CN1750752A - 使用短dsRNA序列在植物中进行有效的基因沉默 - Google Patents

使用短dsRNA序列在植物中进行有效的基因沉默 Download PDF

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Abstract

提供了当使用具有长度短于大约200个碱基对的茎区的dsRNA序列时增加基因沉默功效的方法和手段，具体方法为提供编码这类dsRNA序列的嵌合基因，所述嵌合基因具有由DNA依赖性RNA聚合酶III识别的启动子，所述启动子包含与DNA依赖性RNA聚合酶III相互作用的所有顺式作用启动子元件。

Description

使用短dsRNA序列在植物中进行有效的基因沉默
发明领域
本发明总体上涉及植物遗传改造领域，更特别地使用短双链(dsRNA)序列有意识地沉默植物细胞和植物中一个或更多个基因的表达。当使用具有茎区长度短于大约200碱基对的dsRNA序列时提供了增加基因沉默有效性的方法和手段。
背景
通过靶基因特异性的dsRNA触发的转录后沉默植物和动物中基因表达的机制近年来已成为许多研究的主题，通过转录编码dsRNA的嵌合基因外源地或内源地提供所述靶基因特异性的dsRNA。自首次在动物和植物中描述该现象以来(Fire等人，1998；Hamilton等人，1998；Waterhouse等人，1998)，已逐渐清楚dsRNA通过具有对dsRNA(例如果蝇中的DICER)优先的RNA酶将dsRNA加工成短的、接近21个核苷酸长度的RNA，所述加工的短dsRNA用作向导序列，向能够降解特异性mRNA分子的复合物提供序列特异性。
高度特异和有效的基因沉默，由与要沉默的基因同源的dsRNA所启动，很快地将这种方法学转为变成产生真核生物体的优选工具，在所述真核生物体中一个或更多个特异性转录核酸序列的表达被降低或失活。为了产生具有优选表型的真核生物体可采取降低或失活这类目的基因的表达(参见例如WO 02/029028，其中使用dsRNA技术产生了发育萼片而不发育花瓣的芸苔属(Brassica)植物)。转录序列表达的降低或失活也在试图确定通过基因组测序项目已获的大量核酸序列功能的实验研究中起着重要作用。
尤其对于后者，使用短dsRNA序列可能会有利，因为可以很方便地在体外产生这类寡聚核苷酸。在高等动物中，考虑到更大的dsRNA分子似乎会触发干扰素应答(Elbashir等人，2000)，因而优选地使用短dsRNA分子。
直到目前，在真核生物体细胞内抑制性RNA(此处用于描述反义RNA、有义RNA和dsRNA)的产生大多数是通过识别共同Pol II类型启动子的DNA依赖性RNA聚合酶II(Pol II)的作用产生的。
在植物中通过RNA聚合酶III产生反义RNA已有描述。
Bourque和Folk(1992)描述了抑制CAT基因的表达，该CAT基因是通过用包含氯霉素乙酰转移酶报告基因反向序列的DNA共同电穿孔瞬时递送入植物细胞中的，所述报告基因融合到缺少终止子的大豆tRNAmet基因中，这样所述tRNAmet序列通过RNA聚合酶III引起CAT反义序列的转录。
US 5,354,854描述了一种表达系统以及在植物中使用该表达系统抑制基因表达的方法，所述系统包括来自tRNA基因的组成型启动子元件和融合到该启动子元件上的反义链DNA，所述反义链将通过RNA聚合酶III作用与该启动子元件共转录从而抑制基因的转录。
Yukawa等人于2002年描述了靶向对抗马铃薯纺锤块茎病类病毒、啤酒花潜伏类病毒和马铃薯病毒S的RNAs保守结构元件或结构域的反义RNA序列(所述结构元件或结构域嵌入在反密码子区域或烟草tRNAtyr基因或拟南芥7SL RNA基因的3’端附近)，并且证明了这类嵌合基因在同源植物提取物中的体外转录。
EP 0 387 755描述并要求保护任意地以多拷贝存在、包含由聚合酶III转录的基因片段和编码抑制性RNA分子的DNA序列的DNA分子，其特征在于其含有聚合酶III转录所必需的tRNA基因的转录单位，包括决定tRNA二级结构的序列；编码抑制性RNA分子的DNA序列排列在所述DNA分子内部，使抑制性RNA分子是转录物的一部分。
近来已经对哺乳动物细胞中小分子干涉性RNAs的表达进行了很好的描述。Paddison等人2002、Sook Lee等人2002、Miyagishi等人2002、Sui等人2002、Brummelkamp等人2002和Paul等人2002都描述了在人或哺乳动物细胞内使用来源于H1-RNA或U6snRNA的RNA聚合酶III特异性启动子进行的小分子干涉性RNA的表达。
US 6,146,886描述和要求保护转录的非天然存在的含有想要的RNA部分的RNA分子，其中所述非天然存在RNA分子包括在所述RNA的3’区域和5’互补核苷酸之间通过碱基对相互作用形成的分子内茎区，其中所述分子内茎区包括至少8个碱基对；其中所述想要的RNA部分选自反义RNA、引诱RNA、酶促RNA、激动剂RNA和拮抗剂RNA，其中所述RNA分子是通过2型RNA聚合酶III启动子系统转录的。
然而现有技术在植物细胞中提供用于小分子干涉性dsRNAs高效表达的方法方面仍有不足。这个问题如下文中所描述的已获得解决。
发明简述
本发明提供了在植物细胞中降低目的基因表达的方法，其包括下列步骤：
(a)给植物细胞提供嵌合基因，所述嵌合基因包括下列有效连接的DNA片段：
i)启动子，所述启动子是由植物细胞的DNA依赖性RNA聚合酶III识别的启动子，其特征在于所述启动子是包含与DNA依赖性RNA聚合酶III相互作用的所有顺式作用启动子元件的III型(3型)启动子，优选地是3型POL III启动子，其选自编码U6snRNA的基因的启动子、编码U3snRNA的基因的启动子、编码7SL RNA的基因的启动子，更优选的包含启动子核酸序列的启动子选自SEQ ID Nr 1、SEQ IDNr 2、SEQ ID Nr 3、SEQ ID Nr 4、SEQ ID Nr 5、SEQ ID Nr 6、SEQID Nr 7或SEQ ID Nr 8所列的核酸序列。
ii)DNA片段，当所述DNA片段转录时，产生RNA分子，所述RNA分子包含有义和反义核苷酸序列，
(1)有义核苷酸序列，所述有义核苷酸序列包含与转录自目的基因的RNA的大约19个连续核苷酸序列的核苷酸序列大约有90到100％序列一致性的大约19个连续核苷酸；
(2)反义核苷酸序列，所述序列包含与所述有义序列的大约19个连续核苷酸序列的互补序列有大约90到100％序列一致性的大约19个连续核苷酸；
其中所述有义和反义核苷酸序列能形成大约19-200个核苷酸长度的双链RNA；和
iii)寡聚dT片段，所述寡聚dT片段含有至少4个连续T残基；并且
(b)鉴定植物细胞，所述植物细胞中目的基因的表达与不包含所述嵌合基因的植物细胞中目的基因的表达相比被降低。
本发明进一步提供包含下列有效连接的DNA片段的嵌合基因：
i)启动子，所述启动子是由植物细胞的DNA依赖性RNA聚合酶III识别的启动子，其特征在于所述启动子是包含与DNA依赖性RNA聚合酶III相互作用的所有顺式作用启动子元件的III型启动子，优选地是3型POLIII启动子，其选自编码U6snRNA的基因的启动子、编码U3snRNA的基因的启动子、编码7SL RNA的基因的启动子，更优选的包含启动子核酸的启动子选自SEQ ID Nr 1、SEQ ID Nr 2、SEQ IDNr 3、SEQ ID Nr 4、SEQ ID Nr 5、SEQ ID Nr 6、SEQ ID Nr 7或SEQ ID Nr 8所列的核酸序列。
ii)DNA片段，当所述DNA片段转录时，产生RNA分子，所述RNA分子包含有义和反义核苷酸序列，
(1)有义核酸序列，所述有义核酸序列包含与转录自目的基因的RNA的大约19个连续核苷酸的核苷酸序列大约有90到100％序列一致性的大约19个连续核苷酸；
(2)反义核苷酸序列，所述反义核苷酸序列包含与所述有义序列的大约19个连续核苷酸序列的互补核苷酸序列有大约90到100％序列一致性的大约19个连续核苷酸；
其中所述有义和反义核苷酸序列能形成大约19-200个核苷酸长度的双链RNA；和
iii)寡聚dT片段，所述寡聚dT片段含有至少4个连续T残基。
本发明进一步提供了包含上述嵌合基因的植物细胞和植物。
图表简述
图1用示意图描述了用于产生和操作编码短dsRNA序列的编码区域的便捷克隆策略。
发明详述
本发明是基于观察：编码短dsRNA分子的嵌合基因导致比由强大的组成型RNA聚合酶II启动子CaMV 35S驱动的类似结构更有效的基因沉默，所述dsRNA分子优选地是大约20个碱基对(bp)和100bp之间并且在RNA聚合酶III识别的3型启动子控制之下的分子。
这些3型启动子具有另外的有利方面：与由RNA聚合酶III识别的2型启动子相反(在现有技术中已用于指导反义RNA的表达)，所有启动子所需的顺式作用元件都位于转录区域的上游区域。
因而，在第一个实施方案中，本发明涉及用于降低植物细胞中目的基因表达的方法，其包括下列步骤：
a)给植物细胞提供嵌合基因，所述嵌合基因包括下列有效连接的DNA片段：
i)启动子，所述启动子是由植物细胞的DNA依赖性RNA聚合酶III识别的启动子，其特征在于所述启动子是包含与DNA依赖性RNA聚合酶III相互作用的所有顺式作用启动子元件的3型启动子；
ii)DNA片段，当所述DNA片段转录时，产生RNA分子，所述RNA分子包含有义和反义核苷酸序列，其中
(1)有义核苷酸序列，所述有义核苷酸序列包含与转录自目的基因的RNA的大约19个连续核苷酸的核苷酸序列大约有90到100％序列一致性的大约19个连续核苷酸；
(2)反义核苷酸序列，所述反义核苷酸序列包含与所述有义序列的大约19个连续核苷酸序列的互补核苷酸序列有大约90到100％序列一致性的大约19个连续核苷酸；
其中所述有义和反义核苷酸序列能形成大约19-200个核苷酸长度的双链RNA；和
iv)寡聚dT片段，所述寡聚dT片段含有至少4个连续T残基；并且
(c)鉴定植物细胞，所述植物细胞中目的基因的表达与不包含所述嵌合基因的植物细胞中目的基因的表达相比被降低。
如此处所使用的“DNA依赖性RNA聚合酶III识别的启动子”是通过RNA聚合酶III的聚合酶作用来指导相关DNA区域转录的启动子。这些包括编码5S RNA、tRNA、7SL RNA、U6 snRNA和少量其它小的稳定的RNAs的基因，其中许多涉及RNA加工。大多数由Pol III使用的所述启动子需要位于+1下游、转录区域内的序列元件。然而少部分polIII的模板不需要任何基因内启动子元件。这些启动子称为3型启动子。换句话说，“3型Pol III启动子”是那些由RNA聚合酶III识别并且含有在RNA聚合酶III正常转录区域上游与RNA聚合酶III相互作用的所有顺式作用元件的启动子。因而这种3型Pol III启动子可以容易地与异源区域组合到嵌合基因中，所述异源区域的转录是想要的，例如本发明的dsRNA编码区域。
一般地，3型Pol III启动子包含TATA盒(位于人U6snRNA基因的-25和-30之间)和近侧序列元件(PSE；位于人U6snRNA的-47和-66之间)。其也可以包含远侧序列元件(DSE；位于人U6snRNA的-214和-244之间)。
可发现3型Pol III启动子例如与编码7SL RNA、U3snRNA和U6snRNA的基因相联系。这类序列已从拟南芥、水稻和蕃茄中分离出来并且这类启动子的代表序列以SEQ ID No 1-8列于序列表中。
其它有关3型Pol III启动子的核苷酸序列可在核苷酸序列数据中找到，所述序列出现在下列条目下：编码7SL RNA的拟南芥(A.thaliana)基因AT7SL-1(X72228)、编码7SL RNA的拟南芥基因AT7SL-2(X72229)、编码7SL RNA的拟南芥基因AT7SL-3(AJ290403)、啤酒花(Humulus lupulus)H17SL-1基因(AJ236706)、啤酒花H17SL-2基因(AJ236704)、啤酒花H17SL-3基因(AJ236705)、啤酒花H17SL-4基因(AJ236703)、拟南芥U6-1 snRNA基因(X52527)、拟南芥U6-26snRNA基因(X52528)、拟南芥U6-29 snRNA基因(X52529)、拟南芥U6-1 snRNA基因(X52527)、玉蜀黍(Zea mays)U3 snRNA基因(Z29641)、马铃薯(Solanum tuberosum)U6 snRNA基因(Z17301；X60506；S83742)、蕃茄U6小核RNA基因(X51447)、拟南芥U3C snRNA基因(X52630)、拟南芥U3BsnRNA基因(X52629)、水稻(Oryza sativa)U3 snRNA启动子(X79685)、蕃茄U3小核RNA基因(X14411)、普通小麦(Triticum aestivum)U3 snRNA基因(X63065)、普通小麦U6 snRNA基因(X63066)。
不用说可通过少量实验从其它蕃茄、水稻或拟南芥物种或从其它植物品种中分离出各种3型Pol III启动子。例如可使用U6snRNA、U3snRNA或7SL RNA编码序列(例如由其登录号确定的上述任何序列的编码序列和另外的蚕豆(Vicia faba)U6snRNA编码序列(X04788)、编码U6snRNA的玉米DNA(X52315)或编码7SL RNA的玉米DNA(X14661))作为探针分离来自这类植物的基因组克隆文库，所述转录区域的上游序列可被分离(优选地为所述转录区域上游大约300到400bp区域)并且作为3型Pol III启动子使用。可选择地，可使用基于PCR的技术例如反向PCR或TAIL-PCR分离基因组序列，包括与已知转录区域相邻的启动子序列。此外，任何由其登录号确定的所附的3型Pol III启动子序列或上述启动子序列可在严谨杂交条件下用作探针或作为产生PCR引物的信息源，以用于从其它植物品种中分离相应启动子序列。
此处使用的“严谨杂交条件”意思是指当探针和靶序列之间至少有95％和优选地至少97％的序列一致性时，杂交通常会发生。严谨杂交条件的例子是：在含有50％甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸盐(pH 7.6)、5XDenhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖、和20μg/ml变性的、剪切过的载体DNA例如硅鱼精子DNA的溶液中孵育过夜，接着在接近65℃下在0.1xSSC中洗涤杂交支持膜。其它杂交和洗涤条件是众所周知的并且例举于Sambrook等人的Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor，NY(1989)，特别是第11章中。
尽管3型Pol III启动子不要求位于转录区域的顺式作用元件，但是很明显通常位于转录起始位置下游的序列仍可包含在本发明的嵌合构建体中。
还观察到最初分离自单子叶植物的3型Pol III启动子在双子叶和单子叶植物细胞和植物中的使用都获得好的效果，然而最初分离自双子叶植物的3型Pol III启动子只能在双子叶植物细胞和植物中有效使用。此外，当使用包含来自相同或关系密切的品种的3型Pol III启动子的嵌合基因时已获得最有效的基因沉默。
如此处所使用的，“目的基因”可以是任何目的核酸，所述核酸易于转录(或复制)成RNA分子，并且易于转录后进行RNA降解。这些包括但不限于转基因、内源基因和被转录的病毒序列。同时显而易见的是，对于本发明方法，不需要知道目的基因的核酸序列。事实上，直接获得小片段并在3型Pol III启动子控制下将其以反向重复方向有效连接是可能的。
如上面所指出，转录的DNA区域应该能编码包含有义和反义核苷酸区域的RNA分子，其中所述有义核苷酸序列包含大约19个连续核苷酸，所述19个连续核苷酸与转录自目的基因的RNA的大约19个连续核苷酸的核酸序列有大约90到100％的序列一致性，并且其中所述反义核苷酸序列包含大约19个连续核苷酸，所述19个连续核苷酸与所述有义序列的大约19个连续核苷酸的核酸的互补序列有大约90到100％的序列一致性。所述有义和反义核苷酸序列应该能形成大约19到200个核苷酸特别是大约21到90或100个、或更优选地是长度大约是40个到大约50个核苷酸的双链RNA。然而，dsRNA的茎区长度也可以是大约30、大约60、大约70或大约80个核苷酸。很明显，如果dsRNA区域大于19个核苷酸，时只需至少有一个大约19个核苷酸的双链区域(由此在有义和反义区域之间可能允许大约一个错配)，所述双链区域的有义链与靶核酸或目的基因的19个连续核苷酸是“一致的”(允许一个错配)。
就本发明的目的来说，两个相关核酸序列的“序列一致性”(以百分比表示)是指在两个最优比对的序列中具有一致残基位点的数目除以比较位点的数目(x100)。缺口，即在比对中存在于一个序列上但不存在于另一个序列上的残基位点，被认为是非一致残基位点。使用Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)进行所述两个序列的比对。使用标准软件程序，例如作为Wsconsin Package10.1版本(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin，USA)一部分的GAP，通过使用缺口产生罚分为50和缺口延伸罚分为3的默认分值矩阵，可便利地进行计算机辅助的序列比对，
转录的DNA区域可包含范围从3到大约100个核苷酸或更特殊地从大约6到大约40个核苷酸的核苷酸片段，所述片段位于有义和反义编码核苷酸区域之间，并且与所述靶基因的核苷酸序列无关(所谓的间隔区域)。
通过在克隆过程中在短的反义和有义片段之间使用填充DNA序列(可在之后除去)可便利地构建本发明的嵌合基因，所述嵌合基因包含具有短的反义和有义片段的可转录DNA区域。为达到此目的，所述填充片段装配有限制性酶(例如用以容易地除去填充序列和重连(自身连接)克隆载体的稀有切割限制性酶)的识别位点，由此所述短的有义和反义区域被相互拉近。如图1所概述的，可通过使用包含所述有义或反义序列和对应于部分填充DNA序列的寡核苷酸引物便利地构建包含短的有义序列、短的与所述有义序列互补的反义序列和填充DNA序列的DNA片段。
上述“寡聚dT片段“是作为RNA聚合酶III活性终止子的连续T残基片段。其应当包含至少4个T残基，但很明显可包含更多T残基。
通过使用在本领域内可获得的任何DNA转化方法可将本发明的嵌合基因导入植物细胞中从而为植物细胞提供所述嵌合基因并且可产生瞬时或稳定转化的植物细胞，所述方法包括但不限于：农杆菌介导的转化、微粒轰击、原生质体或植物组织直接吸入DNA(通过电穿孔、PEG介导的吸收等)。也可通过使用能在植物细胞中复制的病毒载体将所述嵌合基因提供给所述植物细胞。也可以通过亲本植物杂交将嵌合基因提供给植物细胞，其中至少一个亲本包含本发明的嵌合基因。
如此处所使用的，“降低目的基因的表达”是指在本发明dsRNA或嵌合基因存在的情况下植物细胞中目的基因的表达与在本发明dsRNA或嵌合基因不存在情况下目的基因的表达进行比较。因而在本发明嵌合RNA存在的情况下所述表达应该低于在缺少其时的表达，例如只有在没有所述嵌合RNA存在时表达量的约75％或50％或10％或大约5％。为了所有实用目的，可通过提供嵌合RNA或编码这种RNA的嵌合基因以完全抑制所述表达。
目的基因表达的降低可通过如下指标进行检测：所述基因(或其部分)在转录上的降低、所述基因(或其部分)在翻译上的降低或被转录RNA(s)或被翻译多肽的存在对植物细胞或植物影响的降低，并且所述基因表达的降低最终将导致表型特征的改变。很清楚目的基因表达上的降低可伴随着或与另外基因表达上的增加有关。尽管dsRNA的主要作用是转录后降解特定RNA，但dsRNA在转录过程中的作用已有描述。这类另外的作用也有助于dsRNA介导降低目的基因的表达。
本发明的其它实施方案涉及此处描述的嵌合基因以及含有本发明嵌合基因的植物、植物细胞、植物组织或种子。
提供含有本发明嵌合基因的植物细胞和植物也是本发明的目的。通过传统育种方法产生的含有本发明所述嵌合基因的配子、种子、胚(合子的或体细胞的)、植物后代或杂种也都包括在本发明的范围内。
相信此处描述的方法和手段适用于所有双子叶和单子叶植物细胞和植物，包括但不限于棉花、芸苔属蔬菜、油菜(oilseed rape)、小麦、玉米(corn)或玉米(maize)、大麦、向日葵、水稻、燕麦、甘蔗、大豆、蔬菜(包括菊苣、莴苣、蕃茄)、烟草、马铃薯、甜菜、木瓜、菠萝、芒果、拟南芥，还包括用于园艺、花卉栽培或森林的植物。
下列非限定实施例描述了用于降低植物细胞目的基因表达的嵌合基因的构建和这类基因的应用，所述目的基因表达的降低是由于小dsRNA造成的。
除非在实施例中另外说明，所有重组DNA技术都根据标准方法进行，所述标准方法描述于Sambrook等人(1989)的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY和Ausubel等人(1994)的Current Protocols in MolecularBiology，Current Protocols，USA的第1卷和第2卷。用于植物分子研究工作的标准材料和方法描述于由R.D.D.Croy编著的、由BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications，UK联合出版的Plant Molecular BiologyLabfax(1993)。其它用于标准分子生物学技术的参考资料包括Sambrook和Russell(2001)的Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，和Brown(1998)的Molecular Biology LabFax的第I和II卷，第二版，Academic Press(UK)。用于聚合酶链式反应的标准材料和方法可在Dieffenbach和Dveksler(1995)的PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press和在McPherson等人(2000)的PCR-Basics：From Background to Bench，第一版，Springer Verlag，Germany中找到。
在整个说明书和实施例中，参考下列序列：
SEQ ID No.1：拟南芥变种Landsberg erecta的7SL-2基因的启动子序列，后接位于寡聚dT片段前的单一限制性位点。
SEQ ID No.2：拟南芥变种Landsberg erecta 7SL-2基因的启动子序列，其包括转录起始位点下游的86个碱基，后接位于寡聚dT片段前的单一限制性位点。
SEQ ID No.3：拟南芥变种Landsberg erecta U3B snRNA基因的启动子序列，后接位于寡聚dT片段前的单一限制性位点。
SEQ ID No.4：拟南芥变种Landsberg erecta的U3B snRNA基因的启动子序列，其包括转录起始位点下游的136个碱基，后接位于寡聚dT片段前的单一限制性位点。
SEQ ID No.5：拟南芥变种Landsberg erecta的U6-26 snRNA基因的启动子序列，其包括转录起始位点下游的3个碱基，后接位于寡聚dT片段前的单一限制性位点。
SEQ ID No.6：拟南芥变种Landsberg erecta U6-26 snRNA基因的启动子序列，其包括转录起始位点下游的20个碱基，后接位于寡聚dT片段前的单一限制性位点。
SEQ ID No.7：水稻(Oryza sativa Indica IR36)U3 snRNA基因的启动子序列，后接位于寡聚dT片段前的单一限制性位点。
SEQ ID No.8：番茄(具有小葫芦形黄色果实的园艺品种)U3snRNA基因的启动子序列，后接位于寡聚dT片段前的单一限制性位点。
SEQ ID No.9：用于沉默GUS基因(GUShp94)表达的94bp的dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.10：用于沉默GUS基因(GUShp41)表达的41bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.11：用于沉默GUS基因(GUShp21)表达的21bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.12：源自PHYB(PHYB5hp-42)-upper链5’末端的用于沉默PHYB基因表达的42bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.13：源自PHYB(PHYB5hp-42)-lower链5’末端的用于沉默PHYB基因表达的42bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.14：源自PHYB(PHYB5hp21)-upper链5’末端的用于沉默PHYB基因表达的21bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.15：源自PHYB(PHYB5hp21)-lower链5’末端的用于沉默PHYB基因表达的21bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.16：源自PHYB(PHYBChp42)-upper链中间部分的用于沉默PHYB基因表达的42bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.17：源自PHYB(PHYBChp42)-lower链中间部分的用于沉默PHYB基因表达的42bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.18：源自PHYB(PHYBChp21)-upper链中间部分的用于沉默PHYB基因表达的21bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.19：源自PHYB(PHYBChp21)-lower链中间部分的用于沉默PHYB基因表达的21bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.20：源自PHYB(PHYB3hp42)-upper链中3’末端的用于沉默PHYB基因表达的42bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.21：源自PHYB(PHYB3hp42)-lower链中3’末端的用于沉默PHYB基因表达的42bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.22：源自PHYB(PHYB3hp21)-upper链中3’末端的用于沉默PHYB基因表达的21bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.23：源自PHYB(PHYB3hp21)-lower链中3’末端的用于沉默PHYB基因表达的21bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.24：用于沉默PDS基因(PDS42)-upper链表达的42bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.25：用于沉默PDS基因(PDS42)-lower链表达的42bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.26：用于沉默PDS基因(PDS21)-upper链表达的21bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.27：用于沉默PDS基因(PDS21)-lower链表达的21bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.28：用于沉默GUS基因(GUS-A)表达的42bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.29：用于沉默GUS基因(GUS-B)表达的42bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.30：用于沉默GUS基因(GUS-C)表达的42bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.31：用于沉默EIN(EIN-A)表达的42bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.32：用于沉默EIN(EIN-B)表达的42bp dsRNA编码区域的序列。
SEQ ID No.33：用于沉默EIN(EIN-C)表达的42bp dsRNA编码区域的序列。
实施例
实施例1.构建3型Pol III启动子-寡聚dT片段盒
3型Pol III启动子经PCR扩增从拟南芥、水稻或蕃茄7SL、U3snRNA或U6snRNA基因中分离出来，所述PCR扩增以这样的方式设计：
a)所得片段两翼是在所述扩增片段内不存在的限制性酶切识别位点；
b)所述启动子片段之后连接单一限制性酶切位点(SalI、XhoI或PvuI)，之后接着是
c)作为Pol III终止子的poly(T)序列(具有7-9个T残基)。
在某些克隆的启动子片段中，转录起始位点下游编码区域的额外序列被保留，以考察小RNAs编码区域内的保守基序对转录和/或基因沉默的可能影响。将所得的片段(展示于SEQ IDs No 1到8)克隆入中间克隆载体(参见表1)内。有义、反义或反向重复序列可容易地插入3型Pol III启动子和poly T片段之间的单一限制酶切位点。
表1.克隆的Pol III启动子-终子止盒*
  小RNAs   克隆的启动子   大小(bp)**  植物种类   中间质粒名称
  7SL-2   At7SL-PAt7SL+86**   343432  拟南芥(L.er)   pMBW444pMBW445
  U3B   AtU3B-PAtU3B+136   334467  拟南芥(L.er)   pWBW442pWBW426
  U6-26   AtU6+3AtU6+20  拟南芥(L.er)   PWGEM.U6+3PWGEM.U3+20
  U3   OsU3-P   407  水稻(Oryza sativa indicaIR36)   pMBW446-LW
  U3   TomU3-P   443  蕃茄(具有小葫芦形状黄色果实的园艺品种)   pMBW443-LW
**该数目表示来自小RNA基因编码区域的序列。
***所述给定的大小包括限制性位点和加入到PCR引物中的寡聚(dT)s。
实施例2.对抗GUS报告基因(烟草(Nicotiana tabacum))的基因
沉默构建体中Pol III启动子的检验。
为了检验这些用于沉默的Pol III启动子，合成GUS反向重复序列(SEQ ID No 9)，所述序列包含186bp有义GUS序列(GUS编码序列的nt.690-875)，所述186bp有义GUS序列在3’末端与所述186bp片段的前94bp(GUS编码序列的nt.690-783)的反义形式融合。这个i/r序列两翼连接两个SalI位点和两个PvuI位点，因而可作为SalI或PvuI片段克隆入Pol III启动子载体中。使用所述i/rGUS序列(GUShp94)(参见表2)将所有描述于表1中的Pol III启动子用于制备构建体。除了所述GUShp94序列，也可通过使用更小的i/rGUS序列例如GUShp41a(被9bp非GUS序列隔开的茎区41bp；SEQ ID No 10)和GUShp21(被6bp非GUS序列隔开的茎区21bp，SEQ ID No 11)(表2)将AtU3B+136启动子(SEQID No 4.)和CaMV35S启动子用于制备构建体。
表2.在烟草中检验的构建体简述
  构建体   描述
  pMBW465   由35S启动子驱动的GUShp94(pART7)
  pMBW466   由AtU3+136驱动的GUShp94
  pMBW468   由AtU3驱动的GUShp94
  pMBW470   由At7SL启动子驱动的GUShp94
  pMBW472   由At7SL+86启动子驱动的GUShp94
  pMBW473   由OsU3启动子驱动的GUShp94
  pMBW476   由AtU3+3启动子驱动的GUShp94
  pMBW477   由AtU3+20启动子驱动的GUShp94
  pLMW64   由TomU3驱动的GUShp 94
  pLMW53   由35S启动子驱动的GUShp41a
  pLMW58   由AtU3+136驱动的GUShp41a
  pLMW61   由AtU3+136驱动的GUShp21
将这些构建体导入用于植物转化的双元载体pART27或pWBVec4a。两个表达GUS的不同转基因烟草系用所有这些构建体进行转化。所述构建体也包括由35S启动子(在pART7中)驱动GUShp94序列的对照构建体。
测定来自生根培养基中转化烟草幼苗的叶组织的GUS活性(荧光MUG测定)并且将结果概述于表3中。
结果显示在烟草中具有AtU3(pMBW468)、At7SL(pMBW470)、At7SL+86(pMBW472)、AtU3+3(pMBW476)、AtU3+20(pMBW477)和TomU3(pLMW64)启动子的GUShp94构建体全都激活了GUS基因的沉默。AtU3、AtU6+20和TomU3构建体表现得比其它构建体更好。AtU3+136构建体(pMBW466)在烟草中似乎不产生显著的GUS沉默。还有OsU3构建体(pWBW473)表现出只赋予低水平的GUS沉默。在烟草中Pol III启动子构建体pLMW58(AtU3+136-GUShp41a)产生了显著水平的GUS沉默而35S构建体pLMW53(35S-GUShp41a)没有，表明Pol III启动子在驱动小发夹RNA的表达方面比Pol II启动子更有效。
表3.用列于表2中的构建体转化的烟草叶组织的MUG测定(5μg蛋白)
  构建体   未转化的   465   466   468   470   472   473   476   477   64   53   58   61
  PPGH2GUS背景   40.051.151.046.8   2.021.41.80.60.73.523.3   17.434.013.916.024.720.2   2.212.84.512.926.97.1   8.210.99.26.912.5   5.65.612.87.89.910.819.15.513.313.9   11.317.014.94.215.32.117.124.320.520.8   8.48.222.936.5   5.23.935.53.78.410.91.832.73.9   7.96.62.920.911.09.06.73.313.6   55.453.427.0   20.617.21.49.1   6.019.425.829.624.121.625.513.731.357.443.512.8
  PPHG24GUS背景   17.732.454.618.6   18.90.5   39.823.915.513.8   19.818.14.39.35.011.6   2.5438.815.58.2   1.720.65.8   9.211.016.714.812.916.525.8   13.418.24.210.9   14.59.1   6.6   50.048.425.9   30.69   14.643.926.88.6
实施例3.对抗GUS报告基因(拟南芥)的基因沉默构建体中Pol III启动子的检验。
产生如实施例2中类似的构建体并克隆入pWBVec4(参见表4)，并且用于转化表达CaMV35S-GUS基因的转基因拟南芥系。
表4.在拟南芥中检验的构建体概述
  构建体   描述
  pMBW479   由35S(pART7)启动子驱动的GUShp94
  pMBW480   由AtU3+136驱动的GUShp94
  pMBW481   由AtU3驱动的GUShp94
  pMBW482   由At7SL启动子驱动的GUShp94
  pMBW483   由At7SL+86启动子驱动的GUShp94
  pMBW485   由OsU3启动子驱动的GUShp94
  pMBW486   由AtU3+3启动子驱动的GUShp94
  pMBW488   由AtU3+20启动子驱动的GUShp94
  pLMW62   由TomU3启动子驱动的GUShp94
  pLMW56   由35S启动子驱动的GUShp41
  pLMW52   由AtU3+136启动子驱动的GUShp41
  pLMW60   由AtU3+136启动子驱动的GUShp21
测定来自显示对选择性试剂PPT呈高水平抗性的T1代植株的叶片组织的GUS活性。所述MUG测定数据概述于表5。
对于GUShp94序列，尽管TomU3和AtU6+20表现更加一致和提供更好的沉默，所有U3和U6启动子驱动的构建体使GUS沉默。所述2个At7SL启动子构建体并不表现使GUS显著沉默，尽管少数株系显示中度沉默(可能是T-DNA插入邻近于内源启动子的缘故)。
对于GUShp41序列，AtU3+136构建体在GUS沉默的程度方面表现得比35S构建体更好，再次表明在植物中Pol III启动子在驱动小发夹RNA的表达方面比Pol II启动子更有效。
表5.用列于表4中的构建体超级转化的拟南芥叶组织的MUG测定(5μg蛋白)
  构建体   未转化的   479   480   481   482   483   485   486   488   62   56   52   60
  35S-GUS背景   56.165.569.545.068.4   1.530.3375.48.731.501.13   19.93.5015.02.87.018.92.972.4813.2   3.112.3714.125.32.904.531.79   14.18.536.7135.615.615.648.339.961.994.4   4.2575.3   0.306.7930.23.8816.49.03   4.5014.40   2.191.997.9717.810.71.086.832.9647.94.322.4910.1   9.5800015.5   9.306.987.429.356.6056.6   3.631.523.80   6.4355.355.363.18.0729.081.6
实施例4.对抗GUS报告基因(水稻)的基因沉默构建体中Pol III启动子的检验。
将构建体pMBW479、pMBW481、pMBW485、pMBW486和pLMW62(参见表4)超级转化到表达Ubil-GUS-nos基因的水稻中。GUS染色显示只有pMBW485(OsU3-GUShp94)和pMBW479(35S-GUShp94)使固有的GUS基因产生显著沉默。这些结果表明双子叶的3型Pol III启动子在单子叶植物中不起作用。
实施例5.对抗拟南芥内源基因的基因沉默构建体中Pol III启动子的检验。
拟南芥U6-26构建体包含从-446到+3bp(SEQ ID 5)的启动子和通过PCR在所述片段各端创建XhoI位点时加上的添加序列。这些用来将所述PCR产物克隆入pGEM衍生质粒的SalI位点。用NotI将所述插入片段切下并且插入到用于植物转化的pART27双元载体。也用PCR将SalI位点整合到所述启动子和终止序列(T8)之间以插入寡核苷酸序列。
靶向两个基因八氢蕃茄红素去饱和酶(PDS沉默产生光漂白表型)和植物光敏色素B(PHYB沉默导致在白光下下胚轴延长)。对于PDS来说，单个靶区域被选择，对于PHYB来说，三个分别来自5’UTR，在植物光敏色素之间保守的编码区域的区域和3′UTR的区域被使用。对每一个靶区域使用两个寡核苷酸，一个用于产生21bp长的双链部分，另一个用于产生42bp双链部分。将双链寡核苷酸变成2个单链(upper和loWer)并且复性形成双链DNA片段。在5’和3’末端带有突出端序列以产生SalI相容性末端。用于PHYB构建体的寡核苷酸序列在序列表中以SEQ ID 12到23表示，用于PDS构建体的寡核苷酸以SEQ ID 24到27表示。
PDShp42构建体在大多数检测的植株中产生了表型。所述结果概述于表6中。
表6.PDS分值(显示表型的T1代幼苗数目)
  表型   U6+PDS42   35S+PDS42
 无表型   2   17
 只有漂白的子叶   0   26
 全部漂白(子叶和第1对叶子)   43   0
具有在35S启动子控制下的dsRNA编码区域PDS42的构建体插入导致比具有在U6启动子控制下的dsRNA编码区域PDS42的构建体产生更多的没有沉默表型的植株，并且具有表型的植株只显示微弱漂白的子叶表型和未漂白的叶子。
对于PHYB沉默实验，使用PHYBC42dsRNA编码区域获得最满意的沉默结果，其中大多数植株显示比对照更长。大多数其它构建体不显示表型或只有一或二株植株显示表型，这表明目的序列的选择可能很重要。
测量白光培养植物的下胚轴并归入5mm类别的组群。从表7中的数据概述来看，似乎U6启动子驱动的构建体比CaMV35S启动子驱动的构建体更加有效，但结果不如上述PDS基因沉默实验明显。
表7.PHYB的沉默
  分类下胚轴长度(cm)   WT   35S-PHYbC42   U6-PHYbC42
  0.1-0.5
  0.6-1.0   13   1   2
  1.1-1.5   10   2   5
  1.6-2.0   3   5   10
  2.1-2.5   6   6
  2.6-3.0   5   9
  3.1-3.5   3   3   2
  3.6-4.0   1   11
  4.1-4.5   2
  4.6-5.0   1   1
因而，从实验中可得出下列结论：
1.3型Pol III启动子可用以在植物细胞中有效地驱动dsRNA分子的表达。
2.AtU6启动子表现为最有效的受检验的启动子。
3.单子叶Pol III启动子在单子叶和双子叶植物中都具有功能，但双子叶启动子在单子叶植物中似乎不具功能。
4.III型Pol III启动子在用相对较短的发夹型序列进行基因沉默上表现比CaMV35S启动子更有效。
实施例6.用小发夹RNA编码构建体进行的额外实验
通过使用如图1中概述的克隆策略，制备如在图7中概述的20种新的小发夹构建体。预计来自所有这些构建体的小hpRNAs包含42bpdsRNA茎(对应于靶基因序列)和9-nt的环(非靶序列)。选择对应于EIN2(描述于SEQ ID 31到33)或GUS(描述于SEQ ID 28到30)不同区域的三个靶序列。这些构建体已被用于转化烟草以估量其诱导对应的内源(EIN2)或报告(GUS)基因沉默的功效。
测定烟草苗的GUS表达，并将结果显示于表8中。
结果显示：
1)大部分小GUS发夹构建体赋予良好的GUS沉默；并且
2)Pol III启动子驱动的构建体pLMW164和pLMW165导致比35S启动子驱动的构建体pLMW155产生更加一致的GUS沉默。
表7.额外小发夹RNA编码构建体概述
  名称   启动子   发夹序列(42nt茎区)   名称   启动子   发夹序列
  pLMW154   35S   GUS-A(SEQ ID No 28)   pLMW164   TomU3   GUS-A(SEQ IDNo 28)
  pLMW155   35S   GUS-B(SEQ ID No 29)   pLMW165   TomU3   GUS-B(SEQ IDNo 29)
  pLMW156   35S   GUS-C(SEQ ID No 30)   pLMW166   TomU3   GUS-C(SEQ IDNo 30)
  pLMW157   35S   EIN-A(SEQ ID No 31)   pLMW167   TomU3   EIN-A(SEQ IDNo 31)
  pLMW158   35S   EIN-B(SEQ ID No 32)   pLMW168   TomU3   EIN-B(SEQ IDNo 32)
  pLMW159   AtU3B   GUS-A(SEQ ID No 28)   pLMW169   AtU6   GUS-A(SEQ IDNo 28)
  pLMW160   AtU3B   GUS-B(SEQ ID No 29)   pLMW170   AtU6   GUS-B(SEQ IDNo 29)
  pLMW161   AtU3B   GUS-C(SEQ ID No 30)   pLMW171   AtU6   GUS-C(SEQ IDNo 30)
  pLMW162   AtU3B   EIN-A(SEQ ID No 31)   pLMW172   AtU6   EIN-A(SEQ IDNo 31)
  pLMW163   AtU3B   EIN-B(SEQ ID No 32)   pLMW173   AtU6   EIN-B(SEQ IDNo 32)
表8：假定转化的烟草苗的GUS活性
  构建体   未转化的   LMW155   LMW156   LMW164   LMW165   LMW166   LMW169   LMW170
MUG分析读数   51.237.052.244.32   7.1420.20.168.983.040.1770.374.381.9   0.76   2.160.401.41   12.41.552.220.812.311.191.24   1.2768.327.67.07   0.941.451.837.7437.53.3525.385.3   1.752.4025.320.7052.726.07.651.312.009.180.6919.61.371.750.9235.3
测定的烟草组织主要是叶片，所述叶片来自生长在加有潮霉素(通常用于严格筛选)的培养基上小的再生苗。
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<151>2003-02-19
<160>33
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>341
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>拟南芥变种Landsberg erecta 7SL-2基因的启动子序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(6)
<223>XhoI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(322)
<223>PolIII启动子区域
<220>
<221>misc_feature
<222>(336)..(341)
<223>XhoI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(329)..(335)
<223>poly T核苷酸片段
<220>
<221>misc_feature
<222>(323)..(328)
<223>SalI限制性位点
<400>1
ctcgagatgt tgttgttacc agaaagtaaa taaatgttca atctctgatg ttctcaagta     60
agtgagtttt attgggaata atattaactc atgttcttct gcatttgatt cctttgccgc    120
tctcttcttc tatcttaaat ctgtgtatac tatttcacta ttgggctttt tattagtcta    180
taatgggact caaaataagg ctttggccca catcaaaaag ataagtcaca aatcaaaact    240
aaattcagag tcttttctcc cacatcggtc actgtactca ttttgtgttt gtttatatat    300
tacacgaacc gatctttgtt acgtcgactt tttttctcga g                        341
<210>2
<211>429
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>拟南芥变种Landsberg erecta 7SL-2基因的启动子序列，包括转录起始位点下游的86个碱基
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(6)
<223>XhoI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(424)..(429)
<223>XhoI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(415)..(423)
<223>poly T片段
<220>
<221>misc_feature
<222>(409)..(414)
<223>SalI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(408)
<223>PolIII启动子区域.
<400>2
ctcgagatgt tgttgttacc agaaagtaaa taaatgttca atctctgatg ttctcaagta    60
agtgagtttt attgggaata atattaactt atgttcttct tgcatttgat ttctttgccg   120
ctctcttctt ctatcttaaa tctgtgtata ctatttcact attgggcttt ttattagtct    180
ataatgggac tcaaaataag gctttggccc acatcaaaaa gataagtcac aaatcaaaac    240
taaattcaga gtcttttctc ccacatcggt cactgtactc ttttgtgttt gtttatatat    300
tacacgaacc gatctttggt acgtcgagct aagtaacatg agcttgtaac ccatgtgggg    360
acattaagat ggtggaacac tggctcgggt ccacgggccg gttctgttgt cgactttttt    420
tttctcgag                                                            429
<210>3
<211>334
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>拟南芥变种Landsberg erecta的U3 snRNA的启动子序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(6)
<223>EcoRI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(314)..(319)
<223>PvuI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(320)..(328)
<223>poly T片段
<220>
<221>misc_feature
<222>(329)..(334)
<223>EcoRI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(313)
<223>Pol III启动子区域
<400>3
gaattcttat gcagcctgtg atggataact gaatcaaaca aatggcgtct gggtttaaga     60
agatctgttt tggctatgtt ggacgaaaca agtgaacttt taggatcaac ttcagtttat    120
atatggagct tatatcgagc aataagataa gtgggctttt tatgtaattt aatgggctat    180
cgtccataga ttcactaata cccatgccca gtacccatgt atgcgtttca tataagctcc    240
taatttctcc cacatcgctc aaatctaaac aaatcttgtt gtatatataa cactgaggga    300
gcaacattgg tcacgatcgt ttttttttga attc                                334
<210>4
<211>467
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>拟南芥变种Landsberg erecta的U3 snRNA基因的启动子序列，包括转录启始位点下游的136个碱基
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(6)
<223>EcoRI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(446)
<223>Pol III启动子区域
<220>
<221>misc_feature
<222>(447)..(452)
<223>XhoI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(453)..(461)
<223>poly T片段
<220>
<221>misc_feature
<222>(462)..(467)
<223>EcoRI限制性位点
<400>4
gaattcttat gcagcctgtg atggataact gaatcaaaca aatggcgtct gggtttaaga     60
agatctgttt tggctatgtt ggacgaaaca agtgaacttt taggatcaac ttcagtttat    120
atatggagct tatatcgagc aataagataa gtgggctttt tatgtaattt aatgggctat    180
cgtccataga ttcactaata cccatgccca gtacccatgt atgcgtttca tataagctcc    240
taatttctcc cacatcgctc aaatctaaac aaatcttgtt gtatatataa cactgaggga    300
gcaacattgg tcacgacctt acttgaacag gatctgttct ataggctcgt acctctgttt    360
ccttgatttc tcaagagaca ggcccttaac cctggttgat gaaccatgac cgtgcggcta    420
gagcgtgatt gacggctacg atcgtcctcg agtttttttt tgaattc                  467
<210>5
<211>456
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>拟南芥变种Landsberg erecta的U6 snRNA基因的启动子序列，包括转录启始位点下游的3个碱基
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(6)
<223>XhoI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(436)
<223>Pol III启动子区域
<220>
<221>misc_feature
<222>(437)..(442)
<223>SalI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(443)..(450)
<223>poly T片段
<220>
<221>misc_feature
<222>(451)..(456)
<223>Sac I限制性位点
<400>5
ctcgagcttc gttgaacaac ggaaactcga cttgccttcc gcacaataca tcatttcttc     60
ttagcttttt ttcttcttct tcgttcatac agtttttttt tgtttatcag cttacatttt    120
cttgaaccgt agctttcgtt ttcttctttt taactttcca ttcggagttt ttgtatcttg    180
tttcatagtt tgtcccagga ttagaatgat taggcatcga accttcaaga atttgattga    240
ataaaacatc ttcattctta agatatgaag ataatcttca aaaggcccct gggaatctga    300
aagaagagaa gcaggcccat ttatatggga aagaacaata gtatttctta tataggccca    360
tttaagttga aaacaatctt caaaagtccc acatcgctta gataagaaaa cgaagctgag    420
tttatataca gctagagtcg actttttttt gagctc                              456
<210>6
<211>488
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>拟南芥变种Landsberg erecta的U3 snRNA基因的启动子序列，包括转录启始位点下游的20个碱基
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(6)
<223>XhoI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(468)
<223>Pol III启动子区域
<220>
<221>misc_feature
<222>(469)..(474)
<223>PvuI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(475)..(482)
<223>Poly T片段
<220>
<221>misc_feature
<222>(483)..(488)
<223>XhoI限制性位点
<400>6
ctcgagcttc gttgaacaac ggaaactcga cttgccttcc gcacaataca tcatttcttc     60
ttagcttttt ttcttcttct tcgttcatac agtttttttt tgtttatcag cttacatttt    120
cttgaaccgt agctttcgtt ttcttctttt taactttcca ttcggagttt ttgtatcttg    180
tttcatagtt tgtcccagga ttagaatgat taggcatcga accttcaaga atttgattga    240
ataaaacatc ttcattctta agatatgaag ataatcttca aaaggcccct gggaatctga    300
aagaagagaa gcaggcccat ttatatggga aagaacaata gtatttctta tataggccca    360
tttaagttga aaacaatctt caaaagtccc acatcgctta gataagaaaa cgaagctgag    420
tttatataca gctagagtcg aagtagtgat tgtcccttcg gggacatccg atcgtttttt    480
ttctcgag                                                             488
<210>7
<211>405
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>水稻(0ryza sativa Indica IR36)的U3 snRNA的启动子序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(6)
<223>EcoRI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(384)
<223>Pol III启动子区域
<220>
<221>misc_feature
<222>(385)..(390)
<223>PvuI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(391)..(399)
<223>poly T片段
<220>
<221>misc_feature
<222>(400)..(405)
<223>EcoRI限制性位点
<400>7
gaattcaagg gatctttaaa catacgaaca gatcacttaa agttcttctg aagcaactta     60
aagttatcag gcatgcatgg atcttggagg aatcagatgt gcagtcaggg accatagcac    120
aggacaggcg tcttctactg gtgctaccag caaatgctgg aagccgggaa cactgggtac    180
gttggaaacc acgtgatgtg gagtaagata aactgtagga gaaaagcatt tcgtagtggg    240
ccatgaagcc tttcaggaca tgtattgcag tatgggccgg cccattacgc aattggacga    300
caacaaagac tagtattagt accacctcgg ctatccacat agatcaaagc tggtttaaaa    360
gagttgtgca gatgatccgt ggcacgatcg tttttttttg aattc                    405
<210>8
<211>442
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>番茄(具有小葫芦形黄色果实的园艺品种)U3 snRNA的启动子序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(6)
<223>EcoRI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(421)
<223>Pol III启动子区域
<220>
<221>misc_feature
<222>(422)..(427)
<223>PvuI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(428)..(436)
<223>Poly T片段
<220>
<221>misc_feature
<222>(437)..(442)
<223>EcoRI限制性位点
<400>8
gaattctgag agcattgtgt ggcgttcctc tgaattactt actgtcactt tgattggagc    60
cattattttc agactctact gaagattgaa ttgaatgaga aactatgaaa ctttacaagt    120
gaattattat ggagttcatg gcaactgcta tggagttttt cctactggga attggaacgg    180
tttctacgaa attaactgtc cacacgttaa aaatataaat taatgcgtaa ttgttatttt    240
ttctataaca aataaaaaac tgaaatacga cataaatttt attactttaa ttgcacttta    300
gccttagaga tattgcgttg tagtcggcgt aggtgtgtca ggggccaata tattgttccc    360
acatcggcag tgcagcacat aaactctagc gttataagaa tctatccact atcaacggtc    420
acgatcgttt ttttttgaat tc                                             442
<210>9
<211>295
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于GUS基因沉默表达的94bp的dsRNA编码区域序列(GUShp94)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(6)
<223>SalI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(11)
<223>PvuI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(100)
<223>GUS序列(有义)
<220>
<221>misc_feature
<222>(101)..(195)
<223>间隔物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(190)..(195)
<223>BamHI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(196)..(284)
<223>GUS序列(反义)
<220>
<221>misc_feature
<222>(285)..(290)
<223>PvuI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(290)..(295)
<223>SalI限制性位点
<400>9
gtcgacgatc gcagcgtaat gctctacacc acgccgaaca cctgggtgga cgatatcacc     60
gtggtgacgc atgtcgcgca agactgtaac cacgcgtctg ttgactggca ggtggtggcc    120
aatggtgatg tcagcgttga actgcgtgat gcggatcaac aggtggttgc aactggacaa    180
ggcactagcg ggatccagac gcgtggttac agtcttgcgc gacatgcgtc accacggtga    240
tatcgtccac ccaggtgttc ggcgtggtgt agagcattac gctgcgatcg tcgac         295
<210>10
<211>93
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于GUS基因沉默表达的41bp的dsRNA编码区域序列(GUShp41)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(6)
<223>SalI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(42)
<223>GUS序列(有义)
<220>
<221>misc_feature
<222>(43)..(51)
<223>间隔物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(52)..(87)
<223>GUS序列(反义)
<220>
<221>misc_feature
<222>(88)..(93)
<223>Sal I限制性位点
<400>10
gtcgactggg cagatgaaca tggcatcgtg gtgattgatg aatgcgagaa cttcatcaat    60
caccacgatg ccatgttcat ctgcccagtc gac                                 93
<210>11
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于GUS基因沉默表达的21bp的dsRNA编码区序列(GUShp21)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(6)
<223>SalI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(22)
<223>GUS序列(有义)
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(28)
<223>间隔物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(44)
<223>GUS序列(反义)
<220>
<221>misc_feature
<222>(45)..(50)
<223>Sal I限制性位点
<400>11
gtcgactggg cagatgaaca tgtacgatca tgttcatctg cccagtcgac               50
<210>12
<211>94
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PHYB基因沉默表达的42bp的dsRNA编码区序列，来自PHYB(PHYB5hp42)-upper链5’末端
<400>12
tcgacggagt cgggggtagt ggcggtggcc gtggcggtgg ccgtggagga ggccacggcc    60
accgccacgg ccaccgccac tacccccgac tccg                                94
<210>13
<211>94
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PHYB基因沉默表达的42bp的dsRNA编码区序列，来自PHYB(PHYB5hp42)-upper链5’末端
<400>13
tcgacggagt cgggggtagt ggcggtggcc gtggcggtgg ccgtggcctc ctccacggcc    60
accgccacgg ccaccgccac tacccccgac tccg                                94
<210>14
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PHYB基因沉默表达的21bp的dsRNA编码区序列，来自PHYB(PHYB5hp21)-upper链5’末端
<400>14
tcgacggagt cgggggtagt ggcggaggag gccgccacta cccccgactc cg              52
<210>15
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PHYB基因沉默表达的21bp的dsRNA编码区序列，来自PHYB(PHYBChp21)-lower链5’末端
<400>15
tcgacggagt cgggggtagt ggcggcctcc tccgccacta cccccgactc cg              52
<210>16
<211>94
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PHYB基因沉默表达的42bp的dsRNA编码区序列，来自PHYB(PHYBChp42)-upper链中部
<400>16
tcgatggatg gtgtggttca gccatgtagg gatatggcgg gggaacagga gggttccccc      60
gccatatccc tacatggctg aaccacacca tcca                                  94
<210>17
<211>94
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PHYB基因沉默表达的42bp的dsRNA编码区序列，来自PHYB(PHYBChp42)-lower链的中部
<400>17
tcgatggatg gtgtggttca gccatgtagg gatatggcgg gggaaccctc ctgttccccc    60
gccatatccc tacatggctg aaccacacca tcca                                94
<210>18
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PHYB基因沉默表达的21bp的dsRNA编码区序列，来自PHYB(PHYBChp21)-upper链中部
<400>18
tcgatggatg gtgtggttca gccataggag gatggctgaa ccacacctcc aa            52
<210>19
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PHYB基因沉默表达的21bp的dsRNA编码区序列，来自PHYB(PHYBChp21)-lower链中部
<400>19
tcgatggatg gtgtggttca gccatcctcc tatggctgaa ccacaccatc ca              52
<210>20
<211>94
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PHYB基因沉默表达的42bp的dsRNA编码区序列，来自PHYB(PHYB3hp42)-upper链的3’端
<400>20
tcgacattgt caactgctag tggaagtggt gacatgatgc tgatgaagga ggtcatcagc      60
atcatgtcac cacttccact agcagttgac aatg                                  94
<210>21
<211>94
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PHYB基因沉默表达的42bp的dsRNA编码区序列，来自PHYB(PHYB3hp42)-lower链的3’端
<400>21
tcgacattgt caactgctag tggaagtggt gacatgatgc tgatgacctc cttcatcagc    60
atcatgtcac cacttccact agcagttgac aatg                                94
<210>22
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PHYB基因沉默表达的21bp的dsRNA编码区序列，来自PHYB(PHYB3hp21)-upper链的3’端
<400>22
tcgacattgt caactgctag tggaaaggag gttccactag cagttgacaa tg              52
<210>23
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PHYB基因沉默表达的21bp的dsRNA编码区序列，来自PHYB(PHYB3hp21)-lower链的3’端
<400>23
tcgacattgt caactgctag tggaacctcc tttccactag cagttgacaa tg              52
<210>24
<211>94
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PDS基因(PDS42)沉默表达的42bp的dsRNA编码序列-upper链
<400>24
tcgacttaac ttgtaaggaa tattacgatc ctaaccggtc aatgctagga ggagcattga    60
ccggttagga tcgtaatatt ccttacaagt taag                                94
<210>25
<211>94
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PDS基因(PDS42)沉默表达的42bp的dsRNA编码序列-lower链
<400>25
tcgacttaac ttgtaaggaa tattacgatc ctaaccggtc aatgctcctc ctagcattga    60
ccggttagga tcgtaatatt ccttacaagt taag                                94
<210>26
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PDS基因(PDS21)沉默表达的21bp的dsRNA编码区序列-upper链
<400>26
tcgacttaac ttgtaaggaa tattaaggag gtaatattcc ttacaagtta ag              52
<210>27
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PDS基因(PDS21)沉默表达的21bp的dsRNA编码区序列-lower链
<400>27
tcgacttaac ttgtaaggaa tattacctcc ttaatattcc ttacaagtta ag             52
<210>28
<211>115
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>小发夹RNA编码区(GUS_A)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(11)
<223>SalI/PvuI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(53)
<223>有义RNA编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(54)..(62)
<223>环结构
<220>
<221>misc_feature
<222>(63)..(104)
<223>反义RNA编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(105)..(115)
<223>SalI/PvuI限制性位点
<400>28
gtcgacgatc gtgcggtcac tcattacggc aaagtgtggg tcaataatca ggagttcctt     60
cttcctgatt attgacccac actttgccgt aatgagtgac cgcagtcgac gatcg         115
<210>29
<211>112
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>小发夹RNA编码区(GUS_B)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(8)
<223>SalI/PvuI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(50)
<223>有义RNA编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(51)..(59)
<223>环结构
<220>
<221>misc_feature
<222>(60)..(101)
<223>反义RNA编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(102)..(112)
<223>SalI/pvuI限制性位点
<400>29
gtcgacgatc gtcatgaaga tgcggacttg cgtggcaaag gattcgataa gttccttctt  60
tatcgaatcc tttgccacgc aagtccgcat cttcatgacg agtcgacgat cg         112
<210>30
<211>115
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>小发夹RNA编码区(GUS_C)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(11)
<223>SalI/PvuI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(53)
<223>有义RNA编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(54)..(62)
<223>环结构
<220>
<221>misc_feature
<222>(63)..(104)
<223>反义RNA编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(105)..(115)
<223>SalI/PvuI限制性位点
<400>30
gtcgacgatc gtgcgacctc gcaaggcata ttgcgcgttg gcggtaacaa gaagttcctt  60
ctttcttgtt accgccaacg cgcaatatgc cttgcgaggt cgcagtcgac gatcg      115
<210>31
<211>115
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>小发夹RNA编码区(EIN_A)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(11)
<223>SalI/PvuI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(53)
<223>有义RNA编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(54)..(62)
<223>环结构
<220>
<221>misc_feature
<222>(63)..(104)
<223>反义RNA编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(105)..(115)
<223>SalI/PvuI限制性位点
<400>31
gtcgacgatc gcatcttatg ccaatatgtt gcagctcgca taagcgttgt gacgttcctt    60
ctgtcacaac gcttatgcga gctgcaacat attggcataa gatggtcgac gatcg        115
<210>32
<211>112
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>小发夹RNA编码区(EIN_B)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(8)
<223>SalI/PvuI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(50)
<223>有义RNA编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(51)..(59)
<223>环结构
<220>
<221>misc_feature
<222>(60)..(101)
<223>反义RNA编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(102)..(112)
<223>SalI/PvuI限制性位点
<400>32
gtcgacgatc ggcaggcctg gtattacttc tctatgtttc tggcgtcttg gttccttctc    60
aagacgccag aaacatagag aagtaatacc aggcctgccg agtcgacgat cg           112
<210>33
<211>115
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>小发夹RNA编码区(EIN_C)
<220>
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<222>(1)..(11)
<223>SalI/PvuI限制性位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(53)
<223>有义RNA编码区
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<222>(54)..(62)
<223>环结构
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<222>(63)..(104)
<223>反义RNA编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(105)..(115)
<223>SalI/PvuI限制性位点
<400>33
gtcgacgatc gcatagctgt ttcctgtgtg aaattggtat ccgctcacaa ttcgttcctt    60
ctgaattgtg agcggatacc aatttcacac aggaaacagc tatggtcgac gatcg        115

Claims (12)

1.用于在植物细胞中降低目的基因表达的方法，其包括下列步骤：
(a)给所述植物细胞提供嵌合基因，所述嵌合基因包括下列有效连接的DNA片段：
i)启动子，所述启动子是由所述植物细胞的DNA依赖性RNA聚合酶III识别的启动子，其特征在于所述启动子是包含与所述DNA依赖性RNA聚合酶III相互作用的所有顺式作用启动子元件的III型启动子；
ii)DNA片段，当所述DNA片段转录时，产生RNA分子，所述RNA分子包含有义和反义核苷酸序列，
(1)所述有义核苷酸序列包含与转录自所述目的基因的RNA的大约19个连续核苷酸序列的核苷酸序列大约有90到100％序列一致性的大约19个连续核苷酸；
(2)所述反义核苷酸序列包含与所述有义序列的大约19个连续核苷酸序列的核苷酸序列的互补序列有大约90到100％序列一致性的大约19个连续核苷酸；
其中所述有义和反义核苷酸序列能形成大约19-200个核苷酸长度的双链RNA；和
iii)寡聚dT片段，所述寡聚dT片段含有至少4个连续T残基；并且
(b)鉴定植物细胞，所述植物细胞中目的基因的表达与不包含所述嵌合基因的植物细胞中目的基因的表达相比被降低。
2.权利要求1的方法，其中所述启动子是选自编码U6s nRNA的植物基因的启动子、编码U3snRNA的植物基因的启动子或编码7SL RNA的植物基因的启动子的3型POLIII启动子。
3.权利要求1或2的方法，其中所述启动子包含选自下列的核苷酸序列：SEQ ID Nr1的从位点7的核苷酸到位点322的核苷酸、
SEQ ID Nr2的从位点7的核苷酸到位点408的核苷酸、
SEQ ID Nr3的从位点7的核苷酸到位点313的核苷酸、
SEQ ID Nr4的从位点7的核苷酸到位点446的核苷酸、
SEQ ID Nr5的从位点7的核苷酸到位点436的核苷酸、
SEQ ID Nr6的从位点7的核苷酸到位点468的核苷酸、
SEQ ID Nr7的从位点7的核苷酸到位点384的核苷酸、或
SEQ ID Nr8的从位点7的核苷酸到位点421的核苷酸。
4.权利要求1到3中任一项的方法，其中所述植物细胞是双子叶植物细胞并且所述启动子来源于双子叶或单子叶植物或植物细胞。
5.权利要求1到3中任一项的方法，其中所述植物细胞是单子叶植物细胞并且所述启动子来源于单子叶植物或植物细胞。
6.权利要求1到3中任一项的方法，其中所述启动子对所述植物细胞而言是内源的。
7.权利要求1到6中任一项的方法，其中所述目的基因是转基因。
8.权利要求1到6中任一项的方法，其中所述目的基因是内源基因。
9.权利要求1到8中任一项的方法，其中所述植物细胞包含于植物中。
10.描述于权利要求1到9中任一项的嵌合基因。
11.包含权利要求10的嵌合基因的植物细胞。
12.一种植物，所述植物在其植物细胞内包含权利要求10的嵌合基因。
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