CZ295108B6 - Syntetický gen obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu a genový konstrukt obsahující tento syntetický gen - Google Patents

Syntetický gen obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu a genový konstrukt obsahující tento syntetický gen Download PDF

Info

Publication number
CZ295108B6
CZ295108B6 CZ20003346A CZ20003346A CZ295108B6 CZ 295108 B6 CZ295108 B6 CZ 295108B6 CZ 20003346 A CZ20003346 A CZ 20003346A CZ 20003346 A CZ20003346 A CZ 20003346A CZ 295108 B6 CZ295108 B6 CZ 295108B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
gene
sequence
plasmid
pvy
promoter
Prior art date
Application number
CZ20003346A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20003346A3 (cs
Inventor
Michael Wayne Graham
Robert Norman Rice
Original Assignee
Benitec Australia Ltd
Commonwealth Scientific And Industrial Research Or
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25645735&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ295108(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from AUPP2492A external-priority patent/AUPP249298A0/en
Priority claimed from AUPP2499A external-priority patent/AUPP249998A0/en
Application filed by Benitec Australia Ltd, Commonwealth Scientific And Industrial Research Or filed Critical Benitec Australia Ltd
Publication of CZ20003346A3 publication Critical patent/CZ20003346A3/cs
Publication of CZ295108B6 publication Critical patent/CZ295108B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/127—RNA-directed RNA polymerase (2.7.7.48), i.e. RNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/38—Vector systems having a special element relevant for transcription being a stuffer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron

Abstract

Syntetický gen, obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu, zahrnující přinejmenším dvě kopie strukturální genové sekvence, kde první kopie této strukturální genové sekvence je přinejmenším z 80 % identická s nukleotidovou sekvencí úseku cílového genu a druhá kopie této strukturální genové sekvence je přinejmenším z 80 % identická s nukleotidovou sekvencí, komplementární k úseku cílového genu, a kde syntetický gen je schopný post-transkripční represe, zpoždění nebo jiné redukce exprese tohoto cílového genu, jestliže je exprimován v hostitelské buňce savce sekvenčně-specifickou degradací RNA transkripce cílového genu endogenním hostitelským buněčným systémem. Do rozsahu řešení rovněž náleží genový konstrukt, obsahující tento syntetický gen. Tyto syntetické geny a genové konstrukty jsou schopné potlačit, zpozdit nebo jinak redukovat expresi endogenního genu nebo cílového genu v organismu, do kterého jsou vneseny.ŕ

Description

Syntetický gen obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu a genový konstrukt obsahující tento syntetický gen
Oblast techniky
Vynález se týká syntetického genu, obsahujícího dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu, zahrnující přinejmenším dvě kopie strukturální genové sekvence, a genového konstruktu, obsahujícího tento syntetický gen. Obecně je vynález zaměřen na modifikaci genové exprese a syntetických genů pro modifikaci endogenní genové exprese v buňce, tkáni nebo orgánu transgenního organismu, zejména transgenního zvířete nebo rostliny. Předkládaný vynález využívá technologie rekombinantní DNA k posttranskripční modifikaci nebo modulaci exprese cílového genu v buňce, tkáni nebo orgánu nebo v celém organismu, čímž se vytvářejí nové fenotypy. Vynález také poskytne nové syntetické geny a genové konstrukty, které jsou schopné potlačit, zpozdit nebo jinak redukovat expresi endogenního genu nebo cílového genu v organismu, do kterého jsou vneseny.
Dosavadní stav techniky
Bibliografické údaje o publikacích, které představují stav techniky, relevantní pro předkládaný vynález, jsou uvedeny na konci popisu vynálezu.
Termín „odvozený“ znamená v předkládaném popisu, že určený specifický celek může být získán z konkrétně specifikovaného zdroje nebo biologického druhu, i když nikoliv nezbytně přímo z takto specifikovaného zdroje nebo biologického druhu.
V celém popisu vynálezu termíny „obsahuje“ a jeho modifikace jako např. „obsahující“ znamenají, pokud nevyplývá ze souvislosti něco jiného, zahrnutí daného kroku nebo prvku nebo celku nebo skupiny kroků, prvků nebo celků, a současně neznamená vyloučení jakýchkoliv dalších kroků, prvků nebo celků nebo skupin prvků nebo celků.
Pro každého odborníka, pracujícího v daném oboru, že zřejmé, že vynález popsaný v tomto popisu je přístupný variacím na modifikacím toho, co je zde specificky popsáno. To znamená, že tyto variace a modifikace jsou také součástí předkládaného vynálezu. Vynález zahrnuje také všechny kroky, vlastnosti, přípravky a sloučeniny, na které se odvolává nebo které jsou uvedeny v popisu, individuálně i kolektivně, a také jakoukoliv ze všech možných kombinací nebo kterékoliv dva a více kroků nebo vlastností.
Předkládaný vynález není nikterak omezen pouze na specifická provedení, popsaná zde pouze jako příklady. Funkčně ekvivalentní produkty, přípravky a způsoby spadají do předmětu předkládaného vynálezu, jak je zde popsán.
Sekvence, označené identifikačními čísly (jako např. sekvence id č. 1), obsahující informace o nukleotidových sekvencích nebo aminokyselinových sekvencích, jsou uvedeny na konci jako seznam sekvencí a byly připraveny pomocí počítačového programu Patentln verze 2,0. Každá nukleotidová nebo aminokyselinová sekvence je identifikována v seznamu sekvencí numerickým identifikátorem <210> následovaným identifikátorem sekvence (tedy např. <210>l, <2102 atd.). Délka a typ sekvence (DNA, protein (=PRT) atd.) a zdrojový organismus jsou pro každou nukleotidovou nebo aminokyselinovou sekvenci uvedeny v informacích v polích, označených indikátory <211>, <212> a <213>. Každá nukleotidová nebo aminokyselinová sekvence, na kterou se v popisu odkazuje, je definováno v poli s indikátorem <400, následovaným identifikátorem sekvence (tedy např. <400> 1, <400>2, atd.).
Označení nukleotidů je uvedeno podle doporučení Biochemické nomenklaturní komise IUPACIUB, kde A představuje adenin, C představuje cytosin, G představuje guanin, T představuje thymin, Y představuje pyrimidinový zbytek, R představuje purinový zbytek, M představuje adenin nebo cytosin, K představuje guanin nebo thymin, S představuje guanin nebo cytosin, W představuje adenin nebo thymin, H představuje nukleotid jiný než guanin, B představuje nukleotid jiný než adenin, V představuje nukleotid jiný než thymin, D představuje nukleotid jiný než cytosin aN představuje jakýkoliv nukleotidový zbytek.
Označení aminokyselinových zbytků podle doporučení Komise pro biochemickou nomenklaturu IUPAC-IUB je uvedenou v následující tabulce 1.
Řízení metabolických drah v eukaryotickém organismu je potřebné kvůli možnosti vytvářet v nich nové znaky nebo vnášet nové znaky do určitých buněk, tkání nebo orgánů těchto organismů. I když technologie rekombinantní DNA významně pokročila v porozumění mechanismu, jakým je regulována eukaryotická genová exprese, mnohem menší pokrok byl učiněn ve skutečném ovlivňování genové exprese, aby se vytvářely nové znaky. Jsou tedy k dispozici omezené prostředky, kterými člověk může modulovat hladinu genové exprese ueukaryot.
Jedna možnost, jak potlačit (reprimovat), zpozdit nebo jinak redukovat genovou expresi, využívá molekulu mRNA, která je transkribována z řetězce, jaderného genu, komplementárního ktomu řetězci, který je normálně transkribován a je schopen translace do peptidu. Ačkoliv přesný mechanismus, na kterém je tento postup založen, není znám, bylo navrženo, že se párováním bází mezi komplementárními sekvencemi může vytvářet dvouřetězcová mRNA a vytváří se tak komplex, který je translatován s nízkou účinností a/nebo je degradován intracelulárními ribonukleázovými enzymy ještě před translací.
Tabulka 1
Označení aminokyselinových zbytků podle doporučení Komise pro biochemickou nomenklaturu IUPAC-IUB
Aminokyselina Třípísmenný kód Jednopísmenný kód
Alanin Ala A
Arginin Arg R
Asparagin Asn N
Asparagová kyselina Asp D
Cystein Cys C
Glutamin Gin Q
Glutamová kyselina Glu E
Glycine Gly G
Histidin His H
Isoleucin Ile I
Leucin Leu L
Lysin Lys K
Methionin Met M
Fenylalanin Phe F
Prolin Pro P
Serin Ser S
Threonin Thr T
Tryptofan Trp w
Tyrosin Tyr Y
Valin Val v
Asparagová k./Asparagin Baa B
Glutamová k./Glutamin Zaa Z
jakákoliv aminokyselina Xaa X
-2CZ 295108 B6
Alternativně exprese endogenního genu v buňce, tkání nebo orgánu může být potlačena, když se do buňky vnese jedna nebo více kopií tohoto genu nebo jedna více kopií v podstatě podobného genu. Mechanismus tohoto jevu nebyl dosud objasněn a zdá se, že zahrnuje z hlediska mechanismu heterogenní procesy. Tak např. bylo navrženo, že zahrnuje transkripční represi, kdy se vytváří somaticky dědičný reprimovaný stav chromatinu nebo alternativně zahrnuje posttranskripční umlčení, kdy dochází normálně k iniciaci transkripce, ale RNA produkty takového „kosuprimovaného“ genu jsou následně eliminovány.
Účinnost obou těchto přístupů v zaměření exprese specifických genů je velmi nízká a obvykle byly získány velmi variabilní výsledky. Při použití různých úseků genu, např. 5'-netranslatovaných úseků, 3'-netranslatovaných úseků, kódujících sekvencí nebo intronových sekvencí, pro zaměření genové exprese byly získány velmi nekonzistentní výsledky. Tudíž dosud neexistuje shoda v tom, jaké genové sekvence poskytují nejúčinnější prostředek k represi, zpoždění nebo jiné redukci genové exprese při použití současných technik. Navíc existuje tak velká variabilita mezi generacemi, že není vůbec možné předvídat míru represe specifického genu u potomstva organismu, ve kterém byla exprese významně modifikována.
Nedávno Dorer a Henikoff (1994) provedli umlčení tandemově opakovaných kopií genu v genomu Drosophila a také transkripční represi rozptýlených (disperzních) genů Adh Drosopila pomocí genů Polycomb (tj. systém Pc-G, Pal-Bhadra a kol., 1997). Avšak takové umlčení tandemově opakovaných kopií genu je v podstatě bez užitku při snaze o manipulaci genové exprese ve zvířecích buňkách metodami rekombinantní DNA, kdy sekvence, schopné zacílení exprese určitého genu, jsou vneseny do různých rozptýlených míst genomu, bez kombinace tohoto přístupu s technologií zaměřování/cílení genů. Ačkoliv je to teoreticky možné, dá se očekávat, že takováto kombinace by byla jen velmi málo účinná, vzhledem ke známé nízké účinnosti zaměřování genů, a kromě toho by vyžadovala velmi složitý vektorový systém. Navíc využití transkripční represe, jako je např. systém Drosophila Pc-G, by vyžadovala získat nějaké znalosti o regulačních mechanismech, které by byly schopné modulovat expresi jakéhokoliv cílového genu, a tudíž by bylo možné tuto metodu zavést do praxe jako obecnou metodu represe, zpoždění nebo redukce genové exprese ve zvířecích buňkách.
Nedostatečné poznání mechanismů, které jsou podstatou těchto jevů, znamená, že v této oblasti, tj. ve zlepšování technik pro modulaci genové exprese, zejména zpoždění, represi nebo jinou redukci exprese specifického genu metodami rekombinantní DNA, byl pokrok dosud velmi malý. Kromě toho, v důsledku nepředvídatelnosti výsledků těchto metod, neexistuje dosud žádný komerčně životaschopný prostředek pro modulaci hladiny genové exprese specifického genu v eukaryotickém nebo prokaryotickém organismu.
Existuje tedy stálá potřeba zlepšit metody modulace genové exprese, zejména represe, zpoždění nebo jiné redukce genové exprese ve zvířecích buňkách, které by umožnily do nich vnášet nové znaky. Tyto metody by poskytly obecné prostředky pro fenotypovou modifikaci, aniž by bylo nutné užívat současně metody zaměřování genů.
Podstata vynálezu
Podstatou předmětného vynálezu je syntetický gen, obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu, zahrnující přinejmenším dvě kopie strukturální genové sekvence, kde první kopie této strukturální genové sekvence je přinejmenším z 80 % identická s nukleotidovou sekvencí úseku cílového genu a druhá kopie této strukturální genové sekvence je přinejmenším z 80 % identická s nukleotidovou sekvencí, komplementární k úseku cílového genu, a
-3 CZ 295108 B6 kde syntetický gen je schopný post-transkripční represe, zpoždění nebo jiné redukce exprese tohoto cílového genu, jestliže je exprimován v hostitelské buňce savce sekvenčně-specifickou degradaci RNA transkripce cílového genu endogenním hostitelským buněčným systémem.
Ve výhodné provedení je uvedená první kopie strukturální genové sekvence přinejmenším z 85 % identická se sekvencí oblasti cílového genu a uvedená druhá kopie strukturální genové sekvence je přinejmenším z 85 % identická s nukleotidovou sekvencí, komplementární k úseku cílového genu, podle ještě výhodnějšího provedení je uvedená první kopie strukturální genové sekvence přinejmenším z 90 % identická se sekvencí oblasti cílového genu a uvedená druhá kopie strukturální genové sekvence je přinejmenším z 90 % identická s nukleotidovou sekvencí, komplementární k úseku cílového genu, podle ještě výhodnějšího provedení je uvedená první kopie strukturální genové sekvence přinejmenším z 95 % identická se sekvencí oblasti cílového genu a uvedená druhá kopie strukturální genové sekvence je přinejmenším z 95 % identická s nukleotidovou sekvencí, komplementární k úseku cílového genu, a podle nejvýhodnějšího provedení podle předmětného vynálezu je uvedená první kopie strukturální genové sekvence přinejmenším z 99 % identická se sekvencí oblasti cílového genu a uvedená druhá kopie strukturální genové sekvence je přinejmenším z 99 % identická s nukleotidovou sekvencí, komplementární k úseku cílového genu.
Podle dalšího provedení podle vynálezu jsou uvedené přinejmenším dvě kopie uvedené strukturální genové sekvence invertované repetice ve stejném pásu nukleové kyseliny.
Podle dalšího provedení podle vynálezu jsou uvedené přinejmenším dvě kopie uvedené strukturální genové sekvence odděleny vloženým fragmentem nukleové kyseliny.
Podle dalšího provedení podle vynálezu je buňka savce myší buňka.
Podle dalšího provedení podle vynálezu je cílový gen endogenní gen, přičemž podle dalšího provedení podle vynálezu je cílovým genem a-l,3-galaktosyntransferáza.
Podle dalšího provedení podle vynálezu jsou uvedené přinejmenším dvě kopie uvedené strukturální genové sekvence umístěny operativně pod kontrolu jediné promotorové sekvence.
Podle dalšího provedení podle vynálezu je každá z uvedených kopií strukturální genové sekvence odděleně a operativně napojena na oddělenou promotorovou sekvenci.
Podle dalšího provedení podle vynálezu je každá z uvedených kopií strukturální genové sekvence operativně napojena na prostorově oddělené promotorové sekvence, přičemž výhodně je uvedená promotorová sekvence CMV promotorová sekvence.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží genový konstrukt, obsahující syntetický gen podle předmětného vynálezu, definovaný výše.
Předkládaný vynález je zčásti založen na překvapivém objevu, spočívajícím v tom, že buňky, které vykazují jeden nebo několik požadovaných znaků, mohou být připraveny nebo selektovány z transformovaných buněk, obsahujících molekulu nebo selektivovány z transformovaných buněk, obsahujících molekulu nukleové kyseliny operativně spojenou s promotorem, když transkripění produkt molekuly nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je v podstatě identická s nukleotidovou sekvencí transkriptu endogenního nebo ne-endogenního cílového genu, jehož exprese má být modulována. Z transformovaných buněk je regenerována celá tkáň, orgány nebo organismus, které vykazují nové znaky, zejména rezistenci k virům a modifikovanou expresi endogenních genů.
Předmětný vynález je tudíž možno využít k modulaci exprese cílového genu ve zvířecí buňce, tkání nebo orgánu, přičemž tento postup zahrnuje alespoň krok, kdy se do buňky, tkáně nebo
-4CZ 295108 B6 orgánu vnese jedna nebo několik rozptýlených molekul nukleové kyseliny nebo cizorodých molekul nukleové kyseliny, obsahujících několik kopií nukleotidové sekvence, která je v podstatě identická s nukleotidovou sekvencí cílového genu nebo jeho úseku, neboje k nim komplementární, a to na dobu a v podmínkách, které jsou dostatečné ktomu, aby translace mRNA produktu cílového genu byla modifikována, a to za předpokladu, že není výhradně reprimována nebo redukována transkripce mRNA produktu.
Ve zvláště výhodném provedení podle vynálezu rozptýlené molekuly nukleové kyseliny nebo cizorodé molekuly nukleové kyseliny obsahují nukleotidové sekvence, které kódují několik kopií molekuly mRNA, která je v podstatě identická s nukleotidovou sekvencí mRNA produktu cílového genu. Výhodněji několik kopií cílové molekuly představuje sekvenci tandemové přímé repetice.
Podle dalšího výhodného provedení podle vynálezu rozptýlené molekuly nukleové kyseliny nebo cizorodé molekuly nukleové kyseliny jsou v exprimovatelné formě, aby byly schopny alespoň transkripce a vytvořily mRNA produkt.
Cílový gen může být gen, který je endogenní pro zvířecí buňku, nebo je to cizorodý gen, jako je např. virová nebo cizorodá genové sekvence. Výhodně je cílový gen sekvence virového genu.
Předkládaný vynález je zvláště využitelný pro modulaci eukaryotické genové exprese, zvláště modulaci genové exprese člověka a zvířat a zejména modulaci genové exprese genů, pocházejících z obratlovců i bezobratlých, jako je např. hmyz, vodní živočichové (např. ryby, měkkýši, škeble, korýši, jako např. krabi, humry, krevety, ptáci a také savci).
Celá řada znaků je selektovatelná užitím vhodných postupů a dostatečného množství transformovaných buněk. K takovým znakům patří, aniž by však výčet byl jakkoliv omezující, viditelné znaky, znaky, související s odolností proti nemocím a znaky, související s odolností kpatogenům. Modulační účinek lze aplikovat na řadu genů, exprimovaných v rostlinách a zvířatech, jako jsou např. endogenní geny buněčného metabolismu nebo buněčné transformace, včetně onkogenů, transkripčních faktorů a dalších genů, které kódují polypeptidy, účastnící se buněčného metabolismu.
Tak např. je možné dosáhnout změny ve tvorbě pigmentu u myši tím, že se v ní zaměří genová exprese genu tyrosinázy. Tím vznikne nový fenotyp albinismu u černé myši. Zaměřením genů v rostlinných nebo živočišných buňkách, které jsou nezbytné pro replikaci viru, je možné vnést genový konstrukt, obsahující několik kopií nukleotidové sekvence, kódující virovou replikázu, polymerázu, obalový protein nebo ten pro rozbalování, nebo proteázu, do buňky, kde dojde k expresi, a tím se buňce poskytuje imunita k viru.
Jak již bylo uvedeno, podle vynálezu rozptýlená molekula nukleové kyseliny nebo cizorodá molekula nukleové kyseliny obecně obsahuje nukleotidovou sekvenci, která má vyšší než 85 % identitu se sekvencí cílového genu, avšak vyšší homologie může vést kúčinnější modulaci exprese cílového genu. Podstatně vyšší homologie, vyšší než 90% je proto výhodná, a ještě výhodnější je potřebná 95% homologie až absolutní identita.
Vnesená rozptýlená molekula nukleové kyseliny nebo cizorodá molekula nukleové kyseliny nemusí být absolutně homologní a ani nemusí mít plnou délku vzhledem k primárnímu transkripčnímu produktu nebo plně opracované mRNA cílového genu. Vyšší homologie v úseku kratší než je plné délka sekvence kompenzuje delší sekvenci s nižší homologií. Kromě toho vnesená sekvence nemusí mít stejný vzorek intronů nebo exonů, a homologie v nekódujících segmentech je stejně účinná. Typicky je užita sekvence delší než 20 až 100 nukleotidů, i když výhodná je sekvence delší než 200 až 300 nukleotidů, a zvláště výhodná je sekvence delší než 500 až 1000 nukleotidů, v závislosti na velikosti cílového genu.
Jak již bylo uvedeno, do rozsahu vynálezu náleží syntetický gen, který je schopen modifikovat expresi cílového genu v buňce, tkáni nebo orgánu polykaryotického nebo eukaryotického
-502 205108 Μ organismu, který je tím genem transfekován nebo transformován, přičemž tento syntetický gen obsahuje alespoň rozptýlenou molekulu nukleové kyseliny nebo cizorodou molekulu nukleové kyseliny, obsahující několik kopií nukleotidové sekvence, která je v podstatě identická s nukleotidovou sekvencí cílového genu, nebo její derivát nebo sekvenci komplementární, operativně spojenou a řízenou promotorovou sekvencí, která je funkční v dané buňce, tkáni nebo orgánu.
Podle dalšího provedení je syntetický gen podle vynálezu schopen modifikovat expresi cílového genu v buňce, tkáni nebo orgánu prokaryotického nebo eukaryotického organismu, který je tím genem transfekován nebo transformován, přičemž syntetický gen obsahuje několik sekvencí strukturálních genů, přičemž každá ze sekvencí těchto strukturních genů obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je v podstatě identická s nukleotidovou sekvencí cílového genu, nebo její derivát nebo sekvenci komplementární, přičemž sekvence strukturních genů jsou operativně spojeny a řízeny jedinou promotorovou sekvencí, která je funkčně vdané buňce, tkáni nebo orgánu.
Podle dalšího provedení je syntetický gen podle vynálezu schopen modifikovat expresi cílového genu v buňce, tkáni nebo orgánu prokaryotického nebo eukaryotického organismu, který je tímto genem transfekován nebo transformován, přičemž syntetický gen obsahuje alespoň několik sekvencí strukturních genů, přičemž každá ze sekvencí těchto strukturních genů je operativně spojena a řízena promotorovou sekvencí, která je funkční v dané buňce tkáni nebo orgánu, a každá ze sekvencí strukturních genů obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je v podstatě identická s nukleotidovou sekvencí cílového genu, nebo její derivát nebo sekvenci k ní komplementární.
Do rozsahu předmětného vynálezu náleží genový konstrukt, který je schopen modifíkovatexpresi endogenního genu nebo cílového genu v transformované nebo transfekované buňce, přičemž tento genový konstrukt obsahuje alespoň syntetický gen podle předkládaného vynálezu a jeden nebo několik replikačních počátků a/nebo sekvencí genů selekčních markérů.
Aby bylo možné pozorovat mnoho nových znaků u mnohabuněčných organismů, jako jsou rostliny nebo zvířata, a zejména takové, které jsou tkáňově nebo orgánově specifické nebo vývojově regulované, je potřeba vytvořit z transformované buňky, nesoucí syntetický gen nebo genový konstrukt podle předkládaného vynálezu, celý organismus. Odborníkovi z tohoto oboru je zřejmé, že to vyžaduje regeneraci celého organismu z transformovaných rostlinných nebo živočišných buněk, skupiny těchto buněk nebo tkáně či orgánu. Přitom odborníkům z tohoto oboru jsou známy standardní metody regenerace některých rostlin a zvířat z izolovaných buněk a tkání.
Podle předmětného vynálezu je takto možno vytvořit buňky, tkáně nebo orgány, které obsahují syntetické geny nebo genové konstrukty podle vynálezu.
Předkládaný vynález je možno využít pro modulaci genové exprese cílového genu v buňce, tkáni nebo orgánu, přičemž tento postup obsahuje alespoň jeden krok, kdy se do buňky, tkáně nebo orgánu vnese jedna nebo několik rozptýlených nebo cizorodých molekul nukleové kyseliny, obsahující několik kopií nukleotidové sekvence, která je v podstatě shodná s nukleotidovou sekvencí cílového genu nebo jejím úsekem nebo k ní komplementární sekvencí, a to na dobu a v podmínkách, dostačujících pro translaci mRNA produktu cílového genu, který má být modifikován, za předpokladu, že transkripce mRNA produktu není výlučně reprimována nebo redukována.
Výrazem „několik kopií“ je míněno to, že jsou přítomny dvě nebo více kopií cílového genu v těsném fyzickém spojení nebo ležící vedle sebe ve stejné molekule nukleové kyseliny, ve shodné nebo odlišné orientaci, případně oddělené „vloženým fragmentem“ nebo mezi generovým úsekem pro usnadnění vytváření sekundární struktury mezi každou repeticí, pokud je to třeba. Vložený fragment může obsahovat jakoukoliv kombinaci nukleotidů nebo aminokyselinových zbytků, nebo molekul sacharidů nebo oligosacharidů nebo atomů uhlíku nebo jejich homologů, analogů nebo derivátů, které mohou být kovalentně spojeny s molekulou nukleové kyseliny.
-6CZ 295108 B6
Ve výhodném provedení vložený fragment obsahuje nukleotidovou sekvenci nebo její homolog, analog nebo derivát.
Výhodněji vložený úsek obsahuje nukleotidovou sekvenci alespoň velikosti 10 až 50 nukleotidů, ještě výhodněji 50 až 10 nukleotidů a nejvýhodněji alespoň 100 až 500 nukleotidů.
V případě, kdy rozptýlená nebo cizorodá nukleová kyselina obsahuje sekvenci sestřihového místa intron/exon, může vložený fragment sloužit jako intronová sekvence, umístěná mezi 3'-sestřihové místo strukturního genu v blízkosti 5'- konci genu a 5'-sestřihové místo jeho následující jednotky po směru transkripce („downstream“). Alternativně, pokud je třeba, aby byly translatovány více než dvě sousední nukleotidové sekvenční jednotky rozptýlené cizorodé nukleové kyseliny, vložený fragment umístěný mezi ně nesmí obsahovat stop-kodon translace v souladu se čtecím rámcem, sekvenci sestřihovaného místa intron/exon ani na jednom svém konci, ani nesmí být dodatečný iniciační kodon translace na 5'-konci každé jednotky, jak je odborníkům zřejmé.
Výhodné vložené fragmenty jsou fragmenty, které kódují detekovatelné markerové proteiny nebo jejich biologicky aktivní analogy nebo deriváty, jako je např. luciferáza, β-galakturonáza, β-galaktosidáza, chloramfenikolacetyltransfe-ráza a zelený fluorescenční protein a další. Ani jiné vložené fragmenty nejsou vyloučeny.
Podle tohoto provedení detekovatelný markér nebo jeho analog nebo derivát slouží jako indikátor exprese syntetického genu podle předkládaného vynálezu v buňce, tkáni nebo orgánu, tím, že poskytuje specificky detekovatelný fenotyp, výhodně vizuálně detekovatelný fenotyp.
Termín „modulovat“ nebo podobný se v popisu užívá v tom smyslu, že exprese cílového genu je redukována z hlediska amplitudy a/nebo načasování genové exprese je zpožděno a/nebo vývojový nebo tkáňově specifický vzorek exprese cílového genu je změněn ve srovnání s expresí téhož genu bez přítomnosti způsobu podle předkládaného vynálezu.
Aniž by tím byl omezen rozsah vynálezu, je možno předpokládaný vynález využít k modulaci genové exprese, která obsahuje represi, zpoždění nebo redukci amplitudy exprese cílového genu ve specifické buňce, tkáni nebo orgánu eukaryotického organismu, zejména rostlině, jako je jednoděložná nebo dvouděložná rostlina, nebo zvířeti či člověku, a zvláště pak u obratlovců či bezobratlých, jako jsou zejména hmyz, vodní živočichové (např. ryby, škeble, měkkýši, korýši, jako krabi, humry a krevety), ptáci a savci a další.
Výhodně je exprese cílového genu úplně inaktivována molekulami rozptýlené nukleové kyseliny nebo molekulami cizorodé nukleové kyseliny, které byly vneseny do buňky, tkáně nebo orgánu. Bez ohledu na stávající teorie nebo známé mechanismy účinku, snížená nebo zcela eliminovaná exprese cílového genu, která je výsledkem aplikace předkládaného vynálezu, může být důsledkem snížené nebo opožděné translace transkripčního produktu mRNA cílového genu, alternativně důsledkem zabránění translace dané mRNA, a sice v důsledku sekvencně-specifícké degradace mRNA transkriptu cílového genu endogenním systémem hostitele.
Zvláště výhodné je, pro dosažení optimálních výsledků, když k sekvenčně-specifické degradaci cílového genu dochází buďto před okamžikem či obdobím kdy by byl transkript mRNA cílového genu normálně translatován, a nebo přímo v tomto okamžiku či v tomto stadiu. Tudíž selekce vhodné promotorové sekvence pro řízení exprese vnesené molekuly rozptýlené nebo cizorodé nukleové kyseliny je důležitým momentem pro optimální vlastnosti vynálezu. Z tohoto důvodu jsou pro regulaci exprese vnesené molekuly rozptýlené nebo cizorodé nukleové kyseliny zvláště vhodné silné konstitutivní promotory nebo indukovatelné promotorové systémy.
Tento vynález je možno rovněž využít ke snížení exprese cílového genu, ke které dojde v důsledku snížené transkripce, a sice za předpokladu, že snížená transkripce není jediným
-7CZ 295108 B6 mechanismem, který redukci exprese způsobuje, a redukce transkripce je alespoň doprovázena současnou redukcí translace ustálené „zásoby“ (pool) molekul mRNA.
Cílovým genem je genová sekvence, která je pro daný organismus endogenní, nebo jde o cizorodou sekvenci, jako je např. sekvence, získaná z viru nebo jiného patogenního organismu, která je schopna vstoupit do buňky a po infekci využívat buněčný metabolismus hostitelské buňky. Když je cílovým genem cizorodá sekvence (tj. jiná než endogenní), je třeba, aby tato sekvence kódovala funkci, která je nezbytná pro replikaci nebo reprodukci virového nebo jiného patogenu.
V takovém provedení je předkládaný vynález zvláště vhodný k profylaxi a k léčení virových infekcí u zvířat nebo k vnášení rezistence či stimulaci rezistence proti danému patogenu.
Výhodně cílový gen obsahuje jednu nebo několik nukleotidových sekvencí virového patogenu rostlinné nebo zvířecí buňky, tkáně nebo orgánu.
Tak např. v případě člověka nebo zvířat virovým patogenem je retrovirus, lentivirus, jako např. virus imunodefícience, nebo virus s jednořetězcovou (+)RNA, jako je bovinní enterovirus (BEV) nebo alfavirus Sinbis. Alternativně cílový gen obsahuje jednu nebo několik nukleotidových sekvencí virového patogenu rostlinné nebo zvířecí buňky, tkáně nebo orgánu, jako je virus, obsahující dvouřetězcovou DNA, např. bovinní Herpes virus nebo virus Herpes simplex I (HSVI), přičemž výčet není nijak omezen.
V případě rostlin je virovým patogenem výhodně potyvirus, caulimovirus, bandavirus, geminivirus, reovirus, rhabdovirus, bunyavirus, tospovirus, tenuivirus, tombusvirus, luteovirus, sobemovirus, bromovirus, cucomovirus, ilavirus, alfamovirus, tobamovirus, tobravirus, potexvirus a clostrovirus, jako jsou např. viry CaMV, SCSV, PVX, PVY, PLRV, and TMV, přičemž tento výčet vynález nijak neomezuje.
Pokud se zvláště týká virových patogen, odborníkovu je známo, že virem kódované funkce mohou být komplementovány v trans polypeptidy, kódovanými hostitelskou buňkou. Např. replikace genomu bovinního Herpes viru v hostitelské buňce je umožněna DNA polymerázou hostitelské buňky, která je schopná nahradit inaktivovaný gen virové DNA polymerázy.
Tudíž pokud je cílovým genem jiná nebo endogenní sekvence zvířecí buňky, další provedení vynálezu se týká cílového genu, kódujícího virový nebo jiný polypeptid, který nemůže být komplementován hostitelskou buňkou, jako je např. virově specifická genová sekvence. K příkladům takových cílových genů podle předkládaného vynálezu patří geny, které kódují virové obalové proteiny, rozbalovací proteiny, RNA-dependentní DNA polymerázu a RNAdependentní RNA polymerázu, přičemž tento výčet není omezující.
Ve zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu cílovým genem je gen RNA-dependentní RNA polymerázy z BEV nebo jeho homolog, analog či derivát, nebo sekvence kódující Nia proteázu z PVY.
Buňky, ve kterých je modifikovaná exprese cílového genu, mohou být jakákoliv buňky, pocházející z mnohabuněčných organismů, rostlin a zvířat, včetně jejich buněčných a tkáňových kultur. Výhodně živočišné buňky pocházející z hmyzu, hadů, obojživelníků, ptáků a savců včetně člověka. K příkladům vhodných buněk patří embryonální kmenové buňky, kultivované kožní fibroblasty, nervové buňky, somatické buňky, hematopoetické kmenové buňky, T-buňky, a imorgalizované buněčné linie, jako jsou buňky COS, VĚRO, HeLa, myší buňky C127, buňky ovarií čínského křečka CHO, buňky WI-38, buňky ledvin křeččích mláďat BHK nebo buňky MDBK a další. Tyto buňky jsou odborníkům v podstatě kdykoliv k dispozici. Tudíž tkáň nebo orgán, kde je exprese cílového genu modifikován podle vynálezu, může být kterákoliv tkáň nebo orgán, obsahující výše uvedené buňky.
-8CZ 295108 B6
Rostlinné buňky výhodně pocházejí z druhů dvouděložných nebo jednoděložných rostlin nebo z buněčných linií z nich odvozených.
Termín „rozptýlená molekula nukleové kyseliny“ v popisu vynálezu označuje molekulu nukleové kyseliny, která obsahuje jednu nebo více vícečetných kopií, výhodně přímé tandemové repetice, nukleotidové sekvence, která je v podstatě identická nebo komplementární s nukleotidovou sekvencí genu, který pochází z buňky, tkáně nebo orgánu, do kterých je molekula nukleové kyseliny vnesena, přičemž tato molekula nukleové kyseliny není endogenní v tom smyslu, že je do buňky, tkáně nebo orgánu vnesena rekombinantními prostředky a obecně je pak přítomna ve formě extrachromozomové nukleové kyseliny, alternativně jako integrovaná nukleová kyselina, která však není geneticky spojena s daným genem. „Rozptýlená molekula nukleové kyseliny“ podle vynálezu zvláště obsahuje chromozomovou nebo extrachromozomovou nukleovou kyselinu, která není ve vazbě ve fyzikální mapě, s cílovým genem, proti které je namířena, a sice proto, že s ním není tandemově spojena nebo obsazuje jinou chromozomovou pozici na stejném chromozomu nebo je lokalizována na jiném chromozomu nebo je přítomna v buňce jako epizom, plazmid, kozmid nebo virová částice.
Termín „cizorodá molekula nukleové kyseliny“ v popisu předkládaného vynálezu označuje izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která obsahuje jednu nebo více vícečetných kopií, výhodně přímých tandemových repetic, nukleotidové sekvence pocházející z genové sekvence organismu, který je odlišný od organismu, do kterého byla molekula cizorodé nukleové kyseliny vnesena. Tato definice zahrnuje molekuly nukleové kyseliny, pocházející z odlišného jedince stejného nejnižšího taxonomického uskupení (tj. ze stejné populace), jako je taxonomické uskupení jedince, do kterého je daná molekula nukleové kyseliny vnesena, stejně tak jako molekula nukleové kyseliny, pocházející z odlišného jedince z odlišné taxonomické skupiny, než je taxonomická skupina jedince, do kterého je daná molekula nukleové kyseliny vnesena, jako je např. gen, pocházející z virového patogenu. Tudíž cílovým genem, proti kterému působí molekula cizorodé nukleové kyseliny při provedení vynálezu, může být molekula nukleové kyseliny, která byla přenesena z jednoho organismu do druhého pomocí transformace nebo jinou technikou přenosu gen. K příkladům cílových genů podle tohoto provedení vynálezu patří gen, kódující zelený fluorescenční protein z medúzy Aequaria victoria (Prasher a kol., 1992; mezinárodní publikovaná patentová přihláška WO 95/07463), gen pro tyrosinázu, zejména myší gen pro tyrosinázu (Kwon a kol., 1988), gen lad z Escherichia coli, kódující polypeptidový represor genu lacZ, prasečí gen pro a-l,3-galaktosytransferázu (NCBI přístupové číslo L36535), uvedené zde jako příklady, a dále strukturní geny PVY a BEV, uvedené zde jako příklady, nebo homology, analogy a deriváty těchto genů, nebo k nim komplementární sekvence.
Předkládaný vynález je rovněž využitelný pro současné zaměření exprese několika cílových genů, které jsou současně exprimovány (ko-exprimovány) v určité buňce, např. pomocí molekuly rozptýlené nukleové kyseliny nebo cizorové nukleové kyseliny, obsahující nukleotidovou sekvenci, která je v podstatě identická s každým z ko-exprimovaných cílových genů.
Termín „v podstatě identický“ je myšleno to, že vnesená molekula rozptýlené nukleové kyseliny nebo cizorodé nukleové kyseliny podle vynálezu a sekvence cílového genu jsou dostatečně identické na úrovni nukleotidové sekvence ktomu, aby došlo k párování bází mezi nimi za standardních intracelulámích podmínek.
Výhodně nukleotidová sekvence každé z repecit v molekule rozptýlené nukleové kyseliny nebo cizorodé nukleové kyseliny podle vynálezu a nukleotidové sekvence, představuje část cílového genu, jsou alespoň z 80 až 85 % identické na úrovni nukleotidové sekvence, výhodněji jsou identické alespoň z 85 až 90 %, ještě výhodněji alespoň z 90 až 95 % a nejvýhodněji je mezi nimi identita alespoň 95 až 99 %, nebo dokonce mohou být ze 100 % identické na úrovni nukleotidové sekvence.
-9CZ 295108 B6
Přestože předkládaný vynález není nijak omezen co do počtu opakovaných sekvencí v molekule rozptýlené nukleové kyseliny nebo cizorodé nukleové kyseliny, je nutné rozumět, že předkládaný vynález vyžaduje, aby alespoň dvě kopie sekvence cílového genu byly v buňce exprimovány. Výhodně jsou přítomny vícečetné kopie sekvence cílového genu v molekule rozptýlené nukleové kyseliny nebo cizorodé nukleové kyseliny, jakožto tandemové invertované repetice a/nebo tandemové přímé repetice. Taková uspořádání jsou ukázána na příkladu „testovacího plazmidu“, který obsahuje úseky genů Galt, BEV nebo PVY.
Výhodně molekula rozptýlené nukleové kyseliny nebo cizorodé nukleové kyseliny podle vynálezu, která je vnesena do buňky, tkáně nebo orgánu, obsahuje RNA nebo DNA.
Výhodně molekula rozptýlené nukleové kyseliny nebo cizorodé nukleové kyseliny podle vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci, nebo je komplementární k nukleotidové sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci, kódovanou cílovým genem. Ještě výhodněji, molekula nukleové kyseliny obsahuje jeden nebo více kodonů počátku translace ATG nebo AUG.
Pro vnesení molekuly rozptýlené nukleové kyseliny nebo cizorodé nukleové kyseliny podle vynálezu do buňky, tkáně nebo orgánu za účelem modulace exprese cílového genu se užijí standardní metody odborníkovi známé. Tak např. molekula nukleové kyseliny může být vnesena ve formě „nahé“ DNA nebo RNA, případně zabalené do liposomu, nebo ve virové částici jako oslabený virus nebo ve spojení s virovým obalem nebo virovým transportním proteinem nebo inertním nosičem, jako je např. zlato, a nebo ve formě rekombinantního virového nebo bakteriálního vektoru nebo jako genový konstrukt, kromě jiného.
Termín „podávání“ se míní injekční podávání nebo perorální podání a strávení (např. ve formě potravy obohacené léčivem) a další způsoby podávání.
Potřebná nukleová kyselina může být podána také pomocí živého přenosového systému, např. užitím bakteriálního expresního systému, optimalizovaného pro expresi v bakteriích, které mohou být vneseny do střevní flóry. Alternativně lze užít virový expresní systém. Jednou z forem může být podávání živého vektoru, obvykle ve formě spreje, potravy nebo vody, jejichž prostřednictvím je účinné množství živých vektorů (tj. viru nebo bakterií) podáno zvířeti. Jinou formou virového expresního systému je nereplikující se virový vektor, který je schopen infikovat buňku, ale nereplikovat se v ní. Nereplikující se virový vektor poskytuje prostředek pro vnesení genetického materiálu do zvířete nebo člověka pro transientní (přechodnou) expresi. Způsob podání takového vektoru je stejný jako u živého virového vektoru.
Nosiče, excipienty a/nebo ředidla jsou pomocné látky, které je třeba užít pro přenos požadovaných nukleových kyselin do hostitelské buňky v případě humánní lékařské nebo veterinární aplikace předkládaného vynálezu. Takové nosiče, excipienty a/nebo ředidla jsou odborníkům známy. K nosičům a ředidlům vhodným k veterinárnímu použití patří jakákoliv rozpouštědla, disperzní média, vodné roztoky, obalová média, antibakteriální a antifungální činidla, izotonizující činidla a činidla zpožďující absorpci apod. Pro přípravky tohoto typu připadají v úvahu dosud všechna obvyklá činidla nebo média, kromě těch, která jsou nekompatibilní s účinnou látkou. Do přípravků lze přidat také dodatkové účinné látky.
Předmětný vynález je možno využít k modulaci exprese cílového genu v buňce, tkáni nebo orgánu, přičemž tento postup obsahuje kroky, kdy se:
- vybere jedna nebo několik molekul rozptýlené nebo cizorodé nukleové kyseliny, obsahující vícečetné kopie nukleotidové sekvence, která je v podstatě identická s nukleotidovou sekvencí cílového genu nebo jeho úseku, nebo která je s ní komplementární,
- a molekula rozptýlené nebo cizorodé nukleové kyseliny se vnese do buňky, tkáně nebo orgánu na dobu a za podmínek, které jsou dostatečně k tomu, aby translace mRNA produktu
-10CZ 295108 B6 cílového genu byla modifikována, za předpokladu, že není výlučně reprimována nebo redukována transkripce mRNA produktu.
K tomu, aby byla vybrána vhodná nukleotidová sekvence pro zaměření exprese cílového genu, lze užít několik přístupů. V jednom provedení vynálezu vícečetné kopie specifických úseků charakterizovaného genu byly klonovány do operativního spojení s vhodným promotorem a pak byla testována jejich účinnost při redukci exprese cílového genu. Alternativně se připraví „shotgun“ genové knihovny, obsahující vícečetné kopie genových sekvencí a testuje se jejich účinnost při redukci exprese cílového genu. Výhodou při druhém z uvedených způsobů je to, že není nutná žádná předchozí znalost významu konkrétního cílového genu pro specifikaci nežádoucího fenotypu v buňce. Např. „shotgun“ knihovny, obsahující virové subgenomové fragmenty, se mohou užít a přímo testovat jejich schopnost poskytovat imunitu vůči viru na zvířecích buňkách, aniž by byla nutná předchozí znalost toho, který z virových genů hraje jakou roli při patogenezi v hostitelské buňce.
Termín „shotgun“ knihovna označuje souboru různých nukleotidových sekvencí, kde každý člen tohoto souboru je výhodně obsažen ve vhodném plazmidovém, kozmidovém, bakteriofágovém nebo virovém vektoru, který je vhodný pro udržování a/nebo replikaci v hostitelské buňce. Termín „shotgun knihovna“ zahrnuje reprezentativní knihovnu, kde rozsah diverzity nukleotidových sekvencí je takový, že všechny sekvence genomu organismu, ze kterého uvedená nukleotidová sekvence pochází, jsou v knihovně obsaženy, ale také limitovanou knihovnu, kde je menší stupeň diverzity sekvencí. Termín „shotgun knihovna“ zahrnuje také náhodné nukleotidové sekvence, přičemž nukleotidové sekvence jsou tvořeny fragmenty virového nebo buněčného genomu, které byly získány parciální štěpením genomové DNA restrikčními endonukleázami. „Shotgun“ knihovna také zahrnuje buňky, virové částice a bakteriofágy, obsahující jednotlivé nukleotidové sekvence souboru.
Výhodné „shotgun“ knihovny, použité podle předkládaného vynálezu, jsou „reprezentativní“ knihovny, obsahující souboru tandemů opakujících se nukleotidových sekvencí, pocházejících z virového patogenu rostlin nebo zvířat.
Ve zvláště výhodném provedení „shotgbun“ knihovna obsahuje buňky virové částice nebo bakteriofágy, obsahující různorodý souboru tandemových opakujících se nukleotidových sekvencí, které kódují různorodý soubor aminokyselinových sekvencí, přičemž každý člen tohoto souboru sekvencí je operativně vložen pod kontrolu promotorové sekvence, která je schopná řídit expresi uvedené tandemové opakované nukleotidové sekvence v buňce.
Nukleotidová sekvence každé jednotky v tandemové repetici (tandemově opakované nukleotidové sekvenci) tudíž obsahuje alespoň 1 až 200 nukleotidů. Použití delších fragmentů, zejména při použití náhodně naštěpené nukleové kyseliny viru, rostliny nebo zvířete, přitom není vyloučeno.
Vnesená nukleová kyselina je výhodně v exprimovatelné formě.
Termín „exprimovatelná forma“ znamená, že nukleová kyselina je přítomna v takovém uspořádání, že může být exprimována v buňce, tkáni, orgánu nebo celém organismu, alespoň na úrovni transkripce tj. v živočišné buňce je exprimována tak, že vzniká alespoň mRNA produkt, který je translatovatelný a případně je translatován do molekuly rekombinantního peptidu, olipeptidu nebo polypeptidů.
Jako příklad, aby bylo dosaženo exprese molekuly rozptýlené nebo cizorodé nukleové kyseliny v požadované buňce, tkáni nebo orgánu, byl připraven syntetický gen nebo genový konstrukt, obsahující syntetický gen, přičemž syntetický gen obsahuje nukleotidovou sekvenci, jak byla popsána výše, operativně spojenou s promotorovou sekvencí, která je schopna regulovat její expresi. Takže uvedená molekula nukleové kyseliny je operativně spojena s jedním nebo několika regulačním prvky, které jsou dostatečné ktomu, aby došlo k neukaryotické transkripci.
-11 CZ 295108 B6
Předmětný vynález je rovněž možno využít pro modulaci exprese cílového genu v živočišné buňce, tkáni nebo orgánu, přičemž tento způsob obsahuje přinejmenším kroky, kdy:
- se vybere jedna nebo několik molekul rozptýlené nebo cizorodé nukleové kyseliny, obsahující vícečetné kopie, výhodně tandemové repetice, nukleotidové sekvence, která je v podstatě identická s nukleotidovou sekvencí cílového genu nebo jeho úseku nebo je k ní komplementární,
- připraví se syntetický gen, obsahující molekulu rozptýlené nebo cizorodé nukleové kyseliny,
- syntetický gen se vnese do požadované buňky, tkáně nebo orgánu, a
- syntetický gen se exprimuje v požadované buňce, tkáni nebo orgánu po dobu a v podmínkách, které jsou dostatečné k tomu, aby translace mRNA produktu cílového genu byla modifikována,
- a to za předpokladu, že transkripce uvedeného mRNA produktu není výlučně reprimována nebo redukována.
Termín „gen“ a „geny“ je třeba v předkládaném popisu chápat v nejširším významu a zahrnují tudíž:
- klasické genomové geny, tvořené sekvencemi pro regulaci transkripce a translace a/nebo kódujícím úsekem/sekvencí a/nebo netranslatovanými sekvencemi (tj. introny, 5' a 3'-netranslatované sekvence), a/nebo
- mRNA nebo cDNA odpovídající kódujícímu úseku (tj. exonům) genu a 5'- a 3'-netranslatovaným sekvencím, a/nebo
- strukturní úsek odpovídající kódujícím úsekům (tj. exonům) případně dále obsahující netranslatované sekvence a/nebo heterologní promotorové sekvence, které vytvářejí regulační úseky transkripce a/nebo translace, které rozhodující o expresi strukturního úseku.
Termín „gen“ také zahrnuje syntetické nebo fúzní molekuly, kódující buďto celý funkční produkt nebo jeho část, zejména „sense“ nebo „antisense“ mRNA produkt nebo peptid, oligopeptid nebo polypeptid nebo biologicky aktivní protein.
Termín „syntetický gen“ označuje v předkládaném popisu gen, ve smyslu výše uvedené definice, který se však nevyskytuje v přírodě, který výhodně obsahuje alespoň jednu sekvenci pro regulaci transkripce a/nebo translace, operativně spojenou se strukturní genovou sekvencí.
Termín „strukturní gen nebo „strukturní sekvence“ označuje nukleotidovou sekvenci, která je schopna produkovat mRNA a případně kódující molekulu peptidů, oligopeptidu, polypeptidů nebo biologicky aktivního proteinu. Odborníkovu je známo, že ne všechny mRNA mohou být translatovány do peptidů, oligopeptidů, polypeptidů nebo proteinů, např. mRNA, postrádající funkční signál pro počátek translace, nebo mRNA, která je antisense mRNA. Předkládaný vynález zahrnuje i takové syntetické geny, které obsahují nukleotidové sekvence, které nemohou kódovat peptidy, oligopeptidy, polypeptidy nebo biologicky aktivní protein. Podle vynálezu bylo zjištěno, že takové geny jsou zvláště výhodné pro modifikaci exprese cílového genu v buňce, tkáni nebo orgánu prokaryotického nebo eukaryotického organismu.
Termín „strukturní genový úsek“ označuje část syntetického genu, která obsahuje molekulu rozptýlené nebo cizorodé nukleotidové sekvence, jak byla popsána výše, která je exprimována v buňce, tkáni nebo orgánu, pod kontrolou promotorové sekvence, se kterou je operativně spojena. Strukturní genový úsek může obsahovat jednu nebo několik molekul rozptýlené nebo cizorodé sekvence nukleové kyseliny operativně pod kontrolou jediné promotorové sekvence nebo několika promotorových sekvencí. Tudíž strukturní genový úsek syntetického genu může obsahovat nukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci neboje k takové sekvenci komplementární. Usek strukturního genu v provedení podle vynálezu může také obsahovat
-12CZ 295108 B6 nukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci, avšak postrádá funkční iniciační kodon translace a/nebo funkční stop-kodon translace, a tudíž neobsahuje úplný otevřený čtecí rámec. V této souvislosti tedy termín „strukturní genový úsek“ zahrnuje také nekódující nukleotidové sekvence, jako jsou sekvence 5'-upstream (na 5'- konci proti směru transkripce) a 3'-downstream (na 3'-konci po směru transkripce) genu, které by normálně nebyly translatovány v eukaryotické buňce, která exprimuje daný gen. Tudíž strukturní genový úsek obsahuje také fúzi dvou nebo více čtecích rámců téhož genu nebo různých genů. V takovém provedení lze vynález užít pro modulaci exprese jednoho genu, zaměřením jeho různých nesouvisejících úseků, alternativně k simultánní modulaci exprese několika různých genů, včetně různých genů multigenové rodiny. V případě fúzní molekuly nukleové kyseliny, která není endogenní pro živočišnou buňku, a zvláště která obsahuje dvě nebo více nukleotidových sekvencí, pocházejících z virového patogenu, fúze poskytuje další výhodu, a sice že uděluje simultánně imunitu nebo ochranu proti několika patogenům, tím, že zaměřuje expresi několika patogenů. Alternativně, a nebo navíc, fúze poskytuje účinnější imunitu proti patogenů tím že zaměřuje expresi více než jednoho genu určitého patogenů.
Zvláště výhodný strukturní genový úsek podle předkládaného vynálezu je úsek, který obsahuje alespoň jeden translatovatelný otevřený čtecí rámec, výhodněji včetně iniciačního kodonu translace na 5'-konci čtecího rámce, avšak nikoliv nezbytně na 5'-konci strukturního genového úseku. I když strukturní genový úsek obsahuje alespoň jeden translatovatelný otevřený čtecí rámec a/nebo AUG nebo ATG kodon počátku translace, vložení těchto sekvencí v žádném případě nepředpokládá, že by předkládaný vynález nutně vyžadoval translaci vnesené molekuly nukleové kyseliny, aby došlo k modulaci exprese cílového genu. Bez ohledu na stávající teorie a známé způsoby účinků, vložení alespoň jednoho translatovatelného čtecího rámce a/nebo translačního počátku do molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu slouží ke zvýšení stability jejího transkripčního produktu, a tím se zlepšuje účinnost předkládaného vynálezu.
Optimální počet sekvencí strukturních genů, které mohou být součástí syntetického genu podle vynálezu, je značně proměnlivý, závisí totiž na délce každé ze sekvencí strukturních genů, jejich orientaci a stupni vzájemné identity. Např. každý odborník v daném oboru si je vědom vnitřní nestability palindromických nukleotidových sekvencí in vivo a také obtíží spojených s konstrukcí dlouhých syntetických genů, obsahujících invertované opakované nukleotidové sekvence (invertované repetice) vzhledem k tendenci těchto sekvencí rekombinovat in vivo. Nehledě na tyto obtíže optimální počet sekvencí strukturních genů, které jsou součástí syntetického genu podle předkládaného vynálezu, může být odborníkem stanoven empiricky, aniž by bylo potřeba nadměrné experimentování užitím standardních postupů, jako je např. konstrukce syntetického genu podle předkládaného vynálezu užitím buněčných linií deficitních na kombinázu, snížení počtu repetic (opakovaných sekvencí) na úroveň, která eliminuje nebo alespoň minimalizuje rekombinantní události, a udržení celkové délky sekvence vícečetného syntetického genu v přijatelném limitu, tj. výhodně ne delší než 5 až 10 kb, výhodněji ne delší než 2 až 5 kb, a ještě výhodněji v limitu délky nejvýše 0,5 až 2 kb.
V případech, kdy úsek strukturního genu obsahuje více než jednu rozptýlenou molekulu nukleové kyseliny nebo molekulu cizorodé nukleové kyseliny, je v tomto popisu použit termín „vícečetný úsek strukturního genu“ nebo podobné jiné termíny.
Řešení podle předmětného vynálezu evidentně zahrnuje použití vícečetných úseků strukturního genu, které výhodně obsahují přímé repetice, invertované repetice nebo přerušené palindromy konkrétního strukturního genu, rozptýlenou molekulu nukleové kyseliny nebo molekulu cizorodé nukleové kyseliny nebo její fragment.
Každá rozptýlená nebo cizorodá molekula nukleové kyseliny, obsažená ve vícečetné jednotce strukturního genu syntetického genu podle tohoto vynálezu, obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je v podstatě identická a jiným cílovým genem stejného organismu. Takové uspořádání je zvláště výhodné v případech, kdy je záměrem tvorby syntetického genu poskytnout ochranu proti
-13 CZ 295108 B6 patogenu v buňce, tkáni nebo orgánu, zvláště proti virovému patogenu, a sice tím, že se modifikuje exprese virových cílových genů. Tak např. vícečetný strukturní gen může obsahovat nukleotidové sekvence (tj. dvě nebo více molekul rozptýlené nebo cizorodé nukleové kyseliny), které jsou v podstatě identické se dvěma nebo více cílovými geny, vybranými ze skupiny, která obsahuje DNA polymerázu, RNA polymerázu, Nia proteázu, obsahový protein nebo jiný cílový gen, který je nezbytný pro infekčnost viru nebo jeho replikaci a reprodukci. Nicméně je při tomto uspořádání výhodné, jestliže jsou jednotky strukturního genu vybrány tak, že cílové geny, se kterými jsou v podstatě identické, jsou normálně exprimovány přibližně ve stejnou dobu (nebo později) v infikované buňce, tkáni nebo orgánu, jako vícečetný strukturní gen v syntetickém genu podle předkládaného vynálezu, řízený promotorovou sekvencí. To znamená, že promotor, řídící expresi vícečetného strukturního genu, je obvykle vybrán tak, aby umožnil expresi v buňce, tkáni nebo orgánu v průběhu celého životního cyklu viru, když jsou virové cílové geny exprimovány v různých stadiích infekce.
Stejně jako jednotlivé jednotky molekuly rozptýlené nebo cizorodé nukleové kyseliny, které jednotlivé jednotky vícečetného strukturního genu mohou být prostorově spojeny vzájemně v jakékoliv orientaci, tedy např. systémem „hlava k hlavě“, „hlava k ocasu“ nebo „ocas k ocasu“, přičemž všechny tyto konfigurace náleží do rozsahu tohoto vynálezu.
Pro expresi v eukaryotických buňkách obsahuje syntetický gen, kromě molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, obvykle promotor a případně ještě další regulační sekvence, které umožňují expresi rozptýlené nebo cizorodé molekuly nukleové kyseliny.
Termín „promotor“ je v tomto textu chápán v nejširším významu a označuje regulační sekvence transkripce klasického genomového genu, včetně TATA boxu, který je potřebný pro přesnou iniciaci transkripce, buďto s nebo bez CCAAT boxu, a další regulační prvky (aktivační sekvence ležící v poloze „upstream“, tj. proti směru transkripce, „enhancery“, neboli zesilovací sekvence a „silencery“, neboli umlčovací sekvence), která mění expresi genu v odpověď na vývojové a/nebo vnější podněty a nebo tkáňově specifickým způsobem. Promotor obvykle, i když ne zcela nutně, leží „upstream“, neboli na 5'-konci úseku strukturního genu, jehož expresi řídí. Kromě toho regulační prvky, obsahující promotor, jsou obvykle umístěny do vzdálenosti2 kb od transkripčního počátku genu.
V textu předkládaného popisu se termín „promotor“ užívá také k označení syntetické nebo fúzní molekuly, nebo jejího derivátu, která poskytuje, aktivuje nebo zvyšuje expresi molekuly nukleové kyseliny v buňce.
Výhodné promotory mohou obsahovat další kopie jednoho nebo několika specifických regulačních prvků, aby ještě více zvýšily expresi významné molekuly a/nebo změnily prostorový a/nebo časový vzorec exprese požadované významné molekuly. Tak např. regulační prvky, poskytující indukovatelnost mědí, mohou být umístěny do sousedství heterologní promotorové sekvence, která řídí expresi významné molekuly, čímž se udělí této významné molekule indukovatelnost mědí.
Umístění molekuly rozptýlené nebo cizorodé nukleové kyseliny pod regulační kontrolu promotorové sekvence znamená umístění této molekuly takovým způsobem, že její exprese je řízena uvedeným promotorem. Promotory jsou obecně umístěny na 5'-konci (tj. „upstream“ činí proti směru transkripce) od sekvence genu, jehož expresi řídí. Při konstrukci kombinace heterologní promotor/strukturní gen je obecně výhodně umístit promotor do určité vzdálenosti od transkripčního počátku genu, která je přibližně stejná, jako je vzdálenost mezi promotorem a genem v přirozené sestavě, tj. v genu, ze kterého je promotor získán. Jak je odborníkům známo, v jistých mezích je možné vzdálenost přizpůsobit beze ztráty funkce promotoru. Podobně výhodné umístění prvků regulačních sekvencí vzhledem k heterolognímu genu, který má být jimi říze, je určeno přirozeným rozmístěním těchto prvků, tj. polohou v genech, ze kterých pocházejí. A stejně tak je v tomto oboru známo, že je možná jistá variabilita této vzdálenosti.
- 14CZ 295108 B6
K příkladům promotorů, vhodných pro syntetické geny podle předkládaného vynálezu, patří promotory virových, fungálních, bakteriálních, zvířecích a rostlinných genů, které jsou schopné fungovat v rostlinných, zvířecích, hmyzích a houbových buňkách nebo v kvasinkách a bakteriích. Promotor může regulovat expresi složky strukturního genu konstitutivně, nebo diferenciálně vzhledem k buňce, tkáni nebo orgánu, kde k expresi dochází, nebo vzhledem k vývojovému stadiu, ve kterém k expresi dochází, nebo v odpověď na vnější podnět, jako jsou fyziologické stresy, patogeny nebo kovové ionty a další.
Výhodně je promotor schopen řídit expresi molekuly nukleové kyseliny v eukaryotické buňce, tkáni nebo orgánu, alespoň po dobu, po kterou je také exprimován cílový gen, výhodněji ještě bezprostředně předtím, než dojde k detekovatelné expresi cílového genu v buňce, tkáni nebo orgánu.
Pro účely předmětného vynálezu jsou tudíž zvláště výhodné silné konstitutivní promotory nebo promotory, které jsou indukovány virovou infekcí nebo zahájením exprese cílového genu.
Z hlediska předmětného vynálezu jsou zejména výhodné promotory funkční v rostlinném nebo zvířecím organismu. K příkladům výhodných promotorů patří promotor bakteriofága T7, promotor bakteriofága T3, promotor SP6, operátor lac, promotor tac, promotor pozdních genů SV40, promotor časných genů SV40, promotor LTR zRSV, IE promotor zCMV, promotor 35S z CaMV, promotor SCSV, promotor SCBV a další.
Vzhledem k výhodnému požadavku vysoké hladiny exprese, která je v časové shodě s expresí cílového genu nebo ji předchází, je žádoucí, aby promotorem byl silná konstitutivní promotor, jako je např. IE promotor z CMV, promotor časných genů SV40, promotor pozdních genů SV40, promotor 35A z CamV nebo promotor SCBV a další. Odborník jsou známy další vhodné promotory sekvence kromě těch, které zde byly specificky zmíněny.
V předkládaném popisu termínu „v operativním spojení“ nebo „operativně pod kontrolou“ nebo podobně znamenají, že exprese úseku strukturního genu nebo vícečetného úseku strukturního genu je řízena (je pod kontrolou) promotorovou sekvencí, se kterou je prostorově spojena, v buňce, tkáni, orgánu nebo celém organismu.
Ve výhodném provedení vynálezu je úsek strukturního genu (molekula rozptýlené nebo cizorodé nukleové kyseliny) nebo vícečetný úsek strukturního genu umístěn operativně do spojení s promotorem v takové vzájemné orientaci, že když je transkribován, dochází k syntéze mRNA produktu, který, když je translatován, kóduje polypeptidový produkt cílového genu nebo jeho fragment.
Avšak předkládaný vynález není omezen pouze na použití tohoto uspořádání, přičemž vynález zahrnuje užití i takových syntetických genů a genových konstruktů, kde úsek strukturního genu nebo úsek vícečetného strukturního genu je umístěn v „antisense“ orientaci (tj. orientaci opačné ke směru transkripce) vzhledem k promotorové sekvenci, takže alespoň část transkripčního produktu mRNA je komplementární k mRNA kódované cílovým genem nebo jeho fragmentem.
Vzhledem k tomu, že molekula rozptýlené nukleové kyseliny nebo cizorodé nukleové kyseliny nebo úsek vícečetného strukturního genu obsahuje tandemové přímo a/nebo nepřímé repetice (opakované sekvence) cílového genu, do rozsahu vynálezu náleží rovněž všechny kombinace výše zmíněných konfigurací.
V alternativním provedení je úsek strukturního genu nebo úsek vícečetného strukturního genu operativně spojen jak s první promotorovou sekvencí, tak i s druhou promotorovou sekvencí, přičemž promotory jsou lokalizovány na distálním a proximálním konci úseku, takže alespoň jedna jednotka úseku strukturního genu nebo úseku vícečetného strukturního genu je vzhledem k sekvenci prvního promotoru v „sense“ orientaci a vzhledem k sekvenci druhého promotoru
- 15 CZ 295108 B6 v „antisense“ orientaci. V takovém provedení vynálezu je výhodné, když první a druhý promotor se navzájem liší, aby se zabránilo kompetici mezi buněčnými faktory, které se na tyto promotory bází. Výhodou takového uspořádání je to, že účinky transkripce z prvního a druhého promotoru na snížení exprese cílového genu v buňce lze porovnat, aby se stanovila optimální orientace pro každou testovanou nukleotidovou sekvenci.
Syntetické geny výhodně obsahují další regulační prvky pro účinnou transkripci, např. sekvenci pro terminaci transkripce.
Termín „terminátor“ označuje sekvenci DNA na konci transkripční jednotky, která signalizuje terminaci (ukončení) transkripce. Terminátory jsou netranslatované sekvence DNA na 3'-konci genu, které obsahují polyadenylační signál, který umožňuje připojení polyadenylátorové sekvence na 3'-konec primárního transkriptu. Terminátory aktivní v rostlinných buňkách jsou obecně známy, přičemž byly popsány v odborné literatuře. Mohou být izolovány z bakterií, hub, virů, zvířat a/nebo rostlin a nebo také syntetizovány de novo.
Stejně jako promotorové sekvence i terminátory mohou být jakékoliv terminátorové sekvence, které jsou funkční v buňkách, tkáních nebo orgánech, kde se mají použít.
K příkladům terminátorů, zvláště vhodných pro použití podle předkládaného vynálezu, patří polyadenylační signál SV40, polyadenylační signál HSV TK, terminátor CYC1, terminátor ADH, terminátor SPA, terminátor genu nopalinsyntázy (NOS) z Agrobacterium tumefaciens, terminátor genu 35S z viru mozaiky květáku (CaMV), terminátor genu zeinu ze Zea mays, terminátorová sekvence malé podjednotky (SSU) Rubisco, terminátory viru kmění jetele (SCSV), jakékoliv terminátory z E. coli, nezávisle na faktoru rho, terminátor lacZ alfa a další.
Ve zvláště výhodném provedení je terminátorem polyadenylační signál SV40 nebo polyadenylační signál HSV TK, který je aktivní v živočišných buňkách, tkáních a orgánech, terminátor oktopinsyntázy (OCS) nebo nopalinsyntázy (NOS), který je aktivní v rostlinných buňkách, tkáních a orgánech, nebo terminátor lacZ alfa, který je aktivní v prokaryotických buňkách.
Pro odborníky, pracující v daném oboru, budou zřejmé i další terminační sekvence, které je možno použít v souvislosti s předmětným vynálezem. Takové sekvence lze okamžitě využít bez nepřiměřeného nadměrného experimentování.
Prostředky pro vnášení (tj. transfekci nebo transformaci) syntetických genů do buněk, popsané v tomto popisu, nebo genové konstrukty, které mohou obsahovat syntetické geny, jsou odborníkům v tomto oboru známy.
V dalším alternativním provedení podle vynálezu je užit genový konstrukt, který obsahuje dva nebo více úseků strukturních genů nebo vícečetných strukturních genů, kde každý úsek strukturního genu je umístěn operativně pod kontrolu vlastní promotorové sekvence. Tak jako v jiných provedeních, popsaných v tomto popisu, se orientace každého úseku strukturního genu může měnit tak,a by bylo dosaženo maximálního modulačního účinku na expresi cílového genu.
Podle tohoto provedení promotory, řídící expresi jednotky strukturního genu, jsou výhodně odlišné promotorové sekvence, aby se snížila kompetice mezi nimi o buněčné transkripční faktory a RNA polymerázy. Výhodné promotory jsou vybrány z promotorů, uvedených výše.
Každému odborníkovi v daném oboru bude zřejmá metoda modifikace uspořádání nebo konfigurace jednotlivých strukturních genů popsaných výše tak, aby byla jejich exprese řízena oddělenými promotorovými sekvencemi.
Syntetické geny popsané výše jsou schopné dalších modifikací, například tím, že se do nich vloží markerové nukleotidové sekvence, kódující detekovatelný markerový enzym nebo jeho funkční
-16CZ 295108 B6 analog nebo derivát, aby se umožnila detekce syntetického genu v buňce, tkáni nebo orgánu, kde je syntetický gen exprimován. Podle tohoto provedení vynálezu, markerové nukleotidové sekvence jsou přítomny v translatovatelné podobě a jsou exprimovány, např. jako fúzní peptid s translačním produktem kteréhokoliv strukturního genu nebo několika strukturních genů nebo alternativně jako polypeptid, který není fúzován.
Pro odborníky pracující v oboru bude zřejmá metoda vytváření syntetických genů podle vynálezu a rovněž požadavky nutné pro dosažení jejich exprese, pokud je to potřeba, ve specifických buňkách nebo buňkách specifického typu při požadovaných podmínkách. Zejména bude odborníkům v tomto oboru zřejmé, že genové manipulace, které jsou potřebné k uskutečnění předkládaného vynálezu, vyžadují namnožení genového konstruktu podle vynálezu nebo jeho derivátu v prokaryotických buňkách, jako je např. E. coli, nebo v rostlinných či živočišných buňkách.
Syntetické geny podle tohoto vynálezu mohou být vneseny do vhodných buněk, tkání nebo orgánů, bez jakékoliv modifikace jakožto lineární DNA, výhodně vložené do vhodného nosiče, jako je např. buňka, virová částice nebo liposom a další. Pro vytvoření genového konstruktu se syntetický gen podle vynálezu vloží do vhodného vektoru nebo episomové molekuly, jako je např. bakteriofágový vektor, virový vektor nebo plazmid, kozmid nebo umělý chromozom, které se mohou udržovat a/nebo replikovat a/nebo exprimovat v hostitelské buňce, tkáni nebo orgánu, do kterého jsou posléze vneseny.
Tudíž další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje genový konstrukt, který obsahuje alespoň syntetický gen podle předkládaného vynálezu a jeden nebo několik replikačních počátků a/nebo sekvencí genu selekčního markéru.
Genové konstrukty jsou zvláště vhodné pro transformaci eukaryotických buněk, aby se do nich vnesl nový genetický znak, kromě vlastnosti rezistence k virovým patogenům. Takové dodatečné nové znaky mohou být vneseny pomocí oddělených genových konstruktů nebo alternativně ve svém genovém konstruktu, který obsahuje syntetický gen podle toho vynálezu. Pro odborníky pracující v tomto oboru budou zřejmé významné výhody řešení, podle kterého jsou sekvence, kódující dodatečné znaky a syntetické geny podle tohoto vynálezu, přítomny společně v jediném konstruktu, zejména ve smyslu redukce genových manipulací a požadavků na tkáňové kultury, a tudíž zvýšené finanční efektivity.
Obvykle jsou replikační počátek a gen selekčního markéru vhodné pro použití v bakteriích fyzicky odděleny od těch genových sekvencí, obsažených v konstruktu, které mají být exprimovány nebo přeneseny do eukaryotické buňky nebo integrovány do genomu eukaryotické buňky.
Ve zvláště výhodném provedení je replikační počátek funkční v bakteriálních buňkách a obsahuje počátek pUC nebo ColEl, alternativně je replikační počátek aktivní v eukaryotických buňkách a tkáních a výhodně obsahuje replikační počátek 2μ nebo SV40.
Termín „selekční markér“, užívaný v tomto popisu, označuje jakýkoliv gen, který svou expresí poskytuje buňce fenotyp, který umožňuje identifikaci a/nebo selekci buněk, které byly transformovány, nebo do kterých byl přenesen genový konstrukt podle předkládaného vynálezu nebo jeho derivát.
K selekčním markérům, vhodným pro použitím v předkládaném vynálezu, patří gen rezistence kampicilinu (AMPr), gen rezistence k tetracyklinu (Tcr), bakteriální gen rezistence ke kanamycinu (Kaď), gen rezistence k zeocinu (Zeocin chráněné označení sloučeniny z rodiny bleomycinů, resp. ochranná známka firmy InVitrogen Corporation), gen AURI-C, poskytující rezistenci kautobiotiku aureobasidinu A, gen rezistence k fosfinotricinu, gen neomycinfosfotransferázy (nptll), gen rezistence k hygromycinu, gen β-glukuronidázy (GUS), gen chloramfenikolacetyltransferázy (CAT), gen kódující zelený fluorescenční protein, gen kódující luciferázu a další.
- 17CZ 295108 B6
Výhodně je selekčním markérem gen npt\\, Kanr nebo gen kódující zelený fluorescenční protein (GFP).
Pro odborníky v daném oboru bude zřejmá celá řada dalších selekčních markérů, které by bylo možné užít k realizaci předkládaného vynálezu. Navíc předmět vynálezu není nijak omezen povahou genu selekčního markéru.
Předkládaný vynález zahrnuje všechny genové konstrukty v podstatě popsané v tomto popisu, které obsahují další genové selekce, určené k udržování a/nebo replikaci genového konstruktu v prokaryotické nebo eukaryotické buňce a/nebo k integraci genového konstruktu nebo jeho části do genomu eukaryotické buňky nebo organismu.
Stejně jako v případě rozptýlené nebo cizorodé molekuly nukleové kyseliny lze standardní metody popsané výše užít k vnesení syntetických genů nebo genových konstruktů do buněk, tkání nebo orgánů, s cílem modulovat expresi cílového genu. K takovým metodám patří např. liposomy zprostředkovaná transfekce nebo transformace, transformace buněk pomocí atenuovaného viru nebo bakterie, fúze buněk nebo další v oboru známé metody transformace nebo transfekce a metody, popsané v publikaci Ausubel a kol. (1992).
K dalším prostředkům pro vnesení rekombinantní DNA do rostlinného pletiva nebo buněk patří, aniž by tím byl vynález jakkoliv omezen, transformace pomocí CaCl2 a její různé varianty, zejména způsob, který popsal Hanahan (1983), přímý příjem protoplasty (Krens a kol., 1982, Paszkowski a kol., 1984), příjem do protoplastů zprostředkovaný PEG (Armstrong a kol., 1990), ostřelování mikročásticemi, elektroporace (Fromm a kol., 1985), mikroinjekce DNA(Crossway a kol., 1986), ostřelování tkání/pletiv, explantátů nebo buněk mikročásticemi (Christou a kol., 1988, Sanford, 1988), vakuová infiltrace tkání nukleovou kyselinou, a specificky v případě rostlin přenosem do rostlinného pletiva, zprostředkovaným Agrobacterium tumefaciens, jako bylo popsáno např. v An a kol., 1985, Herrera-Estrela a kol., 1983a, 1983b, 1985.
Při ostřelování mikročásticemi je mikročástice vehnána (vstřelena) do buňky a vzniká tak transformovaná buňka. Je možné užít v podstatě jakoukoliv metodu balistické transformace a taktéž jakékoliv vhodné zařízení pro realizaci předkládaného vynálezu. Příklad vhodného postupu i zařízení popsali např. Stomp a kol. (patent USA č. 5 122 466) a Sanford a Wolf (patent USA č. 4 945 050). Při použití balistické metody transformace genové konstrukt může obsahovat plazmid, schopný replikace v buňce, která má být transformována.
K příkladům vhodných mikročástic pro výše popsaný systém patří zlaté kulovité částice 1 až 5 μ. DNA konstrukty jsou naneseny na mikročástice jakoukoliv vhodnou technikou, např. precipitací.
Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu jsou syntetické geny a genové konstrukty zde popsané adaptovány pro integraci do genomu buněk, kde jsou pak exprimovány.
Pro každého odborníka v daném oboru je zřejmé, že k dosažení integrace genové sekvence nebo genového konstruktu do genomu hostitelské buňky mohou být zapotřebí ještě další genové sekvence. V případě rostlin jsou např. obecně potřebná sekvence levé a pravé hranice T-DNA z Ti plazmid Agrobacterium tumefaciens·.
Řešení podle vynálezu je možno využít pro izolované buňky, tkáně nebo orgány, které obsahují syntetické geny podle tohoto vynálezu, nebo genové konstrukty, obsahující syntetické geny podle tohoto vynálezu. Tento vynález je možné kromě toho využít pro tkáň/pletivo, orgány nebo celé organismy, regenerované z těchto buněk, tkání a orgánů a také jejich rozmnožovací materiál a potomstvo.
Například rostliny lze regenerovat z transformovaných rostlinných buněk nebo tkání nebo orgánů na médium, obsahujícím hormony, přičemž regenerované rostliny mohou být v mnoha různých
-18CZ 295108 B6 podobách, jako chiméry transformovány a netransformovaných buněk, klonální transformanty (např. všechny buňky jsou transformované a obsahují expresní kazetu), štěpy transformovaného a netransformovaného pletiva (např. transformovaná podnož roubovaná netransformovaným roubem u citrusů). Transformované rostliny lze množit mnoha způsoby, klonálním množením nebo klasickými šlechtitelskými metodami. Např. první generace (TI) transformovaných rostlin může být samospřažena, přičemž poskytne homozygotní druhou generaci (T2) transformovaných rostlin, a rostliny z generace T2 se již dále množí klasickými šlechtitelskými metodami.
Popis přiložených obrázků
Obr. 1 schematicky znázorňuje plazmid pEGFP-Nl NCS.
Obr. 2 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.cass.
Obr. 3 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.SV40L.cass.
Obr. 4 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.SV40R.cass.
Obr. 5 schematicky znázorňuje plazmid pCR.BgH-GFP-Bam.
Obr. 6 schematicky znázorňuje plazmid pBSII (SK+).EGFP.
Obr. 7 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.EGFP.
Obr. 8 schematicky znázorňuje plazmid pCR.SV40L.
Obr. 9 schematicky znázorňuje plazmid pCR.BEV. 1.
Obr. 10 schematicky znázorňuje plazmid pCR.BEV.2.
Obr. 11 schematicky znázorňuje plazmid pCR.BEV.3.
Obr. 12 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.EGFP.BEV:2
Obr. 13 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEV.2.
Obr. 14 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEV.3.
Obr. 15 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.VEB.
Obr. 16 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEV.GFP
Obr. 17 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.0.SV401-0
Obr. 18 schematicky znázorňuje plazmid.pCMV.0.SV40L.BEV
Obr. 19 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.0.SV40L.VEB
Obr. 20 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEVx2.
Obr. 21 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEVx3.
Obr. 22 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEVx4.
Obr. 23 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.SV40L.BEV.
Obr. 24 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.SV40L.VEB.
Obr. 25 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEV.GFP.VEB.
Obr. 26 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.EGFP.BEV2.PFG.
Obr. 27 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.BEV.SV40.LR.
Obr. 28 schematicky znázorňuje plazmid pCDNA3.Galt.
Obr. 29 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.
Obr. 30 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.EGFP.Galt.
Obr. 31 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.GFP.
-19CZ 295108 B6
Obr. 32 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.SV4OL.O
Obr. 33 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.SV40L.tlaG.
Obr. 34 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.0.SV40L.Galt.
Obr. 35 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galtx2.
Obr. 36 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galtx4.
Obr. 37 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.SV40L.Galt.
Obr. 38 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.SV40L.tlaG.
Obr. 39 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.GFP.tlaG.
Obr. 40 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.EGFP.Galt. PFG.
Obr. 41 schematicky znázorňuje plazmid pCMV.Galt.SV40LR.
Obr. 42 schematicky znázorňuje plazmid pART7
Obr. 43 schematicky znázorňuje plazmid pART7.35S.SCBV.cass.
Obr. 44 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVY.
Obr. 45 schematicky znázorňuje plazmid pSP72.PVY.
Obr. 46 schematicky znázorňuje plazmid pClapBC.PVY.
Obr. 47 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVYx2.
Obr. 48 schematicky znázorňuje plazmid pSP72.PVYx2.
Obr. 49 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVYx2.
Obr. 50 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVYx4.
Obr. 51 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVY.LNYV.
Obr. 52 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVY.LNYV.PVY.
Obr. 53 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVY.LNYV.YPVA.
Obr. 54 schematicky znázorňuje plazmid pBC.PVY.LNYV.YVP
Obr. 55 schematicky znázorňuje plazmid pART27.PVY.
Obr. 56 schematicky znázorňuje plazmid pART27.35S.PVY.SCBV.O.
Obr. 57 schematicky znázorňuje plazmid pART27.35S.O.SCBV.PVY.
Obr. 58 schematicky znázorňuje plazmid pART27.35S.O.SCBV.YVP.
Obr. 59 schematicky znázorňuje plazmid pART7.PVYx2.
Obr. 60 schematicky znázorňuje plazmid pART7.PVYx3.
Obr. 61 schematicky znázorňuje plazmid pART7.PVYx4.
Obr. 62 schematicky znázorňuje plazmid pART7.PVY.LNYV.PVY.
Obr. 63 schematicky znázorňuje plazmid pART7.PVY.LNYV.YVPA.
Obr. 64 schematicky znázorňuje plazmid pART7.PVY.LNYV.YVP.
Obr. 65 schematicky znázorňuje plazmid pART7.35S.PVY.SCBV.YVP.
Obr. 66 schematicky znázorňuje plazmid pART7.35S.PVYx3.SCBV.YVPx3.
Obr. 67 schematicky znázorňuje plazmid pART7.35S.PVYx3.LNYV.YVPx3.
Obr. 68 schematicky znázorňuje plazmid pART7.PVYMULTI.
-20CZ 295108 B6
Příklady provedení vynálezu
Vynález bude blíže objasněn s pomocí následujících příkladů, které jsou ovšem pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah tohoto vynálezu.
Příklad 1
Genetické konstrukty, obsahující sekvenci genu BEV polymerázy, spojenou se sekvencí CMV promotoru a/nebo SV40L promotoru
1. Komerčně dostupné plazmidy
Plazmid pBluescriptII(SK+)
Plazmid pBluescriptII(SK+), komerčně dostupný od firmy Stratagene, obsahuje sekvenci LacZ promotoru a transkripční terminátor lacZ-alfa, společně s vícečetným klonovacím místem pro vložení sekvence strukturního genu. Plazmid dále obsahuje replikační počátky ColEl a fl a gen rezistence k ampicilinu.
Plazmid Psvl
Plazmid pSVL, konečně dostupný od firmy Pharmacia, slouží jako zdroj pozdního promotoru SV40. Nukleotidová sekvence pSVL je veřejnosti přístupná k databázi GenBak pod přístupovým číslem U13868.
Plazmid pCR2.1
Plazmid pCR2.1, konečně dostupný od firmy Stratagene, obsahuje sekvenci LacZ promotoru a transkripční terminátor lacZ-alfa, společně s vícečetným klonovacím místem pro vložení sekvence strukturního genu. Plazmid byl navržen pro klonování fragmentů nukleové kyseliny pomocí A-přesahujících konců, které často vznikají při syntéze za použití Taq polymerázy při polymerázové řetězové reakci (PCR). PCR fragmenty klonované tímto způsobem jsou obklopeny dvěma restrikčními místy EcoRI. Plazmid dále obsahuje replikační počátky ColEl a fl a geny rezistence ke kanamycinu a k ampicilinu.
Plazmid pEGFP-Nl MCS
Plazmid pEGFP-Nl MCS (obr. 1, Clontech) obsahuje CMVIE promotor, operativně spojený s otevřeným čtecím rámcem, který kóduje variantu divokého typu zeleného fluorescenčního proteinu (GFP, Prasher a kol., 1992, Charfie a kol., 1994, Inouye a Tsuji, 1994) s posunem k červené, optimalizovaného pro jasnější fluorescenci. Specifická varianta GFP kódovaná pEGFP-Nl MCS byla objevena Cormackem a kol. (1996). Plazmid pEGFP-Nl MCS obsahuje vícečetné klonovací místo, obsahující restrikční BglII a BamHI a mnoho dalších míst pro restrikční endonukleázy, lokalizované mezi CMV IE promotorem a čtecím rámcem GFP. Strukturní gen, klonovány do vícečetného klonovacího místa, pokud postrádá funkční počátek translace, bude exprimován na úrovni transkripce, avšak nebude exprimován na úrovni proteinu (nebude translatován). Sekvence strukturního genu, vložená do vícečetného klonování místa, pokud obsahuje funkční počátek translace, bude exprimována jako fúzní polypeptid GFP, jestliže byla klonována v souhlase se čtecím rámcem sekvence kódující GFP. Plazmid dále obsahuje SV40 polyadenylační signál „downstream“ od čtecího rámce GFP, aby došlo ke správnému opracování 3'-konce mRNA transkribované z CMV-IE promotoru. Plazmid dále obsahuje replikační počátek SV40 funkční ve zvířecích buňkách, gen rezistence kneomycinu, obsahující časný SV40 promotor (SV40 EP na obr. 1), operativně spojený s genem rezistence k neomycinu/kanamycinu, pocházejícímu zTn5 (Kan/neo na obr. 1) a polyadenylační signál thymidinkinázového genu sHSV (HSV TK poly(A) na obr. 1) pro selekci transformovaných buněk na kanamycinu, neomycinu
-21 CZ 295108 B6 nebo G418, replikační počátek pUC funkční v bakteriálních buňkách (pUC Ori na obr. 1) a replikační počátek fl pro replikaci jednořetězcové DNA (fl Ori na Obr. 1).
2. Expresní kazety
Plazmid pCMV.cass
Plazmid pCMV.cass (obr. 2) je expresní kazeta pro expresi sekvence strukturního genu řízenou promotorovou sekvencí CM IE. Plazmid pCMV.cass byl odvozen zpEGFP-Nl CMS odstraněním (delecí) čtecího rámce GFP následujícím způsobem: Plazmid pEGFP-Nl CMS byl naštěpen PinAI a Notl, zatupen pomocí Pful polymerázy a znovu spojen (ligován). Sekvence strukturního genu se do pCMV.cass klonuje pomocí vícečetného klonovacího místa, které je identické s vícečetným klonovacím místem pEGFP-Nl CMS, až na to, že postrádá místo PinAI.
Plazmid pCMV.SV40L.cass
Plazmid pCMV.SV40L.cass (obr. 3) obsahuje syntetické polyA místo a sekvenci pozdního SV40 promotoru z plazmidu pCR.SV40L (obr. 4), subklonované jako Sáli fragment do Sáli místa plazmidu pCMV.cass (obr. 2)., takže sekvence CMV IE promotoru a pozdního SV40 promotoru jsou schopné řídit transkripci ve stejném směru. Tudíž syntetické polyA místo na 5'-konci sekvence SV40 promotoru je užito jako transkripční terminátor strukturního genu, exprimovaného z CMV IE promotoru v tomto plazmidu, což také umožňuje inzerci strukturního genu prostřednictvím vícečetného klonovacího místa, ležícího mezi pozdním SV40 promotorem a syntetickým poly(A) místem (obr. 5). Vícečetné klonovací místo leží za CMV IE a SV40 promotory, včetně míst BamHI a BglII.
Plazmid pCMV.SV40LR.cass
Plazmid pCMV.SV40LR.cass (obr. 4) obsahuje sekvenci pozdního SV40 promotoru z plazmidu pCR.SV40L, subklonovanou jako Sáli fragment do Sáli místa plazmidu pCMV.cass (obr. 2), takže CMV IE promotor nebo pozdní SV40 promotor jsou schopné řídit transkripci strukturního genu nebo vícečetné strukturní genové jednotky v orientaci sense nebo antisense podle požadavků. Vícečetné klonovací místo leží mezi proti sobě položenými promotory CMV IE a SV40 promotory, aby bylo umožněno vkládání sekvence strukturního genu. Aby došlo k expresi strukturního genu v tomto plazmidu, musí být tato sekvence vložena se svým vlastním transkripčním terminátorem, umístěným na 3'-konci, neboť v tomto plazmidu mezi proti sobě položenými promotory CMV IE a SV40 promotory není žádný transkripční terminátor. Výhodně sekvence strukturního genu nebo jednotka vícečetného strukturního genu, která se má vložit do pCMV.SV40LR.cass, obsahuje jak 5'- tak i 3'-polyadenylační signály: I) když má být sekvence strukturního genu nebo jednotky vícečetného strukturního genu exprimována v orientaci sense z CMV IE promotoru a/nebo v anti-sense orientaci z pozdního SV40 promotoru, 5'-polyadenylační signál by měl být v anti-sense orientaci a 3'-polyadenylační signál by měl být v sense orientaci, a II) když má být sekvence strukturního genu nebo jednotky vícečetného strukturního genu exprimována v antisense orientaci z CMV IE promotoru a/nebo v sense orientaci z pozdního SV40 promotoru 5'-polyadenylační signál by měl být v sense orientaci a 3'-polyadenylační signál by měl být v antisense orientaci.
Alternativně, a nebo navíc, vhodně orientované transkripční terminátory mohou být umístěny na 5'-konci CMV a SV40L promotoru, jak ukazuje obr. 4.
Alternativně plazmid pCMV.SV40LR.cass je dále modifikován tak, že vznikne odvozený plazmid, který obsahuje dva polyadenylační signály, umístěné mezi sekvence promotorů CMV IE a SV40, v orientaci vhodné pro expresi jakéhokoliv strukturního genu, vloženého sem v sense nebo antisense orientaci buďto z CMV IE promotoru nebo SV40 promotoru. Předkládaný vynález jasně zahrnuje i takové deriváty.
-22CZ 295108 B6
Alternativně vhodně orientované transkripční terminátory mohou být vloženy „upstream“ (proti směru trankripce) od CMV a SV40 promotorů, takže může dojít kterminaci transkripce po přečtení každého z obou promotorů v antisense orientaci.
3. Konstrukční meziprodukty
Plazmid pCR.Bgl-GFP-Bam
Plazmid pCR.Bgl-GFP-Bam (obr. 5) obsahuje vnitřní úsek otevřeného čtecího rámce GFP, získaný z plazmidů pEGFP-Nl MCS (obr. 1), umístěný operativně pod kontrolu promotoru lacZ. Pro přípravu tohoto plazmidů byl úsek otevřeného čtecího rámce GFP amplifikován z pEGFPN1 MCS pomocí PCR s primery Bgl-GFP sekvence s identifikačním číslem 1 a GFP-Bam sekvence s identifikačním číslem 2 a klonován do pCR2.1. Vnitřní kódující úsek GFP v plazmidů pCR.Bgl-GFP-Bam postrádá funkční kodony pro počátek a konec translace.
Plazmid PBSII/SK+). EGFP
Plazmid pBSII/SK+).EGFP (obr. 6) obsahuje otevřený čtecí rámec EGFP, pocházející z plazmidů pEGFP-Nl MCS (obr. 1), umístěný operativně pod kontrolu promotoru lacZ. Pro přípravu tohoto plazmidů byl úsek kódující EGFP zpEGFP-Nl MCS vy štěpen jako fragment a klonován do klonovacího místa Notl/Xhol plazmidů pBluescript II (SK+).
Plazmid pCMV.EGFP
Plazmid pCMV.EGFP (obr. 7) je schopen exprimovat strukturní gen EGFP pod kontrolou promotorové sekvence CMV EI. Pro přípravu tohoto plazmidů byla sekvence EGFP vyštěpena z plazmidů pBSII(SK+).EGFP jako fragment BamHI-SacI a klonována do klonovacího místa BglII/SacI plazmidů pCMV.cass (obr. 2).
Plazmid pCR.SV40L
Plazmid pCR.SV40L (obr. 8) obsahuje pozdní promotor SV40, pocházející z plazmidů pSVL (GeneBank č. U13868, Pharmacia), klonovaný do pCR2.1 (Stratagene). Pro přípravu tohoto plazmidů byla sekvence pozdního promotoru SV40 amplifikována v PCR pomocí oligonukleotidových primerů SV40-1 sekvence s identifikačním číslem 3 a SV40-2 sekvence s identifikačním číslem 4, které obsahuje klonovací místa Sáli pro subklonování amplifikovaného fragmentu do plazmidů pCMV.cass. Primer obsahuje také syntetické poly(A) místo na 5'-konci, takže amplifikovaný produkt obsahuje syntetické poly(A) místo na 5'-konci promotorové sekvence SV40.
Plazmid pCR.BEV. 1
Kódující úsek BEV RNA-dependentní RNA polymerázy byl amplifikován jako fragment DNA velikosti 1385 bp z klonu cDNA plné délky pro tento gen pomocí oligonukleotidových primerů, označených BEV-1 sekvence s identifikačním číslem 5 a BEV-2 sekvence s identifikačním číslem 6, za standardních podmínek amplifikace. Amplifikovaná DNA obsahovala na 5'-konci restrikční místo BglII, vnesené sekvencí primeru BEV-1 a na 3'-konci restrikční místo BamHI, vnesené sekvencí primeru BEV-2. Navíc sekvence BEV-1 obsahovala signál pro počátek translace 5-ATG-3', vnesený do pozice 15 až 17, takže amplifikovaný strukturní gen BEV polymerázy obsahuje počáteční kodon ve shodném tečím rámci s kódující sekvencí BEV polymerázy. Tudíž amplifikovaný strukturní gen BEV polymerázy obsahuje ATG kodon bezprostředně „upstream“ (tj. před, proti směru transkripce) k sekvenci, kódující BEV polymerázu. V amplifikované DNA není žádný stop-kodon. Tento plazmid je znázorněn na obr. 9.
Plazmid pCR.BEV.2
Úplný kódující úsek BEV polymerázy byl amplifikován z klonu cDNA plné délky pomocí primerů BEV-1 a BEV-3. Primer BEV-3 obsahuje restrikční místo BamHI v pozici 5 až 10 včetně a komplementární sekvenci ke stop-kodonu translace v pozici 11 až 13. V důsledku toho otevře-23 CZ 295108 B6 ný čtecí rámec obsahuje signál počátku translace a translační stop-kodon mezi restrikčními místy BglII a BamHI. Amplifikovaný fragment byl klonován do plazmidů pCR2.BEV.2 (obr. 10).
Plazmid pCR.BEV.3
Netranslatovatelný strukturní gen BEV polymerázy byl amplifíkován z klonu cDNA plné délky pomocí primeru BEV-3 sekvence s identifikačním číslem 7 a BEV-4 sekvence s identifikačním číslem 8. Primer BEV-4 obsahuje restrikční místo BglII v pozici 5 až 10 a sekvence, ležící „downstream“ (po směru transkripce od BglII místa, je homologní s nukleotidovou sekvencí genu BEV polymerázy. V produktu, amplifikovaném pomocí primerů BEV-3 a BEV-4, není žádný funkční startovací ATG kodon. BEV polymerázaje exprimována jako část polypeptidu a tudíž v tomto genu není také počátek translace ATG. Amplifikovaná DNA byla klonována do plazmidů pCR.BEV.3 (obr. 11).
Plazmid pCMV.EGFP.BEV2
Plazmid pCMV.EGFP.BEV2 (obr. 12) byla připraven klonováním sekvence BEV polymerázy z pCR.BEV.2 v podobě fragmentu BglII/BamHI do BamHI místa pCMV.EGFP.
4. Kontrolní plazmidy
Plazmid pCMV.BEV.2
Plazmid pCMV.BEV.2 (obr. 13) je schopen exprimovat celý otevřený čtecí rámec BEV polymerázy pod kontrolou CMV El promotorové sekvence. Pro přípravu pCMV.BEV.2 byla sekvence BEV polymerázy z pCR.BEV2 subklonována v sense orientaci jakož fragment BglII-BamHI do plazmidů pCMV.cass (obr. 2) naštěpeného BglII/BamHI.
Plazmid pCMV.BEV.3
Plazmid pCMV.BEV.3 (obr. 14) je schopen exprimovat celý netranslatovatelný strukturní gen BEV polymerázy pod kontrolou CMV IE promotorové sekvence. Pro přípravu pCMV.BEV.nt byla sekvence BEV polymerázy z pCR.BEV.3 subklonována v sense orientaci jakožto fragment BglII-BamHI do plazmidů pCMV.cass (obr. 2) naštěpeného BglII/BamHI.
Plazmid pCMV.VEB
Plazmid pCMV.VEB (obr. 15) exprimuje antisense mRNA BEV polymerázy pod kontrolou CMV IE promotorové sekvence. Pro přípravu pCMV.VEB byla sekvence BEV polymerázy z pCR.BEV.2 subklonována v anti-sense orientaci jakožto fragment BglII-BamHI do plazmidů pCMV.cass (obr. 2) naštěpeného BglII/BamHI.
Plazmid pCMV.BEV.GFP
Plazmid pCMV.BEV.GFP (obr. 16) byl zkonstruován klonováním fragmentu GFP z plazmidů pCR.Bgl-GFP-Bam jako fragmentu BglII/BamHI do plazmidů pCMV.BEV.2 naštěpeného BamHI. Tento plazmid sloužil jako kontrola v některých experimentech a také je konstrukční meziprodukt.
Plazmid pCMV.BEV.SV40-L.O
Plazmid pCMV.BEV.SV40-L.O (obr. 17) obsahuje translatovatelný strukturní gen BEV polymerázy z plazmidů pCR.BEV.2, vložený v sense orientaci mezi CMV-IE promotor a SV40 pozdní promotor v plazmidů pCMV.SV40L.cass. Pro přípravu plazmidů pCMV.BEV.SV40L-O byl strukturní gen BEV polymerázy subklonován jako fragment BglII-BamHI do DNA plazmidů pCMV.SV.40L.cass naštěpeného BglII.
-24CZ 295108 B6
Plazmid pCMV.O.SV40L.BEV
Plazmid pCMV.O.SV40L.BEV (obr. 18) obsahuje translatovatelný strukturní gen BEV polymerázy, získaný z plazmidu pCR.BEV.2, klonovaný downstream od tandemu CMV-IE promotoru a SV40 pozdního promotoru, přítomného v plazmidu pCMV.SV40L.cass. Pro přípravu plazmidu pCMV.O.SV40L.BEV byl strukturní gen BEV polymerázy subklonován v sense orientaci jako fragment BglII-BamHI do plazmidu pCMV.SV40L.cass.
Plazmid pCMV.O.SV40L.VEB
Plazmid pCMV.O.SV40L.VEB (obr. 19) obsahuje antisense strukturního gen BEV polymerázy, získaný z plazmidu pCR.BEV.2, klonovaný downstream od tandemu CMV-IE promotoru a SV40 pozdního promotoru, přítomného v plazmidu pCMV.SV40L.cass. Pro přípravu plazmidu pCMV.O.SV40L.VEB byl strukturní gen BEV polymerázy subklonován v anti-sense orientaci jako fragment BglII-BamHI do plazmidu pCMV.SV40L.cass.
5. Testovací plazmidy
Plazmid pCMV.BEVx2
Plazmid pCMV.BEVx2 (obr. 20) obsahuje přímou repetici úplného čtecího rámce BEV polymerázy pod kontrolou CMV-IE promotorové sekvence. Přinejmenším v eukaryotických buňkách je otevřený čtecí rámec, lokalizovaný v blízkosti CMV-IE promotoru, translatovatelný. Pro přípravu plazmidu pCMV.BEVx2 byl strukturní gen BEV polymerázy z plazmidu pCMV.BEV.2 subklonován v sense orientaci jako fragment BglII-BamHI do plazmidu pCMV.BEV.2, bezprostředně downstream od strukturního genu BEV polymerázy již vplazmidu přítomného.
Plazmid pCMV.BEVx3
Plazmid pCMV.BEVx3 (obr. 21) obsahuje přímou repetici úplného čtecího rámce BEV polymerázy pod kontrolou CMV-IE promotorové sekvence. Pro přípravu plazmidu pCMV.BEVx3 byl strukturní gen BEV polymerázy z plazmidu pCR.BEV.2 subklonován v sense orientaci jako fragment BglII-BamHI do plazmidu pCMV.BEVx2, bezprostředně downstream od strukturních genů BEV polymerázy již v plazmidu přítomných.
Plazmid pCMV.BEVx4
Plazmid pCMV.BEVx4 (obr. 22) obsahuje přímou repetici úplného čtecího rámce BEV polymerázy pod kontrolou CMV-IE promotorové sekvence. Pro přípravu plazmidu pCMV.BEVx4 byl strukturní gen BEV polymerázy z plazmidu pCR.BEV.2 subklonován v sense orientaci jako fragment BglII-BamHI do plazmidu pCMV.BEVx3, bezprostředně downstream od strukturních genů BEV polymerázy již v plazmidu přítomných.
Plazmid pCMV.BEV.SV40L.BEV
Plazmid pCMV.BEV.SV40L.BEV (obr. 23) obsahuje jednotku vícečetného strukturního genu, obsahující 2 strukturní geny BEV polymerázy operativně a samostatně pod kontrolou CMV-IE promotoru a pozdního SV40 promotoru. Pro přípravu plazmidu pCMV.BEVSV40.BEV. byl translatovatelný strukturní gen BEV polymerázy z plazmidu pCR.BEV.2 subklonován v sense orientaci jako fragment BlglII-BamHI za sekvenci pozdního SV40 promotoru do plazmidu pCMV.BEV.SV40L-O naštěpeného BamHl.
Plazmid pCMV.BEV.SV40L.VEB
Plazmid pCMV.BEV.SV40L.BEV (obr. 24) obsahuje jednotku vícečetného strukturního genu, obsahující 2 strukturní geny BEV polymerázy operativně a samostatně pod kontrolou CMV-IE promotoru a pozdního SV40 promotoru. Pro přípravu plazmidu pCMV.BEV.SV40L.VEB byl translatovatelný strukturní gen BE polymerázy z plazmidu pCR.BEV.2 subklonován v anti-sense
-25 CZ 295108 B6 orientaci jako fragment BglII-BamHI za sekvenci pozdního SV40 promotoru do plazmidu pCMV.BEV.SV40L-O naštěpeného BamHI. V tomto plazmidu je strukturní gen BEV polymerázy exprimován v sense orientaci pod kontrolou CMV-IE promotoru, čímž vniká translatovatelná mRNA, přičemž je strukturní gen BEV polymerázy exprimován pod kontrolou SV40 promotoru, kde vzniká anti-sense mRNA.
Plazmid pCMV.BEV.GFP.VEB
Plazmid pCMV.BEV.GFP.VEB (obr. 25) obsahuje invertovanou repetici strukturního genu BEV, nebo-li palindrom, přerušený vložením otevřeného čtecího rámce pro GFP (jakožto „vloženého fragmentu“) mezi strukturními sekvencemi BEV v invertované repetici. Pro přípravu plazmidu pCMV.BEV.GFP.VEB byl vložený fragment GFP z plazmidu pCR.Bgl-GFP-Bam nejdříve subklonován v sense orientaci jakožto fragment BglII-BamHI do pCMV.BEV.2 naštěpeného BamHI, aby se vytvořil meziprodukt pCMV.BEV.GFP, ve kterém jsou obsaženy sekvence, kódující BEV polymerázu a GFP v jednom a témže fragmentu ,,5'-BglII-BamHI-3'“. Strukturní gen BEV polymerázy z pCMV.BEV.2 byl pak klonován v antisense orientaci jako fragment BglII-BamHI do pCMV.BEV.GFP naštěpeného BamHI. Strukturní gen BEV polymerázy v blízkosti CMV-IE promotorové sekvence v plazmidu pCMV.BEV.GFP.VEB je schopný translace, přinejmenším v eukaryotických buňkách.
Plazmid pCMV.EGFP.BEV2.PGF
Plazmid pCMV.EGFP.BEV2.PFG (obr. 26) obsahuje GFP palindrom, přerušený vložením sekvence genu BEV polymerázy mezi každé dva strukturní geny GFP. Pro přípravu tohoto plazmidu byl vložený fragment GFP z plazmidu pCR.Bgl-GFP-Bam klonován jakožto fragment BglII-BamHI v antisense orientaci vzhledem k CMV promotoru do místa BamHI v pCMV.EGFP.BEV2.
Plazmid pCMV.BEV.SV40LR
Plazmid pCMV.BEV.SV40LR (obr. 27) obsahuje strukturní gen, obsahující celý otevřený čtecí rámec BEV polymerázy, umístěný operativně a separátně pod kontrolu opačně položeného CMV-IE promotoru a sekvence pozdního SV40 promotor, tudíž potenciálně produkující transkripty BEV polymerázy alespoň z obou řetězců strukturního genu BEV plné délky. Pro přípravu plazmidu pCMV.BEV.SV40LR byl translatovatelný strukturní gen BEV polymerázy, přítomný v pCR.BEV2, subklonován jako BlglII - BamHI fragment do jedinečného místa BglII plazmidu pCMV.SV40LR.cass, takže otevřený čtecí rámec BEV je přítomný v sense orientaci vzhledem k sekvenci CMV-IE promotoru.
Odborníkovi je zřejmé, že použití téže klonovací strategie je možné vytvořit plazmid, kde fragment BEV polymerázy z pCR.BEV2 je vložen v antisense orientaci vzhledem k sekvenci CMV-IE promotoru. Předkládaný vynález tedy zahrnuje i takový genový konstrukt.
Příklad 2
Genové konstrukty, obsahující sekvenci strukturního genu prasečí a-1,3-galaktosyntransferázy (Galt) nebo sekvence, operativně spojené se sekvencí CMV promotor a/nebo SV40L promotoru
1. Komerční dostupné plazmidy
Plazmid pcDNA3
Plazmid pcDNA3 je konečně dostupný od firmy Invintrogen a obsahuje CMV-IE promotor a transkripční terminátor BGHpA, s vícečetným klonovacím místem pro vložení sekvence strukturního genu mezi nimi. Plazmid dále obsahuje počátky replikace ColEl a FI a geny rezistence k neomycinu a ampicilinu.
-26CZ 295108 B6
2. Plazmidové produkty
Plazmid pcDNA3Galt
Plazmid pCDNA3Galt (BresGen Limited, South Australia, obr. 28) je plazmid pcDNA3 (Invitrogen), obsahující cDNA sekvenci, kódující prasečí gen a-l,3-galaktosyltransferázy (Galt) operativně pod kontrolou CMV-IE promotoru, takže je schopna exprese. Pro přípravu plazmidu pcDNA3.Galt byla cDNA sekvence prasečí gen a-l,3-galaktosyntronsferázy klonována jako EcoRI fragment do EcoRI klonovacího místa plazmidu pcDNA3. Plazmid dále obsahuje replikační počátky ColEl a FI a geny rezistance kneomycinu ampicilinu.
3. Kontrolní plazmidy
Plazmid pCMV.Galt
Plazmid pCMV.Galt (obr. 29) je schopen exprimovat strukturní gen Galt, řízený promotorem CMV-IE. Pro přípravu plazmidu pCMV.Galt byla sekvence Galt z plazmidu pcDNA3. Galt vyštěpena jako EcoRI fragment a klonována v sense orientaci do EcoRI místa plazmidu pCMV.cass (viz obr. 2).
Plazmid pCMV.EGFP.Galt
Plazmid pCMV.EGFP.Galt (obr. 30) je schopen exprimovat strukturní gen Galt jako fúzní polypeptid, řízený promotorem CMV-IE. Pro přípravu plazmidu pCMV.EGFP.Galt byla sekvence Galt z plazmidu pCMV.Galt (obr. 29) vyštěpena jako BglII-BamHI fragment a klonována do BamHI místa plazmidu pCMV.EGFP.
Plazmid pCMV.Galt.GFP
Plazmid pCMV.Galt.GFP (obr. 31) byl připraven klonováním cGNA Galt v podobě EcoRI fragmentu z pCDNA3 do plazmidu pCMV.EGFP, naštěpeného EcoRI v sense orientaci. Tento plazmid sloužil současně jako kontrolní plazmid i jako konstrukční meziprodukt.
Plazmid pCMV.Galt.SV40L0
Plazmid pCMV.Galt.SV40L0 (obr. 32) obsahuje strukturní gen Galt, klonovaný downstream od CMV promotoru, přítomného vpCMV.SVS40L.cass. Pro přípravu plazmidu pCVM.Galt.SV40L0 byl fragment Galt cDNA z pCMV.Glat klonován jako BglII-BamHI fragment do pCMV.SV40L.cass naštěpeného BglII v sense orientaci.
Plazmid pCMV.O.SV.40L.tlaG
Plazmid pCMV.O.SV:40L.tlaG (obr. 33) obsahuje strukturní gen Galt, klonovaný v antisense orientaci downstream od promotoru SV40L, přítomného v pCMV.SV40L.cass. Pro přípravu tohoto plazmidu byl fragment Galt dDNA z pCMV.Galt klonován jako BglII-BamHI fragment do pCMV.SV40L.cass naštěpeného BamHI v antisense orientaci.
Plazmid pCMV.O.SV40L.Galt
Plazmid pCMV.O.SV:40L.Galt (obr. 34) obsahuje strukturní gen Galt, klonovaný downstream od promotoru SV40L, přítomného v pCMV.SV40L.cass. Pro přípravu tohoto plazmidu byl fragment Galt cDNA z pCMV.Galt klonován jako BglII-BamHI fragment do pCMV.SV40L.cass naštěpeného BamHI v sense orientaci.
4. Testovací plazmidy
Plazmid pCMV.Galtx2
-27CZ 295108 B6
Plazmid pCVM.Galtx2 (obr. 35) obsahuje přímou repetici otevřeného čtecího rámce pod kontrolou promotorové sekvence CMV-IE. Přinejmenším v eukaryotických buňkách je otevřený čtecí rámec, lokalizovaný v blízkosti promotoru CMV-IE, translatovatelný. Pro přípravu plazmidu pCMV.-Galtx2 byl strukturní gen Galt vyštěpen z pCMV.Galt jako BglII-BamHI fragment a klonován do BamHI klonovacího místa pCMV.Galt.
Plazmid pCMV.Galtx2
Plazmid pCMV.Galtx2 (obr. 36) obsahuje čtyřnásobnou přímou repetici otevřeného čtecího rámce pod kontrolou promotorové sekvence CMV-IE. Přinejmenším v eukaryotických buňkách je otevřený čtecí rámec, lokalizovaný v blízkosti promotoru CMV-IE, translatovatelný. Pro přípravu plazmidu pCMV.Galtx4 byla sekvence Galtx2 vyštěpena z pCMV.Galtx2 jako BglIIBamHI fragment a klonována v sense orientaci do BamHI klonovacího místa pCMV.Galtx2.
Plazmid pCMV.Galt.SV40L.Galt
Plazmid pCMV.Galt.SV40L.Galt (obr. 37) byl připraven tak, že exprimuje 2 sense transkripty Galt, přičemž jeden je řízen promotorem CMV a druhý je řízen promotorem SV40L. Pro přípravu plazmidu byl fragment Galt cDNA z pCMV.Galt klonován v sense orientaci jako BglII-BamHI fragment do pCMV.O.SV40.Galt naštěpeného BglII.
Plazmid pCMV.Galt.SV40L.tlaG
Plazmid pCMV.Galt. SV40L.tlaG (obr. 38) byl připraven tak, že exprimuje sense transkript Galt, řízený promotorem CMV a antisense transkript Galt, řízený promotorem SV40L. Pro přípravu tohoto plazmidu byl fragment Galt cDNA z pCMV.Galt klonován v sense orientaci jako BglII-BamHI fragment do pCMV.O.SV40.talG naštěpeného BglII.
Plazmid pCMV.Galt.GFP.tlaG
Plazmid pCMV.Galt.GFP.tlaG (obr. 39) obsahuje palindrom galt, přerušený vloženou sekvencí GFP mezi dvěma strukturními geny, tvořícími invertovanou repetici. Pro přípravu tohoto plazmidu byl fragment Galt cDNA z pCMV.Galt klonován v antisense orientaci vzhledem k promotoru CMV jako BglII-bamHI fragment do pCMV.Galt.GFP naštěpeného BamHI.
Plazmid pDMV.EGFP.Galt.PFG
Plazmid pCMV.EGFP.Galt.PFG (obr. 40) obsahuje palindrom GFP, přerušený vloženou sekvencí Galt mezi dvěma strukturními geny GFP, tvořícími invertovanou repetici, jejíž exprese je řízena promotorem CMV. Pro přípravu tohoto plazmidu byla sekvence Galt z pCMV.Galt klonována v sense orientaci jako BglII-BamHI fragment do pCMV.EGFP naštěpeného BamHI, čímž vznikl meziprodukt pCMV.EGFP.Glat (není znázorněn), a pak další GFP sekvence z pCR-Bgl-pCMVEGFP.Galt v antisense orientaci.
Plazmid pCMV.Galt. SV40LR
Plazmid pCMV.Galt.SV40LR (obr. 41) byl připraven pro expresi GalT cDNA sekvencí, klonovaných mezi opačně orientované CMV a SV40L promotory v expresní kazetě pCMV.SV40LR.cass. Pro přípravu tohoto plazmidu byla sekvence Galt z pCMV.Galt klonována v sense orientaci vzhledem k promotoru 35S jako BglII-BamHI fragment do pCMV.SV40LR naštěpeného BamHI.
Příklad 3
Genové konstrukty, obsahující PVY Nia sekvence, operativně spojené s promotorem 35S a/nebo SCBV
Binární vektory
-28CZ 295108 B6
Plazmid pART27
Plazmid pART27 je binární vektor specificky navržený tak, aby byl kompatibilní s expresní kazetou pART7. Obsahuje bakteriální počátek replikace jak pro E. coli, tak i pro Agfrobacterium tumefaciens, gen rezistence ke spektimycinu pro bakteriální selekci, levou pravou hraniční DNA pro přenos DNA z Agrobacterium tumefaciens do rostlinné buňky a kazetu rezistence ke kanamycinu, aby byla možná selekce transformovaných rostlinných buněk. Kazeta rezistence kanamycinu je lokalizována mezi dvěma hraničními sekvencemi T-DNA, a pART27 obsahuje také jedinečné restrikční místo Notl, které dovoluje klonování konstruktu, připraveného ve vektoru, jako je pART7, mezi hraniční sekvence T-DNA. Konstrukce pART27 byla podrobně popsána v práci Gleave, A.P., (1992).
Při klonování Notl inzertů do tohoto vektoru může být inzert ve dvou orientacích .Ve všech dalších příkladech byla vybrána stejná orientace inzertu, vzhledem ke směru promotoru 35A v popsaném pART7, a to proto, aby se minimalizovaly experimentální artefakty, které mohou vznikat srovnáním různých konstruktů s různou orientací inzertů.
2. Komerčně dostupné plazmidy
Plazmid pBC(KS-)
Plazmid pBC(KS-), komerčně dostupný od firmy Stratagene, obsahuje sekvenci LacZ promotoru a transkripční terminátor lacZ-alfa, společně s vícečetným klonovacím místem pro vložení sekvence strukturního genu. Plazmid dále obsahuje replikační počátky ColEl a fl a gen rezistence k chloramfenikolu.
Plazmid SP72
Plazmid SP72 je komerčně dostupný od firmy Promega a obsahuje vícečetné klonovací místo pro vložení sekvence strukturního genu. Plazmid dále obsahuje replikační počátek ColEl a gen rezistence k ampicilinu.
Expresní kazety
Plazmid pART7
Plazmid pART7 je expresní kazeta, navržená pro expresi sekvencí, klonovaných za promotor 35S. Obsahuje polylinker (vícečetné klonovací místo) pro usnadnění klonování a úsek terminátoru oktopinsyntázy. Klonovací kazeta 35S je obklopena dvěma restrikčními místy Notl, která dovoluje klonování do expresního binárního vektoru, jako je např. pART27, který obsahuje jedinečné místo Notl. Popis konstrukce byl uveden v práci Gleave, A.P. (1992), a mapa plazmidu je uvedena na obr. 42.
Plazmid pART7.35S.SCBV.cass
Plazmid pART7.35S.SCBV.cass byl navržen pro expresi dvou oddělených sekvencí, klonovaných do téhož plazmidu. Pro přípravu tohoto plazmidu byly sekvence, odpovídající terminátoru NOS a SCBV promotoru, amplifikovány v PCR a pak klonovány do polylinkeru pART7 mezi promotor 35A a OCS. Výsledný plazmid měl následující uspořádání prvků:
„35S promotor - polylinker 1 - NOS terminátor - SCBV promotor - polylinker 2 - OCS terminátor“.
Exprese sekvence, klonované do polylinkeru 1, je řízena promotorem 35S, exprese sekvence, klonované do polylinkeru 2, je řízena promotorem SCBV.
-29CZ 295108 B6
Sekvence terminátoru NOS byly amplifikovány z plazmid pAHC27 (Christiansen a Quail, 1996) užitím dvou oligonukleotidových primerů:
NOS 5' (sekvence id. č. 9): 5-GGATTCCCGGACGTCGCGAATTTCCCCCGAATCGTTC-3'; a
NOS 3' (sekvence id. č. 10):
5-CCATGGCCATATAGGCCCGATCTAGTAACATAG-3'
Nukleotidy 1 až 17 v NOS 5' a 1 až 15 v NOS 3' představují dodatečné nukleotidy, přidané, aby vytvořily restrikční místa pro usnadnění klonování. V případě NOS 5' jsou do BamHI, AatlI a první 4 báze z místa Nrul, pro NOS 3' jsou to místa Ncol a Sfil. Zbývající část sekvence každého oligonukleotidu je homologní k 5' a 3' konci sekvence NOS v pAHC27.
Promotorové sekvence SCBV byly amplifikovány z plazmidů pScBV-20 (Tzafir a kol., 1998) užitím dvou oligonukleotidových primerů:
SCBV 5':5'-CCATGGCCTATATGGCCATTCCCCACATTCAAG-3' sekvence id. č. 11 a
SCBV 3': 5-AACGTTAACTTCTACCCAGTTCCAGAG-3' sekvence id č. 12
Nukleotidy 1 až 17 v SCBV 5' kódující Ncol a Sfil restrikční místa pro usnadnění klonování konstruktu, zbývající sekvence je homologní s „upstream“ sekvencemi promotorového úseku SCMV. Nukleotidy 1 až 9 SCBV 3' kódující restrikční místa Psp 10461 a Hpal pro usnadnění klonování konstruktu, zbývající sekvence je homologní s reverzní a komplementární sekvencí v blízkosti místa iniciace transkripce v SCBV.
Sekvence byly amplifikovány z pScBV-20 užitím CPR a klonovány do pCR2.1 (Invitrogen), čímž byly připraveny pCR.NOS a PCR.SCBV. pCR.NOS naštěpený Smál a Sfil a pCR.SBV naštěpený Sfil a Hpal byly ligovány do pART7 naštěpeného Smál. Plazmid s vhodnou orientací byl vybrán a pojmenován pART7.35S.SCBV.cass, jeho mapa je uvedena na obr. 43.
Konstrukční meziprodukty
Plazmid pBC.PVY
Usek PVY genomu byl amplifikován pomocí standardní PCR, ve které byla užita jako templát reverzně transkribovaná RNA, izolovaná z tabáku, infikovaného PVY, a klonována do plazmidů pGEM3 (Stratagene), aby se vytvořil pGEM.PVY. Sall/HindlII fragment zpGEM.PVY, odpovídající fragmentu Sall/HindlII v pozici 1536 až 2270 sekvence PVY kmenu O (GenBank č. D12539), byl pak subklonován do plazmidů pBC ((Stratagene), aby se vytvořil plazmid pBC.PVY (obr. 44).
Plazmid pSP72.PVY
Plazmid pSP72.PVY byl připraven vložením EcoRI-SalI fragmentu z pBC.PVY do pSP72 (Promega) naštěpeného EcoRI/SalI. Tento konstrukt obsahuje dodatečná restrikční místa, obklopující inzert PVY, která byla vložena pro usnadnění dalších manipulací. Mapa tohoto konstruktu je uvedena na obr. 45.
Plazmid ClapBC.PVY
Plazmid ClapBC.PVY byl připraven vložením Clal-Sall fragmentu zpSP72.PVY do pBC (Stratagene) naštěpeného Clal/Sall. Tento konstrukt obsahuje dodatečná restrikční místa, obklopující PVY inzert, která byla použita pro usnadnění dalších manipulací. Mapa tohoto konstruktu je uvedena na obr. 46.
-30CZ 295108 B6
Plazmid pBC.PVYx2
Plazmid pBC.PVYx2 obsahuje dvě přímé (tzv. hlava k ocasu) repetice PVY sekvencí, pocházejících z pBC.PVY. Plazmid byl připraven klonováním AccI-Clal PVY fragmentu z pSP72.PVY do pBC.PVY naštěpeného AccI a je znázorněn na obr. 47.
Plazmid pSP72.PVYx2
Plazmid pSP72.PVYx2 obsahuje dvě přímo (tzv. hlava k ocasu) repetice PVY sekvencí, pocházejících z pBC.PVY. Plazmid byl připraven klonováním AccI-Clal PVY fragmentu z pBC.PVY do pSP72.PVY naštěpeného AccI a je znázorněn na obr. 48.
Plazmid pBC.PVYx3
Plazmid pBC.PVYx2 obsahuje tři přímé (tzv. hlava k ocasu) repetice PVY sekvencí, pocházejících z pBC.PVY. Plazmid byl připraven klonováním AccI-Clal PVY fragmentu z pSP72.PVY do pBC.PVYx2 naštěpeného AccI a je znázorněn na obr. 49.
Plazmid pCB.PVYx4
Plazmid pBC.PVYx4 obsahuje čtyři přímé (tzv. hlava k ocasu) repetice PVY sekvencí, pocházejících z pBC.PVY. Plazmid byl připraven klonováním AccI-Clal PVY fragmentu z pSP72. PVY do pBC.PVYx2 naštěpeného AccI a je znázorněn na obr. 50.
Plazmid pBC.PVY.LNYV
Všechny pokusy vytvořit přímé palindromy sekvencí PVY selhaly, pravděpodobně protože takové uspořádání sekvencí je nestabilní v obecně užívaném hostiteli pro klonování, a sice E. coli. Přerušené palindromy se však ukázaly jako stabilní.
Pro vytvoření přerušených palindromů PVY sekvencí byl „vložený“ fragment velikosti 360 bp vložen do ClapBV.PVY do polohy „downstream“ od PVY sekvence. „Vložený“ fragment byl připraven následujícím způsobem:
Klon, získaný původně z cDNA knihovny, připravené z genomové RNA viru žluté nekrózy salátu (LNYV) (Deitzgen a kol., 1989), obsahující gen 4b viru, byl amplifíkován PCR užitím následujících oligonukleotidových primerů:
LNYV l:5'-ATGGGATCCGTTATGCCAAGAAGAAGGA-3' sekvence id. č. 13; a
LNYV 2:5'- TGTGGATCCCTAACGGACCCGATG-3' sekvence id. č. 14
Prvních 9 nukleotidů kóduje místo BamHI, zbývající nukleotidy jsou homologní se sekvencí genu LNYV 4b.
Po amplifikaci byl vzniklý fragment klonován do EcoRI místa plazmidu pCR2.1 (Stratagene). Tento EcoRI fragment byl klonován do EcoRI místa ClapBC.PVY, čímž byl vytvořen meziprodukt pBC.PVY.LNYV, který je znázorněn na obr. 51.
Plazmid pBC.PVY.LNYV.PVY
Plazmid pBC.PVY.LNYV.PVY obsahuje přerušenou přímou repetici pVY sekvencí. Pro přípravu tohoto plazmidu byl Hpal-HincII fragment zpSP72 klonován do pBC.PVY.LNYV naštěpeného Smál a plazmid, obsahující konstrukt v sense orientaci, znázorněný na obr. 52., byl izolován.
Plazmid pBC.PVY .LNYV .YVPA
-31 CZ 295108 B6
Plazmid pBC.PVY.LNYV.PVYA obsahuje částečný přerušený palindrom PVY sekvencí. Jedno rameno palindromu obsahuje všechny PVY sekvence z pBC.PVY, druhé rameno obsahuje část sekvence PVY, obsahující úseku mezi restrikčními místy EcoRV a HincII v pSP72.PVY. Pro přípravu tohoto plazmidů byl EcoRVHincII fragment z pSP72 klonován do pBC.PVY.LNYV, naštěpeného Smál a plazmid, obsahující konstrukt v požadované orientaci, byl izolován. Mapa tohoto konstruktu je znázorněno na obr. 53.
Plazmid pBC.PVY.LNYV.YVP
Plazmid pBC.PVY.LNYV.PVY obsahuje přerušený palindrom PVY sekvencí. Pro přípravu tohoto plazmidů byl Hpal-HincII fragment z pSP72 klonován do pBC.PVY.LNYV, naštěpeného Smál a plazmid, obsahující konstrukt v antisense orientaci, byl izolován. Mapa tohoto konstruktu je znázorněna na obr. 54.
Kontrolní plazmidy
Plazmidy pART7.PVY a pART27.PVY
Plazmid pART7.PVY (obr. 55) byl připraven do expresi PVY sekvencí, řízených promotorem 35S. Plazmid sloužil v experimentech jako kontrolní konstrukt, vůči kterému byly srovnávány všechny ostatní konstrukty. Pro vytvoření tohoto plazmidů byl Clal-AccI fragment z ClapBC.PVY klonován do pART7, naštěpeného Clal, a byl selektován plazmid s očekávanou expresí PVY sekvencí v sense orientaci. Sekvence, sestávající z promotoru 35S, sekvence PVY a terminátoru OCS byla vyštěpena jako Notl fragment a klonována do pART27, naštěpeného Notl, byl selektován plazmid s požadovanou orientací inzertu a pojmenován pART27.PVY.
Plazmid pART7.35S.PVY.SCBV.O a pART27.35S.PVY.SCBV.O
Plazmid pART7.35S.PVY.SCBV.O (obr. 56) byl připraven jako kontrolní konstrukt pro současnou expresi vícečetných konstruktů zjediného plazmidů v transgenních rostlinách. Promotor 35S byl určen k expresi PVY sekvencí v sense orientaci, zatímco SCBV promotor zůstal nevyužitý. Pro vytvoření tohoto plazmidů byl PVY fragment z ClapBC.PVY klonován jako Xhol-EcoRI fragment do pART735S.SCBV.cass, naštěpeného Xhol a EcoRI, čímž vznikl p35S.PVY.SCBV>O. Sekvence, tvořená promotorem 35S, řídícím PVY sekvence, terminátorem NOS, promotorem SCBV a terminátorem OCS, byla vyštěpena jako Notl fragment a klonován do pART27. Plazmid s požadovanou orientací inzertu byl selektován a pojmenován pART27.35S.PVY.SCBV.O.
Plazmid pART7.35S.O.SCBV.PVY a pART27.35S.O.SCBV.PVY
Plazmid pART7.35S.O.SCBV.PVY (obr. 57) byl připraven jako dodatečný kontrolní konstrukt pro současnou expresi vícečetných konstruktů zjediného plazmidů v transgenních rostlinách. Za promotorem 35S nebyla klonována žádná exprimovatelná sekvence, zatímco SCBV promotor řídil expresi PVY v sense orientaci. Pro přípravu tohoto plazmidů byl PVY fragment z ClapBC.PVY klonován jako Clal fragment do pART735S.SCBV.cass, naštěpeného Clal, byl izolován plazmid, obsahující PVY sekvenci v sense orientaci a pojmenován p35S.O.SCBV.PVY. Sekvence, tvořená promotorem 35S a terminátorem NOS, promotorem SCBV řídícím PVY sekvence a terminátorem OCS, byla vyštěpena jako Notl fragment a klonována do pART27. Plazmid s požadovanou orientací inzertu byl selektován a pojmenován pART27.35S.O.SCBV.PVY.
Plazmid pART7.35S.O.SCBV.YVP a pART2.35S.O.SCBV.YVP
Plazmid pART7.35S.O.SCBV.YVP (obr. 58) byl připraven jako dodatečný kontrolní konstrukt pro současnou expresi vícečetných konstruktů zjediného plazmidů v transgenních rostlinách. Za promotorem 35S nebyla klonována žádná exprimovatelná sekvence, zatímco SCBV promotor řídil expresi PVY sekvence a antisense orientaci. Pro přípravu tohoto plazmidů byl PVY fragment z ClapBC.PVY klonován jako Clal fragment do p35S.SCBV.cass, naštěpeného Clal, byl
-32CZ 295108 B6 izolován plazmid, obsahující PVY sekvenci v antisense orientaci a pojmenován p35S.O.SCBV.YVP. Sekvence, tvořená promotorem 35S a terminátorem NOS, promotorem SCBV řídícím sense PVY sekvence a terminátorem OCS, byla vyštěpena jako Notl fragment a klonován do pART27. Plazmid s požadovanou orientací inzertu byl selektován a pojmenován aARt27.35S.O.SCBV.YVP.
3. T estovací plazmidy
Plazmidy pART7.PVYx2 a pART27.PVYx2
Plazmid pART7.PVYx2 (obr. 59) byl připraven pro expresi přímé repetice PVY sekvencí, řízených promotorem 35S v transgenních rostlinách. Pro přípravu tohoto plazmidu byla přímá repetice zpBC.PVYx2 klonována jako Xhol-BamHI fragment do pART7, naštěpeného XhoI/BamHI. Sekvence, složená z promotoru 35S, přímých repetic sekvencí PVY a terminátoru OCS byla vyštěpena jako Notl fragment zpART7.PVYx2 a klonována do pART727, naštěpeného Notl, byl selektován plazmid s požadovanou orientací inzertu a pojmenován pART27.PVYx2.
Plazmidy pART7.PVYx3 a pART27.PVYx3
Plazmid pART7.PVYx3 (obr. 60) byl připraven pro expresi přímé repetice třech PVY sekvencí, řízenou promotorem 35S v transgenních rostlinách. Pro přípravu tohoto plazmidu byla přímá repetice zpBC.PVYx3 klonována jako Xhol-BamHI fragment do pART7, naštěpeného XhoI/BamHI. Sekvence, složená z promotoru 35S, přímých repetic sekvencí PVY a terminátoru OCS byla vyštěpena jako Notl fragment z pART7.PVYx3 a klonována do pART27, naštěpeného Notl, byl selektován plazmid s požadovanou orientací inzertu a pojmenován pART27.PVYx3.
Plazmid pART7.PVYx4 a pART37.PVYx4
Plazmid pART7.PVYx4 (obr. 61) byl připraven pro expresi přímé repetice čtyřech PVY sekvencí, řízenou promotorem 35S v transgenních rostlinách. Pro přípravu tohoto plazmidu byla přímá repetice zpBC.PVYx4 klonována jako Xhol-BamHI fragment do pART7, naštěpeného XhoI/BamHI. Sekvence, složená z promotoru 35S, přímých repetic sekvencí PVY a terminátoru OCS, byla vyštěpena jako Notl fragment z pART7.PVYx4 a klonována do pART27, naštěpeného Notl, byl selektován plazmid s požadovanou orientací inzertu a pojmenován pART27. PVYx4.
Plazmidy pART7.PVY.LNYV.PVY a pART27.PVY.LNYV.PVY
Plazmid pART7.PVY.LNYV.PVY (obr. 62) byl připraven pro expresi přerušené přímé repetice pVY sekvencí, řízenou promotorem 35S v transgenních rostlinách. Tento konstrukt byl připraven klonováním přerušené přímé repetice PVY sekvencí z pBC.PVY.LNYV.PVY jako Xhol-Xbal fragment do pART27, naštěpeného Xhol/Xbal. Sekvence, složená z promotoru 35S, přerušené přímé repetice sekvencí PVY a terminátoru OCS, byla vyštěpena jako Notl fragment z pART7.PVY.LNYV.PVY a klonována do pART27 naštěpeného Notl, byl selektován plazmid s požadovanou orientací inzertu a pojmenován pART27.PVY.LNYV.PVY.
Plazmid pART7.PVY.LNYV.YVPA a pART27.PVY.LNYV.YVPA
Plazmid pART7.PVY.LNYV.PVYA (obr. 63) byl připraven pro expresi částečného přerušeného palindromu PVY sekvencí, řízenou promotorem 35S v transgenních rostlinách. Tento konstrukt byl připraven klonováním částečného přerušeného palindromu PVY sekvencí z pBC.PVY.LNYV.PVYA jako Xhol-Xbal fragment do pART27, naštěpeného Xhol/Xbal. Sekvence složená z promotoru 35S, částečného přerušeného palindromu sekvencí PVY a terminátoru OCS, byla vyštěpena jako Notl fragment z pART7.PVY.LNYV.PVYA a byla klonována do pART27, naštěpeného Notl, pak byl selektován plazmid s požadovanou orientací inzertu a pojmenován pART27.PVY.LNYV.YVPA.
Plazmidy pART7.PVY.LNYV.YVPA a pART27.PVY.LNYV.YVPA
-33 CZ 295108 B6
Plazmid paRT7.PVY.LNYV.PVYA (obr. 63) byl připraven pro expresi částečného přerušeného palindromu PVY sekvencí, řízenou promotorem 35S v transgenních rostlinách. Tento konstrukt byl připraven klonováním částečného přerušeného palindromu PVY sekvencí z pBC.PVY.LNYV.PVYA jeho Xhol-Xbal fragment do pART27, naštěpeného Xhol/Xbal. Sekvence složená z promotoru 35S, částečného přerušeného palindromu sekvencí PVY a terminátoru OCS, byla vyštěpena jako Notl fragment z pART7.PVY.LNYV.PVYA a byla klonována do pART27, naštěpeného Notl, pak byl selektován plazmid s požadovanou orientací inzertu a pojmenován pART27.PVY.LNYV.YVPA.
Plazmidy pART7.PVY.LNYV.YVPA a pART27.PVY.LNYV.YVPA
Plazmid pART7.PVY.LNYV.PVYA (obr. 63) byl připraven pro expresi částečného přerušeného palindromu PVY sekvencí, řízenou promotorem 35S v transgenních rostlinách. Tento konstrukt byl připraven klonováním částečného přerušeného palindromu PVY sekvencí z pBC.PVY.LNYV.PVYA jako Hhol-Xbal fragment do pARAT27, naštěpeného Hhol/Xbal. Sekvence složená z promotoru 35S, částečného přerušeného palindromu sekvencí PVY a terminátoru OCS, byla vyštěpena jako Notl fragment z pART7.PVY.LNYV.PVYA a byla klonována do pART27, naštěpeného Notl, pak byl selektován plazmid s požadovanou orientací inzertu a pojmenován pART27.PVY.LNYV.YVPA.
Plazmidy ApART7.PVY.LNYV.YVPA a pART27.PVY. LNYV.YVPA
Plazmid pART7. PVY.LNYV.YVPA (obr. 63) byl připraven pro expresi částečného přerušeného palindromu PVY sekvencí, řízenou promotorem 35S v transgenních rostlinách. Tento konstrukt byl připraven klonováním částečného přerušeného palindromu PVY sekvencí z pBC.PVY.LNYV.PVYA jako Xhol-Xbal fragment do pAART27, naštěpeného Xhol/Xbal. Sekvence složená z promotoru 35S, částečného přerušeného palindromu sekvencí PVY a terminátoru OCS, byla vyštěpena jako Notl fragment z pART.PVY.LNYV.PVYA a byla klonována do pART27, naštěpeného Notl, pak byl selektován plazmid s požadovanou orientací inzertu a pojmenován pART27.PVY.LNYV.YVPA.
Plazmidy pART7.PVY.LNYV.YVP a pART27.PVY.LNYV.YVP
Plazmid pART7.PVY.LNYV.YVP (obr. 64) byl připraven pro expresi přerušeného palindromu PVY sekvencí, řízenou promotorem 35S v transgenních rostlinách. Tento konstrukt byl připraven klonováním přerušeného palindromu PVY sekvencí z pBVC.PVY.LNYV.YVPA jako XholXbal fragment do pART27, naštěpeného Xhol/Xbal. Sekvence složená z promotoru 35S, částečného přerušeného palindromu sekvencí PVY a terminátoru OCS, byla vyštěpena jako Notl fragment z pART7.PVY.LNYV.YVP a byla klonována do pART27, naštěpeného Notl, pak byl selektován plazmid s požadovanou orientací inzertu a pojmenován pART27.PVY.LNYV.YVP.
Plazmidy pART7.35S.PVY.SCBV.YVP a pART27.35S.PVY.SCBV.YVP
Plazmid pART7.35S.PVY.SCBV.YVP (obr. 65) byl připraven pro současnou expresi sense a antisense konstruktů v transgenních rostlinách. Pro přípravu tohoto plazmidu byl PVY fragment z ClapBC.PVY klonován jako Xhol-EcoRI fragment do p35S.SCBV.O.SCBV.YVP, naštěpeného Xhol/EcoRI. Sekvence, tvořená promotorem 35S, řídícím sense PVY sekvence a terminátorem OCS, byla vyštěpena jako Notl fragment a klonována do pART27. Plazmid s požadovanou orientaci inzertu byl izolován a pojmenován pART27.35S.PVY.SCBV.YVP.
Plazmidy pART7.35S.PVYx3.SCBV.YVPx3 a pART27.35S.PVYx3.SCBV.YVPx3
Plazmid pART7.35S.PVYx3.SCBV.YVPx3 (obr. 66) byl připraven pro současnou expresi sense a antisense repetic PVY sekvencí v transgenních rostlinách. Pro přípravu tohoto plazmidu byl připraven nejdříve meziprodukt pART7.35S.O.SCBV.YVPx3 tak, že YVPx3 fragment z ClapBC.PVYx3 byl klonován jako Clal-AccI fragment do p35S.PVYxSCBV.cass, naštěpeného Clal a byl izolován plazmid s antisense orientací. Pro přípravu p35S.PVYx3.SCBV.YVPx3
-34CZ 295108 B6 byla trojitá přímá repetice PVY z ClapBC.PVYx3 klonována jako KpnI-Smal fragment do p35S.O.SCBV.YVPx3, čímž byl vytvořen p35S.PVYx3.SCBV.YVPx3. Sekvence, tvořená oběma promotory, přímou repeticí PVY a terminátory, byla vyštěpena jako Not I fragment a klonována do pART27. Plazmid s požadovanou orientací inzertu byl izolován a pojmenován pART27.35S.PVYx3.SCBV.
Plazmidy pART7.PVYx3.LNYV.YVPx3 a pART27.PVYx3 .LNYV.YVPx3
Plazmid pART7.PVYx3.LNYV.YVPx3 (obr. 67) byl připraven pro expresi trojité repetice PVY sekvencí jakožto přerušeného palindromu. Pro konstrukci tohoto plazmidu byl připraven nejdříve meziprodukt pART7.PVYx3.LNYV.YVP klonováním AccI-Clal fragmentu PVY.LNYV.YVP z pBC.PVY.LNYV.YVP do plazmidu pART7.PVYx2. Plazmid pART7.PVYx3.LNYV.YVPx3 byl připraven klonováním další přímé repetice PVY z pBC.PVYx2 jako AccI-Clal fragmentu do pART7.PVYxy3.LNYV.YVP, naštěpeného Clal. Sekvence zpART7.35S.PVYx3.LNYV.YVPx3, obsahující 35S promotor, všechny PVY sekvence a terminátor OCS, byla vyštěpena jako Notl fragment a byla klonována do pART27, naštěpeného Notl, pak byl selektován plazmid s požadovanou orientací inzertu a pojmenován pART27.35S.PVYx3.LNYV.
Plazmidy pART7.PVYmulti a pART27.PVYmulti
Plazmid pART7.PVYmulti (obr. 68) byl připraven pro expresi přímých repetic vyššího řádu úseků PVY sekvencí v transgenních rostlinách. Přímé repetice vyššího řádu úseku NI PVY velikosti 72 bp byly připraveny spojením dvou částečně komplementárních oligonukleotidů následujících sekvencí:
PVY1:
5-TAATGAGGATGATGTCCCTACCTTTAATTGGCAGAAATTTCTGTGGAAAGACA GGGAAATCTTTCGGCATTT-3' sekvence id. č. 15; a
PVY2:
5-TTCTGCCAATTAAAGGTAGGGACATCATCCTCATTAAAATGCCGAAAGATTTC CCTGTCTTTCCACAGAAAT-3' sekvence id č. 16
Tyto oligonukleotidy byly fosfoiylovány T4 polynukleotidylkinázou, zahřátý a ponechány pomalu chladnout, aby došlo k samovolnému napojení (annaeling), pak byly ligovány T4 DNA ligázou, konce byly doplněny Klenowovým fragmentem DNA polymerázy a celý fragment byl klonován do pCR2.1 (Invitrogen). Plazmidy, obsahující vícečetné repetice, byly izolovány a sekvence byly klonovány jakožto EcoRI fragmenty v sense orientaci do pART7, naštěpeného EcoRI, čímž byl vytvořen meziprodukt pART7.PVY.multi. Pro přípravu pART27.PVY.multi byla sekvence, obsahující 35S promotor, PVY sekvence a terminátor OCS, vyštěpena jako Notl fragment a byla klonována do pART27, naštěpeného Notl. Plazmid s požadovanou orientací inzertu byla pak izolován a pojmenován pART27.PVAmulti.
Příklad 4
Inaktivace exprese virových genů u savců
Buněčné linie odolné vůči virům byly připraveny tak, že virové sekvence byly exprimovány v buňkách stabilně transformovaných linií.
V tomto případě byly užity zejména lytické viry, neboť lýze poskytuje možnost jednoduchého screeningu a také nabízí možnost přímé selekce na potenciálně velmi vzácnou událost, kterou může vzniknout imunita vůči viru. Subgenomové fragmenty, odvozené z viru (bovinní enterovirus, BEV), s jednovláknovým RNA genomem nebo komplexního viru (Herpes simplex I, HSV I) s dvouřetězcovou DNA, byly klonovány do vhodného vektoru a exprimovány v transformovaných buňkách. Savčí buněčné linie byly transformovány genovými konstrukty, které byly připra-35 CZ 295108 B6 vény pro expresi virových sekvencí, řízenou silným promotorem cytomegaloviru (CMV-IE). Použité sekvence zahrnovaly gen virově specifické replikázy. Také náhodné knihovny, připravené tzv. „shotgun“ metodou, obsahující reprezentativní virové sekvence, mohou být také užity jako vnesená molekula rozptýlené nukleové kyseliny pro zacílení na expresi virových sekvencí.
K příkladům genových konstruktů, použitých v tomto pokusu, patří nukleotidové sekvence, odvozené z genu RNA-dependentní RNA polymerázy viru BEV, které jsou zde uvedeny formou příkladu.
Pro konstrukty virové polymerázy bylo připraveno velké množství transformovaných buněčných linií (asi 100) a bylo infikováno příslušný virem. Pro buňky, transformované pomocí „shotgun“ knihovny, bylo připraveno zvláště velké množství (stovky) transformovaných linií a byly jako celek podrobeny screeningu na virovou imunitu. Po provokační infekci virem byly selektovány k viru rezistentní linie a byly dále analyzovány, aby se určily sekvence, určující imunitu.
Rezistentní buněčné linie podporují skutečnost, že vnesené nukleotidové sekvence jsou schopny inaktivovat expresi virových genů v savčím systému.
Kromě toho rezistentní linie, získané v tomto pokuse, byly použity k podrobnějšímu určení molekulárních a biochemických charakteristik modulace, která byla v pokusu pozorována.
Příklad 5
Indukce rezistence k virům u rostlin
Kmen LBA4404 Agrobacterium tumefaciens byl v nezávislých pokusech transformován následujícími konstrukty:
pART27.PVA, pART27.PVYx2, pART27.PVYx3, pART27.PVYx4, pART27.PVY.LNYV.PVY, pART27.PVY.LNYV.YVPA, pART27.PV.LNYV.YVP, pART27.35S.PVY.SCBV.O,pART27.35S.O.SCBV.PVY, pART27.35S.O.SCBV.YVP, pART27.35S.PVY.SCBV.YVP, pART27.35S.PVYx3.SCBV.YVPx3,pART27.PVYx3.LNYV.YVPx3 a pART27.PVYxlO, a sice metodou triparentální konjugace. Z těchto kmenů byla minipreparací připravena DNA a restrikcí enzymem Notl bylo ověřeno, že obsahují odpovídající binární vektory.
Rostliny tabáku Nicotiana tabaccum (kultivar W38) byly transformovány výše uvedenými kmeny Agrobacterium tumefaciens standardním postupem transformace. Výhonky z pravděpodobných transformant byly odříznuty a zakořeněny v médiu, obsahujícím kanamycin. Bylo pozorováno, že pouze transformované výhonky zakořeňovaly v médiu s kanamycinem. Zakořeněné rostlinky byly přeneseny do půdy a aklimatizovány. Po dvou až třech týdnech byly vybrány dobře rostoucí silné rostliny, které měly alespoň tři sady listů, a byly infikovány PVY.
Virové inokulum bylo připraveno z rostlin tabáku W38 předtím infikovaných virem, které projevovaly zřetelné symptomy virové infekce: Asi 2 g listového materiálu byly rozdrceny karborundum v 10 ml ÍOOmM Na-fosfátového pufru (pH 7,5). Inokulum pak bylo naředěno do 200 ml dalším Na-fosfátovým pufrem. Dva listy každé transgenní rostliny byly poprášeny karborundovým práškem, pak bylo na každý list naneseno 0,4 ml inokula a vetřeno do listu silným promnutím prsty. Užitím tohoto postupu bylo 100 % kontrolních netransgenních rostlin infikováno virem PVY.
-36CZ 295108 B6
Pro testování transgenních rostlin na virovou rezistenci a imunitu byly rostliny sledovány z hlediska rozvoje symptomů. U použitého kmenu PVY (PVCY-D, Australský izolát PVY) jsou na tabáku W38 zřetelné symptomy, vyjasnění žilnatiny, jsou ihned pozorovatelné na dvou listech nad inokulovanými listy, a u dalších listů se projevují chlorotické léze. Rozvoj symptomů byl pozorován po období šesti týdnů.
Transgenní linie byly uznány za rezistentní, když se u nich projevovaly redukované symptomy, tedy menší než počet listů s chlorotickými lézemi. Rezistence se projevovala od velmi silné rezistence, kdy se dalo pozorovat jen několik málo lézi, až po slabou rezistenci, která se projevila redukovanými symptomy, které se projevily na listech, které se vyvinuly v pozdějších fázích růstu.
Transgenní rostliny, které neprojevovaly vůbec žádné příznaky, byly hodnoceny jako imunní. K ověření imunity byly tyto rostliny znovu inokulovány virem, přičemž většina rostlin růstala imunní, a několik rostlin, u kterých se projevily symptomy, bylo hodnoceno jako rezistentní.
Pro vytvořené linie rostlin byly provedeny Southemovy hybridizace a byla sledována rezistence v následující generaci, aby se ověřilo, zda se rezistence/imunita přenáší. Kromě toho šíře virové rezistence byla monitorována provokační infekcí linií jiným kmenem PVY, aby se zjistilo, zda nedošlo k modifikaci rozsahu vnímavosti hostitele.
Výsledky z těchto pokusů jsou shrnuty v tabulce 2. Tato data ukazují, že konstrukty, obsahující tandemové repetice cílové genové sekvence, buďto v konfiguraci jako palindromy, přerušené palindromy nebo přímé repetice, poskytují transgenním rostlinám virovou rezistenci a/nebo imunitu.
Tudíž takové invertované a/nebo přímé repetice modulují expresi virových cílových genů v transgenních rostlinách. Konstrukty, kombinující použití přímé a invertované repetice, zejména pART27.35S.PVYx3.SCBV.YVPx3 a pART27.PVYx3.LNYV.YVPx3, byly užitečné pro modulaci genové exprese.
Příklad 6
Inaktivace genu Galt v živočišných buňkách
Pro otestování inaktivace Galt byly prasečí buňky PK2 transformovány odpovídajícími konstrukty. Buňky PK2 konstitutivně exprimují enzym Galt, jehož aktivita vede k adici různých a-1,3galaktosylových skupin na řadu proteinů, exprimovaných na povrch těchto buněk. Buňky byly transformovány užitím přípravku Lipofectin a stabilně transformované linie byly selektovány pomocí genetecinu.
V počátečním testu byly buněčné linie zkoumány na přítomnost Galt epitopu, tj. oc-l,3-galaktosylových skupin na proteinem buněčného povrchu, užitím lektinu IB4. Vazba IB4 byla sledována buďto n šitu nebo pomocí třídění buněk průtokovou cytometrií, FACS.
Pro vazbu in šitu byly buňky fixovány k pevné podložce chladným metanolem 5 minut, pak byly opláchnuty PBS (solný roztok pufrovaný fosfátem) a nespecifická vazba IB4 byla blokována 1% BSA v PBS 10 minut. Fixované buňky byly testovány s 20 pg/ml konjugátu IB4-biotin (Sigma) v 1% BSA v PBS, 30 minut při teplotě místnosti, buňky byly opláchnuty PBS a pak testovány s Extravidin-FITC (Sigma) v ředění 1:200 v PBS po 30 minut a pak opět opláchnuty PBS. Buňky pak byly vyšetřeny fluorescenčním mikroskopem, přičemž za těchto podmínek byl vnější povrch kontrolních buněk PK2 uniformě zeleně obarven.
Pro analýzu FACS byly buňky po ošetření resuspendovány s trypsinem, opláchnuty v roztoku HSS/Hepes (Hanksův pufrovaný roztok s 20mM Hepes, pH 7,4) a pak inkubovány s 10 pg/ml
-37CZ 295108 B6 konjugátu IB4-biotin (Sigma) v HBSS/Hepes po 45 minut při 4 °C. Pak byly buňky opláchnuty HBSS/Hepes a inkubovány Extravidin-FITC (Sigma) v ředění 1:200 HBSS/HEPES po 45 minut při 4 °C a opláchnuty HBSS/Hepes před FACS analýzou.
Tímto postupem byly transformované buněčné linie otestovány na aktivaci galt a kvantitativně byla vyhodnocena účinnost použitých konstruktů. Navíc buněčné linie, které jevily inaktivaci Galt, byly izolovány a podrobněji dále analyzovány ke stanovení molekulárního mechanismu genové inaktivace.
Tabulka 2
PROCENTO ROSTLIN/VÝKAZU JÍCÍ SPECIFICKÝ FENOTYP REZISTENTNÍ CM rr xt- CD Γ— nr- TT xi CO co M- o
z z o S τ— M· to r- o O o CO CN O r—
'111 3 s z > CO IO CN LO OO co CO CO CO r-
POČET ROSTLIN w LU F- > σ> co V“ r- CM CN LO CN CM CN CO Γ-* T co CN o CN CO T“
PLAZMIDOVÝ KONSTRUKT CL H cr < CL CM X 5 Ol CN ία: < CL CO X CL H CZ < CL xr X CL r-4 CN H CZ < CL O Q CQ O ω £ CL ώ lO CO r-7 CN 1— CZ < CL 5 n. > m o CO ó <z> io co r-’ CN 1— CC < CL CL š o ω ó ω m co r-‘ CN F~ CZ < CL pART27.35S.PVY.SCBV.YVP 5 CL z CL CN ιοί < Cl pART27.PVY.LNYV.YVP CL ř 5Ť z —J 5 CL CN Ftx: < CL
-38CZ 295108 B6
Seznam sekvencí < 110> Benitec Australia Limited AND
Statě of Queensland through its Department of Primary Industries <120> Control of gene expression <130> CAM/00101 <140> PCT/AU99/00195 <141> 1999-03-19 <150> AUPP2492 <151> 1998-03-20 <150> AUPP2499 <151> 1998-03-20 <160> 16 < 170> Patentln version 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> jellyfísh <400> 1 agatctgtaa acggccacaa gttcag 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> jellyfísh <400>2 ggatccttgt acagctcgtc catgcc26 <210>3 <211>74 <212> DNA <213> virus <400>3 gtcgacaata aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgatttt60 tgcaaaagc tagg <210>4 <211>31 <212> DNA <213> virus
-39CZ 295108 B6 <400>4 gtcgacgttt agagcagaag taaacacttcc g31 <210>5 <211>38 <212> DNA <213> virus <400>5 cggcagatct aacaatggca ggacaaatcg agtacatc38 <210> 6 <211>31 <212> DNA <213> virus <400>6 cccgggatcc tcgaaagaat cgtaccactt c31 <210>7 <211>29 <212> DNA <213> virus <400>7 gggcggatcc ttagaaagaa tcgtaccac29 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> virus <400>8 cggcagatct ggacaaatcg agtacatc28 <210>9 <211>37 <212> DNA <213> agrobacterium <400>9 ggattcccgg gacgtcgcga atttcccccg atcgttc37 <210> 10 <211>33 <212> DNA <213> agrobacterium <400>10 ccatggccat ataggcccga tctagtaaca tag33 <210> 11 <211>33 <212> DNA <213> virus
-40CZ 295108 B6 <400> 11 ccatggccta tatggccatt ccccacattc aag 33 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> virus <400> 12 aacgttaact tctacccagt tccagag 27 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> virus <400>13 atgggatccg ttatgccaag aagaagga <210>14 <211>24 <212> DNA <213> virus <400> 14 tgtggatccc taacggaccc gatg 24 <210> 15 <211> 72 <212> DNA <213> virus <400> 15 taatgaggat gatgtcccta cctttaattg gcagaaaattt ctgtggaaag acagggaaat 60 ctttcggcat tt <210> 16 <211> 72 <212> DNA <213> virus <400> 16 ttctgccaat taaaggtagg gacatcatcc tcattaaaat gccgaaagat ttccctgtct 0 ttccacagaa at
-41 CZ 295108 B6
Citovaná literatura
1. An et al.. (1985) EMBO J. 4:277-284.
2. Armstrong, et al., Planí Cell Reports9:335-339, 1990.
3. Ausubel, F.M. et al., (1987) In: Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (ISBN 047140338).
4. Chalfíe, M.e/al. (1994) Science 263: 802-805.
5. Christensen, A.H., and Quail, P.H., (1996) Transgenic Research 5. 213-218.
6. Christou, P., et al., Plant Physiol 87: 671-674, 1988.
7. Cormack, B. Et al. (1996) Gene 173: 33-38.
8. Crossway et al., Mol. Gen. Genet.202: 179—185, 1986.
9. Dorer, D.R., and Henikoff, S. (1994) Cell 7: 993-1002.
10. Fromm et al. Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 82: 5824-5828, 1985.
11. Gleave, A.P. (1992) Plant Molecular Biology 20: 1203-1207.
12. Hanahan, D. (1983), J. Mol. Biol. 166: 557-560.
13. Herrera-Estella et al., Nátuře 303: 209-213, 1983a.
14. Herrera-Estella et al., EMBOJ. 2:987-995, 1983b.
15. Herrera-Estella et al., In: Plant Genetic Engineering, Cambridge University Press, N.Y., pp.63-93, 1985.
16. Inouye, S. and Tsuji, F.I. (1994) FEBS Letts. 341:277-280.
17. Jackson, I.J. (1995) Ann. Rev. Gene t. 28. 189-217.
18. Krens, F.A., et al.. Nátuře 296: 72-74, 1982.
19. Kwon, B.S. et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Comm. 153: 1301-1309.
20. Pal-Bhadra M. etal., EMBOJ. 3: 2717-2722, 1984
22. Prasher, D. C. et al., (1992) Gene 111: 229-233:
23. Sanford, J.C., et al., Particulate Science and Technology 5: 27-37, 1987.
-42CZ 295108 B6

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Syntetický gen, obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu, 5 zahrnující přinejmenším dvě kopie strukturální genové sekvence, kde první kopie této strukturální genové sekvenceje přinejmenším z 80 % identická s nukleotidovou sekvencí úseku cílového genu a druhá kopie této strukturální genové sekvence je přinejmenším z 80 % identická s nukleotidovou sekvencí, komplementární k úseku cílového genu, a kde syntetický gen je schopný post-translační represe, zpoždění nebo jiné redukce exprese tohoto 10 cílového genu, jestliže je exprimován v hostitelské buňce savce sekvenčně-specifíckou degradací
    RNA transkripce cílového genu endogenním hostitelským buněčným systémem.
  2. 2. Syntetický gen podle nároku 1, kde uvedená první kopie strukturální genové sekvence je přinejmenším 85 % identická se sekvencí oblasti cílového genu a uvedená druhá kopie strukturál-
    15 ní genové sekvenceje přinejmenším z 85 % identická s nukleotidovou sekvencí, komplementární k úseku cílového genu.
  3. 3. Syntetický gen podle nároku 1, kde uvedená první kopie strukturální genové sekvence je přinejmenším 90 % identická se sekvencí oblasti cílového genu a uvedená druhá kopie strukturál-
    20 ní genové sekvenceje přinejmenším z 90 % identická s nukleotidovou sekvencí, komplementární k úseku cílového genu.
  4. 4. Syntetický gen podle nároku 1, kde uvedená první kopie strukturální genové sekvenceje přinejmenším 95 % identická se sekvencí oblasti cílového genu a uvedená druhá kopie strukturál-
    25 ní genové sekvence je přinejmenším z 95 % identická s nukleotidovou sekvencí, komplementární k úseku cílového genu.
  5. 5. Syntetický gen podle nároku 1, kde uvedená první kopie strukturální genové sekvenceje přinejmenším 99 % identická se sekvencí oblasti cílového genu a uvedená druhá kopie strukturál-
    30 ní genové sekvenceje přinejmenším z 99 % identická s nukleotidovou sekvencí, komplementární k úseku cílového genu.
  6. 6. Syntetický gen podle nároku 1, kde uvedené přinejmenším dvě kopie uvedené strukturální genové sekvence jsou invertované repetice ve stejném pásu nukleové kyseliny.
  7. 7. Syntetický gen podle nároku 1, kde uvedené přinejmenším dvě kopie uvedené strukturální genové sekvence jsou odděleny vloženým fragmentem nukleové kyseliny.
  8. 8. Syntetický gen podle nároku 1, kde buňka savce je myší buňka.
  9. 9. Syntetický gen podle nároku 1, kde cílový gen je endogenní gen.
  10. 10. Syntetický gen podle nároku 1, kde cílovým genem je a-1,3-galaktosyntransferáza.
    45
  11. 11. Syntetický gen podle nároku 1, kde uvedené přinejmenším dvě kopie uvedené strukturální genové sekvence jsou umístěny operativně pod kontrolu jediné promotorové sekvence.
  12. 12. Syntetický gen podle nároku 1, kde každá z uvedených kopií strukturální genové sekvenceje odděleně a operativně napojena na oddělenou promotorovou sekvenci.
  13. 13. Syntetický gen podle nároku 1, kde každá z uvedených kopií strukturální genové sekvenceje operativně napojena na prostorově oddělené promotorové sekvence.
    -43 CZ 295108 B6
  14. 14. Syntetický gen podle nároku 11 nebo 12, kde uvedená promotorová sekvence je CMV promotorová sekvence.
  15. 15. Genový konstrukt, obsahující syntetický gen podle nároku 1.
CZ20003346A 1998-03-20 1999-03-19 Syntetický gen obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu a genový konstrukt obsahující tento syntetický gen CZ295108B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AUPP2492A AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-03-20 Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
AUPP2499A AUPP249998A0 (en) 1998-03-20 1998-03-20 Gene expression I

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20003346A3 CZ20003346A3 (cs) 2001-03-14
CZ295108B6 true CZ295108B6 (cs) 2005-05-18

Family

ID=25645735

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20003346A CZ295108B6 (cs) 1998-03-20 1999-03-19 Syntetický gen obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu a genový konstrukt obsahující tento syntetický gen

Country Status (21)

Country Link
US (6) US20030074684A1 (cs)
EP (5) EP2302057B1 (cs)
JP (4) JP4187413B2 (cs)
KR (3) KR101085210B1 (cs)
CN (3) CN101818145A (cs)
AT (2) ATE526406T1 (cs)
AU (6) AU743316C (cs)
BR (1) BRPI9908967B1 (cs)
CA (3) CA2323726C (cs)
CZ (1) CZ295108B6 (cs)
DK (1) DK1624060T3 (cs)
ES (2) ES2374290T3 (cs)
GB (1) GB2353282C (cs)
HK (1) HK1035742A1 (cs)
HU (1) HU230353B1 (cs)
NZ (2) NZ547283A (cs)
PL (1) PL343064A1 (cs)
SG (2) SG115493A1 (cs)
SK (1) SK287538B6 (cs)
WO (1) WO1999049029A1 (cs)
ZA (1) ZA200004507B (cs)

Families Citing this family (280)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
KR101085210B1 (ko) 1998-03-20 2011-11-21 커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 유전자 발현 조절방법
JP5015373B2 (ja) * 1998-04-08 2012-08-29 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション 改良表現型を得るための方法及び手段
US8598332B1 (en) 1998-04-08 2013-12-03 Bayer Cropscience N.V. Methods and means for obtaining modified phenotypes
US20040214330A1 (en) 1999-04-07 2004-10-28 Waterhouse Peter Michael Methods and means for obtaining modified phenotypes
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
US6939712B1 (en) * 1998-12-29 2005-09-06 Impedagen, Llc Muting gene activity using a transgenic nucleic acid
AU776150B2 (en) 1999-01-28 2004-08-26 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for (in vivo) and (in vitro) attenuation of gene expression using double stranded RNA
AU2008202208C1 (en) * 1999-01-30 2014-04-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a defined gene
DE19956568A1 (de) * 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
WO2000063364A2 (en) * 1999-04-21 2000-10-26 American Home Products Corporation Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US20040138168A1 (en) * 1999-04-21 2004-07-15 Wyeth Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
TR200103088T2 (tr) * 1999-05-10 2002-05-21 Syngenta Participations Ag Viral gen ekspresyonunun düzenlenmesi.
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
US7067722B2 (en) 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
BR0013607A (pt) 1999-08-26 2002-04-30 Calgene Llc Sequências de ácidos nucléicos e processos de uso para a produção de plantas com ácidos graxos poliinsaturados modificados
US7531718B2 (en) 1999-08-26 2009-05-12 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
GB9927444D0 (en) * 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
WO2003070918A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Rna interference by modified short interfering nucleic acid
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US20070026394A1 (en) 2000-02-11 2007-02-01 Lawrence Blatt Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US8202846B2 (en) 2000-03-16 2012-06-19 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for RNA interference
JP2003526367A (ja) 2000-03-16 2003-09-09 ジェネティカ インコーポレイテッド Ｒｎａ干渉の方法とｒｎａ干渉組成物
AU2001240375A1 (en) * 2000-03-17 2001-10-03 Benitec Australia Limited Genetic silencing
CA2404890C (en) 2000-03-30 2013-11-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US20080032942A1 (en) 2000-08-30 2008-02-07 Mcswiggen James RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering nucleic acid (siNA)
CA2427347C (en) 2000-10-31 2011-01-18 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Method and means for producing barley yellow dwarf virus resistant cereal plants
BRPI0115814B8 (pt) 2000-12-01 2021-05-25 Europaeisches Laboratorium Fuer Molekularbiologie Embl moléculas de rna de filamento duplo, seu método de preparação e composição farmacêutica compreendendo as mesmas
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US8546143B2 (en) 2001-01-09 2013-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
CA2429397C (en) 2001-01-26 2014-06-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and means for producing efficient silencing construct using recombinational cloning
EP1229134A3 (en) 2001-01-31 2004-01-28 Nucleonics, Inc Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
US20050159378A1 (en) 2001-05-18 2005-07-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050256068A1 (en) 2001-05-18 2005-11-17 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of stearoyl-CoA desaturase (SCD) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US9994853B2 (en) 2001-05-18 2018-06-12 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
WO2003070972A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20050014172A1 (en) 2002-02-20 2005-01-20 Ivan Richards RNA interference mediated inhibition of muscarinic cholinergic receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20030175950A1 (en) * 2001-05-29 2003-09-18 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of HIV gene expression using short interfering RNA
US8008472B2 (en) 2001-05-29 2011-08-30 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of human immunodeficiency virus (HIV) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
BR0211111A (pt) 2001-07-12 2004-06-22 Univ Massachusetts Molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, transgene, precursor de rna engenheirado, animal transgênico não humano, e, método de induzir a interferência de ácido ribonucleico de um gene alvo em uma célula
EP1409506B1 (en) 2001-07-23 2012-05-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for rnai mediated inhibition of gene expression in mammals
US10590418B2 (en) 2001-07-23 2020-03-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for RNAi mediated inhibition of gene expression in mammals
US7612194B2 (en) 2001-07-24 2009-11-03 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof
US20050037989A1 (en) * 2001-08-27 2005-02-17 Lewis David L. Inhibition of gene function by delivery of polynucleotide-based gene expression inhibitors to mammalian cells in vivo
EP3415625A1 (en) 2002-02-01 2018-12-19 Life Technologies Corporation Double-stranded oligonucleotides
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US7893248B2 (en) 2002-02-20 2011-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7928218B2 (en) 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of polycomb group protein EZH2 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090192105A1 (en) 2002-02-20 2009-07-30 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF INTERCELLULAR ADHESION MOLECULE (ICAM) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCELIC ACID (siNA)
AU2003207708A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
US7700760B2 (en) 2002-02-20 2010-04-20 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular cell adhesion molecule (VCAM) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7795422B2 (en) 2002-02-20 2010-09-14 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of hypoxia inducible factor 1 (HIF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7897752B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of telomerase gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7667029B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (CHK-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7910724B2 (en) 2002-02-20 2011-03-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Fos gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090253774A1 (en) 2002-02-20 2009-10-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PLATELET DERIVED GROWTH FACTOR (PDGF) AND PLATELET DERIVED GROWTH FACTOR RECEPTOR (PDGFR) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7667030B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of matrix metalloproteinase 13 (MMP13) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7662952B2 (en) 2002-02-20 2010-02-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of GRB2 associated binding protein (GAB2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
ATE519774T1 (de) 2002-02-20 2011-08-15 Sirna Therapeutics Inc Durch eine störung der rna vermittelte inhibierung der genexpression des hepatitis c virus (hcv) mit kurzer, störender nukleinsäure (short interfering nucleic acid, sina)
WO2003070966A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc RNA INTERFERENCE MEDIATED TARGET DISCOVERY AND TARGET VALIDATION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20090099117A1 (en) 2002-02-20 2009-04-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MYOSTATIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7691999B2 (en) 2002-02-20 2010-04-06 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of NOGO and NOGO receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US8013143B2 (en) 2002-02-20 2011-09-06 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of CXCR4 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090253773A1 (en) 2002-02-20 2009-10-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF TNF AND TNF RECEPTOR GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US8067575B2 (en) 2002-02-20 2011-11-29 Merck, Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of cyclin D1 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7683165B2 (en) 2002-02-20 2010-03-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US8258288B2 (en) 2002-02-20 2012-09-04 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of respiratory syncytial virus (RSV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7897753B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of XIAP gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7935812B2 (en) 2002-02-20 2011-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of hepatitis C virus (HCV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7678897B2 (en) 2002-02-20 2010-03-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of platelet-derived endothelial cell growth factor (ECGF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7928219B2 (en) 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of placental growth factor gene expression using short interfering nucleic acid (SINA)
US7683166B2 (en) 2002-02-20 2010-03-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7928220B2 (en) 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7897757B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of protein tyrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
ES2346645T3 (es) * 2002-03-14 2010-10-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Procedimientos y medios de supervision y modulacion del silenciamiento genico.
US7566813B2 (en) 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
EP1484959A4 (en) 2002-03-21 2005-08-31 Monsanto Technology Llc NUCLEIC ACID CONSTRUCTS AND METHODS FOR PRODUCING MODIFIED SEED OIL COMPOSITIONS
US7166771B2 (en) 2002-06-21 2007-01-23 Monsanto Technology Llc Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs
US20040180438A1 (en) 2002-04-26 2004-09-16 Pachuk Catherine J. Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity
CA2524569C (en) 2002-05-03 2013-10-22 Duke University A method of regulating gene expression
SI3222724T1 (sl) 2002-08-05 2019-03-29 Silence Therapeutics Gmbh Nadaljnje nove oblike molekul interferenčne RNA
US20050042646A1 (en) 2002-08-05 2005-02-24 Davidson Beverly L. RNA interference suppresion of neurodegenerative diseases and methods of use thereof
US20080274989A1 (en) 2002-08-05 2008-11-06 University Of Iowa Research Foundation Rna Interference Suppression of Neurodegenerative Diseases and Methods of Use Thereof
US20040241854A1 (en) 2002-08-05 2004-12-02 Davidson Beverly L. siRNA-mediated gene silencing
EP1552018B1 (en) 2002-08-12 2009-07-01 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions relating to gene silencing
CA2899360A1 (en) 2002-08-21 2004-04-08 Revivicor, Inc. Porcine animals lacking any expression of functional alpha 1,3 galactosyltransferase
US7956176B2 (en) 2002-09-05 2011-06-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US20040242518A1 (en) * 2002-09-28 2004-12-02 Massachusetts Institute Of Technology Influenza therapeutic
US20040152651A1 (en) * 2002-11-01 2004-08-05 Rana Tariq M. Regulation of transcription elongation factors
US7078234B2 (en) 2002-12-18 2006-07-18 Monsanto Technology Llc Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof
CN1836045B (zh) 2003-03-28 2012-05-09 孟山都技术有限公司 用于早期种子发育的新型植物启动子
WO2004106517A1 (en) * 2003-06-03 2004-12-09 Benitec Australia Limited Double-stranded nucleic acid
NZ544391A (en) 2003-06-06 2009-06-26 Arborgen Llc Plant transformation and selection
EP1636385A4 (en) * 2003-06-24 2010-06-02 Mirus Bio Corp INHIBITION OF GENE FUNCTION BY IN VIVO DISTRIBUTION OF GENE EXPRESSION INHIBITORS BASED ON POLYNUCLEOTIDES IN MAMMALIAN CELLS
BRPI0412282A (pt) * 2003-07-02 2006-09-19 Musc Found For Res Dev imunidade especìfica e não-especìfica induzida de dsrna em crustáceos e outros invertebrados, e veìculos de bioliberação para uso nestes
CA2533259C (en) 2003-07-21 2014-01-28 Lifecell Corporation Acellular tissue matrices made from galactose .alpha.-1,3-galactose-deficient tissue
CA2536112A1 (en) 2003-08-20 2005-03-03 Northern Sydney And Central Coast Area Health Service Methods for enhancing embryo viability
IL157538A0 (en) 2003-08-21 2004-03-28 Bar Ilan Res & Dev Company Ltd Plant resistant to cytoplasm-feeding parasites
CA2568603A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Modified gene-silencing nucleic acid molecules and uses thereof
AU2004290006A1 (en) 2003-11-05 2005-05-26 University Of Pittsburgh Porcine isogloboside 3 synthase protein, cDNA, genomic organization, and regulatory region
WO2005081714A2 (en) 2003-11-21 2005-09-09 Revivicor, Inc. Use of interfering rna in the production of transgenic animals
EP1697534B1 (en) 2003-12-01 2010-06-02 Life Technologies Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
AU2004304665B2 (en) 2003-12-24 2009-03-12 Novo Nordisk A/S Transgenic non-human mammal comprising a polynucleotide encoding human or humanized C5aR
US7683237B2 (en) 2004-02-10 2010-03-23 Monsanto Technology Llc Maize seed with synergistically enhanced lysine content
AR047598A1 (es) 2004-02-10 2006-01-25 Monsanto Technology Llc Semilla de maiz transgenica con mayor contenido de aminoacidos
US7855323B2 (en) 2004-02-10 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Recombinant DNA for gene suppression
US20060075515A1 (en) 2004-08-11 2006-04-06 Luethy Michael H Enhanced zein reduction in transgenic corn seed
CA2554212A1 (en) 2004-02-10 2005-08-25 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using multifunctional short interfering nucleic acid (multifunctional sina)
JP4763681B2 (ja) 2004-03-05 2011-08-31 ベニテック インコーポレイテッド ＲＮＡｉ作用媒介物の同時デリバリーのためのマルチプロモーター発現カセット
CA2857051A1 (en) 2004-03-17 2005-09-29 David Ayares Tissue products derived from animals lacking any expression of functional alpha 1,3 galactosyltransferase
US20060041961A1 (en) 2004-03-25 2006-02-23 Abad Mark S Genes and uses for pant improvement
US8049069B2 (en) 2004-03-31 2011-11-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Genes involved in plant fibre development
US20060021087A1 (en) 2004-04-09 2006-01-26 Baum James A Compositions and methods for control of insect infestations in plants
CA2884237C (en) 2004-04-22 2020-09-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
CA2557532A1 (en) 2004-04-23 2005-11-10 Angela M. Christiano Inhibition of hairless protein mrna
US10508277B2 (en) 2004-05-24 2019-12-17 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US20060075522A1 (en) 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
US7576261B2 (en) 2004-10-13 2009-08-18 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Nematode resistant transgenic plants
WO2006046148A2 (en) 2004-10-25 2006-05-04 Devgen Nv Rna constructs
EP1809720B1 (en) * 2004-10-29 2012-05-02 Life Technologies Corporation Functionalized fluorescent nanocrystals, and methods for their preparation and use
US8404927B2 (en) * 2004-12-21 2013-03-26 Monsanto Technology Llc Double-stranded RNA stabilized in planta
EP1831376A1 (en) 2004-12-28 2007-09-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Improved grain quality through altered expression of seed proteins
EP2489726A3 (en) 2005-01-12 2012-11-28 Monsanto Technology LLC Genes and uses for plant improvement
AU2006236453B2 (en) * 2005-01-25 2012-02-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Delivery of siRNA by neutral lipid compositions
EP1851317B1 (en) 2005-02-23 2011-10-26 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
DE202005004135U1 (de) * 2005-03-11 2005-05-19 Klocke Verpackungs-Service Gmbh Mehrkomponentenverpackung mit Applikator
WO2006113743A2 (en) * 2005-04-18 2006-10-26 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for rna interference with sialidase expression and uses thereof
ATE552343T1 (de) 2005-04-19 2012-04-15 Basf Plant Science Gmbh Endosperm-spezifische expression und/oder expression in keimenden embryos monokotyledoner pflanzen
US20060272057A1 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for improving crop plant architecture and yield
CA2622660C (en) 2005-09-16 2017-11-07 Devgen Nv Transgenic plant-based methods for plant pests using rnai
PL2431473T3 (pl) 2005-09-16 2017-05-31 Monsanto Technology Llc Sposoby genetycznej kontroli inwazji owadów u roślin i kompozycje do tego przeznaczone
CA2620387C (en) 2005-09-20 2018-09-18 Basf Plant Science Gmbh Methods for controlling gene expression using ta-sirna
US8093369B2 (en) 2005-10-11 2012-01-10 Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Ltd. Compositions for silencing the expression of VDAC1 and uses thereof
CA2626304C (en) 2005-10-20 2015-07-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Cereals with altered dormancy
CA2637254A1 (en) 2006-01-17 2007-07-26 Biolex Therapeutics, Inc. Compositions and methods for humanization and optimization of n-glycans in plants
EP1991568A2 (en) 2006-02-09 2008-11-19 Pioneer Hi-Bred International Inc. Genes for enhancing nitrogen utilization efficiency in crop plants
BRPI0707626A2 (pt) 2006-02-10 2011-05-10 Monsanto Technology Llc identificaÇço e uso de genes alvos para o controle de nematàides parasitas de plantas
CN101421406B (zh) 2006-02-13 2016-08-31 孟山都技术有限公司 用于产生改变的种子油组成的核酸构建体和方法
CA2836368C (en) 2006-02-13 2020-04-07 Monsanto Technology Llc Method for managing crop pest resistance
FR2898908A1 (fr) 2006-03-24 2007-09-28 Agronomique Inst Nat Rech Procede de preparation de cellules aviaires differenciees et genes impliques dans le maintien de la pluripotence
EP2007799A2 (en) 2006-04-19 2008-12-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Isolated polynucleotide molecules corresponding to mutant and wild-type alleles of the maize d9 gene and methods of use
US8536429B2 (en) 2006-07-12 2013-09-17 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Polynucleotides encoding a NAX2 polypeptide and methods for enhancing salinity tolerance in plants
CN101600798A (zh) 2006-08-31 2009-12-09 孟山都技术有限公司 相位型小rna
CN101195821A (zh) 2006-12-04 2008-06-11 中国科学院上海生命科学研究院 利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法
MY152893A (en) 2007-01-10 2014-11-28 Sanofi Aventis Method for determining the stability of organic methyleneamines in the presence of semicarbazide-sensitive amine oxidase
CN101686641B (zh) 2007-02-05 2014-05-07 新加坡国立大学 推定的细胞激动素受体和其应用方法
US8067390B2 (en) * 2007-03-02 2011-11-29 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Therapeutic targeting of interleukins using siRNA in neutral liposomes
DK2129680T3 (en) 2007-03-21 2015-08-10 Brookhaven Science Ass Llc COMBINED hairpin ANTISENSE COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING EXPRESSION OF
CA2682047A1 (en) 2007-03-26 2008-10-02 University Of Massachusetts Medical School Compositions and methods for increasing immunogenicity of glycoprotein vaccines
US20100240597A1 (en) 2007-06-15 2010-09-23 Arkansas State University Methods of delivery of molecules to cells using a ricin subunit and compositions relating to same
CN101821375B (zh) 2007-08-13 2013-07-10 联邦科学技术研究组织 具有低水平大麦醇溶蛋白的大麦
AU2008286701B2 (en) 2007-08-14 2015-02-12 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved gene silencing methods
JP2010536388A (ja) 2007-08-30 2010-12-02 ザ ウォルター アンド エリザ ホール インスティテュート オブ メディカル リサーチ 樹状細胞マーカーおよびその使用法
US8129586B2 (en) 2007-11-20 2012-03-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize ethylene signaling genes and modulation of same for improved stress tolerance in plants
UA113829C2 (uk) 2007-11-27 2017-03-27 Коммонвелс Сайнтіфік Енд Індастріал Рісерч Організейшн Генетично модифікована рослина зі збільшеним потенціалом продуктивності
US8809626B2 (en) 2007-12-21 2014-08-19 Keygene N.V. Trichome specific promoters
EP2268278A4 (en) * 2008-04-04 2011-11-09 Shorr Robert PHARMACEUTICAL COMPOSITION
JP5722765B2 (ja) 2008-04-24 2015-05-27 ニューサウス イノベイションズ ピーティーワイ リミテッド 藍藻類サキシトキシン遺伝子クラスタおよびシアノトキシンを有する生物の検出
WO2009132351A2 (en) * 2008-04-25 2009-10-29 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Anti-sense microrna expression vectors
US8093043B2 (en) 2008-06-04 2012-01-10 New York University β-TrCP1, β-TrCP2 and RSK1 or RSK2 inhibitors and methods for sensitizing target cells to apoptosis
CA2729303A1 (en) 2008-06-30 2010-01-14 Angioblast Systems, Inc. Treatment of eye diseases and excessive neovascularization using a combined therapy
ES2603530T3 (es) 2008-07-21 2017-02-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Aceite de semilla de algodón mejorado y usos
US8329989B2 (en) 2008-09-29 2012-12-11 Monsanto Technology Llc Soybean transgenic event MON87705 and methods for detection thereof
CN102197137A (zh) 2008-10-30 2011-09-21 先锋国际良种公司 对谷氨酰胺合成酶(gs)进行操作以改善高等植物中的氮利用效率和籽粒产量
CN102272157B (zh) 2008-11-07 2015-11-25 研究发展基金会 用于抑制cripto/grp78复合物形成和信号的组合物和方法
US8734853B2 (en) 2008-11-17 2014-05-27 University Of North Texas Health Science Center At Fort Worth HDL particles for delivery of nucleic acids
EP2370092A1 (en) 2008-12-03 2011-10-05 Research Development Foundation Modulation of olfml-3 mediated angiogenesis
CA2743707A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for enhanced yield by targeted expression of knotted1
US8497075B2 (en) 2008-12-09 2013-07-30 Novartis Ag Methods of identifying a modulator that inhibits the binding between Epstein-Barr virus induced receptor 2 and cholesterol derived ligands
WO2010101818A1 (en) 2009-03-02 2010-09-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nac transcriptional activators involved in abiotic stress tolerance
AU2010225469B2 (en) 2009-03-20 2016-05-05 Mesoblast, Inc. Production of reprogrammed pluripotent cells
US20110045080A1 (en) * 2009-03-24 2011-02-24 William Marsh Rice University Single-Walled Carbon Nanotube/Bioactive Substance Complexes and Methods Related Thereto
EP2419510B1 (en) 2009-04-14 2015-09-16 Pioneer Hi-Bred International Inc. Modulation of acc synthase improves plant yield under low nitrogen conditions
CA2758824A1 (en) 2009-04-17 2010-10-21 Basf Plant Science Company Gmbh Plant promoter operable in endosperm and uses thereof
MX2011011076A (es) 2009-04-20 2011-11-18 Monsanto Technology Llc Resistencia a multiples virus en plantas.
ES2644055T3 (es) 2009-06-05 2017-11-27 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Moléculas terapéuticas y de diagnóstico
EP2440664B1 (en) 2009-06-08 2021-04-21 Nunhems B.V. Drought tolerant plants
CA2768571A1 (en) 2009-07-24 2011-01-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. The use of dimerization domain component stacks to modulate plant architecture
CN101760555B (zh) * 2009-09-30 2012-06-27 西南大学 一种基于pcr技术鉴定单拷贝转基因烟草的方法
BR112012007516A2 (pt) 2009-10-02 2015-09-15 Pioneer Hi Bred Int ácido nucléico isolado, plantas , células vegetais, métodos de redução de produção de etileno em uma planta, de aumento de produtividade em uma planta e de aumento de tolerância à aridez, cassete de expressão e semente
US8293718B2 (en) 2009-12-18 2012-10-23 Novartis Ag Organic compositions to treat HSF1-related diseases
MX2012007855A (es) 2010-01-06 2013-06-05 Du Pont Identificacion de ritmos diurnos en tejidos fotosinteticos del zea mays y uso en el mejoramiento de plantas de cultivo.
CN102770767A (zh) 2010-02-10 2012-11-07 诺瓦提斯公司 用于肌肉生长的方法和组合物
CN107090453A (zh) * 2010-05-10 2017-08-25 德克萨斯A&M大学系统 用在植物中表达基因产物的组合物、生物体、体系和方法
CN107974457A (zh) 2010-05-28 2018-05-01 纽海姆有限公司 果实大小增大的植物
US9512188B2 (en) 2010-07-12 2016-12-06 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Isolated polynucleotides and methods and plants using same for regulating plant acidity
EP4050109A1 (en) 2010-08-18 2022-08-31 Fred Hutchinson Cancer Center Agents for use in treating facioscapulohumeral dystrophy (fshd)
US9233997B2 (en) * 2010-08-26 2016-01-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of prolyl hydroxylase domain 2 (PHD2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20120107355A1 (en) 2010-10-27 2012-05-03 Harrisvaccines, Inc. Method of rapidly producing improved vaccines for animals
DK3124610T3 (da) 2010-10-28 2019-06-11 Benitec Biopharma Ltd Hbv-behandling
US9260471B2 (en) 2010-10-29 2016-02-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acids (siNA)
US9585413B2 (en) 2010-11-04 2017-03-07 Arista Cereal Technology Pty Limited Food ingredients produced from high amylose wheat
US20130224116A1 (en) 2010-11-05 2013-08-29 TransBio Ltd. Markers of Endothelial Progenitor Cells and Uses Thereof
AU2012217792A1 (en) 2011-02-14 2013-08-29 Revivicor, Inc. Genetically modified pigs for xenotransplantation of vascularized xenografts and derivatives thereof
CN103842511A (zh) 2011-03-23 2014-06-04 先锋国际良种公司 产生复合转基因性状基因座的方法
US9677084B2 (en) 2011-04-29 2017-06-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Down-regulation of a homeodomain-leucine zipper I-class homeobox gene for improved plant performance
WO2012174139A2 (en) 2011-06-14 2012-12-20 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for making and b ioc ont aining auxotrophic transgenic plants
US9574208B2 (en) 2011-06-21 2017-02-21 Ei Du Pont De Nemours And Company Methods and compositions for producing male sterile plants
US20150159166A1 (en) 2011-10-31 2015-06-11 Pioneer Hi Bred International Inc Plant drought tolerance and nitrogen use efficiency by reducing plant sensitivity to ethylene
EP2773183A4 (en) 2011-11-04 2015-04-15 Arista Cereal Technologies Pty Ltd WHEAT WITH HIGH AMYLOSE CONTENT - II
UA116097C2 (uk) 2011-12-11 2018-02-12 Зе Стейт Оф Ізраел, Міністрі Оф Агрікалче Енд Руерал Девелопмент, Агрікалчерал Рісьоч Організейшн, (А.Р.О.), Волкані Сентре Спосіб модуляції провідності устячка рослини
EP2798065B1 (en) 2011-12-27 2019-06-05 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Simultaneous gene silencing and supressing gene silencing in the same cell
JP6461604B2 (ja) 2011-12-27 2019-01-30 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション 脂質製造のための工程
AU2012327162A1 (en) 2011-12-27 2013-07-11 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of dihydrosterculic acid and derivatives thereof
CN104302768A (zh) 2012-01-09 2015-01-21 诺华股份有限公司 治疗β-联蛋白相关疾病的有机组合物
US20150353949A1 (en) 2012-01-11 2015-12-10 The Australian National University Method for modulating plant root architecture
WO2013138309A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
CN104703998B (zh) 2012-03-13 2020-08-21 先锋国际良种公司 植物中雄性育性的遗传减少
KR102208924B1 (ko) 2012-04-25 2021-01-29 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 고 올레산 오일
CN102719454B (zh) * 2012-06-15 2014-07-30 华南农业大学 一种优化的硫化物醌氧化还原酶基因及其表达载体
WO2014027021A1 (en) 2012-08-16 2014-02-20 Vib Vzw Means and methods for altering the lignin pathway in plants
WO2014045126A2 (en) 2012-09-18 2014-03-27 Uti Limited Partnership Treatment of pain by inhibition of usp5 de-ubiquitinase
AU2014211570A1 (en) 2013-01-29 2015-07-23 The University Court Of The University Of Glasgow Methods and means for increasing stress tolerance and biomass in plants
CN105143470B (zh) 2013-02-28 2020-06-09 德克萨斯大学系统董事会 用于将癌症分类为易感于tmepai定向疗法以及治疗所述癌症的方法
US20160002648A1 (en) 2013-03-11 2016-01-07 Mei Guo Genes for improving nutrient uptake and abiotic stress tolerance in plants
WO2014164074A1 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Enhanced nitrate uptake and nitrate translocation by over-expressing maize functional low-affinity nitrate transporters in transgenic maize
US20160017360A1 (en) 2013-03-13 2016-01-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Functional expression of bacterial major facilitator superfamily mfs gene in maize to improve agronomic traits and grain yield
BR112015023304A2 (pt) 2013-03-14 2017-07-18 Pioneer Hi Bred Int método para melhorar a tolerância ao estresse abiótico de uma planta, planta e semente
US20160017350A1 (en) 2013-03-15 2016-01-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods of use of acc oxidase polynucleotides and polypeptides
AU2014234265B2 (en) 2013-03-21 2020-01-30 Universiteit Gent Means and methods for the reduction of photorespiration in crops
EP2810952A1 (en) 2013-06-03 2014-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel pest control methods
CA2911185C (en) 2013-06-11 2023-09-05 Syngenta Participations Ag Methods for generating transgenic plants
CN105492591B (zh) 2013-06-13 2019-09-13 联邦科学技术研究组织 具有极低水平的大麦醇溶蛋白的大麦
EP3013329B1 (en) 2013-06-25 2020-08-05 The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research Smac mimetics for the treatment of persistent intracellular hbv infection
US10428336B2 (en) 2013-10-16 2019-10-01 The Australian National University Method for modulating plant growth
US10307510B2 (en) 2013-11-04 2019-06-04 Lifecell Corporation Methods of removing alpha-galactose
US10203327B2 (en) 2013-11-05 2019-02-12 Novartis Ag Organic compounds
DK3074038T3 (en) 2013-11-28 2019-03-11 Csl Ltd METHOD OF TREATING DIABETIC NEPHROPATHY
WO2015089338A2 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Glucocorticoid inhibitors for treatment of prostate cancer
KR20160096194A (ko) 2013-12-18 2016-08-12 씨에스엘 리미티드 상처 치료 방법
US20170166920A1 (en) 2014-01-30 2017-06-15 Two Blades Foundation Plants with enhanced resistance to phytophthora
WO2015171723A1 (en) 2014-05-06 2015-11-12 Research Development Foundation Methods for treating insulin resistance and for sensitizing patients to glp1 agonist therapy
WO2015171603A1 (en) 2014-05-06 2015-11-12 Two Blades Foundation Methods for producing plants with enhanced resistance to oomycete pathogens
BR112016030971B1 (pt) 2014-07-07 2022-09-27 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processo para produzir um produto de óleo e processo para produzir um produto de óleo a partir do óleo da planta
EP3166964A1 (en) 2014-07-08 2017-05-17 Vib Vzw Means and methods to increase plant yield
WO2016079527A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Tetralogic Birinapant Uk Ltd Combination therapy
CA2970177C (en) 2014-12-08 2023-09-19 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Lipocationic polymers and uses thereof
WO2016097773A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Children's Cancer Institute Therapeutic iap antagonists for treating proliferative disorders
US10750690B2 (en) 2015-05-29 2020-08-25 Arcadia Biosciences, Inc. Reduced gluten grains and compositions thereof
US10000766B2 (en) * 2015-07-17 2018-06-19 National Chung Hsing University Recombinant construct, recombinant microorganism, recombinant plant cell and method of providing plant with resistance against DNA virus and RNA virus
EP3344774A1 (en) 2015-09-04 2018-07-11 Keygene N.V. Diplospory gene
CN108271360B (zh) 2015-09-14 2023-01-24 得克萨斯州大学系统董事会 亲脂阳离子树枝状聚合物及其用途
WO2017062790A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Two Blades Foundation Cold shock protein receptors and methods of use
SG11201804169QA (en) 2015-11-18 2018-06-28 Commw Scient Ind Res Org Rice grain with thickened aleurone
EP3375445A4 (en) 2015-11-30 2019-08-07 Xie, Yanhui USE OF AKT2 IN THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF A TUMOR
MX2018011298A (es) 2016-03-18 2019-03-07 Pioneer Hi Bred Int Metodos y composiciones para producir gametos clonados, sin reducir, sin recombinar.
WO2017162265A1 (en) * 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Trans-replicating rna
AU2017267634C1 (en) 2016-05-16 2022-05-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Cationic sulfonamide amino lipids and amphiphilic zwitterionic amino lipids
EP3500279A4 (en) * 2016-08-19 2020-04-22 Calimmune, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANINE CONDITIONS USING A RECOMBINANT SELF-COMPLEMENTARY ADENO-ASSOCIATED VIRUS.
CA3073137A1 (en) 2016-08-19 2018-02-22 Jeffrey S. Bartlett Methods and compositions for treating conditions using recombinant self-complementary adeno-associated virus
CN107841510B (zh) * 2016-09-20 2021-02-09 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种原核细胞转录后水平控制不同基因表达比例的方法
MX2019006614A (es) 2016-12-07 2019-10-15 Univ Florida Adnc del antagonista del receptor de interleucina-1.
CA3133899A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 University Of Geneva Micro rna expression constructs and uses thereof
JP2022512706A (ja) 2018-10-16 2022-02-07 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 眼科におけるＡｋｔ阻害剤の使用
US20220091137A1 (en) 2019-01-17 2022-03-24 Hoffmann-La Roche Inc. E3 ubiquitin ligase (ube3a) protein targets
EP3920889A4 (en) 2019-02-08 2022-12-07 Board of Regents, The University of Texas System TELOMERASE-CONTAINING EXOSOMES FOR THE TREATMENT OF DISEASES RELATED TO AGE-RELATED ORGANDYS FUNCTION
WO2021019536A1 (en) 2019-07-30 2021-02-04 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Methods of controlling cannabinoid synthesis in plants or cells and plants and cells produced thereby
EP3825408A1 (en) 2019-11-19 2021-05-26 FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Methods of multi-species insect pest control
JP2023522103A (ja) 2020-04-20 2023-05-26 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 生物学的に活性な乾燥粉末組成物ならびにその製造および使用の方法
EP4157864A1 (en) 2020-05-27 2023-04-05 Antion Biosciences SA Adapter molecules to re-direct car t cells to an antigen of interest
US20230266325A1 (en) 2020-06-30 2023-08-24 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting lung cancer
EP4284513A1 (en) 2021-01-26 2023-12-06 Universite Brest Bretagne Occidentale Novel stim1 splicing variants and uses thereof
AU2022324708A1 (en) 2021-08-06 2024-02-15 Kws Vegetables B.V. Durable downy mildew resistance in spinach
WO2023020980A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 F. Hoffmann-La Roche Ag E3 ubiquitin ligase (ube3a) protein targets
GB202206507D0 (en) 2022-05-04 2022-06-15 Antion Biosciences Sa Expression construct
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
WO2024028794A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Temple Therapeutics BV Methods for treating endometrial and ovarian hyperproliferative disorders

Family Cites Families (229)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US266005A (en) * 1882-10-17 William allen
US27783A (en) * 1860-04-10 Improvement in apparatus for evaporating sugar-juices
US74684A (en) * 1868-02-18 of wallingford
US56235A (en) * 1866-07-10 Improvement in paring-knives
US114784A (en) * 1871-05-16 Improvement in compounds for cure of chills and fever
US36197A (en) * 1862-08-12 Improvement in compound bullets for small-arms
US86356A (en) * 1869-02-02 Improvement in the construction of fire-proof safes
US165894A (en) * 1875-07-20 Improvement in vessels for removing foul water from docks
US3931397A (en) 1971-11-05 1976-01-06 Beecham Group Limited Biologically active material
US4024222A (en) 1973-10-30 1977-05-17 The Johns Hopkins University Nucleic acid complexes
US4034323A (en) * 1975-03-24 1977-07-05 Oki Electric Industry Company, Ltd. Magnetic relay
US4283393A (en) 1979-03-13 1981-08-11 Merck & Co., Inc. Topical application of interferon inducers
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4605394A (en) 1982-12-03 1986-08-12 Simon V. Skurkovich Methods for the treatment of pathological conditions by removing interferon from the organism
DE3208247A1 (de) 1982-03-08 1983-09-22 Philips Patentverwaltung Gmbh, 2000 Hamburg Cuvette fuer die atom-absorptions-spektrometrie
JPS5936698A (ja) 1982-08-20 1984-02-28 Science & Tech Agency Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞
NZ209840A (en) 1983-10-17 1988-11-29 Kaji Akira A method of inhibiting viral propagation by hybridising dna with the viral rna thus blocking its action
US5272065A (en) * 1983-10-20 1993-12-21 Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US5190931A (en) 1983-10-20 1993-03-02 The Research Foundation Of State University Of New York Regulation of gene expression by employing translational inhibition of MRNA utilizing interfering complementary MRNA
US5208149A (en) 1983-10-20 1993-05-04 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acid constructs containing stable stem and loop structures
ATE198350T1 (de) 1983-10-20 2001-01-15 Univ New York State Res Found Regulierung der genexpression durch translationshemmung unter verwendung einer m-rns behindernden komplementären rns
US5173410A (en) 1984-02-15 1992-12-22 Lubrizol Genetics Inc. Transfer vector
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4766072A (en) 1985-07-17 1988-08-23 Promega Corporation Vectors for in vitro production of RNA copies of either strand of a cloned DNA sequence
GB8521646D0 (en) 1985-08-30 1985-10-02 English Clays Lovering Pochin Inorganic fillers
CA1326450C (en) 1985-08-26 1994-01-25 William A. Carter Modulation of aids virus-related events by double stranded rnas (dsrnas)
US6617496B1 (en) 1985-10-16 2003-09-09 Monsanto Company Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs
GB8601680D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Agricultural Genetics Co Modification of plant viruses
NZ219472A (en) 1986-03-28 1990-08-28 Calgene Inc Regulation of phenotype in plant cells using dsdna constructs
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
US5017488A (en) 1986-04-01 1991-05-21 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Highly efficient dual T7/T3 promoter vector PJKF16 and dual SP6/T3 promoter vector PJFK15
DE3850683T2 (de) * 1987-02-09 1994-10-27 Lubrizol Genetics Inc Hybrides RNS-Virus.
PH24467A (en) 1987-03-03 1990-07-18 Hem Res Inc Synergistics interplay of lymphokines and dsrnas
US4950652A (en) 1987-03-23 1990-08-21 Hem Research, Inc. dsRNAs for combination therapy in the treatment of viral diseases
AU1820588A (en) 1987-07-17 1989-01-19 Hem Research, Inc. Double-stranded rna correction of abnormalities in circulating immune complexes and monocyte function
IE72103B1 (en) 1987-08-12 1997-03-12 Hem Res Inc Promotion of host defense by systemic dsRNA treatment
IE66830B1 (en) 1987-08-12 1996-02-07 Hem Res Inc Topically active compositions of double-stranded RNAs
ATE122402T1 (de) 1987-09-04 1995-05-15 Hem Pharma Corp Diagnose von mangelzuständen doppelsträngiger rns.
US5874555A (en) 1987-10-30 1999-02-23 California Institute Of Technology Triple helices and processes for making same
US4963532A (en) 1987-11-25 1990-10-16 Hem Research, Inc. dsRNA-based prevention of viral escape
EP0640688A1 (en) 1987-12-15 1995-03-01 Gene Shears Pty. Limited Ribozymes
US5254678A (en) 1987-12-15 1993-10-19 Gene Shears Pty. Limited Ribozymes
PH25365A (en) 1987-12-23 1991-05-13 Hem Research Rhase l inhibitor as a marker for virus infections
US5922602A (en) 1988-02-26 1999-07-13 Biosource Technologies, Inc. Cytoplasmic inhibition of gene expression
GB8810120D0 (en) 1988-04-28 1988-06-02 Plant Genetic Systems Nv Transgenic nuclear male sterile plants
CA1320446C (en) 1988-06-20 1993-07-20 William A. Carter Modulation of lymphokine-resistant cellular states by dsrnas
EP0350151B1 (en) 1988-07-07 1994-03-30 Hem Pharmaceuticals Corp. Diagnosing and treating chronic fatigue syndrome
US5597718A (en) 1988-10-04 1997-01-28 Agracetus Genetically engineering cotton plants for altered fiber
US5198346A (en) * 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5405775A (en) 1989-02-24 1995-04-11 The University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Retrons coding for hybrid DNA/RNA molecules
US5436141A (en) 1989-02-24 1995-07-25 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Method for synthesizing stable single-stranded CDNA in eukaryotes by means of a bacterial retron and products
US5780269A (en) 1989-02-24 1998-07-14 The University Of Medicine And Denistry Of New Jersey Hybrid molecules
US5434070A (en) 1989-02-24 1995-07-18 The University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Reverse transcriptases from Escherichia coli and Myxococcus xanthus
ES2090049T3 (es) 1989-03-16 1996-10-16 Boehringer Ingelheim Int Unidades geneticas para la inhibicion de la funcion de arn.
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
AU5421090A (en) 1989-04-05 1990-11-05 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The A clone of double-stranded rna virus and applications thereof
WO1990012488A2 (en) 1989-04-05 1990-11-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce A clone of double-stranded rna virus applied to antibody production, study of retrovirus-like frameshifting and production of proteins in yeast
EP0473576A4 (en) 1989-05-19 1993-03-10 Hem Research, Inc. Short therapeutic dsrna of defined structure
US5122466A (en) 1989-06-13 1992-06-16 North Carolina State University Ballistic transformation of conifers
GB8916213D0 (en) 1989-07-14 1989-08-31 Ici Plc Dna constructs,cells and plants derived therefrom
DE69034268D1 (de) 1989-08-10 2011-03-03 Bayer Bioscience Nv Pflanzen mit modifizierten Blüten
US5747308A (en) 1989-10-25 1998-05-05 Celltech Therapeutics Limited Recombinant DNA method
US5939600A (en) 1989-11-03 1999-08-17 Goldbach; Robert Willem Nucleic acids encoding tospovirus genome and expression thereof
HUT57265A (en) * 1989-11-03 1991-11-28 Zaadunie Bv Process for producing plants of diminished infection-sensitivity
US5457189A (en) 1989-12-04 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus
US5578718A (en) * 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
WO1991010453A1 (en) * 1990-01-18 1991-07-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce Vector with multiple target response elements affecting gene expression
US6245560B1 (en) * 1990-01-18 2001-06-12 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vector with multiple target response elements affecting gene expression
US5168064A (en) 1990-04-20 1992-12-01 The Regents Of The University Of California Endo-1,4-β-glucanase gene and its use in plants
GB9009307D0 (en) 1990-04-25 1990-06-20 Ici Plc Dna,constructs,cells and plant derived therefrom
WO1991018088A1 (en) 1990-05-23 1991-11-28 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
AU8059891A (en) 1990-06-13 1992-01-07 Trustees Of Princeton University, The A (lac) repressor-hsv vp16 chimeric transcriptional activator protein system functioning in transfected mammalian cells
HUT69956A (en) 1990-08-14 1995-09-28 Isis Pharmaceuticals Inc Methode for inhibition of influenza virus by antiseuse oligonucleotides
DE4027616A1 (de) * 1990-08-31 1992-03-05 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung von polymerase-aktivitaet
MX9100993A (es) 1990-09-10 1992-05-04 Us Agriculture Secuencia de adn aislado y enzima acido 1-aminociclopropan-1-carboxilico sintasa,recombinante
US5306862A (en) 1990-10-12 1994-04-26 Amoco Corporation Method and composition for increasing sterol accumulation in higher plants
SE9004095L (sv) 1990-12-21 1992-06-01 Amylogene Hb Genetisk foeraendring av potatis foer bildning av staerkelse av amylostyp
SE467358B (sv) 1990-12-21 1992-07-06 Amylogene Hb Genteknisk foeraendring av potatis foer bildning av staerkelse av amylopektintyp
CA2100251A1 (en) 1991-01-25 1992-07-26 Robert L. Lechner Regulation of nucleic acid translation
GB9105383D0 (en) 1991-03-14 1991-05-01 Immunology Ltd An immunotherapeutic for cervical cancer
GB9106713D0 (en) 1991-03-28 1991-05-15 Ici Plc Dna,dna constructs,cells and plants derived therefrom
CZ214593A3 (en) 1991-04-16 1994-07-13 Mogen Int Plants exhibiting male sterility, process of obtaining thereof and recombinant dna for application of such process
EP0580754A1 (en) 1991-04-18 1994-02-02 The Salk Institute For Biological Studies Oligodeoxynucleotides and oligonucleotides useful as decoys for proteins which selectively bind to defined dna sequences
FR2675803B1 (fr) 1991-04-25 1996-09-06 Genset Sa Oligonucleotides fermes, antisens et sens et leurs applications.
GB9109063D0 (en) 1991-04-26 1991-06-12 Ici Plc Modification of lignin synthesis in plants
CA2110169A1 (en) 1991-05-30 1992-12-10 Walter Van Der Eycken Nematode-responsive plant promoters
AU2273392A (en) 1991-07-11 1993-02-11 International Flower Developments Pty Ltd Genetic sequences encoding flavonoid pathway enzymes and uses therefor
US6010908A (en) 1992-08-21 2000-01-04 The Regents Of The University Of California Gene therapy by small fragment homologous replacement
CA2073630C (en) 1991-08-30 2007-12-11 Atsushi Ohshima Method for synthesizing single-stranded stem-loop dnas, the products and uses therefor
US5714323A (en) 1991-08-30 1998-02-03 The University Of Medecine And Dentistry Of New Jersey Over expression of single-stranded molecules
RU2143000C1 (ru) 1991-11-20 1999-12-20 Моген Интернэшнл Н.В. Способ получения растения с пониженной восприимчивостью к растительным паразитическим нематодам (варианты), рекомбинантная днк (варианты), трансформирующий растение вектор, штамм agrobacterium и способ снижения ущерба урожаю
FR2685346B1 (fr) 1991-12-18 1994-02-11 Cis Bio International Procede de preparation d'arn double-brin, et ses applications.
JPH08500003A (ja) 1992-02-19 1996-01-09 オレゴン州 翻訳不能なプラスセンスウイルスｒｎａの導入による耐ウイルス性植物の生産
DE4208107A1 (de) 1992-03-13 1993-09-16 Bayer Ag Pseudorabies-virus (prv)-polynukleotide und ihre verwendung zur herstellung von virusresistenten eukaryotischen zellen
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
US5496698A (en) 1992-08-26 1996-03-05 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method of isolating ribozyme targets
GB9210273D0 (en) 1992-05-13 1992-07-01 Ici Plc Dna
US5693535A (en) 1992-05-14 1997-12-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. HIV targeted ribozymes
US6451603B1 (en) 1992-06-29 2002-09-17 Gene Shears Pty. Limited Ribozyme nucleic acids and methods of use thereof for controlling viral pathogens
NZ255028A (en) 1992-07-02 1997-03-24 Hybridon Inc Antisense oligonucleotides resistant to nucleolytic degradation
EP0606454A1 (en) 1992-07-30 1994-07-20 Keygene N.V. Dna constructs, cells and plants derived therefrom
CA2106260A1 (en) 1992-09-17 1994-03-18 Robert M. Kotin Human adeno-associated virus integration site dna and uses thereof
WO1994007367A1 (en) 1992-09-29 1994-04-14 Apollon, Inc. Anti-viral oligomers that bind polypurine tracts of single-stranded rna or rna-dna hybrids
EP0665891A1 (en) 1992-10-15 1995-08-09 Mogen International N.V. Genetic moderation or restoration of plant phenotypes
US6872872B1 (en) 1992-11-17 2005-03-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
US6372965B1 (en) 1992-11-17 2002-04-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants
ZA939767B (en) 1993-01-21 1994-09-14 Univ North Carolina State Nematode-resistant transgenic plants
US6069298A (en) 1993-02-05 2000-05-30 Regents Of The University Of Minnesota Methods and an acetyl CoA carboxylase gene for conferring herbicide tolerance and an alteration in oil content of plants
CA2150133A1 (en) 1993-02-05 1994-08-18 Vincent Jean-Marie Armel Arondel Altered linolenic and linoleic acid content in plants
EP0620281A3 (en) 1993-03-31 1995-05-03 Mitsubishi Corp Oilseed plants producing valuable seeds with modified amino acid and fatty acid compositions.
WO1994029465A1 (en) 1993-06-08 1994-12-22 Nunhems Zaden B.V. Process for generating male sterile plants
US5739309A (en) 1993-07-19 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enhancement of oligonucleotide inhibition of protein production, cell proliferation and / or multiplication of infectious disease pathogens
WO1995003406A2 (en) 1993-07-19 1995-02-02 Gen-Probe Incorporated Enhancement of oligonucleotide inhibition of protein production, cell proliferation, and/or multiplication of infectious disease pathogens
US5808036A (en) 1993-09-01 1998-09-15 Research Corporation Technologies Inc. Stem-loop oligonucleotides containing parallel and antiparallel binding domains
CA2105364A1 (en) 1993-09-01 1995-03-02 Eric T. Kool Stem-loop oligonucleotides containing parallel and antiparallel binding domains
US6146826A (en) 1993-09-10 2000-11-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Green fluorescent protein
GB9318927D0 (en) 1993-09-13 1993-10-27 Zeneca Ltd Regulation of senescence
PT1584682E (pt) 1993-09-20 2009-08-03 Univ Pennsylvania Regulação da expressão do gene bcl-2
US5858981A (en) 1993-09-30 1999-01-12 University Of Pennsylvania Method of inhibiting phagocytosis
GB9320548D0 (en) 1993-10-06 1993-11-24 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5624803A (en) 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5908779A (en) 1993-12-01 1999-06-01 University Of Connecticut Targeted RNA degradation using nuclear antisense RNA
US5578716A (en) 1993-12-01 1996-11-26 Mcgill University DNA methyltransferase antisense oligonucleotides
FR2714383B1 (fr) 1993-12-29 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Contrôle de l'expression de gènes.
CA2180358A1 (en) 1994-01-05 1995-07-13 Geoffrey P. Symonds Ribozymes targeting the retroviral packaging sequence expression constructs and recombinant retroviruses containing such constructs
US5849991A (en) * 1994-01-27 1998-12-15 Bresatch Limited Mice homozygous for an inactivated α 1,3-galactosyl transferase gene
CA2183992A1 (en) 1994-02-23 1995-08-31 Dan T. Stinchcomb Method and reagent for inhibiting the expression of disease related genes
US5686649A (en) 1994-03-22 1997-11-11 The Rockefeller University Suppression of plant gene expression using processing-defective RNA constructs
US5631148A (en) * 1994-04-22 1997-05-20 Chiron Corporation Ribozymes with product ejection by strand displacement
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US6146886A (en) 1994-08-19 2000-11-14 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA polymerase III-based expression of therapeutic RNAs
WO1996008558A1 (en) 1994-09-12 1996-03-21 City Of Hope Modulation of drug radiation resistant genes
US5576716A (en) * 1994-12-07 1996-11-19 Sadler; Kermit M. Owner oriented system for locating lost or stolen property
WO1996035706A1 (en) 1995-05-11 1996-11-14 Hybridon, Inc. Pyrimidine targeting hairpin triplex-forming oligonucleotides
US5691140A (en) 1995-05-18 1997-11-25 New England Biolabs, Inc. Bidirectional in vitro transcription vectors utilizing a single RNA polymerase for both directions
US5693773A (en) 1995-06-07 1997-12-02 Hybridon Incorporated Triplex-forming antisense oligonucleotides having abasic linkers targeting nucleic acids comprising mixed sequences of purines and pyrimidines
CA2226088A1 (en) 1995-06-30 1997-01-23 Dna Plant Technology Corporation Delayed ripening tomato plants
FR2737501B1 (fr) 1995-07-31 1997-10-24 Transgene Sa Nouveaux virus auxiliaires pour la preparation de vecteurs viraux recombinants
WO1997010360A1 (en) 1995-09-13 1997-03-20 Chiron Corporation Method and construct for screening for inhibitors of transcriptional activation
CA2239976A1 (en) 1995-09-20 1997-03-27 Paul A. Zamecnik Antisense oligonucleotide chemotherapy for benign hyperplasia or cancer of the prostate
AU718082B2 (en) 1995-10-06 2000-04-06 Plant Genetic Systems N.V. Seed shattering
JPH09110894A (ja) 1995-10-17 1997-04-28 Soyaku Gijutsu Kenkyusho:Kk ハイブリッドｄｎａ／ｒｎａオリゴヌクレオチド及び抗ウイルス剤
EP0771878A1 (en) 1995-10-31 1997-05-07 Plant Genetic Systems N.V. Plants with reduced glucosinolate content
US5773692A (en) 1995-12-12 1998-06-30 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By Agriculture And Agri-Food Canada Anti-sense RNA for CAB transcript to reduce chlorophyll content in plants
CA2279675A1 (en) 1995-12-15 1997-06-16 Enzo Therapeutics, Inc. Property effecting and/or property exhibiting constructs for localizing a nucleic acid construct within a cell for therapeutic and diagnostic uses
IT1283876B1 (it) 1996-01-12 1998-05-07 Univ Roma Molecole chimeriche ribozima-snrna ad attivita' catalitica per rna a localizzazione nucleare
EP0880598A4 (en) 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US5891855A (en) 1996-02-12 1999-04-06 The Scripps Research Institute Inhibitors of leaderless protein export
JP3847366B2 (ja) 1996-02-22 2006-11-22 アンジェスＭｇ株式会社 アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた固定性分裂終了細胞増殖剤
US5989864A (en) * 1996-10-29 1999-11-23 Smithkline Beecham Corporation DNA encoding spo-rel polypeptides
AU2089197A (en) 1996-03-13 1997-10-01 National Research Council Of Canada Process of raising squalene levels in plants and dna sequences used therefor
DE69727558T2 (de) 1996-03-15 2004-12-16 Munin Corporation, Chicago Humanes CYR61, ein Signalmolekül der extrazellularen Matrix
US6022863A (en) 1996-05-21 2000-02-08 Yale University Regulation of gene expression
DK0907735T5 (da) 1996-05-24 2010-06-14 Biogen Idec Inc Modulatorer af vævsregenerering
JP2000513217A (ja) 1996-06-21 2000-10-10 プラント・ジェネティック・システムズ・エヌ・ブイ 植物内での遺伝子発現
US5994526A (en) 1996-06-21 1999-11-30 Plant Genetic Systems Gene expression in plants
US5952546A (en) 1996-06-27 1999-09-14 Dna Plant Technology Corporation Delayed ripening tomato plants with T-DNA bearing a truncated ACC2 synthase gene
US5850026A (en) 1996-07-03 1998-12-15 Cargill, Incorporated Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content
AU727447B2 (en) 1996-07-03 2000-12-14 University Of Pittsburgh Emulsion formulations for hydrophilic active agents
NZ333802A (en) 1996-08-02 2001-09-28 Genesense Technologies Inc Antitumor antisense sequences directed against R1 and R2 components of ribonucleotide reductase
DE19631919C2 (de) 1996-08-07 1998-07-16 Deutsches Krebsforsch Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
US5747338A (en) 1996-08-15 1998-05-05 Chiron Corporation Method and construct for screening for inhibitors of transcriptional activation
US6225290B1 (en) 1996-09-19 2001-05-01 The Regents Of The University Of California Systemic gene therapy by intestinal cell transformation
US5814500A (en) 1996-10-31 1998-09-29 The Johns Hopkins University School Of Medicine Delivery construct for antisense nucleic acids and methods of use
GB9703146D0 (en) 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
WO1998037213A1 (en) 1997-02-21 1998-08-27 Danisco A/S Antisense intron inhibition of starch branching enzyme expression
CN1226930A (zh) * 1997-03-10 1999-08-25 日本烟草产业株式会社 反义核苷酸序列
GB9706381D0 (en) 1997-03-27 1997-05-14 Cambridge Advanced Tech Improvements relating to the specificity of gene expression
US7589253B2 (en) 1997-04-15 2009-09-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Fatty acid epoxygenase genes from plants and uses therefor in modifying fatty acid metabolism
US5942395A (en) 1997-05-09 1999-08-24 Universite De Montreal Hybrid ribozymes and methods of use
GB9710475D0 (en) * 1997-05-21 1997-07-16 Zeneca Ltd Gene silencing
WO1999009045A1 (en) * 1997-08-20 1999-02-25 Somagenics, Inc. Antisense and antigene therapeutics with improved binding properties and methods for their use
GB9720148D0 (en) 1997-09-22 1997-11-26 Innes John Centre Innov Ltd Gene silencing materials and methods
EP1032692A1 (en) 1997-11-18 2000-09-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Targeted manipulation of herbicide-resistance genes in plants
DE19754622A1 (de) 1997-12-09 1999-06-10 Antje Von Dr Schaewen Pflanzliche GntI-Sequenzen und Verwendung derselben zur Gewinnung von Pflanzen mit verminderter oder fehlender N-Acetylglucosaminyltransferase I (GnTI)-Aktivität
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
KR101085210B1 (ko) 1998-03-20 2011-11-21 커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 유전자 발현 조절방법
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
JP5015373B2 (ja) 1998-04-08 2012-08-29 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション 改良表現型を得るための方法及び手段
US8598332B1 (en) 1998-04-08 2013-12-03 Bayer Cropscience N.V. Methods and means for obtaining modified phenotypes
US20040214330A1 (en) 1999-04-07 2004-10-28 Waterhouse Peter Michael Methods and means for obtaining modified phenotypes
EP0959133A1 (en) 1998-05-22 1999-11-24 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek (Cpro-Dlo) A process for inhibiting expression of genes
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
US6040908A (en) * 1998-07-28 2000-03-21 Litton Systems, Inc. Method for stress tuning fiber optic sensor coils
AU776150B2 (en) 1999-01-28 2004-08-26 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for (in vivo) and (in vitro) attenuation of gene expression using double stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
WO2000063397A2 (en) 1999-04-20 2000-10-26 Aventis Cropscience N.V. Methods for delivering inhibitory rna to plants and applications thereof
WO2000063364A2 (en) 1999-04-21 2000-10-26 American Home Products Corporation Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US20040138168A1 (en) 1999-04-21 2004-07-15 Wyeth Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
CA2373628A1 (en) 1999-06-14 2000-12-21 Michael A. Costa Animal models and methods for analysis of lipid metabolism and screening of pharmaceutical and pesticidal agents that modulate lipid metabolism
MXPA01013462A (es) 1999-07-09 2002-07-02 Wyeth Corp Metodos y composiciones para prevenir la formacion de arn aberrante durante la transcripcion de una secuencia plasmidica.
US6423885B1 (en) * 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
WO2001019857A2 (en) 1999-09-16 2001-03-22 Genoptera, Llc Facilitative transporter (ft1 and ft2) from drosophila melanogaster and uses thereof
AU1086501A (en) 1999-10-15 2001-04-30 Carnegie Institution Of Washington Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
US6291504B1 (en) 1999-10-20 2001-09-18 Dupont Pharmaceuticals Company Acylsemicarbazides and their uses
GB9925459D0 (en) 1999-10-27 1999-12-29 Plant Bioscience Ltd Gene silencing
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
WO2001037654A2 (en) 1999-11-24 2001-05-31 Dna Plant Technology Corporation METHOD OF EXPRESSING dsRNA IN PLANTS TO INHIBIT INSECT PESTS
WO2001038359A2 (en) 1999-11-29 2001-05-31 Genoptera, Llc Drosophila nicotinic acetylcholine receptor
GB9930691D0 (en) 1999-12-24 2000-02-16 Devgen Nv Improvements relating to double-stranded RNA inhibition
AU2001240375A1 (en) 2000-03-17 2001-10-03 Benitec Australia Limited Genetic silencing
CA2404890C (en) 2000-03-30 2013-11-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference
GB2362383B (en) 2000-05-19 2003-12-31 Devgen Nv Gene expression system
US6995258B1 (en) 2000-05-25 2006-02-07 City Of Hope Nucleolar targeting of therapeutics against HIV
JP2004512020A (ja) 2000-06-23 2004-04-22 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 組換え構築物ならびにこれを遺伝子発現を減少させる際に用いる方法
US7109393B2 (en) 2000-08-15 2006-09-19 Mendel Biotechnology, Inc. Methods of gene silencing using inverted repeat sequences
BRPI0115814B8 (pt) 2000-12-01 2021-05-25 Europaeisches Laboratorium Fuer Molekularbiologie Embl moléculas de rna de filamento duplo, seu método de preparação e composição farmacêutica compreendendo as mesmas
US20020150968A1 (en) * 2001-01-10 2002-10-17 Wang Peng G. Glycoconjugate and sugar nucleotide synthesis using solid supports
EP1229134A3 (en) 2001-01-31 2004-01-28 Nucleonics, Inc Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
BR0211111A (pt) 2001-07-12 2004-06-22 Univ Massachusetts Molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, transgene, precursor de rna engenheirado, animal transgênico não humano, e, método de induzir a interferência de ácido ribonucleico de um gene alvo em uma célula
WO2003023015A2 (en) 2001-09-13 2003-03-20 California Institute Of Technology Method for expression of small antiviral rna molecules within a cell
WO2003027298A1 (en) 2001-09-27 2003-04-03 Timothy Albert Holton Stem-loop vector system
US20030148519A1 (en) 2001-11-14 2003-08-07 Engelke David R. Intracellular expression and delivery of siRNAs in mammalian cells
GB0130955D0 (en) 2001-12-24 2002-02-13 Cancer Res Ventures Expression system
US20040022748A1 (en) 2002-03-12 2004-02-05 Unilever Home & Personal Care Usa, Division Of Conopco, Inc. Method of enhancing skin lightening
BR0308424A (pt) 2002-03-14 2005-02-22 Commw Scient Ind Res Org Métodos e meios para infra-regular eficientemente a expressão de qualquer gene de interesse em células e organismos eucarióticos
ITRM20020253A1 (it) 2002-05-08 2003-11-10 Univ Roma Molecole chimeriche di snrna con sequenze antisenso per le giunzioni di splicing del gene della distrofina e applicazioni terapeutiche.
US20040106566A1 (en) 2002-05-17 2004-06-03 Shi-Lung Lin RNA-splicing and processing-directed gene silencing and the relative applications thereof
AU2003297474A1 (en) 2002-12-18 2004-07-14 Salk Institute For Biological Studies Methods of inhibiting gene expression by rna interference
CN1750752A (zh) 2003-02-19 2006-03-22 联邦科学和工业研究组织 使用短dsRNA序列在植物中进行有效的基因沉默
CA2568603A1 (en) 2003-09-12 2005-03-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Modified gene-silencing nucleic acid molecules and uses thereof
WO2007128052A1 (en) 2006-05-03 2007-11-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved gene silencing methods
WO2009109937A1 (en) * 2008-03-05 2009-09-11 Nxp B.V. Dynamic mbsfn area configuration method in consideration of radio resource efficiency and system thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP1071762A4 (en) 2003-09-24
AU2008249157B2 (en) 2011-03-03
US20040237145A1 (en) 2004-11-25
KR101085210B1 (ko) 2011-11-21
KR20100039457A (ko) 2010-04-15
JP2005323615A (ja) 2005-11-24
SK287538B6 (sk) 2011-01-04
NZ547283A (en) 2008-06-30
CN101818145A (zh) 2010-09-01
AU743316C (en) 2005-09-15
KR20010042069A (ko) 2001-05-25
DK1624060T3 (da) 2012-04-10
JP2002507416A (ja) 2002-03-12
ATE526405T1 (de) 2011-10-15
EP1857549A3 (en) 2007-12-05
AU3564702A (en) 2002-06-13
ZA200004507B (en) 2001-12-24
BRPI9908967B1 (pt) 2017-05-30
CA2323726A1 (en) 1999-09-30
CZ20003346A3 (cs) 2001-03-14
HK1035742A1 (en) 2001-12-07
US20060014715A1 (en) 2006-01-19
JP2008073055A (ja) 2008-04-03
AU2008249157A1 (en) 2008-12-11
EP1624060B1 (en) 2011-09-28
JP4187737B2 (ja) 2008-11-26
US9963698B2 (en) 2018-05-08
GB2353282B (en) 2003-06-04
SG115493A1 (en) 2005-10-28
HUP0101225A1 (hu) 2001-08-28
AU2005209648B2 (en) 2008-08-21
US20030074684A1 (en) 2003-04-17
NZ506648A (en) 2003-08-29
EP1857549B1 (en) 2018-10-17
EP1624060A3 (en) 2006-04-26
EP1555317A1 (en) 2005-07-20
JP4460600B2 (ja) 2010-05-12
US20040064842A1 (en) 2004-04-01
GB2353282A (en) 2001-02-21
GB2353282A8 (en) 2008-06-23
AU2005209648A1 (en) 2005-10-06
AU2916399A (en) 1999-10-18
CN1294631A (zh) 2001-05-09
CA2513336A1 (en) 1999-09-30
HU230353B1 (hu) 2016-02-29
AU743316B2 (en) 2002-01-24
HUP0101225A3 (en) 2004-08-30
JP2009219504A (ja) 2009-10-01
EP1555317B1 (en) 2011-09-28
EP2302057B1 (en) 2019-02-20
EP1624060A2 (en) 2006-02-08
AU2005202658A1 (en) 2005-07-14
JP4981103B2 (ja) 2012-07-18
US20140193856A1 (en) 2014-07-10
JP4187413B2 (ja) 2008-11-26
KR20060030526A (ko) 2006-04-10
GB0024727D0 (en) 2000-11-22
KR101054060B1 (ko) 2011-08-04
US7754697B2 (en) 2010-07-13
AU2005211538B2 (en) 2008-07-24
SG141233A1 (en) 2008-04-28
US8168774B2 (en) 2012-05-01
EP1071762A1 (en) 2001-01-31
WO1999049029A1 (en) 1999-09-30
ES2374534T3 (es) 2012-02-17
BR9908967A (pt) 2000-12-19
SK13722000A3 (sk) 2001-05-10
AU2005211538A1 (en) 2005-10-13
CN1796556A (zh) 2006-07-05
ATE526406T1 (de) 2011-10-15
CA2487328A1 (en) 1999-09-30
PL343064A1 (en) 2001-07-30
GB2353282C (en) 2013-02-27
AU2005211538C1 (en) 2014-02-13
EP2302057A1 (en) 2011-03-30
AU2005202658B2 (en) 2008-08-21
CA2323726C (en) 2005-02-08
EP1857549A2 (en) 2007-11-21
ES2374290T3 (es) 2012-02-15
US20120277285A1 (en) 2012-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ295108B6 (cs) Syntetický gen obsahující dispergovanou nebo cizorodou deoxyribonukleovou molekulu a genový konstrukt obsahující tento syntetický gen
MXPA00008631A (en) Control of gene expression

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20170319