CN114806914B - 一种高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母菌及其应用 - Google Patents

一种高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产β‑胡萝卜素的解脂耶氏酵母菌及其应用。所述重组菌株是在初始菌株po1f基因组插入香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素脱氢酶、八氢番茄红素合成酶/八氢番茄红素环化酶、3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶、乙酰辅酶A羧化酶构建得到菌株解脂耶氏酵母Yli‑CAH后，再次插入crtE、crtI、crtYB、柠檬酸裂解酶（ACL）或者tHMGR中至少一种表达盒后得到的。本发明重组解脂耶氏酵母的构建方法，操作简单、高效，可以解除MVA途径的限速步骤，使更多的乙酰CoA转通量流向β‑胡萝卜素的合成，通过过表达柠檬酸裂解酶编码基因，能够提高细胞生长，有利于工业化利用。

Description

一种高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及生产β-胡萝卜素的重组解脂耶氏酵母表达宿主菌的构建和应用。
背景技术
β-胡萝卜素主要通过有机溶剂浸提法、超声波辅助提取法等方法从植物、藻类等天然原料中提取；但由于植物中的β-胡萝卜素含量低，存在投料多、耗时长、步骤繁琐等缺点，不能满足市场的需求。目前，化学合成是大规模生产β-胡萝卜素的方法之一，以紫罗兰酮为原料，经过一系列复杂的化学反应，通过wittig反应生成β-胡萝卜素。但由于存在多种异构体、对人体代谢有一定的负担，因此在其用途上存在很多争议。而微生物生长周期短，可以利用糖类等原料在短时间内实现大量生产，并且生物体内的酶催化可以获得单一构型的物质，相对于植物提取法和化学合成法而言，是一种经济高效的天然产物合成方式。
3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶能催化HMG-CoA合成甲羟戊酸，增加β-胡萝卜素前体异戊二烯的积累，柠檬酸裂解酶能催化宁柠檬酸裂解成乙酰CoA和草酰乙酸，为β-胡萝卜素的生产提供前体，而通过增加香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素脱氢酶、八氢番茄红素合成酶/八氢番茄红素环化酶三种基因的拷贝数，将更多的代谢通量拉向下游β-胡萝卜素的合成，进一步提高其产量。
解脂耶氏酵母是一种非常规酵母，与其他微生物相比，解脂耶氏酵母安全、无毒，可作为底盘菌株经过代谢工程改造合成油脂类化合物和多种功能营养化学品。因此，我们利用解脂耶氏酵母来生产β-胡萝卜素。但是由于解脂耶氏酵母中并不含有β-胡萝卜素合成途径，所以我们将β-胡萝卜素合成模块引入解脂耶氏酵母中。鉴于解脂耶氏酵母中已含有MVA途径，因此仅需要将与β-胡萝卜素合成有关的酶引入，即可构建完整的代谢途径。
目前，现有的研究主要是过量表达代谢途径中的相关基因，这阻碍了细胞的正常生长，不利于菌株的工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组解脂耶氏酵母，通过对ACL的过表达，能够提高细胞生长，对后期的放大实验具有有利影响，为大规模发酵奠定基础。
本发明的再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母的构建方法，该方法便捷高效、操作简便，在异源引入3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶和香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素脱氢酶、八氢番茄红素合成酶/八氢番茄红素环化酶和乙酰CoA羧化酶的解脂耶氏酵母Yli-CAH的基础上增加3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶和香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素脱氢酶、八氢番茄红素合成酶/八氢番茄红素环化酶的拷贝数并引入柠檬酸裂解酶，进一步提高解脂耶氏酵母中β-胡萝卜素的产量，同时为β-胡萝卜素的工业化生产奠定基础。
本发明的再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母在生产β-胡萝卜素中的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
将初始菌株po1f基因组插入香叶基香叶基二磷酸合酶(CrtE)、八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)、八氢番茄红素合成酶/八氢番茄红素环化酶(CrtYB)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(tHMGR)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)构建得到菌株解脂耶氏酵母Yli-CAH(构建方法参见专利：202210480414.3)。
在本发明中，重组菌Yli-II是将含有crtI-crtYB-crtE基因表达盒的质粒113-TEF-GPD-crtIEYB导入解脂耶氏酵母Yli-CAH中，crtI-crtYB-crtE表达盒整合到基因组NotI位点处，得到重组菌Yli-II。
重组菌Yli-III是将含有tHMGR与hph基因表达盒的质粒113-TEF-GPD-hph-2tHMGR导入重组菌Yli-II中，含有tHMGR与hph基因表达盒的线性质粒113-TEF-GPD-hph-2tHMGR整合到基因组Not I位点处，得到重组菌Yli-III。
重组菌Yli-IV是将含有ACL与hph基因表达盒的质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR-ACL导入重组菌Yli-III中，含有ACL与hph基因表达盒的线性质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR-ACL整合到基因组Not I位点处，得到重组菌Yli-IV。
重组解脂耶氏酵母Yli-IV株是在已插入香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素脱氢酶、八氢番茄红素合成酶/八氢番茄红素环化酶、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶、乙酰CoA羧化酶的解脂耶氏酵母Yli-CAH的基因组中插入了3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶和香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素脱氢酶、八氢番茄红素合成酶/八氢番茄红素环化酶、柠檬酸裂解酶表达盒后得到的。
在本发明中，所述香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素去饱和酶编码基因来源于红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)，柠檬酸裂解酶来源于毛孢子菌(Trichosporon porosum)，其编码基因经密码子优化后适合在解脂耶氏酵母中表达，3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶编码基因来源于解脂耶氏酵母。
在本发明中，所述重组解脂耶氏酵母是在已插入crtE、crtI、crtYB、tHMGR、acc1的解脂耶氏酵母Yli-CAH基因组中插入香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素脱氢酶、八氢番茄红素合成酶/八氢番茄红素环化酶、柠檬酸裂解酶、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶中的至少一种的表达盒后所得。
在本发明中，所述香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素脱氢酶、八氢番茄红素合成酶/八氢番茄红素环化酶、柠檬酸裂解酶、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶表达盒的启动子为解脂耶氏酵母的TEF-in启动子或GPD启动子；所述终止子为解脂耶氏酵母的cyc1终止子或XPR2终止子。
在本发明中，所述重组解脂耶氏酵母还表达1个或多个标记基因；所述标记基因选自质粒PAN7-1的潮霉素编码基因表达盒。
在本发明中，所述香叶基香叶基二磷酸合酶的编码基因如SEQ ID No：1所示；所述八氢番茄红素合酶的编码基因序列如SEQ ID No：2所示；所述八氢番茄红素脱氢酶的编码基因如SEQ ID No：3所示。所述3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶编码基因序列如SEQ IDNo：4所示。所述柠檬酸裂解酶编码基因序列如SEQ ID No：5所示。
本发明中，大写的CrtE代表酶，小写斜体crtE代表编码这个酶的基因；香叶基香叶基二磷酸合酶编码基因(crtE)、八氢番茄红素脱氢酶编码基因(crtI)、八氢番茄红素合成酶/八氢番茄红素环化酶编码基因(crtYB)、柠檬酸裂解酶(ACL)、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶编码基因(tHMGR)。
本发明还提供所述重组解脂耶氏酵母菌株的构建方法，包括将所述香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、柠檬酸裂解酶和3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶表达盒通过质粒形式导入所述解脂耶氏酵母菌株，然后整合在解脂耶氏酵母菌株基因组上的步骤。
质粒113-TEF-GPD-crtIEYB结构如图1所示：crtI启动子为TEF-in，终止子为CYC1；crtYB的启动子为GPD启动子，终止子为XPR2；crtE的启动子为GPD，终止子为XPR2，该质粒携带的URA3基因用作解脂耶氏酵母的筛选标记；
质粒113-TEF-GPD-crtYB结构如图2所示：crtYB的启动子为GPD启动子，终止子为XPR2，该质粒克隆时携带的URA3用于菌落筛选；
质粒113-TEF-GPD-hph结构如图3所示：hph基因来自于质粒PAN7-1，启动子为GPD，终止子为XPR2，该质粒克隆时携带的AmpR用于菌落筛选；
质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR结构如图4所示：hph基因启动子为GPD，终止子为XPR2；tHMGR的启动子为TEF-in，终止子为cyc1，该质粒hph基因用作解脂耶氏酵母的筛选标记；
质粒113-TEF-GPD-hph-crtIEYB结构如图5所示：crtI启动子为GPD，终止子为XPR2；crtYB的启动子为TEF1启动子，终止子为cyc1；crtE的启动子为TEF-in，终止子为cyc1，该质粒携带的URA3基因用作解脂耶氏酵母的筛选标记，hph基因来自于质粒PAN7-1，启动子为GPD，终止子为XPR2，该质粒hph基因用作解脂耶氏酵母的筛选标记；
质粒113-TEF-GPD-hph-2tHMGR结构如图6所示：hph基因启动子为GPD，终止子为XPR2；tHMGR的启动子为TEF-in，终止子为cyc1，该质粒hph基因用作解脂耶氏酵母的筛选标记；
质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR-ACL结构如图7所示：hph基因启动子为GPD，终止子为XPR2；tHMGR的启动子为TEF-in，终止子为cyc1，ACL基因启动子为TEF-in，终止子为cyc1，该质粒hph基因用作解脂耶氏酵母的筛选标记。
构建含有crtI、crtYB、crtE基因表达盒的质粒113-TEF-GPD-crtIEYB，导入解脂耶氏酵母Yli-CAH中，crtI-crtYB-crtE表达盒整合到基因组Not I位点处，得到重组菌Yli- II；
构建含有tHMGR与hph基因表达盒的质粒113-TEF-GPD-hph-2tHMGR，导入重组菌Yli-II中，含有tHMGR与hph基因表达盒的线性质粒113-TEF-GPD-hph-2tHMGR整合到基因组Not I位点处，得到重组菌Yli-III；
构建含有ACL与hph基因表达盒的质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR-ACL，导入重组菌Yli-III中，含有ACL与hph基因表达盒的线性质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR-ACL整合到基因组Not I位点处，得到重组菌Yli-IV。
本发明还提供所述的解脂耶氏酵母菌株在生产β-胡萝卜素中的应用，在营养培养基上培养重组解脂耶氏酵母菌株，得到发酵产物，对发酵产物进行分离纯化，得到β-胡萝卜素。
所述发酵可以是小规模发酵也可以是大规模发酵或者高密度发酵等。
例如一个实施例中，在摇瓶发酵，包括如下步骤：
(1)种子液培养：按1％接种量从冻存管中取所述重组菌液接种于YPD试管中30℃，200r培养24小时作为一级种子液；所述的YPD培养基含有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖；
(2)发酵培养:取1％的一级种子液接种于50ml YPD摇瓶中同样温度条件下进行发酵，发酵周期为7天。而且每24h对菌液取样，记录各参数、镜检验证并保存发酵产物；
(3)丙酮和二甲基亚砜萃取所述发酵产物，得到β-胡萝卜素，其产量达到120 mg/L。
进一步优选地，所述培养基中添加有柠檬酸钠，添加浓度为2～10g/L，优选柠檬酸钠添加浓度为5g/L。
例如一个实施例中，在5L发酵罐中采用分批补料发酵，β-胡萝卜素产量提高到了2695.5 mg/L
本发明构建的重组菌增强了产物合成的代谢通量，增加了菌株的生物量，可以应用于更大的发酵体系，且其产量会进一步提高。
本发明的重组解脂耶氏酵母是基于能够过表达香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素去饱和酶、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶和乙酰CoA羧化酶的解脂耶氏酵母Yli-CAH菌株，向其中导入多拷贝的香叶基香叶基二磷酸合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素去饱和酶、柠檬酸裂解酶和3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶，实现了天然产物β-胡萝卜素在解脂耶氏酵母中的大量合成。
有益效果：本发明的重组解脂耶氏酵母具有以下优点：重组解脂耶氏酵母通过过表达3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶编码基因，可以解除MVA途径的限速步骤，使更多的乙酰CoA转通量流向β-胡萝卜素的合成。通过过表达柠檬酸裂解酶编码基因，能够提高细胞生长，对后期放大实验有利。通过过表达香叶基香叶基二磷酸合酶编码基因、八氢番茄红素合酶编码基因和八氢番茄红素去饱和酶编码基因，将乙酰CoA更多的拉向β-胡萝卜素的合成，实现了β-胡萝卜素的高效合成。
附图说明
图1为质粒113-TEF-GPD-crtIEYB结构图：crtI启动子为TEF-in，终止子为CYC1；crtYB的启动子为GPD启动子，终止子为XPR2；crtE的启动子为GPD，终止子为XPR2，该质粒携带的URA3基因用作解脂耶氏酵母的筛选标记；
图2为质粒113-TEF-GPD-crtYB结构图：crtYB的启动子为GPD启动子，终止子为XPR2，该质粒克隆时携带的URA3用于菌落筛选；
图3为质粒113-TEF-GPD-hph结构图：hph基因来自于质粒PAN7-1，启动子为GPD，终止子为XPR2，该质粒克隆时携带的AmpR用于菌落筛选；
图4为质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR结构图：hph基因启动子为GPD，终止子为XPR2；tHMGR的启动子为TEF-in，终止子为cyc1，该质粒hph基因用作解脂耶氏酵母的筛选标记；
图5为质粒113-TEF-GPD-hph-crtIEYB结构图：crtI启动子为GPD，终止子为XPR2；crtYB的启动子为TEF1启动子，终止子为cyc1；crtE的启动子为TEF-in，终止子为cyc1，该质粒携带的URA3基因用作解脂耶氏酵母的筛选标记，hph基因来自于质粒PAN7-1，启动子为GPD，终止子为XPR2，该质粒hph基因用作解脂耶氏酵母的筛选标记；
图6为质粒113-TEF-GPD-hph-2tHMGR结构图：hph基因启动子为GPD，终止子为XPR2；tHMGR的启动子为TEF-in，终止子为cyc1，该质粒hph基因用作解脂耶氏酵母的筛选标记；
图7为质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR-ACL结构图：hph基因启动子为GPD，终止子为XPR2；tHMGR的启动子为TEF-in，终止子为cyc1，ACL基因启动子为TEF-in，终止子为cyc1，该质粒hph基因用作解脂耶氏酵母的筛选标记；
图8为重组解脂耶氏酵母产β-胡萝卜素检测图。
实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、基因元件的扩增与目标质粒的制备
(一)目标基因的制备
根据NCBI上提供的来自Xanthophyllomyces denrorhous的香叶基香叶基二磷酸合酶编码基因crtE的核苷酸序列，八氢番茄红素合酶编码基因crtYB的核苷酸序列和八氢番茄红素去饱和酶编码基因crtI的核苷酸序列经过密码子优化后，委托通用生物系统(安徽)有限公司进行密码子优化并合成后，将各基因片段通过一步克隆方法插入质粒113-TEF-GPD(实验室保藏)中，得到质粒113-TEF-GPD-crtIEYB,质粒结构如图1所示。crtE、 crtYB、crtI的基因序列如SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3所示。
以PAN7-1质粒(实验室保藏)为模板，将hph进行PCR扩增，所得片段以一步克隆方法插入质粒113-TEF-GPD，得到质粒113-TEF-GPD-hph，质粒结构如图3所示。
PCR扩增条件：
根据NCBI上提供的来自解脂耶氏酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶编码基因序列，如SEQ ID No：4所示，以解脂耶氏酵母基因组为模板进行PCR扩增。将tHMGR以一步克隆方法插入质粒113-TEF-GPD-hph，得到113-TEF-GPD-hph-tHMGR质粒，质粒结构如图4所示。
(二)重组质粒的构建
重组质粒113-TEF-GPD-hph-crtIEYB和重组质粒113-TEF-GPD-hph-2tHMGR的构建是基于重组质粒113-TEF-GPD-crtIEYB、重组质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR的构建。
1、重组质粒113-TEF-GPD-hph-crtIEYB的构建
重组质粒的结构见表1和图5。
重组质粒113-TEF-GPD-hph-crtIEYB是以113-TEF-GPD-crtIEYB为骨架，将hph片段插入质粒113-TEF-GPD-crtIEYB的Sal I位点中。结构见图5。
目的基因纯化所用条件见表1。
表1
以hph-F和hph-R为引物，以实验室的PAN7-1质粒为模板，扩增hph片段，引物序列见表7。
扩增所使用的PCR酶为南京诺唯赞生物科技股份有限公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase。体系见表2。
表2
对扩增后的hph片段进行回收，琼脂糖凝胶电泳进行纯化和回收。
对质粒113-TEF-GPD-crtIEYB进行酶切，所使用限制性内切酶为Sma I，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化的Sma I位点整合质粒。
使用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MuLtiS One Step CloningKit进行一步克隆，反应体系见表3所示。
表3
其中，线性化载体(x)、插入片段(y)的使用量可由下面公式计算获得：
片段最适使用量(A)＝[0.04×片段碱基对数]ng/Y ng/uL。(Y为浓度)
载体最适使用量(B)＝[0.02×片段碱基对数]ng/X ng/uL。(X为浓度)
将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒113-TEF-GPD-hph-crtIEYB，质粒结构见表6和图5。
2、重组质粒113-TEF-GPD-hph-2tHMGR的构建
重组质粒的结构见表6和图6。
重组质粒113-TEF-GPD-hph-2tHMGR是以113-TEF-GPD-hph-tHMGR为骨架，将tHMGR片段插入质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR的Pme I位点。以2tHMGR-F和2tHMGR-R为引物，以解脂耶氏酵母基因组为模板，扩增tHMGR片段。
目的基因纯化所用条件见表4。
表4
扩增所使用的PCR酶为南京诺唯赞生物科技股份有限公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase。对片段tHMGR片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收。引物序列见表7。
对质粒113-TEF-GPD-hph-2tHMGR进行酶切，所使用限制性内切酶为Pme I，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化的Pme I位点整合质粒。
使用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MuLtiS One Step CloningKit进行一步克隆。将线性化载体113-TEF-GPD-hph-tHMGR与tHMGR片段连接，将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过卡纳抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒113-TEF-GPD-hph-2tHMGR，质粒结构见表6和图6。
.3、重组质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR-ACL的构建
重组质粒的结构见表6和图7。
重组质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR-ACL是以113-TEF-GPD-hph-tHMGR为骨架，将ACL段插入质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR的Pme I位点。以ACL-F和ACL-R为引物，以毛孢子菌基因组为模板，扩增ACL片段。
目的基因纯化所用条件如表5所示。
表5
扩增所使用的PCR酶为南京诺唯赞生物科技股份有限公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase。对片段ACL片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收。引物序列见表7。
对质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR-ACL进行酶切，所使用限制性内切酶为Pme I，琼脂糖凝胶电泳胶回收线性化的Pme I位点整合质粒。
使用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MuLtiS One Step CloningKit进行一步克隆。将线性化载体113-TEF-GPD-hph-tHMGR与ACL片段连接，将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过卡纳抗性平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR-ACL，质粒结构见表6和图7。
表6各重组质粒中插入序列
表7引物序列
实施例2、重组菌的构建
原始菌株Yli-CAH是基于常规解脂耶氏酵母po1f菌株，在解脂耶氏酵母po1f菌株基因组中插入了香叶基香叶基二磷酸合酶(CrtE)、八氢番茄红素合酶(CrtB)、八氢番茄红素去饱和酶(CrtI)、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(tHMGR)以及乙酰CoA羧化酶(ACC)表达盒后得到的；构建方法参见专利：202210480414.3。
(一)重组菌Yli-II的构建
将含有crtI-crtYB-crtE基因表达盒的质粒113-TEF-GPD-crtIEYB导入解脂耶氏酵母Yli-CAH中，crtI-crtYB-crtE表达盒整合到基因组Not I位点处，得到重组菌Yli-II。具体方法如下：
①原始解脂耶氏酵母Yli-CAH菌株于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态细胞。
②利用酵母转化试剂盒Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZYeast Transformation Kit II将113-TEF-GPD-crtIEYB导入解脂耶氏酵母感受态细胞，进行同源重组。
③采用筛选培养基SD-Leu筛选，3-4天长出单菌落，将PCR鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌Yli-II。其中筛选培养基基SD-Ura含有：葡萄糖20g/L，Tris乙磺酸2.26g/L，硫酸铵3g/L，微量元素1ml/L，100×盐溶液10ml/L，琼脂粉25g/L。
(二)重组菌Yli-III的构建
将含有tHMGR与hph基因表达盒的质粒113-TEF-GPD-hph-2tHMGR导入重组菌Yli- II中，含有tHMGR与hph基因表达盒的线性质粒113-TEF-GPD-hph-2tHMGR整合到基因组NotI位点处，得到重组菌Yli-III。具体方法如下：
①重组菌Yli-II于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态细胞。
②利用酵母转化试剂盒Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZYeast Transformation Kit II将113-TEF-GPD-hph-2tHMGR导入重组菌Yli-II感受态细胞，进行同源重组。
③采用潮霉素平板筛选，3-4天长出单菌落，将PCR鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌Yli-III。其中潮霉素筛选培养基含有：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L,千分之一的hph(50g/L)。
(三)重组菌Yli-IV的构建
将含有ACL与hph基因表达盒的质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR-ACL导入重组菌Yli- III中，含有ACL与hph基因表达盒的线性质粒113-TEF-GPD-hph-tHMGR-ACL整合到基因组Not I位点处，得到重组菌Yli-IV。具体方法如下：
.①重组菌Yli-III于YPD液体培养基(含有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖)中过夜培养后制备感受态细胞。
②利用酵母转化试剂盒Zymo Research Corporation的Zymogen Frozen EZYeast Transformation Kit II将113-TEF-GPD-hph-tHMGR-ACL导入重组菌Yli-III感受态细胞，进行同源重组。
③采用潮霉素平板筛选，3-4天长出单菌落，将PCR鉴定正确的阳性克隆，命名为重组菌Yli-IV。其中潮霉素筛选培养基含有：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L,千分之一的hph(50g/L)。
实施例3、重组菌在生产β-胡萝卜素中的应用
1、工程菌的培养
分别采用实施例2中出发菌株解脂耶氏酵母Yli-CAH、重组菌Yli-II、重组菌Yli- III、重组菌Yli-IV生产β-胡萝卜素。具体方法如下：保种管中取出菌株，以1％接种量接入YPD试管，30℃培养24h得到种子液；将种子液以1％的接种量接种于50ml发酵培养基中，在25℃、220rpm震荡培养7天。发酵24h时外源添加2mM的H2O2，每24h定时取样检测。
其中发酵培养基含有20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物和20g/L胰蛋白胨。
2、β-胡萝卜素的提取
(1)将混匀的发酵液取1ml，12000rpm离心3min(用纯水洗涤两次)。
(2)控干水分后重悬在1.5ml二甲基亚砜(DMSO)中(60℃预热)并在涡旋震荡仪上震荡均匀，后置于50℃水浴3min。
(3)加入1.5ml丙酮，在50℃下避光水浴10min。
(4)将样品以12000rpm离心3min。取上清液转移到新离心管中避光保存。
3、β-胡萝卜素的定量分析
使用高效液相色谱检测β-胡萝卜素的浓度。本研究使用的液相色谱型号为Agilent Technologies 1200Infinity series；色谱柱为：AcclaimTM 120 C18色谱柱；紫外吸收波长为450nm；流动相为甲醇、乙腈和二氯甲烷(42:42:16)；流速控制为1.0mL/min；柱温为30℃。
图8为重组菌β-胡萝卜素的HPLC检测图。发酵7天后，重组菌Yli-III的β-胡萝卜素产量最高，达到了117.5 mg/L，即每升发酵液产118mg的β-类胡萝卜素。
出发菌株解脂耶氏酵母Yli-CAH产量为87 mg/L，重组菌Yli-II、重组菌Yli-III、重组菌Yli-IV产量分别为95.3 mg/L、117.5 mg/L、120.3 mg/L。
实施例4、发酵条件优化重组菌Yli-IV高产β-胡萝卜素
将最终工程改造后的菌株Yli-IV在外源添加柠檬酸钠的YPD培养基中进行混合底物发酵，发酵温度为25℃。培养基中的柠檬酸钠能够增加细胞内的乙酰-CoA的积累。进行共底物发酵时菌株Yli-IV的β-胡萝卜素产量达到123.3 mg/L，相较于单一YPD发酵时候产量提高了2.5％。柠檬酸钠添加浓度为2～10g/L，更佳的添加浓度为5g/L，能大幅增加菌株的生物量，有利于大规模生产。β-胡萝卜素的产量有一定的增加，其原因是在培养基体系中外源添加柠檬酸钠，柠檬酸盐分解后的柠檬酸被细胞中的柠檬酸裂合酶(ACL)催化生成草酰乙酸和乙酰-CoA，后者为目标产物合成增加前体库，加强了细胞的TCA循环，增强了细胞呼吸作用，促进了细胞生长，有利于细胞的高密度发酵，对后期产物合成产生有利影响，也为后续的发酵罐扩大实验提供了基础。
重组菌株Yli-IV发酵生产β-胡萝卜素
①种子液培养：
a.一级种子液：按1％接种量从冻存管中取所述重组菌株Yli-IV菌液接种于YPD试管中30℃，200r下培养24小时作为一级种子液；所述的YPD培养基含有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖；
b.二级种子液：取一级种子液按10％接种量接种于新的种子培养基，和a同样条件下恒温培养，得到用于发酵培养的种子液。
②分批补料发酵
种子培养得到的种子液接种至装有发酵培养基的5L发酵罐中，重组菌株Yli-IV在5L的发酵罐中进行分批补料发酵，发酵温度25℃±1℃，600r，pH值维持在5.6。发酵罐中初始葡萄糖浓度为30g/L，发酵第二天起每天补充葡萄糖至浓度为30g/L，培养七天，测定细胞干重，提取发酵液中β-胡萝卜素，测定β-胡萝卜素含量。在发酵第48h待菌体生长稳定后在发酵罐添加2mM的H2O2进行氧化胁迫，菌液在第60h时OD600达到最高164.4。通过分批补料发酵，将β-胡萝卜素产量提高到了2695.5 mg/L，细胞内β-胡萝卜素的含量为51.34 mg/gDCW，比原始菌株Yli-CAH生物量提高了363.1％，产量提高了35.1％。
本专利强化了解脂耶氏酵母MVA途径，并添加了外源β-胡萝卜素合成模块。对Yli- IV菌株进行发酵优化，加入柠檬酸钠并过表达ACL，增强了产物合成的代谢通量，增加了菌株的生物量。通过发酵罐进行分批补料发酵，对菌株的生产能力进行评估，通过对5L发酵罐中OD600及β-胡萝卜素产量的监测，在更大体积的发酵罐中β-胡萝卜素的产量有望进一步提升，为后续工业化生产奠定基础。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母菌及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1755
<212> DNA
<213> 香叶基香叶基二磷酸合酶(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
atgggcaaag agaaggacca agacaagcca actgctatca tcgttggttg tggtattggt 60
ggtatcgcta ctgctgctag attggccaaa gagggtttcc aggttaccgt gttcgaaaag 120
aacgactact ccggtggtag atgctccttg attgagagag atggttacag attcgaccag 180
ggtccatcct tgttgttgtt gccagacttg ttcaagcaga ccttcgagga cttgggtgag 240
aagatggaag attgggttga cctgatcaag tgcgagccaa actacgtttg tcacttccac 300
gacgaagaga ctttcacttt gtccactgac atggccttgc tgaagagaga ggtcgaaaga 360
ttcgaaggta aggacggttt cgacagattc ctgtccttca ttcaagaggc ccacagacac 420
tacgagttgg ctgttgttca tgtcctgcag aagaacttcc caggtttcgc tgctttcttg 480
agactgcagt tcatcggtca gattttggct ctgcacccat tcgagtccat ttggactaga 540
gtctgcagat acttcaagac cgacagactg agaagagtgt tctccttcgc cgttatgtac 600
atgggtcaat ctccatactc tgccccaggt acttactcct tgttgcagta cactgagctg 660
accgaaggta tctggtatcc aagaggtggt ttctggcagg ttccaaacac tttgttgcag 720
atcgtcaaga gaaacaaccc atccgccaag ttcaacttca acgctccagt ttctcaggtc 780
ttgttgtctc cagctaagga cagagctacc ggtgttagat tggaatctgg tgaagaacac 840
cacgccgacg ttgttatcgt taacgctgat ttggtttacg cctccgagca cttgattcca 900
gatgacgcta gaaacaagat cggtcagttg ggtgaagtca agagatcttg gtgggctgac 960
ttggttggtg gtaagaagtt gaagggttcc tgttcctcct tgtccttcta ctggtctatg 1020
gacagaatcg tcgatggtct tggtggtcac aacattttct tggccgagga cttcaagggt 1080
tctttcgaca ctatcttcga ggaactgggt ttgccagctg acccatcttt ttacgtcaac 1140
gtcccatcca gaatcgaccc atctgctgca cctgaaggta aagacgccat cgttattttg 1200
gttccatgcg gtcacatcga cgcttctaac ccacaagact acaacaagtt ggttgccaga 1260
gccagaaagt tcgtcatcca aactttgtcc gctaagttgg gtctgcctga cttcgagaag 1320
atgatcgttg ctgaaaaggt tcacgacgct ccatcttggg agaaagagtt taacctgaag 1380
gacggctcca ttttgggtct tgctcacaac ttcatgcagg tcttgggttt cagaccatcc 1440
actagacacc caaagtacga caagttgttc ttcgttggtg cctctactca tccaggtact 1500
ggtgttccaa tcgttttggc tggtgctaag ttgactgcca accaggtttt ggaatccttc 1560
gatagatctc cagctccaga tccaaacatg tccttgtctg ttccatacgg taagccactg 1620
aagtccaacg gtactggtat tgactcccag gtccagttga agttcatgga cttggagaga 1680
tgggtctact tgttggtctt gctgatcggt gctgttatcg ctagatccgt tggtgttttg 1740
gccttctaag aattc 1755
<210> 2
<211> 1131
<212> DNA
<213> 八氢番茄红素合酶(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
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gttttgttgg agccatacca ctacttgggt aagaacccag gtaaagagat cagatcccag 120
ttgatcgagg ccttcaacta ctggttggac gtcaagaaag aggacttgga ggttatccag 180
aacgtcgtcg gtatgttgca tactgcttct ctgttgatgg acgacgttga ggactcttcc 240
gttttgagaa gaggttctcc agtcgctcac ctgatctacg gtattccaca gactatcaac 300
accgccaact acgtctactt cttggcctac caagagatct tcaagctgag gccaactcca 360
attccaatgc cagttattcc accatcctct gcttccctgc aatcttctgt ttctagtgct 420
tcttcctctt cttccgcctc ctctgaaaac ggtggtactt ctactccaaa ctcacagatc 480
ccattctcca aggacaccta cttggacaag gttatcaccg acgagatgtt gtccttgcac 540
agaggtcaag gtttggagct gttttggaga gactccttga cttgtccatc cgaagaggaa 600
tacgtgaaga tggttctggg taagaccggt ggtttgttca gaatcgccgt cagattgatg 660
atggccaagt ccgaatgtga catcgacttc gttcagctgg tcaacctgat ctccatctac 720
ttccagatca gggacgacta tatgaacttg cagtcctctg agtacgccca caacaagaac 780
ttcgctgagg atttgactga gggcaagttc tctttcccaa ccattcactc cattcacgct 840
aacccatcct ccagattggt catcaacacc ttgcagaaga agtccacctc tccagaaatc 900
ttgcaccact gcgtcaacta catgagaact gagactcact ccttcgagta cacccaagag 960
gttttgaaca ctttgtccgg tgccttggaa agagagttgg gtagattgca aggtgagttc 1020
gctgaagcta actccaagat tgacttgggt gacgttgaat ccgagggtag aactggtaag 1080
aacgttaagt tggaggccat cttgaagaag ttggctgaca tcccactgta a 1131
<210> 3
<211> 2022
<212> DNA
<213> 八氢番茄红素脱氢酶(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
atgactgctt tggcctacta ccagatccac ttgatctaca ccttgccaat cttgggtttg 60
ttgggtctgt tgacttcccc aatcttgacc aagttcgaca tctacaagat ctccatcctg 120
gtgttcattg ctttctccgc tactactcca tgggactctt ggatcattag aaacggtgct 180
tggacttacc catctgctga atctggtcaa ggtgtgttcg gtactttctt ggacgttcca 240
tacgaagagt acgctttctt cgttatccag accgtcatca ccggtttggt ttacgttttg 300
gctaccagac acttgttgcc atccttggct ttgccaaaga ctagatcttc cgctttgtcc 360
ttggccttga aggctttgat tccactgcca atcatctacc tgttcactgc tcatccatct 420
ccatcaccag atcctttggt taccgaccac tacttctaca tgagagcctt gtccttgttg 480
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tccggtagag ctaagtctac tatcgctgcc atcatgatcc caaccgtcta cttgatttgg 600
gttgactacg ttgctgttgg tcaggactcc tggtctatta acgacgagaa gatcgtcggt 660
tggagacttg gtggtgtttt gccaattgaa gaggctatgt tcttcctgct gaccaacttg 720
atgatcgtct tgggattgtc tgcctgtgac catactcaag ccttgtactt gctgcacggt 780
agaaccatct acggtaacaa gaagatgcca tcctcctttc cactgatcac tccacctgtg 840
ttgtccctgt tcttcagttc tagaccttac tcttcccagc caaagagaga cttggagttg 900
gccgttaagt tgctggaaga aaagtccagg tccttcttcg ttgcttctgc tggtttccca 960
tctgaggtca gagaaagatt ggttggtctg tacgccttct gtagagttac cgacgacttg 1020
attgactccc cagaggtttc ttctaaccca cacgctacta tcgacatggt gtccgatttc 1080
ttgaccttgt tgttcggtcc accattgcac ccatctcagc cagataagat tttgtcctct 1140
ccactgttgc caccatctca cccttctaga ccaactggta tgtacccatt gccaccacca 1200
ccatctttgt ctccagctga gttggttcag ttcctgactg agagagttcc agtccaatac 1260
cacttcgcct ttagattgct ggctaagttg cagggtctga tcccaagata cccattggac 1320
gagttgttga gaggttacac caccgacttg atcttcccat tgtctactga ggctgttcag 1380
gctagaaaga ccccaattga aactaccgct gacttgttgg actacggttt gtgtgttgct 1440
ggttccgttg ctgagttgtt ggtgtacgtt tcttgggctt ctgctccatc tcaagttcca 1500
gctaccattg aagagagaga ggctgttttg gttgcctcca gagaaatggg tactgccttg 1560
cagttggtca acattgccag agacattaag ggtgacgcta ccgagggtag attctacttg 1620
ccattgtcat tcttcggtct gagggacgaa tccaagttgg ctattccaac tgattggacc 1680
gagccaagac cacaagattt cgacaagttg ttgtctctgt ccccatcctc tactttgcca 1740
tcttctaacg cttccgagtc cttcagattc gagtggaaaa cttactcctt gccactggtt 1800
gcttacgctg aggatttggc taagcactcc tacaagggta tcgacagatt gccaactgag 1860
gttcaggctg gtatgagagc tgcttgtgct tcctacttgc tgatcggaag agagatcaag 1920
gttgtttgga agggtgatgt cggtgagaga agaactgttg caggttggag aagagtcaga 1980
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<210> 4
<211> 1503
<212> DNA
<213> 3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 4
atgacccagt ctgtgaaggt ggttgagaag cacgttccta tcgtcattga gaagcccagc 60
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aagcccgtga ccgagacccg ttctctggac gacctagagg ctatcatgaa ggcaggtaag 180
accaagcttc tggaggacca cgaggttgtc aagctctctc tcgagggcaa gcttcctttg 240
tatgctcttg agaagcagct tggtgacaac acccgagctg ttggcatccg acgatctatc 300
atctcccagc agtctaatac caagacttta gagacctcaa agcttcctta cctgcactac 360
gactacgacc gtgtttttgg agcctgttgc gagaacgtta ttggttacat gcctctcccc 420
gttggtgttg ctggccccat gaacattgat ggcaagaact accacattcc tatggccacc 480
actgagggtt gtcttgttgc ctcaaccatg cgaggttgca aggccatcaa cgccggtggc 540
ggtgttacca ctgtgcttac tcaggacggt atgacacgag gtccttgtgt ttccttcccc 600
tctctcaagc gggctggagc cgctaagatc tggcttgatt ccgaggaggg tctcaagtcc 660
atgcgaaagg ccttcaactc cacctctcga tttgctcgtc tccagtctct tcactctacc 720
cttgctggta acctgctgtt tattcgattc cgaaccacca ctggtgatgc catgggcatg 780
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cctgatatgg acattgtgtc tgtctcgggt aactactgca ctgacaagaa gcccgcagcg 900
atcaactgga tcgaaggccg aggcaagagt gttgttgccg aagccaccat ccctgctcac 960
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aatctgatcg gtagtgccat ggctggctct gtgggaggtt tcaatgcaca cgccgcaaac 1080
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Claims (5)

1.一种重组解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株在生产β-胡萝卜素中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）采用YPD培养基培养所述重组解脂耶氏酵母菌株，得到发酵产物；
（2）丙酮和二甲基亚砜萃取所述发酵产物，得到β-胡萝卜素；
所述重组解脂耶氏酵母菌株，是在初始菌株po1f基因组插入香叶基香叶基二磷酸合酶基因(crtE)、八氢番茄红素合成酶/八氢番茄红素环化酶基因(crtYB)、八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(tHMGR)、乙酰辅酶A羧化酶基因(ACC1)表达盒构建得到菌株解脂耶氏酵母Yli-CAH后，再次在基因组中插入crtE、crtYB、crtI、tHMGR和柠檬酸裂解酶基因(ACL)表达盒得到的；
所述crtE、crtYB、crtI来源于红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)；tHMGR来源于解脂耶氏酵母；ACL来源于毛孢子菌(Trichosporon porosum)，经密码子优化后适合在解脂耶氏酵母中表达，序列如SEQ ID No：5所示；
所述YPD培养基中添加有柠檬酸钠，添加浓度为2～10 g/L；
发酵中，在菌体生长稳定后，在发酵罐添加2mM的H2O2进行氧化胁迫。
2.根据权利要求1所述的重组解脂耶氏酵母菌株在生产β-胡萝卜素中的应用，其特征在于，crtE序列如SEQ ID No：1所示、crtYB序列如SEQ ID No：2所示、crtI序列如SEQ IDNo：3所示。
3.根据权利要求1所述的重组解脂耶氏酵母菌株在生产β-胡萝卜素中的应用，其特征在于，tHMGR序列如SEQ ID No：4所示。
4.根据权利要求1所述的重组解脂耶氏酵母菌株在生产β-胡萝卜素中的应用，其特征在于，所述表达盒的启动子为解脂耶氏酵母的TEF-in启动子、TEF1启动子或GPD启动子；终止子为解脂耶氏酵母的cyc1终止子或XPR2终止子。
5.根据权利要求1所述的重组解脂耶氏酵母菌株在生产β-胡萝卜素中的应用，其特征在于，所述重组解脂耶氏酵母还表达1个或多个标记基因；所述标记基因选自质粒PAN7-1的潮霉素编码基因表达盒。
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解脂耶氏酵母异源合成类胡萝卜素的研究进展;买洁;《南京工业大学学报（自然科学版）》;第第44卷卷(第第5期期);546-555 *

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