencias a un ácido nucleico usado en la transfección de una célula huésped y en el cual puede insertarse un polinucleótido. Los vectores son comúnmente replicones. Los vectores de expresión permiten la transcripción de un ácido nucleico insertado en él. Se usan los siguientes términos para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia" y (e) "identidad sustancial". Como se lo usa en la presente documentación, una "secuencia de referencia" es una secuencia definida, usada como la base para realizar una comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo, un segmento o la totalidad de la secuencia de un ADNc o un gen, o la secuencia completa del ADNc o el gen. Como se lo usa en la presente documentación, una "ventana de comparación" incluye referencias a un segmento contiguo y específico de una secuencia de polinucleótidos, donde la secuencia de polinucleótidos puede compararse con una secuencia de referencia y donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, faltas de coincidencia) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para alinear ambas secuencias en forma óptima. En general, la ventana de comparación tiene al menos 20 nucleótidos contiguos de largo, y opcionalmente puede tener 30, 40, 50, 100 o más. Aquellos entrenados en la técnica comprenden que, para evitar una similitud elevada con una secuencia de referencia debido a la inclusión de faltas de coincidencia en la secuencia de polinucleótidos, típicamente se introduce una penalidad de falta de coincidencia y se la sustrae de la cantidad de coincidencias.

Los métodos para alinear secuencias de nucleótidos y aminoácidos con fines de comparación son bien conocidos en la técnica. Puede usarse el algoritmo de homología local (BESTFIT) de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math 2:482 (1981 ), para efectuar un alineamiento óptimo de secuencias con fines comparativos; puede usarse el algoritmo de alineamiento por homología (GAP) de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-53 (1970); el método de búsqueda por similitud (Tfasta y Fasta) de Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); implementaciones computarizadas de estos algoritmos, incluyendo, sin limitaciones: CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Conjunto de Software Wisconsin Genetics, Versión 8 (disponible en Genetics Computer Group (programas GCG® (Accelrys, Inc., San Diego, CA)). El programa CLUSTAL está bien descripto por Higgins y Sharp, Gene 73:237-44 (1988); Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-3 (1988); Corpet et al., Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang, et al., (1992) Computer Applications in the Biosciences 8:155-65, y Pearson, et al., (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-31. El programa preferido para usar en el alineamiento global óptimo de múltiples secuencias es PileUp (Feng y Doolittle, J. Mol. Evol., 25:351-60 (1987), que es similar al método descripto por Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-53 (1989) y se incorpora en la presente documentación a modo de referencia). La familia de programas BLAST, que pueden usarse para realizar búsquedas por similitud con secuencias en bases de datos, incluye: BLASTN para búsquedas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de nucleótidos; BLASTX para búsquedas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de proteínas; BLASTP para búsquedas de secuencias de proteínas en bases de datos de secuencias de proteínas; TBLASTN para búsquedas de secuencias de proteínas en bases de datos de secuencias de nucleótidos; y TBLASTX para búsquedas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de nucleótidos. Véase Current Protocols In Molecular Biology, Capítulo 19, Ausubel et al., editores, Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York (1995). GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch, supra, para hallar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza la cantidad de coincidencias y minimiza la cantidad de faltas de coincidencia. GAP considera todos los alineamientos posibles y todas las posiciones de falta de coincidencia, y crea el alineamiento con la mayor cantidad de coincidencias de bases y la menor cantidad de faltas de coincidencia. Permite proveer una penalidad de creación de faltas de coincidencia y una penalidad de extensión de faltas de coincidencia en unidades de bases coincidentes. GAP debe crear una ganancia a partir de la cantidad de coincidencias, respecto de la penalidad de creación de faltas de coincidencia, para cada falta de coincidencia que inserta. Si se selecciona una penalidad de extensión de falta de coincidencia mayor que cero, GAP debe además crear una ganancia para cada falta de coincidencia insertada, que abarca la longitud de la falta de coincidencia multiplicada por la penalidad de extensión de falta de coincidencia. Los valores por omisión de creación de faltas de coincidencia y extensión de faltas de coincidencia en la Versión 10 del Conjunto de Software Wisconsin Genetics para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Pueden expresarse las penalidades de creación y extensión de faltas de coincidencia como un número entero seleccionado del grupo de enteros que consiste en entre 0 y 100. Por consiguiente, por ejemplo, las penalidades de creación y extensión de faltas de coincidencia pueden ser 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más. GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineamientos. Pueden existir muchos miembros de esta familia, pero ningún otro tiene mejor calidad. GAP muestra cuatro cifras de mérito para los alineamientos: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada para el alineamiento de las secuencias. La Relación es la Calidad dividida por la cantidad de bases en el segmento más corto. El Porcentaje de Identidad es el porcentaje de los símbolos que coinciden de hecho. El Porcentaje de Similitud es el porcentaje de símbolos que son similares. Los símbolos que están a lo largo de las faltas de coincidencia son ignorados. Se evalúa una semejanza cuando el valor de la matriz de puntuación para un par de símbolos es mayor o igual que 0,50, el umbral de semejanza. La matriz de calificación usada en la Versión 10 del Conjunto de Software Wisconsin Genetics es BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915). A menos que se establezca lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente documentación hacen referencia al valor obtenido usando el conjunto de programas BLAST 2.0 con los parámetros por omisión (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402). Como lo comprenderán aquellos entrenados en la técnica, las búsquedas BLAST asumen que las proteínas pueden modelarse como secuencias al azar. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencia no azarosas, que pueden ser tractos homopoliméricos, repeticiones de período corto o regiones enriquecidas en uno o más aminoácidos. Estas regiones de baja complejidad pueden alinearse entre proteínas no relacionadas, aún cuando otras regiones de las proteínas sean muy diferentes. Puede emplearse una cantidad de programas de filtro de baja complejidad para reducir estos alineamientos de baja complejidad. Por ejemplo, pueden emplearse los filtros de baja complejidad SEG (Wooten y Federhen, Comput. Chem. 17:149-63 (1993)) y XNU (Claverie y States, Comput. Chem. 17:191-201 (1993)) solos o combinados. Como se la usa en la presente documentación, la "identidad de secuencia" o la "identidad", en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son idénticos cuando se efectúa un alineamiento de correspondencia máxima para una ventana de comparación específica. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de residuos que no son idénticas comúnmente difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas, donde se sustituyen los residuos de aminoácidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad), y, por ende, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, puede incrementarse el porcentaje de identidad de secuencia para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren en dichas sustituciones conservativas presentan "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Típicamente, esto comprende evaluar una sustitución conservativa como una falta de coincidencia parcial, en vez de total, lo que incrementa el porcentaje de identidad de secuencia. Por consiguiente, por ejemplo, cuando a un aminoácido idéntico se le asigna un valor de 1 y a una sustitución no conservativa se le asigna un valor de cero, a una sustitución conservativa se le asigna un valor entre cero y 1. El valor de las sustituciones conservativas se calcula, por ejemplo, de acuerdo con el algoritmo de Meyers y Miller, Computer Appllc. Biol. Sc¡. 4:11-17 (1988), por ejemplo, tal como está implementado en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, EEUU). Como se lo usa en la presente documentación, el "porcentaje de identidad de secuencia" designa el valor determinado por medio de la comparación de dos secuencias alineadas en forma óptima a lo largo de una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia), en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones), para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Se calcula el porcentaje determinando la cantidad de posiciones en las cuales existe una base de ácido nucleico idéntica en ambas secuencias, de modo de obtener la cantidad de posiciones de coincidencia, dividiendo la cantidad de posiciones de coincidencia por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando la cantidad total de posiciones por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene entre 50 y 100% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 50% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 60% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, y más preferiblemente al menos 95%, en comparación con una secuencia de referencia, usando uno de los programas de alineamiento descriptos, con los parámetros convencionales. Aquellos entrenados en la técnica reconocerán que pueden ajustarse apropiadamente estos valores para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos, teniendo en cuenta la degeneración de los codones, la similitud de los aminoácidos, la localización en el marco de lectura y semejantes. La identidad sustancial de secuencias de aminoácidos para estos propósitos normalmente comprende una identidad de secuencia de entre 55 y 100%, preferiblemente al menos 55%, preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, 80%, 90%, y más preferiblemente al menos 95%. Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es cuando las dos moléculas hibridizan una con otra bajo condiciones severas. La degeneración del código genético permite muchas sustituciones de aminoácidos que producen variedad en la secuencia de nucleótidos que codifica el mismo aminoácido, por lo que es posible que las secuencias de ADN codifiquen el mismo polipéptido pero no hibridicen una con otra bajo condiciones severas. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando se crea una copia del ácido nucleico usando la degeneración de codones máxima permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico presenta reactividad inmunológica cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico. El término "identidad sustancial", en contexto de un péptido, indica que un péptido comprende una secuencia con entre 55 y 100% de identidad de secuencia con una secuencia de referencia, preferiblemente al menos 55% de identidad de secuencia, preferiblemente 60% preferiblemente 70%, más preferiblemente 80%, más preferiblemente al menos 90% o 95% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia, en una ventana de comparación específica. Preferiblemente, el alineamiento óptimo se efectúa usando el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, supra. Una indicación de que dos secuencias de péptidos son sustancialmente idénticas es que un péptido presenta reactividad inmunológica cruzada con anticuerpos dirigidos contra el segundo péptido. Por consiguiente, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente en una sustitución conservadora. Además, un péptido puede ser sustancialmente idéntico a un segundo péptido cuando difieren en una sustitución no conservativa si el epitope reconocido por el anticuerpo permanece sustancialmente idéntico. Los péptidos que son "sustancialmente similares" comparten secuencias como las que se indicó previamente, excepto que las posiciones de los residuos que no son idénticos pueden diferir en cambios de aminoácidos conservadores. La invención describe polinucleótidos y polipéptidos NUE. Los nuevos nucleótidos y proteínas de la invención tienen un patrón de expresión que indica que aumentan la utilización de nitrógeno, y por consiguiente, tienen una participación importante en el desarrollo de la planta. Los polinucleótidos se expresan en diversos tejidos vegetales. Por consiguiente, los polinucleótidos y los polipéptidos proporcionan una oportunidad para manipular el desarrollo de la planta para alterar el desarrollo, el cronograma o la composición de los tejidos. Esto se puede usar para crear una planta con rendimiento mejorada bajo un suministro limitado de nitrógeno. Ácidos nucleicos La presente invención provee, entre otros, ácidos nucleicos aislados de ARN, ADN y análogos y/o quimeras de éstos, que comprenden un polinucleotido NUE. La presente invención también incluye polinucleótidos optimizados para expresar en distintos organismos. Por ejemplo, para expresar el polinucleótido en una planta de maíz, puede alterarse la secuencia para dar cuenta de las preferencias de codones específicas, y puede alterarse el contenido de GC de acuerdo con Murray et al, supra. Se indica el uso de codones de maíz para 28 de plantas de maíz en la Tabla 4 de Murray et al., supra. Los ácidos nucleicos NUE de la presente invención comprenden polinucleótidos NUE aislados que incluyen: (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido NUE, y variantes modificadas en forma conservadora y polimórficas de éste; (b) un polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con los polinucleótidos de (a) o (b); (c) secuencias complementarias de los polinucleótidos de (a) o (b). Construcción de los ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención pueden prepararse usando (a) métodos recombinantes convencionales, (b) técnicas sintéticas o combinaciones de éstos. En algunas realizaciones, los polinucleótidos de la presente invención se clonarán, amplificarán o construirán de otro modo a partir de un hongo o una bacteria. Convenientemente, los ácidos nucleicos pueden comprender secuencias adicionales, además de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, puede insertarse un sitio de clonación múltiple, que comprende uno o más sitios para endonucleasas de restricción en el ácido nucleico, para contribuir en el aislamiento del polinucleótido. También pueden insertarse secuencias traducibles para contribuir en el aislamiento del polinucleótido traducible de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexa-histidina provee un medio conveniente para purificar las proteínas de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención - excluyendo la secuencia de polinucleótidos -es opcionalmente un vector, un adaptador o un conector para clonar y/o expresar un polinucleótido de la presente invención. Pueden agregarse secuencias adicionales a dichas secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o la expresión, para contribuir en el aislamiento del polinucleótido, o para mejorar la introducción del polinucleótido en una célula. Típicamente, la longitud de un ácido nucleico de la presente invención menor que la longitud del polinucleótido de la presente invención es menor que 20 kilopares de bases, comúnmente menor que 15 kb, y frecuentemente menor que 10 kb. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y conectores es bien conocido en la técnica. Los ejemplos de ácidos nucleicos incluyen vectores tales como M13, lambda ZAP Express, lambda ZAP II, lambda gt10, lambda gt11 , pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II, lambda DASH II, lambda EMBL 3, lambda EMBL 4, pWE15, SuperCos 1 , SurfZap, Uni-ZAP, pBC, pBS+/-, pSG5, pBK, pCR-Script, pET, pSPUTK, p3'SS, pGEM, pSK+/-, pGEX, pSPORTI y II, pOPRSVI CAT, pOPI3 CAT, pXT1 , pSG5, pPbac, pMbac, pMCI neo, pOG44, pOG45, pFRTpGAL, pNEOpGAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, lambda MOSSIox, y lambda MOSEIox. Los vectores opcionales para la presente invención incluyen, sin limitaciones, lambda ZAP II y pGEX. Para hallar una descripción de varios ácidos nucleicos, véase por ejemplo, Stratagene Cloning Systems, Catálogos 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA); y Amersham Life Sciences, Inc, Catálogo '97 (Arlington Heights, IL). Métodos sintéticos para construir los ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención también pueden prepararse empleando una síntesis química directa con métodos tales como el método de fosfotriéster de Narang eí al., Meth. Enzymol. 68:90-9 (1979); el método de fosfodiéster de Brown eí al., Meth. Enzymol. 68:109-51 (1979); el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Letís. 22(20): 1859-62 (1981 ); el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descripto por Beaucage eí al., supra, por ejemplo, usando un sintetizador automático, por ejemplo, como se describe en Needham-VanDevanter eí al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-68; y el método en soporte sólido de la Patente de los EEUU N° 4458066. La síntesis química generalmente produce un oligonucleótido de cadena simple. Éste puede convertirse en ADN de cadena doble realizando una hibridización con una secuencia complementaria, o efectuando una polimerización con una ADN polimerasa, usando la cadena individual como molde. Aquellos entrenados en la técnica reconocerán que, si bien la síntesis química de ADN se limita una secuencias de aproximadamente 100 bases, pueden obtenerse secuencias más largas uniendo secuencias más cortas. UTR y preferencia de codones En general, se ha descubierto que la eficiencia de la traducción está regulada por elementos de secuencia específicos en la región 5' no codificante o no traducida (5' UTR) del ARN. Los motivos de secuencia positivos incluyen secuencias consenso de inicio de la traducción (Kozak, Nucleic Acids Res.15:8125 (1987)) y la estructura del ARN 5<G> 7 metil GpppG cap (Drummond et al., (1985) Nucleic Acids Res. 13:7375). Los elementos negativos incluyen las estructuras de tallo-rizo 5' UTR intramoleculares estables (Muesing et al., Cell 48:691 (1987)) y las secuencias AUG o los marcos abiertos de lectura cortos precedidos por un AUG apropiado en la 5' UTR (Kozak, supra, Rao et al., Mol. y Cell. Biol. 8:284 (1988)). Por consiguiente, la presente invención provee regiones 5' y/o 3' UTR para modular la traducción de secuencias codificantes heterólogas.

Además, pueden modificarse los segmentos que codifican polipéptidos de los polinucleótidos de la presente invención para alterar el uso de codones. Puede emplearse un uso de codones alterado para modificar la eficiencia de la traducción y/u optimizar la secuencia codificante para expresarla en un huésped deseado, o para optimizar el uso de codones en una secuencia heteróloga para expresarla en maíz. Puede analizarse en forma estadística el uso de codones en las regiones codificantes de los polinucleótidos de la presente invención, usando conjuntos de software disponibles comercialmente, tales como "Codon Preference", disponible el conjunto University of Wisconsin Genetics Computer Group. Véase Devereaux et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:387-395); o MacVector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.). Por consiguiente, la presente invención provee una frecuencia de uso de codones característica de la región codificante de al menos uno de los polinucleótidos de la presente invención. La cantidad de polinucleótidos (3 nucleótidos por aminoácido) que puede usarse para determinar la frecuencia de uso de codones puede ser cualquier número entero entre 3 y la cantidad de polinucleótidos de la presente invención proporcionados en la presente documentación. Opcionalmente, los polinucleótidos serán secuencias completas. Un ejemplo de cantidad de secuencias para realizar un análisis estadístico puede ser de al menos 1 , 5, 10, 20, 50 ó 100. Barajado de secuencias La presente invención provee métodos para barajar secuencias usando los polinucleótidos de la presente invención, y composiciones obtenidas de este modo. El barajado de secuencias se describe en la Publicación PCT N° 96/19256. Véanse también, Zhang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-9 (1997); y Zhao et al., Nature Biotech 16:258-61 ( 998). En general, el barajado de secuencias provee un medio para generar bibliotecas de polinucleótidos con características deseadas, que pueden seleccionarse o analizarse Las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos con secuencias relacionadas, que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden recombinarse en forma homologa in vitro o in vivo. La población de polinucleótidos con secuencias recombinadas comprende una subpoblación de polinucleótidos que poseen características deseadas o ventajosas, y que pueden seleccionarse empleando un método de selección o análisis apropiado. Las características pueden ser cualquier propiedad o atributo que pueda seleccionarse o detectarse en un sistema de análisis, y pueden incluir propiedades de: una proteína codificada, un elemento de la transcripción, una secuencia que controla la transcripción, el procesamiento del ARN, la estabilidad del ARN, la formación de la cromatina, la traducción, u otra propiedad de la expresión de un gen o un transgen, un elemento de replicación, un elemento que une proteínas, o semejantes, tal como cualquier característica que confiere una propiedad que puede seleccionarse o detectarse. En algunas realizaciones, la característica seleccionada será una Km y/o una Kcat alterada en la proteína tipo salvaje, tal como se la proporciona en la presente documentación. En otras realizaciones, una proteína o un polinucleótido generado a partir del barajado de secuencias tendrá una afinidad de unión a ligando mayor que aquella del polinucleótido tipo salvaje no modificado. En aún otras realizaciones, una proteína o un polinucleótido generado a partir del barajado de secuencias tendrá un pH óptimo alterado, en comparación con aquel del polinucleótido tipo salvaje no modificado. El incremento en estas propiedades puede ser de al menos 110%, 120%, 130%, 140% o mayor que 150% respecto del valor tipo salvaje. Casetes de expresión recombinantes Además, la presente invención provee casetes de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polinucleótido de la presente invención deseado, por ejemplo, un ADNc o una secuencia genómica que codifica un polipéptido suficientemente largo para codificar una proteína activa de la presente invención, puede usarse para construir un cásete de expresión recombinante que puede introducirse en la célula huésped deseada. Un cásete de expresión recombinante típicamente comprenderá un polinucleótido de la presente invención unido operativamente una secuencias reguladoras de inicio de la transcripción, que dirigirán la transcripción del polinucleótido en la célula huésped deseada, tal como en los tejidos de una planta transformada. Por ejemplo, los vectores de expresión para plantas pueden incluir (1 ) un gen vegetal clonado bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras 5' y 3' y (2) un marcador de selección dominante. Estos vectores de expresión para plantas también pueden contener, si se lo desea, una región reguladora promotora (por ejemplo, una que confiera una expresión inducible o constitutiva, regulada por el ambiente o el desarrollo, o específica/selectiva en células o tejidos), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión a ribosomas, una señal de procesamiento del ARN, un sitio de terminación de la transcripción, y/o una señal de poliadenilación. Puede emplearse un fragmento promotor vegetal que dirige la expresión de un polinucleótido de la presente invención en todos los tejidos de una planta regenerada. Estos promotores se conocen en la presente documentación como promotores "constitutivos", y están activos bajo la mayoría de las condiciones ambientales y los estados del desarrollo o la diferenciación celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor 1 ' o 2' derivado del ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, el promotor Smas, el promotor de la cinamil alcohol deshidrogenasa (Patente de los EEUU N° 5683439), el promotor Nos, el promotor de la rubisco, el promotor GRP1-8, el promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor (CaMV), descripto en Odell eí al., Nature 313:810-2 (1985); el promotor de actina de arroz (McEIroy eí al., Plant Ce// 163-171 (1990)); ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1992) y Christensen eí al., Plant Mol. Biol. 18:675-89 (1992)); pEMU (Last eí al., Theor. Appl. Genet. 81 :581-8 (1991 )); MAS (Velten eí al., EMBO J. 3:2723-30 (1984)); y la histona H3 de maíz (Lepetit eí al., Mol. Gen. Genet. 231 :276-85 (1992); y Atanassvoa eí al., Plant Journal 2(3):291-300 (1992)); el promotor ALS, descripto en la Solicitud PCT N° WO 96/30530; y otras regiones de inicio de la transcripción de varios genes vegetales conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Para la presente invención, el de la ubiquitina es el promotor preferido para obtener expresión en plantas monocotiledóneas. Como alternativa, el promotor vegetal puede dirigir la expresión de un polinucleótido de la presente invención en un tejido específico, o puede presentar un control más específico en términos ambientales o de desarrollo. Estos promotores se conocen en la presente documentación como promotores "inducibles". Las condiciones ambientales que pueden provocar la transcripción por promotores inducibles incluyen el ataque de patógenos, las condiciones anaeróbicas o la presencia de luz. Los ejemplos de promotores inducibles son el promotor Adh1 , que puede ser inducido por hipoxia o estrés por frío, el promotor Hsp70, que puede ser inducido por estrés por calor, y el promotor PPDK, que puede ser inducido por la luz. Los ejemplos de promotores controlados por el desarrollo incluyen los promotores que inician la transcripción solamente, o con preferencia, en determinados tejidos, tales como hojas, frutos, semillas o flores. La operación de un promotor también puede variar dependiendo de su localización en el genoma. Por consiguiente, un promotor inducible puede pasar a ser completa o parcialmente constitutivo en determinadas localizaciones. Si se desea expresar un polipéptido, es generalmente deseable incluir una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la región codificante de un polinucleótido. La región de poliadenilación se puede derivar de diversos genes vegetales o de ADN-T. La secuencia del extremo 3' que se agrega se puede derivar de, por ejemplo los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o como alternativa de otro gen vegetal, o menos preferentemente de cualquier otro gen eucariótico. Los ejemplos de estos elementos reguladores incluyen, sin limitaciones, las regiones de terminación 3' y/o poliadenilación, tales como aquellas del gen de nopalina sintetasa (nos) de Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., (1983) Nucleic Acids Res. 12:369-85); el gen del inhibidor II de la proteinasa de papa (PINII) (Keil et al., (1986) Nucleic Acids Res. 14:5641-50; y An, et al., (1989) Plant Ce// 1 :115-22); y el gen CaMV 19S (Mogen, et al., (1990) Plant Ce// 2:1261 -72). Puede introducirse la secuencia de un intrón en la región 5' no traducida o en la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para incrementar la cantidad de mensajero maduro acumulado en el citosol. Se ha demostrado que la inclusión de un intrón separable en la unidad de transcripción de las construcciones de expresión para plantas y animales incrementa la expresión genética a nivel del ARNm y las proteínas hasta 1000 veces (Buchman y Berg, (1988) Mol. Cell Biol. 8:4395-4405; Callis et al., (1987) Genes Dev. 1 :1 183-200). Este mejoramiento intrónico de la expresión genética es típicamente mayor cuando se coloca dicho intrón cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. En la técnica se conoce el uso de los intrones de maíz Adh1-S 1 , 2, y 6, y el intrón Bronze-1. Véase en general The Maize Handbook, Capítulo 1 16, Freeling y Walbot, editores, Springer, Nueva York (1994). Las secuencias señal para plantas, incluyendo, sin limitaciones, los ADN/ARN que codifican péptidos señal que dirigen las proteínas blanco hacia la matriz extracelular de la célula vegetal (Dratewka-Kos et al., J. Biol. Chem. 264:4896-900 (1989)), tales como el gen de extensión de Nicotiana plumbaginifolia (DeLoose eí al., Gene 99:95-100 (1991 )); los péptidos señal que dirigen proteínas hacia la vacuola, tales como el gen de esporamina de batata (Matsuka eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:834 (1991 )) y el gen de lectina de cebada (Wilkins eí al., Plant Cell, 2:301-13 (1990)); los péptidos señal que provocan la secreción de las proteínas, tales como aquellos de PRIb (Lind eí al., Plant Mol. Biol. 18:47-53 (1992)) la alfa amilasa de cebada (BAA) (Rahmatullah eí al., Plant Mol. Biol. 12:1 19 (1989), incorporado en la presente documentación a modo de referencia), o los péptidos señal que dirigen las proteínas hacia los plástidos, tales como aquellos de la reductasa enoil-ACP de colza (Verwaert eí al., Plant Mol. Biol. 26:189-202 (1994)), son útiles en la invención. El vector que comprende las secuencias de un polinucleótido de la presente invención típicamente comprenderá un gen marcador que conferirá un fenotipo seleccionare a las células vegetales. Comúnmente, el gen marcador codificará resistencia a antibióticos, donde los genes apropiados incluirán los genes que codifican resistencia al antibiótico espectinomicina (por ejemplo, el gen aada), el gen de estreptomicina fosfotransferasa (SPT), que codifica resistencia a estreptomicina, el gen de neomicina fosfotransferasa (NPTII), que codifica resistencia a kanamicina o geneticina, el gen de higromicina fosfotransferasa (HPT), que codifica resistencia a higromicina, los genes que codifican resistencia a los herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la acetolactato sintetasa (ALS), en particular los herbicidas tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de acetolactato sintetasa (ALS) que contiene mutaciones que permiten obtener dicha resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra), los genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la glutamina sintetasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), u otros genes como los mencionados conocidos en la técnica. El gen bar codifica resistencia al herbicida basta, y el gen ALS codifica resistencia al herbicida clorsulfurón. Los vectores útiles para expresar los genes en plantas superiores típicos son bien conocidos en la técnica, y e incluyen vectores derivados del plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens, descripto por Rogers et al. (1987)., Meth. Enzymol. 153:253-77 Estos vectores son vectores que se integran en las plantas por transformación, procedimiento por el que se transfiere una porción del ADN del vector al genoma de la planta huésped. Los ejemplos de vectores de A. tumefaciens útiles en la presente documentación son los plásmidos pKYLX6 y pKYLX7 de Schardl et al., Gene 61 :1-11 (1987), y Berger eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86:8402-6 (1989). Otro vector útil en la presente documentación es el plásmido pBI101.2, que está disponible en CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA). Expresión de proteínas en células huésped Usando los ácidos nucleicos de la presente invención, es posible expresar una proteína de la presente invención en una célula modificada en forma recombinante, tal como una bacteria, una levadura, una célula de insecto o mamífero, o preferiblemente una célula vegetal. Las células producen la proteína en una condición no natural (por ejemplo, en lo referente a la cantidad, la composición, la localización y/o el momento), ya que han sido modificadas genéticamente merced a la intervención humana para que lo hagan. Se espera que aquellos entrenados en la técnica conozcan los numerosos sistemas de expresión disponibles para expresar un ácido nucleico que codifica una proteína de la presente invención. No se intentará describir en detalle los distintos métodos conocidos para expresar proteínas en procariotas o eucariotas. En pocas palabras, la expresión de los ácidos nucleicos aislados que codifican una proteína de la presente invención típicamente se efectuará uniendo operativamente, por ejemplo, el ADN o el ADNc, con un promotor (que será constitutivo o inducible), a lo que seguirá la incorporación en un vector de expresión. Los vectores pueden ser apropiados para la replicación y la integración en procariotas o eucariotas. Los vectores de expresión típicos contienen terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de inicio y promotores útiles para regular la expresión del ADN que codifica la proteína de la presente invención. Para obtener un nivel de expresión elevado de un gen clonado, es deseable construir vectores de expresión que contienen, como mínimo, un promotor fuerte, tal como el de la ubiquitina, para dirigir la transcripción, un sitio de unión a ribosoma para iniciar la traducción, y un terminador de la transcripción/traducción. Los promotores constitutivos son aquellos que proporcionan un rango de expresión constitutiva. Por consiguiente, algunos son promotores constitutivos débiles y otros son promotores constitutivos fuertes. En general, un "promotor débil" designa un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante con un nivel bajo. Un nivel de expresión bajo abarca niveles de expresión de aproximadamente 1/10000 transcriptos, aproximadamente 1/100000 transcriptos y aproximadamente 1/500000 transcriptos. Por otro lado, un "promotor fuerte" dirige la expresión de una secuencia codificante a "niveles elevados", o aproximadamente 1/10 transcriptos, aproximadamente 1/100 transcriptos y aproximadamente 1/1000 transcriptos. Aquellos entrenados en la técnica reconocerán que pueden efectuarse modificaciones a las proteínas de la presente invención sin disminuir su actividad biológica. Pueden efectuarse algunas modificaciones para facilitar la clonación, la expresión o la incorporación de la molécula de direccionamiento en una proteína de fusión. Estas modificaciones son bien conocidas por aquellos entrenados en la técnica e incluyen, por ejemplo, una metionina agregada en el extremo amino para proporcionar un sitio de inicio, o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poli His) colocados en cualquier extremo para crear sitios de restricción, codones de terminación o secuencias de purificación en localizaciones convenientes. Expresión en procariotas Pueden usarse células procariotas como huéspedes de expresión. Los procariotas están frecuentemente representados por varias cepas de E. coli. Sin embargo, también pueden usarse otras cepas de microbios. Las secuencias de control procariota de uso común están definidas en la presente documentación como secuencias que incluyen promotores para iniciar la transcripción, opcionalmente con un operador, en combinación con secuencias de sitios de unión a ribosomas, e incluyen promotores de uso común, tales como los sistemas promotores de la beta lactamasa (penicilinasa) y la lactosa (lac) (Chang et al., Nature 198:1056 (1977)), el sistema promotor del triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980)) y el promotor P L derivado de lambda con el gen N de unión a ribosomas (Shimatake et al., Nature 292:128 (1981 )). La inclusión de marcadores de selección en los vectores de ADN transfectados en E coli. también resulta de utilidad. Los ejemplos de dichos marcadores incluyen genes con resistencia específica a ampicilina, tetraciclina o cloranfenicol. El vector se selecciona con el objeto de permitir la introducción del gen de interés en la célula huésped apropiada. Los vectores bacterianos típicamente se originan en plásmidos o fagos. Se infectan células bacterianas apropiadas con partículas de fagos, o se las transfecta con ADN vector de fago desnudo. Si se usa un vector plasmídico, se transfectan las células bacterianas con el ADN del vector plasmídico. Existen sistemas de expresión para expresar una proteína de la presente invención disponibles que usan Bacillus sp. y Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-35 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-5 (1983)). El plásmido vector pGEX-4T-1 de Pharmacia es el vector de expresión en E. coli preferido para la presente invención. Expresión en eucariotas Existe una variedad de sistemas de expresión en eucariotas, tales como levaduras, líneas de células de insectos, células vegetales y de mamíferos, conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Como se explica brevemente más adelante, puede expresarse la presente invención en estos sistemas eucariotas. En algunas realizaciones se emplean células vegetales transformadas/transfectadas, como se describirá más adelante, como sistemas de expresión para producir las proteínas de la presente invención. La síntesis de proteínas heterólogas en levaduras es bien conocida.

Sherman, ef al., (1982) Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory) es un trabajo bien conocido que describe los distintos métodos disponibles para producir la proteína en levaduras. Dos levaduras ampliamente utilizadas para producir proteínas eucariotas son Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. En la técnica se conocen vectores, cepas y protocolos para obtener expresión en Saccharomyces y Pichia, y están disponibles en proveedores comerciales (por ejemplo, Invitrogen). Los vectores apropiados contienen secuencias para controlar la expresión, tales como promotores, incluyendo aquellos de 3-fosfoglicerato quinasa o alcohol oxidasa, y un origen de replicación, secuencias de terminación y semejantes, según se lo desee. Una vez expresada, puede aislarse una proteína de la presente invención de la levadura lisando las células y aplicando técnicas convencionales de aislamiento de proteínas sobre los lisados o los pélets. Puede efectuarse el monitoreo del proceso de purificación usando técnicas de Western blot, radioinmunoensayo u otras técnicas de inmunoensayo convencionales. Las secuencias que codifican las proteínas de la presente invención también pueden unirse a varios vectores de expresión para usar en la transfección de cultivos celulares, por ejemplo, originados en mamíferos, insectos o plantas. Los sistemas de células de mamíferos a menudo tienen la forma de monocapas de células aunque también pueden usarse suspensiones de células de mamífero. En la técnica se ha desarrollado una cantidad de líneas de células huésped apropiadas capaces de expresar proteínas intactas, incluyendo las líneas celulares HEK293, BHK21 y CHO. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias para controlar la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor (por ejemplo, el promotor CMV, un promotor HSV tk o pgk (fosfoglicerato quinasa)), un potenciador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), y sitios necesarios para procesar la información, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte del ARN, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de adición de poli A SV40 grande T Ag) y secuencias de terminación de la transcripción. Hay otras células animales útiles para producir las proteínas de la presente invención disponibles, por ejemplo, en el Catálogo de Líneas Celulares e Hibridomas de la Colección Americana de Tipos de Cultivo (7a edición, 1992). Los vectores apropiados para expresar las proteínas de la presente invención en células de insectos comúnmente derivan del baculovirus SF9. Las células de insecto apropiadas incluyen líneas celulares de larvas de mosquito, gusano de seda, oruga marchadora, polilla Drosophila, tales como una línea celular de (véase, por ejemplo, Schneider (1987) J. Embryol. Exp. Morphol. 27:353-65). Al igual que con la levadura, cuando se emplean células huésped de animales o plantas superiores, típicamente se incorporan secuencias de poliadenilación o secuencias de terminación de la transcripción en el vector. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilación del gen de hormona de crecimiento bovina. También pueden incluirse secuencias para el corte apropiado del transcripto. Un ejemplo de una secuencia de separación es el intrón VP1 de SV40 (Sprague et al., J. Virol. 45:773-81 (1983)). Adicionalmente, en el vector pueden incorporarse secuencias genéticas para controlar la replicación en la célula huésped, tales como aquellas halladas en vectores semejantes al virus de papilloma bovino (Saveria-Campo, "Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector", en DNA Cloning: A Practical Approach, vol. II, Glover, editor, IRL Press, Arlington, VA, pp. 213-38 (1985)). Además, puede usarse el gen NUE, localizado en el vector de expresión apropiado para la planta, para transformar células vegetales. Luego puede aislarse el polipéptido a partir de callos, o pueden usarse las células vegetales transformadas para regenerar plantas transgénicas. Estas plantas transgénicas pueden cosecharse, y pueden someterse los tejidos apropiados (semillas u hojas, por ejemplo) a una extracción de proteínas a gran escala y a técnicas de purificación. Métodos para transformar plantas Se conocen numerosos métodos para introducir genes extraños en plantas, y puede usárselos para insertar un polinucleótido NUE en una planta huésped, incluyendo protocolos biológicos y físicos de transformación de plantas. Véase, por ejemplo, Miki et al., "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants", en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick y Thompson, editores, CRC Press, Inc., Boca Ratón, pp. 67-88 (1993). Los métodos seleccionados varían con la planta huésped, e incluyen métodos de transfección química, tales como aquella mediada por fosfato de calcio, transferencia de genes mediada por microorganismos, tales como Agrobacteríum (Horsch et al., Science 227:1229-31 (1985)), electroporación, microinyección y bombardeo biolístico. Los casetes y los vectores de expresión, y los métodos de cultivo in vitro para la transformación de células o tejidos vegetales, y para la regeneración plantas, son conocidos y están disponibles. Véase, por ejemplo, Gruber et al., "Vectors for Plant Transformaron", en Methods In Plant Molecular Biology And Biotechnology, supra , pp . 89- 119. Los polinucleótidos o los polipéptidos aislados pueden introducirse en la planta empleando una o más técnicas de uso común para efectuar una administración directa en las células. Estos protocolos pueden variar dependiendo del tipo de organismo, célula, planta o célula vegetal, es decir monocotiledónea o dicotiledónea, que se desea modificar. Los métodos adecuados para transformar células vegetales incluyen microinyección (Crossway et al., (1986) Biotechniques 4:320-334; y Patente de los Estados Unidos . N°: 6.300.543), electroporación (Riggs et al., (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 83:5602-5606, transferencia directa de genes (Paszkowski et al., (1984) EMBO J. 3:27 '17 '-2722) y aceleración balística de partículas (véase, por ejemplo, Sanford et al., Patente de los Estados Unidos . N°: 4.945.050; WO 91/10725; y McCabe et al., (1988) Biotechnology 6:923-926). También véase, Tomes et al., Direct DNA Transfer ¡nto Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment, págs. 97-213 en Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods eds. O. L. Gamborg & G.C. Phillips.. Springer-Verlag Berlín Heidelberg Nueva York, 1995; Patente de los Estados Unidos . N°: 5.736.369 (meristema); Weissínger et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou et al., (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); Datta et al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein eí al., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 85:4305-4309 (maíz); Klein et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); WO 91/10725 (maíz); Klein et al., (1988) Plant Physiol. 91 :440-444 (maíz); Fromm et al., (1990) Biotechnology 8:833-839; y Gordon-Kamm et al., (1990) Plant Cell 2:603-618 (maíz); Hooydaas-Van Slogteren & Hooykaas (1984) Nature (Londres) 31 1 :763-764; Bytebier et al., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al., (1985) En The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. G.P. Chapman et al., págs. 197-209. Longman, NY (polen); Kaeppler et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; y Kaeppler et ai, (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por fibras); Patente de los Estados Unidos . N°: 5.693.512 (sonicación); D'Halluin et al., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250-255; y Christou & Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al., (1996) Nature Biotech. 14:745-750; transformación de maíz mediada por Agrobacterium (Patente de los Estados Unidos . N°: 5.981.840); métodos con fibras de carburo de silicio (Frame et al., (1994) Plant J. 6:941-948); métodos con láser (Guo ef al., (1995) Physiologia Plantarum 93:19-24); métodos con sonicación (Bao ef al., (1997) Ultrasound in Medicine & Biology 23:953-959; Finer & Finer (2000) Lett Appl Microbio!. 30:406-10; Amoah et al., (2001 ) J Exp Bot 52:1135-42); métodos con polietilenglicol (Krens et al., (1982) Nature 296:72-77); los protoplastos de células monocotiledóneas y dicotiledóneas se pueden transformar usando electroporación (Fromm ef al., (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 82:5824-5828) y microinyección (Crossway et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202:179-185); todos los cuales se incorporan en la presente a modo de referencia.. Transformación mediada por Agrobacterium El método más usado para introducir un vector de expresión en plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium. A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias patogénicas de plantas que habitan en la tierra, que transforman células vegetales por medios genéticos. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, contienen genes responsables de la transformación genética de las plantas. Véase, por ejemplo, Kado, (1990) Crit. Rev. Plant Sci. 10:1. Se proporcionan descripciones de los sistemas de vectores de Agrobacterium y los métodos para transferir genes con la mediación de Agrobacterium en Gruber ef al., supra; Miki et al., supra; y Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989).

De forma similar, puede insertarse el gen en la región del ADN-T del plásmido Ti o Ri derivado de A. tumefaciens o A. rhizogenes, respectivamente. Por consiguiente, pueden construirse casetes de expresión como se describió previamente, usando estos plásmidos. Se conocen muchas secuencias de control que, cuando se las une a una secuencia codificante heteróloga y se las transforma en un organismo huésped, presentan fidelidad en la expresión genética respecto de la especificidad por tejidos/órganos de la secuencia codificante original. Véase, por ejemplo, Benfey y Chua, Science 244:174-81 (1989).Las secuencias de control particularmente apropiadas para usar en estos plásmidos son los promotores para la expresión constitutiva específica en hojas del gene en las distintas plantas blanco. Otras secuencias de control útiles incluyen un promotor y un terminador del gen de nopalina sintetasa (NOS). El promotor y el terminador NOS están presentes en el plásmido pARC2, disponible en la Colección Americana de Tipos de Cultivo con la designación ATCC 67238. Si se usa un sistema como este, también debe estar presente el gen de virulencia (w'r) del plásmido Ti o Ri, en combinación con la porción de ADN-T o a través de un sistema binario, donde el gen vlr está presente en un vector separado. Dichos sistemas, los vectores para usar en los mismos y los métodos para transformar células vegetales se describen en la Patente de los EEUU N° 4.658.082; la Solicitud de Patente de los EEUU N°: 913914, presentada el 1o de octubre de 1986, como se menciona en la Patente de los EEUU N° 5.262.306, presentada el 16 de Noviembre de 1993; y Simpson et al., Plant Mol. Biol. 6:403-15 (también mencionada en la atente 306); se incorporan todas como referencia en su totalidad. Una vez construidos, pueden introducirse estos plásmidos en A. rhizogenes o A. Tumefaciens, y pueden usarse estos vectores para transformar células de especies vegetales comúnmente susceptibles de ser infectadas por Fusarium o Alternaría. En la presente invención también se contemplan varias otras plantas transgénicas, incluyendo, sin limitaciones, soja, maíz, sorgo, alfalfa, arroz, trébol, repollo, banana, café, apio, tabaco, garbanzo, algodón, melón y pimienta. La selección de A. tumefaciens o A. rhizogenes dependerá de la planta que se desee transformar. En general, A. tumefaciens es el organismo preferido para la transformación. La mayoría de las plantas dicotiledóneas, algunas gimnospermas y unas pocas plantas monocotiledóneas (por ejemplo, determinados miembros de Liliales y Arales) son susceptibles de una infección con A. tumefaciens. . A. rhizogenes también tiene un amplio rango de huéspedes, que abarca a la mayoría de las dicotiledóneas y algunas gimnospermas, que incluyen miembros de las familias Leguminosae, Compositae, y Chenopodiaceae. En la actualidad pueden transformarse plantas monocotiledóneas con algún grado de éxito. La Solicitud de Patente Europea N° 604 662 A1 describe un método para transformar monocotiledóneas usando Agrobacterium. La Solicitud Europea N° 672 752 A1 describe un método para transformar monocotiledóneas con Agrobacterium usando el escutelo de embriones inmaduros. Ishida et al. describen un método para transformar maíz exponiendo embriones inmaduros a A. tumefaciens (Nature Biotechnology 14:745-50 (1996)). Una vez transformadas, pueden usarse estas células para regenerar plantas transgénicas. Por ejemplo, pueden infectarse plantas completas con estos vectores, lesionando la planta y luego introduciendo el vector en el sitio de la lesión. Puede lesionarse cualquier parte de la planta, incluyendo hojas, tallos y raíces. Como alternativa, puede inocularse tejido vegetal, bajo la forma de un explante, tal como tejido de cotiledones o discos de hojas, con estos vectores, y puede cultivárselo bajo condiciones que promueven la regeneración de plantas. Pueden usarse raíces o brotes transformados mediante la inoculación del tejido vegetal con A. rhizogenes o A. tumefaciens, que contienen el gen que codifica la enzima degradadora de fumonisina, como fuente de tejido vegetal para regenerar plantas transgénicas resistentes a fumonisina, por embriogénesis somática u organogénesis. Se describen ejemplos de estos métodos para regenerar tejido vegetal en Shahin, Theor. Appl. Genet. 69:235-40 (1985); la Patente de los EEUU N° 4658082; Simpson, et al., supra; y las Solicitudes de Patentes de los EEUU N° 913913 y 913914, ambas presentadas el 1o de Octubre de 1986, como se menciona en la Patente de los EEUU N° 5262306, presentada el 16 de Noviembre de 1993, cuyas descripciones completas se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. Transferencia directa de genes A pesar del hecho de que el rango de huéspedes para la transformación mediada por Agrobacterium es amplio, algunas especies de cereales de cultivo importantes y gimnospermas han sido generalmente recalcitrantes a este modo de transferencia de genes, aunque se han obtenido algunos éxitos recientes en arroz (Hiei et al., The Plant Journal 6:271-82 (1994)). Se han desarrollado varios métodos de transformación de plantas, conocidos colectivamente como transferencia directa de genes, como una alternativa a la transformación mediada por Agrobacteríum. Un método que puede aplicarse en general a la transformación de plantas es la transformación mediada por microproyectiles, donde se transporta ADN en la superficie de microproyectiles que miden entre aproximadamente 1 y 4 µ?t?. El vector de expresión se introduce en los tejidos vegetales con un dispositivo biolístico que acelera los microproyectiles hasta velocidades de entre 300 y 600 m/s, lo que es suficiente para penetrar las paredes y las membranas de las células vegetales (Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987); Sanford, Trends Biotech 6:299 (1988); Sanford (1990), Physiol. Plant 79:206 y Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)). Otro método para administrar ADN por medios físicos es la sonicación de las células blanco, como se describe en Zang et al., BioTechnology 9:996 (1991 ).Como alternativa, se han usado fusiones de liposomas o esferoplastos para introducir vectores de expresión en plantas. Véanse, por ejemplo, Deshayes et al., EMBO J. 4:2731 (1985); y Christou et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3962 (1987).También se ha descripto la asimilación directa de ADN en protoplastos usando precipitación con CaC , alcohol polivinílico, o poli-L-ornitina. Véanse, por ejemplo, Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985); y Draper et al. (1982), Plant Cell Physiol. 23:451 . También se ha descripto la electroporación de protoplastos y células y tejidos completos. Véanse, por ejemplo, Donn et al., en Abstracts of the Vllth Int'l.

Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990); D'Halluin ef a/., Plant Cell 4:1495-505 (1992); y Spencer et a/., Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994). Incremento de la actividad y/o el nivel de un polipéptido NUE Se proporcionan métodos para incrementar la actividad y/o el nivel del polipéptido NUE de la invención. Puede obtenerse un incremento en el nivel y/o actividad del polipéptido NUE de la invención introduciendo en la planta un polipéptido NUE. Puede proporcionarse el polipéptido NUE introduciendo la secuencia de aminoácidos que codifica el polipéptido NUE en la planta, introduciendo en la planta una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido NUE, o como alternativa, modificando un locus genómico que codifica el polipéptido NUE de la invención. Como se describió en otra parte de la presente documentación, en la técnica se conocen muchos métodos para introducir un polipéptido en una planta, incluyendo, sin limitaciones, la introducción directa del polipéptido en la planta, la introducción en la planta (en forma transitoria o estable) de una construcción de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad mejorada de utilización de nitrógeno. También se reconoce que los métodos de la invención pueden emplear un polinucleótido que no es capaz de dirigir la expresión de una proteína o un ARN en la planta transformada. Por consiguiente, puede incrementarse el nivel y/o la actividad de un polipéptido NUE alterando el gen que codifica el polipéptido NUE o su promotor. Véase, por ejemplo, Kmiec, Patente de los EEUU N° 5565350; Zarling et al., PCT/US93/03868. Por consiguiente, se proporcionan plantas mutagenizadas que contienen mutaciones en los genes NUE, donde las mutaciones incrementan la expresión del gen NUE o incrementan la actividad NUE del polipéptido codificado. Reducción de la actividad y/o el nivel de un polipéptido NUE Se proporcionan métodos para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido NUE de la invención, que comprenden transformar una célula vegetal con un cásete de expresión que expresa un polinucleótido que inhibe la expresión del polipéptido NUE. El polinucleótido puede inhibir la expresión del polipéptido NUE en forma directa, evitando la transcripción o la traducción del ARN mensajero NUE, o indirecta, codificando un polipéptido que inhibe la transcripción o la traducción de un gen NUE que codifica un polipéptido NUE. Los métodos para inhibir o eliminar la expresión de un gen en una planta son bien conocidos en el arte y se puede usar cualquiera de dichos métodos en la presente invención para inhibir la expresión de un polipéptido NUE. De acuerdo con la presente invención, se inhibe la expresión de un polipéptido NUE si el nivel de proteínas del polipéptido NUE es menor que 70% del nivel de proteínas del mismo polipéptido NUE en una planta que no ha sido modificada genéticamente o mutagenizada para inhibir la expresión del polipéptido NUE. En realizaciones particulares de la invención, el nivel de proteínas del polipéptido NUE en una planta modificada de acuerdo con la invención es menor que 60%, menor que 50%, menor que 40%, menor que 30%, menor que 20%, menor que 10%, menor que 5%, o menor que 2% del nivel de proteínas del mismo polipéptido NUE en una planta que no es una muíante o que no ha sido modificada genéticamente para inhibir la expresión de dicho polipéptido NUE. Puede medirse el nivel de expresión del polipéptido NUE en forma directa, por ejemplo, evaluando el nivel de polipéptido NUE expresado en la célula vegetal o la planta, o indirecta, por ejemplo, midiendo la actividad de captación de nitrógeno del polipéptido NUE en la célula vegetal o la planta, o midiendo la cantidad de células en la planta. Se describen métodos para efectuar estos ensayos en otra parte de la presente documentación. En otras realizaciones de la invención, se reduce o se elimina la actividad de los polipéptidos NUE transformando una célula vegetal con un cásete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que inhibe la actividad de un polipéptido NUE. La actividad mejorada de unitilización de nitrógeno de un polipéptido NUE se inhibe de acuerdo con la presente invención si la actividad NUE del polipéptido NUE es menor que 70% de la actividad NUE del mismo polipéptido NUE en una planta que no ha sido modificada para inhibir la actividad NUE de dicho polipéptido NUE. En realizaciones particulares de la invención, la actividad NUE del polipéptido NUE en una planta modificada de acuerdo con la invención es menor que 60%, menor que 50%, menor que 40%, menor que 30%, menor que 20%, menor que 10%, o menor que 5% de la actividad NUE del mismo polipéptido NUE en una planta que no ha sido modificada para inhibir la expresión de dicho polipéptido NUE. La actividad NUE de un polipéptido NUE es "eliminada" de acuerdo con la invención cuando no es detectable con los métodos de ensayo descritos en otra parte en la presente. Los métodos de determinar la alteración de la actividad de utilización de nitrógeno de un polipéptido NUE se describen en otra parte de la presente. En otras realizaciones, la actividad de un polipéptido NUE puede ser reducida o eliminada por ruptura del gen que codifica al polipéptido NUE. La invención abarca plantas mutagenizadas que contienen mutaciones en los genes NUE, donde dichas mutaciones reducen la expresión del gen NUE o inhiben la actividad de utilización del nitrógeno del polipéptido NUE codificado. Por consiguiente, pueden usarse muchos métodos para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido NUE. Además, puede usarse más de un método para reducir la actividad de un único polipéptido NUE. 1. Métodos basados en polinucleótidos: En algunas realizaciones de la presente invención, se transforma una con un cásete de expresión que es capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de un polipéptido NUE de la invención. El término "expresión", como se lo usa en la presente documentación, hace referencia a la biosíntesis de un producto genético, incluyendo la transcripción y/o la traducción de dicho producto genético. Por ejemplo, para los propósitos de la presente invención, un cásete de expresión capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de al menos un polipéptido NUE es un cásete de expresión capaz de producir una molécula de ARN que inhibe la transcripción y/o la traducción de al menos un polipéptido NUE de la invención. La "expresión" o la "producción" de una proteína o un polipéptido a partir de una molécula de ADN hace referencia a la transcripción y la traducción de la secuencia codificante para producir la proteína o el polipéptido, al tiempo que la "expresión" o la "producción" de una proteína o un polipéptido a partir de una molécula de ARN hace referencia a la traducción de la secuencia codificante de ARN para producir la proteína o el polipéptido. A continuación se proporcionan ejemplos de polinucleótidos que inhiben la expresión de un polipéptido NUE. /'. Supresión en el sentido del marco de lectura/Cosupresión En algunas realizaciones de la invención, puede lograrse la inhibición de la expresión de un polipéptido NUE por supresión en el sentido del marco de lectura o cosupresión. Para la cosupresión, se diseña un cásete de expresión para expresar una molécula de ARN que corresponde a la totalidad o una parte de un ARN mensajero que codifica un polipéptido NUE en la orientación "del marco de lectura". La sobreexpresión de la molécula de ARN puede resultar en la expresión reducida del gen nativo. Por consiguiente, se analizan múltiples líneas de plantas transformadas con el cásete de expresión de cosupresión para identificar aquellas que presentan la mayor inhibición de la expresión del polipéptido NUE. El polinucleotido usado para la cosupresión puede corresponder a la totalidad o una parte de la secuencia que codifica el polipéptido NUE, la totalidad o una parte de la región 5' y/o 3' no traducida de un polipéptido de un transcripto NUE, o la totalidad o una parte de la secuencia codificante y las regiones no traducidas de un transcripto que codifica un polipéptido NUE. En algunas realizaciones donde el polinucleotido comprende la totalidad o una parte de la región codificante del polipéptido NUE, se diseña el cásete de expresión de modo de eliminar el codón inicial del polinucleotido para que no se traduzca el producto proteico.

Puede recurrirse a la cosupresión para inhibir la expresión de genes vegetales y producir plantas con niveles indetectables de proteínas para las proteínas codificadas por estos genes. Véase, por ejemplo Broin et al (2002) Plant Cell 14:1417-1432. También puede usarse la cosupresión para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos . N°: 5.942.657. Los métodos para usar cosupresión para inhibir la expresión de genes endógenos en plantas se describen en Flavell et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sel. EE.UU. 91 : 3490-3496; Jorgensen et al. (1996) Plant Mol. Blol. 31 : 957-973; Johansen y Carrington (2001 ) Plant Physiol. 126:930-938; Broin et al. (2002) Plant Cell 14: 1417-1432; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 1723-1731 ; Yu et al. (2003) Phytochemistry 63: 753-763; y las Patentes de los Estados Unidos . N°: 5.034.323, 5.283.184 y 5.942.657; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Puede incrementarse la eficiencia de la cosupresión incluyendo una región de pol¡-dT en el cásete de expresión, en una posición 3' de la secuencia en el sentido del marco de lectura y 5' de la señal de poliadenilación. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de los EEUU N° 20020048814, incorporada en la presente documentación a modo de referencia. Típicamente, una secuencia de nucleótidos como esta tiene una identidad de secuencia sustancial con la secuencia del transcripto del gen endógeno, en términos óptimos más que aproximadamente 65% de identidad de secuencia, en términos más óptimos más que aproximadamente 85% de identidad de secuencia, en términos más óptimos más que aproximadamente 95% de identidad de secuencia. Véase, las Patentes de los Estados Unidos . N°: 5283184 y 5034323; incorporadas en la presente documentación a modo de referencia. /'/'. Supresión antisentido En algunas realizaciones de la invención, puede lograrse la inhibición de la expresión del polipéptido NUE por supresión antisentido. Para efectuar la supresión antisentido, se diseña el cásete de expresión para que exprese una molécula de ARN complementaria con la totalidad o una parte de un ARN mensajero que comprenda una región que codifique el polipéptido NUE. La sobreexpresion de la molécula de ARN antisentido puede resultar en una expresión reducida del gen nativo. Por consiguiente, se analizan múltiples líneas de plantas transformadas con el cásete de expresión de supresión antisentido para identificar aquellas que presentan la mayor inhibición de la expresión del polipéptido NUE. El polinucleótido de uso en la supresión antisentido puede corresponder a todo o parte del complemento de la secuencia que codifica al polipéptido NUE, todo o parte del complemento de la región no traducida 5' y/o 3' del transcripto NUE o todo o parte del complemento de la secuencia de codificación y la regiones no traducidas de un transcripto que codifica al polipéptido NUE. Además, el polinucleótido antisentido puede ser completamente complementario (es decir, 100% idéntico al complemento de la secuencia blanco) o parcialmente complementario (es decir, menos que 100% idéntico al complemento de la secuencia blanco) con la secuencia blanco. Puede usarse la supresión antisentido para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta.

Véase, por ejemplo, la Patente de los EEUU N° 5942657. Además, pueden usarse porciones de los nucleótidos antisentido para interrumpir la expresión del gen blanco. En general, pueden usarse secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, 300, 400, 450, 500, 550 o más. Se describen métodos para usar la supresión antisentido con el objeto de inhibir genes endógenos en plantas por ejemplo, en Liu et al (2002) Plant Physiol. 1732-1743 y en las Patentes de los Estados Unidos . N°: 5.759.829 y 5.942.657, cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Puede incrementarse la eficiencia de la supresión antisentido incluyendo una región de poli-dT en el cásete de expresión, en una posición 3' de la secuencia antisentido y 5' de la señal de poliadenilación. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de los EEUU N° 20020048814, incorporada en la presente documentación a modo de referencia. /'/'/'. Interferencia con ARN de cadena doble En algunas realizaciones de la invención, podrá lograrse la inhibición de la expresión de un polipéptido NUE por medio de interferencia con ARN de cadena doble (dsARN). Para la interferencia con dsARN, se expresa en la misma célula una molécula de ARN en el sentido del marco de lectura, como aquella descripta previamente para la cosupresión, y una molécula de ARN antisentido, que es completa o parcialmente complementaria a la molécula de ARN en el sentido del marco de lectura, lo que resulta en la inhibición de la expresión del ARN mensajero endógeno correspondiente. Puede obtenerse la expresión de las moléculas en el sentido del marco de lectura y antisentido diseñando el cásete de expresión de modo que comprenda una secuencia en el sentido del marco de lectura y una secuencia antisentido. Como alternativa, pueden usarse cassettes de expresión separados para las secuencias en el sentido del marco de lectura y antisentido. Luego se analizan múltiples líneas de plantas transformadas con uno o más cassettes de expresión de interferencia de dsARN para identificar aquellas líneas de plantas que presentan la mayor inhibición de la expresión del polipéptido NUE. Se describen métodos para usar interferencia de dsARN para inhibir la expresión de genes vegetales endógenos en Waterhouse et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:13959-13964, Liu, et al., (2002) Plant Physiol 129:1732-1743, y WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631 y WO 00/49035; cada uno de los cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. iv. Interferencia con ARN en horquilla e interferencia con ARN en horquilla que contiene intrones En algunas realizaciones de la invención, puede efectuarse la inhibición de la expresión de un polipéptido NUE por interferencia con ARN en horquilla (hpARN) o interferencia con ARN en horquilla que contiene intrones (ihpARN). Estos métodos son muy eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos. Véase Waterhouse y HelliweII (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38 y las referencias citadas en dicha publicación. Para realizar la interferencia de hpARN, se diseña un cásete de expresión que puede expresar una molécula de ARN que hibridiza consigo misma para formar una estructura en horquilla, la cual comprende un rizo de cadena simple y un tallo de bases apareadas. En algunas realizaciones, la región de tallo con bases apareadas comprende una secuencia en el sentido del marco de lectura que corresponde a la totalidad o una parte del ARN mensajero endógeno que codifica el gen cuya expresión se desea inhibir, y una secuencia antisentido que es completa o parcialmente complementaria con la secuencia en el sentido del marco de lectura. Como alternativa, la región de tallo con bases apareadas puede corresponder a una porción de una secuencia promotora que controla la expresión del gen a inhibir. Por consiguiente, la región de tallo con bases apareadas de la molécula generalmente determina la especificidad de la interferencia del ARN. Las moléculas de hpARN son muy eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos, y la interferencia de ARN que inducen es heredada por las generaciones de plantas subsiguientes. Véanse, por ejemplo, Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731 ; y Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Se describen métodos para usar interferencia de hpARN para inhibir o silenciar la expresión de genes, por ejemplo, en Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al. , (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731 ; Waterhouse and Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini et al., BMC Biotechnology 3:7, y la Publicación de Patente de los EEUU N° 2003/0175965,; cada uno de los cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. En Panstruga, et al., (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140, que se incorpora como referencia, se describe un ensayo transitorio de la eficiencia de las construcciones de ARNhp para silenciar la expresión genética in vivo. Para el ihpARN, las moléculas de interferencia tienen la misma estructura general que para el hpARN, pero la molécula de ARN comprende adicionalmente un intrón que puede cortarse en la célula donde se expresa el ihpARN. El uso de un intrón minimiza el tamaño del rizo en la molécula en horquilla después del corte, y esto incrementa la eficiencia de la interferencia. Véase, por ejemplo, Smith et al. (2000) Nature 407:319-320. De hecho, Smith et al. demostraron un 100% de supresión de la expresión del gen endógeno usando interferencia mediada por ¡ARNhp. Los métodos para usar la interferencia con ARNhi para inhibir la expresión de genes endógenos vegetales se describen, por ejemplo, en Smith et al. (2000) Nature 407:319-320; Wesley et al. (2001 ) Plant J. 27:581-590; Wang y Waterhouse (2001 ) Curr. Opin. Planta Biol. 5:146-150; Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell y Waterhouse (2003) Methods 30:289-295, y la Publicación de Patente de los EEUU N° 2003/0180945, cada uno de los cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. El cásete de expresión para efectuar la interferencia con hpARN puede estar diseñado de modo tal que la secuencia en el sentido del marco de lectura y la secuencia antisentido no correspondan a ARN endógeno. En esta realización, las secuencias en el sentido del marco de lectura y antisentido rodean una secuencia de rizo que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a la totalidad o una parte del ARN mensajero endógeno del gen blanco. Por consiguiente, es la región del rizo la que determina la especificidad de la interferencia de ARN. Véase, por ejemplo, WO 02/00904; Mette, et al., (2000) EMBO J 19:5194-5201 ; Matzke, et al., (2001 ) Curr. Opin. Genet. Devel. 11 :221-227; Scheid, et al., (2002) Proc. Nati. Acad. Sci., USA 99:13659-13662; Aufsaftz, et al., (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. 99(4):16499-16506; Sijen et al., Curr. Biol. (2001 ) 11 :436-440), incorporados en la presente documentación a modo de referencia. v. Interferencia mediada por amplicones Los casetes de expresión de amplicones comprenden una secuencia derivada de un virus vegetal que contiene la totalidad o una parte del gen blanco, pero generalmente no todos los genes del virus nativo. Las secuencias virales presentes en el producto de transcripción del cásete de expresión permiten que el producto de transcripción dirija su propia replicación. Los transcriptos producidos por el amplicón pueden estar en el sentido del marco de lectura o antisentido respecto de la secuencia blanco (es decir, el ARN mensajero del polipéptido NUE). Se describen métodos para usar amplicones para inhibir la expresión de genes vegetales endógenos, por ejemplo, en Angelí y Baulcombe (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angelí y Baulcombe (1999) Plant J. 20:357-362, y la Patente de los EEUU N° 6646805, cada uno de los cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. vi. Ribozimas En algunas realizaciones, el polinucleótido expresado por el cásete de expresión de la invención es un ARN catalítico o tiene una actividad de ribozima específica para el ARN mensajero del polipéptido NUE. Por consiguiente, el polinucleótido provoca la degradación del ARN mensajero endógeno, lo que resulta en una expresión reducida del polipéptido NUE. Este método se describe, por ejemplo, en la Patente de los EEUU N° 4987071 , incorporada en la presente documentación a modo de referencia. vii. Interferencia con ARN pequeño o micro ARN En algunas realizaciones de la invención, puede lograrse la inhibición de la expresión de un polipéptido NUE por interferencia con ARN, mediante la expresión de un gen que codifica un micro ARN (miARN). Los miARN son agentes reguladores que consisten en aproximadamente 22 ribonucleótidos. Los miARN son altamente eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos. Véase, por ejemplo, Javier, et al., (2003) Nature 425:257-263, que se incorpora como referencia. Para efectuar la interferencia con miARN, se diseña el cásete de expresión de modo que exprese una molécula de ARN modelada en un ARNm de un gen endógeno. El gen de miARN codifica un ARN que forma una estructura de horquilla que contiene una secuencia de 22 nucleótidos que es complementaria con otro gen endógeno (secuencia blanco). Para suprimir la expresión de NUE, la secuencia de 22 nucleótidos se selecciona entre una secuencia de un transcripto NUE y contiene 22 nucleótidos de dicha secuencia NUE en la orientación del marco de lectura y 21 nucleótidos de una secuencia antisentido correspondiente que es complementaria con la secuencia en el sentido del marco de lectura. Las moléculas de miARN son muy eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos, y la interferencia de ARN que inducen es heredada por generaciones subsiguientes de las plantas. 2. Inhibición de la expresión de genes basada en polipéptidos En una realización, el polinucleótido codifica una proteína de dedos de cinc que se une a un gen que codifica un polipéptido NUE, lo que resulta en una expresión reducida del gen. En realizaciones particulares, la proteína de dedos de cinc se une a una región reguladora de un gen NUE. En otras realizaciones, la proteína de dedos de cinc se une a un ARN mensajero que codifica un polipéptido NUE y evita su traducción. Se describen métodos para seleccionar sitios para dirigir proteínas de dedos de cinc, por ejemplo, en la Patente de los EEUU N° 6453242, y métodos para usar proteínas de dedos de cinc en la inhibición de la expresión de genes en plantas, por ejemplo, en la Publicación de Patente de los EEUU N° 2003/0037355; cada una de las cuales se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. 3. Inhibición de la actividad proteica basada en polipéptidos En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido codifica un anticuerpo que se una a al menos un polipéptido NUE y reduce la actividad aumentada de utilización de nitrógeno del polipéptido NUE. La unión del anticuerpo resulta en el recambio incrementado del complejo de anticuerpo-NUE por los mecanismos celulares de control de calidad. La expresión de anticuerpos en células vegetales y la inhibición de vías moleculares mediante la expresión y la unión de anticuerpos a proteínas en células vegetales son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Conrad y Sonnewald (2003) Nature Biotech. 21 :35-36, incorporado en la presente documentación a modo de referencia. 4. Alteración de genes En algunas realizaciones de la presente invención, se reduce o elimina la actividad de un polipéptido NUE interrumpiendo al gen que codifica el polipéptido NUE. Puede alterarse el gen que codifica el polipéptido NUE empleando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, en una realización se altera el gen efectuando una marcación con transposones. En otra realización, el gen es interrumpido por mutaciones en las plantas usando mutagénesis aleatoria o dirigida, y seleccionando las plantas que presentan una menor actividad de utilización del nitrógeno. /. Marcación con transposones En una realización de la invención, se usa una marcación con transposones para reducir o eliminar la actividad de NUE de uno o más polipéptidos NUE. La marcación con transposones comprende insertar un transposón en un gen NUE endógeno para reducir o eliminar a expresión del polipéptido NUE. Un "gen NUE" designa el gen que codifica un polipéptido NUE de acuerdo con la invención. En esta realización, se reduce o se elimina la expresión de uno o más polipéptidos NUE insertando un transposón dentro de una región reguladora o una región codificante del gen que codifica el polipéptido NUE. Puede usarse un transposón que está dentro de un exón, un intrón, una secuencia 5' o 3' no traducida, un promotor, o cualquier otra secuencia reguladora de un gen NUE para reducir o eliminar la expresión y/o la actividad del polipéptido NUE codificado.

Los métodos para efectuar la marcación con transposones de genes específicos en plantas son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Maes et al. (1999) Trends Plant Sci. 4:90-96; Dharmapuri y Sonti, (1999) FEMS Microbiol. Leti. 179:53-59; Meissner, et al., (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat, et al., (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot, (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 2:103-107; Gai, et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28:94-96; Fitzmaurice, et al., (1999) Genetics 153:1919-1928). Además, el proceso TUSC para seleccionar inserciones My en genes seleccionados, ha sido descrito en Bensen, et al., (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena, et al., (1996) Science 274:1537-1540; Patente de los EEUU Nro 5,962,764; ambos incorporados como referencia. //'. Plantas mutantes con actividad reducida En la técnica también se conocen otros métodos para disminuir o eliminar le expresión de genes endógenos en plantas, y puede aplicárselos de forma similar en la presente invención. Estos métodos incluyen otras formas de mutagénesis, tales como la mutagénesis inducida por metansulfonato de etilo, la mutagénesis por deleción y la mutagénesis por deleción con neutrones rápidos, usada en un sentido de genética inversa (con PCR) para identificar líneas de plantas donde se ha eliminado el gen endógeno. Para consultar ejemplos de estos métodos, véase Ohshima, et al., (1998) Virology 243:472-481 ; Okubara, et al., (1994) Genetics 137:867-874; y Quesada, et al., (2000) Genetics 154:421-436; todos los cuales se incorporan a la presente como referencia. Además, en la presente invención también puede aplicarse un método rápido y automatizado para efectuar mutaciones inducidas por sustancias químicas, TILLING (Direccionamiento de Lesiones Locales Inducidas En Genomas), usando HPLC desnaturalizante o digestión selectiva con endonucleasas de productos de PCR seleccionados. Véase McCallum et al (2000) Nal Biotechnol. 18:455-457, incorporado en la presente documentación a modo de referencia. Las mutaciones que afectan la expresión genética o interfieren con la función de la proteína codificada (aumento de la actividad de utilización del nitrógeno) son bien conocidas en la técnica. Las mutaciones de inserción en exones de genes comúnmente resultan en mutantes nulas. Las mutaciones en los residuos conservados son particularmente eficaces para inhibir la actividad de la proteína codificada. Se han descrito residuos conservados de los polipéptidos NUE vegetales adecuados para una mutagénesis con la finalidad de eliminar la actividad NUE. Estas mutantes pueden aislarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos, y pueden agruparse mutaciones en distintos loci NUE mediante cruzamientos genéticos. Véase, por ejemplo, Gruis, et al., (2002) Plant Cell 14:2863-2882. En otra realización de esta invención, pueden usarse mutantes dominantes para efectuar el silenciamiento de ARN debido a la inversión genética y la recombinación del locus de un gen duplicado. Véase, por ejemplo, Kusaba, et al., (2003) Plant Cell 15:1455-1467. La invención comprende métodos adicionales para reducir o eliminar la actividad de uno o más polipéptidos NUE. En la técnica se conocen ejemplos de otros métodos para alterar o mutar una secuencia de nucleótidos genómica en una planta, e incluyen, sin limitaciones, el uso de vectores de ARN: ADN, vectores de mutación de ARN: ADN, vectores de reparación de ARN: ADN, oligonucleótidos con dobletes mixtos, oligonucleótidos de ARN: ADN auto-complementarios y oligonucleobases recombinogénicas. Dichos vectores y métodos de uso son conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos . N°: 5.565.350; 5.731.181 ; 5.756.325; 5.760.012; 5.795.972; y 5.871.984; cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia. Véase también, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821 , y Beetham, et al., (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:8774-8778; cada una de las cuales se incorpora a la presente a modo de referencia. /'/'/'. Actividad de modulación de la utilización de nitrógeno En métodos específicos, se disminuye el nivel y/o la actividad de un regulador NUE en una planta incrementando el nivel o la actividad del polipéptido NUE en la planta. La expresión aumentada de una molécula reguladora negativa puede disminuir el nivel de expresión uno o dos genes aguas debajo de los genes responsables de un fenotipo NUE mejorado. Se describen métodos para incrementar el nivel y/o la actividad de polipéptidos NUE en una planta en otra parte de la presente documentación. Brevemente, estos métodos comprenden introducir un polipéptido NUE de la invención en una planta para incrementar el nivel y/o la actividad del polipéptido NUE. En otras realizaciones, se proporciona una secuencia de nucleótidos NUE, que codifica un polipéptido NUE, introduciendo en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la invención, expresando la secuencia NUE, incrementando la actividad del polipéptido NUE, y disminuyendo de este modo la cantidad de células en los tejidos o en otras partes de la planta. En otras realizaciones, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora en forma estable en el genoma de la planta.

En otros métodos, se incrementa el crecimiento de un tejido vegetal disminuyendo el nivel y/o la actividad del polipéptido NUE en la planta. Estos métodos se describen con mayor detalle en otra parte de la presente documentación. En uno de estos métodos, se introduce una secuencia de nucleótidos NUE en la planta, y la expresión de dicha secuencia de nucleótidos NUE disminuye la actividad del polipéptido NUE e incrementa de este modo el crecimiento del tejido en la planta o la parte de la planta. En otras realizaciones, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora en forma estable en el genoma de la planta. Como se describió precedentemente, el especialistas podrá reconocer el promotor apropiado para su uso para modular el nivel/actividad de un NUE en una planta. Se han descripto ejemplos de promotores para esta realización en otra parte de la presente documentación. En otras realizaciones, estas plantas tienen una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la invención, unida operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal, incorporada en forma estable en su genoma. iv. Modulación del desarrollo de la raíz Se proporcionan métodos para modular el desarrollo de la raíz en una planta. La "modulación desarrollo de la raíz" designa cualquier alteración en el desarrollo de la raíz de la planta en comparación con una planta control. Estas alteraciones en el desarrollo de la raíz incluyen, sin limitaciones, alteraciones en la velocidad de crecimiento de la raíz primaria, el peso fresco de la raíz, la extensión de formación de raíces laterales y adventicias, el sistema de la vasculatura, el desarrollo de meristemas, o la expansión radial. Se proporcionan métodos para modular el desarrollo de la raíz en una planta. Los métodos comprenden modular el nivel y/o la actividad del polipéptido NUE en la planta. En un método, se proporciona una secuencia NUE de la invención a la planta. En otro método, la secuencia de nucleótidos NUE se proporciona introduciendo en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la invención, expresando la secuencia NUE y modificando de este modo el desarrollo de la raíz. En aún otros métodos, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta es incorporada de forma estable en el genoma de la planta. En otros métodos, se modula el desarrollo de la raíz alterando el nivel o la actividad del polipéptido NUE en la planta. Un cambio en la actividad NUE puede ocasionar al menos uno o más de las siguientes alteraciones del desarrollo de la raíz, que incluyen, no taxativamente, las alteraciones en la biomasa y longitud radicular. Como se lo usa en la presente documentación, el "crecimiento de la raíz" abarca todos los aspectos del crecimiento de las distintas partes que forman el sistema radicular en las distintas etapas de su desarrollo, en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Debe comprenderse que el crecimiento mejorado de la raíz puede ser el resultado del crecimiento mejorado de una o más de sus partes, incluyendo la raíz primaria, las raíces laterales, las raíces adventicias, etcétera.

En la técnica se conocen métodos para medir estas alteraciones en el desarrollo del sistema radicular. Véanse, por ejemplo, la Solicitud de los EEUU N° 2003/0074698 y Werner et a/.(2001 ) PNAS 18:10487-10492, que se incorporan a la presente a modo de referencia. Como se describió previamente, aquellos entrenados en la técnica reconocerán los promotores apropiados para usar en la modulación del desarrollo de la raíz en la planta. Los ejemplos de promotores para esta realización incluyen promotores constitutivos y promotores con preferencia por las raíces. Se han descripto ejemplos de promotores con preferencia por las raíces en otra parte de la presente documentación. La estimulación del crecimiento de las raíces y el incremento de la masa radicular mediante la disminución de la actividad y/o el nivel del polipéptido NUE también pueden usarse en el mejoramiento de la verticalidad de una planta. El término "resistencia al vuelco" o " verticalidad" hace referencia a la capacidad de una planta de fijarse en la tierra. Para las plantas con un hábito de crecimiento erecto o semi-erecto, este término también hace referencia a la capacidad de mantener una posición erecta bajo condiciones (ambientales) adversas. Este carácter se relaciona con el tamaño, la profundidad y la morfología del sistema radicular. Además, también puede usarse la estimulación del crecimiento radicular y el incremento de la masa radicular mediante la alteración del nivel y/o la actividad del polipéptido NUE en la promoción de la propagación in vitro de los explantes. Además, la mayor producción de biomasa radicular debida a la actividad de NUE tiene un efecto directo sobre el rendimiento y un efecto indirecto sobre la producción de los compuestos generados por las células de las raíces, o por cultivos de células obtenidas a partir de dichas raíces transgénicas. Un ejemplo de un compuesto interesante producido en cultivos de raíces es la shikonina, cuyo rendimiento puede ser ventajosamente mejorado empleando dichos métodos. Por consiguiente, la presente invención provee adicionalmente plantas que presentan un desarrollo de la raíz modulado, en comparación con el desarrollo de la raíz de una planta control. En algunas realizaciones, la planta de la invención presenta un mayor nivel/actividad del polipéptido NUE de la invención, y tiene un crecimiento radicular y/o una biomasa radicular mejorada. En otras realizaciones, estas plantas tienen una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la invención, unida operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal, incorporada en forma estable en su genoma. v. Modulación del desarrollo de los brotes y las hojas También se proporcionan métodos para modular el desarrollo de los brotes y las hojas en una planta. La "modulación del desarrollo de los brotes y/o las hojas" designa cualquier alteración en el desarrollo de los brotes y/o las hojas de la planta. Estas alteraciones en el desarrollo de los brotes y/o las hojas incluyen, sin limitaciones, alteraciones en el desarrollo de los meristemas de los brotes, la cantidad de hojas, el tamaño de las hojas y la vasculatura del tallo, la longitud de los internodos, y la senescencia de las hojas. Como se lo usa en la presente documentación, el "desarrollo de las hojas" y el "desarrollo de los brotes" abarcan todos los aspectos del crecimiento de las distintas partes que forman el sistema foliar y el sistema de los brotes, respectivamente, en las distintas etapas de su desarrollo, en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. En la técnica se conocen métodos para medir estas alteraciones en el desarrollo del sistema de brotes y hojas. Véanse, por ejemplo Werner et a/.(2001 ) PNAS 98:10487-10492, y la Solicitud de los EEUU No. 2003/0074698 que se incorporan a la presente a modo de referencia. El método para modular el desarrollo de los brotes y/o las hojas en una planta comprende modular la actividad y/o el nivel de un polipéptido NUE de la invención. En una realización, se proporciona una secuencia NUE de la invención. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos NUE puede proporcionarse introduciendo en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la invención, expresando la secuencia NUE, y modificando de este modo el desarrollo de los brotes y/o las hojas. En otras realizaciones, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora en forma estable en el genoma de la planta. En realizaciones específicas, se modula el desarrollo de brotes o de hojas incrementando el nivel y/o la actividad del polipéptido NUE en la planta. Un incremento en la actividad de NUE puede resultar en al menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo de los brotes y/o las hojas, incluyendo, sin limitaciones, menor cantidad de hojas, menor superficie foliar, sistema vascular reducido, internodos más cortos y crecimiento acortado, y senescencia demorada de las hojas, en comparación con una planta control.

Como se describió previamente, aquellos entrenados en la técnica reconocerán los promotores apropiados para usar en la modulación del desarrollo de los brotes y las hojas de la planta. Los ejemplos de promotores para esta realización incluyen promotores constitutivos, promotores con preferencia por los brotes, promotores con preferencia por los meristemas de los brotes y promotores con preferencia por las hojas. Se han descripto ejemplos de promotores en otra parte de la presente documentación. El incremento de la actividad y/o el nivel de NUE en una planta resulta en internodos y crecimiento modificados. Por consiguiente, los métodos de la invención pueden usarse para producir plantas modificadas. Además, como se describió previamente, la actividad de NUE en la planta modula el crecimiento de las raíces y los brotes. Por consiguiente, la presente invención provee adicionalmente métodos para alterar la relación raíces/brotes. Puede modularse adicionalmente el desarrollo de los brotes o las hojas alterando el nivel y/o la actividad del polipéptido NUE en la planta. Por consiguiente, la presente invención provee adicionalmente plantas que presentan un desarrollo modulado de los brotes y/o las hojas, en comparación con una planta control. En algunas realizaciones, la planta de la invención tiene un mayor nivel/actividad del polipéptido NUE de la invención. En otras realizaciones, la planta de la invención presenta un menor nivel/actividad del polipéptido NUE de la invención. vi. Modulación del desarrollo de los tejidos reproductivos Se proporcionan métodos para modular el desarrollo de los tejidos reproductivos. En una realización, se proporcionan métodos para modular el desarrollo floral en una planta. La "modulación del desarrollo floral" designa cualquier alteración en la estructura de un tejido reproductivo de la planta, en comparación con una planta control en que no se ha modulado la actividad o el nivel del polipéptido NUE. Además, la "modulación del desarrollo floral" incluye cualquier alteración en el cronograma de desarrollo del tejido reproductivo de la planta (es decir, un cronograma de desarrollo floral demorado o acelerado), en comparación con una planta control en que no se ha modulado la actividad o el nivel del polipéptido NUE. Las alteraciones macroscópicas pueden incluir cambios en el tamaño, la forma, la cantidad o la localización de los órganos reproductivos, el período de tiempo de desarrollo en que se forman estas estructuras, o la capacidad de mantener o proceder con el proceso de florecimiento en momentos de estrés ambiental. Las alteraciones microscópicas pueden incluir cambios en los tipos o las formas de las células que componen los órganos reproductivos. El método para modular el desarrollo floral en una planta comprende modular la actividad de NUE en una planta. En un método, se proporciona una secuencia NUE de la invención. Una secuencia de nucleotidos NUE puede proporcionarse introduciendo en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleotidos NUE de la invención, expresando la secuencia NUE y modificando de este modo desarrollo floral. En otras realizaciones, la construcción de nucleotidos NUE introducida en la planta se incorpora en forma estable en el genoma de la planta.

En métodos específicos, se modula el desarrollo floral incrementando el nivel o la actividad del polipéptido NUE en la planta. Un incremento en la actividad de NUE puede resultar en al menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo floral, incluyendo, sin limitaciones, un florecimiento alterado, una cantidad modificada de flores, esterilidad masculina modificada y producción de semillas modificada, en comparación con una planta control. Puede usarse la inducción de un florecimiento demorado o la inhibición del florecimiento para mejorar el rendimiento en cultivos de forrajeo, tales como alfalfa. En el arte se conocen métodos para medir dichas alteraciones en el desarrollo flora. Véase, por ejemplo, Mouradov, et al., (2002) The Plant Cell S11 1-S130, que se incorpora a la presente como referencia. Como se describió previamente, aquellos entrenados en la técnica reconocerán los promotores apropiados para usar en la modulación del desarrollo floral de la planta. Los ejemplos de promotores para esta realización incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores con preferencia por los brotes, y promotores con preferencia por las inflorescencias. En otros métodos, se modula el desarrollo floral alterando el nivel y/o la actividad de la secuencia NUE de la invención. Estos métodos pueden comprender introducir una secuencia de nucleotidos NUE en la planta y nodificar la actividad del polipéptido NUE. En otros métodos, la construcción de nucleotidos NUE introducida en la planta se incorpora en forma estable en el genoma de la planta. La alteración de la expresión de la secuencia NUE de la invención puede modular el desarrollo floral durante los períodos de estrés. Estos métodos se describen en otra parte de la presente documentación. Por consiguiente, la presente invención provee adicionalmente plantas que tienen un desarrollo floral modulado, en comparación con el desarrollo floral de una planta control. Las composiciones incluyen plantas que tienen un nivel/actividad modificados del polipéptido NUE de la invención, y que presentan un desarrollo floral alterado. Las composiciones también incluyen plantas que tienen un menor nivel/actividad del polipéptido NUE de la invención, donde la planta mantiene o prosigue a través del proceso de florecimiento en los momentos de estrés. También se proporcionan métodos para usar las secuencias NUE de la invención para incrementar el tamaño y/o el peso de las semillas. El método comprende incrementar la actividad de las secuencias NUE en una planta o una parte de una planta, tal como la semilla. Un incremento en el tamaño y/o el peso de las semillas comprende un tamaño o un peso mayor de las semillas, y/o un incremento en el tamaño o el peso de una o más partes de las semillas, incluyendo, por ejemplo, el embrión, el endosperma, el recubrimiento de las semillas, la aleurona o el cotiledón. Como se describió previamente, aquellos entrenados en la técnica reconocerán los promotores apropiados para usar en el incremento del tamaño y/o el peso de las semillas. Los ejemplos de promotores de esta realización incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores con preferencia por las semillas, promotores con preferencia por los embriones y promotores con preferencia por el endosperma. El método para alterar el tamaño de la semilla y/o el peso de la semilla en una planta comprende incrementar la actividad de NUE en la planta. En una realización, la secuencia de nucleótidos NUE puede proporcionarse introduciendo en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la invención, expresando la secuencia NUE, y disminuyendo de este modo el peso y/o el tamaño de las semillas. En otras realizaciones, la construcción de nucleótidos NUE introducida en la planta se incorpora en forma estable en el genoma de la planta. Se reconoce adicionalmente que también puede obtenerse el incremento en el tamaño y/o el peso de las semillas incrementando la velocidad de crecimiento de los retoños o incrementando el vigor temprano. Como se lo usa en la presente documentación, el término "vigor temprano" hace referencia a la capacidad de una planta de crecer rápidamente durante el desarrollo temprano, y se relaciona con el establecimiento exitoso, después de la germinación, de un sistema radicular bien desarrollado y un aparato fotosintético bien desarrollado. Además, un incremento en el tamaño y/o el peso de las semillas también puede resultar en un incremento en el rendimiento de la planta, en comparación con un control. Por consiguiente; la presente invención provee adicionalmente plantas que tienen un mayor peso de las semillas y/o un mayor tamaño de las semillas, en comparación con una planta control. En otras realizaciones, también se proporcionan plantas que tienen un mayor vigor y un mayor rendimiento. En algunas realizaciones, la planta de la invención presenta un nivel/actividad modificados del polipéptido NUE de la invención y posee un mayor peso de semillas y/o tamaño de semillas. En otras realizaciones, estas plantas tienen una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos NUE de la invención, unida operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal, incorporada en forma estable en su genoma. vii. Método de Uso de un polinucleótido NUE, casetes de expresión y polinucleótidos adicionales Los nucleótidos, casetes de expresión y métodos descriptos en la presente documentación son útiles para regular la expresión de cualquier secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta huésped, con el objeto de alterar el fenotipo de una planta. Son de interés varios cambios en el fenotipo, incluyendo la modificación de la composición de ácidos grasos en una planta, la alteración del contenido de ácidos grasos de una planta, la alteración del mecanismo de defensa a patógenos de la planta, y semejantes. Pueden obtenerse estos resultados proporcionando la expresión de productos heterólogos o incrementando la expresión de productos endógenos en plantas. Como alternativa, pueden obtenerse los resultados provocando una reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, particularmente enzimas o cofactores, en la planta. Estos cambios resultan en un cambio en el fenotipo de la planta transformada. Los genes de interés reflejan los mercados comerciales y los intereses de aquellos que participan en el desarrollo de los cultivos. Los cultivos y los mercados de interés cambian, y, a medida que las naciones en desarrollo se abren a los mercados mundiales, también emergen nuevos cultivos y tecnologías.

Además, a medida que crece el conocimiento de caracteres y características agronómicas, tales como el rendimiento y la heterosis, varía la selección de genes a transformar en forma concordante. Las categorías generales de genes de interés incluyen, por ejemplo, aquellos genes que participan en la información, tales como los dedos de cinc, aquellos que participan en la comunicación, tales como quinasas, y aquellos que participan en el mantenimiento, tales como las proteínas de ataque calórico. Las categorías de transgenes más específicos incluyen, por ejemplo, genes que codifican caracteres de importancia agrícola, resistencia a insectos, resistencia enfermedades, resistencia a herbicidas, esterilidad, características de los granos y productos comerciales. En general, los genes de interés incluyen aquellos que participan en el metabolismo de aceites, almidón, hidratos de carbono o nutrientes, así como aquellos que afectan el tamaño de los granos, la carga de sacarosa, y semejantes. En determinadas realizaciones, las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención pueden usarse en combinación ("agrupadas") con otras secuencias de polinucleótidos de interés, con el fin de crear plantas con un fenotipo deseado. Las combinaciones generadas pueden incluir múltiples copias de cualquiera de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de la presente invención pueden combinarse con cualquier gen o combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de caracteres, incluyendo, sin limitaciones, caracteres deseables para alimentos para animales, tales genes que confieren un contenido elevado de aceite (por ejemplo, Patente de los EEUU N° 6232529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordotioninas (Patentes de los EEUU N° 5990389, 5885801 , 5885802 y 5703409); cebada rica en lisina (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; y WO 98/20122); y proteínas ricas en metionina (Pedersen, et al., (1986) J. Biol. Chem. 261 :6279; Kirihara, et al., (1988) Gene 71 :359; and Musumura, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); mayor digeribilidad (por ejemplo almacenamiento modificado (Solicitud de los Estados Unidos No. 10/053,410, presentada el 7 de noviembre de, 2001 ); y tiorredoxinas (Solicitud de los Estados Unidos No. 10/005,429, presentada el 3 de diciembre de 2001 )), cuyo contenido se incorpora a la presente por referencia. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden apilar con características deseables para resistencia a insectos, enfermedades o herbicidas (por ejemplo, proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (Patentes de los Estados Unidos . N°: 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881 ; Geiser et al., (1986) Gene 48:109); lectinas (Van Damme et al., (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); genes de detoxificación de fumonisina (Patente de los Estados Unidos . N°: 5.792.931 ); genes de avirulencia y resistencia a enfermedades (Jones et al., (1994) Science 266:789; Martin et al., (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al., (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintetasa (ALS) que conducen a resistencia a herbicidas, tal como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintetasa tal como fosfinotricina o Basta (por ejemplo, el gen bar); y resistencia a glifosato (gen EPSPS)); y características deseables para el procesamiento o los productos de procesos tal como alto contenido de aceites (por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos . N°: 6.232.529 ); aceites modificados (por ejemplo, genes de ácido graso desaturasas (Patente de los Estados Unidos . N°: 5.952.544; WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPasa), almidón sintetasas (SS), enzimas ramificadoras de almidón (SBE) y enzimas desramificadoras de almidón (SDBE)); y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos . N°: 5.602.321 ; beta-cetotiolasa, polihidroxibutirato sintetasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert et al., (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilita la expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs)), cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia.. También se podrían combinar los polinucleótidos de la presente invención con los polinucleótidos que afectan características agronómicas, tal como esterilidad masculina {por ejemplo, véase la Patente de los Estados Unidos . N°: 5.583.210), longitud de tallos, momento de floración o características de tecnología de transformación tal como regulación del ciclo celular o direccionamiento de genes (por ejemplo, WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821 ), cuyos contenidos se incorporan en este documento a modo de referencia.. En una realización, las secuencias de interés mejoran el crecimiento de la planta y/o el rendimiento del cultivo. Por ejemplo, las secuencias de interés incluyen genes de importancia agrícola que resultan en sistemas de raíces primarias o laterales mejorados. Estos genes incluyen, sin limitaciones, transportadores de nutrientes/agua e inductores del crecimiento. Los ejemplos de dichos genes, incluyen en un sentido no limitativo, H+-ATPasa de membrana plasmática de maíz (MHA2) (Frias et al., (1996) Plañí Cell 8:1533-44); AKT1 , un componente del aparato de captación de potasio en Arabidopsis, (Spalding et al., (1999) J Gen Physiol ÍÍ3:909-18); genes RML que activan el ciclo de división celular en las células apicales de raíz (Cheng et al. (1995) Plant Physiol 108:881 ); genes de glutamina sintetasa de maíz (Sukanya et al., (1994) Plant Mol Biol 26:1935-46) y hemoglobina (Duff et al., (1997) J. Biol. Chem 27:16749-16752, Arredondo-Peter et al., (1997) Plant Physiol. 11 :1259-1266; Arredondo-Peter et al., (1997) Plant Physiol 174:493-500 y las referencias citadas en las mismas). La secuencia de interés también puede ser útil para expresar secuencias de nucleótidos antisentido de genes que afectan negativamente el desarrollo de la raíz. Además, pueden alterarse caracteres de importancia agrícola, tales como el contenido de aceite, almidón y proteínas, por modificación genética, además del uso de métodos de cruzamiento tradicionales. Las modificaciones incluyen el incremento del contenido de ácido oleico, aceites saturados e insaturados, niveles incrementados de lisina y azufre, proporción de aminoácidos esenciales, y también la modificación del almidón. Las modificaciones de la proteína hordotionina se describen en las Patentes de los Estados Unidos . N°: 5.703.049, 5.885.801 , 5.885.802 y 5.990.389, incorporadas en este documento a modo de referencia. Otro ejemplo es la proteína de semilla rica en lisina y/o azufre codificada por 2S albúmina de soja descrito en la Patente de los Estados Unidos . N°: 5.850016, y el inihbidor de quimotripsina de cebada, descrito en Williamson et al., (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Pueden prepararse derivados de las secuencias codificantes mediante mutagénesis dirigida a sitios específicos para incrementar el nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipéptido codificado. Por ejemplo, el gen que codifica el polipéptido rico en lisina de cebada (BHL) deriva del inhibidor de quimiotripsina de cebada, Solicitud de los EEUU con N° de Orden 08/740682, presentada el 1o de Noviembre de 1996, y WO 98/20133, cuyas descripciones se incorporan en la presente documentación a modo de referencia. Otras proteínas incluyen proteínas vegetales ricas en metionina tales como de semilla de girasol (Lilley et al., (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utllization in Human Foods and Animal Feedstuffs, ed. Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), págs. 497-502; incorporada en la presente a modo de referencia); de maíz (Pedersen et al., (1986) J. Biol. Chem. 261 :6279; Kirihara et al., (1988) Gene 71 :359; cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia); y de arroz (Musumura et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:123, incorporada en la presente a modo de referencia). Otros genes de importancia agrícola codifican látex, Floury 2, factores de crecimiento, factores de almacenamiento en semillas y factores de transcripción. Los genes de resistencia a insectos pueden codificar resistencia a plagas que producen grandes mermas en el rendimiento, tales como la oruga de la raíz, la oruga cortadora, el taladro del maíz europeo y semejantes. Dichos genes incluyen, por ejemplo genes de las proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (Patentes de los EEUU N° 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881 ; y Geiser, et al., (1986) Gene 48:109); y similares. Los genes que codifican características de resistencia a enfermedades pueden incluir: genes de desintoxicación, tal como contra fumonisina (Patente de los Estados Unidos . N°: 5.792.931 ); genes de avirulencia (avr) y genes de resistencia a enfermedades (R) (Jones et al., (1994), Science 266: 789; Martin et al., (1993) Science 262: 1432; Mindrinos et al., (1994), Cell 78:1089); y semejantes. Los caracteres de resistencia a herbicidas pueden incluir genes que codifican resistencia a los herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la acetolactato sintetasa (ALS), en particular los herbicidas tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de acetolactato sintetasa (ALS) que contiene mutaciones que permiten obtener dicha resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra), genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la glutamina sintetasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), u otros genes como los mencionados conocidos en la técnica. El gen bar codifica resistencia al herbicida basta, el gen nptll codifica resistencia a los antibióticos kanamicina y geneticina, y las mutantes del gen ALS codifican resistencia al herbicida clorsulfurón. También puede haber genes de esterilidad codificados en un cásete de expresión, los cuales proporcionan una alternativa a la remoción física de espigas. Los ejemplos de genes usados de estas formas incluyen genes con preferencia por los tejidos masculinos y genes con fenotipos de esterilidad masculina, tales como QM, descripto en la Patente de los EEUU N° 5583210. otros genes incluyen quinasas y aquellos que codifican compuestos tóxicos para el desarrollo de los gametofitos masculinos o femeninos.

La calidad del grano se ve reflejada en caracteres tales como, por ejemplo, los niveles y los tipos de aceite, saturados o ¡nsaturados, la calidad y la cantidad de aminoácidos esenciales, y los niveles de celulosa. En maíz, las proteínas modificadas de la hordotionina se describen en las Patentes de los EEUU N° 5.703.049, 5.885.801 , 5.885.802 y 5.990.389. Los caracteres comerciales también pueden estar codificados por uno o más genes que, por ejemplo, pueden incrementar el contenido de almidón para producir etanol, o proporcionan la expresión de proteínas. . Otro uso comercial importante de las plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos . N°: 5.602.321. Los genes, tal como de ß-cetotiolasa, PHBasa (polihidroxiburirato sintetasa) y acetoacetil-CoA reductasa (véase Schubert et al., (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA). Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales, así como aquellos de otras fuentes, incluyendo procariotas y otros eucariotas. Estos productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas y semejantes. Puede incrementarse el nivel de proteínas, particularmente proteínas modificadas con una distribución de aminoácidos mejorada, para mejorar el valor nutritivo de la planta. Esto se logra expresando proteínas que tienen un mayor contenido de aminoácidos. Esta invención puede comprenderse mejor en referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Aquellos entrenados en la técnica podrán apreciar que pueden ponerse en práctica otras realizaciones de la invención sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención, como se describe y reivindica en la presente documentación. EJEMPLOS Ejemplo 1. Aislamiento de secuencias NUE Se empleó una rutina para identificar todos los miembros de una familia de genes para realizar una búsqueda de genes de mayor eficiencia en la utilización de nitrógeno de interés. Se preparó un conjunto diverso de todos los miembros conocidos de la familia de genes como secuencias de proteínas. Estos datos incluyen secuencias de otras especies. Luego, se realizan búsquedas con estas especies en un conjunto de datos de secuencias de maíz propietarias, y se identifica un conjunto no redundante de aciertos superpuestos. Se toman las secuencias de nucleótidos de cualquier gen de interés por separado y se realizan búsquedas en la base de datos para obtener un conjunto no redundante de aciertos completamente superpuestos. Luego se compara el conjunto de aciertos de proteínas con los aciertos de nucleótidos. Si la familia de genes está completa, todos los aciertos de proteínas están contenidos en los aciertos de nucleótidos. Ejemplo 2. Categorización de NUE por función TABLA 1 Ejemplo 3. Patrones de expresión en maíz usando MPSS MPSS designa la Secuenciación Masiva de Firmas Paralelas, una técnica inventada y comercializada por Lynx Therapeutics, Inc., de Hayward, California. Se ha descripto la MPSS y las tecnologías relacionadas en publicaciones de Brenner et a\.(Nature Biotechnol [2000] 18:630-634, y PNAS [2000] 97:1665- 1670). Al igual que el SAGE (Análisis Seriado de la Expresión Genética), la MPSS produce firmas de secuencia cortas a partir de una posición definida dentro de un ARNm, y la abundancia relativa de estas firmas en una biblioteca dada representa una estimación cuantitativa de la expresión de dicho gen. Las firmas de MPSS tienen 17 bp de largo, y pueden identificar en forma única >95% de los genes en Arabidopsis. Se hicieron coincidir las secuencias NUE con datos de MPSS, y se curaron las marcas coincidentes (GATC-17meros). Idealmente, la marca correcta para un gen está en la cadena positiva, en una posición cercana y adyacente a la cola de poli A y su gen específico. Cuando hay más de una coincidencia de marca en un gen, comúnmente se selecciona la más cercana a la cola de poli A, que también es comúnmente aquella con la mayor expresión genética. Cuando la marca coincide con más de un gen, la asociación genética correcta es comúnmente aquella que tiene una distribución de EST que corresponde mejor al patrón de expresión revelado por los datos de MPSS. Ejemplo 4. Transformación y regeneración de plantas transgénicas Se bombardean embriones inmaduros de maíz de plantas donantes de invernadero con un plásmido que contiene la secuencia NUE unida operativamente al promotor inducible por sequía RAB17 (Vilardell et al. (1990) Plant Mol Biol 14:423-432) y el gen marcador de selección PAT, que confiere resistencia al herbicida Bialaphos Como alternativa, se proporciona el gen marcador de selección en un plásmido separado. Se llevó a cabo la transformación tal como sigue. Siguen mas abajo las recetas de los medios. Preparación del tejido blanco: Las mazorcas se desvainan y esterilizan superficialmente en decolorante Chlorox al 30%, más 0,5% de detergente Micro por 20 minutos, y se lava dos veces con agua estéril. Se cortaron los embriones maduros y se colocaron los embriones con el eje hacia abajo (el lado del escutelo hacia arriba), 25 embriones por placa, sobre un medio 560Y durante 4 horas y luego en la preparación para el se alinearon dentro de la zona blanco de 2,5cm bombardeo. Preparación del ADN: Se prepara un vector plasmídico que comprende la secuencia NUE unida operativamente a un promotor de ubiquitina. Este ADN de plásmido, más el ADN de plásmido que codifica un marcador de selección PAT, se precipita en pellets de tungsteno de 1 ,1 //m (diámetro promedio) utilizando un procedimiento de precipitación con CaC , como se indica a continuación: I de partículas de tungsteno preparadas en agua 10//I (1 jt/g) de ADN en amortiguador TrisEDTA (1 //g de ADN total) 100¿/l de CaCI22,5 M 10µ? de espermidina 0,1 M Se agrega cada reactivo en forma consecutiva a la suspensión de partículas de tungsteno, mientras se mantiene esta última en un agitador para tubos múltiples. Las mezcla final fue brevemente sonicada y se la incubó bajo agitación con vortex durante 10 minutos. Después del periodo de precipitación, los tubos fueron brevemente centrifugados, se eliminó el liquido, se lavaron con 500ml de etanol al 100%, y se centrifugaron durante 30 segundos. Se elimina el líquido nuevamente y se agregan 105 µ\ de etanol al 100% a los precipitados finales de partículas de tungsteno. Para realizar el bombardeo con cañón de partículas, se sonican brevemente las partículas de tungsteno/ADN, se introducen 10 µ\ en el centro de cada macrotransportador y se deja secar por aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo. Tratamiento con cañón de partículas: Las placas de muestras se bombardear a nivel Nro 4 en una pistola de partículas. Todas las muestras reciben un único disparo a 650 PSI con un total de diez alícuotas tomadas de cada tubo de partículas preparadas/ADN. Tratamiento subsiguiente: Luego del bombardeo, se mantuvieron los embriones en un medio 560Y durante 2 días, y luego se transfirieron a un medio de selección 560R que contenía 3 mg/litro de Bialafos, y se subcultivarón cada dos semanas. Después de aproximadamente 10 días de selección, los clones de los cayos resistentes a la selección se transfirieron a un medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Luego de la maduración de los embriones somáticos (2-4 semanas), los embriones somáticos que se desarrollaron bien se transfirieron a un medio para germinación y se los ubicó en un cuarto de cultivo iluminado. Aproximadamente 7-10 días mas tarde, las plántulas desarrolladas se transfirieron a un medio libre de hormona 272V en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas se establecieron correctamente. Las plantas fueron luego transferidas a injertos en planos (equivalentes a macetas de 2,5") que contenían suelo para macetas y se hicieron crecer durante una semana en una cámara de crecimiento, haciéndolas crecer subsecuente por 1-2 semanas adicionales en un invernadero, y luego se las transfirió a macetas clásicas de 600 (1 ,6 galones) y se las hizo crecer hasta madurez. Se monitorea y se analiza la tolerancia a la sequía incrementada en las plantas. Los ensayos para medir la tolerancia a la sequía incrementada son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, rendimientos de capacidad de obtención de granos mejorados bajo condiciones de sequía, en comparación con plantas de maíz control bajo condiciones ambientales idénticas. Como alternativa, en las plantas transformadas puede monitorearse la modulación en el desarrollo del meristema (es decir, una disminución en la formación de espinas en la mazorca). Véase, por ejemplo, Bruce, et al., (2002) Journal of Experimental Botany 53: 1-13. Bombardeo v medios de cultivo: El medio de bombardeo (560Y) comprende 4,0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-151 1 ), 0,5 mg/l de tiamina HCI, 120,0 g/l de sacarosa, 1 ,0 mg/l de 2,4-D, y 2,88 g/l de L-prolina (llevada a volumen con D-l H20 después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); 2,0 g/l de Gelrite (agregado después de llevar a volumen con D-l H20); y 8,5 mg/l de nitrato de plata (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de selección (560R) comprende 4,0 g/l de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1 ,0 ml/l de mezcla de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511 ), 0,5 mg/l de tiamina HCI, 30,0 g/l de sacarosa y 2,0 mg/l de 2,4-D (llevado a volumen con D-l H20 después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); 3,0 g/l de Gelrite (agregado después de llevar a volumen con D-l H20); y 0,85 mg/l de nitrato de plata y 3,0 mg/l de Bialaphos (ambos agregados después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de regeneración de plantas (288J) comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 11 1 17-074), 5,0 ml/l de solución madre de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCI, 0,10 g/l de piridoxina HCI y 0,40 g/l de glicina, llevado a volumen con D-l H20 pulida) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 75:473), 100 mg/l de mio-inositol, 0,5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sacarosa y 1 ,0 ml/l de ácido abscísico 0,1 mM (llevado a volumen con D-l H20 pulida después de ajustar el pH en 5,6); 3,0 g/l de Gelrite (agregado después de llevar a volumen con D-l H20); y 1 ,0 mg/l de ácido indolacético y 3,0 mg/l de Bialaphos (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a 60°C). El medio libre de hormonas (272V) comprende 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 1 11 17-074), 5,0 ml/l de solución madre de vitaminas MS (0,100 g/l de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCI, 0,10 g/l de piridoxina HCI y 0,40 g/l de glicina, llevado a volumen con D-l H20 pulida), 0,1 g/l de mio-inositol y 40,0 g/l de sacarosa (llevado a volumen con D-l H20 pulida después de ajustar el pH en 5,6); y 6 g/l de bacto-agar (agregado después de llevar a volumen con D-l H20 pulida), esterilizado y enfriado a 60°C. Ejemplo 5. Transformación mediada por Agrobacterium Para la transformación mediada por Agrobacterium del maíz con una secuencia antisentido de la secuencia NUE de la presente invención, se emplea preferiblemente el método de Zhao (Patente de los EEUU N° 5981840, y Publicación de Patente PCT WO 98/32326; cuyos contenidos se incorporan en la presente documentación a modo de referencia). Brevemente, se aislan embriones inmaduros de maíz y se ponen en contacto los embriones con una suspensión de Agrobacterium, donde las bacterias son capaces de transferir las secuencias antisentido NUE a al menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1 : etapa de infección). En esta etapa los embriones inmaduros fueron preferentemente sumergidos en una suspensión de Agrobacterium para el inicio de la inoculación. Los embriones fueron co-cultivados durante un tiempo con Agrobacterium (etapa 2: la etapa de co-cultivo). Preferentemente los embriones inmaduros fueron cultivados luego de la etapa de infección en un medio sólido. Luego de este período de co-cultivo se contempló una etapa opcional de "reposo". En esta etapa de reposo, los embriones fueron incubados en presencia de al menos un antibiótico que se sabe que inhibe el crecimiento de Agrobacterium sin el agregado de un agente selectivo para las plantas transformantes (etapa 3: etapa de reposo). Preferentemente los embriones inmaduros se cultivaron en un medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección para la eliminación de Agrobacterium y para una fase de reposo de las células infectadas. Luego, los embriones inoculados fueron cultivados en un medio que contenía un agente de selección y se hicieron crecer y se recuperaron los callos transformados (etapa 4: etapa de selección). Preferentemente, se cultivaron los embriones maduros en un medio sólido con un agente de selección que dá como resultado el crecimiento selectivo de las células transformadas. Luego los callos se regeneraron en plantas (etapa 5: etapa de regeneración), y preferentemente los callos que crecieron en el medio selectivo se cultivaron en un medio sólido para regenerar plantas. Se monitorean las plantas y se evalúa una modulación en el desarrollo del meristema. Por ejemplo, alteraciones en el tamaño y la apariencia de los meristemas de los brotes y florales, y/o rendimientos mejorados de hojas, flores y/o frutos. Ejemplo 6. Transformación de embriones de soja Se bombardean embriones de soja con un plásmido que contiene secuencias NUE antisentido unidas operativamente a un promotor de ubiquitina como se indica a continuación. Para inducir embriones somáticos, se cultivan cotiledones de 3-5 mm de largo, disectados a partir de semillas inmaduras de semillas inmaduras del cultivar de soja A2872 esterilizadas superficialmente, con luz u oscuridad, a 26°C sobre un medio de agar apropiado, durante seis a diez semanas. Los embriones somáticos que producen embriones secundarios se recortan y colocan en un medio líquido adecuado. Después de una selección repetida de agrupaciones de embriones somáticos que se multiplicaron como embriones en etapa globular temprana, se mantienen las suspensiones como se describirá más adelante. Los cultivos en suspensión de soja embriogénica pueden mantenerse en mi de medio líquido sobre un agitador rotativo, con una velocidad de 150 rpm, a 26°C con luz fluorescente, con un programa de 16:8 horas de día/noche. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas mediante la inoculación de aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mi de medio líquido. Luego pueden transformarse los cultivos en suspensión de soja embriogénica por el método de bombardeo con cañón de partículas (Kline et al (1987) Nature (Londres) 327:70, Patente de los EEUU N° 4945050). Puede emplearse el equipo DuPont Biolistic™ PDS1000/HE (con retroalimentación con helio) para estas transformaciones. Un gen marcador de selección que puede utilizarse para facilitar la transformación en soja es un gen quimérico compuesto por el promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor (Odell et al (1985) Nature 313:810-812), el gen de higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E coli; Gritz et al (1983) Gene 25:179-188) y la región 3' del gen de nopalina sintetasa del ADN-T del plásmido Ti de Agrobacteríum tumefaciens. El cásete de expresión en semillas, que comprende una secuencia NUE antisentido unida operativamente a un promotor de ubiquitina puede aislarse como un fragmento de restricción. Luego puede insertarse este fragmento en un sitio de restricción único en el vector que contiene el gen marcador. A 50 µ\ de una suspensión de 60 mg/ml de partículas de oro de 1 µ?? se agregan (en orden): 5 µ\ de ADN (1 µ ?µ\), 20 µ\ de espermidina (0,1 M) y 50 µ\ de CaC (2,5 M). La preparación de partículas se agita durante tres minutos, se pasa por una microcentrífuga durante 10 segundos y se retira el sobrenadante. Luego se lavan las partículas recubiertas con ADN una vez en 400 µ\ de etanol 70%, y se suspenden nuevamente en 40 µ\ de etanol anhidro. La suspensión de ADN/partículas puede sonicarse tres veces durante un segundo por vez. Luego se cargan cinco µ? de las partículas de oro recubiertas con ADN en cada disco macrotransportador. Se colocan entre aproximadamente 300 y 400 mg de un cultivo en suspensión de dos semanas en una caja de Petri vacía de 60 x 15 mm, y se retira el líquido residual del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, se bombardean aproximadamente 5-10 placas de tejido. Se define la presión de ruptura de la membrana en 1 100 psi, y se evacúa la cámara hasta un vacío de 28 pulgadas de mercurio. El tejido se coloca a aproximadamente 3,5 pulgadas de distancia de la pantalla de retención y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, puede dividirse el tejido por la mitad, puede colocárselo nuevamente en el líquido y puede cultivárselo como se describió anteriormente. Entre cinco y siete días después del bombardeo, puede cambiarse el medio líquido por medio fresco, y once a doce días después del bombardeo, por medio fresco que contiene 50 mg/ml de higromicina. Este medio selectivo puede cambiarse semanalmente. Siete a ocho semanas después del bombardeo, puede observarse tejido transformado verde creciendo desde las agrupaciones embriogénicas necróticas no transformadas. Se retira el tejido verde aislado y se lo inocula en frascos individuales con el fin de generar nuevos cultivos embriogénicos transformados en suspensión, propagados por clonación. Cada línea nueva puede tratarse como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones pueden subcultivarse y mantenerse como agrupaciones de embriones inmaduros, o pueden regenerarse en plantas enteras por maduración y germinación de los embriones somáticos individuales. Ejemplo 7. Transformación de tejido meristemático de girasol Se transforma tejido meristemático de girasol con un cásete de expresión, que contiene una secuencia NUE antisentido unida operativamente a un promotor de ubiquiina, como se indica a continuación (véase también la Patente Europea N° EP 0 486233, incorporada en la presente documentación a modo de referencia, y Malone-Schoneberg et al. (1994) Plant Science 103:199-207). Se eliminan las cáscaras de semillas de girasol maduras (Helianthus annuus L.) usando una trilladora con cabeza individual para trigo. Se esterilizan superficialmente las semillas por 30 minutos en una solución de decolorante Chlorox al 20%, con la adición de dos gotas de Tween 20 por cada 50 mi de solución. Se lavan las semillas dos veces con agua destilada estéril. Se preparan explantes de embriones separados por el eje empleando una modificación de los procedimientos descriptos por Schrammeijer et al. (Schrammeijer et a/.(1990) Plant Cell Rep. 9:55-60). Se embeben semillas en agua destilada por 60 minutos, después de un procedimiento de esterilización superficial. Luego se separan los cotiledones de cada semilla para obtener una fractura clara en el plano del eje del embrión. Después de separar el extremo de la raíz, se disectan los explantes en forma longitudinal entre las hojas primordiales. Se colocan las dos mitades, con la superficie cortada hacia arriba, en un medio GBA que consiste en elementos minerales Murashige y Skoog (Murashige et al. (1962) Physiol. Plant. 15:473-497), vitaminas de Shepard (Shepard (1980) en Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops (University of Minnesota Press, St.Paul, Minnesota), 40 mg/l de sulfato de adenina, 30 g/l de sacarosa, 0,5 mg/l de 6-bencil-aminopurina (BAP), 0,25 mg/l de ácido indol-3-acético (IAA), 0,1 mg/l de ácido giberélico (GA3), pH 5,6, y 8 g/l de Phytagar. Los explantes se someten a bombardeo de microproyectiles antes del tratamiento con Agrobacterium (Bidney, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:301-313). Se colocan entre treinta y cuarenta explantes en un círculo en el centro de una placa de 60 x 20 mm para este tratamiento. Se suspenden nuevamente aproximadamente 4,7 mg de microproyectiles de tungsteno de 1 ,8 mm en 25 mi de amortiguador TE estéril (Tris HCI 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), y se usan alícuotas de 1 ,5 mi para cada bombardeo. Se bombardea cada placa dos veces a través de una pantalla de nytex de 150 mm, colocada a una altura de 2 cm de las muestras, en un dispositivo de aceleración de partículas PDS 1000®. Se usa la cepa desarmada de Agrobacterium tumefaciens EHA105 en todos los experimentos de transformación. Se introduce en la cepa EHA105 de Agrobacterium un vector plasmídico binario que comprende el cásete de expresión del gen NUE ligado operativamene al promotor de ubiquitina por congelamiento-descongelamiento como lo describe Holsters, et al., (1978) Mol. Gen. Genet. 163: 81-187. Este plásmido comprende además un gen marcador seleccionable de kanamicina (es decir, nptl\). Se cultivan las bacterias para los experimentos de transformación de plantas durante la noche (28°C y agitación continua a 100 RPM) en medio líquido YEP (10 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de bactopeptona y 5 g/l de NaCI, pH 7,0) con los antibióticos apropiados necesarios para mantener la cepa bacteriana y los plásmidos binarios. La suspensión se utiliza cuando alcanza un OD600 de entre aproximadamente 0,4 y 0,8. Las células de Agrobacterium se peletean y resuspenden a un OD600 final de 0,5 en un medio de inoculación que comprende 12.5 mM MES pH 5.7, 1 gm/l NH4CI, y 0.3 gm/l MgS04. Se colocan los explantes recién bombardeados en una suspensión de Agrobacteríum, se mezcla y se deja reposar por 30 minutos. Luego se transfieren los explantes a un medio GBA y se los co-cultiva, con la superficie cortada hacia abajo, a 26°C y con días de 18 horas. Después de tres días de co-cultivo, se transfieren los explantes a un medio 374B (un medio GBA sin reguladores del crecimiento y con un nivel de sacarosa reducido de 1 %) suplido con 250 mg/l de cefotaxima y 50 mg/l de sulfato de kanamicina. Los explantes se cultivan por entre dos y cinco semanas en medio de selección, y luego se los transfiere a un medio 374B fresco que carece de kanamicina, para que se desarrollen en forma continua por una o dos semanas. Los explantes con áreas de crecimiento diferenciadas, resistentes a antibióticos, que no han producido brotes apropiados para la escisión, se transfieren a un medio GBA que contiene 250 mg/l de cefotaxima para efectuar un segundo tratamiento con fitohormonas de 3 días. Se evalúa la presencia de NPTII por ELISA y la presencia de expresión transgénica evaluando la modulación en el desarrollo del meristema (es decir, una alteración en el tamaño y la apariencia de los meristemas florales) en muestras de hojas de brotes verdes, resistentes a kanamicina. Los brotes positivos para NPTII se injertan en brotes con raíces de híbridos Pioneer® 6440 de girasol cultivados in vitro. Se hace germinar las semillas esterilizadas en superficie en medio 48-0 (sales Murashige y Skoog con media fuerza, 0,5% de sacarosa, 0,3% de Gelrite™, pH 5,6), y se cultiva bajo las condiciones descriptas para el cultivo de explantes. Se retira la porción superior del brote, se efectúa un corte vertical de 1 cm en el hipocótile y se inserta el brote transformado en el corte. Se envuelve el área entera con parafilm para asegurar la raíz. Pueden transferirse las plantas injertadas a la tierra después de una semana de cultivo in vitro. Los injertos en la tierra se mantienen bajo condiciones de humedad elevada, después de una aclimatación lenta al ambiente del invernadero. Los sectores transformados de las plantas T0 (generación progenitora) que maduran en el invernadero se identifican por NPTII ELISA y/o mediante análisis de actividad de NUE, al tiempo que las semillas transgénicas cosechadas de plantas To positivas para NPTII se identifican por medio de análisis de actividad de NUE de porciones pequeñas de cotiledones de hojas secas. Un protocolo de transformación de girasoles alternativo permite recuperar la progenie transgénica sin usar una presión de selección química. Se eliminan las cáscaras de las semillas y se las esteriliza en forma superficial por 20 minutos en una solución de decolorante Chlorox al 20%, con la adición de dos o tres gotas de Tween 20 por cada 100 mi de solución, luego se lava tres veces con agua destilada. Se embeben las semillas esterilizadas en la oscuridad a 26°C por 20 horas en papel de filtro humedecido con agua. Se retiran los cotiledones y los extremos de las raíces, y se cultivan los explantes de meristemas en medio 374E (un medio GBA que consiste en sales MS, vitaminas de Shepard, 40 mg/l de sulfato de adenina, 3% de sacarosa, 0,5 mg/l de 6-BAP, 0,25 mg/l de IAA, 0,1 mg/l de GA y 0,8% de Phytagar a pH 5,6) por 24 horas en la oscuridad. Se eliminan las hojas primarias para exponer el meristema apical, se colocan aproximadamente 40 explantes, con el domo apical hacia arriba, en un círculo de 2 cm en el centro de una placa con medio 374M (un medio GBA con 1 ,2% de Phytagar), y luego se cultiva en el medio por 24 horas en la oscuridad. Se suspenden nuevamente aproximadamente 18,8 mg de partículas de tungsteno de 1 ,8 /m en 150 µ\ de etanol absoluto. Después de la sonicación, se vierten 8 µ? de éstas en el centro de la superficie del disco macrotransportador. Se bombardea cada placa dos veces con discos de ruptura a 650 psi en el primer nivel, con un cañón de helio con un vacío de 26 mm de Hg. Se introduce el plásmido de interés en la cepa de Agrobacteríum tumefaciens EHA105 por congelamíento-descongelamiento, como se describió previamente. Se suspende nuevamente el precipitado de bacterias, cultivadas durante la noche a 28°C en un medio líquido YEP (10 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de bactopeptona y 5 g/l NaCI, pH 7,0) en presencia de 50 vg/l de kanamicina, en un medio de inoculación (ácido 2-(N-morfolin) etansulfónico 12,5 mM, MES 2 mM, 1 g/l de NH4CI y 0,3 g/l de MgS04 a pH 5,7) hasta alcanzar una concentración final de 4,0 a una OD 600. Los explantes sometidos al bombardeo de partículas se transfieren a un medio GBA (374E), y se coloca una gota de suspensión de bacterias directamente en la parte superior del meristema. Se co-cultivan los explantes en el medio por 4 días, después de lo cual se transfieren los explantes a un medio 374C (GBA con 1 % de sacarosa y son BAP, IAA o GA3, y suplido con 250 //g/ml de cefotaxima). Se cultivan las plántulas en el medio por aproximadamente dos semanas con días de 16 horas, bajo condiciones de incubación a 26°C. Se analiza la actividad plaguicida en explantes (de aproximadamente 2 cm de largo) cultivados por dos semanas en medio 374C, usando ensayos conocidos en la técnica. Después de identificar los explantes positivos, los brotes que no presentan actividad NUE modificada se descartan, y cada explante positivo se divide en explantes nodales. Un explante nodal contiene al menos un nodo potencial. Se cultivan los segmentos nodales en medio GBA por tres o cuatro días para promover la formación de retoños auxiliares en cada nodo. Luego se los transfiere a un medio 374C y se los deja crecer por otras cuatros emanas. Se separan los retoños en desarrollo y se los cultiva otras cuatro semanas en medio 374C. Se analizan muestras de hojas agrupadas de cada brote recién recuperado empleando los ensayos de actividad proteica apropiados. En este momento, los brotes positivos recuperados de un único nodo generalmente estarán enriquecidos en el sector transgénico detectado en el ensayo inicial antes del cultivo nodal. Los brotes recuperados positivos con una expresión modificada de NUE se injertan en brotes con raíces de híbridos Pioneer 6440 de girasol cultivados in vitro. Se preparan las plantas del siguiente modo. Se elimina la cáscara de las semillas y se las esteriliza superficialmente por 20 minutos en una solución de decolorante Chiorox al 20%, con la adición de dos o tres gotas de Tween 20 por cada 100 mi de solución, luego se lava tres veces con agua destilada. Se hacen germinar las semillas esterilizadas en superficie en medio 48 (sales MS con media fuerza, 0,5% de sacarosa, 0,3% de gelrite, pH 5,0), y se cultiva a 26°C en la oscuridad por tres días, bajo condiciones de cultivo con días de 16 horas. Se retira la porción superior del brote, se efectúa un corte vertical en cada hipocótile y se inserta un brote transformado en un corte en V. Se envuelve el área cortada con parafilm. Después de una semana de cultivo en el medio, se transfieren las plantas injertadas a la tierra. Durante las primeras dos semanas, se las mantiene bajo condiciones de humedad elevada para aclimatarlas al ambiente del invernadero. Ejemplo 8. Transformación de tejidos de arroz Confirmación genética del gen NUE Un método para transformar ADN en células de plantas superiores, que está disponible para aquellos entrenados en la técnica, es el bombardeo balístico de alta velocidad, usando partículas metálicas recubiertas con las construcciones de ácidos nucleicos de interés (véase Klein et a\.Nature (1987) (London) 327:70-73, y véase Patente de los EEUU No. 4,945,050) Para estos experimentos complementarios se utilize un Biolistic PDS-1000/He (BioRAD Laboratories, Hercules, CA) . La técnica de bombardeo de partículas se utiliza para transformar los mutantes NUE y el arroz de tipo salvaje con fragmentos de ADN. Se utiliza el gen de higromicina B fosfotransferasa bacteriana (Hpt II) de Streptomyces hygroscopicus, que confiere resistencia al antibiótico , como marcador de selección para la transformación de arroz. En el vector pML18, se modificó el gen Hpt II con el promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor y las señales de terminación y poliadenilación del gen de octopina sintetasa de Agrobacterium tumefaciens. Se describe pML18 en WO 97/47731 , que se publicó el 18 de Diciembre de 1997, cuya descripción se incorpora en la presente documentación a modo de referencia. Se usan cultivos de callos derivados del ecutello de semillas de arroz en germinación como fuente de material para los experimentos de transformación. Puede generarse este material haciendo germinar semillas de arroz estériles en un medio de iniciación de callos (sales MS, vitaminas Nitsch y Nitsch, 1 ,0 mg/l de 2,4-D y AgNÜ3 10 µ?) en la oscuridad a 27-28°C. Luego se transfieren los callos embriogénicos que proliferan desde el escutelo de los embriones hacia medio CM (sales N6, vitaminas Nitsch y Nitsch, 1 mg/l de 2,4-D, Chu et al., 1985, Sci. Sínica 18: 659-668). Se mantienen los cultivos de callos en CM, realizando subcultivos rutinarios a intervalos de dos semanas, y se los usa para la transformación a las 10 semanas de iniciado el experimento. Se preparan callos por transformación, subcultivando trozos de 0,5-1 ,0 mm separados aproximadamente 1 mm, dispuestos en un área a circular de aproximadamente 4 cm de diámetro, en el centro de un círculo de papel Whatman #541 introducido en medio CM. Se incuban las placas con callos en la oscuridad a 27-28°C por 3-5 días. Antes del bombardeo, se transfieren los filtros con callos a medio CM suplido con manitol 0,25 M y sorbitol 0,25 M por 3 horas en la oscuridad. Luego se dejan las placas de petri abiertas por 20-45 minutos en una campana estéril para dejar que se disipe la humedad en los tejidos. Cada fragmento de ADN genómico se co-precipita con pML18, que contiene el marcador de selección de transformación de arroz, en la superficie de las partículas de oro. Para lograr esto, se agrega un total de 10 µg de ADN, con una relación de 2:1 entre el ADN del carácter, y el ADN marcador de selección, en una alícuota de 50 µ? de partículas de oro, que se suspenden nuevamente a una concentración de 60 mg mi"1. Luego se agrega cloruro de calcio (50 µ? de una solución 2,5 M) y espermidina (20 µ? de una solución 0,1 M) a la suspensión de oro-ADN, y se agita el tubo por 3 minutos. Se centrifugan las partículas de oro en una centrífuga por 1 segundo y se elimina el sobrenadante.. Luego se lavan las partículas de oro dos veces con 1 mi de etanol absoluto, y luego se las suspende nuevamente en 50 µ\ de etanol absoluto y se sónica (sonicador en baño) por un segundo para dispersar las partículas de oro. Se incuba la suspensión de oro a -70°C por cinco minutos y se sónica (sonicador en baño), de ser necesario, para dispersar las partículas. Luego se cargan seis µ\ de las partículas de oro recubiertas con ADN en discos macrotransportadores de mylar, y se deja que se evapore el etanol. Al final del período de secado, se coloca una placa de petri que contiene el tejido en la recámara del dispositivo PDS-1000/He. Luego se evacúa el aire en la recámara hasta obtener un vacío de 28-29 pulgadas de Hg. Se acelera el macrotransportador con una onda de choque de helio, usando una membrana que se rompe cuando la presión de He en el tubo de descarga alcanza 1080-1 100 psi. El tejido se coloca a aproximadamente 8 cm de la pantalla detención, y se bombardean dos veces los callos. Se bombardean dos de las cuatro placas de tejido de este modo con las partículas de oro recubiertas con ADN. Después del bombardeo, se transfiere el tejido de los callos a un medio CM sin sorbitol o manitol adicional. 3-5 días después del bombardeo, se transfiere el tejido de los callos a un medio (medio CM que contiene 50 mg/l de higromicina). Para lograr esto, se transfiere tejido de callos desde las placas hasta tubos cónicos estériles de 50 mi y se lo pesa. Se agrega agar superior fundido a 40°C, usando 2,5 mi de agar superior/100 mg de callos. Se degradan los conjuntos de callos en fragmentos de menos de 2 mm de diámetro mediante un pasaje repetitivo a través de una pipeta de 10 mi pipet. Se plaquean alícuotas de diez mi de la suspensión de callos en medio SM fresco, y se incuban las placas en la oscuridad por 4 semanas a 27-28°C. Después de 4 semanas, se identifican los eventos transgénicos en los callos, se los transfiere a placas SM frescas y se los cultiva otras 2 semanas en la oscuridad a 27-28°C. Luego se transfieren los callos en crecimiento a un medio RM1 (sales MS, vitaminas Nitsch y Nitsch, 2% de sacarosa, 3% de sorbitol, 0,4% de gelrite +50 ppm de hyg B), donde permanecen 2 semanas en la oscuridad a 25°C. Después de 2 semanas, pueden transferirse los callos a medio RM2 (sales MS, vitaminas Nitsch y Nitsch, 3% de sacarosa, 0,4% de gelrite + 50 ppm de hyg B) y se los coloca bajo una luz blanca fría (aproximadamente 40 µ???~?1) con un fotoperíodo de 12 horas a 25°C y 30-40% de humedad. Después de 2-4 semanas a la luz, los callos comienzan a organizarse y formar brotes. Se retiran los brotes de los callos/el medio circundante, y se transfieren cuidadosamente a medio RM3 (1/2 x sales MS, vitaminas Nitsch y Nitsch, 1 % de sacarosa + 50 ppm de higromicina B) en fitobandejas (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), y se continua la incubación usando las mismas condiciones descriptas en el paso previo. Luego se transfieren las plantas a macetas RM3 de 4", que contienen una mezcla Metro 350, después de 2-3 semenas, cuando se verifica la ocurrencia de un crecimiento apropiado de las raíces y los brotes. La complementación genética de la mutación NUE en las semillas obtenidas de las plantas transgénicas, que contienen el ADN genómico tipo salvaje con el gen NUE. Ejemplo 9. Variantes de secuencias NUE A. Variantes de secuencias de nucleótidos de NUE que no alteran la secuencia de aminoácidos codificada Se usan las secuencias de nucleótidos NUE para generar variantes de las secuencias de nucleótidos que tienen la secuencia de nucleótidos del marco abierto de lectura con aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95% de identidad de secuencia de nucleótidos, en comparación con las secuencias de nucleótidos de los ORF iniciales no relacionados de los SEQ ID N° correspondientes. Estas variantes funcionales se generan usando una tabla de codones convencional. Si bien se altera la secuencia de nucleótidos de las variantes, la secuencia de aminoácidos codificada por los marcos abiertos de lectura no cambia. B. Variantes de las secuencias de aminoácidos de polipéptidos NUE Se generaron variantes de aminoácidos de las secuencias de los polipéptidos NUE. En este ejemplo se altera un aminoácido. Específicamente, se revisan los marcos abiertos de lectura para determinar la alteración del aminoácido apropiado. La selección del aminoácido a cambiar se efectúa consultando el alineamiento de proteínas (con los otros ortólogos y con otros miembros de familias de genes de varias especies). Se selecciona un aminoácido del que no se considera que está bajo una presión de selección elevada (no muy conservado), que puede ser sustituido fácilmente por un aminoácido con características químicas similares (es decir, cadenas laterales funcionales similares). Usando el alineamiento de proteínas, se puede cambiar un aminoácido apropiado. Una vez identificado el aminoácido apropiado, se pone en práctica el procedimiento descripto en la sección C a continuación. Generalmente se producen variantes que tienen aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos usando este método. C. Variante adicional de las secuencias de aminoácidos de polipéptidos NUE En este ejemplo se crean secuencias de proteínas artificiales que tienen 80%, 85%, 90% y 95% de identidad respecto de la secuencia de la proteína de referencia. Este último esfuerzo requiere de la identificación de regiones conservadas y variables en el alineamiento, y luego es necesaria la aplicación apropiada de una tabla de sustituciones de aminoácidos. Estas partes se describen con mayor detalle a continuación. En gran medida, la determinación de cuáles secuencias de aminoácidos deben alterarse se efectúa sobre la base de las regiones conservadas entre las proteínas NUE, o entre los otros polipéptidos NUE. Sobre la base del alineamiento de secuencias, se representan las distintas regiones del polipéptido NUE que pueden alterarse con letras minúsculas, al tiempo que las regiones conservadas se representan con letras mayúsculas. Se reconoce que pueden efectuarse sustituciones conservativas en las siguientes regiones conservadas sin alterar la función. Además, aquellos entrenados en la técnica comprenderán que las variantes funcionales de la secuencia NUE de la invención pueden tener alteraciones de aminoácidos no conservativas menores en el dominio conservado.

Luego se crean secuencias de proteínas artificiales que son diferentes de la original en los intervalos de 80-85%, 85-90%, 90-95% y 95-100% de identidad. Se centra el enfoque en los puntos medios de estos intervalos, con intervalos de incertidumbre de más o menos 1 %, por ejemplo. Se efectuarán sustituciones de aminoácidos empleando un programa Perl modificado. En la Tabla 2 se proporciona la tabla de sustituciones.

Tabla 2. Tabla de sustituciones Primero, se identifican los aminoácidos conservados que no deberían cambiarse en la proteína, y se los "marca en forma negativa" para aislarlos de al sustitución. Por supuesto, se agrega la metionina inicial automáticamente a esta lista. Luego se efectúan los cambios. No se cambian H, C, y P bajo ninguna circunstancia. Los cambios tendrán lugar con isoleucina primero, pasando de N-terminal a C-terminal. Después la leucina, y así sucesivamente avanzando por la lista hasta obtener el blanco deseado. Pueden efectuarse sustituciones de cantidades intermedias para no provocar una inversión de los cambios. La lista se ordena de 1 a 17, con el objeto de comenzar con tantos cambios de isoleucina como sea posible antes de la leucina, y se sigue del mismo modo hasta la metionina. Claramente, no será necesario cambiar muchos aminoácidos de este modo. L, I y V comprenderán una sustitución 50:50 de las dos sustituciones óptimas alternadas. Se escriben las variantes de las secuencias de aminoácidos como salida del programa. Se usa el programa Perl para calcular los porcentajes de identidad. Usando este procedimiento, se generan variantes del polipéptidos NUE que tienen aproximadamente 80%, 85%, 90% y 95% de identidad de aminoácidos respecto de la secuencia de nucleótidos del ORF sin alterar de SEQ ID N°: 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 1 1 1 , 1 13, 115, 117, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 169, 171 , 173, 175, 177, 179, 181 , 183, 185, 187, 189, 191 , 193, 195, 197, 199, 201 , 203, 205, 207, 209, 21 1 , 213, 215, 217, 219, 221 , 223, 225, 227, 229, 231 , 233, 235, 237, 239, 241 , 243, 245, 247, 249, 251 , 253, 255, 257, 259, 261 , 263, 265, 267, 269, 271 , 273, 275, 277, 279, 281 , 283, 285, 287, 289, 291 , 293, 295, 297, 299, 301 , 303, 305, 307, 309, 31 1 o 313. Ejemplo 10. Plantas transgénicas de maíz Se generaron plantas transgénicas de maíz To que contenían la construcción NUE bajo el control del promotor . Estas plantas se cultivaron en condiciones de invernadero, bajo el sistema FASTCORN, como se describe en la publicación de patente de los EEUU 2003/0221212, Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nro 10/367,417.

Se analizó en cada una de las plantas la existencia de alteraciones mensurables en uno o más de las siguientes características, de las siguiente manera: La progenie Ti derivada de la auto-fertilización de cada planta T0 que contenía una única copia de cada construcción NUE que se encontró que segregaba 1 :1 para el evento transgénico se analizó para verificar un mejoramiento en la tasa de crecimiento en KNO3 reducido. El crecimiento se monitoreó hasta la antesis y se determinó el crecimiento acumulativo, la tasa de crecimiento y el peso de la espiga con respecto a eventos transgénicos positivos, transgénicos nulos, y controles no transformados. Se comparó la distribución del fenotipo de plantas individuales con la distribución de un conjunto de control y con la distribución de todos los tratamientos remanentes. Las varianzas para cada grupo se calcularon y compararon usando una prueba F en la que se compare la varianza de los eventos con un control no transgénico y con la varianza combinada de los eventos remanentes en el experimento. Mientras mayor fue la respuesta al KN03, mayor fue la varianza dentro de un evento establecido y mayor fue el valor de F. Los resultados positivos se compararán con la distribución del transgén dentro del evento para asegurarse de que la respuesta se segregue con el transgén. Ejemplo 1 1. Análisis de eventos transgénicos en lotes de terreno Se evaluaron eventos transgénicos en lotes de terrenos en los cuales el rendimiento es limitado por la reducción de la aplicación de fertilizante en un 30% o más. Se utilizan las mejoras de rendimiento, los componentes del rendimiento u otras características agronómicas entre plantas transgénicas y no transgénicas en estos lotes con fertilidad reducida por nitrógeno para determinar las mejoras en la utilización de nitrógeno contribuidas por la expresión de eventos transgénicos. Se hacen comparaciones similares en lotes complementados con tasas de fertilidad recomendadas para el nitrógeno. Los eventos transgénicos eficaces son aquéllos que logran rendimientos similares en los experimentos limitados en nitrógeno y los experimentos con niveles normales de nitrógeno. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los especialistas en la técnica a los cuales está dirigida esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente documentación a modo de referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual se incorporara específicamente e individualmente en la presente documentación a modo de referencia. Se ha descrípto la invención con referencia a varias realizaciones y técnicas preferidas. Sin embargo, deberá comprenderse que pueden efectuarse muchas variaciones y modificaciones sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES: 1.
Un polinucleótido aislado CARACTERIZADO PORQUE se selecciona del grupo formado por: a. un polinucleótido que tiene al menos una identidad de secuencia del 70%, determinada por el algoritmo GAP bajo parámetros por omisión, con la secuencia de longitud completa de un polinucleótido seleccionado del grupo formado por las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311 o 313, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que funciona como modificador de la eficiencia de utilización del nitrógeno . b. un polinucleótido que codifica un polipéptido que se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312 y 314; un polinucleótido que se selecciona del grupo formado por las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311 y 313; y Un polinucleótido que es complementario al polinucleótido de (a), (b) o (c) Un cásete de expresión recombinante, CARACTERIZADO PORQUE comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 , donde el polinucleótido está operativamente ligado, en orientación sentido o antisentido, a un promotor.
Una célula huésped CARACTERIZADA PORQUE comprende el cásete de expresión de la reivindicación 2.
Una planta transgénica CARACTERIZADA PORQUE comprende el cásete de expresión recombinante de la reivindicación 2.
La planta transgénica de la reivindicación 4, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una monocotiledónea.
La planta transgénica de la reivindicación 4, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una dicotiledónea.
La planta transgénica de la reivindicación 4 CARACTERIZADA PORQUE dicha planta se selecciona entre el grupo que consiste en: maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, maní y cacao.
Una semilla transgénica CARACTERIZADA PORQUE proviene de la planta transgénica de la reivindicación 4.
Un método para modular la eficiencia en la utilización del nitrógeno en plantas, CARACTERIZADO PORQUE comprende a. introducir en una célula vegetal un cásete de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 unido operativamente un promotor, y b. cultivar la planta bajo condiciones de cultivo de células vegetales, donde se modula la utilización del nitrógeno en dicha célula vegetal
10. El método de la reivindicación 9, CARACTERIZADO PORQUE la célula 5 vegetal proviene de una planta seleccionada del grupo formado por maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, maní y cacao.
11. Un método para modular la eficiencia en la utilización del nitrógeno en una planta, CARACTERIZADO PORQUE comprende í o a. introducir en una célula vegetal un cásete de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 unido operativamente un promotor, y b. cultivar la célula vegetal bajo condiciones de cultivo de células vegetales; y 15 c. regenerar una planta a partir de dicha célula vegetal, donde se modula la eficiencia en la utilización del nitrógeno en dicha planta.
12. El método de la reivindicación 11 , CARACTERIZADO PORQUE la planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, soja, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, maní y cacao. 20
13. Un método para disminuir la actividad del polipéptido NUE en una célula vegetal, CARACTERIZADO PORQUE comprende a. proveer una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 15 nucleótidos consecutivos del complemento de SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301 , 303, 305, 307, 309, 311 o 313; proveer una célula vegetal que comprende un ARNm que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311 o 313; y c. introducir la secuencia de nucleótidos del paso (a) en la célula vegetal del paso (b), donde la secuencia de nucleótidos inhibe la expresión del ARNm en la célula vegetal.
14. El método de la reivindicación 13, CARACTERIZADO PORQUE dicha célula vegetal es de una monocotiledónea.
15. El método de la reivindicación 14, CARACTERIZADO PORQUE dicha monocotiledónea es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo, o centeno.
16. El método de la reivindicación 13, CARACTERIZADO PORQUE dicha célula vegetal es de una dicotiledónea.
17. La planta transgénica de la reivindicación 4, CARACTERIZADA PORQUE la actividad de eficiencia en la utilización del nitrógeno en dicha planta se encuentra incrementada.
18. La planta transgénica de la reivindicación 17, CARACTERIZADA PORQUE la planta tiene un crecimiento radicular incrementado.
19. La planta transgénica de la reivindicación 17, CARACTERIZADA PORQUE la planta tiene un tamaño de semilla incrementado.
20. La planta transgénica de la reivindicación 17, CARACTERIZADA PORQUE la planta tiene un peso de semilla incrementado.
21. La planta transgénica de la reivindicación 17, CARACTERIZADA PORQUE la planta tiene una semilla con un tamaño de embrión incrementado.
22. La planta transgénica de la reivindicación 17, CARACTERIZADA PORQUE la planta tiene un tamaño de hoja incrementado.
23. La planta transgénica de la reivindicación 17, CARACTERIZADA PORQUE la planta tiene un vigor de las plántulas incrementado.
24. La planta transgénica de la reivindicación 17, CARACTERIZADA PORQUE la planta tiene un incremento en la emergencia de barba.
25. La planta transgénica de la reivindicación 17, CARACTERIZADA PORQUE la planta tiene un tamaño de espiga incrementado.
26. La planta transgénica de la reivindicación 4, CARACTERIZADA PORQUE la actividad de eficiencia en la utilización del nitrógeno en dicha planta se encuentra disminuida.
27. La planta transgénica de la reivindicación 26, CARACTERIZADA PORQUE la planta tiene un crecimiento radicular disminuido.
28. La planta transgénica de la reivindicación 26, CARACTERIZADA PORQUE la planta tiene un tamaño de semilla disminuido.
29. La planta transgénica de la reivindicación 26, CARACTERIZADA PORQUE la planta tiene un peso de semilla disminuido.
30. La planta transgénica de la reivindicación 26, CARACTERIZADA PORQUE la planta tiene un tamaño de embrión disminuido.
31. La planta transgénica de la reivindicación 26, CARACTERIZADA PORQUE la planta tiene una producción de espigas disminuida.