CN1223660A - 治疗突变引起的疾病的方法和化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有2’－脱氧核糖核苷酸和核糖苷酸的双链体寡核苷酸的用途,其中在两种类型的核苷酸间形成碱基对。选择所述寡核苷酸的序列,使得所述寡核苷酸的3’和5’的大多数区与预先选定细胞的靶基因序列同源(相同)。同源的两个区包含一个与靶序列异源的区。将所述寡核苷酸引入细胞引起靶基因改变,使得改变的靶基因序列是异源区的序列。所述本发明的寡核酸被称为嵌合突变载体(CMV)。在本发明的一个实施方案中,所述靶基因是珠蛋白基因,所述靶细胞是造血干细胞。该实施方案可以用于校正某些血红蛋白病,诸如镰刀形细胞病、β－地中海贫血病和高歇氏病。珠蛋白基因的校正率足够高,以致不需选择处理的造血干细胞,则获得显著的治疗效果。在一个实施方案中,所述CMV的核糖核苷酸含有甲基化的2’－O。

Description

治疗突变引起的疾病的方法和化合物
Ⅰ．发明领域
本发明的领域涉及突变引起的疾病的治疗，所述突变引起造血细胞或可从受治疗者人体取出、培养和再植入的其它类型细胞中的突变基因的异常水平或异常产物。通过突变基因和嵌合修复载体(CRV)的同源重组使病人突变基因配对实现治疗，CRV是既有脱氧核糖核苷酸又有核糖核苷酸的核酸。更详细地讲，该领域涉及引起镰刀形红细胞病、β-地中海贫血和高歇氏病的突变的修复。
Ⅱ．发明背景A．造血细胞表达基因的突变引起的疾病及其用骨髓移植的治疗
1．血红蛋白病和高歇氏病
已知有500多种血红蛋白的结构变异体。有变异血红蛋白的许多人是无症状的或是只有轻微的影响。三个常见的变异体就和重要的疾病有关。HbS(镰状细胞性贫血红蛋白)和HbC两种血红蛋白是编码β-珠蛋白Glu6的密码子中发生了点突变，这两种珠蛋白在非洲人及其后裔中有发现。HbC是由于第6个密码子的第一位发生G→A的置换，而HbS则是由于第6个密码子的第二位发生了A→T置换，分别产生了Lys6和Val6。与疾病有关的血红蛋白的第三种常见的变异体HbE，是由于编码Glu26的第26个密码子的第一位置发生了G→A的置换，结果产生了Lys26，HbE最初是在东南亚人群及其后裔中发现的。
HbS、HbC或HbE杂合的人没有明显的病症。然而，HbS纯合体、HbS/HbC杂合体及HbC或HbE与β-地中海贫血病的等位基因的杂合体就有严重影响，并需经常的医疗照顾。
地中海贫血是一类血红蛋白病，其中α-珠蛋白与β-珠蛋白合成速度不均衡。地中海贫血病根据突变基因可分为α或β型，并根据受影响蛋白是完全还原还是部分还原分为例如α0和β0(完全还原)或者如α+和β+(部分还原)。
在单倍体人类基因组中有两个紧密相连的功能α-珠蛋白基因。α-地中海贫血病的最普遍的原因是相连的α-珠蛋白基因或者α-珠蛋白基因座控制区发生了缺失或重排。
相反，β-地中海贫血病的普遍原因是点突变。最普遍原因是β-珠蛋白基因110位发生G→A置换，在第一个内含子(IVSI)中产生一个新的剪接接受位点。
已经特征记述了大约100种不同类型的β-地中海贫血病。已描述特性的突变中只有14种是显性的，即与野生型β-珠蛋白等位基因杂合时引起显著的临床病况。其余的突变与第二个β-地中海贫血病基因纯合或杂合时导致严重的临床病况，称为重型地中海贫血病。血红蛋白病的详细综述见Weatherall等著的《遗传病的新陈代谢和分子基础》(THE METABOLIC AND MOLECULAR BASIS OF INHERITEDDESEASE)第七版第113章(McGraw-Hill，纽约，1995)。
高歇氏病是溶酶体糖脂贮积病。有三种公认的类型。1型高歇氏病在阿什哈巴德(东欧)的犹太人及其后裔中最普遍；2型是panethinc；3型在瑞典北部最普遍。高歇氏病的病因是葡糖脑苷酯酶有缺陷，该酶也叫酸性葡糖苷酶。葡糖脑苷脂酶在源于骨髓的巨噬细胞/单核白细胞的细胞类型中表达。
有三种不同的引起高歇氏病的常见突变：mRNA的第1225位核苷酸发生A→G的置换，导致葡糖脑苷脂酶第370位残基发生Asn→Ser的置换(N370S突变)；mRNA第1448位核苷酸发生T→C置换，导致葡糖脑苷脂酶第444残基发生Leu→Pro置换(L444P突变)；及第位核苷酸G的重复导致移码突变(84GG突变)。N370S和84GG突变与阿什哈巴德人群有关，而L444P突变与瑞典北部人群有关且是偶尔发生的突变。
引起高歇氏病的编码序列的不常见但并不罕见的突变已鉴定如下：于754位T→C；于1192位，C→T；于1193位，G→A；于1297位，G→T；于1342位，G→C；于1504位，C→T；及于1604位，G→A。
引起高歇氏病的突变是隐性的，即有一个野生型葡糖脑苷脂酶等位基因的个体没有症状。N370S突变纯合的个体通常在其生命晚期发展成轻微的病。相反，L444P突变的纯合个体患有比较严重的2型和3型高歇氏病。84GG突变在纯合状态时导致产物没有酶活性，且导致严重的临床疾病。在不常见的突变中，于核苷酸754、1192、1297和1342的突变与严重形式的疾病相关。高歇氏病的详细综述见Beutler,E.和Grabowski《遗传疾病的新陈代谢和分子基础》(THEMETABOLIC AND MOLECULAR BASIS OF INHERITED DESEASE)第7版、第86章(McGraw-Hill，纽约，1995)。
2．通过骨髓移植治疗突变引起的疾病
通过HLA匹配的具有正常β-珠蛋白基因的骨髓的同种异体骨髓移植治疗严重的β-地中海贫血的病例已报道是有临床益处的。Giardini,C等，1995,Annu.Rve.Med.46:319-30(地中海贫血病)；Lucarelli,G等，1991,Hematol.Oncoi.Clin.North Am.5:549(地中海贫血病)；Kalinyak,K.A等1995,Am.J.of Hemat.48:256-61(镰刀形细胞)；Abboud,M.R.等1994,Am.J.ofPed.Hem/Onc 16:86-89(镰刀形细胞)；Kirkpatrick,D.V等1991,Semi.Hematol.28:240(镰刀形细胞)。临床结果显示移入成功时是有疗效的。移入可以是持久的；有报导在随后的3-8年中没有发现排斥作用。然而，由于移植物抗宿主病的发展和如环孢菌素的免疫抑制药物的维持剂量，失败的比率是明显的。获得HLA匹配的骨髓也可能有相当的困难。
治疗1型高歇氏病的同种异体骨髓移植已产生了与上述地中海贫血病大致相同的结果。Ringden,O.等1995,Transplantation 59:864)；Chan,K.W.等1994,Bone Marrow Transplantation 14:327。骨髓移植用于治疗更严重的涉及中枢神经系统的2型和3型高歇氏病据报道也已获得满意的结果。Tsai,P.等1992,Pediatr.Res.31:503；Svennerholm,L.等1991,Dev.Neurosci.13:345-51。与珠蛋白基因相对比，用病毒表达载体可以获得有效水平的葡糖脑苷脂酶表达，这就提示转导骨髓的自体移植对高歇氏病是有效的疗法。Karlsson,S.和Correll,P.H.,1993,Bone Marrow Transplantation 11(增刊11):124-7。B．具DNA·RNA碱基对的嵌合寡核苷酸
具有互补脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸并含与噬菌体M13mp19的片段同源序列的寡核苷酸，在Kmiec.E.等1994年11月Mol.and Cell.Biol.14:7163-7172中有描述。该寡核苷酸有单一相邻的核苷酸区段。Kmies等指出，该寡核苷酸是源于玉蜀黍黑粉菌的REC2同源配对酶的底物。
1995年6月15日公布的并为相应的于1994年12月9日提交的美国专利申请序号08/353,657的专利说明书WO 95/15972，描述了在原核细胞中引进遗传改变的嵌合修复载体(CRV)。在玉蜀黍黑粉菌基因和鼠ras基因中已有实例报道。后一例子设计用来把转化突变引入到ras基因，使得ras基因在NIH 373细胞中的成功突变能使细胞集落生长(“转化”)。WO 95/15927说明书报告了NIH 373的最大转化率小于0.1％，即每106个细胞大约100个转化子受到ras CRV的作用。在玉蜀黍黑粉菌系统中转化子出现频率大约是600个/106。设计把突变引入人bcl-2基因的嵌合载体在Kmiec,E.B.,1996年2月，Seminar inOncology 23:188中有描述。
设计修复K-ras的密码子12中突变的CRV在Kmiec,E.B 1995年2月，Advanced Drug Delivery Reviews 17:333-40中有描述。用脂质转染法体把CRV引入Capan2细胞，在源自人胰腺癌的细胞系Capan 2中检测CRV。接触CRV 24小时后，收获细胞并提取基因组DNA；含K-ras密码子12的片段用PCR扩增，并通过与等位基因的特异性探针杂交估计转化率。报道转化率接近18％。
设计修复编码肝/骨/肾型碱性磷酸酶基因突变的CRV在Yoon,K.等，1996年3月，Proc.Natl.Acad.Sci 93:2071中有报道。所述碱性磷酸酶基因用质粒瞬时引入CHO细胞、6小时后引入CRV。CRV引入24小时后回收质粒并进行分析。结果显示用CRV修复近30-38％的碱性磷酸酶基因。
Ⅲ．发明概述
本发明提供了治疗靶基因突变引起的人类受治疗者遗传病的方法。本发明包含了受治疗者细胞类型基因的致病突变的修复，其中可以从受治疗者取出细胞类型，进行培养并通过把CRV引入到细胞类型的细胞中进行体外修复，然后再植入受治疗者体内，其中再植入细胞或者其子代的突变修复是有疗效的。一般来讲，细胞类型的细胞群体25％以上的隐性突变的修复和50％以上的显性突变的修复是治疗上有效的修复率。
在本发明的一个实施方案中，靶基因是在下文中统称为“造血细胞”的骨髓髓细胞或骨髓细胞的后代中正常表达的类型。因此，本发明的一个实施方案是这样一种方法，包括把受治疗者的造血干细胞(HSC)置于培养基中，把嵌合修复载体(CRV)引入HSC中修复靶突变，再把包含CRV的HSC移植入受治疗者体内等的步骤。
本发明包含了除大段缺失或插入(即大约6个以上碱基的缺失或插入)、易位和染色体内重排外的任何突变的修复。在最佳实施方案中，本发明包括单个碱基置换(“点突变”)和1、2或3个相邻碱基的缺失或插入的修复。
本发明的其它实施方案是CRV,CRV为大约40到100个核苷酸的寡核苷酸，其中大约12到46个核苷酸具有2’-羟基或2’-羟甲基。所述CRV包含与靶基因野生型序列相同的区段，该区段跨越引起受治疗者疾病的突变。该CRV是由一个双链寡核苷酸组成的，即除了使寡核苷酸组成发夹末端的大约4个未配对核苷酸的两个区外，其核苷酸碱基是Watson-Crick配对的。在特定实施方案中，本发明包括具人类葡糖脑苷脂酶基因和珠蛋白基因和人类β-珠蛋白启动子的序列的CRV。
Ⅳ．附图简述
图1．嵌合修复载体实施方案的一般形式。
图2A和2B．图2A显示了寡核苷酸Dh1(SEQ ID NO:91)和嵌合寡核苷酸Ch1(SEQ ID NO:88)、Ch2(SEQ ID NO:89)和Ch3(SEQID NO:90)的序列和结构。图2B阐明了CRV Ch1的序列和碱性磷酸酶基因(SEQ ID NO:92)之间的关系。DNA的核苷酸是大写；RNA的核苷酸是小写。
图3．βS-珠蛋白(SEQ ID NO:93的核苷酸1-25)、βA-珠蛋白(SEQ ID NO:94的核苷酸1-25)、δ-珠蛋白(SEQ ID NO:98)及嵌合载体SC1-SC5(SEQ ID NO:93-97)的密码子3-9和密码子2和10的相邻二核苷酸的序列。DNA和RNA的核苷酸如图2A所示。
图4A和4B．图4A和4B显示在EB转化的淋巴母细胞培养中分别随nM SC1和nM SC2而变的由βS转变为βA的β-珠蛋白拷贝的函数及βA转变为βS的β-珠蛋白拷贝的函数。
图5．图5显示了随加入到cd34+造血干细胞中的ng SC2而变的由βA-βS的β-珠蛋白拷贝的函数。
Ⅴ．发明详述
本发明提供了嵌合修复载体(CRV)与其应用方法，该方法称为“嵌合整复术(chimeroplasty)”，用来校正来自人类受治疗者的可瞬时置于细胞培养中的无转化细胞类型的有害突变。嵌合整合术是这样一个过程：把适当细胞群体(靶细胞)置于培养中，进行或不进行生长，再把培养的细胞暴露于CRV，然后把细胞再移植到该受治疗者体内。本发明部分基于此发现：应用根据本发明的CRV导致30％以上的靶基因得到修复，而且可以导致50％以上的靶基因得到修复。
在一个实施方案中，所述靶细胞是造血细胞，特别是造血干细胞。这里用的造血细胞包括红细胞类、淋巴样单核细胞样(巨噬细胞)和粒性白细胞的谱系的前体和成熟细胞。这里使用的造血干细胞(HSC)包括在骨髓或外围血中发现的而且能种群恢复骨髓区(bone marrowspace)并产生造血谱系后代的所有细胞。A．对本发明治疗敏感的疾病
本发明可用于治疗造血细胞中突变引起的异常基因产物的产生或正常基因产物表达过量或表达不足引起的遗传疾病，其中所述突变不包括大段插入或缺失突变或染色体内重排或易位。
大段插入或缺失突变是与正常或野生型序列相比有超过6个相邻核苷酸插入或缺失的突变。能用本发明治疗的突变类型包括：核苷酸被不同核苷酸置换引起的突变，包括多至3个和多至6个相邻核苷酸的置换；多至3个相邻核苷酸的插入或缺失引起的任何突变；或者是多至6个相邻核苷酸插入或缺失引起的突变。能用本发明治疗的突变类型在这里称为“CRV可修复突变”。
CRV可修复突变可以是任何的人类基因。这里用的基因指的是或者是结构基因，如编码蛋白质的基因的外显子和间插序列；或者是控制元件，如结构基因的启动子或增强子。本发明还包含同一基因内的几个CRV可修复突变引起的疾病的治疗。单一CRV能校正相互之间在大约30个核苷酸内的非相邻点突变。或者通过把多个CRV的混合物引入受治疗者的HSC，以便用混合物中的一个CRV修复每一个CRV可修复突变，使疾病得到治疗。本发明包含能修复任何这样的突变的人类基因的CRV序列，所述突变的人类基因在造血细胞或HSC子代中的表达或缺乏表达或表达过量是该受治疗者的病因。在一个实施方案中，本发明消除了ras基因，见Taparowski,E.1982 Nature 300:762；Sukumar,S.等，1983,Nature 306:658；在可选择的实施方案中，本发明消除了ras基因和碱性磷酸酶基因，Weiss,M.J.等1988,Proc.Natl.Acad.Sci.85:7666。
能用本发明治疗的非限定病例包括：珠蛋白结构基因中CRV可修复突变引起的血红蛋白病，如镰刀形细胞贫血病；β-地中海贫血病，为β-珠蛋白启动子或β-珠蛋白结构基因中CRV可修复突变引起β-珠蛋白基因表达不足的疾病；在葡糖脑苷脂酶结构基因中一个或多个CRV可修复突变引起的高歇氏病类型。这里使用的名词“结构基因”指编码基因产物的DNA；名词“基因”包括调节序列(即启动子和增强子)、内含子和外显子。名词“基因序列”指基因的编码链序列。因此其互补序列是非编码链序列。
任何受治疗者中的一个或多个CRV可修复突变的位置用本领域技术人员熟知的技术来鉴定。镰刀形细胞病(SCD)的突变位置在编码β-珠蛋白的第6个密码子的密码子中。
除了负责的突变位置是熟知的少数情况外，需要对受治疗者的靶基因进行测序，以便确定点突变的位置。例如已经描述了珠蛋白基因的500多个点突变。(Bunn,H.F.&Forget.B.G.,1986,HEMOGLOBIN:MOLECULAR,GENETIC AND CLINICAL ASPECTS,W.B.Saunders,Phil.)。同样，没有一个突变引起高歇氏病(Hong,C.M.等，1990 DNA CellBiol 9:233-41)或β-地中海贫血病(Kazazian,H.H.,1990,Seminars inHematology 27:209-228)。本领域的专业技术人员熟知鉴定特定点突变的技术。B．HSC的回收、培养和转染
用本领域技术人员现在熟知或发展的技术，从受治疗者外周血或骨髓回收造血干细胞(HSC)。通过本领域技术人员熟悉的技术用单采血液成分术的方法很方便从受治疗者获得HSC。在一个实施方案中，受治疗者提前3天给与粒细胞集落刺激因子且在细胞单采血液成分术的四天期间连续服用。单采血液成分术的单核细胞通过密度梯度离心或相当的过程分离，取出附着的细胞，用抗CD34的抗体分离HSC。以CellPro和Isolex商标市售的柱子或它们的等价物适合实施本发明。
镰刀形细胞病病人易受能通过给与G-CSF沉淀的镰刀形细胞危象(crisis)的影响。因此，在单采血液成分术前危象(pre-apheresis crisis)开始以前，受治疗者应该给予预防性交换输血。
可以通过现在已知的或开发用于用DNA转染细胞的任何技术，用CRV转染细胞。这些技术包括电穿孔、脂质体转移和磷酸钙沉淀。在一个实施方案中，该转染用脂质体转移化合物如DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲铵甲磺酸盐，Boehringer-Mannheim)或其等价物来完成。CRV的量对本发明的实施不是决定性的，用10nM/105个细胞就可以得到很好的结果。可以使用的比率是每105个细胞含500ng CRV的3μg DOTAP。可以使用下面实施例1-3中的转染技术，改进为在无血清培养基、补加了人类血清白蛋白或人血清的培养基中培养转染的细胞。
在本发明的一个实施方案中，单采血液成分术的HSC分离后立即暴露于CRV和脂质体转移化合物的混合物中，温育大约6-16小时使其转染。然后洗涤转染的细胞除去未吸收的脂质体，根据骨髓移植领域熟知的技术低温保存。低温保存在含10％DMSD的培养基中完成，冷却速率大约是3℃/分钟。C．修复的HSC的移植
现在用来在镰刀形细胞病和β-地中海贫血病的病人中进行HLA匹配的骨髓前体细胞异体转移技术的任何技术，均可以用来将修复的HSC移植入受治疗者中。在单采血液成分术获得骨髓细胞后，该受治疗者立即经受细胞还原过程。总体需800-1200Rads剂量的照射。或者使用骨髓细胞毒性剂。可以使用受治疗者准备接受骨髓移植使用的制度。可以使用这样的制度：移植前四天使用白消安3.5mg/Kg/天和环磷酰胺50mg/Kg/天的组合物。或者，如果宿主骨髓没有完全脱离，就使用4.0mg/Kg/天白消安的剂量再加少量或不加环磷酰胺，以获得显著效果。修复的HSC可以通过外周静脉输注。输注的修复CD34+细胞的总剂量可以是对重建病人骨髓有效的任何剂量。有效剂量通常是大约1-4×106个CD34+细胞(HSC)/Kg。
修复的HSC输注后，前48小时静脉给与重组10μg/k/天粒细胞集落刺激因子，直到嗜中性粒细胞绝对数连续三天达到1.5×109/L。地中海贫血病和镰刀形细胞病的骨髓移植领域由下述文献进行说明：Giardini,C.等,1995,Ann.Rev.Medicine 46:319-30；Abboud,M.R.,American.J.of Ped.Hematol./Oncol.16:86-89；Storb,R.等，1991,Seminars in Hematology 28:235-39。D．嵌合修复载体的结构
嵌合修复载体(CRV)是3’,5’-连接的核酸，至多有一个3’末端和一个5’末端，大约有40-100个核苷酸。在可选择的实施方案中，3’和5’末端可以共价连接。3’和5’末端没有连接时，就说CRV是有切口的。CRV含有未配对的核苷酸，形成1个或2个发夹转折，所述转折把CRV分成两条链，使得第一条链的至少15个碱基与第二条链的碱基是Watson-Crick配对的。CRV的另一特征为存在许多至少三个相邻碱基的区段，这些区段由2’-O或2’-烷基醚核糖核苷酸组成，这些核糖核苷酸与第二条链的脱氧核糖核苷酸是Watson-Crick配对的。
这里使用的名词“区”指多核苷酸的一部分，它的序列有某些特定的来源，例如CRV有一个至少15个核苷酸的区具有人类β-珠蛋白基因片段的序列。区段是有结构意义的CRV的一部分。给定的区段或给定区包含2’-脱氧核苷酸和核糖核苷酸。然而，“核糖核苷酸区段”或“2’-脱氧核糖核苷酸区段”只含核糖核苷酸和2’-脱氧核糖核苷酸。
图1显示了一个实施方案的CRV的结构，该CRV具有区段(a)-(h)。图解的目的是为了说明CRV的3’末端在区段(a)的3’末端，5’末端显示在区段(h)的5’末端，即切口位于(a)和(h)区段之间的边界处。然而，如果有切口，切口的位置和相对于所述区段的CRV 3’和5’方向的定向不是关键的。按顺序给所述区段标上(a)-(h)。在图1的实施方案中，第一区包含区段(c)、(d)和(e)，与由(a)区段组成的第二区是互补的。
在一个实施方案中，所述区段的长度和特性如下：区段(a)为16-40个核苷酸，最好是20-30个核苷酸。区段(a)区的序列可以是包含要修复的点突变基因(靶基因)的正常(即野生型)等位基因编码链的序列或非编码链的序列。这里用的陈述：一个区具有特定基因序列片段的序列，意思是它有源于该基因的编码链序列，当一个区段或区的序列与编码链或非编码链的片段序列相同时，就说该区段或该区与所述基因是完全同源的。这里用的野生型等位基因的序列包括与受治疗者疾病无关的靶基因的任何等位基因序列；因此，多态性基因有多个野生型序列。区段(a)序列的位置必须包括靶基因的含有要修复突变的部分。除非靶基因在靶细胞不能正常转录，否则，区段(a)的序列最好是野生型靶基因的编码链序列。当靶基因在靶细胞中不转录时，那么最好既不使用编码链序列也不使用非编码链序列。区段(a)的序列决定区段(c)-(e)的序列和结合的长度，区段(c)-(e)必须与区段(a)互补。
区段(a)与区段(c)和(e)碱基配对的部分的核苷酸可以是已知的或将研制的任何2’-脱氧核糖核苷酸。称为核糖核苷酸区段的区段(c)和(e)的核苷酸可以是任何2’-O-核糖核苷酸，即含有2’-羟基或烷基醚部分的核苷酸。这里用的名词“核糖核苷酸”指任何具有2’-O或2’-烷基醚的核苷酸。在最佳实施方案中，称为间插区段的区段(d)的核苷酸是2’-脱氧核糖核苷酸。区段(d)也可选择由核糖核苷酸组成；如果这样，区段(c)、(d)和(e)的界限就不确定。区段(b)和(f)-(h)可以是任何类型的核苷酸。或者脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸间的连接部分可以是磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键或是这样的任何其它连接基团：它们允许形成双链体核酸，便于转染入细胞并且不干扰同源重组。
在最佳实施方案中，区段(c)和(e)的序列与靶基因完全同源。在一最佳实施方案中，区段(d)的序列与靶基因的野生型等位基因完全同源；且是与一个或多个靶突变以外的靶基因同源。
区段(b)和(g)的长度大约为4个核苷酸，且形成单链的发夹转折，所述转折使得区段(a)和(c)-(e)以及区段(f)和(h)形成Watson-Crick碱基对，即形成双链体核酸。
区段(c)和(e)也称第一和第二核糖核苷酸区段，在一最佳实施方案中，是由2’-O-甲基核糖核苷酸组成。在一最佳实施方案中，区段(c)和(e)的长度各自为6-13个核苷酸。
区段(d)也称为间插区段，在一个实施方案中，其长度是4-20个核苷酸。区段(d)必须与靶基因包含要修复的点突变的片段同源，在这种情况下就说所述间插区段跨越该突变。区段(d)最好包含点突变核苷酸的3’和5’端，在这种情况下就说所述间插区段包括该点突变。如果靶基因包含有由少于15个核苷酸隔开的两个或两个以上的点突变，那么每个点突变都可以用同一CRV修复。
区段(f)和(h)形成双链体，使得在区段(a)和(h)间有切口的CRV 3’和5’末端并列。在一个实施方案中，3’末端和5’末端可以是脱磷酸的。在可选择的实施方案中，3’和5’末端可以由磷酸二酯键或与其相当的键共价连接，使得CRV是闭合环状的寡核苷酸。可以从闭合环状的CRV中可任选地缺失区段(f)和(h)。E．涉及非造血细胞的本发明的实施方案
本发明可以用于修复突变或是把突变引入到可从受治疗者体内取出、培养并再植入到该受治疗者中的任何类型细胞。肝细胞、尤其是肝补充(干)细胞的取出、培养和再植入技术描述于Naughton,G.B.和Sibanda,B.1994年4月28日的专利说明书WO 94/08598中。可以通过修复肝细胞的突变治疗的遗传疾病包括：由LDL受体突变引起的家族性高胆甾醇血症；α1-抗胰蛋白酶基因突变引起的肺气肿；及由凝结因子Ⅷ和Ⅸ突变引起的血友病和克里斯马斯氏病。F．本发明的具体实施方案
在本发明的一个实施方案中，构建CRV，使得所述CRV的序列包含人β-珠蛋白基因的正常等位基因序列的至少15个核苷酸片段的序列。人β-珠蛋白最常见等位基因的序列参见Lawn等1980,Cell 21:647的图2，该序列通过引用结合到本文中。包含β-珠蛋白片段序列的CRV可用来修复引起镰刀形细胞病、HbC和β-地中海贫血病的突变。
适于修复HbC和镰刀形细胞病突变的实施方案包含下列序列中的至少15个核苷酸片段的序列：5’-CAC CTG ACT CCT GAG GAGAAG TCT GCC-3’(SEQ ID NO:1)。适于修复HbE突变的实施方案包含下列序列中至少15个核苷酸片段的序列：5’-GAA GTT GGT GGTGAG GCC CTG GGC AGG-3’(SEQ ID NO:2)。在HbC、HbS和HbE中突变的核苷酸下划横线。
在本发明的第二个实施方案中，构建CRV使得所述CRV序列包含人葡糖脑苷酯酶基因正常等位基因序列的至少15个核苷酸片段的序列。葡糖脑苷酯酶最常见的等位基因序列见Tsuji等，1986,J.Biol.Chem 261:50-53的图2，该序列通过引用结合到本文中。
下面的表Ⅰ包括在高歇氏病和β-地中海贫血病中发现的更占优势的突变、所述突变的位置和用于CRV中来修复所述突变的野生型等位基因片序列的一览表。表Ⅰ的序列是以常规的5’→3’方向给出的编码链的序列。所述突变的大约位置用下划线核苷酸表明。
Ⅵ．实施例实施例1．应用CRV修复附加型碱性磷酸酶
获得了包含人类肝/骨/肾碱性磷酸酶cDNA的表达质粒，所述cDNA受SV40早期启动子控制，该质粒命名为pHAP。获得了该cDNA突变形式的相同质粒并命名为p711。图2A图示了用于pHAP和p711序列相互转换的CRV的设计。设计CRV Ch1以修复第711位的错义突变。野生型序列中对应于该突变位点具有一个G残基。Ch2的设计和Ch1相同，只是对应于位置711由A取代G。Ch3和Ch1的序列相同，只是核糖核苷酸区段的序列是碱性磷酸基因编码链的序列，而不是非编码链的序列。寡核苷酸Dh1包含与Ch1相同的序列，只是仅含有2’-脱氧核苷酸。
在图2B中p711的图解表明碱性磷酸酶cDNA编码区第711位的单一点突变A、SV40的早期启动子(PE)、SV40复制起点(ori)、多腺苷酸加入位点和用于剪接的小t内含子序列(SV40 polyA)。图2B中的虚线框表明pBR322编码复制起点和β-内酰胺酶(AmpR)基因的序列。用p711转染CH细胞，6小时后，将CRV、Ch1引入预先转染了p711的CHO细胞。两种转染都用脂质转染法进行。转化成野生型表型的程度通过分光光度测定、组织化学染色和Hirt DNA分析在生物化学和DNA序列两个水平上监测。材料和方法
寡核苷酸的合成和纯化：在ABI 394 DNA/RNA合成仪上，用1000宽孔CPG在0.2μmole范围合成所述嵌合寡核苷酸。DNA亚膦酰胺(Applied Biosystems,Foster City,CA)的外向环氨基用苯甲酰保护腺嘌呤和胞嘧啶，用异丁酰保护鸟嘌呤。2’-O-甲基RNA亚磷酰胺(GlenResearch,Sterllng,VA)用苯氧乙酰基保护腺嘌呤，用二甲基甲脒保护鸟嘌呤，用异丁酰基保护胞嘧啶。合成完成后，通过在乙醇∶浓氢氧化铵(1∶3)中于55℃加热20小时去掉碱基保护基。粗品寡核苷酸与7M尿素和10％甘油混合，加热到70℃，加样于含7M尿素的聚丙烯酰胺凝胶上。凝胶电泳后，DNA条带用紫外照射(shadowing)显示，从胶上切下条带、压碎并在TE缓冲液(10mM Tris-Hcl和1mM EDTA,pH7.5)中边震荡边洗脱过夜。含有凝胶块的洗脱液用0.45μm的离心滤器(spinfilter)(Millipore,Bedford,MA)离心，并用乙醇沉淀。样品用G-25离心柱(spin column)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)进一步脱盐，发现95％以上纯化的寡核苷酸是全长的。
瞬时转染和组织化学染色：在含10％FBS(B.R.L.,Bethesda,MD)的DMEM中保持CHO细胞。通过加入每孔中加入的1ml OPTIMEM中的10μg脂质转染剂，进行瞬时转染。寡核苷酸转染24小时后，测定碱性磷酸酶活性。对于组织化学染色，细胞用0.15M NaCl洗涤三次，用染色液温育20分钟，然后用50％乙醇固定。染色液组成为溶于50ml水中的2mg Fast Violet、2ml Naphtol AS-MX碱性磷酸盐溶液(Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)。
碱性磷酸活性的分光光度测定：通过将1μg质粒p711与含1μg脂质转染剂的100αl的OPTIMEN(B.R.L,Betbesda,MD)加入1×104个CHO细胞中，以三份在96孔板上进行瞬时转染。6小时后，将不同量的Ch1或其它CRV与含1μg脂质转染剂的100μl OPTIMEM混合，再加到每个孔中。18小时后，吸出培养基，每孔加入含10％FBS的200μl DMEM。嵌合寡核苷酸转染24小时后，测定碱性磷酸活性。用Elisa Amplication System(B.R.L,Betbesda,MD)进行分光光度测定。细胞用0.15M NaCl洗涤三次，于100μl NP40缓冲液中裂解，所述NP40缓冲液含10mM NaCl、0.5％NP40、3mM MgCl2和10mMpH7.5的Tris-HCl。一部分细胞裂解液(20μl)与50μl Elisa底物和50μlElisa放大剂(B.R.L,Betbesda,MD)温育。用放大剂温育5分钟后，加入50μl 0.3M H2SO4停止反应。反应的程度在检测方法的线性范围内进行。在490nm波长下，用Elisa读板仪(B.R.L,Betbesda,MD)读出吸收值。
Hirt DNA分离、菌落杂交和PCR片段的直接DNA测序：用嵌合寡核苷酸转染24小时后，收获细胞，以通过改进的碱裂解法分离载体DNA。通过胰酶消化、洗涤、再悬浮于含50mM Tris-HCl,pH 8.0、10mM EDTA的10μl溶液和含5mM Tris-HCl,pH 8.0、10mM EDTA和10μg/ml的RNA酶A的110μl溶液中，使细胞分离。加入等体积的细胞裂解液(0.2N NaOH和1％SDS)，紧接着再加入100μl中和溶液(3MKAc,pH 5.5)。室温温育10分钟后，以10,000rpm离心10分钟。上清液用等体积的苯酚-氯仿抽提，用乙醇沉淀。将Hirt DNA转化到大肠杆菌DH5α细胞(B.R.L,Betbesda,MD)中。就设计的每个探针特异性杂交方面筛选Hirt DNA菌落，以辨别点突变。让菌落在氨苄青霉素平板上生长，以双份影印到硝酸纤维素滤纸上，经处理用于菌落杂交。所述印迹与P32-末端标记的寡核苷酸探针711-A(5’-CCGCCTACACCCACTCG-3’(SEQ ID NO:3))或711-G(5’-CCGCCTACGCCCACTCG-3’(SEQ ID NO:4))于37℃在含5×Denhardts、1％SDS、2×SSC和100μg/ml变性鲑精DNA的溶液中杂交。印迹于52℃在TMAC溶液(3.0M氯化四甲铵/50mM Tris-HCl,pH 8.0、2mM EDTA和0.1％SDS)中洗涤。使用Qiagen小量制备试剂盒(Chatworth,CA)，从显示与711-G或711-A杂交的20个菌落制备质粒DNA。每个质粒的第711位两侧的几百个碱基通过自动测序(ABI 373A,Applied Biosystem,Foster City,CA)从两个方向测序。采用相应于所述碱性磷酸酶cDNA第711位两侧的630-650位和803-822位的两个引物(5’-CAATGTCCCTGATGTTATGCA-3’(SEQ ID NO:5)和5’-CGCTGGGCCAAGGACGCT-3’(SEQ ID NO:6)，用VentR聚合酶(New England Biolabs,Beverly,MA)产生190个bp的PCR扩增片段。将所述扩增片段凝胶纯化，然后进行自动DNA测序(ABI 373A,Applied Biosystem,Foster City,CA)。
寡核苷酸稳定性的检测：将10ng 32P-末端标记的寡核苷酸与500ng未标记寡核酸混合，并如上进行转染。为降低寡核苷酸的非特定结合，细胞用PBS和含1M NaCl/HAc pH2.5的溶液彻底洗涤。在含10mM Tris-HCl pH7.5、0.5mM MgCl2和0.5％Trito X-100的溶液中裂解细胞，制备粗裂解液，然后用苯酚-氯仿抽提。裂解液用含7M尿素的15％聚丙烯酰胺凝分析，接着进行放射自显影。在含10％FBS的DMEM中温育的寡核苷酸用同样方式处理和分析。
在我们的实验设计中，将各种嵌合寡核苷酸引入预先用p711转染的CHO细胞。转化成野生型表型的程度用组织化学染色监测；红色颜料沉积在细胞上表示有活性酶。当含突变基因的细胞用11nM Ch1转染时，红色细胞出现的频率平均来说几乎占受转染CHO细胞的1/3。相反，Ch2和Dh1都不引起酶活性增加。当细胞用Ch3转染时，观察到转化成野生型的频率低。通过野生型质粒pHAP的表达测得的转染率估计是30％。
酶活性也用上述的分光光度法测定。p711质粒存在时，观察到高至17nM Ch1时碱性磷酸酶活性的剂量依赖性增加。用17nM Ch1处理的细胞，其酶活性接近用野生型质粒pHAP转染细胞酶活性的60％。这种增加是序列特异性的，因为等量的Ch1并没有影响用pHAP转染细胞的酶活性。此外，与序列Ch1只差一个碱基对的Ch2没有引起酶活性增加。含有与Ch1相同的序列、但不含核糖核苷酸区段的寡核苷酸Dh1显示酶活性没有增加。因此，碱性磷酸酶酶活性分光光度法测定与组织化学染色法结果一致。
用嵌合寡核苷酸校正靶DNA序列的点突变：为了证实DNA序列水平的变化，在嵌合寡核苷转染24小时后，用改进碱裂解法(Wang,G.等，1995,Mol Cell Biol.15,1759)，从用p711和各种寡核苷酸转染的细胞制备Hirt抽提物。Hirt DNA有效地转化DH5α细胞，从106个受转染的CHO细胞产生104个AmpR茵菌。在与设计辨别点突变(A)和野生型(G)序列的探针特异性杂交方面筛选DH5α转化体，所述点突变序列和野生型序列分别相应于突变cDNA和正常cDNA的第703-719位，Weiss,MJ.,2988,Proc.Natl Acad.Sci 85:7666。从至少两次独立的转染实验产生的多个平板的500多个茵菌，通过与711-G探针或711-A探针杂交的菌落的平均数测定校正率(表Ⅰ)。通过独立合成制备的两批Ch1观察到相近的转化率。从用p711和Ch1转染细胞制备的Hirt DNA产生的近70％茵菌与711A探针杂交，而30％的菌落显示与711-G探针杂交(表Ⅰ)。因此，在11nM Ch1下可重复观察到30％的校正率。杂交是特异的，在两种群体之间没有观察到交叉杂交。应用相应于所述碱性磷酸酶cDNA第711位两侧的第630-650位和第803-822位的两个引物5’-CAATGTCCCTGATGTTATGCA-3’(SEQ ID NO:7)和5’-CGCTGG GCCAAGGACGCT-3’(SEQ ID NO:8)，从两个方向用这些菌落中的20个菌落制备的质粒进行DNA测序。在每种情况下均证实了序列转化，而且在靶核苷酸周围的数百个碱基内没有观察到其它序列改变。来自从Ch2或Dh1处理细胞制备的Hirt提取物的所有菌落只与711-A探针杂交(表Ⅰ)。来自Ch3的Hirt提取物的某些菌落与野生型探针杂交，但其程度比Ch1小很多(表Ⅱ)。这些结果证实，显示的不同碱性磷酸酶活性是由于在DNA序列水平上校正点突变(A→G)产生的。
           表Ⅱ．从p711质粒和11nM的各种寡核苷酸双重转染制备
                      的Hirt提取物得到的转化体的杂交模式
寡核苷酸 转染数   每平板的菌落总数     与711-G杂交的菌落数     与711-A杂交的菌落数 转化％
    Ch1     1     84189219     327074     54117143     383734
    2     139162159     424951     98110108     303032
    Ch2     1     10890     00     10890     00
    2     218148     00     218148     00
    Ch3     1     190151     34     185145     23
    2     189143     00     185143     00
    Dh1     1     217180     00     217180     00
    2     157188     00     157188     00
用于繁殖质粒DNA的RecA缺陷型大肠杆菌菌株能够用附加型DNA(21)修复和进行同源配对。为了排除序列转化是由大肠杆菌介导的可能性，进行Hirt DNA PCR扩增片段的直接DNA测序。通过VentR聚合酶的作用，用第711位两侧的两个引物产生190bp的PCR扩增片段。结果表明，当从p711和Ch1的组合物的转染细胞制备Hirt DNA样品时，第711位是A(70％)与G(30％)的混合物。相反，当从寡核苷酸Dh1制备Hirt DNA时，在711位没有观察到混合序列。这些结果清楚地证实了，用嵌合寡核苷酸进行的序列校正在哺乳动物细胞中发生。
嵌合寡核苷酸的稳定性：测定胞内和含10％FBS的生长培养基中所述嵌合寡核苷酸的稳定性。将10ng放射性标记的寡核苷酸Ch1加入进行组织化学染色和Hirt DNA分析的相同转染实验中(参见参考材料和方法)。所述嵌合寡核苷酸极其稳定。当嵌合寡核苷酸于含10％FBS的生长培养基中温育时，温育24小时后，没有观察到可检测的降解。此外，在同样的温育时间期间，从细胞分离的寡核苷酸也没有显示任何降解。当温育24小时后从细胞分离时，只检测到嵌合寡核苷酸的单体。因此，在这里用的实验条件下，没有观察到嵌合寡核苷酸的首尾连接(Litigation)。实施例2．用CRV修复EB-转化细胞的β-珠蛋白基因
设计了用于修复在镰刀形细胞病β-珠蛋白基因中发现的突变的CRV，即图3的SC1。该分子由含有两个间插块的DNA残基组成，所述间插块为5个DNA的短序列侧翼的10个2’-O-甲基RNA残基组成。当该分子折叠为双链体构象时，一条链只含DNA残基，而另一条键含RNA/DNA块。这样，内部序列和βS-珠蛋白序列中跨越βS突变位点的25个残基序列上的序列互补，粗体并用星号标明的单碱基(T)除外。侧翼为5个DNA残基的RNA的中心大约位于βS编码序列中突变T残基。除了标示粗体和星号的碱基(A)外，用同样方式设计了对照嵌合寡核苷酸(SC2)。βA、βS和密切相关的δ-珠蛋白基因的基因组序列也显示在图3A中，βS突变的特定位点用粗体印刷。
如下制备类淋巴母细胞细胞。从镰刀形细胞病病人和一个既无该病病史也无症状的调查者的一次性临床材料获得肝素处理的血液。通过在Ficoll中进行密度梯度离心，从血液(≈8ml)获得单核细胞，并用在狨猴细胞系B95-8(Coriell Intitute for Medical Research#GM07404D)中繁殖的EB病毒感染。在T25烧瓶中，在10ml补加了20％胎牛血清的RPMI培养基中加入0.1mg的白细胞凝集素PHA-L进行感染。从第5天开始，每周2次给培养物送养料，一旦在第21天时有60-70％的细胞保持存活就认为建立了培养物。βA和βS类淋巴母细胞在含10％胎牛血清的RPMI培养基中保持。
如下把所述CRV引入到βS等位基因纯合的上述类淋巴母细胞中。实验前一天，在24孔组织培养板上，每孔1ml培养基接种细胞1×105个细胞/ml。通过将嵌合寡核苷酸与含3mg DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲铵甲磺酸盐，Boehringer-Mannheim)的20ml 20mM HEPES,pH 7.3混合，于室温温育15分钟，然后加到培养的细胞中进行转染。6小时后，离心收获细胞，洗涤，并制备用于按E.S.Kawasaki的方法(PCR Protocols，编辑M.A.Innis,D.H.Gelford,J.J.Sninsky和T.J.White，第146-152页，Acadamic Press,1990)进行PCR扩增。
利用熟知的由βS突变引起的限制性片段长度多态性估价单碱基突变的校正，参见R.F.Greeves等，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.78:5081；J.C.Chang和Y.W.Kan,1982,N.Eng.J.Med.307:30；S.H.Orkin等，出处同上，第32页；J.T.Wilson等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.79:3628)。βS等位基因中T→A的颠换导致Bsu36I限制酶切位点(CCTGAGG)的丧失。因此，Bsu36I酶切的基因组DNA Southern杂交分析可以检测βS等位基因。正常存在的β-珠蛋白基因的1.2kbp Bsu36IDNA片段在βS等位基因中不存在，并由1.4kpb的诊断片段取代。当从纯合的βS类淋巴母细胞中回收的基因组DNA用这种方法分析时，观察到预期的1.4kbp。然而，在用SC1 CRV转染细胞的DNA中，观察到两个片段。除了1.4kbp片段外还存在1.2kbp片段，表明βS等位基因的部分校正是以剂量依赖性方式进行的。
为了快速、灵敏地测定校正率，我们采用基于PCR的RFLP分析。为了分析β-珠蛋白基因序列，使用引物BG02(5’-TCCTAAGCCAGTGCCAGAAGA-3’(SEQ ID NO:9))和BG05(5’-CTATTGGTCTCCTTAAACCTG-3’(SEQ ID NO:10))和扩增Taq聚合酶(BoehringerMannheim)，从粗细胞裂解液扩增制备345bp的PCR片段。为了分析δ-珠蛋白基因，在扩增反应中用相同的细胞提取物和引物DG06(5’-CTCACAAACTAATGAAACCCTGC-3’(SEQ ID NO:11))和DG07(5’-GAAAACAGCCCAAGGGACAG-3’(SEQ ID NO:12))，产生一个335bp的片段。凝胶用SYBRTM绿(FMC Bioproducts)染色，而荧光强度用Molecular Dynamics的荧光成象器来定量。用ABI 373A测序仪在两个方向上进行DNA测序。
设计上面的引物，在PCR扩增基因组DNA后以产生一个跨越βS突变位点的345个bp片段。正常细胞的片段包含Bsu36I识别序列，并产生228bp和117bp的片段，而来自βS DNA的DNA包含序列CCTGTGG，且难以酶切。分析指出从SC1处理的βS细胞扩增的345bpDNA片段用Bsu36I部分酶切，表明了突变的校正只是在一些染色体上发生，并不是在所有染色体上发生。电泳分离后并用荧光染料SYBRTM绿染色后，通过比较三个DNA片段的相对强度获得定量测量。用激光荧光成象器使着色带成象，并计算它们的相对水平。通过用荧光成象器扫描cyber green染色的琼脂糖凝胶，定量测定转化率。剂量为2.5-25.0pM SC1/105个βS类淋巴母细胞的实验表明，βS→βA的转化率大约为40-50％(图4A)。
镰刀形突变通过CRV SC2的引入频率用上面提出的方法测定。分析表明，在输入嵌合分子的最高水平25nM下，校正水平超过50％，但是即使在2.5nM下，观察到30％的β-蛋白基因也得到校正(图4B)。
PCR扩增的345bp片段的直接测序证实在编码链中T→A的改变。在来自βS的DNA样品中，细胞用高于12nM/105个细胞的较高浓度的嵌合分子SC1转染。序列分析显示了在βS突变位点上A和T残基几乎相等的混合物。用SC1处理时，未处理的βS细胞的DNA在该位点只含有T，而βA细胞的DNA只含A。用对照CRV SC2转染的βS细胞的处理没有引起β-珠蛋白基因序列的改变。然而，正如该序列在预期的序列位点上为T和A残基的混合物所证明，SC2转染的正常细胞的DNA部分转化成βS突变序列。
通过相关δ-珠蛋白基因的测序估价CRV作用的特异性，所述相关δ-珠蛋白基因90％以上与β-珠蛋白基因同源。β和δ珠蛋白基因在SC15bp DNA的核心靶区上相同。在图3中在两个不同的单碱基下划线。为了确定SC2是否改变了δ-珠蛋白基因，如上进行了序列分析。结果显示：与观察到的由SC2在βA-珠蛋白序列中指导的改变相反，SC2CRV没有在δ-珠蛋白基因中引入改变。实施例3．CRV修复HSC的β-珠蛋白基因的实验用法材料和方法
干细胞分离和转染：连续5天一天两次皮下给与正常志愿者G-CSF 300μg。在G-CSF治疗的第四天和第五天，他们利用COBE波谱除去仪(spectra pheresis machine)经过4小时干细胞单采血液成分术。通过在Ficoll-Hypaqne(密度1.077g/ml,Pharmacia)上的密度梯度离心(2000rpm,10分钟，室温)制备单核细胞。粘附到塑料上后除去大部分单核细胞(30分钟，37℃,5％CO2，含10％FBS的RPMI)。通过旋转以取出松散粘附在塑料上的细胞，收获细胞，用PBS洗涤三次。该群体在含生物素化鼠抗CD34抗体的PBS/1％BSA中于室温温育25分钟，浓度为100×106个细胞/ml。使抗体处理过的细胞通过抗生物素蛋白柱，收集通过柱子的细胞进行分析。随后用PBS洗涤柱子，粘附在柱子上的CD34+细胞通过挤压柱子回收。最后的纯度通过FACS来估价。
将细胞再悬浮于含10％热失活FCS的RPMI中，将1×105个细胞/ml铺平板于24孔板中，每孔接受1×105个细胞。将所示量的嵌合寡核苷酸与20μl 20mM pH7.3 HEPES中的3μg DOTAP混合。混合物冰浴15分钟，然后加到细胞中。于37℃5％CO2下培养16小时后，收获细胞，将其沉淀，用PBS洗涤，并用裂解缓冲液裂解。
PCR扩增和分析．分别用PCD2(5’-TCCTAAGCCAGTGCCAGAAGA-3’(SEQ ID NO:13))和PCO5(5’-CT ATTGGTCTCCTTAAACCTG-3’(SEQ ID NO:14))和扩增Taq聚合酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)在50μl的反应中，于94℃30秒、于52.5℃30秒、于72℃30秒进行35个循环，PCR扩增基因组DNA，产生一个345bp的片段。对于对δ基因座，5’引物是5’-CTCAC AAACCTAATGAAACCCTGC-3’(SEQ ID NO:15),3’引物为5’-GAA AACAGCCCAAGGGACAG-3’(SEQ ID NO:16)，于94℃30秒、于59℃30秒、于72℃30秒，进行35个循环。
PCR产物用DdeI或BSU36I限制性核酸内切酶(New EnglandBiolabs,Beverly,MA)消化，加样到1.2％琼脂糖凝胶(1×TBS)进行电泳。该凝胶于含1∶20,000 cyber green strain(FMC,Rockland,ME)的200ml 1×TBE中暗处染色20分钟，通过荧光成象器(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)定量。PCR产物通过Qiaquick PCR纯化离心柱(purification spin colume)(Qiagen,Chatsworth,CA)在水中离心，真空干燥至5μl，并且用260nm的O.D分光测定其浓度。DNA样品(30μg)通过自动Applied Biosystems Model 373A DNA测序系统(AppliedBiosystems,Foster Cify,CA)直接测序。
寡核苷酸的合成和纯化：采用1000宽孔CPG，在ABI 394DNA/RNA合成仪上在0.2μmol范围合成嵌合寡核苷酸。在这种构成物中，DNA亚磷酰胺(Applied Biosystem)的外向环氨基用苯甲酰基保护腺嘌呤和胞嘧啶，用异丁酰基保护鸟嘌呤。2’-甲氧基RNA亚磷酰胺(Glen Research,Sterling.VA)用苯氧乙酰基保护腺嘌呤，用二甲基甲脒保护鸟嘌呤，用异丁酰基保护胞嘧啶。合成后，通过在乙醇∶浓氢氧化铵(1∶3)中于55℃加热20小时除去碱基保护基。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化粗品寡核苷酸，该样品与7M脲素和10％甘油混合，加热到70℃，然后加到含7M脲素的聚丙烯酰胺凝胶上。凝胶电泳后，通过UV照射使DNA条带可见，从该凝胶上切下DNA条带，压碎并在TE缓冲液(10mM Tris-HCl和1mM EDTA pH7.5)中振荡过夜洗脱。含凝胶碎片的洗脱液通过0.45μm离心滤器(Millipore,Bedfod,MA)离心，并用乙醇沉淀。样品于G-25离心柱(Boehringer Mannheim)进一步脱盐，并且发现95％以上的纯化寡核苷酸是全长的。结果
分离的CD34+富集群体首先用于寡核苷酸吸收实验。除了放射性标记置于该寡核苷酸的5’末端外，在上述条件下将嵌合分子SC2与脂质体制剂DOTAP混合。将增加量的标记的和未标记的寡核苷酸与所述脂质体温育15分钟。然后该混合物与细胞温育6小时后，细胞用PBS彻底洗脱，以降低非特异性结合。然后离心细胞，沉淀部分用0.2M甘油(pH4.5)洗涤，以除去残留的非特异性结合。用闪烁计数测定细胞沉淀中的放射活性。细胞以剂量依赖性方式吸收所述嵌合寡核苷酸。因为我们的实验策略集中在nM浓度上，所以我们不能将曲线延伸超过25nM。基于放射性标记的嵌合寡核苷酸的比活，且假定每个细胞对转化有同样的接受能力，我们估计至大约50％的CD34+细胞群体受该底物转染。对于每个实验，背景水平可通过放射性标记的嵌合分子在没有DOTAP时与细胞混合来进行估价，并且该水平从不会超过0.05％。
用不同量的SC2和3μg/ml的DOTAP转染含有βA基因型的两个等位基因的CD34+富集细胞群体。如上述转染16小时后，分离基因组DNA,βA→βS的转化程度通过限制性酶多态性和直接DNA测序来测定。从105个细胞分离的基因DNA，用两个引物PCO2和PCO5进行PCR扩增，产生一个345bp的片段。用限制性内切酶DdeI酶切βA特异性序列，产生分别为192bp、108bp和45bp的三个片段，而βS序列只酶切一次，产生300bp和45bp的片段。观察到未酶切的300bp片段的水平随SC2浓度的增大而增加，表明βA→βS基因型的转化，参见图5。在相对低浓度(600ng=30nM×1ml)的嵌合寡核苷酸下观察到50％的转化率。相反，在用SC1处理的细胞中没有观察到转化，SC1为与βA位点配对的完全互补的嵌合分子。
为了证明在正常细胞中DNA序列的改变(A→T)，进行345bp片段的直接DNA测序。如上述用23nM SC2转染含纯合βA等位基因的CD34+群体。分离基因组DNA，进行PCR扩增，然后对样品进行自动DNA测序。单独的βADNA序列和SC1处理的βA DNA序列都包含T。相反，用SC2处理的βA细胞的DNA序列在预期位置上显示A→T的剂量依赖性转化。SC2 CRV包含一个与β-珠蛋白基因编码链相同的(a)区段。命名为SC5的CRV包含一个与β-珠蛋白基因的非编码链片段相同的(a)区段。我们用SC2和SC5重复上述的转染实验。结果见图5，表明尽管没有SC2活性强，但SC5是有活性的，在低于20nM下似乎无活性。
来自已经用SC2处理的βA细胞的基因组DNA用两个δ-珠蛋白特异引物PCO6和PCO7进行PCR扩增。只发现了野生型δ-珠蛋白序列，这证明了SC2 CRV对β-珠蛋白是特异性的。
                                                  表Ⅰ
                                                                                            β地中海贫血
密码子 碱基置换 受影响的人种群                靶序列在受影响序列或密码子下已划线 SEQ ID NO:
                                       非功能性mRNA无义突变体
    17     A→T     中国人 GCC CTG TGG GGC AAG GTG AAC GTG GAT     17
    39     C→T     地中海/欧洲人 TAC CCT TGG ACC CAG AGG TTC TTT GAG     18
    15     G→A     印度人 GTT ACT GCC CTG TGG GGC AAG GTG AAC     19
    121     A→T     波兰人/瑞士人 CAC TTT GGC AAA GAA TTC ACC CCA CCA     20
    37     G→A     沙特阿拉伯人 GTG GTC TAC CCT TGG ACC CAG AGG TTC     21
    43     G→T     中国人 CAG AGG TTC TTT GAG TCC TTT GGG GAT     22
    61     A→T     黑人 AAC CCT AAG GTG AAG GCT CAT GGC AAG     23
    35     C→A     泰国人 CTG CTG GTG GTC TAC CCT TGG ACC CAG     24
                                                                                   非功能性mRNA移码突变体
    1     -G缺失     地中海人 ACA GAC ACC ATG GTG CAC CTG ACT CCT     25
    5     -CT缺失     地中海人 GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCY     26
    6     -A缺失     地中海人 CAC CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCY GCN     27
    8     -AA缺失     土耳其人 ACT CCT GAG GAG AAG TCY GCN GTT ACT     28
    8/9     +G插入     印度人 ACT CCT GAG GAG AAG TCY GCN GTT ACT     29
    11     -T缺失     墨西哥人 GAG AAG TCT GCC GTT ACT GCC CTG TGG     30
    14/15     +G插入     中国人 GCC GTT ACT GCC CTG TGG GGC AAG GTG AAC     31
    16     -C缺失     印度人 ACT GCC CTG TGG GGC AAG GTG AAC GTG     32
    27-28     +C插入     中国人 GTT GGT GGT GAG GCC CTG GGC AGG CTG CTG     33
    35     -C缺失     印度尼西亚人 CTG CTG GTG GTC TAC CCT TGG ACC CAG     34
    36-37     -T缺失     伊朗人 CTG GTG GTC TAC CCT TGG ACC CAG AGG TTC     35
                                                  β地中海贫血
密码子 碱基置换 受影响的人种群                  靶序列在受影响序列或密码子下已划线 SEQ ID NO:
    37     -G缺失     库尔德人 GTG GTC TAC CCT TGG ACC CAG AGG TTC TTT     36
41/42 -CTTT缺失 印度人/中国人 TGG ACC CAG AGG TTC TTT GAG TCC TTT GGG 37
    44     -C缺失     库尔德人 AGG TTC TTT GAG TCC TTT GGG GAT CTG     38
    47     +A插入     苏利南黑人 GAG TCC TTT GGG GAT CTG TCC ACT CCT     39
    64     -G缺失     瑞士人 GTG AAG GCT CAT GGC AAG AAA GAG CTC     40
    71     +T插入     中国人 GTG CTC GGT GCC TTT AGT GAT GGC CTG     41
    71/72     +A插入     中国人 GTG CTC GGT GCC TTT AGT GAT GGC CTG GCT     42
    76     -C缺失     意大利人 AGT GAT GGC CTG GCT CAC CTG GAC AAC     43
    82/83     -G缺失     阿塞拜疆人 CTG GAC AAC CTC AAG GGC ACC TTT GCC ACA     44
    94     +TG插入     意大利人 GAG CTG CAC TGT GAC AAG CTG CAC GTG     45
    106/107     +G插入     美洲黑人 AAC TTC AGG CTC CTG GGC AAC GTG CTG GTC     46
    109     -G缺失     立陶宛人 CTC CTG GGC AAC GTG CTG GTC TGT GTG     47
    126     -T缺失     意大利人 TTC ACC CCA CCA GTG CAG GCN GCC TAT     48
                                                   起始密码子突变体
    ATG-AGG     中国人 CAA ACA GAC ACC ATG GTG CAC CTG ACT     49
    ATH-ACG     南斯拉夫人 CAA ACA GAC ACC ATG GTG CAC CTG ACT     50
                                                  RNA加工突变体-剪接界变化
    IVS1第1位     G→A     地中海人 GAG GCC CTG GGC AGG TTG GTA TCA AGG     51
    IVS1第1位     G→T     印度人/中国人 GAG GCC CTG GGC AGG TTG GTA TCA AGG     52
    IVS2第1位     G→A     地中海人/突尼斯人/美洲黑人 GAG AAC TTC AGG GTG AGT CTA TGG GAC     53
    IVS1第2位     T→G     突尼斯人 GCC CTG GGC AGG TTG GTA TCA AGG TTA     54
    IVS1第2位     T→C     黑人 GCC CTG GGC AGG TTG GTA TCA AGG TTA     55
   1                                                      β地中海贫血
密码子 碱基置换 受影响的人种群                靶序列在受影响序列或密码子下已划线 SEQ ID NO:
    IVS13’末端     G→C     意大利人     TTT CCC ACC CTT AGG CTG CTG GTG GTC     56
    IVS23’末端     A→G     美洲黑人     ATC TTC CTC CCA CAG CTC CTG GGC AAC     57
    IVS23’末端     A→C     美洲黑人     ATC TTC CTC CCA CAG CTC CTG GGC AAC     58
    IVS13’末端     G→A     埃及人     TTT CCC ACC CTT AGG CTG CTG GTG GTC     59
                                        RNA加工突变体-共有变化
    IVS1第5位     G→C     印度人/中国人/美拉尼西亚人    CTG GGC AGG TTG GTA TCA AGG TTA CAA     60
    IVS1第5位     G→T     地中海人/黑人    CTG GGC AGG TTG GTA TCA AGG TTA CAA     61
    IVS1第5位     G→A     阿尔及利亚人    CTG GGC AGG TTG GTA TCA AGG TTA CAA     62
    IVS1第-1位(密码子30)     G→C     突尼斯人/黑人    GAG GCC CTG GGC AGG TTG GTA TCA AGG     63
    1VS1第-1位(密码子30)     G→A     保加利亚亚人    GAG GCC CTG GGC AGG TTT GTA TCA AGG     64
    IVS1第-3位(密码子29)     C→T     黎巴嫩人    GGT GAG GCC CTG GGC AGG TTG GTA TCA     65
    IVS23’末端     CAG→AAG     伊朗人/埃及人/黑人 ATC TTC CTC CCA CAG CTC CTG GGC AAC GTG     66
    IVS13’末端     TAG→GAG     沙特阿拉伯人 TAT TTT CCC ACC CTT AGG CTG CTG GTG GTC     67
                                                  内部内含子变化
    IVS1第110位     G→A     地中海人 TCT CTC TGC CTA TTT TGG TCT ATT TTT CCC     68
    IVS1第116位     T→G     地中海人    TGC CTA TTG GTC TAT TTT CCC ACC CTT     69
    IVS2第705位     T→G     地中海人    AAA TTG TAA CTG ATG TAA GAG GTT TCA     70
    IVS2第745位     C→G     地中海人73 AGC AGC TAC AAT CCA GCT ACC ATT CTG CTT     71
    IVS2第654位     C→T     中国人303    TTT CTG GGT TAA GGC AAT AGC AAT ATT     72
                                              β地中海贫血
密码子 碱基置换 受影响的人种群               靶序列在受影响序列或密码子下已划线 SEQ ID NO:
                                        影响加工的编码区置换
    26     G→A     东南亚人 GAA GTT GGT GGT GAG GCC CTG GGC AGG     73
    24     T→A     美洲黑人 GTG GAT GAA GTT GGT GGT GAG GCC CTG     74
    27     G→T     地中海人 GTT GGT GGT GAG GCC CTG GGC AGG CTG     75
    19     A→G     马来西亚人 CTG TGG GGC AAG GTG AAC GTG GAT GAA GTT     76
该信息摘自The Metabolie and Molecular Bases of Inherited Disease,Chartes R.Seriver编辑(John B.Stanbury,James M.Wyngaarden,Donald S.Frederickson，顾问编辑)第七版，McGraw-Hill,Health Profesions Division，纽约，1995.
                                                     高歇氏病
cDNA编号 氨基酸编号 基因组编号 核苷酸置换     氨基酸置换            靶序列在突变的核苷酸下划线 SEQ ID NO:
    常见的
    1226     370     5841     A→G     Asn→Ser     AGC ATC ATC ACG AAC CTC CTG TAC CAT     77
    1448     444     6433     T→C     Leu→Pro     CAG AAG AAC GAC CTG GAC GCA GTG GCA     78
    84     1035     G→GG插入     CCT AAA AGC TTC GGC TAC AGC TCG GTG     79
    非常见的
    IVS2     1067     G→A     TGT CGT GGG CAT CAG GTG AGT GAG TCA     80
    754     213     3548     T→A     Phe→Ile     TGG GCC AGA TAC TTT GTG AAG TTC CTG     81
    1192     359     5408     C→T     Arg→终止     GGC TCC TGG GAT CGA GGG ATG CAG TAC     82
    1193     359     5409     G→A     Arg→Gln     GGC TCC TGG GAT CGA GGG ATG CAG TAC     83
    1297     394     5912     G→T     Val→Len     GGA CCC AAT TGG GTG CGT AAC TTT GTC     84
    1342     409     5957     G→C     Asp→His     GAC ATC ACC AAG GAC ACG TTT TAC AAA     85
    1504     463     6489     C→T     Arg→Cys     GTC CTA CTA AAC CGC TCC TCT AAG GAT     86
    1604     496     6683     G→A     Arg→His     TAC CTG TGG CGT CGC CAG TGA TGG AGC     87
                         序列表(1)一般资料
(ⅰ)申请人：
    (A)收信人：Thomas Jeffrson University
(ⅱ)发明名称：治疗突变引起的疾病的方法和化合物
(ⅲ)序列数：100
(ⅳ)通信地址：
    (A)收信人：Pennie & Edmonds
    (B)街道：1155 Avenue of the Americas
    (C)城市：纽约
    (D)州：纽约
    (E)国家：美国
    (F)邮政编码：10036-2711
(ⅴ)计算机可读形式
    (A)媒体类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本1.30
(ⅵ)当前中请数据
    (A)申请号：PCT/US97/
    (B)提交日期：1997年5月1日
    (C)分类：
(ⅶ)在先申请数据
    (A)申请号：
    (B)提交日期：
(ⅷ)代理律师/代理人资料
    (A)姓名：Friebel,Thomas E
    (B)注册号：29,258
    (C)参考/档案号：7991-011-228
(ⅸ)电讯资料
    (A)电话：(212)790-9090
    (B)传真：(212)869-9741/8864
    (C)电报：66141 PENNIE(2)SEQ ID NO:1的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:CACCTGACTC CTGAGGAGAA GTCTGCC                                        27(2)SEQ ID NO:2的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:GAAGTTGGTG GTGAGGCCCT GGGCAGG                                        27(2)SEQ ID NO:3的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：17个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:CCGCCTACAC CCACTCG                                                   17(2)SEQ ID NO:4的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：17个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:CCGCCTACGC CCACTCG                                                   17(2)SEQ ID NO:5的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：21个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:CAATGTCCCT GATGTTATGC A                                              21(2)SEQ ID NO:6的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：18个碱基对
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(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:CGCTGGGCCA AGGACGCT                                                  18(2)SEQ ID NO:7的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：21个碱基对
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    (C)链型：单链
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(ⅱ)分子类型：DNA
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(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：18个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
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(ⅱ)分子类型：DNA
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(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：21个碱基对
    (B)类型：核酸
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(ⅱ)分子类型：DNA
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(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：21个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
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(ⅱ)分子类型：DNA
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(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：23个碱基对
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(ⅱ)分子类型：DNA
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(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：20个碱基对
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(ⅱ)分子类型：DNA
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(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：21个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13:TCCTAAGCCA GTGCCAGAAG A                                          21(2)SEQ ID NO:14的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：21个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
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(ⅱ)分子类型：DNA
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(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：24个碱基对
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(ⅱ)分子类型：DNA
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(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：20个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
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(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
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    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
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(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
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(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18:TACCCTTGGA CCCAGAGGTT CTTTGAG                          27(2)SEQ ID NO:19的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19:GTTACTGCCC TGTGGGGCAA GGTGAAC                    27(2)SEQ ID NO:20的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20:CACTTTGGCA AAGAATTCAC CCCACCA                    27(2)SEQ ID NO:21的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:21:GTGGTCTACC CTTGGACCCA GAGGTTC                    27(2)SEQ ID NO:22的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
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(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:22:CAGAGGTTCT TTGAGTCCTT TGGGGAT                    27(2)SEQ ID NO:23的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:23:AACCCTAAGG TGAAGGCTCA TGGCAAG                    27(2)SEQ ID NO:24的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:24:CTGCTGGTGG TCTACCCTTG GACCCAG                    27(2)SEQ ID NO:25的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:25:ACAGACACCA TGGTGCACCT GACTCCT                    27(2)SEQ ID NO:26的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:26:GTGCACCTGA CTCCTGAGGA GAAGTCY                    27(2)SEQ ID NO:27的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:27:CACCTGACTC CTGAGGAGAA GTCYGCN                    27(2)SEQ ID NO:28的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:28:ACTCCTGAGG AGAAGTCYGC NGTTACT                    27(2)SEQ ID NO:29的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:29:ACTCCTGAGG AGAAGTCYGC NGTTACT                    27(2)SEQ ID NO:30的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:30:GAGAAGTCTG CCGTTACTGC CCTGTGG                    27(2)SEQ ID NO:31的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:31:GCCGTTACTG CCCTGTGGGG CAAGGTGAAC                 30(2)SEQ ID NO:32的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:32:ACTGCCCTGT GGGGCAAGGT GAACGTG                    27(2)SEQ ID NO:33的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:33:GTTGGTGGTG AGGCCCTGGG CAGGCTGCTG                 30(2)SEQ ID NO:34的信息：
(ⅱ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:34:CTGCCTGGTGG TCTACCCTTG GACCCAG                   27(2)SEQ ID NO:35的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:35:CTGGTGGTCT ACCCTTGGAC CCAGAGGTTC                 30(2)SEQ ID NO:36的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:36:GTGGTCTACC CTTGGACCCA GAGGTTCTTT                 30(2)SEQ ID NO:37的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:37:TGGACCCAGA GGTTCTTTGA GTCCTTTGGG                 30(2)SEQ ID NO:38的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:38:AGGTTCTTTG AGTCCTTTGG GGATCTG                    27(2)SEQ ID NO:39的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:39:GAGTCCTTTG GGGATCTGTC CACTCCT                    27(2)SEQ ID NO:40的信息：
(ⅱ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:40:GTGAAGGCTC ATGGCAAGAA AGTGCTC                    27(2)SEQ ID NO:41的信息:
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:41:GTGCTCGGTG CCTTTAGTGA TGGCCTG                    27(2)SEQ ID NO:42的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:42:GTGCTCGGTG CCTTTAGTGA TGGCCTGGCT                 30(2)SEQ ID NO:43的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:43:AGTGATGGCC TGGCTCACCT GGACAAC                    27(2)SEQ ID NO:44的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:44:CTGGACAACC TCAAGGGCAC CTTTGCCACA                 30(2)SEQ ID NO:45的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:45:GAGCTGCACT GTGACAAGCT GCACGTG                    27(2)SEQ ID NO:46的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:46:AACTTCAGGC TCCTGGGCAA CGTGCTGGTC                 30(2)SEQ ID NO:47的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:47:CTCCTGGGCA ACGTGCTGGT CTGTGTG                    27(2)SEQ ID NO:48的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
     (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:48:TTCACCCCAC CAGTGCAGGC NGCCTAT                    27(2)SEQ ID NO:49的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:49CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACT                    27(2)SEQ ID NO:50的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:50:CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACT                    27(2)SEQ ID NO:51的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:51:GAGGCCCTGG GCAGGTTGGT ATCAAGG                    27(2)SEQ ID NO:52的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ IDNO:52:GAGGCCCTGG GCAGGTTGGT ATCAAGG                    27(2)SEQ ID NO:53的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:53:GAGAACTTCA GGGTGAGTCT ATGGGAC                    27(2)SEQ ID NO:54的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:54:GCCCTGGGCA GGTTGGTATC AAGGTTA                    27(2)SEQ ID NO:55的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:55:GCCCTGGGCA GGTTGGTATC AAGGTTA                    27(2)SEQ ID NO:56的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:56:TTTCCCACCC TTAGGCTGCT GGTGGTC                   27(2)SEQ ID NO:57的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:57:ATCTTCCTCC CACAGCTCCT GGGCAAC                    27(2)SEQ ID NO:58的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:58:ATCTTCCTCC CACAGCTCCT GGGCAAC                    27(2)SEQ ID NO:59的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:59:TTTCCCACCC TTAGGCTGCT GGTGGTC                    27(2)SEQ ID NO:60的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:60:CTGGGCAGGT TGGTATCAAG GTTACAA                    27(2)SEQ ID NO:61的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:61:CTGGGCAGGT TGGTATCAAG GTTACAA                    27(2)SEQ ID NO:62的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:62:CTGGGCAGGT TGGTATCAAG GTTACAA                   27(2)SEQ ID NO:63的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:63:GAGGCCCTGG GCAGGTTGGT ATCAAGG                    27(2)SEQ ID NO:64的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:64:GAGGCCCTGG GCAGGTTGGT ATCAAGG                    27(2)SEQ ID NO:65的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:65:GGTGAGGCCC TGGGCAGGTT GGTATCA                    27(2)SEQ ID NO:66的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:66:ATCTTCCTCC CACAGCTCCT GGGCAACGTG                 30(2)SEQ ID NO:67的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:67:TATTTTCCCA CCCTTAGGCT GCTGGTGGTC                 30(2)SEQ ID NO:68的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:68:TCTCTCTGCC TATTGGTCTA TTTTCCC                    27(2)SEQ ID NO:69的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEO ID NO:69:TGCCTATTGG TCTATTTTCC CACCCTT                    27(2)SEQ ID NO:70的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:70:AAATTGTAAC TGATGTAAGA GGTTTCA                    27(2)SEQ ID NO:71的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:71:AGCAGCTACA ATCCAGCTAC CATTCTGCTT                 30(2)SEQ ID NO:72的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:72:TTTCTGGGTT AAGGCAATAG CAATATT                    27(2)SEQ ID NO:73的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:73:GAAGTTGGTG GTGAGGCCCT GGGCAGG                    27(2)SEQ ID NO:74的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:74:GTGGATGAAG TTGGTGGTGA GGCCCTG                    27(2)SEQ ID NO:75的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:75:GTTGGTGGTG AGGCCCTGGG CAGGCTG                    27(2)SEQ ID NO:76的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:76:CTGTGGGGCA AGGTGAACGT GGATGAAGTT                 30(2)SEQ ID NO:77的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:77:AGCATCATCA CGAACCTCCT GTACCAT                    27(2)SEQ ID NO:78的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:78:CAGAAGAACG ACCTGGACGC AGTGGCA                    27(2)SEQ ID NO:79的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:79:CCTAAAAGCT TCGGCTACAG CTCGGTG                    27(2)SEQ ID NO:80的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:80:TGTCGTGGGC ATCAGGTGAG TGAGTCA                    27(2)SEQ ID NO:81的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
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(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:81:TGGGCCAGAT ACTTTGTGAA GTTCCTG                    27(2)SEQ ID NO:82的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
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(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:82:GGCTCCTGGG ATCGAGGGAT GCAGTAC                    27(2)SEQ ID NO:83的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
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(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:83:GGCTCCTGGG ATCGAGGGAT GCAGTAC                    27(2)SEQ ID NO:84的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:84:GGACCCAATT GGGTGCGTAA CTTTGTC                    27(2)SEQ ID NO:85的信息：
(ⅱ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:85:GACATCACCA AGGACACGTT TTACAAA                    27(2)SEQ ID NO:86的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:86:GTCGTGCTAA ACCGCTCCTC TAAGGAT                    27(2)SEQ ID NO:87的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：未知
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:87:TACCTGTGGC GTCGCCAGTG ATGGAGC                    27(2)SEQ ID NO:88的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：68个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：Ch1
    (B)位置：1...68
    (D)其他信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:88:AGCGCCGCCT ACGCCCACTC GGCTGTTTTC AGCAGCGUGG GCGTAGGCGG CGCUGCGCGT     60TTTCGCGC                                                              68(2)SEQ ID NO:89的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：68个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：Ch2
    (B)位置：1...68
    (D)其他信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:89:AGCGCCGCCT ACACCCACTC GGCTGTTTTC AGCCGAGUGG GTGTAGGCGG CGCUGCGCGT    60TTTCGCGC                                                             68(2)SEQ ID NO:90的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：68个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：Ch3
    (B)位置：1...68
    (D)其他信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:90:GCGCGTTTTC GCGCAGCGCC GCCUACGCCC ACUCGGCUGT TTTCAGCCGA GTGGGCGTAG     60GCGGCGCT                                                              68(2)SEQ ID NO:91的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：68个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：Dh1
    (B)位置：1...68
    (D)其他信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:91:AGCGCCGCCT ACGCCCACTC GGCTGTTTTC AGCCGAGTGG GCGTAGGCGG CGCTGCGCGT    60TTTCGCGC                                                             68(2)SEQ ID NO:92的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：36个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:92:ACCCCCAGCG CCGCCTACAC CCACTCGGCT GACCGG                              36(2)SEQ ID NO:93的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：68个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：SC1
    (B)位置：1...68
    (D)其他信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:93:ACCTGACTCC TGAGGAGAAG TCTGCTTTTG CAGACUUCUC CTCAGGAGUC AGGUGCGCGT    60TTTCGCGC                                                             68(2)SEQ ID NO:94的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：68个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：SC2
    (B)位置：1...68
    (D)其他信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:94:ACCTGACTCC TGTGGAGAAG TCTGCTTTTG CAGACUUCUC CACAGGAGUC AGGUGCGCGT    60TTTCGCGC                                                             68(2)SEQ ID NO:95的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：68个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：SC3
    (B)位置：1...68
    (D)其他信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:95:ATCTGACTCC TGAGGAGAAG ACTGCTTTTG CAGUCUUCUC CTCAGGAGUC AGAUGCGCGT    60TTTCGCGC                                                             68(2)SEQ ID NO:96的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：68个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：SC4
    (B)位置：1...68
    (D)其他信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:96:ACCTGACTCC TGAGGAGAAG ACTGCTTTTG CAGUCUUCUC CTCAGGAGUC AGGUGCGCGT     60TTTCGCGC                                                              68(2)SEQ ID NO:97的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：68个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：SC5
    (B)位置：1...68
    (D)其他信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:97:GCGCGTTTTC GCGCACCUGA CUCCTGTGGA GAAGUCUGCT TTTGCAGACT TCTCCACAGG     60AGTCAGGT                                                              68(2)SEQ ID NO:98的信息:
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：25个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：δ
    (B)位置：1...25
    (D)其他信息：
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:98:ATCTGACTCC TGAGGAGAAG ACTGC                                                    25(2)SEQ ID NO:99的信息:
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:99:CACCTGACTC CTGAGGAGAA GTCTGCC                                        27(2)SEQ ID NO:100的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:100:GAAGTTGGTG GTGAGGCCCT GGGCAGG                                 27

Claims (20)

1．最多具有一个3’端和一个5’端的核酸，它具有一个未配对碱基的区段，该区段的配置使得所述未配对碱基将该核酸分成了第一条链和第二条链，所述第一条链和第二条链分别包含第一区和第二区，每个区有至少15个核苷酸，其中：
(a)所述第一区的每个核苷酸与所述第二区的一个核苷酸是Watson-Crick配对的；
(b)第一区包含至少8个核糖核苷酸，与2’-脱氧核苷酸是Watson-Crick配对的，这些核糖核苷酸形成至少一个核糖核苷酸区段，所述区段至少有3个核糖核苷酸。
(c)所述第一区或所述第二区的序列是人类基因野生型等位基因片段的序列。
2．权利要求1的核酸，提供的人类基因不是ras基因。
3．权利要求1的核酸，其中所述第一区或所述第二区的序列是5’-AGC GCC GCC TAC GCC CAC TCG GCT GT-3’(SEQ ID NO:88的核苷酸1-26)或其片段。
4．权利要求2的核酸，提供的人类基因不是编码碱性磷酸酶的基因。
5．权利要求1的核酸，其中所述第一区由至少6个相邻核糖核苷酸的第一核糖核苷酸区段、至少3个核糖核苷酸的第二核糖核苷酸区段及在第一和第二核糖核苷酸区段之间配置的间插区段组成，所述插入区段包含至少有3个2’-脱氧核糖核苷酸。
6．权利要求4的核苷酸，其中所述第二区包含大约20-100个2’-脱氧核糖核苷酸。
7．权利要求5的核酸，其中所述第一和第二核糖核苷酸区段各由大约6至大约13个核糖核苷酸组成，所述间插区段由大约4-20个2’-脱氧核糖核苷酸组成。
8．权利要求5的核酸，其中所述第一和第二核糖核苷酸区段各由大约8-12个核糖核苷酸组成，所述间插区段由大约4-15个2’-脱氧核糖核苷酸组成。
9．权利要求5的核酸，其中所述第一和第二核糖核苷酸区段分别由大约10个核糖核苷酸组成，所述间插区段由大约5个2’-脱氧核糖核苷酸组成。
10．权利要求3的核酸，其中所述人类基因选自β-珠蛋白基因和葡糖脑苷酯酶基因。
11．权利要求9的核酸，其中所述第一或第二区的序列选自表Ⅰ的序列或为其片段。
12．权利要求9的核酸，其中所述第一或第二区的序列是5’-CACCTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT GCC-3’(SEQ ID NO:99)或者5’-GAA GTT GGT GGT GAG GCC CTG GGC AGG-3’(SEQ ID NO:100)或者是其片段。
13．修复人类受治疗者的细胞突变的方法，包括从患有CRV可修复细胞突变的存在引起的疾病的受治疗者中取出细胞，并把核酸引入到取出的细胞中，其中所述核酸最多具有一个3’端和一个5’端，并包含一个未配对碱基的区段，该区段的配置使得所述未配对碱基将该核酸分成了第一条链和第二条链，所述第一条链和第二条链分别包含第一区和第二区，每个区有至少15个核苷酸，其中：
(a)所述第一区的每个核苷酸与所述第二区的一个核苷酸是Watson-Crick配对的；
(b)所述第一区包含至少8个核糖核苷酸，与2’-脱氧核苷酸是Watson-Crick配对的，这些核糖核苷酸形成至少一个区段，所述区段至少有3个核糖核苷酸；并且
(c)所述第一区或所述第二区的序列是人类基因野生型等位基因片段的序列，所述片段包含CRV可修复突变。
14．权利要求12的方法，其中所述第一区或所述第二区的序列是5’-AGC GCC GCC TAC GCC CAC TCG GCT GT-3’(SEQ ID NO:88的核苷酸1-26)或者是其片段。
15．权利要求12的方法，它还包括把修复的细胞再植入所述受治疗者体内的步骤。
16．权利要求13的方法，其中所述核酸的第一区由至少6个相邻核糖核苷酸的第一核糖核苷酸区段、第二核糖核苷酸区段及在所述第一和第二核糖核苷酸区段之间配置的间插区段组成，所述插入区段包含至少3个2’-脱氧核糖核苷酸，并且其中所述细胞是造血干细胞。
17．权利要求14的方法，其中所述间插区段包含所述CRV可修复突变。
18．权利要求14的方法，其中所述人类基因选自β-珠蛋白基因和葡糖脑苷酯酶基因。
19．权利要求16的方法，其中所述第一区或第二区的序列选自表Ⅰ的序列或者是其片段。
20．权利要求16的方法，其中所述第一区或第二区的序列是5’-CAC CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT GCC-3’(SEQ ID NO:99)或5’-GAA GTT GGT GGT GAG GCC CTG GGC AGG-3’(SEQ ID NO:100)或是其片段。
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