ES2625154T3 - Métodos y composiciones para producir escualeno empleando levaduras - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende una levadura transformada genéticamente, en donde dicha levadura transformada genéticamente expresa una o más enzimas modificadas que tienen una o más mutaciones diseñadas, dicha enzima o enzimas modificadas comprenden escualeno epoxidasa, en donde dicha escualeno epoxidasa tiene una actividad y/o expresión reducida, en donde dicha mutación o mutaciones diseñadas están en posiciones determinadas dentro de dicha enzima, en donde dicha levadura produce cantidades aumentadas de escualeno en comparación con la levadura nativa, y en donde la levadura es una cepa de Yarrowia lipolytica que se selecciona del grupo que consiste en ATCC 90812, ATCC MYA-2613, o Yeastern polg.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y composiciones para producir escualeno empleando levaduras Campo de la invencion

Se describen metodos y composiciones para producir isoprenoides, tales como escualeno, empleando levaduras. Antecedentes de la invencion

La siguiente descripcion de los antecedentes de la invencion se proporciona simplemente como una ayuda para comprender la invencion y no se admite para describir o constituir una tecnica anterior a la invencion.

Los isoprenoides, tales como escualeno, son un tipo de lfpidos importantes comercialmente. Son excelentes lubricantes, estabilizantes oxidativos, con bajos puntos de fusion y de congelacion, altos puntos de ebullicion, y facil biodegradabilidad. El escualeno se produce en la actualidad mediante la extraccion a partir del aceite de oliva o del aceite de dgado de tiburon en agua fna a un elevado coste por unidad. Debido al alto coste por unidad, los usos viables economicamente para escualeno y escualano (el derivado completamente hidrogenado del escualeno) estan en aplicaciones de mercado reducido, tal como lubricantes de relojes, composiciones farmaceuticas/nutraceuticas, cosmeticos, perfumes y como intermediarios qdmicos para productos de elevado valor. Existen, sin embargo, significativos mercados potenciales para los lubricantes biodegradables, aditivos lubricantes, y fluidos hidraulicos. Es particularmente importante la biodegradabilidad de estos productos para aplicaciones sensibles con el medio ambiente, tales como en aplicaciones en la agricultura, o cuando fluidos hidraulicos o lubricantes importantes puedan aparecer en el medio ambiente. Los mercados potenciales para los lubricantes biodegradables, aditivos lubricantes y fluidos hidraulicos, son muy amplios, se estima que es del orden de cinco millones de toneladas al ano.

Estan disponibles lubricantes biodegradables, aditivos lubricantes, y fluidos hidraulicos derivados de grasas vegetales y animales, pero tienen inconvenientes. Normalmente solidifican a temperaturas relativamente altas (es decir, solidifican en fno) y tienen puntos de ebullicion que son demasiado bajos para emplear en condiciones de calor (es decir, se descomponen o combustionan bajo condiciones normales de motor en caliente).

Por tanto, se desea un metodo de produccion de escualeno a coste eficaz que permita la fabricacion a gran escala y uso generalizado del escualeno y escualano en lubricantes biodegradables, aditivos lubricantes, y fluidos hidraulicos.

Chang et al., (Appl. Microbiol. Biotechnol., 2008, 78, 963-72) divulga el descubrimiento de una levadura de tipo salvaje, Pseudozyma sp. JCC207, que produce “una gran cantidad de escualeno y varios acidos grasos poliinsaturados”. Chang et al., describen el aislamiento de Pseudozyma sp. JCC207 a partir de agua de mar recogida en Guam, E.E.U.U., y no esta seguro si Pseudozyma sp. JCC207 es una nueva especie o una variante de P. regulosa o P. aphidis. En el artfculo, “la eficacia de la produccion de escualeno [de Pseudozyma sp. JCC207] se investigo bajo diferentes condiciones”.

Dow AgroSciences LLC, Using Yeast Fermentation to Produce Cost-Effective and Biodegradable Lubricants,
http://statusreports.atp.nist.gov/reports/PDF.pdf, divulga que “[t] la comparMa propuso el empleo de la ingeniena genetica para alterar las caractensticas metabolicas de una levadura oleaginosa (oleosa) para incrementar la capacidad de la levadura para producir isoprenos mediante biosmtesis”. Espedficamente, fueron objetivo cuatro enzimas: ACCasa, hidroximetilglutaril CoA reductasa (HMGR), escualeno sintetasa, y escualeno epoxidasa.

La Patente de E.E.U.U. N° 5.460.949 divulga “[a] un metodo para incrementar la acumulacion de escualeno y esteroles espedficos en la levadura”. En particular, se divulga que “[s] la acumulacion de escualeno y esterol se incrementa mediante el aumento del nivel de expresion de un gen que codifica un polipeptido que tiene actividad HMG-CoA reductasa”.

WO 2008/130372 A9 se refiere a metodos para la produccion biologica de determinados compuestos de esterol, y a sistemas para producir levaduras oleaginosas u hongos que son capaces de producir determinados compuestos de esterol.

Compendio de la invencion

Una materia sujeto de la presente invencion es una composicion como se define en la reivindicacion 1, y un metodo para producir escualeno como se define en la reivindicacion 2. Las reivindicaciones dependientes se refieren a realizaciones particulares de las mismas.

Un aspecto segun la presente invencion se refiere a una composicion que comprende una levadura transformada geneticamente. La levadura transformada geneticamente expresa una o mas enzimas modificadas que tienen una o mas mutaciones disenadas, en donde la mutacion o mutaciones disenadas estan en posiciones determinadas dentro de dicha enzima. La enzima o enzimas modificadas comprenden escualeno epoxidasa, y la escualeno epoxidasa tiene actividad y/o expresion reducida. La levadura produce cantidades aumentadas de escualeno en comparacion

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con la levadura nativa, y se selecciona una cepa de Yarrowia lipolytica del grupo que consiste en ATCC 90812, ATCC MYA-2613, o Yeastern polg.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para producir escualeno mediante una levadura modificada geneticamente. El metodo comprende incrementar o disminuir la actividad o expresion de una o mas enzimas en la ruta de biosmtesis isoprenoide. La actividad o expresion enzimatica se incrementa o disminuye mediante una o mas mutaciones disenadas, en donde la mutacion o mutaciones disenadas estan en posiciones determinadas dentro de dicha enzima. La enzima o enzimas modificadas comprenden escualeno epoxidasa, y la escualeno epoxidasa tiene actividad y/o expresion reducida. La levadura produce cantidades aumentadas de escualeno en comparacion con la levadura nativa, y es una cepa de Yarrowia lipolytica seleccionada del grupo que consiste en ATCC 90812, ATCC MYA-2613, o Yeastern polg.

Segun una realizacion particular, la levadura transformada geneticamente se deriva de una levadura oleaginosa.

Segun una realizacion particular, la enzima o enzimas modificadas comprenden ademas una enzima modificada seleccionada del grupo que consiste en acetil-CoA carboxilasa (“ACCasa”), HMG-CoA reductasa, escualeno sintasa, ATP citrato liasa, ATP citrato sintasa, mevalonato quinasa, glicerol quinasa y 5-aminolevulinato sintasa.

Segun una realizacion particular, la actividad o expresion se reduce a aproximadamente el 90%; o aproximadamente 80%; o aproximadamente 70%; o aproximadamente 60%; o aproximadamente 50%; o aproximadamente 40%; o aproximadamente 30%; o aproximadamente 20%; o aproximadamente 10%; o aproximadamente 5% de la actividad o expresion de la levadura nativa correspondiente.

Segun una realizacion particular, la actividad o expresion esta entre 90-95%; o 80-90%; o 70-80%; o 60-70%; o 5060%; o 40-50%; o aproximadamente 30-40%; o aproximadamente 20-30%; o aproximadamente 10-20%; o aproximadamente 5-10%; o aproximadamente 2-5% de la actividad de la levadura nativa correspondiente.

Segun una realizacion particular, la levadura es la cepa Yeastern polg de Yarrowia lipolytica.

Segun una realizacion particular, esta presente en la composicion un agente antifungico o se anade a la levadura en el metodo. Por ejemplo, un agente antifungico esta presente en la composicion o se anade a la levadura en el metodo a una concentracion entre 0,5 a 100 pg/ml, entre 1 a 25 pg/ml, o entre 10 a 15 pg/ml. Segun una realizacion particular, el agente antifungico puede ser un agente antifungico de alilamina. Por ejemplo, el agente antifungico puede ser un agente antifungico de alilamina presente a una concentracion entre 0,5 a 100 pg/ml, tal como entre 1 a 25 pg/ml, o entre 10 a 15 pg/ml. Segun una realizacion particular, el agente antifungico puede ser terbinafina. Por ejemplo, la terbinafina se puede presentar a una concentracion entre 0,5 a 100 pg/ml, tal como entre 1 a 25 pg/ml, o entre 10 a 15 pg/ml.

Segun una realizacion particular, el metodo comprende cultivar la levadura con un agente antifungico; en donde la levadura es la cepa Yeastern polg de Yarrowia lipolytica y en donde el agente antifungico es terbinafina. Por ejemplo, la terbinafina se puede presentar a una concentracion de aproximadamente 12,5 pg/ml o mas.

Como se divulga en la presente memoria, cantidades aumentadas de un isoprenoide (por ejemplo, escualeno) producidas mediante transformacion genetica o no genetica de la levadura, pueden ser el resultado de mutar, modificar y/o alterar la actividad de una o mas enzimas dentro de la ruta de biosmtesis isoprenoide. Por ejemplo se pueden modificar, mutar o alterar la actividad de acetil-CoA carboxilasa (o “ACCasa”), HMG-CoA reductasa, escualeno epoxidasa, escualeno sintasa, ATP citrato sintasa, mevalonato quinasa (por ejemplo, Y. lipolytica mevalonato quinasa (Genolevures YALI0B16038g)), glicerol quinasa (por ejemplo, Y. lipolytica glicerol quinasa (Genolevures YALI0F00484g)) y/o 5-aminolevulinato sintasa (por ejemplo, codificada por el gen Saccharomyces cerevisiae HEM1).

Como se divulga en la presente memoria, una levadura transformada geneticamente que expresa una enzima modificada, se puede producir mediante la introduccion de una mutacion en la enzima a traves del empleo de una oligonucleobase de un gen reparador como se describe en la presente memoria. Tales metodos pueden incluir la introduccion de una oligonucleobase de un gen reparador que contiene una mutacion espedfica para un gen diana de interes dentro de una celula de levadura, mediante cualquiera de los metodos que son bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, electroporacion, LiOAc, biolfstica, esferoplastica y/o Agrobacterium (vease, por ejemplo, McClelland, C.M., Chang, Y.C., y Kwon-Chung, K.J. (2005) Fungal Genetics and Biology 42:904-913) e identificacion de una celula que tiene la enzima mutada.

Como se describe en la presente memoria, un metodo para producir isoprenoides, preferiblemente escualeno, puede incluir proporcionar una levadura transformada geneticamente o no transformada geneticamente como se describe en la presente memoria y extraer escualeno a partir de la levadura. El metodo puede incluir exponer la levadura (bien transformada geneticamente o transformada no geneticamente) a un agente antifungico (por ejemplo, un agente antifungico de alilamina tal como terbinafina) y extraer escualeno a partir de la levadura. El metodo puede incluir exponer una levadura transformada geneticamente tal como se describe en la presente memoria a un agente antifungico (por ejemplo, un agente antifungico de alilamina tal como terbinafina) y extraer escualeno a partir de la levadura. El metodo puede incluir exponer la levadura transformada no geneticamente, tal como se describe en la

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presente memoria a un angente antifungico (por ejemplo un agente antifungico de alilamina tal como terbinafina) y extraer escualeno a partir de la levadura.

En los metodos y composiciones descritos en la presente memoria que incluyen un agente antifungico (por ejemplo, un agente antifungico de alilamina tal como terbinafina), el agente antifungico (por ejemplo terbinafina u otro agente antifungico) se puede anadir o presentar en una concentracion a o por encima de aproximadamente 1 pg/ml; o aproximadamente 5 pg/ml; o aproximadamente 10 pg/ml; o aproximadamente 11 pg/ml; o aproximadamente 12 pg/ml; o aproximadamente 12,5 pg/ml; o aproximadamente 13 pg/ml, o aproximadamente 15 pg/ml; o aproximadamente 16 pg/ml; o aproximadamente 20 pg/ml; o aproximadamente 25 pg/ml; o aproximadamente 30 pg/ml; o aproximadamente 40 pg/ml; o aproximadamente 50 pg/ml o mas. En los metodos y composiciones descritos en la presente memoria que incluyen un agente antifungico (por ejemplo, un agente antifungico de alilamina tal como terbinafina), el agente antifungico (por ejemplo terbinafina u otro agente antifungico) se puede anadir o presentar en una concentracion entre aproximadamente 0,5 a 100 pg/ml; o 0,5 a 50 pg/ml, o 1 a 50 pg/ml; o 5 a 50 pg/ml; o 8 a 50 pg/ml; o 10 a 50 pg/ml; o 12 a 50 pg/ml, o 15 a 50 pg/ml; o 15 a 50 pg/ml; o 25 a 50 pg/ml; o 1 a 25 pg/ml; o 5 a 25 pg/ml; o 10 a 25 pg/ml; o 10 a 20 pg/ml; o 10 a 15 pg/ml.

Se describe en la presente memoria una levadura transformada geneticamente que produce isoprenoides. En determinados ejemplos, la levadura transformada geneticamente produce escualeno.

Se describe ademas en la presente memoria una levadura transformada geneticamente, en donde la levadura se transforma geneticamente, tal que produce niveles aumentados de escualeno en comparacion con la levadura nativa correspondiente. En determinados ejemplos, la levadura transformada geneticamente expresa una o mas enzimas modificadas que tienen una o mas mutaciones. En determinados ejemplos, el nivel de expresion de una o mas enzimas en la levadura transformada geneticamente, esta aumentado o disminuido en relacion a la levadura nativa correspondiente. En ejemplos relacionados, la levadura transformada geneticamente expresa una o mas enzimas modificadas que tienen una o mas mutaciones y el nivel de expresion de una o mas enzimas en la levadura transformada geneticamente esta aumentada o disminuida en relacion a la levadura nativa correspondiente. En determinados ejemplos preferidos, una levadura trasformada geneticamente como se describe en la presente memoria, esta trasformada geneticamente mediante la introduccion de una mutacion dentro de una enzima empleando una oligobase de un gen reparador. En algunos ejemplos, una levadura transformada geneticamente como se describe en la presente memoria, se transforma geneticamente mediante la introduccion de una o mas mutaciones en o alrededor del sitio de comienzo de translacion de un gen que codifica una enzima para incrementar o disminuir la expresion de la enzima, por ejemplo, como se describe en la Solicitud de Patente de E.E.U.U. Nos 10/411.969 y 11/625.586. En determinados ejemplos, la enzima modificada en una levadura transformada geneticamente como se describe en la presente memoria, incluye una o mas enzimas seleccionadas del grupo que consiste en acetil-CoA carboxilasa (o “ACCasa”), HMG-Co reductasa, escualeno epoxidasa, escualeno sintasa, ATP citrato liasa, ATP citrato sintasa, mevalonato quinasa (por ejemplo, Y. lipolytica mevalonato quinasa (Genolevures YALI0B16038g)), glicerol quinasa (por ejemplo, Y. lipolytica glicerol quinasa (Genolevures YALI0F00484g)) y 5- aminolevulinato sintasa.

Una nucleobase comprende una base, que es una purina, pirimidina, o un derivado o analogo de las mismas. Los nucleosidos son nucleobases que contienen un resto pentosefuranosil, por ejemplo, una ribosa o 2'-desoxirribosa, sustituido opcionalmente. Los nucleosidos se pueden unir mediante uno de los varios restos de union, que pueden o no contener fosforo. Los nucleosidos que se unen mediante enlaces fosfodiester sin sustituir se denominan nucleotidos. “Nucleobases” como se emplean en la presente memoria, incluyen nucleobases peptfdicas, las susbunidades de acidos nucleicos peptttidicos, y nucleobases de morfolina, asf como nucleosidos y nucleotidos.

Una oligonucleobase es un polfmero de nucleobases, cuyo polfmero puede hibridar mediante el emparejamiento de bases Watson-Crick para un ADN que tiene la secuencia complementaria. Una cadena oligonucleobase tiene un extremo 5'y 3'unico, que son las ultimas nucleobases del polfmero. Una cadena de oligonucleobase particular, puede contener nucleobases de todos los tipos. Un compuesto oligonucleobase es un compuesto que comprende una o mas cadenas de oligonucleobases que son complementarias e hibridan mediante el emparejamiento de bases Watson-Crick. Las nucleobases son bien de tipo desoxirribosa o bien de tipo ribosa. Las nucleobases de tipo ribosa son pentosefuranosilo que contienen nucleobases en donde el carbono 2'es un metileno sustituido con un hidroxilo, alquiloxi o halogeno. Las nucleobases de tipo desoxirribosa son nucleobases diferentes a las nucleobases de tipo ribosa e incluyen todas las nucleobases que no contienen un resto de pentosefuranosilo.

Una hebra oligonucleobase incluye genericamente tanto cadenas oligonucleobase como segmentos o regiones de cadenas de oligonucleobases. Una hebra oligonucleobase tiene un extremo 3' y un extremo 5'. Cuando una hebra oligonucleobase es coextensiva con una cadena, los extremos 3' y 5'de la hebra son tambien los extremos 3'y 5' de la cadena.

El termino “oligonucleobase de un gen reparador” se emplea en la presente memoria para indicar oligonucleobases, que incluyen oligonucleotidos dobles mixtos, moleculas que no contienen nucleotido, oligodesoxinucleotidos monocatenarios y otras moleculas reparadoras geneticas como se describe en detalle a continuacion.

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En algunos ejemplos, una levadura transformada geneticamente o una levadura transformada no geneticamente como se describe en la presente memoria, se deriva de una levadura oleaginosa. En determinados ejemplos preferidos, una levadura transformada geneticamente o una levadura no transformada geneticamente, como se describe en la presente memoria, se deriva de una levadura que se selecciona del grupo que consiste en Cryptococcus curvatus, Yarrowia lipolytica, Rhodotorula glutinis, y Rhorosporidium toruloides. En algunos ejemplos preferidos, la levadura transformada geneticamente o la levadura no transformada geneticamente se deriva de una levadura que se selecciona del grupo que consiste en Cryptococcus curvatus, Yarrowia lipolytica y Rhodotorula glutinis. En ejemplos relacionados, la levadura transformada geneticamente o la levadura transformada no geneticamente se deriva de una levadura que se selecciona del grupo que consiste en Cryptococcus curvatus y, Rhodotorula glutinis. En determinados ejemplos preferidos, la levadura transformada geneticamente o la levadura trasformada no geneticamente no deriva de Yarrowia lipolytica. La levadura transformada geneticamente que se emplea en los metodos y composiciones segun la presente invencion es una cepa de Yarrowia lipolytica que se selecciona del grupo que consiste en ATCC 90812, ATCC MYA-2613, y Yeastern polg.

En determinados ejemplos preferidos, una enzima que se modifica en una levadura trasformada geneticamente, como se describe en la presente memoria, es acetil-CoA carboxilasa (o “ACCasa”). En algunos ejemplos preferidos, la acetil-CoA carboxilasa en una levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que su actividad y/o expresion disminuye en relacion a la levadura nativa correspondiente; o tal que se elimina la actividad y/o expresion. En otros ejemplos, la acetil-CoA carboxilasa se puede modificar para que se altere la selectividad de su sustrato. En algunos ejemplos preferidos, la levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que la actividad y/o expresion de la acetil-CoA carboxilasa se reduce en relacion a la levadura nativa correspondiente pero la actividad no se elimina. En algunos ejemplos preferidos, la levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que la actividad y/o expresion de la acetil-CoA carboxilasa en la levadura transformada geneticamente se reduce a aproximadamente el 90%; o aproximadamente 80%; o aproximadamente 70%; o aproximadamente 60%; o aproximadamente 50%; o aproximadamente 40%; o aproximadamente 30%; o aproximadamente 20%; o aproximadamente 10%; o aproximadamente 5% de la actividad y/o expresion de la levadura nativa correspondiente. En ejemplos relacionados, la levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que la actividad y/o expresion de la acetil-CoA carboxilasa en la levadura transformada geneticamente esta entre aproximadamente el 90-95%; o aproximadamente 80-90%; o aproximadamente 70-80%; o aproximadamente 60-70%; o aproximadamente 50-60%; o aproximadamente 40-50%; o aproximadamente 30-40%; o aproximadamente 20-30%; o aproximadamente 10-20%; o aproximadamente 5-10%; o aproximadamente 2-5% de la actividad y/o expresion de la levadura nativa correspondiente.

En determinados ejemplos preferidos, una enzima que se modifica en una levadura transformada geneticamente como se describe en la presente memoria, es HMG-CoA reductasa. En algunos ejemplos preferidos, la HMG-CoA reductasa en una levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que su actividad y/o expresion se incrementa en relacion a la levadura nativa correspondiente. En otros ejemplos, la HMG-CoA reductasa se puede modificar para que se altere la selectividad del sustrato. En determinados ejemplos preferidos, la levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que la actividad y/o expresion de la HMG-CoA reductasa en la levadura transformada geneticamente se aumenta hasta al menos 1,2 veces; o 1,5 veces; o 2 veces, o 3 veces; o 4 veces; o 5 veces; o 10 veces; o 15 veces; o 20 veces; o 50 veces; o 100 veces; o 1.000 veces; o 10.000 veces; o 100.000 veces; o 1.000.000 de veces mas que la actividad y/o expresion de la levadura nativa correspondiente.

Una enzima que se modifica en la levadura transformada geneticamente que se emplea en los metodos y composiciones segun la presente invencion, es escualeno epoxidasa. En algunos ejemplos preferidos, el escualeno epoxidasa en una levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que su actividad y/o expresion se disminuye en relacion a la levadura nativa correspondiente; o de tal manera que se elimina la actividad y/o expresion. En otros ejemplos, la escualeno epoxidasa se puede modificar de tal manera que se altere la selectividad de su sustrato. En algunos ejemplos preferidos, la levadura modificada geneticamente se modifica de tal manera que la actividad y/o expresion de la escualeno epoxidasa se reduce en relacion con la levadura nativa correspondiente, pero la actividad no se elimina. En determinados ejemplos, la escualeno epoxidasa se modifica para incluir una o mas mutaciones u homologos de una o mas mutaciones asociadas con una sensibilidad incrementada a terbinafina. En determinados ejemplos, la levadura no es Saccharomyces cerevisiae y la escualeno epoxidasa se modifica para incluir los homologos de una o mas de las siguientes mutaciones asociadas con una sensibilidad incrementada a terbinafina en el gen ERG1 de Saccharomyces cerevisiae: G30S, L37P, y R269G (vease, por ejemplo, Turnowsky, 2005, 2007 y 2008). En determinados ejemplos la levadura es Y. lipolytica y la escualeno epoxidasa se modifica para incluir los homologos de una o mas de las siguientes mutaciones asociadas con una sensibilidad incrementada a terbinafina en el gen ERG1 de Saccharomyces cerevisiae: G30S, L37P, y R269G (vease, por ejemplo, Turnowsky, 2005, 2007 y 2008). En algunos ejemplos, el gen de escualeno epoxidasa de la levadura se modifica como se describe en la presente memoria mediante la smtesis y reemplazamiento del gen de tipo salvaje o mediante la introduccion de mutaciones mediante RTDS. En algunos ejemplos preferidos, la levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que la actividad y/o expresion de la escualeno epoxidasa en la levadura transformada geneticamente se reduce a aproximadamente el 90%; o aproximadamente 80%; o aproximadamente 70%; o aproximadamente 60%; o aproximadamente 50%; o aproximadamente 40%; o aproximadamente 30%; o aproximadamente 20%; o aproximadamente 10%; o aproximadamente 5% de la actividad y/o expresion de la levadura nativa correspondiente. En determinados ejemplos, la levadura modificada geneticamente se modifica de

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tal manera que la actividad y/o expresion de la escualeno epoxidasa en la levadura modificada geneticamente esta entre aproximadamente 90-95%; o aproximadamente 80-90%; o aproximadamente 70-80%; o aproximadamente 6070%; o aproximadamente 50-60%; o aproximadamente 40-50%; o aproximadamente 30-40%; o aproximadamente 20-30%; o aproximadamente 10-20%; o aproximadamente 5-10%; o aproximadamente 2-5% de la actividad y/o expresion de la levadura nativa correspondiente.

En determinados ejemplos preferidos, la enzima que se modifica en una levadura transformada geneticamente como se describe en la presente memoria, es escualeno sintasa. En algunos ejemplos preferidos, la escualeno sintasa en una levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que su actividad y/o expresion se incrementa en relacion a la levadura nativa correspondiente. En otros ejemplos, la escualeno sintasa se puede modificar para que se altere la selectividad del sustrato. En determinados ejemplos preferidos, la levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que la actividad y/o expresion de la escualeno sintasa en la levadura transformada geneticamente se incrementa al menos 1,2 veces; o 1,5 veces; o 2 veces; o 3 veces; o 4 veces; o 5 veces; o 10 veces; o 15 veces; o 20 veces; o 50 veces; o 100 veces; o 1.000 veces; o 10.000 veces; o 100.000 veces; o 1.000.000 de veces mas que la actividad y/o expresion de la levadura nativa correspondiente.

En determinados ejemplos, la enzima que se modifica en una levadura transformada geneticamente como se describe en la presente memoria, es ATP citrato liasa. En algunos ejemplos, se modifican como se describe en la presente memoria o bien solo una subunidad o bien ambas subunidades de los genes de ATP citrato liasa (por ejemplo, citrato liasa de Yarrowia lipolytica; Genolevures YALI0D24431g y YALI0E34793g). En determinados ejemplos, la actividad de la ATP citrato liasa en una levadura modificada se incrementa mediante la insercion y/o expresion heterologa de un gen ATP liasa animal que comprende solo una subunidad de holoenzima. En algunos ejemplos preferidos, la ATP citrato liasa en una levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que su actividad y/o expresion se incrementa en relacion a la levadura nativa correspondiente. En determinados ejemplos preferidos, la levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que la actividad y/o expresion de la ATP citrato liasa en la levadura transformada geneticamente se incrementa al menos 1,2 veces; o 1,5 veces; o 2 veces; o 3 veces; o 4 veces; o 5 veces; o 10 veces; o 10 veces; o 20 veces; o 50 veces; o 100 veces; o 1.000 veces; o 10.000 veces; o 100.000 veces; o 1.000.000 de veces mas que la actividad y/o expresion de la levadura nativa correspondiente.

En determinados ejemplos de las composiciones y metodos descritos en la presente memoria, la enzima que se modifica en una levadura transformada geneticamente o una levadura transformada no geneticamente es la ATP citrato sintasa. Preferiblemente, su actividad y/o expresion se incrementa en relacion a la levadura nativa correspondiente.

En determinados ejemplos, la enzima que se modifica en una levadura transformada geneticamente como se describe en la presente memoria, es mevalonato quinasa (por ejemplo, mevalonato quinasa de Y. lipolytica (Genolevures YALI0B16038g)). En algunos ejemplos preferidos, la mevalonato quinasa (por ejemplo, mevalonato quinasa de Y. lipolytica (Genolevures YALI0B16038g)) en una levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que su actividad y/o expresion se incrementa en relacion a la levadura nativa correspondiente. En determinados ejemplos preferidos, la levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que la actividad y/o expresion de mevalonato quinasa (por ejemplo, mevalonato quinasa de Y. lipolytica (Genolevures YALI0B16038g)) en la levadura transformada geneticamente se incrementa al menos 1,2 veces; o 1,5 veces; o 2 veces; o 3 veces; o 4 veces; o 5 veces; o 10 veces; o 15 veces; o 20 veces; o 50 veces; o 100 veces; o 1.000 veces; o 10.000 veces; o 100.000 veces; o 1.000.000 de veces mas que la actividad y/o expresion de la levadura nativa correspondiente.

En determinados ejemplos, la enzima que se modifica en una levadura transformada geneticamente como se describe en la presente memoria, es glicerol quinasa (por ejemplo, glicerol quinasa de Y. lipolytica (Genolevures YALI0F00484g)). En algunos ejemplos preferidos, la glicerol quinasa (por ejemplo, glicerol quinasa de Y. lipolytica (Genolevures YALI0F00484g)) en una levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que su actividad y/o expresion se incrementa en relacion a la levadura nativa correspondiente. En determinados ejemplos preferidos, la levadura transformada geneticamente se modifica de tal manera que la actividad y/o expresion de la glicerol quinasa (por ejemplo, glicerol quinasa de Y. lipolytica (Genolevures YALI0F00484g)) en la levadura transformada geneticamente se incrementa al menos 1,2 veces; o 1,5 veces; o 2 veces; o 3 veces; o 4 veces; o 5 veces; o 10 veces; o 15 veces; o 20 veces; o 50 veces; o 100 veces; o 1.000 veces; o 10.000 veces; o 100.000 veces; o 1.000.000 de veces mas que la actividad y/o expresion de la levadura nativa correspondiente.

En determinados ejemplos de las composiciones y metodos descritos en la presente memoria, la enzima que se modifica en una levadura transformada geneticamente o una levadura transformada no geneticamente es 5- aminolevulinato sintasa (por ejemplo, codificada por el gen HEM1 de Saccharomyces cerevisiae). Preferiblemente, su actividad y/o expresion se aumenta en relacion a la levadura nativa correspondiente.

En determinados ejemplos preferidos descritos en la presente memoria, la levadura transformada es una levadura trasformada geneticamente; en otros ejemplos preferidos, la levadura transformada geneticamente es una levadura transgenica. Otros ejemplos son una levadura que incluyen tanto alteraciones transgenicas como geneticas.

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En determinados ejemplos, se describen composiciones que incluyen una levadura (por ejemplo una levadura transformada geneticamente tal como se describen en la presente memoria, o una levadura transformada no geneticamente) en donde al menos el 10% del contenido de Kpido total es escualeno; o al menos 20% del contenido de lfpido total es ecualeno; o al menos 25% del contenido total de lfpido es escualeno; o al menos 28% del contenido total de lfpido es escualeno; o al menos 30% del contenido total de lfpido es escualeno; o al menos 32% del contenido total de lfpido es escualeno; o al menos 35% del contenido total de lfpido es escualeno; o al menos 37% del contenido total de lfpido es escualeno; o al menos 38% del contenido total de lfpido es escualeno; o al menos 40% del contenido total de lfpido es escualeno; o al menos 42% del contenido total de lfpido es escualeno; o al menos 45% del contenido total de lfpido es escualeno; o al menos 47% del contenido total de lfpido es escualeno; o al menos 50% del contenido total de lfpido es escualeno; o al menos 52% del contenido total de lfpido es escualeno; o al menos 55% del contenido total de lfpido es escualeno; o al menos 57% del contenido total de lfpido es escualeno; o al menos 60% o mas del contenido total de lfpido es escualeno.

La frase “levadura transformada geneticamente” o “levadura alterada geneticamente” como se emplea en la presente memoria, se refiere a una levadura que tiene una o mas modificaciones geneticas, tal como transgenes y/o enzimas modificadas que contienen una o mas mutaciones disenadas. Tales mutaciones disenadas pueden resultar en una enzima modificada que tiene una actividad que es diferente de la enzima nativa. Tales diferencias pueden incluir diferencias en un sustrato espedfico o nivel de actividad. Como se emplea en la presente memoria, una “levadura transgenica” es un tipo de “levadura transformada geneticamente”.

El termino “levadura nativa” como se emplea en la presente memoria, se refiere a una levadura que no se transforma geneticamente (es decir, transgenica o alterada geneticamente). Las levaduras nativas incluyen levaduras de tipo salvaje, asf como levaduras que se han seleccionadas selectivamente para lograr caractensticas particulares.

La frase “levadura transgenica” se refiere a una levadura que tiene un gen de otras especies de levadura o especies de no levaduras. Tal gen se puede referir como un “transgen”.

Como se emplea en la presente memoria, el termino “gen diana” se refiere al gen que codifica la enzima a modificar.

La frase “levadura oleaginosa” se refiere a una levadura que contiene al menos aproximadamente el 20% del peso seco celular (de sus siglas en ingles, cdw) del lfpido extrafble del organismo. La capacidad para acumular niveles de lfpido hasta al menos el 20% cdw, no se limita a un gen en particular; se ha notificado mas de aproximadamente el 20% cdw lipfdico en Lipomyces lipofer, L. starkeyi, L. tetrasporus, Candida lipolytica, C. diddensiae, C. paralipolytica, C. curvata, Cryptococcus albidus, Cryptococcus laurentii, Geotrichum candidum, Rhodotorula graminus, Trichosporon pullulans, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula gracilis, y Yarrowia lipolytica. Vease, por ejemplo, Tatsumi et al. Patente de E.E.U.U. N° 4.032.405, y Rattray, Microbial Lipids, Vol. 1 (1998).

El termino “aproximadamente” como se emplea en la presente memoria, significa en terminos cuantitativos mas o menos del 10%. Por ejemplo, “aproximadamente 3%” abarcana del 2,7-3,3% y “aproximadamente 10%” abarcana del 9-11%.

A menos que se indique de otra manera, cualquiera de los porcentajes que se indican en la presente memoria, son porcentaje en peso.

Se manifestaran otras caractensticas y ventajas de la invencion a partir de la descripcion de las siguientes realizaciones preferidas y, a partir de las reivindicaciones.

Descripcion detallada de la invencion

Tipos de levadura

Las composiciones y metodos como se describen en la presente memoria, se pueden basar en cualquiera de las diversas especies o cepas de levadura. En determinados ejemplos, la levadura es una levadura oleaginosa. Por ejemplo, la levadura puede ser Cryptococcus curvatus (por ejemplo ATCC 20508), Yarrowia lipolytica (por ejemplo ATcC 20688 o ATcC 90811), Rhodotorula glutinis (por ejemplo ATCC 10788 o AtCC 204091), y Rhorosporidium toruloides. Los inventores han descubierto que, respecto a otras levaduras determinadas (tales como Yarrowia lipolytica, Cryptococcus curvatus y Rhodotorula glutinis), crecen hasta densidades celulares elevadas en una amplia variedad de sustratos, y producen grandes cantidades de lfpido total bajo muchas condiciones de cultivo.

Por consiguiente, en determinados ejemplos, Cryptococcus curvatus y Rhodotorula glutinis pueden ser ventajosos particularmente para las composiciones y metodos como se describen en la presente memoria. Existen muchas herramientas geneticas (por ejemplo, protocolos de transformacion, marcadores seleccionables) que estan muy desarrolladas y, en espedfico para Yarrowia lipolytica; asf como en algunas realizaciones, Yarrowia lipolytica puede ser particularmente ventajosa para las composiciones y metodos como se describen en la presente memoria. En las composiciones y metodos segun la presente invencion, la levadura transformada geneticamente es una cepa de Yarrowia lipolytica que se selecciona del grupo que consiste en ATCC 90812, ATCC MYA-2613, o Yeastern polg.

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Oligonucleobases del gen reparador

Los metodos descritos en la presente memoria se pueden practicar con “oligonucleobases de un gen reparador” que tienen las conformaciones y composiciones qmmicas como se describen en detalle a continuacion. Las “oligonucleobases del gen reparador” incluyen oligonucleotidos dobles mixtos, moleculas que no contienen nucleotidos, oligodesoxinucleotidos monocatenarios y otras moleculas del gen reparador descritas en las patentes y publicaciones de patentes senaladas abajo. Las “oligonucleobases del gen reparador” tambien se han descrito en publicaciones cientificas y bibliograffa de patentes empleando otros nombres que incluyen “oligonucleobases recombinagenicas”; “oligonucleotidos quimericos de ARN/ADN”, “oligonucleotidos quimericos”, “oligonucleotidos dobles mixtos (MDONs)”, “oligonucleotidos de ARN y ADN (RDOs)”, “oligonucleotidos del gen diana”, “genoplastos”, “oligonucleotidos modificados monocatenarios”, “vectores mutacionales de oligodesoxinucleotidos monocatenarios”, “vectores mutacionales dobles”, y “vectores mutacionales heterodobles”.

Las oligonucleobases que tienen las conformaciones y composiciones qmmicas descritas en la Patente de E.E.U.U N° 5.565.350 por Kmiec (Kmiec I) y la Patente de E.E.U.U. N° 5.731.181 por Kmiec (Kmiec II), son adecuadas para emplearse como “oligonucleobases del gen reparador”.

Las oligonucleobases del gen reparador en KMiec I y/o Kmiec II contienen dos hebras complementarias, una de las cuales contiene al menos un segmento de nucleotidos de tipo ARN (un “segmento de ARN”) que son bases apareadas a los nucleotidos de tipo ADN de la otra hebra.

Kmiec II divulga que las bases purina y pirimidina que no contienen nucleotidos se pueden sustituir por nucleotidos. Moleculas adicionales del gen reparador que se pueden emplear, se describen en las Patentes de E.E.U.U. Nos 5.756.325; 5.871.984; 5.760.012; 5.888.983; 5.795.972; 5.780.296; 5.945.339; 6.004.804 y 6.010.907 y la Patente Internacional n° PCT/US00/23457; y en la Publicacion de Patente Internacional Nos WO 98/49350; wO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702 y WO 99/40789.

En un ejemplo, la oligonucleobase del gen reparador es un oligonucleotido doble mixto en el que los nucleotidos de tipo ARN del oligonucleotido doble mixto son ARNasas resistentes mediante el reemplazamiento funcional del 2'- hidroxilo por un fluor, cloro o bromo o mediante la colocacion de un sustituyente en el 2'-O. Sustituyentes adecuados incluyen los sustituyentes ensenados por Kmiec II. Sustituyentes alternativos incluyen los sustituyentes ensenados por la Patente de E.E.U.U. N° 5.334.711 (Sproat) y el sustituyente ensenado por las solicitudes de patente EP 629 387 y EP 679 657 (colectivamente, Las Solicitudes Martin).

Como se emplea en la presente memoria, un 2'-fluor, cloro o boro derivado de un ribonucleotido o un ribonucleotido que tiene un 2'-OH sustituido por un sustituyente descrito en las Solicitudes Martin o Sproat, se denomina un “2'- Ribonucleotido Sustituido”. Como se emplea en la presente memoria, el termino “nucleotido tipo ARN” significa un 2'-hidroxilo o un Nucleotido 2'-Sustituido que se une a otros nucleotidos de un oligonucleotido doble mixto mediante un enlace fosfodiester sin sustituir o cualquiera de los enlaces no naturales ensenados por Kmiec I o Kmiec II. Como se emplea en la presente memoria, el termino “nucleotido tipo desoxirribo” significa un nucleotido que tiene un 2'-H, que se puede unir a otros nucleotidos de una oligonucleobase del gen reparador mediante un enlace fosfodiester sin sustituir o cualquiera de los enlaces no naturales ensenados por Kmiec I o Kmiec II.

En un ejemplo particular descrito en la presente memoria, la oligonucleobase del gen reparador es un oligonucleotido doble mixto que se une unicamente mediante enlaces fosfodiester sin sustituir. En ejemplos alternativos, el enlace es mediante enlaces fosfodiester sustituidos, derivados fosfodiester y enlaces que no se basan en fosforo, como se ensena por Kmiec II. En otro ejemplo, cada nucleotido tipo ARN en el oligonucleotido doble mixto es un Nucleotido 2'-Sustituido. Ejemplos preferidos particulares de Ribonucleotidos 2'-Sustituidos son ribonucleotidos 2'-fluor, 2'-metoxi, 2'-propiloxi, 2'-aliloxi, 2'-hidroxietiloxi, 2'-metoxietiloxi, 2'-fluoropropiloxi y 2'- trifluoropropiloxi sustituidos. Ejemplos mas preferidos de Ribonucleotidos 2'-Sustituidos son nucleotidos 2'-fluor, 2'- metoxi, 2'-metoxietiloxi, y 2'-aliloxi sustituidos. En otro ejemplo, el oligonucleotido doble mixto se une mediante enlaces fosfodiester sin sustituir.

Aunque los oligonucleotidos dobles mixtos que tienen solo un tipo de nucleotido 2'-sustituido de tipo ARN se sintetizan mas facilmente, los metodos descritos en la presente memoria se pueden practicar con oligonucleotidos dobles mixtos que tienen dos o mas tipos de nucleotidos tipo ARN. La funcion de un segmento de ARN puede no afectarse por una interrupcion causada mediante la introduccion de un desoxinucleotido entre dos trinucleotidos tipo ARN, por consiguiente, el termino segmento de ARN abarca como tal al “segmento de ARN interrumpido”. Un segmento de ARN ininterrumpido se denomina un segmento de ARN contiguo. En un ejemplo alternativo, un segmento de ARN puede contener ARN-asa resistente y nucleotidos 2'-ON sin sustituir alternativamente. Los oligonucleotidos dobles mixtos tienen preferiblemente menos de 100 nucleotidos y, mas preferiblemente menos de 85 nucleotidos, pero mas de 50 nucleotidos. La primera y segunda hebras son bases emparejadas mediante Watson-Crick. En un ejemplo, las hebras del oligonucleotido doble mixto estan unidas covalentemente mediante un ligando, tal como un tetra, penta o hexanucleotido monocatenario, para que la primera y la segunda hebra sean segmentos de una sola cadena de oligonucleotido que tenga un extremo 3'y 5', unicos. Los extremos 3' y 5'se pueden proteger mediante la adicion de una “caperuza en horquilla” a traves de la cual el 3' y 5' de los nucleotidos terminales se emparejan mediante Watson-Crick a los nucleotidos adyacentes. Se puede colocar, adicionalmente,

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una segunda caperuza en horquilla en la union entre la primera y la segunda hebra alejadas de los extremos 3' y 5', para que se estabilice el emparejamiento de Watson-Crick entre la primera y la segunda hebras.

La primera y segunda hebras contienen dos regiones que son homologas con dos fragmentos del gen diana, es decir, tienen la misma secuencia que el gen diana. Una region homologa contiene los nucleotidos de un segmento de ARN y puede contener uno o mas nucleotidos de tipo ADN del segmento de ADN unido y puede contener tambien nucleotidos de tipo ADN que no estan dentro del segmento de ADN intermedio. Las dos regiones de homologfa se separan mediante una region contigua a cada una de ellas que tiene una secuencia que es diferente de la secuencia del gen diana, denominada una “region heterologa”. La region heterologa puede contener uno, dos o tres nucleotidos desemparejados. Los nucleotidos desemparejados pueden ser contiguos o pueden estar separados alternativamente mediante uno o dos nucleotidos que son homologos al gen diana. Alternativamente, la region heterologa puede contener tambien una insercion o uno, dos, tres o cinco nucleotidos o menos. Alternativamente, la secuencia del oligonucleotido doble mixto puede diferir de la secuencia del gen diana solo mediante la eliminacion de uno, dos, tres, o cinco nucleotidos o menos del oligonucleotido doble mixto. La longitud y posicion de la region heterologa es, en este caso, considerada por ser la longitud de la eliminacion, incluso aunque no haya nucleotidos del oligonucleotido doble mixto dentro de la region heterologa. La distancia entre los fragmentos del gen diana que son complementarios a las dos regiones homologas, es identica a la longitud de la region heterologa cuando se pretende una sustitucion o sustituciones. Cuando la region heterologa contiene una insercion, las regiones homologas se separan asf en el oligonucleotido doble mixto mas lejos de sus fragmentos homologos complementarios en el gen, y lo contrario es aplicable cuando la region heterologa codifica una eliminacion.

Los segmentos de ARN de los oligonucleotidos dobles mixtos, estan en cada una de las partes de la region homologa, es decir, una region que es identica en la secuencia a un fragmento del gen diana, cuyos segmentos juntos contienen preferiblemente al menos 13 nucleotidos de tipo ARN y, preferiblemente de 16 a 25 nucleotidos de tipo ARN o aun mas preferiblemente de 18-22 nucleotidos de tipo ARN o lo mas preferiblemente, 20 nucleotidos. En un ejemplo, los segmentos de ARN de las regiones homologas se separan mediante uno contiguo, es decir, “conectado mediante” un segmento de ADN intermedio. En un ejemplo, cada nucleotido de la region heterologa es un nucleotido del segmento de ADN intermedio. Un segmento de ADN intermedio que contiene la region heterologa de un oligonucleotido doble mixto se denomina un “segmento mutador”.

En otro ejemplo descrito en la presente memoria, la oligonucleobase del gen reparador es un Vector Mutacional de Oligodesoxinucleotido de Cadena sencilla (SSOMV, de sus siglas en ingles), que se describe en la Solicitud de la Patente Internacional PCT/US00/23457, Patentes E.E.U.U. Nos 6.271.360, 6.479.292, y 7.060.500. La secuencia del SSOMV se basa en los mismos principios de los vectores mutacionales descritos en la Patente de E.E.U.U. Nos 5.756.325; 5.871.984; 5.760.012; 5.888.983; 5.795.972; 5.780.296; 5.945.339; 6.004.804; y 6.010.907 y en la Publicacion Internacional Nos WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702; y WO 99/40789. La secuencia del SSOMV contiene dos regiones que son homologas a la secuencia diana separada mediante una region que contiene la alteracion genetica deseada denominada la region de mutacion. La region de mutacion puede tener una secuencia que es de la misma longitud que la secuencia que separa la regiones homologas en la secuencia diana, pero que tiene una secuencia diferente. Tal region de mutacion puede causar una sustitucion. Alternativamente, las regiones homologas en la SSOMV pueden estar contiguas entre sf, mientras que las regiones en el gen diana que tienen la misma secuencia estan separadas por uno, dos o mas nucleotidos. Tal SSOMV causa una eliminacion del gen diana de los nucleotidos que estan ausentes en la SSOMV. Finalmente, la secuencia del gen diana que es identico a las regiones homologas, puede estar adyacente en el gen diana pero separado por uno o mas nucleotidos en la secuencia del SSOMV. Tal SSOMV causa una insercion en la secuencia del gen diana.

Los nucleotidos del SSOMV son desoxirribonucleotidos que se unen mediante enlaces fosfodiester sin modificar, excepto que el enlace del internucleotido 3' terminal y/o el 5' terminal o alternativamente los dos enlaces del internucleotido 3' terminal y/o 5' terminal, pueden ser un fosforotioato o fosfoamidato. Como se emplea en la presente memoria, un enlace internucleotido es el enlace entre nucleotidos del SSOMV y no incluye la union entre el nucleotido 3' final o el nucleotido 5' final y un sustituyente de bloqueo, vease supra. En un ejemplo espedfico, la longitud del SSOMV esta entre 21 y 55 desoxinucleotidos y las longitudes de las regiones homologas son, por consiguiente, una longitud total de al menos 20 desoxinucleotidos y al menos dos regiones homologas debenan tener cada una longitudes de al menos 8 desoxinucleotidos.

El SSOMV se puede disenar por complementariedad hacia la hebra de codificacion o de no codificacion del gen diana. Cuando la mutacion deseada es una sustitucion de una sola base, se prefiere que ambos nucleotidos mutadores sean una pirimidina. En la medida que sea compatible para lograr el resultado funcional deseado, se prefiere que tanto el nucleotido mutador como el nucleotido diana en la hebra complementaria, sean pirimidinas. Se prefiere particularmente que los SSMOV que codifican mutaciones de transversion, es decir, un nucleotido C o T mutador sea incompatible, respectivamente, con un nucleotido C o T en la hebra complementaria.

Ademas, el oligodesoxinucleotido del SSOMV puede contener un sustituyente 5 de bloqueo que se une a los carbonos 5' terminales a traves de un enlazador. La qrnmica del enlace no es fundamental, a excepcion de que su longitud debe ser preferiblemente de al menos 6 atomos y de que el enlace debe ser flexible. Se pueden emplear una variedad de sustituyentes no toxicos, tales como biotina, colesterol u otros esteroides o un colorante fluorescente cationico no intercalante. Reactivos particularmente preferidos para preparar SSOMV son los reactivos

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comercializados como Cy3TM y Cy5TM por Glen Research, Sterling Va, que son fosforoamidatos de bloqueo que se incorporan dentro de la produccion de un oligonucleotido 3, 3, 3', 3'-tetrametil N, N'-isopropil sustituido de colorantes de indomonocarbocianina e indodicarbicianina, respectivamente. Se prefiere Cy3. Cuando la indocarbocianina esta sustituida por un N-oxialquilo, se puede unir convenientemente al 5'terminal del oligodesoxinucleotido a traves de un fosfodiester con un fosfato 5' terminal. La qrnmica del colorante enlazador entre el colorante y el oligodesoxinucleotido no es fundamental y se elige por conveniencia sintetica. Cuando el fosforamidato Cy3 disponible comercialmente se emplea como se indica la modificacion 5' resultante consiste en un sustituyente de bloqueo y un enlazador juntos que son una N-hidroxipropil, N'-fosfatidilpropil 3, 3, 3', 3'-tetrametil indomonocarbocianina.

En un ejemplo preferido, el colorante de indocarbocianina esta tetra sustituido en las posiciones 3 y 3' de los anillos de indol. Sin limitaciones a la teona, estas sustituciones previenen que el colorante sea un colorante intercalante. La identificacion de los sustituyentes en estas posiciones no es fundamental. El SSOMV puede tener ademas un sustituyente 3' de bloqueo. De nuevo, la qrnmica del sustituyente de bloqueo 3' no es fundamental.

Expresion heterologa

En determinados ejemplos, se emplea la expresion heterologa para expresar genes extranos o copias extras de genes endogenos en la levadura (por ejemplo, Yarrowia lipolytica).

La expresion heterologa en levadura se puede realizar empleando metodos bien conocidos en la tecnica. La expresion de genes extranos o copias extras de genes endogenos en la levadura empleando la expresion heterologa, puede implicar el uso de un vector que incluye (a) secuencias promotoras para la iniciacion transcripcional, (b) secuencias terminadoras para la finalizacion de la transcripcion, y (c) un marcador seleccionable. La expresion heterologa y los vectores de expresion pueden ser como se describen, por ejemplo, en Madzak, C., Gaillardin, C., y Beckerich, J-M., 2004 Heterologous Protein Expression and Secretion in the Non-Conventional Yeast Yarrowia lipolytica; un analisis Journal of Biotechnology 109:63-81. En determinados ejemplos de las composiciones y metodos descritos en la presente memoria, el vector es pYLEX1 (Yeastern). Una lista no limitante de los marcadores seleccionables que se pueden emplear incluye ura3, lys5, trpl, leu2, adel, E.coli hph que codifica resistencia a higromicina, y SUC2 de Saccharomyces cerevisiae. Una lista no limitante de promotores que se pueden emplear incluye pLEU2, pXPR2, pPOX2, pPOT1, pICL1, pG3P, pMTP, pTEF, y pRPS7. En determinados ejemplos, el promotor es el promotor hp4d, que es un fuerte promotor hforido constitutivo (Patente de E.E.U.U. 6.083.717 publicada el 4 de Julio, 2000). Una lista de secuencias terminadoras no limitante que se puede emplear incluye XPR2t, LIP2t, y PHO5t.

En determinados ejemplos, se emplean como marcadores seleccionables uno o mas genes LYS1 (Genolevures YALI0B15444g), tRp1 (Genolevures YALI0B07667g), y ADE1 (Genolevures YALI0E33033g) de Yarrowia lipolytica. En determinados ejemplos, se emplean como marcadores seleccionables genes URA3 (GenBank: U40564.1) o LEU2 (genolevures YALI0C00407) de Yarrowia lipolytica.

En determinados ejemplos, un vector de expresion de integracion incluye una o mas secuencias promotoras y/o terminadoras que se seleccionan del grupo que consiste en genes de la ruta glucolftica de Yarrowia lipolytica, genes de utilizacion de glicerol o alcano, XPR2, ACC1, HMG1, ERG1 y ERG9.

En determinados ejemplos una o ambas subunidades de ATP citrato liasa de Yarrowia lipolytica (Genolevures YALI0D24431g y YALI0E34793g) estan sobreexpresadas en Yarrowia lipolytica.

Enzimas modificadas

Una enzima modificada o mutada de la presente divulgacion se pueden modificar o mutar mediante cambios, inserciones, sustituciones, y similares, en los pares de bases.

Los genes que codifican enzimas implicadas en la ruta de biosmtesis de acidos grasos y en la ruta de biosmtesis de isoprenoides, son las dianas preferidas para la mutacion. En algunos ejemplos, el gen dina codifica una acil CoA carboxilasa. En otros ejemplos, el gen diana codifica una HMG-CoA reductasa. En otros ejemplos, el gen diana codifica una escualeno epoxidasa. En otros ejemplos, el gen diana codifica una escualeno sintasa. En determinados ejemplos, el gen diana codifica una ATP citrato liasa. Las mutaciones se pueden disenar para que reduzcan o eliminen la actividad de una enzima, mejore la actividad de una enzima, o que altere la actividad de la enzima (por ejemplo, cambiar la selectividad del sustrato).

En levaduras oleaginosas de tipo salvaje, la acetil-CoA se dirige extensivamente en la biosmtesis de acidos grasos a traves dela acetil-CoA carboxilasa (ACCasa). Por tanto, para incrementar la cantidad de acetil-CoA disponible para la smtesis de escualeno, es deseable reducir la expresion enzimatica o la actividad espedfica de la ACCasa. Un ejemplo de una secuencia genetica para la ACCasa es el gen ACC1 en Saccharomyces cerevisiae como se muestra en el numero de entrada Z71631. Por consiguiente, en determinados ejemplos, las actividades intracelulares reducidas de la ACCasa, enzima del punto de ramificacion entre la biosmtesis de mevalonato y la biosmtesis de trigliceridos, disminuira la cantidad de acetil-CoA dividida para la smtesis de grasa, incrementando de esta manera su capacidad para la ruta de isopreno.

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La actividad de la HMG-CoA reductasa es la enzima limitante para la smtesis de isopreno. Ejemplos de secuencias geneticas para la HMG-CoA reductasa incluyen HMG1 y los genes HMG1 de Saccharomyces cerevisiae, como se muestra en los numeros de entrada NC_00ll45 y NC_001144, respectivamente. Por consiguiente, en determinados ejemplos, la actividad HMG-CoA reductasa se aumentara mediante la modificacion del gen HMGR para incrementar la transcripcion, estabilizar la protema resultante, y/o reducir la inhibicion del producto.

El descenso de la actividad ACCasa y/o incremento de la actividad HMG-CoA reductasa en una levadura puede crear la produccion de un organismo isoprenoide principal capaz de producir una cantidad de productos isoprenoides relacionados mediante la manipulacion de enzimas posteriores en la ruta.

La escualeno epoxidasa cataliza la primera etapa comprometida en la biosmtesis de esterol. Un ejemplo de una secuencia genetica para Escualeno epoxidasa es el gen ERG1 de Saccharomyces cerevisisae, como se muestra en el numero de entrada NC_001139. Por consiguiente, en determinados ejemplos, la actividad de la escualeno epoxidasa, sensibilidad hacia los inhibidores y/o expresion se atenuaran en una levadura, por ejemplo mediante residuos importantes catalfticamente en la secuencia de aminoacidos de la enzima.

La escualeno sintasa cataliza la smtesis de escualeno mediante condensacion de dos precursores de isopreno c15 (farnesil difosfato (FPP)). Un ejemplo de secuencia genetica para la smtesis de escualeno es el gen ERG9 de Saccharomyces cerevisiae, como se muestra en el numero de entrada NC_001140. Por consiguiente, en determinados ejemplos, la actividad y/o expresion de la escualeno sintasa, se incrementara en una levadura.

La ATP citrato liasa (E.C. 4.1.3.8) separa catalfticamente el citrato para producir acetil CoA y oxalacetato. La AcetilCoA se puede emplear por la ACCasa para la biosmtesis de acidos grasos o por la acetil CoA acetil transferasa para la produccion de isoprenos y derivados tales como escualeno.

La mevalonato quinasa es la primera enzima despues de la HMG-CoA Reductasa en la ruta del mevalonato, y cataliza la conversion del Mevalonato a Mevalonato-5-fosfato. Por consiguiente, en determinados ejemplos, la actividad mevalonato quinasa y/o la expresion de los niveles se incrementara en la levadura, por ejemplo, mediante el cambio catalftico de restos importantes de la secuencia de aminoacidos de la enzima o incrementando su dosis genetica o niveles de transcripcion.

La glicerol quinasa cataliza la transferencia de un fosfato del ATP al glicerol para formar glicerol fosfato. Por consiguiente, en determinados ejemplos, la actividad glicerol quinasa y/o niveles de expresion se incrementaran en la levadura, por ejemplo, mediante el cambio catalftico de restos importantes de la secuencia de aminoacidos de la enzima o incrementando su dosis genetica o niveles de transcripcion.

El resultado de los cambios metabolicos en determinados ejemplos sera en el canal de carbono de acetil-CoA a escualeno, y atenuar rutas competitivas importantes para este flujo de carbono, dando como resultado un incremento significativo del escualeno producido.

Reparto de oligonucleobases del gen reparador dentro de celulas de levadura

En los metodos descritos en la presente memoria se puede emplear cualquier metodo comunmente conocido para transformar una celula de levadura con una oligonucleobase del gen reparador. Ejemplos de metodos incluyen el empleo de electroporacion, LiOAc, bioftstica, esferoplastica, y/o Agrobacterium (vease, por ejemplo, McClelland, C.M., Chang, Y.C., y Kwon-Chung, K.J (2005) Fungal Genetics and Biology 42:904-913).

En determinados ejemplos, se introduce una oligonucleobase de un gen reparador dentro de una celula de levadura mediante electroporacion. En algunos ejemplos, se introduce una oligonucleobase de un gen reparador dentro de una celula de levadura que se ha tratado qmmicamente con PEG (3350 o 4000 mw) y/o Acetato de Litio mediante electroporacion. En determinados ejemplos, una oligonucleobase del gen reparador se introduce dentro de una celula de levadura utilizando PEG (3350 o 4000 mw) y/o Acetato de Litio.

En la Publicacion Internacional WO 99/07865, US09/129.298, se describen condiciones espedficas para emplear microtransportadores en los metodos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, microtransportadores de hielo (60 mg/mL), oligonucleotido doble mixto (60 mg/mL), 2.5 M CaCl2 y 0,1 M espermidina se anaden en este orden; la mezcla se agita suavemente, por ejemplo mediante agitador Vortex, durante 10 minutos y dejandolo a temperatura ambiente durante 10 minutos, tras lo cual los microtransportadores se diluyen en 5 volumenes de etanol, se centrifugan y resuspenden en etanol 100%. Ejemplos de concentraciones de los componentes en la disolucion de adhesion incluyen microtransportadores de 8-10 pg/pL, 14-17 pg/pL de oligonucleotido doble mixto, 1,1-1,4 M CaCl2 y 18-22 mM de espermidina. En un ejemplo, las concentraciones de los componentes son de 8 pg/pL para los microtransportadores, 16,5 pg/pL para el oligonucleotido doble mixto, 1,3 M de CaChy 21 mM de espermidina.

En algunos ejemplos, las oligonucleobases del gen reparador se pueden repartir a la celula de la levadura mediante electroporacion, segun tecnicas bien conocidas por los expertos en la tecnica. (Vease, por ejemplo, Becker, D. M., y Guarente, L. High Efficiency Transformation of Yeast by Electroporation. Methods in Enzymology, vol. 194, seccion [12] pp. 182-186. 1991. Elsevier Academic Press, Londres).

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Seleccion de la levadura que tiene la enzima modificada deseada

La enzima modificada que expresa la levadura se puede identificar a traves de una cantidad de medios. En un metodo, se emplea una estrategia de co-conversion de las oligonucleobases del gen reparador (GRONs) para dirigir simultaneamente una conversion seleccionable (es decir, un marcador) y una conversion no seleccionable (por ejemplo, un gen diana de interes) en el mismo experimento. De esta manera, se eliminanan las celulas para las que no se repartio las GRONs o que no fueron capaces de transmitir las conversiones especificadas mediante la GRON. Ya que se espera que el reparto de GRONs a genes ajenos a los diana no sea selectivo, a la misma frecuencia, tambien se espera que una colonia con una conversion correctamente seleccionada tenga una conversion en uno de los otros genes diana. Los casos de conversion se resolveran mediante el analisis del polimorfismo de un solo nucleotido (SNP).

Por tanto, el ADN genomico se extrae a partir de la levadura y de la investigacion de las muestras de ADN individuales empleando tecnologfa de deteccion de SNP, por ejemplo, la Reaccion de la Cadena de Polimerasa alelo-espedfica (ASPCR, de sus siglas en ingles). Para confirmar independientemente el cambio de secuencia en la levadura positiva, se puede amplificar por PCR la region apropiada del gen diana y o bien secuenciar directamente el amplicon resultante, o bien clonar y secuenciar los multiples insertos.

Alternativamente, la incorporacion de la mutacion dentro del gen de interes se puede identificar mediante cualquiera de las diversas tecnicas de biologfa molecular disenadas para detectar mutaciones de un solo nucleotido en el acido nucleico extrafdo (por ejemplo, metodos de amplificacion tales como PCR y analisis de extension del primer nucleotido). Se pueden detectar mutaciones mas extensas mediante la amplificacion y secuenciacion de la region del gen diana a mutar.

Alternativamente, las celulas de la levadura o de las levaduras que contienen la enzima modificada se pueden identificar mediante, por ejemplo, el analisis de la composicion de los isoprenoides producidos por la levadura. Por tanto, la levadura se puede cultivar y extraer y analizar las grasas empleando metodos conocidos en la tecnica (por ejemplo, cromatograffa de gases o HPLC).

Ejemplos

Ejemplo 1. Sistemas de transformacion de Cryptococcus curvatus y Rhodotorula glutinis. (no segun la presente invencion)

Para crear un sistema de transformacion de Cryptococcus curvatus (ATCC cepa 20508) y Rhodotorula glutinis (ATCC cepas 10788 y 204091), se emplea un casete de expresion KANMX (promotor-gen-terminador) el cual confiere resistencia a Kanamicina para S. cerevisiae como un marcador seleccionable para convertir las cepas sensibles a kanamicina en resistentes (Vease, por ejemplo, Baudin, A., et al. (1993) Nucleic Acids Research (21) 3329-3330). Las cepas se transforman solo con el casete de expresion, asf como con el KANMX ligado a fragmentos de restriccion de un plasmido presentado en R. glutinis (Vease, por ejemplo, Oloke, J.K., y Glick, B.R. (2006) African Journal of Biotechnology 5(4):327-332) que contiene ADN de origen de replicacion. El ADN se introduce en el C. curvatus y R. glutinis mediante electroporacion, LiOAc, biolfstica, esferoplastica y/o Agrobacterium (McClelland, C.M., Chang, Y.C., y Kwon-Chung, K.J. (2005) Fungal Genetics and Biology 42:904-913).

Ejemplo 2. Marcadores Seleccionables (no segun la presente invencion)

Para generar mutaciones auxotroficas de uracilo en Cryptococcus curvatus y Rhodotorula glutinis, las celulas se cultivaron en un medio mmimo que contiene el antimetabolito acido 5-fluorootico para seleccionar los mutantes resistentes con lesiones en los genes ura3 o ura5. Se acumularon 33 colonias 5-FOar estables de Cryptococcus curvatus y 20 colonias 5-FOAR de Rhodotorula glutinis. Se clonaron tanto los genes ura3 de tipo salvaje de Cryptococcus curvatus como de Rhodotorula glutinis, y se secuenciaron los genes ura3 mutantes en los aislados 5- FOAr.

Se clonaron otros marcadores auxotroficos mediante complementacion funcional en Saccharomyces cerevisiae (Vease Ho, Y.R., y Chang, M.C. (1988) Chinese Journal of Microbiology and Immunology 21(1):1-8). Se construyeron bibliotecas genomicas y/o de ADNc a partir de Cryptococcus curvatus y Rhodotorula glutinis para la union a un vector de expresion de Saccharomyces seleccionable de uracilo para la transformacion en la cepa YPH500 (MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-A63 his3-A200 leu2-A1) para seleccionar lisina, adenina, triptofano, histidina, y leucina prototrofos. A partir de estos prototrofos, se secuencian los genes correspondientes para LYS2, ADE2, TRP1, HIS3, y LEU2 a partir del inserto genonimo o ADNc.

Ejemplo 2. Manipulacion Genetica en la Levadura empleando tecnologfa RTDS.

(no segun la presente invencion)

Se clonaron los alelos de los genes leu2, lys5 y ura3 de la cepa ATCC 90811 de Yarrowia lipolytica (leu2-35 lys5-12 ura3-18 XPR2B) mediante PCR y se compararon sus secuencias con las de los alelos de tipo salvaje para identificar las diferencias.

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Para ura3, las diferencias se encontraron en las posiciones 1365 (mutacion A^-G, dando como resultado un cambio silente de AAA^-AAG que codifica para lisina), 1503 (secuencias AAGAA extra en ATCC 90811 que da como resultado un cambio de estructura, pero que vuelve a resaltar en la posicion 1511 dando como resultado 7 aminoacidos adicionales, despues de lo cual la secuencia continua como la YL URA3 en GenBanK), 1511 (T extra en ATCC 90811), y 1978 (mutacion C^T, conduciendo a una mutacion de parada que trunca 24 aminoacidos cortos de la protema del carbono Terminal). Se diseno una GRON de un oligonucleotido para restaurar la prototrofia mediante conversion STOP(TGA)^-R(CGA) para la produccion de 264R en base a la numeracion de aminoacido Y1Ura3 - YLU40564. Las gRoNs que se emplearon son Y1Ura31264/C/40/5'Cy3/3'idC, que tiene la secuencia

VCGAGGTCTGTACGGCCAGAACCGAGATCCTATTGAGGAGGH, y Y1Ura31264/NC/40/5'Cy3/3'idC, que tiene la secuencia

VCCTCCTCAATAGGATCTCGGTTCTGGCCGTACAGACCTCGH, donde V=CY3; H=3'DMT dC CPG. Se prepararon 10, 30, y 50 |jg de cada una de las GRONs en la cepa ATCC 90811 de Yarrowia lipolytica usando un metodo basado en Acetato de litio, y se coloco en placas ura- 2% glucosa. Se obtuvo un total de 82 colonias ura+ con la GRON disenada empleando la hebra codificante y 6 colonias con la GRON disenada empleando la hebra no codificante, demostrando la preferencia comun de la hebra en la transformacion con falta de oligonucleotidos de reparacion. De la secuenciacion de 18 de los transformantes de la hebra codificante, 17 de los clones demostraron el cambio previsto.

Para LEU2 las diferencias se encontraron en las posiciones 1710 (la ausencia del C extra conduce a un cambio de estructura y una terminacion proteica prematura); 1896 (T extra); 2036 (mutacion T^A, localizado despues del codon de parada); 2177 (T extra ausente, localizado despues del codon de parada).

Para LEU2 las diferencias se encontraron en las posiciones 1092 (G^A TCG^TCA, una sustitucion conservadora (Serina)); 1278 (G^-A CAG^-CAA, una sustitucion conservadora (Glutamina)); 1279 (G^A GGT^-ATT, cambiando V^I).

Por consiguiente, las mutaciones se pueden emplear para varios propositos, por ejemplo convertir la levadura prototrofica a auxotrofica y viceversa.

Una estrategia similar para demostrar la eficacia de la tecnologfa RTDS en Cryptococcus curvatus y Rhodotorula glutinis se realiza como se describe para Yarrowia lipolytica, en la que se corrigen las mutaciones ura3 para restaurar la prototrofia.

En determinados ejemplos, la eficacia del RTDS en Y. lipolytica se puede demostrar mediante la integracion de una version mutada del gen higromicina de E. coli en su genoma. Esta version del gen, que tiene un punto de mutacion en G34T, codifica un cambio en E12STOP tal que no se ve afectada la sensibilidad natural de Y. lipolytica a higromicina. La transformacion con una GRON que corrige esta mutacion conferira resistencia a la cepa de Y. lipolytica, por ejemplo, hasta 1000 jg/ml de higromicina. Tambien se han construido mutaciones dobles en el gen resistente a higromicina (HGH), que comprenden de G34T A37T (E12ASTOP K13STOP) que se pueden corregir mediante una GRON unica, y G34TT149G (E12STOP Y46 STOP) que se puede corregir por 2 GRoNs.

Para ensayar la actividad de GRON en Yarrowia, se empleo la sensibilidad natural de Yarrowia lipolytica de tipo salvaje para el antibiotico aminoglucosido higromicina B. La higromicina B (hmB) es un antibiotico aminodclico producido por Streptomyces hygroscopicus que inhibe la smtesis proteica tanto en procariotas como en eucariotas interfiriendo con la translocacion ribosomal y con el reconocimiento del aminoacilARNt. La resistencia se puede conferir mediante la introduccion del gen hph (tambien conocido como aph(4)) de E. coli (GENBANK V01499) que codifica una fosfotransferasa aminodclica que inactiva la higromicina B mediante la adicion covalente de un grupo fosfato en la posicion 4 del anillo dclico. La cepa Polg de Yarrowia lipolytica (Mat a ura3-302:URA3 leu2-270 xpr2- 322 axp-2 de Yeastern) se realizo con el gen hph de E. coli que contiene o bien una sola mutacion (E12stop de G34T) o bien una mutacion doble E12stopK13stop (G34T.A37T) mutaciones clonadas en el vector pyLEX1-2u-ura3- 13, dejando el gen bajo control del promotor hpd4 y el terminador XPR2. Los vectores lineales se integraron en el genoma de seleccion para la restauracion de la prototrofia conferida mediante el marcador LEU2. Las cepas resultantes tienen versiones desactivadas del gen de higromicina fosfotransferasa (por lo tanto sensible a higromicina), y se convirtieron con las GRONs de a continuacion, restaurando bien la G34T o bien la G34T.A37T para el tipo salvaje (resistente a higromicina).

GRONs para la restauracion de E12stop de tipo salvaje (T34G)

HPH2/C/42/5'Cy3/3'idC

5'Cy3-GAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAG-3'idC

HPH2/NC/42/5'Cy3/3'idC

5'Cy3-HCTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGTCGCGGTGAGTTC-3'idC

GRONs para la restauracion de E12stopk13stop de tipo salvaje (T34G T37A)

HPH3/C/43/5'Cy3/3'idC

5'Cy3-CTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCG-3'idC

HPH3/NC/43/5'Cy3/3'idC

5 5'Cy3-CGAACTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGTCGCGGTGAG-3'idC

Se emplearon 30 |jg de la GRON indicada para convertir la cepa mutante hph simple o doble en replicas (x6), se agruparon, y una alfcuota se coloco en placas YEPD que contienen 100-1000 jg/ml de higromicina para optimizar la tasa de la senal-interferencia. Con ambas cepas, se obtuvieron cantidades significativas de colonias presuntamente transformadas a cualquier concentracion de higromicina proporcionada por encima del control 'No ADN', con una 10 fuerte predisposicion hacia la hebra GRON no codificante en ambos casos. Tomados conjuntamente, estos resultados sugieren la conversion de GRON del gen de fosfotransferasa higromicina del gen diana de Yarrowia lipolytica, y ademas que se puede conseguir la conversion de dos mutaciones (T34G T37A) empleando una sola GRON. Se realizo la secuenciacion del ADN para confirmar la restauracion del genotipo de tipo salvaje.

Cepa

ADN Colonias en Higromicina 100 jg/ml Colonias en Higromicina 200 jg/ml Colonias en Higromicina 400 jg/ml Colonias en Higromicina 600 jg/ml Colonias en Higromicina 800 jg/ml Colonias en Higromicina 1000 jg/ml

E12stop

No ADN 0 0 1 1 0 0

E12stop

30 jg hebra codificante 0 1 6 1 1 0

E12stop

30 jg hebra no codificante 20 21 21 12 10 8

E12stopK13stop

No ADN 0 0 4 1 0 0

E12stopK13stop

30 jg hebra codificante 2 2 1 2 0 2

E12stopK13stop

30 jg hebra no codificante 5 3 5 7 8 8

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Ejemplo 3. Clonacion de genes diana. (no segun la presente invencion)

Las secuencias para la ACCasa, HMGR, escualeno sintasa y escualeno epoxidasa, disponibles en la base de datos NCBI de Saccharomyces y otras levaduras, se emplearon como fuente de iniciadores PCR y los correspondientes genes se clonaron a partir de Cryptococcus curvatus y Rhodotorula glutinis junto con sus regiones reguladoras 20 correspondientes (promotores, terminadores). Para identificar las mutaciones promotoras al “alza” o a la “baja” que incrementan o disminuyen la transcripcion, respectivamente, los promotores de estos cuatro genes se clonaron con una ADN polimerasa relativamente propensa a cometer errores para generar mutaciones puntuales en los promotores, y estos fragmentos se clonaron en plasmidos fusionados con Protema Verde Fluorescente (GFP, de sus siglas en ingles) o con genes marcadores de beta-galactosidasa para ensayar in vitro en S. cerevisiae o E. coli. Se 25 reintrodujeron mutaciones del promotor al “alza” mediante RTDS en las secuencias genomicas de HMGR y escualeno sintasa, mientras que las mutaciones promotoras “a la baja” se realizaron en las secuencias genomicas de ACCasa y escualeno epoxidasa. Se clonaron los promotores de los genes esenciales (por ejemplo, GAPDH, actina) en R. glutinis y C. curvatus para emplear en la expresion del gen heterologo. Los iniciadores para la clonacion PCR se disenaron a partir de la homologfa por estos genes en S. cerevisiae.

30 Ejemplo 4. Manipulacion de genes diana para la produccion aumentada de escualeno.

ACCasa. Se determino el numero de copias del gen ACCasa en R. glutinis y C. curvatus y otras levaduras. Se empleo RTDS para reducir la expresion ACCasa mediante la introduccion de codones de parada inmediatamente despues del sitio de comienzo transcripcional en cualquiera de las copias extra.

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Escualeno epoxidasa. De forma similar, se alcanzo un incremento en la acumulacion de escualeno en S. cerevisiae mediante disrupcion en el diploide de una copia de escualeno epoxidasa. Kamimura, N., Hidaka, M., Masaki, H., y Uozumi, T. (1994) Appl. Microb. Biotech. 42: 353-357. Se determino el numero de copias de la escualeno epoxidasa en R. glutinis y C. curvatus y otras levaduras, se empleo RTDS para crear o insertar un codon de parada inmediatamente despues del sitio de comienzo transcripcional en copias extras mas alla de la primera.

En algunos ejemplos, la actividad escualeno epoxidasa se atenua mediante la adicion de terbinafina (un inhibidor de escualeno epoxidasa) al medio. En determinados ejemplos, se realizan cambios en los aminoacidos de la escualeno epoxidasa para incrementar la sensibilidad de escualeno epoxidasa a terbinafina (por ejemplo, cambios de aminoacidos homologos a G30S, L37P, y R269G mapeado por Saccharomyces ERG1). En algunos ejemplos, los cambios de aminoacidos se realizan mediante smtesis genica y reemplazo del gen de tipo salvaje por una version mutante mediante recombinacion homologa. En otros ejemplos, los cambios se introducen en el gen de tipo salvaje mediante RTDS.

HMGR. Tanto Saccharomyces cerevisiae como las enzimas HMGR de mamferos contienen secuencias de aminoacidos en sus regiones enlazantes, que se presentan en muchas protemas de corta vida que son objeto de una rapida renovacion intracelular en eucariotas (vease Rogers, S., Wells, R., y Rechsteiner, M. (1986) Science 234: 364-368; y Chun, K.T., y Simoni, R.D. (1991) J. Biol. Chem. 267(6): 4236-4246). Se identifican, si estan presentes, secuencias similares en los genes HMGR en Y. lipolytica, R. glutinis y/o C. curvatus, y se eliminan empleando RTDS para reducir la renovacion HMGR proteica. Se encontraron secuencias similares en el gen escualeno sintasa de S. cerevisiae, y se determinaron tambien si tales secuencias se presentaban en los genes sintasa escualeno en Y. lipolytica y/o C. curvatus. Se eliminaron tambien las secuencias si estaban presentes en la escualeno sintasa de Y. lipolytica y/o C. curvatus utilizando RTDS para reducir la renovacion proteica.

La HMGR en S. cerevisiae comprende dos dominios altamente conservados, de los que el N-terminal de los 552 aminoacidos son responsables de la asociacion de la membrana. La sobreexpresion de la protema HMG1 truncada que contiene solo la porcion catalftica C-terminal, conduce a un incremento de la actividad de la HMG-CoA de 40 veces en S. cerevisiae, con una acumulacion de escualeno aumentada en un 5,5% de la materia seca (Polakowski, T., Stahl, U., y Lang, C. (1998) Appl. Microbiol. Biotech. 49:66-71). Se determino si las protemas HMGR de Y. lipolytica, R. glutinis y C. curvatus teman una estructura similar, y, si es asf, solo se podfan expresar los fragmentos que tienen el dominio catalftico soluble.

La estructura proteica y la secuencia de ADN de HMGR estan altamente conservadas entre los eucariotas de los hongos hasta los animales, con un dominio N-terminal asociado a la membrana y un dominio catalftico C-terminal. El ftmite entre los dos dominios se puede mapear hasta una region de 500-600 aminoacidos en el gen HMG1 de Yarrowia lipolytica (Genolevures Yarrowia lipolytica YALI0E04807g) donde se trazan las transiciones hidrofobicas a las hidrofflicas. Se eligieron los restos 548 y 544 para la evaluacion del diagrama de hidrofobicidad de HMG1 de Yarrowia lipolytica, y su homologfa para el N-terminal de las protemas truncadas de Saccharomyces cerevisiae (Donald, K.A.G., et al, 1997. Appl. Environ. Micro. 63(9):3341-3344) y Candida utilis (Shimada, H. et al, 1998. Appl. Environ. Micro. 64(7):2676-2680). Por consiguiente, en un ejemplo, se expresan los aminoacidos 548-1000 del dominio C-terminal de HMG1 de Yarrowia lipolytica; en un segundo ejemplo, se expresan los aminoacidos 544-1000 del dominio C-terminal de HMG1 de Yarrowia lipolytica. En ejemplos relacionados, se expresan los aminoacidos 543-1000 del dominio C-terminal de HMG1 de Yarrowia lipolytica; o se expresan los aminoacidos 545-1000 de los dominios C-terminales de HMG1 de Yarrowia lipolytica; o se expresan los aminoacidos 546-1000 de los dominios C- terminales de HMG1 de Yarrowia lipolytica; o se expresan los aminoacidos 547-1000 de los dominios C-terminales de HMG1 de Yarrowia lipolytica; o se expresan los aminoacidos 549-1000 de los dominios C-terminales de HMG1 de Yarrowia lipolytica.

La expresion del dominio catalftico C-terminal del aminoacido 457 de HMGR (restos 543-1000) en la cepa Polg de Y. lipolytica produjo un 2% de escualeno/ftpido total en comparacion con el 0% en la cepa control que contiene solo el vector en experimentos que emplean agitacion de matraces. El proceso se repitio y amplio empleando fermentadores.

En hamsters sirios, la actividad del dominio catalftico de HMGR se modula a la baja mediante la fosforilacion por una quinasa dependiente de AMP (Omkumar, R.V., Darnay, B.G., y Rodwell, V.W. (1994) J. Biol. Chem. 269:6810-6814), y se describio un modo de regulacion similar en S. cerevisiae. Se determino si las protemas HMGR en R. glutinis, C. curvatus y otras levaduras se regulaban de forma similar, y de ser asf, se empleo RTDS para eliminar el sitio de fosforilacion.

Escualeno sintasa. La escualeno sintasa en sistemas de mairftferos se regula coordinadamente en el nivel transcripcional junto con la HMG-CoA sintasa y la farnesil difosfato sintasa mediante SREBPs (de sus siglas en ingles, protemas de union al elemento regulador del esterol) (Szkopinsda, A., Swiezewska, E., y Karst, F (2000) Biochem. Biophys. Res. Comm. 267:473-477). Las SREBPs existen en tres formas, de las cuales una se une al promotor de la escualeno sintasa. Se determino si tales factores de transcripcion y/o sitios de union se presentan en el promotor de la escualeno sintasa en R. glutinis, C. curvatus y otras levaduras, y, si se presentan, se empleo RTDS para realizar los cambios en tales factores de transcripcion y/o sitios de union que mejoraran la transcripcion de la escualeno sintasa.

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La sobreexpresion de Escualeno Sintasa en Y. lipolytica y en la cepa Polg de Y. lipolytica produjo un 2% de escualeno/Upido total en comparacion con el 0% en la cepa control que contiene solo el vector en experiments que emplean agitacion de matraces. El proceso se repitio y amplio empleando fermentadores.

Ejemplo 5. Condiciones de Cultivo para Cryptococcus curvatus.

(no segun la presente invencion)

El cultivo de Cryptococcus curvatus se evaluo para determinar las mejores fuentes de carbono para maximizar su masa celular en cultivo. En un medio rico basado en extracto de levadura (10 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de peptona), C. curvatus se cultivo en pocillos de 2-20% p/v de glucosa, alcanzando un nivel maximo de 55 g/L peso seco celular (CDW) al 16% p/v de glucosa y despues de 4 dfas. De forma similar, C. curvatus crecio en el mismo medio con 3-12% p/v de glicerol, alcanzando un CDW de 40 g/L en 12% de glicerol despues de 5 dfas. C. curvatus tambien se cultivo en glicerol Biodiesel (Imperial Western Products, Coachella, CA) hasta 3,5% p/v, dando como resultado 23 g/L CDW.

Ejemplo 6. Manipulacion medioambiental de genes diana para la produccion aumentada de escualeno.

Se ensayaron manipulaciones medioambientales para incrementar el rendimiento neto de escualeno. Estas incluyen (a) inhibir la expresion y/o actividad ACCasa con acido oleico, aceite de oliva, u otro aceite o aceites vegetales, inositol, colina, soraphen, fluazifop, y cletodim u otros herbicidas inhibidores de la ACCasa, (b) inhibir la expresion y/o actividad de la escualeno epoxidasa con terbinafina, tolnaftato, y ergosterol u otros fungicidas inhibidores de la escualeno epoxidasa, (c) manipular la tasa C/N en el medio basado en glicerol (en el medio de inicio o mediante adiciones), (d), variar la fuente de nitrogeno en el medio (organico frente inorganico frente simple/complejo), (e) variar los regfmenes de adicion de carbono (por ejemplo, lotes frente alimentacion), (f) examinar el efecto de los nutrientes agotados diferentes a la fuente de carbono, (g) variar la fuente de carbono para incluir mezclas de azucares, alcoholes de azucar, alcoholes, polialcoholes, y acidos organicos, (h) seleccionar para el cultivo compuestos inhibidores de la HMGR, tales como lovastatina u otros inhibidores de tipo estatina, y (i) seleccionar para una gran produccion de aceite en cultivo el empleo de colorantes o cepas lipofflicos y/o mediante analisis de ifpidos extrafbles empleando, por ejemplo, metodos gravimetricos o cromatograffa de gases.

Por ejemplo, Yarrowia lipolytica ATCC 90904 se cultivo en un medio con una alta tasa de Carbono/Nitrogeno (C/N = 420, Li, Y-H., Liu, B., Zhao, Z-B., y Bai, F-W. 2006 “Optimized Culture Medium and Fermentation Conditions for Lipid Production by Rhodosporidium toruloides” Chinese Journal of Biotechnology 22(4): 650-656) (de aqrn en lo sucesivo “Medio CYM001”) enriquecido con 0 a 50 pg/ml de terbinafina a 30 °C, 300 rpm durante 120 horas. Concentraciones de terbinafina de 12,5 pg/ml o superiores, dieron como resultado hasta el 18,5% de escualeno del lfpido total.

Se emplearon varias cepas de Yarrowia lipolytica para la produccion de lfpido y escualeno, incluyendo ATCC 20688, ATCC 90811, ATCC 90904, ATCC 90812, ATCC MYA-2613, y Yeastern polg. Por ejemplo, se cultivo una cepa de polg (Yeastern) de Yarrowia lipolytica en un medio de una tasa elevada de Carbono/Nitrogeno (C/N = 420, Li, Y-H., Liu. B., Zhao, Z-B., y Bai, F-W. 2006 “Optimized Culture Medium and Fermentation Conditions for Lipid Production by Rhodosporidium toruloides” Chinese Journal of Biotechnology 22(4): 650-656) (de aqrn en lo sucesivo “Medio CYM001”) enriquecido con 0 a 50 pg/ml de terbinafina a 30 °C, 300 rpm durante 120 horas. Concentraciones de terbinafina de 12,5 pg/ml o superiores, dieron como resultado hasta el 38% de escualeno del lfpido total y se alcanzaron Valores de lfpido total/Peso seco celular de hasta 51%.

En otro ejemplo, se cultivo Yarrowia lipolytica ATCC 90904 en un medio CYM001 enriquecido con 0 a 50 pg/ml de acido oleico a 30°C, 300 rpm durante 120 horas.

Se encontro que el enriquecimiento con 10 pg/ml de acido oleico mejoraba en 10 veces la acumulacion de lfpido en el lfpido/CDW (peso celular en seco) frente al no enriquecimiento.

En otro ejemplo, se cultivo Yarrowia lipolityca ATCC 90904 en un medio CYM001 enriquecido con 0 a 200 pM de cletodim a 30°C, 300 rpm durante 120 horas. El enriquecimiento de 200 pM de cletodim dio como resultado un incremento de 60 veces el rendimiento (mg) de escualeno por matraz de 60 ml.

Se ha demostrado que un incremento de oxfgeno causa una regulacion diferencial de HMG1 y HMG2 en S. cerevisiae, dando como resultado una rapida degradacion de la HMG2 y una expresion incrementada de HMG1 bajo condiciones aerobicas (Casey, W.M., Keesler, G.A., Parks, L.W. (1992) J. Bact. 174:7283-7288). Se determino si el numero de genes HMGR en nuestras levaduras oleaginosas se afecta por el oxfgeno, y si es asf, se manipula su expresion y actividad en el fermentador mediante la alteracion de los niveles de oxfgeno.

Comenzando con un “Medio CYM001” (Li, Y-H., Liu, B., Zhao, Z-B, y Bai, F-W. (2006) Chinese Journal of Biotechnology 22(4):650-656), se cambian varios componentes y concentraciones de los componentes (incluyendo la adicion de nuevos componentes) para mejorar el crecimiento celular, porcentaje de contenido de lfpido total/unidad de masa celular, y el porcentaje de escualeno/lfpido total. Los componentes del medio que se evaluan incluyen: fuentes de carbono: glicerol, glucosa, fuentes de nitrogeno: compuestos de amonio, nitratos, aminoacidos, sales minerales: potasio, magnesio, sodio, hierro, manganeso, zinc, calcio, cobre, extracto de levadura, precursores

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lipfdicos, y efectores de la smtesis lip^dica: terbinafina, cletodim, acido oleico, acido palmitoleico, acido linoleico, acido linolenico y agentes antiespumantes. Otros factores que se evaluan incluyen: porcentaje inoculante, tiempo de fermentacion, temperatura, pH, contrapresion, ox^geno disuelto (DO), composicion de la alimentacion, estrategia de la alimentacion y estrategia de agitacion.

Ejemplo 7. Seleccion de la Cepa. (no segun la presente invencion)

Se emplearon metodos de seleccion de la cepa tradicional en levaduras oleaginosas para incrementar su productividad neta de escualeno. Se evaluaron y/o seleccionaron las cepas mutadas mediante UV, nitrosoguanidina, o etil metano sulfonato para una acumulacion incrementada de escualeno. Las cepas tambien se sometieron a una presion de seleccion repetitiva, tal como el paso repetido por medio YEP (15 g/L de extracto de levadura, 5 g/L peptona) que contiene 3% de glicerol o un medio que contiene lovastatina y otro inhibidor HMGR conocido. Las cepas se sometieron tambien al paso repetido en Medio CYM001 que contiene cantidades variables de glicerol y/o glucosa o un medio que contiene lovastatina y/o otros inhibidores HMGR conocidos, y/o inhibidores de escualeno sintasa para obtener mutantes espontaneos que incrementan la actividad HMGR y/o escualeno sintasa. Tales mutaciones pueden estar en la HMGr, escualeno sintasa, u otros genes (“mutaciones en sitios secundarios”).

A menos que se defina de otra manera, todos los terminos tecnicos y cientificos que se emplean en la presente memoria, tienen el mismo significado que el que se entiende comunmente por cualquier experto en la tecnica a la cual pertenece esta invencion.

Las invenciones que se describen de forma ilustrativa en la presente memoria, se pueden practicar adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elemento, limitacion o limitaciones, que no se describen espedficamente en la presente memoria. Por tanto, por ejemplo, los terminos “que comprende”, “que incluye”, “que contiene”, etc, se debenan leer de una forma extensa y sin limitacion. Ademas, los terminos y expresiones que se emplean en la presente memoria se han empleado como terminos de descripcion y no de limitacion, y no existe intencion en el empleo de tales terminos y expresiones, de excluir ninguna de las equivalencias de las caractensticas mostradas y descritas, o porciones de las mismas, pero se reconoce que son posibles varias modificaciones dentro del alcance de la invencion que se reivindica.

Por tanto, se entendera que aunque la invencion se ha divulgado espedficamente mediante realizaciones preferidas, el experto en la tecnica puede recurrir a caractensticas, modificaciones, mejoras y variaciones opcionales de las invenciones descritas en la presente memoria incluidas en ellas, y que tales modificaciones, mejoras y variaciones, se consideran que estan dentro del alcance de esta invencion. Los materiales, metodos, y ejemplos que se proporcionan aqd, son representativos de realizaciones preferidas, son ejemplos, y no tienen la intencion de limitar el alcance de la invencion.

Claims (12)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion que comprende una levadura transformada geneticamente, en donde dicha levadura transformada geneticamente expresa una o mas enzimas modificadas que tienen una o mas mutaciones disenadas, dicha enzima o enzimas modificadas comprenden escualeno epoxidasa, en donde dicha escualeno epoxidasa tiene una actividad y/o expresion reducida, en donde dicha mutacion o mutaciones disenadas estan en posiciones determinadas dentro de dicha enzima, en donde dicha levadura produce cantidades aumentadas de escualeno en comparacion con la levadura nativa, y en donde la levadura es una cepa de Yarrowia lipolytica que se selecciona del grupo que consiste en ATCC 90812, ATCC MYA-2613, o Yeastern polg.
2. 2. Un metodo para producir escualeno mediante una levadura transformada geneticamente,

   comprendiendo dicho metodo el incremento o descenso de la actividad o expresion de una o mas enzimas en la ruta de biosmteis isoprenoide, dicha enzima o enzimas comprenden escualeno epoxidasa, donde dicha escualeno epoxidasa tiene una actividad y/o expresion reducida, en donde dicha actividad o expresion enzimatica se aumenta o disminuye mediante una o mas mutaciones disenadas, en donde dicha mutacion o mutaciones disenadas estan en posiciones determinadas dentro de dicha enzima, en donde dicha levadura transformada geneticamente produce cantidades aumentadas de escualeno en comparacion con la levadura nativa y, en donde la levadura es una cepa de Yarrowia lipolytica que se selecciona del grupo que consiste en ATCC 90812, ATCC MYA-2613, o Yeastern polg.
3. 3. Las composiciones o metodos segun la reivindicacion 1 o 2, en donde dicha levadura transformada geneticamente se deriva de una levadura oleaginosa.
4. 4. Las composiciones o metodos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que

   comprenden ademas una enzima modificada que se selecciona del grupo que consiste en acetil-CoA carboxilasa (“ACCasa”), HMG-CoA reductasa, escualeno sintasa, ATP citrato liasa, ATP citrato sintasa, mevalonato quinasa, glicerol quinasa y 5-aminolevulinato sintasa.
5. 5. Las composiciones o metodos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde

   dicha actividad o expresion se reduce al 90%; o 80%; o 70%; o 60%; o 50%; o 40%; o 30%; o 20%; o 10%; o 5% de la actividad o expresion de la levadura nativa correspondiente.
6. 6. Las composiciones o metodos segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha actividad o expresion esta entre 90-95%; o 80-90%; o 70-80%; o 60-70%; o 50-60%; o 40-50%; o 30-40%; o 20-30%; o 10-20%; o 5-10%; o 2-5% de la actividad o expresion de la levadura nativa correspondiente.
7. 7. Las composiciones o metodos de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la levadura es la cepa Yeastern polg de Yarrowia lipolytica.
8. 8. Las composiciones o metodos de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde un agente antifungico esta presente en la composicion o se anade a la levadura en el metodo; o en donde un agente antifungico esta presente en la composicion o se anade a la levadura en el metodo a una concentracion entre 0,5 a 100 |jg/ml, entre 1 a 25 jg/ml, o entre 10 a 15 jg/ml.
9. 9. Las composiciones o metodos de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde un agente antifungico esta presente en la composicion o se anade a la levadura en el metodo; y en donde el agente antifungico es un agente antifungico de alilamina; o en donde un agente antifungico esta presente en la composicion o se anade a la levadura en el metodo; y en donde el agente antifungico es un agente antifungico de alilamina a una concentracion entre 0,5 a 100 jg/ml, entre 1 a 25 jg/ml, o entre 10 a 15 jg/ml.
10. 10. Las composiciones o metodos de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde un agente antifungico esta presente en la composicion o se anade a la levadura en el metodo; y en donde el agente antifungico es terbinafina, o es terbinafina a una concentracion entre 0,5 a 100 jg/ml, entre 1 a 25 jg/ml, o entre 10 a 15 jg/ml.
11. 11. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo dicho metodo el cultivo de dicha levadura con un agente antifungico; en donde la levadura es la cepa Yeastern polg de Yarrowia lipolytica y en donde el agente antifungico es terbinafina.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, en donde el agente antifungico es terbinafina a una concentracion de 12,5 jg/ml o mas.