CN114058525A - 一种高产角鲨烯基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高产角鲨烯基因工程菌的构建方法，是利用同源重组的方式在酿酒酵母中整合表达MVA途径限速酶‑截短形式的HMG‑CoA还原酶编码基因(tHMG1)和整合融合表达FPP合酶编码基因(ERG20)与酿酒酵母内源性角鲨烯合酶编码基因(ERG9)，以增强MVA途径代谢强度，增强角鲨烯的表达。同时使用铜离子诱导启动子pCUP1替换角鲨烯单加氧酶编码基因ERG1启动子下调其表达水平，减少角鲨烯环氧化合成麦角固醇，提高角鲨烯产量；最终获得高产角鲨烯的基因工程菌株。该基因工程菌的角鲨烯的摇瓶发酵产量可达到约57mg/L，发酵罐产量可达到约7g/L，完全具备商业化生产水平，具有良好的工业应用前景。

Description

一种高产角鲨烯基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种高产角鲨烯基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

角鲨烯(squalene)分子式：C₃₀H₆₀，又名鲨烯，是一种由6个异戊二烯构成的无环三萜烯。广泛存在于动植物及微生物体内，因其具有较强的生物活性而被广泛应用于化妆品、食品、保健品和医药等领域。

角鲨烯可以从深海鲨鱼的肝油中提取，成本昂贵，而且鲨鱼的数量在急剧减少，鲨鱼作为角鲨烯来源不可持续；也可以从各类油作物中进行提取分离，但含量极低而且原料预处理复杂，产量不稳定，都很难进行角鲨烯的工业化生产。除此之外，微生物发酵也是角鲨烯的一个来源，微生物发酵法具有条件温和，不受地理和气候影响和容易进行大规模生产等优势。目前能发酵生产角鲨烯的菌株有很多，比如类酵母菌，解脂耶氏酵母，酿酒酵母等，但产量都普遍偏低很难用于工业化生产。

酿酒酵母是国际公认的安全模式菌株且遗传操作方法成熟且能够合成内源性角鲨烯，有天然的优势。目前针对改造酿酒酵母生产角鲨烯的研究有很多，但真正量产投入市场的微生物发酵角鲨烯暂时还没有，因此，构建高产稳定的角鲨烯酿酒酵母生产菌株，对其生产和应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种高产角鲨烯基因工程菌及其构建方法与应用。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供的一种高产角鲨烯基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

步骤S1，构建酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块：过表达tHMG1模块，包括诱导型双向强启动子pGAL1-10和MVA途径限速酶编码基因tHMG1，所述pGAL1-10的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，所述tHMG1的核苷酸序列如 SEQ NO.2所示；

步骤S2，构建角鲨烯生产相关基因表达模块：ERG20-Linker-ERG9模块，包括FPP合酶的编码基因ERG20和酿酒酵母内源性角鲨烯合酶的编码基因 ERG9，所述ERG20的核苷酸序列如SEQ NO.3所示，所述ERG9的核苷酸序列如SEQ NO.4所示；

步骤S3，构建敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的工程菌：将步骤S1 所述酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块和步骤S2所述角鲨烯生产相关基因表达模块整合至半乳糖调节蛋白GAL80基因位点，同时敲除半乳糖调节蛋白 GAL80基因，得到敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块，将所述敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块转化至构建的酿酒酵母基因工程菌GS-A3中，经多次基因工程操作，获得敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的基因工程菌；

步骤S4，构建角鲨单加氧酶途径下调表达质粒，包括将铜离子诱导启动子 pCUP1替换为角鲨烯单加氧酶ERG1启动子，所述pCUP1的核苷酸序列如SEQ NO.5所示；所述角鲨烯单加氧酶ERG1启动子取至ERG1基因起始密码子前 461bp，其核苷酸序列如SEQ NO.6所示

步骤S5，将步骤S4所述角鲨单加氧酶途径下调表达质粒转化至步骤S3所述的敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的基因工程菌中，依次经抗生素抗性筛选，然后通过菌落PCR验证，获得高产角鲨烯基因工程菌；

所述构建方法还包括两个终止子tCYC1和tERG20，所述终止子tCYC1的核苷酸序列如SEQ NO.7所示，所述终止子tERG20的核苷酸序列如SEQ NO.8 所示。

进一步的，在步骤S1中，所述过表达tHMG1模块的构建方法包括以下步骤：

步骤S1，以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用tCYC1-F和 tCYC1-R、tHMG1-F和tHMG1-R、pGAL1pGAL10-F和pGAL1pGAL10-R引物进行PCR反应，获得DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1；

步骤S2，将步骤S1获得的三个DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1，通过用引物tCYC1-F和pGAL1pGAL10-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得过表达tHMG1模块，即tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1模块。

进一步的，步骤S2中，所述ERG20-Linker-ERG9模块的构建方法包括以下步骤：

步骤S1，以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用ERG20-F和ERG20- Linker–S-R引物进行PCR反应，扩增得到DNA片段ERG20_Linker；

步骤S2，用引物Linker-ERG9-F和ERG9-R进行PCR反应，扩增得到DNA 片段Linker_ERG9；

步骤S3，用引物tERG20-S-F和tERG20-R进行PCR反应，扩增得到DNA 片段tERG20；

步骤S4，将步骤S1获得的DNA片段ERG20_Linker、步骤S2获得的DNA 片段Linker_ERG9和步骤S3获得的DNA片段tERG20，通过用引物ERG20-F 和tERG20-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得融合表达 ERG20-Linker-ERG9模块，即ERG20_Linker_ERG9_tERG20。

进一步的，所述Linker包括甘氨酸和丝氨酸，其组合结构包括GSG、GGGS 和GSGGSG中的任一种，其中G对应核酸序列GGT，S对应核酸序列TCT。

进一步的，在步骤S2中，所述ERG20-Linker-ERG9模块中的Linker为GSG。

进一步的，在步骤S3中，所述构建敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块的构建方法包括以下步骤：

步骤S1，以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用GAL80left-F和 GAL80left-R、GAL80right-F和GAL80right-R引物进行PCR反应，扩增得到DNA 片段GAL80的左右同源臂GAL80left和GAL80right；

步骤S2，以质粒载体pFZ201为模板，用引物Hyg-F和Hyg-R进行PCR反应，获得潮霉素表达盒Hyg；

步骤S3，将所述过表达tHMG1模块和所述ERG20-Linker-ERG9模块、 GAL80left，GAL80right和Hyg五个DNA片段，通过用引物GAL80left-F和 GAL80right-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段为敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块的；

步骤S4，将步骤S3获得的DNA片段与质粒pMD19-T连接，获得重组质粒载体，用限制性内切酶PmeI线性化所述重组质粒，回收带有目的基因的片段，将片段用酵母醋酸锂转化法转化至宿主菌酿酒酵母中，依次经抗生素抗性筛选，然后通过菌落PCR获取阳性菌落，获得敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的工程菌。

进一步的，在步骤S3中，所述宿主菌酿酒酵母包括酿酒酵母30000B、酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1D、酿酒酵母BY4741和酿酒酵母GS-A3中的任一种，所述酿酒酵母GS-A3于2021年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M20211191。

进一步的，在步骤S4中，所述角鲨单加氧酶途径下调表达质粒的构建方法包括以下步骤：

步骤S1，以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用pERG1-left- F和pERG1-left-R、pCUP1-S-F和pCUP1-S-R、pERG1-right-F和pERG1-right-R 引物进行PCR反应，扩增得到DNA片段pERG1-left、pCUP1和pERG1-righ；

步骤S2，以质粒载体pFZ202为模板，用引物G418-S-F和G418-S-R进行PCR 反应，获得G418表达盒G418；

步骤S3，将步骤S1获得的DNA片段pERG1-left、pCUP1和pERG1- righ和步骤S1获得的表达盒G418四个DNA片段，通过用引物pERG1-left-F 和pERG1-right-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段 G418_pCUP1/ΔpERG1；

步骤S4，将步骤S3获得的DNA片段G418_pCUP1/ΔpERG1与质粒 pMD19-T连接，获得角鲨烯单加氧酶途径下调表达质粒载体，记为pSZ101。

本发明还提供了一种高产角鲨烯基因工程菌，采用上述构建方法得到的。

本发明还提供了利用上述高产角鲨烯基因工程菌的生产角鲨烯，所述高产角鲨烯基因工程菌的液体发酵培养基组分包括葡萄糖20-50g/L，酵母提取物 5-10g/L，硫酸铵6-15g/L，磷酸二氢钾3-8g/L，七水硫酸镁5-10g/L，硫胺素 100-500mg/L，吡哆素100-500mg/L，肌醇400-800mg/L，生物素20-100mg/L和泛酸钙100-500mg/L。

本发明提供的技术方案带来的有益效果是：

(1)本发明的构建方法是利用同源重组的方式，将双向强启动子 (pGAL1-10)驱动的酿酒酵母菌来源的甲羟戊酸途径限速：截短形的HMG-CoA 还原酶的编码基因tHMG1和FPP合酶(ERG20)与酿酒酵母内源性角鲨烯合酶 (ERG9)融合蛋白质的基因元件(ERG20-Linker-ERG1)整合入出发菌株酿酒酵母基因组，整合位点为半乳糖调节蛋白80基因(GAL80)，整合目的基因的同时敲除半乳糖调节蛋白80基因，以增强甲羟戊酸代谢途径代谢强度，进一步增强角鲨烯的表达。该构建方法具有简单快速高效的优点，2～3周即可获得大片段整合工程菌株，明显缩短工程菌构建周期。

(2)本发明以(1)中所获工程菌为基础，使用铜离子诱导启动子pCUP1替换角鲨单加氧酶编码基因ERG1启动子下调其表达水平，可以减少角鲨烯环氧化合成麦角固醇，进一步提高角鲨烯产量；最终获得高产角鲨烯的基因工程菌株。按照本发明的方法获得的基因工程菌的角鲨烯的摇瓶发酵产量可达到约 57mg/L，发酵罐产量可达到约7g/L，具备商业化生产水平，具有良好的工业应用前景。

(3)本发明可利用简单培养基发酵生产角鲨烯，可实现多基因一次性高效转化与整合，可明显缩短工程菌构建时间，所得工程菌可利用葡萄糖、蔗糖等简单碳源进行角鲨烯的发酵生产，有较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明的酿酒酵母基因工程菌的生产角鲨烯的生物代谢原理示意图；

图2为本发明实施例1构建的敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块的重组质粒pSZ100的结构示意图；

图3为本发明实施例1构建的角鲨烯合酶途径下调表达的重组质粒pSZ101 的结构示意图；

图4为不同Linke连接对角鲨烯产量的影响比较图；

图5为不同基因工程菌GS-A3-S4、G30000B-S2、CEN.PK2-1D-S2和 BY474-S2生产角鲨烯的比较图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明实施方式作进一步地描述。

本发明在研究的过程中使用的材料和方法如下：

本发明中的全基因合成、引物合成及测序皆由武汉天一华煜基因科技有限公司完成，用到的高保真酶(PrimeSTAR GXL DNA Polymerase)，普通Taq 酶(Premix Taq)，pMD19-T Vector等购买于武汉友名生物技术有限公司，限制性内切酶购买于湖北晶茂生物技术有限公司；酿酒酵母30000B为市售。

本发明中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备﹑转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著,黄培堂等译，科学出版社，2002)进行。

LB固体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，20g/L 琼脂粉；

YPD培养基：10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖；

YPD固体培养基:10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖，20g/L 琼脂粉。

下列实施例中还有未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明,为从商业途径得到的试剂和材料。

如图1所示为生物合成角鲨烯的代谢原理图，本发明构建的高产角鲨烯基因工程菌，是利用同源重组的方式将双向强启动子pGAL1-10驱动的酿酒酵母菌来源的甲羟戊酸途径限速酶编码基因tHMG1；FPP合酶(ERG20)与酿酒酵母内源性角鲨烯合酶(ERG9)融合蛋白质的基因元件(ERG20-Linker-ERG9)整合入出发菌株酿酒酵母基因组，整合位点为半乳糖调节蛋白80基因(GAL80)，整合目的基因的同时敲除半乳糖调节蛋白80基因；然后用铜离子诱导启动子 pCUP1替换重组菌体内角鲨烯单加氧酶基因ERG1的启动子下调其表达水平。

其中，诱导型双向强启动子pGAL1-10的核苷酸序列如SEQ NO.1所示；甲羟戊酸途径限速酶为截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，编码基因 tHMG1的核苷酸序列如SEQ NO.2所示，FPP合酶(ERG20)编码基因的苷酸序列如SEQ NO.3所示，酿酒酵母内源性角鲨烯合酶(ERG9)编码基因的苷酸序列如SEQ NO.4所示，将SEQ ID NO.3所示序列的3’端终止密码子TAG去除, 与SEQ ID NO.4所示序列的5'端用编码Linker的碱基序列连接；构建出ERG20-Linker-ERG9融合蛋白质的基因元件；ERG20的催化产物FPP，是ERG9 的底物，两个酶通过linker序列融合表达，在空间构象上拉近它们的距离，可以提高由IPP到FPP再到角鲨烯的反应效率，避免FPP的浪费和减少FPP去往其他代谢支路，从而提高角鲨烯的产量。

又因为角鲨烯单加氧酶(ERG1)催化角鲨烯环氧化进入麦角固醇合成途径，是角鲨烯衍生途径的第一个酶，导致在酿酒酵母细胞内积累的角鲨烯很少。因此，要想实现角鲨烯的高效合成，敲除或下调角鲨烯单加氧酶(ERG1)是十分必要的。但麦角固醇是生长必须物质，不能直接敲除ERG1，必须动态调控。本发明用铜离子诱导启动子pCUP1替换角鲨烯单加氧酶(ERG1)的启动子下调其表达水平。因此本发明用铜离子诱导启动子pCUP1替换角鲨烯单加氧酶基因 ERG1的启动子下调其表达水平；铜离子诱导启动子pCUP1的核苷酸序列如SEQ NO.5所示；选用角鲨烯单加氧酶基因ERG1启动子取ERG1基因起始密码子前 461bp，其核苷酸序列如SEQ NO.6所示。

为了更准确的指导构建的各个模块的正确结合，构建过程中还使用了两个终止子tCYC1和tERG20，分别对应的核苷酸序列为SEQ NO.7和SEQ NO.8。

实施例1-3和对比例1-3中使用的引物序列信息如表1所示：

表1：引物序列

实施例1

高产角鲨烯基因工程菌GS-A3-S4的构建：

步骤S1，过表达tHMG1模块的构建

tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1

1)以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用tCYC1-F和tCYC1-R、 tHMG1-F和tHMG1-R、pGAL1pGAL10-F和pGAL1pGAL10-R引物进行PCR反应，获得DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1；

2)将步骤S1获得的三个DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1，通过用引物tCYC1-F和pGAL1pGAL10-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得过表达tHMG1模块，即tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1模块。

步骤S2，融合表达ERG20-Linker-ERG9模块的构建

ERG20_Linker_ERG9_tERG20

1)以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用ERG20-F和ERG20-Linker -S-R引物进行PCR反应，扩增得到DNA片段ERG20_Linker。

2)用引物Linker-ERG9-F和ERG9-R进行PCR反应，扩增得到DNA片段 Linker_ERG9。

3)用引物tERG20-S-F和tERG20-R进行PCR反应，扩增得到DNA片段 tERG20。

4)将上述获得的DNA片段ERG20_Linker、步骤S2获得的DNA片段 Linker_ERG9和步骤S3获得的DNA片段tERG20，通过用引物ERG20-F和 tERG20-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得融合表达 ERG20-Linker-ERG9模块，即ERG20_Linker_ERG9_tERG20。

其中，Linker包括Linker1、Linker2和Linker3，分别对应的氨基酸序列为 GSG、GGGS和GSGGSG，G对应核酸序列GGT，S对应核酸序列TCT。

步骤S3，敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块的构建

1)以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用GAL80left-F和 GAL80left-R、GAL80right-F和GAL80right-R引物进行PCR反应，扩增得到DNA 片段GAL80的左右同源臂GAL80left和GAL80right。

2)以质粒载体pFZ201为模板，用引物Hyg-F和Hyg-R进行PCR反应，获得潮霉素表达盒Hyg。

3)将所述过表达tHMG1模块和所述ERG20-Linker-ERG9模块、GAL80left，GAL80right和Hyg五个DNA片段，通过用引物GAL80left-F和GAL80right-R 进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段为敲除半乳糖调节蛋白 GAL80基因表达模块的。

选用Linker1连接，可获得模块：

GAL80left_Hyg_tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1_ERG20_Linker1_ERG9_tERG20_GAL80right。

4)将上述获得的模块连接pMD19-T载体，转入大肠内扩增，酶切和测序验证正确后，获得重组质粒载体pSZ100：

pSZ100ΔGAL80：：Hyg_tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1_ERG20_Linker1_ERG9_tERG20；

质粒载体pSZ100的结构图如图2所示。

5)将上述构建的重组质粒载体pSZ100，用限制性内切酶PmeI分别线性化，回收带有目的基因的片段，将片段用酵母醋酸锂转化法转化至酿酒酵母GS-A3，涂布到含500ug/mL潮霉素的YPD平板上，挑取转化子并提基因组PCR验证，获得对应正确的转化菌株GS-A3-S1。

步骤S4，角鲨烯单加氧酶(ERG1)途径下调表达质粒的构建

pSZ101ΔpEGR1：：G418_pCUP1

1)以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用pERG1-left-F和 pERG1-left-R、pCUP1-S-F和pCUP1-S-R、pERG1-right-F和pERG1-right-R引物进行PCR反应，扩增得到DNA片段pERG1-left、pCUP1和pERG1-righ。

2)以质粒载体pFZ202为模板，用引物G418-S-F和G418-S-R进行PCR反应，获得G418表达盒G418。

3)将上述获得的DNA片段pERG1-left、pCUP1和pERG1-righ和步骤S1 获得的表达盒G418四个DNA片段，通过用引物pERG1-left-F和pERG1-right-R 进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段G418_pCUP1/ΔpEGR1。

4)将上述获得的DNA片段G418_pCUP1/ΔpEGR1与质粒pMD19-T连接，获得角鲨烯合酶途径下调表达质粒载体，记为pSZ101，其结构图如图3所示。

步骤S5，用限制性内切酶PmeI线性化质粒pSZ101，回收带有目的基因的片段，将片段用酵母醋酸锂转化法转化至上述酿酒酵母GS-A3-S1菌株中，涂布到含500μg/mL G418和200μmol/L铜离子的YPD平板上，挑取转化子并提基因组PCR验证，获得对应正确的高产角鲨烯的转化菌株GS-A3-S4。

实施例2

基因工程菌GS-A3-S5的构建：

构建方法同实施例1，其中步骤S3中选用的Linker连接为Linker2，构建的敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达DNA片段为：

GAL80left_Hyg_tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1_ERG20_Linker2_ERG9_tERG20_GAL80right；

构建的重组质粒载体pSZ200为：

pCZ200ΔGAL80：：Hyg_tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1_ERG20_Linker2_ERG9_tERG20；

构建的敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的工程菌为GS-A3-S2。

实施例3

基因工程菌GS-A3-S6的构建：

构建方法同实施例1，其中步骤S3中选用的Linker连接为Linker3，构建的敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达DNA片段为：

GAL80left_Hyg_tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1_ERG20_Linker3_ERG9_tERG20_GAL80righ；

构建的重组质粒载体pSZ300为：

pCZ300ΔGAL80：：Hyg_tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1_ERG20_Linker3_ERG9_tERG20；

构建的敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的工程菌为GS-A3-S3。

对比例1

基因工程菌30000B-S2的构建

构建方法同实施例1，将步骤S3获得的质粒载体pSZ100和步骤S4获得质粒载体pSZ101，用限制性内切酶PmeI线性化，回收带有目的基因的片段，分两步将片段用酵母醋酸锂转化法转化至酿酒酵母底盘菌株30000B中，挑取转化子并提基因组PCR验证，获得对应正确的高产角鲨烯的转化菌株30000B-S2。

对比例2

基因工程菌CEN.PK2-1D-S2的构建

构建方法同实施例1，将步骤S3获得的质粒载体pSZ100和步骤S4获得质粒载体pSZ101，用限制性内切酶PmeI线性化，回收带有目的基因的片段，分两步将片段用酵母醋酸锂转化法转化至酿酒酵母底盘菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1D中，挑取转化子并提基因组PCR验证，获得对应正确的高产角鲨烯的转化菌株CEN.PK2-1D-S2。

对比例3

基因工程菌BY474-S2的构建

构建方法同实施例1，将步骤S3获得的质粒载体pCZ100和步骤S4获得质粒载体pCZ101，用限制性内切酶PmeI线性化，回收带有目的基因的片段，分两步将片段用酵母醋酸锂转化法转化至酿酒酵母底盘菌株BY474中，挑取转化子并提基因组PCR验证，获得对应正确的高产角鲨烯的转化菌株BY474-S2。

为了说明本发明构建的高产角鲨烯基因工程菌的高产角鲨烯的机理和应用能力，通过对不同Linker对角鲨烯产量的影响，改造不同酿酒酵母底盘菌株的对角鲨烯产量的影响进行了对比研究。

测定发酵液中角鲨烯浓度的方法：

检测流程：

测定发酵液中角鲨烯浓度的方法：

检测流程；

取200μL发酵液至2mL圆底离心管中，4000rpm室温下离心5min，将离心后样品缓慢弃去上清；加入0.2g的0.5mm的玻璃珠至含菌体离心管中，震荡10min；加入1000μL色谱级丙酮至上述离心管中，震荡10min；将上述样品以12000rpm离10min，收集上清，稀释至合适浓度

检测仪器：使用安捷伦7890A气相色谱仪,色谱柱为Agilent HP-5(30mx0.32mmx0.25μm)，柱箱温度：初始温度100℃，保留2min，以10℃/min升至300℃, 保留3min，进样口温度280℃，进样量1μL，柱流量1mL/min，注入分流比1:50，检测器(FID)温度300℃，氮气作为载气，入口压力是12-18psi，模式为恒流模式，标准品：角鲨烯(SIGMA)。

1.比较不同Linker连接对角鲨烯产量的影响

分别取10μL保存在甘油管的菌株GS-A3-S1、菌株菌株GS-A3-S2和菌株 GS-A3-S3到含有5mLYPD(含铜离子终浓度为200μmol/L)培养基的PA瓶中， 30℃摇床220rpm培养16h，获得一级种子；将一级种子以1％的转接量转到含有200mL YPD培养基的摇瓶中，30℃摇床220rpm培养五天，测定角鲨烯的含量。

如图4所示，结果显示菌株结果如图3所示，GS-A3-S1细胞中的角鲨烯含量高于GS-A3-S2和GS-A3-S3为17.86±1.13mg/g。可见，Llinker-GSG更有利于 ERG20和ERG9融合表达，提高由IPP到FPP再到角鲨烯的反应效率，从而提高角鲨烯的产量。可见，用启动子pCUP1替换pERG9，有利于减少FPP流向麦角固醇，更多流向角鲨烯途径，进而提高角鲨烯的产量。

2.比较用启动子pCUP1替换pERG1对角鲨烯产量的影响

取10μL保存在甘油管的菌株GS-A3-S4到含有5mLYPD(含铜离子终浓度为200μmol/L)培养基的PA瓶中，30℃摇床220rpm培养16h，获得一级种子；将一级种子以1％的转接量转到含有200mL YPD培养基的摇瓶中，30℃摇床220rpm培养五天，测定角鲨烯的含量。

结果显示，GS-A3-S4细胞中的角鲨烯含量相较于于GS-A3-S1的 17.86±1.13mg/g提高到57.12±4.13mg/L。可见，用启动子pCUP1替换pERG1，有利于减少FPP流向麦角固醇，更多流向角鲨烯途径，进而提高角鲨烯的产量。

3.比较改造不同酿酒酵母底盘菌株的角鲨烯产量

分别取10μL保存在甘油管的菌株GS-A3-S4、菌株30000B-S2、菌株 CEN.PK2-1D-S2和菌株BY474-S2到含有5mLYPD(含铜离子终浓度为 200μmol/L)培养基的PA瓶中，30℃摇床220rpm培养16h，获得一级种子；将一级种子以1％的转接量转到含有200mL YPD培养基的摇瓶中，30℃摇床 220rpm培养五天，测定角鲨烯的含量。

如图5所示，结果显示菌株GS-A3-S4的角鲨烯产量明显高于菌株 G30000B-S2、菌株CEN.PK2-1D-S2和菌株BY474-S2。可见，GS-A3是本申请人筛选进化的一株高产角鲨烯菌株，能提供更充足的前体物质，从而提高角鲨烯的产量。

3.利用菌株GS-A3-S4发酵生产角鲨烯

取10μL保存在甘油管的菌株到含有5mLYPD(含铜离子终浓度为 200μmol/L)培养基的PA瓶中，30℃摇床220rpm培养16h，获得一级种子；将一级种子以1％的转接量转到含有200mL YPD(含铜离子终浓度为 200μmol/L)培养基的摇瓶中，30℃摇床220rpm培养12h，获得二级级种子；向5L生物发酵罐中加入2.5L发酵培养基,以10％的转接量接入活化的二级种子液。发酵过程中，温度控制在30℃，pH用浓氨水全程控制在5.0，发酵罐起始转速为200rpm，通气量为1L/min，溶氧100％，随着发酵的进行，OD不断增大，溶氧会不断下降，待降到20％左右，就通过逐步提升转速和通气量控制溶氧在 20％左右，直到最大转速和通气；前期通过调整补料一把发酵罐中葡萄糖浓度控制在1g/L以下；发酵到30小时时，改用补料二，将发酵罐中乙醇浓度维持在 1g/L以下，发酵5天。

发酵培养基中包含如下组分：葡萄糖40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸铵12g/L，磷酸二氢钾8g/L，七水硫酸镁6.2g/L，硫胺素200mg/L，吡哆素200mg/L，肌醇 500mg/L，生物素50mg/L，泛酸钙200mg/L。

补料一组分为：葡萄糖800g/L，酵母提取物50g/L。

补料二组分为：蔗糖800g/L，酵母提取物50g/L。

最终发酵罐生产的角鲨烯产量高达到7g/L，备工业化生产能力，本发明构建的高产角鲨烯基因工程菌可应用于工业生产角鲨烯。

在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北冠众通科技有限公司

<120> 一种高产角鲨烯基因工程菌及其制备方法与应用

<141> 2021-10-22

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 668

<212> DNA

<213> 酿酒酵母 pGAL1-10

<400> 2

ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

atcatattac atggcaatac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120

tggaaatgta aagagcccca ttatcttagc ctaaaaaaac cttctctttg gaactttcag 180

taatacgctt aactgctcat tgctatattg aagtacggat tagaagccgc cgagcgggcg 240

acagccctcc gacggaagac tctcctccgt gcgtcctggt cttcaccggt cgcgttcctg 300

aaacgcagat gtgcctcgcg ccgcactgct ccgaacaata aagattctac aatactagct 360

tttatggtta tgaagaggaa aaattggcag taacctggcc ccacaaacct tcaaatcaac 420

gaatcaaatt aacaaccata ggataataat gcgattagtt ttttagcctt atttctgggg 480

taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat gcaaaagctg 540

cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcggtttg tattacttct tattcaaatg 600

tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt caaggagaaa 660

aaactata 668

<210> 2

<211> 1509

<212> DNA

<213> 酿酒酵母 tHMG1

<400> 2

ttaggattta atgcaggtga cggacccatc tttcaaacga tttatatcag tggcgtccaa 60

attgttaggt tttgttggtt cagcaggttt cctgttgtgg gtcatatgac tttgaaccaa 120

atggccggct gctagggcag cacataagga taattcacct gccaagacgg cacaggcaac 180

tattcttgct aattgacgtg cgttggtacc aggagcggta gcatgcgggc ctcttacacc 240

taataagtcc aacatggcac cttgtggttc tagaacagta ccaccaccga tggtacctac 300

ttcgatggat ggcatggata cggaaattct caaatcaccg tccacttctt tcatcaatgt 360

tatacagttg gaactttcaa cattttgtgc aggatcttgt cctaatgcca agaaaacagc 420

tgtcactaaa ttagctgcat gtgcgttaaa tccaccaaca gacccagcca ttgcagatcc 480

aaccaaattc ttagcaatgt tcaactcaac caatgcggaa acatcacttt ttaacacttt 540

tctgacaaca tcaccaggaa tagtagcttc tgcgacgaca ctcttaccac gaccttcgat 600

ccagttgatg gcagctggtt ttttgtcggt acagtagtta ccagaaacgg agacaacctc 660

catatcttcc cagccatact cttctaccat ttgctttaat gagtattcga cacctttaga 720

aatcatattc atacccattg cgtcaccagt agttgttcta aatctcatga agagtaaatc 780

tcctgctaga caagtttgaa tatgttgcag acgtgcaaat cttgatgtag agttaaaagc 840

ttttttaatt gcgttttgtc cctcttctga gtctaaccat atcttacagg caccagatct 900

tttcaaagtt gggaaacgga ctactgggcc tcttgtcata ccatccttag ttaaaacagt 960

tgttgcacca ccgccagcat tgattgcctt acagccacgc atggcagaag ctaccaaaca 1020

accctctgta gttgccattg gtatatgata agatgtacca tcgataacca aggggcctat 1080

aacaccaacg ggcaaaggca tgtaacctat aacattttca caacaagcgc caaatacgcg 1140

gtcgtagtca taatttttat atggtaaacg atcagatgct aatacaggag cttctgccaa 1200

aattgaaaga gccttcctac gtaccgcaac cgctctcgta gtatcaccta attttttctc 1260

caaagcgtac aaaggtaact taccgtgaat aaccaaggca gcgacctctt tgttcttcaa 1320

ttgttttgta tttccactac ttaataatgc ttctaattct tctaaaggac gtattttctt 1380

atccaagctt tcaatatcgc gggaatcatc ttcctcacta gatgatgaag gtcctgatga 1440

gctcgattgc gcagatgata aacttttgac tttcgatcca gaaatgactg ttttattggt 1500

taaaaccat 1509

<210> 3

<211> 1059

<212> DNA

<213> 酿酒酵母 ERG20

<400> 3

atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60

gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg tgactggtat 120

gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagctaa atagaggttt gtccgttgtg 180

gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga agaatacgaa 240

aaggttgcca ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttacttctt ggtcgccgat 300

gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360

gttggggaaa ttgccatcaa tgacgcattc atgttagagg ctgctatcta caagcttttg 420

aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt ccatgaggtc 480

accttccaaa ccgaattggg ccaattgatg gacttaatca ctgcacctga agacaaagtc 540

gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcaa gactgcttac 600

tattctttct acttgcctgt cgcattggcc atgtacgttg ccggtatcac ggatgaaaag 660

gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatacttcca aattcaagat 720

gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac agatatccaa 780

gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattggaac ttgcttccgc agaacaaaga 840

aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa atgcaaaaag 900

attttcaatg acttgaaaat tgaacagcta taccacgaat atgaagagtc tattgccaag 960

gatttgaagg ccaaaatttc tcaggtcgat gagtctcgtg gcttcaaagc tgatgtctta 1020

actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaatag 1059

<210> 4

<211> 1335

<212> DNA

<213> 酿酒酵母 ERG9

<400> 4

atgggaaagc tattacaatt ggcattgcat ccggtcgaga tgaaggcagc tttgaagctg 60

aagttttgca gaacaccgct attctccatc tatgatcagt ccacgtctcc atatctcttg 120

cactgtttcg aactgttgaa cttgacctcc agatcgtttg ctgctgtgat cagagagctg 180

catccagaat tgagaaactg tgttactctc ttttatttga ttttaagggc tttggatacc 240

atcgaagacg atatgtccat cgaacacgat ttgaaaattg acttgttgcg tcacttccac 300

gagaaattgt tgttaactaa atggagtttc gacggaaatg cccccgatgt gaaggacaga 360

gccgttttga cagatttcga atcgattctt attgaattcc acaaattgaa accagaatat 420

caagaagtca tcaaggagat caccgagaaa atgggtaatg gtatggccga ctacatctta 480

gatgaaaatt acaacttgaa tgggttgcaa accgtccacg actacgacgt gtactgtcac 540

tacgtagctg gtttggtcgg tgatggtttg acccgtttga ttgtcattgc caagtttgcc 600

aacgaatctt tgtattctaa tgagcaattg tatgaaagca tgggtctttt cctacaaaaa 660

accaacatca tcagagatta caatgaagat ttggtcgatg gtagatcctt ctggcccaag 720

gaaatctggt cacaatacgc tcctcagttg aaggacttca tgaaacctga aaacgaacaa 780

ctggggttgg actgtataaa ccacctcgtc ttaaacgcat tgagtcatgt tatcgatgtg 840

ttgacttatt tggccggtat ccacgagcaa tccactttcc aattttgtgc cattccccaa 900

gttatggcca ttgcaacctt ggctttggta ttcaacaacc gtgaagtgct acatggcaat 960

gtaaagattc gtaagggtac tacctgctat ttaattttga aatcaaggac tttgcgtggc 1020

tgtgtcgaga tttttgacta ttacttacgt gatatcaaat ctaaattggc tgtgcaagat 1080

ccaaatttct taaaattgaa cattcaaatc tccaagatcg aacagtttat ggaagaaatg 1140

taccaggata aattacctcc taacgtgaag ccaaatgaaa ctccaatttt cttgaaagtt 1200

aaagaaagat ccagatacga tgatgaattg gttccaaccc aacaagaaga agagtacaag 1260

ttcaatatgg ttttatctat catcttgtcc gttcttcttg ggttttatta tatatacact 1320

ttacacagag cgtga 1335

<210> 5

<211> 459

<212> DNA

<213> 酿酒酵母 pCUP1

<400> 5

cgatcccatt accgacattt gggcgctata cgtgcatatg ttcatgtatg tatctgtatt 60

taaaacactt ttgtattatt tttcctcata tatgtgtata ggtttatacg gatgatttaa 120

ttattacttc accacccttt atttcaggct gatatcttag ccttgttact agttagaaaa 180

agacattttt gctgtcagtc actgtcaaga gattcttttg ctggcatttc ttctagaagc 240

aaaaagagcg atgcgtcttt tccgctgaac cgttccagca aaaaagacta ccaacgcaat 300

atggattgtc agaatcatat aaaagagaag caaataactc cttgtcttgt atcaattgca 360

ttataatatc ttcttgttag tgcaatatca tatagaagtc atcgaaatag atattaagaa 420

aaacaaactg tacaatcaat caatcaatca tcacataaa 459

<210> 6

<211> 461

<212> DNA

<213> 酿酒酵母 pERG1

<400> 6

gggaatcgtt ctgcaagctc ttctaccaaa ccatcggcga atttgcgtcg ctttaatgcg 60

atactgccgt agcgggcctt cgtatagctc ggccgagctc gtacaaaagg caagcagtgt 120

atcggacaga gctgatataa cacaatacgc tcgtagtcga tgcatgccgt ggctgctctc 180

ggtcgggtat aagtcttaga caatagtctt acctcgcatg tataataaat cttttgtatt 240

taatctatta tatgtttcta tgcttttttt tcctattgtt gtttgctttt ccttttcctt 300

atttctttct agcttctaat tttctttctt tttttttttt ttttcattga aaattatata 360

tatatatata tatcagaaca attgtccagt attgaacaat acaggttatt tcgaacaatt 420

gaaaaaaaaa aatcacagaa aaacatatcg agaaaagggt c 461

<210> 7

<211> 273

<212> DNA

<213> 酿酒酵母 tCYC1

<400> 7

gcaaattaaa gccttcgagc gtcccaaaac cttctcaagc aaggttttca gtataatgtt 60

acatgcgtac acgcgtttgt acagaaaaaa aagaaaaatt tgaaatataa ataacgttct 120

taatactaac ataactataa aaaaataaat agggacctag acttcaggtt gtctaactcc 180

ttccttttcg gttagagcgg atgtgggggg agggcgtgaa tgtaagcgtg acataactaa 240

ttacatgata tcgacaaagg aaaaggggcc tgt 273

<210> 8

<211> 149

<212> DNA

<213> 酿酒酵母 tERG20

<400> 8

aactaacgct aatcgataaa acattagatt tcaaactaga taaggaccat gtataagaac 60

tatatacttc caatataata tagtataagc tttaagatag tatctctcga tctaccgttc 120

cacgtgacta gtccaaggat tttttttaa 149

Claims (10)

1.一种高产角鲨烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、构建酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块：过表达tHMG1模块，包括诱导型双向强启动子pGAL1-10和MVA途径限速酶编码基因tHMG1，所述pGAL1-10的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，所述tHMG1的核苷酸序列如SEQ NO.2所示；

S2、构建角鲨烯生产相关基因表达模块：ERG20-Linker-ERG9模块，包括FPP合酶的编码基因ERG20和酿酒酵母内源性角鲨烯合酶的编码基因ERG9，所述ERG20的核苷酸序列如SEQNO.3所示，所述ERG9的核苷酸序列如SEQ NO.4所示；

S3、构建敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的工程菌：将步骤S1所述酿酒酵母MVA途径相关基因表达模块和步骤S2所述角鲨烯生产相关基因表达模块整合至半乳糖调节蛋白GAL80基因位点，同时敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因，得到敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块，将所述敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块转化至构建的酿酒酵母基因工程菌GS-A3中，获得敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的基因工程菌；

S4、构建角鲨烯单加氧酶途径下调表达质粒，包括将铜离子诱导启动子pCUP1替换为角鲨烯单加氧酶ERG1启动子，所述pCUP1的核苷酸序列如SEQ NO.5所示；所述角鲨烯单加氧酶ERG1启动子取至ERG1基因起始密码子前461bp，其核苷酸序列如SEQ NO.6所示；

S5、将步骤S4所述角鲨单加氧酶途径下调表达质粒转化至步骤S3所述的敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的基因工程菌中，依次经抗生素抗性筛选，然后通过菌落PCR验证，获得高产角鲨烯基因工程菌；

所述构建方法还包括两个终止子tCYC1和tERG20，所述终止子tCYC1的核苷酸序列如SEQ NO.7所示，所述终止子tERG20的核苷酸序列如SEQ NO.8所示。

2.如权利要求1所述的一种高产角鲨烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤S1中，所述过表达tHMG1模块的构建方法包括以下步骤：

S1、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用tCYC1-F和tCYC1-R、tHMG1-F和tHMG1-R、pGAL1pGAL10-F和pGAL1pGAL10-R引物进行PCR反应，获得DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1；

S2、将步骤S1获得的三个DNA片段tCYC1、tHMG1和pGAL10pGAL1，通过用引物tCYC1-F和pGAL1pGAL10-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得过表达tHMG1模块，即tCYC1_tHMG1_pGAL10pGAL1模块。

3.如权利要求1所述的一种高产角鲨烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤S2中，所述ERG20-Linker-ERG9模块的构建方法包括以下步骤：

S1、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用ERG20-F和ERG20-Linker-S-R引物进行PCR反应，扩增得到DNA片段ERG20_Linker；

S2、用引物Linker-ERG9-F和ERG9-R进行PCR反应，扩增得到DNA片段Linker_ERG9；

S3、用引物tERG20-S-F和tERG20-R进行PCR反应，扩增得到DNA片段tERG20；

S4、将步骤S1获得的DNA片段ERG20_Linker、步骤S2获得的DNA片段Linker_ERG9和步骤S3获得的DNA片段tERG20，通过用引物ERG20-F和tERG20-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得融合表达ERG20-Linker-ERG9模块，即ERG20_Linker_ERG9_tERG20。

4.如权利要求3所述的一种高产角鲨烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述Linker包括甘氨酸和丝氨酸，其组合结构包括GSG、GGGS和GSGGSG中的任一种，其中G对应核酸序列GGT，S对应核酸序列TCT。

5.如权利要求4所述的一种高产角鲨烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤S2中，所述ERG20-Linker-ERG9模块中的Linker为GSG。

6.如权利要求1所述的一种高产角鲨烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤S3中，所述构建敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块的构建方法包括以下步骤：

S1、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用GAL80left-F和GAL80left-R、GAL80right-F和GAL80right-R引物进行PCR反应，扩增得到DNA片段GAL80的左右同源臂GAL80left和GAL80right；

S2、以质粒载体pFZ201为模板，用引物Hyg-F和Hyg-R进行PCR反应，获得潮霉素表达盒Hyg；

S3、将所述过表达tHMG1模块和所述ERG20-Linker-ERG9模块、GAL80left，GAL80right和Hyg五个DNA片段，通过用引物GAL80left-F和GAL80right-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段为敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达模块的；

S4、将步骤S3获得的DNA片段与质粒pMD19-T连接，获得重组质粒载体，用限制性内切酶PmeI线性化所述重组质粒，回收带有目的基因的片段，将片段用酵母醋酸锂转化法转化至宿主菌酿酒酵母中，依次经抗生素抗性筛选，然后通过菌落PCR获取阳性菌落，获得敲除半乳糖调节蛋白GAL80基因表达的工程菌。

7.如权利要求6所述的一种高产角鲨烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤S3中，所述宿主菌酿酒酵母包括酿酒酵母30000B、酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1D、酿酒酵母BY4741和酿酒酵母GS-A3中的任一种，所述酿酒酵母GS-A3于2021年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M20211191。

8.如权利要求1所述的一种高产角鲨烯基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤S4中，所述角鲨烯单加氧酶途径下调表达质粒的构建方法包括以下步骤：

S1、以酿酒酵母3000B基因组DNA为模板，分别用pERG1-left-F和

pERG1-left-R、pCUP1-S-F和pCUP1-S-R、pERG1-right-F和pERG1-right-R引物进行PCR反应，扩增得到DNA片段pERG1-left、pCUP1和pERG1-righ；

S2、以质粒载体pFZ202为模板，用引物G418-F和G418-R进行PCR反应，获得G418表达盒G418；

S3、将步骤S1获得的DNA片段pERG1-left、pCUP1和pERG1-righ和步骤S1获得的表达盒G418四个DNA片段，通过用引物pERG1-left-F和pERG1-right-R进行重叠延伸PCR反应，连接在一起，获得DNA片段G418_pCUP1/ΔpEGR1；

S4、将步骤S3获得的DNA片段G418_pCUP1/ΔpEGR9与质粒pMD19-T连接，获得角鲨烯单加氧酶途径下调表达质粒载体，记为pSZ101。

9.一种高产角鲨烯基因工程菌，其特征在于：采用如权利要求1-8任一项所述的构建方法得到的。

10.一种如权利要求9所述的高产角鲨烯基因工程菌的应用，其特征在于：.利用所述的基因工程菌发酵生产角鲨烯，所述高产角鲨烯基因工程菌的液体发酵培养基组分包括葡萄糖20-50g/L，酵母提取物5-10g/L，硫酸铵6-15g/L，磷酸二氢钾3-8g/L，七水硫酸镁5-10g/L，硫胺素100-500mg/L，吡哆素100-500mg/L，肌醇400-800mg/L，生物素20-100mg/L和泛酸钙100-500mg/L。

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