CN1867672A - 改良的siRNA分子和应用该改良的siRNA分子的抑制基因表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及为调控siRNA对基因表达的抑制效果而对其进行改造所得的双链RNA分子。本发明的双链RNA分子是可通过RNAi抑制细胞内靶基因表达的双链RNA分子,自其双链RNA部分的正链3’末端或5’末端依次有一个以上核苷酸是与反义链不互补的核苷酸。在本发明的双链RNA分子中,其双链部分的正义链中与反义链不互补的核苷酸的数目是能够使双链在上述细胞内杂交的数目。
Description
技术领域
本发明涉及RNAi现象引起的基因沉默,更具体而言,涉及经过改良的siRNA和使用其的基因表达抑制方法。
背景技术
RNAi(RNA干扰)是由双链RNA(dsRNA)诱导的序列特异性基因转录后抑制机制。该现象已在苍蝇、昆虫、原生动物、脊椎动物、高等植物等多种物种观察到。有关RNAi在分子水平上的作用机制,根据对果蝇(Drosophila)和线虫(Caenorhabditis elegans)的多项研究表明,被称为siRNA(短链干扰RNA)的21-25个核苷酸长的RNA片段是RNAi所必须的序列特异性中介体(Hammond,S.M.等人,Nature404,293-296,2000;Parrish,S.等人,Mol.Cell.6,1077-1087,2000;Zamore,P.D.等人,Cell 101,25-33,2000),并且该siRNA是由长的双链RNA在RNase III样核酸酶Dicer的作用下生成(Brenstein,E.等人,Nature 409,363-366,2001;Elbashir,S.M.等人,Genes Dev.15,188-200,2001)。
起初认为,对于哺乳动物而言,RNAi现象仅存在于卵母细胞和着床前的胚。哺乳动物细胞一般具有作为序列非特异性RNase的Rnase L介导的快速且非特异性RNA分解途径、干扰素诱导的双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)介导的快速翻译阻断途径,这些都是由30个核苷酸以上的双链RNA激活。因而,在除未分化细胞和PKR缺失的分化细胞以外的哺乳动物细胞中,常常存在序列特异性RNAi活性因上述对30个核苷酸以上的双链RNA的应答而被掩盖的现象。最近,据报道,合成的具有21个核苷酸的siRNA的二聚体可在哺乳动物细胞培养基中特异性阻断内源性基因的表达(Elbashir,S.M.等人,Nature 411,494-498,2001)。
RNAi介导的基因表达抑制的原理一般认为如下。首先,当siRNA被导入细胞时,其和多蛋白复合体结合,形成RISC(RNA诱导型沉默复合体)。接着,该RISC结合于靶基因的mRNA,再在其核酸酶的作用下,切断mRNA中与siRNA结合的部分。由此,靶基因的蛋白质表达被阻断。
最近,利用将合成的siRNA导入细胞产生的RNAi现象的方法,作为基因表达的抑制方法,被广泛关注和应用。siRNA的构成和基因表达抑制效果之间的关系也作为研究的对象。
例如,Hohjoh H.在报告(Hohjoh H.,FEBS Letters 521,195-199,2002)中,针对对应于萤火虫荧光素酶(Photinus luciferase)基因的各种双链寡核苷酸,研究了它们对该基因在哺乳动物细胞中的表达抑制效果。据该报告所记载:正义链和反义链3’末端的2个核糖核苷酸突出端,反义链的结构很重要,并且,基因表达的抑制效果会因对象基因的靶序列的不同而有所差异。
Hamada M.等人的报告(Hamada M.等人,Antisense Nucleic AcidDrug Dev.12,301-309,2002)中,采用在正义链和/或反义链各自3’末端以外的部分中一个以上不连续位点引入了与靶序列错配的核苷酸的siRNA,研究其对靶基因的表达抑制效果。据该报告记载,基因表达抑制效果因反义链中存在的与靶序列的错配而降低,然而另一方面,正义链中的错配对基因表达抑制效果没有影响。
发明内容
本发明人发现,针对siRNA,通过在其正义链的双链部分的3’末端的几个核苷酸位点,导入与反义链的错配,该siRNA对基因表达抑制效果得到增强。进而,本发明人发现,siRNA中通过在其正义链的双链部分的5’末端的几个核苷酸位点,导入与反义链的错配,该siRNA的基因表达抑制效果被降低。本发明是基于这些发现而完成的。
因而,本发明的目的在于,提供为调控siRNA对基因表达的抑制效果而对其改良所得的双链RNA分子,以及使用该改良后的siRNA的基因表达抑制方法。
根据本发明的第一个方面的双链RNA分子是能够通过RNAi作用抑制细胞内靶基因的表达的双链RNA分子,其双链部分中正义链的3’末端依次有1个以上的核苷酸是与反义链不互补的核苷酸,且其双链部分的正义链中与反义链互补的核苷酸的数目是能够使双链在上述细胞内杂交的数目。
进而,根据本发明的第二个方面的双链RNA分子是能够通过RNAi作用抑制细胞内靶基因的表达的双链RNA分子,其该双链部分的正义链的5’末端依次有1个以上的核苷酸是与反义链不互补的核苷酸,且该双链部分的正义链中与反义链互补的核苷酸的数目是能够使双链在上述细胞内杂交的数目。
进而,本发明的基因表达抑制方法是包含将本发明的双链RNA分子导入细胞的步骤的抑制细胞内靶基因的表达的方法。
在利用RNAi现象抑制靶基因表达的方法中,基于本发明,可实现对靶基因表达抑制效率的调控。
附图说明
图1表示的是各种siRNA对HeLa细胞中的萤火虫荧光素酶基因的表达的抑制效果的双荧光素酶基因检测结果的示意图。
图2是各种siRNA基因对HeLa细胞内的内源性基因的表达抑制效果的示意图。
图3是在正义链3’末端含有错配的siRNA分子(La21-3’m2)和不含错配的siRNA分子(La21-conv.)对两种质粒的报告基因的表达水平的影响的棒状示意图。
具体实施方式
本说明书中,“双链RNA”指的是两条单RNA分子全部或部分杂交所得的RNA分子。构成各单链RNA的核苷酸数目可以不同。此外,构成双链RNA的一条或者两条核苷酸链也可包含单链部分(突出端)。
本说明书中,“双链部分”指的是,在双链RNA中,两条链中核苷酸配对的部分,即,除双链RNA的单链部分以外的部分。
本说明书中,“正义链”指的是,具有和基因编码链相同的序列的核苷酸链,“反义链”指的是,具有与基因编码链互补的序列的核苷酸链。
本说明书中,“互补”指的是,两个核苷酸在杂交条件下能够配对,例如,腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)之间的关系,以及胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)之间的关系。
能够通过RNAi抑制细胞内靶基因表达的双链RNA分子,本领域的技术人员可基于有关RNAi的现有知识很容易地设计。一般来说,首先,在靶基因中选择其基因特异性区域,将在细胞内能够和该区域特异性杂交的核糖核苷酸链作为上述双链RNA分子的反义链。此处,“特异性区域”指的是,在能够实施靶基因的表达抑制的细胞内,具有其它核酸分子所不具有的序列的区域。此外,“能够特异性杂交”指的是,该反义链在能够实施靶基因的表达抑制的细胞内,和除靶基因及其转录产物以外的核酸分子不能杂交。上述反义链含有与上述特异性区域相对应的序列,但并不需要具有上述特异性区域的完全互补序列,只要是能够和该特异性区域特异性杂交,即使含有非互补核苷酸也可以。然而,上述反义链优选具有完全互补序列。双链RNA分子的正义链含有与反义链完全互补的序列。
从靶基因中选出的上述特异区域,优选仅选自靶基因的外显子。此外,上述特异性区域一般优选选自除5’末端和3’末端非翻译区(UTR)和翻译起始密码子周围以外的部分,例如,在包含外显子和内含子两者的序列中,优选距离翻译起始密码子3’侧50个核苷酸以上的区域,更优选距翻译起始密码子3’侧75个核苷酸以上的区域,尤其优选距离100个核苷酸以上的区域。上述特异性区域的长度没有特殊限制,但优选是15个核苷酸以上,更优选是17个核苷酸以上,进而优选是19个核苷酸以上,尤其优选是19-23个核苷酸,更加优选是19-21个核苷酸。
上述双链RNA分子的反义链,可以在与正义链的核苷酸互补配对而成的双链部分的3’末端侧含有单链部分(突出端)。该单链部分的核苷酸序列,可以是靶基因的关联序列,也可以是与靶基因不相关的序列,其长度也没有特殊限制,优选2个核苷酸长度的序列,更优选是2个尿残基(UU)。正义链也可以具有类似突出端。
根据本发明第一个方面的双链RNA分子是在上述那样的双链RNA分子中,其自双链部分中的正义链3’末端依次有1个以上核苷酸是与反义链不互补的核苷酸的双链RNA分子。即,根据本发明的第一个方面的双链RNA分子的正义链在自其双链部分的3’末端依次有1个以上与反义链错配的核苷酸。由此,靶基因的表达抑制效果得到增强。但是,由于该正义链和反义链须在细胞内保持双链状态,因而错配的核苷酸数目取决于为保持双链状态所必需的与反义链互补的核苷酸数目。因而,在根据本发明的第一个方面的双链RNA分子中,其双链部分的正义链中与反义链互补的核苷酸数是可在细胞内进行双链杂交的数目。
双链核糖核苷酸链在细胞内杂交与否,本领域技术人员能够很容易研究。例如,可以将目的细胞内的杂交条件在体外(in vitro)再现,在其中添加两条核糖核苷酸链,观察它们是否杂交。
根据本发明的优选实施方式,在根据本发明的第一个方面的双链RNA分子中,自双链部分的正义链的3’末端依次与反义链不互补的核苷酸的数目为1-4个,更优选为2个。
为更好地抑制细胞内靶基因的表达,除上述正义链的3’末端的错配外,在位于其3’末端的第11-13个核苷酸位点再引入一个核苷酸错配是有好处的。因而,基于本发明的优选实施方式,根据本发明的第一个方面的双链RNA分子优选在位于双链部分的正义链3’末端第11-13位,更加优选第12位有一个核苷酸是与反义链不互补的核苷酸。
经应用下述DNA分子的实验数据证实,在双链部分的正义链的3’末端第11-13位有一个错配核苷酸的双链RNA分子在增强基因表达抑制效果方面是有利的,上述实验使用的双链RNA分子是在19-20个核苷酸长度的正义链的3’末端的2个核苷酸位点以及其3’末端起的第12位核苷酸引入错配的RNA分子。于是,该错配位点邻近RISC对靶基因转录产物的切断位点。因而,在根据本发明的第一个方面的双链RNA分子中,除正义链的双链部分3’末端的错配外,也可以在正义链上其它特定位点的5’侧或3’侧第1-3个核苷酸位点处导入其它的错配,上述特定位点指的是对应于RISC对靶基因转录产物的切断位点的位点。RISC对靶基因转录产物的切断位点,依据双链RNA分子中所含的靶基因特异性区域的序列,本领域技术人员能够很容易地确定,其典型地位于前述特异性区域的中心部分。
根据本发明的优选实施方式,在根据本发明的第一个方面的双链RNA分子中,除正义链的双链部分3’末端的错配外引入的其它错配,当正义链的双链部分由奇数个核苷酸构成时,在位于中心的核苷酸5’侧第1-3个核苷酸的位置,优选第2个核苷酸处引入;当正义链的双链部分由偶数个核苷酸构成时,其在中心3’侧核苷酸的5’侧的第1-3个核苷酸,优选第2个核苷酸处引入。
根据本发明第二个方面的双链RNA分子是通过RNAi作用能够抑制细胞内靶基因表达的双链RNA分子,自其双链部分的正义链的5’末端依次有一个以上的核苷酸是与反义链不互补的核苷酸。即,根据本发明第二个方面的双链RNA分子的正义链,自其双链部分的5’末端依次有一个以上与反义链的错配。由此,靶基因表达的抑制效果被降低。然而,由于需保持该正义链和反义链在细胞内的双链状态,因而错配的核苷酸数取决于保持双链状态所必需的与反义链互补的核苷酸数。因此,在根据本发明的第二个方面的双链RNA分子中,其双链部分的正义链中与反义链互补的核苷酸数是可在细胞内进行双链杂交反应的数目。
根据本发明的优选实施方式,在根据本发明的第二个方面的双链RNA分子中,自双链部分的正义链的5’末端依次与反义链不互补的核苷酸的数目优选为1-4个,更优选为2个。
根据本发明的第二个方面的双链RNA分子,也可含有根据第一个方面的双链RNA分子的正义链上的一部分或全部错配。由此,可对靶基因的表达抑制效果进行更为精细的调控。
已经知道,当在哺乳动物细胞内导入长的双链RNA分子时,双链RNA依赖性蛋白酶、2’,5’-寡聚腺苷酸合成酶被诱导,进而和细胞死亡相关。因而,根据本发明的双链RNA分子,优选为在哺乳动物细胞内不诱导双链RNA依赖性蛋白酶和2’,5’-寡聚腺苷酸合成酶的双链RNA分子。满足该条件的双链RNA分子的链长,对本领域技术人员而言,是很容易知道的。已知上述细胞死亡一般是由30个核苷酸以上的双链RNA分子引起的,因而,由本发明的双链RNA分子优选具有29个或以下,更优选25个或以下核苷酸链长的RNA分子。此处使用的“链长”指的是不仅包括双链RNA分子的双链部分,还包括单链部分在内的核苷酸长。
本发明的双链RNA分子,是能够依据RNAi作用调控基因表达的抑制效果的分子,这可由本说明书记载的实验数据得到验证。根据这些实验数据证实,siRNA中,当在正义链3’末端引入错配时,RNAi的基因表达抑制效果得到增强,反过来当在5’末端引入错配时,其效果被减弱。因此,这样的基因表达抑制效果的调控是通过调控siRNA整合入RNA诱导型沉默复合体(RISC)时的方向性来实现的。即,当引入到siRNA的任意末端的错配将该端部的杂交解除时,siRNA就从该端部开始整合到RISC中,此时,构成siRNA的两条链中,从5’末端整合的链就作为RNAi的中介体(真正的反义链)发挥作用。因而,在针对作为表达抑制对象的靶基因设计的siRNA中,通过对该siRNA进行改造使得从其反义链5’末端整合入RISC,能够增强靶基因的表达抑制效果,另一方面,通过对该siRNA进行改造使得从其正义链5’末端整合入RISC,能够降低靶基因的表达抑制效果。
因而,根据本发明,提供通过RNAi作用能够抑制细胞内靶基因表达的双链RNA分子,所述RNA分子经改造使其从反义链5’末端侧整合到RNA诱导型沉默复合体中。这种改造的具体例子与上述针对根据本发明的第一个方面的RNA分子所述一致。通过这种改造,靶基因的表达抑制效果得到增强。
进而,根据本发明,提供通过RNAi作用能够抑制细胞内靶基因表达的双链RNA分子,所述RNA分子经改造使其从正义链5’末端侧整合到RNA诱导型沉默复合体中。这种改造的具体例子与上述针对根据本发明的第二个方面的RNA分子所述一致。通过这种改造,靶基因的表达抑制效果被减弱。
根据本发明的双链RNA分子,可在细胞内抑制靶基因的表达。因而,根据本发明,提供包含将本发明的双链RNA分子导入细胞内的步骤的抑制细胞内靶基因表达的方法。
细胞只要是可通过siRNA诱导的RNAi现象的细胞就可以,例如可以举出来自于昆虫、线虫、植物、哺乳动物等的细胞,优选哺乳动物细胞。作为植物来源的细胞,例如可以举出,西红柿、烟草、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、稻等植物来源的细胞。作为动物来源的细胞,例如可举出,HeLa细胞、NIH/3T3细胞、COS-7细胞、293细胞等。
将本发明的双链RNA分子导入细胞的方法,只要是能将双链RNA分子导入细胞中的方法就可以,没有特殊限制。在根据本发明的方法中,尤其优选的将双链RNA分子向细胞内导入的方法是,使用脂质体,优选阳离子脂质体的转染法,可使用Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen公司生产)、Oligofectamin转染试剂(Invitrogen公司生产)、jetSI转染试剂(Polyplus-transfection公司生产)、TransMessenger(Qiagen公司生产)等市售转染试剂,容易地进行。
或者,在利用本发明的双链RNA分子抑制靶基因表达时,也可通过将在细胞中表达本发明的双链RNA分子的载体导入目的细胞中来实施。在该方法中,可以使用分别表达本发明的双链RNA分子的正义链和反义链的2种载体,也可使用同时含有编码本发明的双链RNA分子的正义链和反义链的DNA的载体。因而,根据本发明的其它实施方式,提供抑制细胞内靶基因表达的方法,该方法包括将含有下述DNA的载体导入细胞的步骤,所述载体是含有编码本发明的双链RNA分子的正义链的DNA的载体和含有编码本发明双链RNA分子的反义链的DNA的载体的混合物,或者是同时含有编码本发明的双链RNA分子的正义链和反义链的DNA的载体。
上述载体只要能够在细胞内表达本发明的双链RNA分子的一条链或两条链就可以。因而,上述载体中编码双链RNA分子的链的DNA是以该DNA能够在细胞内进行转录的形式存在。这种载体,本领域的技术人员很容易就能构建,例如,根据需要,可将启动子、终止子等要素以能够发挥作用的形式进行连接。作为启动子,只要是能够在目的细胞内发挥作用即可,例如可使用组成型启动子、诱导型启动子等。此外,也可使用和控制靶基因表达的启动子一样的启动子。由此,在靶基因的转录产物生成的同时,可产生用于分解该转录产物的本发明的RNA分子。本领域技术人员根据本领域已知方法,就能够很好地将构建的载体导入目的细胞中。
尤其优选使用一种能够表达本发明的双链RNA分子的两条链的载体。这种载体可以是分别表达双链RNA分子的两条链的载体,也可以是表达两条链通过连接序列连接的发夹型双链RNA的载体。将本发明的双链RNA分子以发夹型双链RNA的形式表达的载体,对于本领域技术人员而言,是能够适当构建的,例如可依据文献记载(Bass,B.L.,Cell 101,235-238,2000;Tavernarakis,N.等人,Nat.Genet.24,180-183,2000;Malagon,E.等人,Mol.Gen.Genet.259,639-644,1998;Parrish,S.等人,Mol.Cell 6,1077-1087,2000)。
本发明的双链RNA分子,以及利用所述双链RNA分子的基因表达抑制方法,可将各种基因作为靶标,例如,可将在细胞内的功能有待解析的基因作为靶标。此外,通过将癌基因、病毒基因等作为表达抑制的靶基因,可阐明这些基因的功能,进而,通过抑制这些基因在生物活体内存活细胞中的表达,也有可能治疗疾病或紊乱。
实施例
例1:各种siRNA在HeLa细胞中对萤火虫荧光素酶基因表达的抑制作用
设计针对萤火虫荧光素酶基因的常规的siRNA,和在正义链多个位点引入了与反义链的错配的siRNA,考察它们对萤火虫荧光素酶基因的表达抑制效果。
设计的各种siRNA的核苷酸序列示于下表1。表1中,以各siRNA的正义链在上,反义链在下进行排列,互补核苷酸在双链间用星号“*”表示。此外,就各siRNA的名称而言,“La2”和“La21”表示萤火虫荧光素酶基因中的靶序列,根据该基因导入细胞时使用的表达载体pGL3-control(Promega公司生产)的编号体系,“La2”是以第282-300个核苷酸为靶标的序列,“La21”是以第340-358个核苷酸为靶标的序列。此外,“conv.”表示基于常规设计标准设计的siRNA,因而,它不含错配。“3’BL”表示其siRNA的正义链的3’末端不含突出部分(突出端)。
表1:针对萤火虫荧光素酶基因设计的siRNA
名称 | 序列 | 序列号 |
La2-conv.La2-3′m1La2-3′m2La2-3′m3La2-3′m4La2-5′m2La2-3′m2m12La2-3′BLLa21-conv.La21-3′m1La21-3′m2La21-3′m3La21-3′m4La21-5′m2La21-3′m2m12La21-3′BL | 5GGAAGACGCCAAAAACAUAUU3′*******************3UUCCUUCUGCGGUUUUUGUAU5′ 5GGAAGACGCCAAAAACAUU3′******************3UUCCUUCUGCGGUUUUUGUAU5′ 5GGAAGACGCCAAAAACAAU3′*****************3UUCCUUCUGCGGUUUUUGUAU5′ 5GGAAGACGCCAAAAACUAU3′****************3UUCCUUCUGCGGUUUUUGUAU5′ 5GGAAGACGCCAAAAAUUAU3′***************3UUCCUUCUGCGGUUUUUGUAU5′ 5UUAAGACGCCAAAAACAUAUU3′*****************3UUCCUUCUGCGGUUUUUGUAU5′ 5GGAAGACUCCAAAAACAAU3′****************3UUCCUUCUGCGGUUUUUGUAU5′ 5GGAAGACGCCAAAAACAUA3′*******************3UUCCUUCUGCGGUUUUUGUAU5′ 5ACCGCUGGAGAGCAACUGCUU3′*******************3UUUGGCGACCUCUCGUUGACG5′ 5ACCGCUGGAGAGCAACUGU3′******************3UUUGGCGACCUCUCGUUGACG5′ 5ACCGCUGGAGAGCAACUUU3′*****************3UUUGGCGACCUCUCGUUGACG5′ 5ACCGCUGGAGAGCAACAUU3′****************3UUUGGCGACCUCUCGUUGACG5′ 5ACCGCUGGAGAGCAAUAUU3′***************3UUUGGCGACCUCUCGUUGACG5′ 5UACGCUGGAGAGCAACUGCUU3′*****************3UUUGGCGACCUCUCGUUGACG5′ 5ACCGCUGUAGAGCAACUUU3′****************3UUUGGCGACCUCUCGUUGACG5′ 5ACCGCUGGAGAGCAACUGC3′*******************3UUUGGCGACCUCUCGUUGACG5′ | 123242526272822829101110121013101410291015103010 |
合成上述各寡核糖核苷酸对,分别添加到退火缓冲液(30mMHEPES,pH7.0,100mM醋酸钾,和10mM醋酸镁)中,终浓度为20μM,90℃、3分钟热变性后,37℃退火一天一夜。由此,得到各siRNA。
HeLa细胞,在补充有10%胎牛血清(Life Technologies公司生产)、100U/ml青霉素(Life Technologies公司生产)和100μg/ml链霉素(LifeTechnologies公司生产)的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(Sigma公司生产)中,于37℃、5%CO2环境中增殖。
转染前一天,以胰蛋白酶处理增殖后的HeLa细胞,再用不含抗生素的新鲜培养基稀释,接种于24孔培养板(0.5ml培养基中约有0.5×105个细胞/孔)。接着,以0.5ml OPT-MEMI(Life Technologies公司生产)替换培养基,并在各孔中添加0.25μg表达萤火虫荧光素酶的pGL3-control质粒(Promega公司生产)、表达海肾萤光素酶(Renillaluciferase)的对照用phRL-TK质粒(Promega公司生产)0.05μg、以及0.24μg各siRNA。采用Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen公司生产)进行2种报告质粒和各siRNA的共转染。
然后,将细胞于37℃孵育4小时,再添加不含抗生素的新鲜培养基0.5ml,再于37℃孵育。转染24小时后配制细胞裂解物,以Dual-Luciferase报告分析系统(Promega公司生产)进行荧光酶表达分析。
图1表示双荧光酶测试结果。图1显示了使用各siRNA时,靶(萤火虫)荧光酶活性与对照(海肾)荧光酶活性的比。该双荧光酶活性比,以使用不引起基因表达抑制的双链RNA(Mock)(Qiagen公司生产)的对照样品时得到的比值为1.0,进行标准化。各数据是至少4次独立实验的平均值,各数据所带的误差棒表示标准差。
根据图1a表明,La2-conv.表现出非常强的基因表达抑制作用,约为98%;而La21-conv.表现出的基因表达抑制作用为中等程度,约为50%。该La2-conv.和La21-conv.之间的基因表达抑制效果的差异被认为是因萤火虫荧光素酶基因中的靶序列上的差异所致。
图1b表示的是使用各种siRNA,以萤火虫荧光素酶基因中的La2为靶标时的基因表达抑制效果。将La2-conv.和La2-3’m1、La2-3’m2、La2-3’m3以及La2-3’m4比较后表明,通过在siRNA的正义链3’末端引入1-4个核苷酸错配,其对靶基因的表达抑制效果达到2-3倍。其中,在正义链3’末端有2个核苷酸错配的siRNA表现出很强的基因表达抑制,而除正义链3’末端的2个核苷酸错配外,还在正义链3’末端第12位核苷酸位点有错配的siRNA(La2-3’m2m12)表现出更为强的基因表达抑制效果。与此相反,在正义链5’末端具有2个核苷酸错配的siRNA(La2-5’m2)表现出比常规siRNA(La2-conv.)还要弱的基因表达抑制效果,这表明,在siRNA正义链5’末端引入错配会降低该siRNA对基因表达的抑制效果。
图1c表示的是使用各种siRNA,以萤火虫荧光素酶基因中的La21为靶标时的基因表达抑制效果。将La21-conv.和La21-3’m1、La21-3’m2、La21-3’m3以及La21-3’m4比较后表明,通过在siRNA的正义链3’末端引入1-4个核苷酸错配,其对靶基因的表达抑制效果达到2-3倍。其中,在正义链3’末端有2个核苷酸错配的siRNA表现出很强的基因表达抑制效果。除正义链3’末端的2个核苷酸错配外,还在正义链3’末端第12位核苷酸位点有错配的siRNA(La21-3’m2m12)表现出更强的基因表达抑制效果。与此相反,在正义链5’末端具有2个核苷酸错配的siRNA(La21-5’m2)表现出比常规siRNA(La21-conv.)还要弱的基因表达抑制效果,这表明,在siRNA正义链5’末端引入错配会降低该siRNA对基因表达的抑制效果。这些结果和上述使用以La2为靶标的各种siRNA的情况一致,因而表明,通过在siRNA的正义链的3’末端引入错配,和进而在3’末端第12位核苷酸引入错配所产生的基因表达抑制增强的效果并非依赖于基因中的靶序列位置、靶序列的核苷酸序列、针对该靶序列设计的不含错配的常规siRNA所产生的基因表达抑制效率等。
例2:各种siRNA对HeLa细胞中的LaminA/C基因和Dnmt1基因的表达抑制作用
分别针对HeLa细胞内表达的内源性LaminA/C基因和Dnmt1基因,设计对应于这些基因的常规的siRNA,和在正义链的各处引入了与反义链的错配的siRNA,考察这些siRNA对上述基因的表达抑制效果。
设计的各种siRNA的核苷酸序列示于表2。表2中,以各siRNA的正义链在上,反义链在下进行排列,互补核苷酸在双链间用星号“*”表示。此外,就各siRNA的名称而言,“Lam”和“Dn1”分别表示靶基因,即,LaminA/C基因和Dnmt1基因。根据以各基因的mRNA序列中翻译起始密码子的“A”为1的编号体系,“Lam”表示以LaminA/C基因的mRNA中的第829-851个核苷酸为靶标的基因,“Dn1(#1)”表示Dnmt1基因的mRNA中的第70-89个核苷酸为靶标的基因,“Dn1(#2)”表示Dnmt1基因的mRNA中的第185-203个核苷酸为靶标的基因。进而,“Nat.Lam”表示以LaminA/C基因为靶标的siRNA,其靶序列在文献中有记载(Elbrashir,S.M.等人,Nature 411:494-498,2001)。此外,“conv.”表示基于常规设计基准设计的siRNA,因而,它不含错配。
表2:针对LaminA/C基因和Dnmt1基因设计的siRNA。
名称 | 序列 | 序列号 |
Lam-conv.Lam-3′m2m12Nat.Lam-conv.Nat.Lam-3′m2m12Dn1(#1)-conv.Dn1(#1)-3′m2m12Dn1(#2)-conv.Dn1(#2)-3′m2m12 | 5UGCUGAGAGGAACAGCAACCU3′*******************3AGACGACUCUCCUUGUCGUUG5′ 5UGCUGAGUGGAACAGCAUU3′****************3AGACGACUCUCCUUGUCGUUG5′ 5CUGGACUUCCAGAAGAACAUU3′*******************3UUGACCUGAAGGUCUUCUUGU5′ 5CUGGACUACCAGAAGAAUU3′****************3UUGACCUGAAGGUCUUCUUGU5′ 5GUCCGCAGGCGGCUCAAAGAUU3′********************3′UUCAGGCGUCCGCCGAGUUUCU5′ 5GUCCGCAGUCGGCUCAAAUU*****************UUCAGGCGUCCGCCGAGUUUCU5′ 5GUGACUUGGAAACCAAAUUUU*******************UUCACUGAACCUUUGGUUUAA5′ 5GUGACUUUGAAACCAAAAA****************UUCACUGAACCUUUGGUUUAA5′ | 16171817192021202223242325262726 |
合成上述各寡核糖核苷酸对,分别添加到退火缓冲液(30mMHEPES,pH7.0,100mM醋酸钾,和10mM醋酸镁)中,终浓度为20μM,90℃、3分钟热变性后,37℃退火一天一夜。由此,得到各siRNA。
HeLa细胞,在补充有10%胎牛血清(Life Technologies公司生产)、100U/ml青霉素(Life Technologies公司生产)和100μg/ml链霉素(LifeTechnologies公司生产)的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(Sigma公司生产)中,于37℃、5%CO2环境中增殖。
以各种siRNA(100nM)转染HeLa细胞时,使用的是jetSI转染试剂(Polyplus-transfection公司生产)。
转染48小时后分离出总RNA,用逆转录酶合成cDNA。以该cDNA为模板,通过实时PCR,测定靶基因的表达水平。采用SYBR green PCR试剂盒(Molecular Probe公司生产)对这一系列表达水平进行测定。
图2表示的是各种siRNA对HeLa细胞中的内源性基因的表达抑制效果。图2显示了使用各siRNA时,靶基因(LaminA/C基因或Dnmt1基因)的表达水平与对照基因(G3PDH基因)的表达水平的比。该表达水平的比,以使用不引起基因表达抑制的双链RNA(Mock)(Qiagen公司生产)的对照样品时得到的比值为1.0,进行标准化。各数据是至少4次独立实验的平均值,各数据所带的误差棒表示标准差。
根据图2a和图2b表明,正义链3’末端具有2个错配,进而在正义链3’末端第12位核苷酸具有错配的siRNA,表现出比常规siRNA更强的基因表达抑制效果。
例3:构成siRNA的正义链3’末端的错配对RISC形成的影响
将siRNA导入细胞内时,其正义链和反义链的任意一方整合入RISC。据认为如此形成的RISC会切断与整合于其中的链所杂交的mRNA。因而认为,靶基因的表达抑制效果,因siRNA的正义链还是反义链易于整合到RISC中而不同。
本例中,通过在siRNA分子的正义链3’末端引入错配,考察整合到RISC内的链的选择性是否发生变化为目的,进行了以下实验。
首先,在海肾荧光酶基因的3’非翻译区分别插入萤火虫荧光酶基因的靶序列“La21”的正义链和反义链的对应序列,制备两种报告质粒。对照质粒采用表达β-半乳糖酶基因的质粒。siRNA分子(2聚体)使用上述表1所示La21-conv.(正义链3’末端没有错配)和La-3’m2(正义链3’末端含有两个错配)。
HeLa细胞,在补充有10%胎牛血清(Life Technologies公司生产)、100U/ml青霉素(Life Technologies公司生产)和100μg/ml链霉素(LifeTechnologies公司生产)的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(Sigma公司生产)中,于37℃、5%CO2环境中,生长增殖。
将任何一种上述报告质粒、任何一种上述siRNA分子和对照质粒共转染HeLa细胞。24小时后,测定荧光酶活性和β-半乳糖酶活性,将荧光酶活性测定值除以β-半乳糖酶活性测定值后的值,作为标准化后的报告基因的表达水平进行评估。
图3是表示在正义链3’末端含有错配的siRNA分子(La21-3’m2)或不含错配的siRNA分子(La21-conv.)作用下,2种质粒的报告基因的表达水平的棒图。图3中,“反义siRNA”的图表示的是靶序列的正义链重组到3’非翻译区的报告质粒的表达水平,因而,该表达水平受到以各siRNA分子的反义链为中介体的RNAi的抑制。另一方面,“正义siRNA”的图表示的是靶序列的反义链重组到3’非翻译区的报告质粒的表达水平,因而,该表达水平受到以各siRNA分子的正义链为中介体的RNAi的抑制。
根据图3可知,在使用正义链3’末端不含错配的常规类型的siRNA分子(La21-conv.)时,其正义链和反义链以几乎相同程度的比例作为RNAi的中介体发挥作用。另一方面可知,在使用正义链3’末端含有错配的siRNA分子(La21-3’m2)时,以其正义链作为中介体的RNAi活性几乎不被诱导,而以反义链为中介体的RNAi活性显著增强。该结果表明,通过在siRNA分子正义链3’末端引入错配,其反义链将优先作为RNAi中介体整合到RISC内。这提示,通过正义链3’末端的错配,siRNA分子将从其反义链5’末端侧整合到RISC内,其结果是,该反义链作为RNAi中介体发挥作用。
序列表
<110>Japan Health Sciences Foundation
<120>改良的siRNA分子和应用该siRNA分子的抑制基因表达的方法
<130>149555
<150>JP 2003-294504
<151>2003-08-18
<150>JP 2003-427970
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ggaagacgcc aaaaacauau u 21
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guugcuguuc cucucagcag a 21
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ugcugagugg aacagcauu 19
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cuggacuucc agaagaacau u 21
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uguucuucug gaaguccagu u 21
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cuggacuacc agaagaauu 19
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guccgcaggc ggcucaaaga uu 22
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ucuuugagcc gccugcggac uu 22
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guccgcaguc ggcucaaauu 20
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aauuugguuu ccaagucacu u 21
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gugacuuuga aaccaaaaa 19
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accgcuggag agcaacugc 19
Claims (30)
1.一种可通过RNAi抑制细胞内靶基因表达的双链RNA分子,其自双链部分的正义链3’末端依次有一个以上的核苷酸是与反义链不互补的核苷酸,并且其双链部分的正义链中与反义链互补的核苷酸的数目是能够使双链在上述细胞内杂交的数目。
2.根据权利要求1所述双链RNA分子,其中,自双链部分的正义链3’末端依次与反义链不互补的核苷酸的数目为1-4个。
3.根据权利要求1所述双链RNA分子,其中,自双链部分的正义链3’末端依次与反义链不互补的核苷酸的数目为2个。
4.根据权利要求1所述双链RNA分子,其中,在双链部分的正义链3’末端第11-13位的核苷酸中还有一个核苷酸是与反义链不互补的核苷酸。
5.根据权利要求4所述双链RNA分子,其中,位于双链部分的正义链3’末端第12位的核苷酸是与反义链不互补的核苷酸。
6.根据权利要求1所述双链RNA分子,其中,在双链部分的正义链上对应于RISC对靶基因转录产物的切断位点的位点的5’或3’侧1-3个核苷酸的位置还有一个核苷酸是与反义链不互补的核苷酸。
7.根据权利要求1所述双链RNA分子,其中,当正义链的双链部分由奇数个核苷酸构成时,在位于双链部分的正义链的中心的核苷酸的5’侧第1-3个核苷酸位点还有一个核苷酸是与反义链不互补的核苷酸;当正义链的双链部分由偶数个核苷酸构成时,在双链部分的正义链的中心3’侧核苷酸的5’侧第1-3个核苷酸位点中还有一个核苷酸是与反义链不互补的核苷酸。
8.根据权利要求1所述双链RNA分子,其中,当正义链的双链部分由奇数个核苷酸构成时,在位于双链部分的正义链的中心的核苷酸的5’侧第2个核苷酸位点还有一个核苷酸是与反义链不互补的核苷酸;当正义链的双链部分由偶数个核苷酸构成时,在双链部分的正义链的中心3’侧核苷酸的5’侧第2个核苷酸位点还有一个核苷酸是与反义链不互补的核苷酸。
9.根据权利要求1所述双链RNA分子,该双链RNA分子在哺乳动物细胞内不诱导双链RNA依赖性蛋白激酶或2’,5’-寡聚腺苷酸合成酶。
10.根据权利要求9所述双链RNA分子,其中,该双链RNA分子具有29个核苷酸或以下的链长。
11.一种可通过RNAi抑制细胞内靶基因表达的双链RNA分子,其自双链部分的正义链5’末端依次有一个以上的核苷酸是与反义链不互补的核苷酸,并且其双链部分的正义链中与反义链互补的核苷酸的数目是能够使双链在上述细胞内杂交的数目。
12.根据权利要求11所述双链RNA分子,其中,自双链部分的正义链5’末端依次与反义链不互补的核苷酸的数目为1-4个。
13.根据权利要求11所述双链RNA分子,其中,自双链部分的正义链5’末端依次与反义链不互补的核苷酸的数目为2个。
14.根据权利要求11所述双链RNA分子,其中,自双链部分的正义链3’末端依次有一个以上与反义链不互补的核苷酸。
15.根据权利要求14所述双链RNA分子,其中,自双链部分的正义链3’末端依次与反义链不互补的核苷酸的数目为1-4个。
16.根据权利要求14所述双链RNA分子,其中,自双链部分的正义链3’末端依次与反义链不互补的核苷酸的数目为2个。
17.根据权利要求11所述双链RNA分子,其中,在双链部分的正义链3’末端第11-13位的核苷酸中还有一个核苷酸是与反义链不互补的核苷酸。
18.根据权利要求17所述双链RNA分子,其中,位于双链部分的正义链3’末端第12位的核苷酸是与反义链不互补的核苷酸。
19.根据权利要求11所述双链RNA分子,其中,在双链部分的正义链上对应于RISC对靶基因转录产物的切断位点的位点的5’或3’侧1-3个核苷酸的位置还有一个核苷酸是与反义链不互补的核苷酸。
20.根据权利要求11所述双链RNA分子,其中,当正义链的双链部分由奇数个核苷酸构成时,在位于双链部分的正义链的中心的核苷酸的5’侧第1-3个核苷酸位点还有一个核苷酸是与反义链不互补的核苷酸;当正义链的双链部分由偶数个核苷酸构成时,在双链部分的正义链的中心3’侧核苷酸的5’侧第1-3个核苷酸位点还有一个核苷酸是与反义链不互补的核苷酸。
21.根据权利要求11所述双链RNA分子,其中,当正义链的双链部分由奇数个核苷酸构成时,在位于双链部分的正义链的中心的核苷酸的5’侧的第2个核苷酸位点还有一个核苷酸是与反义链不互补的核苷酸;当正义链的双链部分由偶数个核苷酸构成时,在双链部分的正义链的中心3’侧核苷酸的5’侧第2个核苷酸位点还有一个核苷酸是与反义链不互补的核苷酸。
22.根据权利要求11所述双链RNA分子,其中,该双链RNA分子在哺乳动物细胞内不诱导双链RNA依赖性蛋白激酶或2’,5’-寡聚腺苷酸合成酶。
23.根据权利要求22所述双链RNA分子,其中,该双链RNA分子具有29个核苷酸或以下的链长。
24.一种抑制细胞内靶基因表达的方法,其包含将权利要求1-23任一项所述双链RNA分子导入细胞的步骤。
25.根据权利要求24所述方法,其中,细胞是哺乳动物细胞。
26.一种载体,其同时含有编码权利要求1-23任一项所述双链RNA分子的正义链的DNA和编码反义链的DNA。
27.一种抑制细胞内靶基因表达的方法,其包含将含有编码权利要求1-23任一项所述双链RNA分子的正义链的DNA的载体和含有编码该双链RNA分子的反义链的DNA的载体的组合,或权利要求26所述载体导入细胞的步骤。
28.根据权利要求27所述方法,其中,细胞是哺乳动物细胞。
29.一种可通过RNAi抑制细胞内靶基因表达的双链RNA分子,该RNA分子经过改造使其自反义链5’末端侧整合入RNA诱导型沉默复合体。
30.一种可通过RNAi抑制细胞内靶基因表达的双链RNA分子,该RNA分子经过改造使其自正义链5’末端侧整合入RNA诱导型沉默复合体。
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Cited By (1)
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Families Citing this family (9)
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---|---|---|---|---|
JP4853892B2 (ja) * | 2005-04-13 | 2012-01-11 | 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター | 変異対立遺伝子に対する特異的なRNAiの評価方法 |
WO2007048629A2 (en) * | 2005-10-28 | 2007-05-03 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Modulation of rna silencing efficiency by argonaute proteins |
CA2663601C (en) * | 2006-09-22 | 2014-11-25 | Dharmacon, Inc. | Duplex oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by rna interference |
CN101126098B (zh) * | 2007-07-05 | 2012-07-11 | 深圳市第二人民医院 | 特异性抑制gfap蛋白表达的小干扰rna分子表达载体及其构建方法与用途 |
US8188060B2 (en) * | 2008-02-11 | 2012-05-29 | Dharmacon, Inc. | Duplex oligonucleotides with enhanced functionality in gene regulation |
EP2250183A4 (en) * | 2008-02-14 | 2012-07-25 | Michael Paul Marie Gantier | SMALL IMMUNOSTIMULATORY RNAI MOLECULES |
JP2011528910A (ja) * | 2008-07-25 | 2011-12-01 | アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | センス鎖中の一般塩基またはミスマッチを使用したsiRNAサイレンシング活性の亢進 |
EP2408904B1 (en) * | 2009-03-20 | 2017-10-18 | Mesoblast, Inc. | Production of reprogrammed pluripotent cells |
US20150025122A1 (en) | 2009-10-12 | 2015-01-22 | Larry J. Smith | Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003046186A1 (en) * | 2001-11-28 | 2003-06-05 | Toudai Tlo, Ltd. | siRNA EXPRESSION SYSTEM AND METHOD FOR PRODUCING FUNCTIONAL GENE KNOCK-DOWN CELLS USING THE SYSTEM |
US20040241854A1 (en) * | 2002-08-05 | 2004-12-02 | Davidson Beverly L. | siRNA-mediated gene silencing |
EP2305812A3 (en) * | 2002-11-14 | 2012-06-06 | Dharmacon, Inc. | Fuctional and hyperfunctional sirna |
US20040248299A1 (en) * | 2002-12-27 | 2004-12-09 | Sumedha Jayasena | RNA interference |
US7750144B2 (en) * | 2003-06-02 | 2010-07-06 | University Of Massachusetts | Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of RNA silencing |
WO2005001043A2 (en) * | 2003-06-02 | 2005-01-06 | University Of Massachusetts | METHODS AND COMPOSITIONS FOR ENHANCING THE EFFICACY AND SPECIFICITY OF FNAi |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009074076A1 (fr) * | 2007-11-29 | 2009-06-18 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd | Molécule complexe interférant avec l'expression de gènes cibles, et ses méthodes de préparation |
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