CN112831427B - 一株高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及一株高产β‑胡萝卜素的解脂耶氏酵母及其应用。所述菌株能够利用普通碳源和氮源，经高密度培养后，β‑胡萝卜素产量达到7.8g/L，含量达到161mg/g DCW，是高产β‑胡萝卜素的优良菌株。该工程菌株以将CarRP和CarB基因定点整合至zeta位点的低产β‑胡萝卜素解脂耶氏酵母菌株T1为出发菌，将内源关键酶HMGs、HMGCR、ERG20、GGS1、ERG8、ERG12、ERG19及IDI进行多轮随机整合，并引入外源GGPP合成酶GPS(可将IPP和DMAPP直接催化成GGPP)和血红蛋白VHb，最后对降低脂质体降解的关键基因AAL8进行敲除得到该高产菌株。作为一种β‑胡萝卜素生产工程菌，在食品、饲料、医药及化妆品领域具有良好的应用前景。

Description

一株高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母及其应用
技术领域
本发明属于工程菌技术领域，具体涉及一株解脂耶氏酵母菌(Yarrowialipolytica)GVD-A，其构建方法、及所述菌株作为β-胡萝卜素生产工程菌的应用； 本发明还包括上述菌株的菌剂，及在食品工业、饲料工业、医药及化妆品工业领 域的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不 必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所 公知的现有技术。
迄今为止，已报道了700多种类胡萝卜素，植物、细菌、藻类和酵母皆可是 其来源，β-胡萝卜素是其中之一。β-胡萝卜素可作为维生素A的前体，是世界卫 生组织和联合国粮农组织食品添加剂联合专家委员会认定的A类全营养食品强 化剂，已被世界上52个国家和地区批准使用。β-胡萝卜素具有抗氧化、保护视 力、抗衰老、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗辐射、预防血管硬化和提高免疫力等许多 重要的生理功能，在食品、药品、保健品等领域具有广阔的应用前景。目前β- 胡萝卜素的生产方法主要有三种：化学合成法、植物提取法和微生物发酵法。化 学合成法工艺流程复杂、能耗高、污染大；β-胡萝卜素在植物中含量通常很低， 植物提取法对野生植物资源造成严重破坏；相比之下，微生物发酵法不受原料的 限制、生产过程绿色清洁，具有很大的优势。目前微生物制备β-胡萝卜素，主要 菌种有杜氏盐藻和三孢布拉氏霉。杜氏盐藻(Dunaliella)和三孢布拉氏霉 (Blakeslea trispro)的发酵生产技术比较成熟，均已经进入工业化生产，其中三 孢布拉氏霉培养5天β-胡萝卜素产量可达800～900mg/L，杜氏盐藻发酵β-胡萝 卜素在干菌体中的含量可达10％。但是三孢布拉氏霉由于霉菌的生殖方式等原 因，其性状易发生衰退，藻类养殖条件要求苛刻，这些不足限制了其发展。因此， 提供一株易于发酵培养的高产β-胡萝卜素的菌株具有重要的现实意义。
发明内容
针对上述研究背景，本发明目的在于克服现有β-胡萝卜素生产菌株产量低的 缺陷，旨在提供一种β-胡萝卜素的高产菌种。基于该目的，本发明以原本不产β- 胡萝卜素的解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)作为出发菌株，将CarRP和 CarB基因定点整合至zeta位点，以此低产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母菌株T1 为出发菌，将内源关键限速酶进行多轮随机整合，并引入外源GGPP合成酶GPS 和血红蛋白VHb，最后对脂质体降解的关键基因乙酰CoA连接酶AAL8进行敲 除得到一种高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A，有 望成为一种β-胡萝卜素生产的工程菌进行应用。
基于上述研究结果，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种β-胡萝卜素的工程菌，所述工程菌被修饰为与内 源活性相比，具有增强的CarB、CarRP、GGPP合成酶GPS、血红蛋白VHb、GGS1 及MVA途径相关酶活性，同时具有减弱的β-氧化酶活性。
本发明效果较好的一种具体实施方式中，采用解脂耶氏酵母菌株(Yarrowialipolytica)作为出发菌株，经本发明方法修饰后获得解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A，实现了高产β-胡萝卜素的效果。
基于该技术效果，本发明第二方面，提供一株解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A，所述菌株已于2020年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中 心，简称CCTCC，地址为：中国武汉，武汉大学，其生物保藏号为：CCTCC NO:M 2020595。
优选的，所述菌株的形态学特征为：菌株呈丝状生长，菌体成深橙黄色，深 橙黄色为积累在油滴中的β-胡萝卜素所致。
本发明第三方面，提供第二方面所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) GVD-A作为β-胡萝卜素生产工程菌的应用。
本发明第四方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述的解脂耶氏酵 母(Yarrowia lipolytica)GVD-A和/或所述菌的培养物。
本发明第五方面，提供第二方面所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) GVD-A，和/或第四方面所述菌剂在食品工业、饲料工业、医药及化妆品工业领 域的应用。
本发明第六方面，提供第二方面所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) GVD-A的构建方法，以解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)作为出发菌株， 制备所述解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)的潮霉素、尿嘧啶及亮氨酸营 养缺陷型，所述营养缺陷型菌株中的β-氧化酶缺失，同时过表达CarB、CarRP、 GGPP合成酶GPS、IDI、血红蛋白VHb、GGS1及MVA途径相关酶，最后对乙酰 CoA连接酶AAL8进行敲除。
基于本发明的研究结果，所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)GVD-A 作为β-胡萝卜素的工程菌能够带来理想的产能，为了更好实现上述菌株的工业化 应用，本发明进一步的，还对所述工程菌的发酵培养方法进行了研究，一方面提 供了更为适合上述菌株的工业化连续发酵方法。另一方面，针对该发酵方法的研 究表明，上述菌株在培养过程中对pH要求宽松，该特点可以有效的节约工业生 产过程中，对培养液pH进行调节的步骤，进一步节约产能。
因此，本发明第七方面，提供第一方面所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)GVD-A的发酵方法，所述发酵方法包括采用2XYPD、YPD培养基进 行发酵培养。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
1、本发明提供了一种新的解脂耶氏酵母，可用于高产β-胡萝卜素，具有广 泛的工业应用前景，属于同类技术的先进水平。
2、本发明在构建工程菌株CCTCC NO:M 2020595时涉及到三个新靶点 (GPS，VHb和AAL8)的应用。
3、本发明构建的解脂耶氏酵母β-胡萝卜素生产工程菌株进行β-胡萝卜素发 酵无需对发酵液pH进行调节，减少人力和物力的消耗。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明 的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所用到的质粒的结构图。
图2为实施例2中过程菌株T1-G的6个转化子β-胡萝卜素产量图。
图3为实施例2中过程菌株T1-GV的6个转化子β-胡萝卜素产量图。
图4为实施例2中过程菌株T1-GVC的6个转化子β-胡萝卜素产量图。
图5为实施例2中过程菌株T1-GVD的6个转化子β-胡萝卜素产量图。
图6为实施例3中工程菌GVD-A摇瓶发酵β-胡萝卜素产量图。
图7为实施例3中工程菌GVD-A上罐发酵β-胡萝卜素产量图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。 除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普 通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限 制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出， 否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使 用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或 它们的组合。
正如背景技术所介绍的，提供一株易于发酵培养的高产β-胡萝卜素的菌株具 有重要的应用前景，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一株解脂耶氏酵母 (Yarrowialipolytica)GVD-A。
本发明第一方面，提供一种β-胡萝卜素的工程菌，所述工程菌被修饰为与内 源活性相比，所述工程菌被修饰为与内源活性相比，具有增强的CarB、CarRP、 GGPP合成酶GPS、血红蛋白VHb、GGS1及MVA途径相关酶活性，同时具有减 弱的β-氧化酶活性。
在本发明中，“修饰为与内源活性相比具有增强的活性”意思是与操纵前的微 生物的活性相比，操纵后微生物的活性增加，所述操纵比如引入显示活性的基因， 或增加基因拷贝数，缺失抑制基因表达的调控因子或修饰表达调控序列，例如， 使用改进的启动子。
另外，上述所述活性增强并不局限于上述蛋白质本身，与上述蛋白具有70％ 或更多与其相似性的、优选地80％或更多相似性、更优选地90％或更多与其相似 性、更优选地95％或更多与其相似性、更优选地98％或更多与其相似性和最优选 地99％或更多与其同源性的氨基酸序列。所述相似性可通过BLAST方法比对得 知。
根据本领域技术人员所掌握的现有技术，微生物的种类或菌株而不同，其中 显示活性的蛋白质的氨基酸序列存在不同，因此，根据工程菌株种类对上述蛋白 进行修饰也是本领域的常规研究手段。即，蛋白质可以是蛋白突变体或人造变体， 而且，氨基酸的替换、缺失、插入、添加或倒位可包括自然发生的突变，其由于 具有多肽或人造变体的活性的微生物的个体或物种的差异而发生。
优选的，所述β-氧化酶为乙酰CoA连接酶8。
优选的，所述GGPP合成酶GPS来源于Archaeoglobus。
优选的，所述血红蛋白VHb来自Vitreoscilla。
优选的，所述番茄红素合成酶CarB来自Rhizomucor circinelloides。
优选的，所述番茄红素环化酶CarRP来自Rhizomucor circinelloides。
优选的，所述MVA途径相关酶为包括但不限于ERG8、ERG12、ERG19中一 种或几种。
优选的，所述IDI为IPP异构酶，所述基因序列号为NC_006072.1。
优选的，所述工程菌中，潮霉素、尿嘧啶及亮氨酸营养缺失。
优选的，所述工程菌为包括但不限于大肠杆菌、酵母菌；进一步的，所述酵 母菌优选解脂耶氏酵母或酿酒酵母菌。
上述优选技术方案的一种实施方式中，采用解脂耶氏酵母作为工程菌，进行 如上所述的蛋白修饰。
本发明第二方面，提供一株解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)GVD-A，所 述菌株已于2020年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地 址为：中国武汉武汉大学，其生物保藏号为：CCTCC NO:M 2020595。
优选的，所述菌株的形态学特征为：菌株呈丝状生长，菌体成深橙黄色，深 橙黄色为积累在油滴中的β-胡萝卜素所致。
优选的，所述菌株的种子培养基中，包括葡萄糖1～3％，蛋白胨1～3％，酵母 提取物0.5～2％；具体的，包括葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母提取物1％。
优选的，所述菌株的发酵培养基中，包括葡萄糖8～12％蛋白胨2～6％，酵母 提取物1～3％，具体的，包括葡萄糖10％，蛋白胨4％，酵母提取物2％。
本发明第三方面，提供第二方面所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) GVD-A作为β-胡萝卜素生产工程菌的应用。
本发明第四方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述的解脂耶氏酵 母(Yarrowia lipolytica)GVD-A和/或所述菌的培养物。
本发明第五方面，提供第二方面所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) GVD-A，和/或第三方面所述菌剂在食品工业、饲料工业、医药及化妆品工业领 域的应用。
本发明第六方面，提供第二方面所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) GVD-A的构建方法，以解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)作为出发菌株， 制备所述解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)的潮霉素、尿嘧啶及亮氨酸营 养缺陷型，所述营养缺陷型菌株中的β-氧化酶缺失，同时过表达CarB、CarRP、 GGPP合成酶GPS、IDI、血红蛋白VHb、GGS1及MVA途径相关酶，最后对β- 氧化酶进行敲除。
优选的，所述出发菌株解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)，其ATCC 编号MYA-2613。
进一步的，出发菌株解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)的基因型为MATAura3-3021leu2-270xpr2-322axp2-deltaNU49XPR2::SUC2。
优选的，所述β-氧化酶为乙酰CoA连接酶8，GenBank:YALI1_B10231g。
进一步的，所述乙酰CoA乙酰转移酶基因atoB来自大肠杆菌E.coli， GenBank:b2224。
进一步的，所述乙酰CoA乙酰转移酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。
优选的，所述GGPP合成酶GPS基因来自Archaeoglobus；其编号为 NC_013741.1。
优选的，所述GGPP合成酶GPS基因，其序列如SEQ ID NO：2所示。
优选的，所述血红蛋白VHb基因来自Vitreoscilla。
进一步的，所述血红蛋白VHb基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
优选的，所述CarB和CarRP来自Rhizomucor circinelloides。
进一步的，所述CarB的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
进一步的，所述CarRP的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
优选的，所述MVA途径相关酶包括但不限于HMGs、HMGCR、ERG20、 GGS1、ERG8、ERG12、ERG19。
优选的，所述CarB、CarRP的插入位点为解脂耶氏酵母菌株(Yarrowialipolytica)基因组的zeta位点处。
优选的，所述CarRP的拷贝数为两个及以上。
多核苷酸的拷贝数可以，但是不具体地限于，通过可操作地将多核苷酸连接 至载体或通过将其整合入宿主细胞基因组而增加。具体而言，宿主细胞基因组中 多核苷酸的拷贝数可以通过将可操作地连接至编码本发明的蛋白质的多核苷酸 和独立于宿主细胞复制和起作用的载体引入宿主细胞而增加，或通过将可操作地 连接至多核苷酸和能够将多核苷酸整合入宿主细胞基因组的载体引入宿主细胞 而增加。本发明所使用的，术语“载体”指的是包含编码期望蛋白质的核苷酸序列 的DNA构建体，其可操作地连接至适当的表达调控序列以在适合的宿主细胞中 表达期望的蛋白质。该调控序列包括可以引发转录的启动子、调控转录的任选的 操纵基因(operator)序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列、和调控转录 和翻译终止的序列。在载体被转化入适当的宿主细胞之后，其可以独立于宿主基因组复制或起作用，并且可以将载体整合入基因组本身。
在本发明中使用的载体不具体地限制，只要它能够在宿主细胞中复制，并且 可以使用本领域中任何已知的载体。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、黏 粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、 t10、t11、卡隆4A和卡隆21A可以用作噬菌体载体或黏粒载体。作为质粒载体， 可使用pBR型、pUC型、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型和pET型。本 发明中可使用的载体不具体地限制，并且可以使用任何已知的表达载体。优选地， 可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118或pCC1BAC载体。
进一步，将多核苷酸插入染色体可以通过本领域中任何已知的方法执行，例 如，同源重组。由于本发明的载体可以通过同源重组插入染色体，所以它可以进 一步包括选择标记以确认染色体插入。选择标记是为了选择转化有载体的细胞， 即，为了确认期望的多核苷酸的插入，并且选择标记可包括提供可选择表型的标 记，所述表型比如抗药性、辅源营养、对细胞毒素剂的抗性或表面蛋白表达。
同样，用于增加多核苷酸表达的表达调控序列的修饰可以，但不限于，通过 在表达调控序列上通过核苷酸序列的缺失、插入、非保守的或保守的替换或其组 合诱导修饰以便进一步增强表达调控序列的活性而进行，或通过利用具有更强活 性的核苷酸序列置换表达调控序列而进行。该表达调控序列包括，但不具体地限 于，启动子、操纵基因序列、编码核糖体结合位点的序列和调控转录和翻译终止 的序列。
优选的，本发明提供的一种实施方式中，所述构建方法如下：
(1)将解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株培养过夜，基于同源重组将CarB和CarRP的基因整合到基因组的zeta位点处，得到产β-胡萝卜素的重组菌T1；
(2)通过非同源重组转化(NHEJ)方式，将线性化的GPS-IDI-ERG12整合至 T1菌株中获得T1-G5菌株；
(3)在菌株T1-G5中过表达VHb，ERG8和ERG19基因获得菌株T1-GV5；
(4)在菌株T1-GV5中过表达CarRP和GGS1基因获得菌株T1-GVC3；
(5)采用Cre-loxP系统将T1-GVC3中已被占用的潮霉素，尿嘧啶及亮氨酸 Marker敲除，采用非同源重组转化方式，将线性化的质粒p-car-M1，p-car-M2， p-car-M3共同转入菌株T1-GVC3中获得T1-GVD2菌株；
(6)将T1-GVD2菌株中的关键酶乙酰CoA连接酶AAL进行敲除获得菌株 GVD-A。
进一步的，所述步骤(1)中，所述解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica) 菌株培养液为YPD液体培养基，更进一步的，所述YPG液体培养基中含有2％蛋 白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖。
本发明第六方面，提供第一方面所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) GVD-A的发酵方法，所述发酵方法包括采用2XYPD、YPD培养基进行发酵培养。
优选的，所述2XYPD培养基包括4％胰蛋白胨，2％酵母提取物，10％葡萄糖。
优选的，所述培养方法如下：将菌液接种于YPD培养基中培养一段时间，获 取单克隆在30℃、220rpm条件下摇瓶培养获得种子液；发酵培养阶段，温度为 30℃，通气量为2.0VVM，溶氧设置为20％，搅拌速度(400-1000)与溶氧偶联。
优选的，所述培养方法中，还包括对发酵装置中的葡萄糖浓度进行检测，当 葡萄糖浓度低于10g/L时，进行补糖，补至55～65g/L。
优选的，所述培养方法中，无需对pH进行调节。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结 合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
一、材料和方法
1、本发明中的基因合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；本发明中的引物合成及测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。
2、下面实施例中所使用的实验方法包括质粒构建、酶切、感受态细胞的制备、 转化等如无特殊说明，均为常规方法。必要时可以通过简单实验确定具体实验条 件。
3、下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
4、本发明所涉及的解脂耶氏酵母原始菌株(ATCC编号MYA-2613；基因型MATAura3-3021leu2-270xpr2-322axp2-deltaNU49XPR2::SUC2)购自ATCC。
5、本发明所涉及的基因，其中来自大肠杆菌E.coli的atoB，来自Archaeoglobus的GPS，来自Vitreoscilla的VHb，来自Rhizomucor circinelloides的CarB和CarRP 都经密码子优化后并合成(金斯瑞，南京，中国)。其中HMGs、HMGCR、ERG20、 GGS1、ERG8、ERG12、ERG19及IDI基因克隆于解脂耶氏酵母基因组。
6、LB固体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，20g/L 琼脂粉。
LB液体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。
YPD培养基：1wt％酵母提取物，2wt％蛋白胨，2wt％葡萄糖。
YPD固体培养基：1wt％酵母提取物，2wt％蛋白胨，2wt％葡萄糖，2wt％琼脂 粉。
二、基因元件的扩增与目标质粒的制备 (一)目标基因的制备
1、根据NCBI上提供的来自大肠杆菌的乙酰CoA乙酰转移酶基因atoB (GenBank:b2224)的核苷酸序列，经过密码子优化后，委托苏州金唯智生物科 技有限公司合成优化后的乙酰CoA乙酰转移酶基因atoBY。atoBY的核苷酸序 列如SEQ ID NO：1所示。
2、根据NCBI上提供的来自Archaeoglobus的GGPP合成酶GPS(NC_013741.1) 的核苷酸序列经过密码子优化后，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成优化后 的GGPP合成酶GPSY。GPSY的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3、根据NCBI上提供的来自Vitreoscilla的血红蛋白基因VHb(ABY61829.1)的 核苷酸序列经过密码子优化后，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成优化后的 血红蛋白VHbY。VHbY的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4、根据NCBI上提供的来自Rhizomucor circinelloides的番茄红素合成酶CarB(GenBank:AJ238028.1)的核苷酸序列经过密码子优化后，委托苏州金唯智生物 科技有限公司合成优化后的番茄红素合成酶CarBY的核苷酸序列如SEQ ID NO： 4所示。
5、根据NCBI上提供的来自Rhizomucor circinelloides的番茄红素环化酶CarRP(GenBank:AJ250827.1)的核苷酸序列经过密码子优化后，委托苏州金唯智生物 科技有限公司合成优化后的番茄红素合成酶CarRPY的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
6、根据NCBI上提供的Yarrowia lipolytica中的HMG-CoA合成酶基因HMGS(Genbank:YALI0_F30481g)，HMG-CoA还原酶基因HMGR(GenBank: Bpet3342)，MVA激酶基因ERG12(GenBank:NC_006068.1)，二氧磷基MVA 激酶基因ERG8(GenBank:NC_006071.1)，MVA焦磷酸脱羧酶基因ERG19 (NC_006072.1)，IPP异构酶基因IDI(NC_006072.1)，FPP合成酶基因ERG20 (YALI0_E05753g)和GGPP合成酶基因GGS1(NC_006070)核苷酸序列，根据引 物表1中的引物从Yarrowia lipolytica基因组中PCR获得。
表1引物序列
Figure BDA0002907240790000101
Figure BDA0002907240790000111
(二)质粒的构建
本实施例用到的质粒的结构见图1。
1、本实施例所使用的基因敲除或敲入系统是根据已有的CRISRPR/Cas9操作系统。针对不同的sgRNA进行的质粒构建都是基于所购买的质粒pCRISPRyl，该 质粒上有一个酶切位点AvrII,该酶切位点上游含有启动子SCR1’-tRNAGly用于 启动sgRNA的表达，将sgRNA的20bp序列插入该位点即获得了sgRNA质粒。 敲除基因TRP所用的sgRNA序列为5‘-cgatggcgtcctgatccagt-3’。敲除基因AAL 所用的sgRNA序列为5‘-tacttgtggtacagctgggc-3’。敲入基因CarB和CarRP所用 的sgRNA为5‘-tacttgtggtacagctgggc-3’。
2、质粒JMP-hyp-GPS-IDI-ERG12的构建
质粒JMP-hyp-GPS-IDI-ERG12是以JMP-hyg-FSErg20-IDI-ERG12为骨架制 得。骨架质粒JMP-hyg-FSErg20-IDI-ERG12的制备方法根据Liu,Y.,et al., Engineering theoleaginous yeast Yarrowia lipolytica for production of alpha-farnesene.Biotechnol Biofuels,2019.12:p.296.Page 8of 11所记载的制备方 法制得。质粒JMP-hyp-GPS-IDI-ERG12是用常规Gibson组装法将基因FSErg20 替换成GPS基因而制得。
3、质粒114-VHb-ERG8-ERG19的构建
质粒114-VHb-ERG8-ERG19是以114-GPPS-ERG8-ERG19为骨架制得。骨 架质粒114-GPPS-ERG8-ERG19的制备方法根据Liu,Y.,et al.,Engineering the oleaginous yeastYarrowia lipolytica for production of alpha-farnesene.Biotechnol Biofuels,2019.12:p.296.Page 8of 11所记载的制备方法制得。质粒 114-VHb-ERG8-ERG19是用常规Gibson组装法将基因GPPS替换成VHb而制得。
4、质粒113-CarRP-GGS1的构建
质粒113-CarRP-GGS1是以p-car-M3为骨架制得。骨架质粒p-car-M3的制 备方法根据Cui,Z.Y.,et al.,Homology-independent genome integration enables rapidlibrary construction for enzyme expression and pathway optimization inYarrowia lipolytica.Biotechnology and Bioengineering,2019.116(2):p.354-363.所记载的制备方法制得。质粒113-CarRP-GGS是用常规反向PCR法将基因CarB 删除后而制得。
5、质粒p-car-M1，p-car-M2，p-car-M3参见Cui,Z.Y.,et al.,Homology-independent genome integration enables rapid library construction for enzymeexpression and pathway optimization in Yarrowia lipolytica.Biotechnology andBioengineering, 2019.116(2):p.354-363.所记载的制备方法制得。
实施例2构建产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母工程菌GVD-A
1、基于已有的CRISPR/Cas9操作系统，将含有CarB和CarRP的基因表达盒的 质粒p-car-M3和pCRISPRyl-car导入Yarrowia lipolytica中，整合到基因组的zeta 位点处，得到产β-胡萝卜素的重组菌T1。
具体方法如下：(1)Yarrowia lipolytica po1fΔTRP于YPD液体培养基(含 有2％蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖)中过夜培养后，采用常规酵母醋酸 锂感受态制备方法制备感受态细胞。(2)向40μL感受态细胞中加入 2μLpCRISPRyl-car和p-car-M3质粒，再加入2μL鲑鱼精DNA，30℃水浴培养 15min。(3)向上述体系中加入350μLPEG 4000-LithiumAcetate(0.1M pH 6.0)及 16μL 1MDTT(40mM)，30℃水浴静止培养1h。(4)向上述体系中加40μLDMSO (终浓度约40％)，39℃热击10min。(5)加600μL Lithium Acetate(0.1M pH6.0),室温放置15min。(6)取200μL上述混合物涂布YNBG筛选平板，30℃培养2-3 天。(6)随机挑选转化子，利用引物F：5’-TCACACCCGAAATCGTTAA-3’和R： 5‘-CATATGATTGCAGTCGTC-3’验证。(7)对转化子中β-胡萝卜素进行检测。β- 胡萝卜素的检测方法简言之：通过离心收获培养的解脂耶氏酵母细胞并重悬于 0.7mL DMSO中，然后加入等体积丙酮，55℃温育10min，再在45℃温育15 min。最后将样品以12,000×g离心5分钟。使用配备有450nm可变波长检测 器的岛津LC-20AT高效液相色谱仪和使用的XDBC18柱(Eclipse，USA)分 析含有β-胡萝卜素的上清液。流动相为甲醇，乙腈和二氯甲烷(42:42:16)，流 速为1.0mL/min，柱温为30℃。生物量的检测简言之：取适量发酵液，3000rpm 离心10min，弃上清收集菌体沉淀。ddH2O清洗细胞2次，将菌体85℃干燥 24h至恒重，使用分析天平称量重量，计算出发酵液的细胞干重(DCW，g/L)。 与原始菌株对比，转化子克隆变成了黄色，获得目的菌株T1，经YPD摇瓶发酵120h，T1菌株的β-胡萝卜素含量可达5.2mg/g DCW,而原始菌株Po1f没有检测 到β-胡萝卜素的产生。
2、为了进一步提高菌株β-胡萝卜素产量，本实施例采用非同源重组转化(NHEJ)方式，将线性化的质粒JMP-hyp-GPS-IDI-ERG12整合至T1菌株中获得T1-G5 菌株。挑取6个转化株，YPD摇瓶发酵结果如图2所示。结果显示过表达GPS， IDI和ERG12基因的菌株类胡萝卜素产量和含量与T1相比有大幅度的提高，提 高6.98倍，但却有大量的中间产物番茄红素的积累。本发明进一步在菌株T1-G5 中过表达VHb，ERG8和ERG19基因获得菌株T1-GV5。经筛选挑取6株转化子 进行摇瓶发酵，结果如图3所示，较T1-G5菌株，T1-GV5菌株的类胡萝卜素产 量又进一步提高(1.37倍)，依然有中间产物番茄红素的积累。说明催化番茄红 素到β-胡萝卜素的环化酶CarRP的催化效率不足，导致了番茄红素的积累。因 此，本发明进一步在菌株T1-GV5中过表达CarRP和GGS1基因获得菌株 T1-GVC。经筛选挑取6株转化子进行摇瓶发酵，结果如图4所示，较T1-G5和 T1-GV5菌株，T1-GVC3已不再有中间产物番茄红素的积累，β-胡萝卜素的含量 可达到40.2mg/g DCW。在此基础上，为了进一步提高菌株T1-GVC3的β-胡萝 卜素产量，首先采用Cre-loxP系统(质粒)将T1-GVC3中已被占用的潮霉素， 尿嘧啶(URA3)及亮氨酸(LEU2)Marker敲除。依然采用非同源重组转化(NHEJ) 方式，将线性化的质粒p-car-M1，p-car-M2，p-car-M3共同转入菌株T1-GVC3 中获得T1-GVD2菌株。经筛选挑取6株转化子进行摇瓶发酵，结果如图5所示， β-胡萝卜素含量较T1-GVC3又有大幅度提高，达到65mg/g DCW。
3、β-胡萝卜素为脂溶性萜类化合物，所以在细胞的积累通常储存于油滴中。为 了提高β-胡萝卜素的储藏空间进而提高β-胡萝卜素的的产量，将解脂耶氏酵母 中负责β-氧化的关键酶乙酰CoA连接酶AAL进行敲除获得菌株GVD-A。对 GVD-A进行摇瓶发酵，结果如图6所示，β-胡萝卜素含量较T1-GVD又有进一 步的提高，含量达到88.9mg/g DCW。GVD-A的产量和含量已达到目前报道的 最高摇瓶水平，具有工业化应用前景。
实施例3GVD-A菌株连续补料发酵培养
将实施例2中所述基因工程构建的GVD-A高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母 GVD-A在1L发酵罐中进行连续补料发酵实验，本实施例选用的培养基为2XYPD 培养基(4％胰蛋白胨，2％酵母提取物，6％葡萄糖)，初始体积为0.6L。从甘油 保种管中取出菌液在YPD固体平板上划线，培养36h。将长起来的单克隆接种 到1瓶含有50mL YPD培养基的摇瓶中，30℃，220rpm培养24h，将此种子接 种到发酵罐中。发酵罐的设定温度为30℃，通气量为2.0VVM,溶氧设置为20％， 搅拌速度(400-1000)与溶氧偶联，不进行pH调节。每个6小时取样检测发酵 罐中葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于10g/L时，进行补糖，补至60g/L。同时对 样品的β-胡萝卜素以及菌体的生物量进行检测。图7显示发酵结果，在发酵216h 时，菌体的生物量为43.5g/L，β-胡萝卜素的产量和含量为7.8g/L和161mg/g DCW。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域 的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一株高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母及其应用
<130> 2010
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1185
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaagaact gtgtcatcgt gtccgccgtg cgaaccgcca tcggctcctt caacggttct 60
ctggcctcca cctccgccat tgacctgggc gccaccgtca ttaaggccgc catcgagcga 120
gccaagatcg actcccagca cgtggacgag gtcattatgg gtaacgtcct gcaggccggc 180
ctgggtcaga accccgctcg acaggccctg ctgaagtccg gcctggccga gaccgtctgt 240
ggtttcaccg tgaacaaggt gtgcggctcc ggtctgaagt ccgtcgccct ggccgcccag 300
gctatccagg ctggacaggc ccagtccatc gtggccggcg gaatggagaa catgtccctg 360
gccccctacc tgctggacgc caaggcccga tccggctacc gactgggcga cggtcaggtg 420
tacgacgtga ttctgcgaga cggtctgatg tgtgccaccc acggttacca catgggcatc 480
accgccgaga acgtcgccaa ggagtacggt atcacccgag agatgcagga cgagctggcc 540
ctgcactccc agcgaaaggc cgccgctgcc atcgagtccg gtgccttcac cgccgagatt 600
gtccccgtca acgtcgtgac ccgaaagaag accttcgtct tctcccagga cgagttcccc 660
aaggccaact ctaccgccga ggccctgggc gctctgcgac ctgctttcga caaggccggt 720
accgtgaccg ccggtaacgc ctccggtatt aacgacggcg ccgccgccct ggtcattatg 780
gaggagtccg ccgccctggc cgctggtctt acccctctgg cccgaatcaa gtcttacgcc 840
tctggtggcg tgccccccgc ccttatgggc atgggtcccg tgcccgccac ccagaaggcc 900
cttcagctgg ccggtctgca gctggccgac attgacctga tcgaggccaa cgaggccttc 960
gccgcccagt tcctggccgt cggaaagaac ctgggtttcg actctgagaa ggtcaacgtg 1020
aacggcggtg ccatcgccct gggccaccct atcggcgctt ccggagcccg aatcctggtc 1080
accctgctgc acgccatgca ggcccgagac aagaccctgg gcctggccac cctgtgtatt 1140
ggtggcggcc agggtattgc catggtcatt gagcgactga actaa 1185
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<211> 954
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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ctgcccgagc gagagcccat cggcctgtac aaggctgccc gacacctgat caaggctggc 120
ggcaagcgac tgcgacccgt gatctctctg ctggccgtcg aggccctcgg caaggactac 180
cgaaagatca tccccgctgc cgtgtctatc gagactatcc acaacttcac cctggtgcac 240
gacgacatca tggaccgaga tgagatgcga cgaggcgtgc ccaccgtgca ccgagtgtac 300
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accaagtgcg acgtcgagtc tgagggcatc cgaaaggcca ccgagatgct gtctgacgtg 420
tgcatcaaga tctgcgaggg ccagtactac gacatgtctt tcgagaagaa ggaatctgtc 480
tctgaagagg aatacctgcg aatggtcgag cttaagaccg gcgtgctgat cgccgcctct 540
gccgctctgc ccgccgtgct gttcggcgag tctgaagaga ttgtgaaggc cctgtgggac 600
tacggcgtcc tgtctggcat cggcttccag atccaggacg acctgctgga cctgaccgag 660
gaaaccggaa aggactgggg ctctgacctg ctgaagggca agaagaccct gatcgtcatt 720
aaggccttcg agaagggcgt gaagctcaag accttcggaa aggaaaaggc cgacgtttct 780
gagatccgag atgacatcga gaagctgcga gagtgcggcg ccatcgacta cgccgcttct 840
atggcccgaa agatggccga ggaagccaag cgaaagctcg aggtgctgcc tgagtctaag 900
gccaaggaaa ccctgctcga gctgactgac ttcctggtga cccgaaagaa gtaa 954
<210> 3
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgctggacc agcagaccat caacatcatc aaggccaccg tgcctgtgct gaaggaacac 60
ggcgtgacca tcaccaccac cttctacaag aacctgttcg ctaagcaccc cgaggtgcga 120
cccctgttcg acatgggccg acaagagtct ctcgagcagc ccaaggctct ggccatgacc 180
gtgctggccg ctgctcagaa catcgagaac ctgcctgcca ttctgcccgc cgtgaagaag 240
atcgccgtca agcactgcca ggccggcgtg gctgccgctc actaccccat cgtgggccaa 300
gagctgctgg gcgccatcaa ggaagtgctg ggcgacgccg ccaccgacga catcctggac 360
gcctggggca aggcctacgg cgtgatcgcc gacgtgttca tccaggtcga ggccgacctg 420
tacgcccagg ccgtcgagta a 441
<210> 4
<211> 1740
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgtccaaga agcacattgt gatcattggc gccggtgtcg gcggcaccgc tactgctgct 60
cgactggctc gagagggctt caaggtgacc gtggtggaga agaacgactt cggtggtggt 120
cgatgctctc tgattcacca ccagggccac cgattcgacc agggcccttc cctgtacctg 180
atgcccaagt acttcgagga cgccttcgcc gacctggacg agcgaattca ggaccacctg 240
gagctgctgc gatgcgacaa caactacaag gtccacttcg acgacggtga gtccattcag 300
ctgtcctctg acctgacccg aatgaaggcc gagctggacc gagtcgaggg ccctcttggc 360
ttcggccgat tcctggactt catgaaggag acccacatcc actacgagtc cggtaccctg 420
atcgccctga agaagaactt cgagtctatc tgggacctga tccgaatcaa gtacgccccc 480
gagattttcc gactgcacct gttcggcaag atctacgacc gagcctccaa gtacttcaag 540
accaagaaga tgcgaatggc cttcaccttc cagaccatgt acatgggtat gtctccctac 600
gacgcccccg ccgtctactc tctgctgcag tacaccgagt tcgccgaggg catctggtac 660
ccccgaggtg gtttcaacat ggtggtccag aagctggagg ccatcgccaa gcagaagtac 720
gacgccgagt tcatctataa cgcccccgtc gccaagatca acaccgacga cgccaccaag 780
caggtcaccg gtgtcaccct ggagaacggt cacattatcg acgccgacgc cgtcgtctgc 840
aacgccgatc tggtctacgc ctaccacaac ctgctgcccc cctgtcgatg gacccagaac 900
accctggcct ccaagaagct gacctcctcc tccatctctt tctactggtc catgtccacc 960
aaggtccccc agctggacgt ccacaacatt ttcctggccg aggcctacca ggagtccttc 1020
gacgagatct tcaaggactt cggtctgccc tccgaggcct ccttctacgt caacgtcccc 1080
tctcgaatcg acccctccgc cgctcctgac ggaaaggact ctgtcatcgt cctggtgccc 1140
attggccaca tgaagtctaa gaccggtgac gcctctaccg agaactaccc cgccatggtc 1200
gacaaggccc gaaagatggt cctggccgtg attgagcgac gactgggcat gtccaacttc 1260
gccgacctca tcgagcacga gcaggtcaac gaccccgccg tgtggcagtc caagttcaac 1320
ctgtggcgag gttctattct gggtctgtct cacgacgtcc tgcaggtgct gtggttccga 1380
ccctccacca aggactccac cggccgatac gacaacctgt tcttcgtggg cgcctccacc 1440
caccccggta ctggtgttcc catcgtcctg gccggctcca agctgacctc tgaccaggtg 1500
gtcaagtctt tcggtaaaac ccccaagccc cgaaagatcg agatggagaa cacccaggcc 1560
cccctggagg agcctgacgc tgagtctacc ttccccgtct ggttctggct gcgagccgcc 1620
ttctgggtca tgttcatgtt cttctacttc ttcccccagt ctaacggtca gacccccgcc 1680
tctttcatca acaacctgct gcctgaggtg ttccgagtcc acaactctaa cgtcatctaa 1740
<210> 5
<211> 1845
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgctgctga cctacatgga ggtccacctg tactacaccc tgcccgtcct gggcgtcctg 60
tcttggctgt cccgacccta ctacaccgcc accgacgccc tgaagttcaa gttcctgacc 120
ctggtggcct tcaccaccgc ctccgcttgg gacaactaca ttgtctacca caaggcctgg 180
tcctactgcc ccacctgcgt gaccgccgtc attggttacg tgcccctgga ggagtacatg 240
ttcttcatca ttatgaccct gctgaccgtg gccttcacta acctggtcat gcgatggcac 300
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gtccccatca ccgccctgct gatcaccgcc tacaaggcct ggcacctggc cgtccctggt 420
aaacccctgt tctacggctc ttgcattctg tggtacgcct gccccgtgct ggcccttctg 480
tggttcggcg ctggcgagta catgatgcga cgacccctgg ccgtcctggt gtctattgcc 540
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atgttcttcg ccctgatcaa caccgtgctg gtgttcggta cctgcgccat cgaccgaacc 720
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ctgcactctg acaccttcca cgacctgtcc gtctcttggg acatcctgcg aaaggcctcc 900
aagtctttct acaccgcctc tgccgtcttc cccggcgacg ttcgacagga gctgggtgtc 960
ctgtacgcct tctgccgagc caccgacgac ctgtgcgaca acgagcaggt gcccgtccag 1020
acccgaaagg agcagctgat cctgacccac cagttcgtct ccgacctgtt cggccagaag 1080
acctccgccc ccaccgctat tgactgggac ttctacaacg accagctgcc cgcctcctgc 1140
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atccagggcg gtctggctcg agagattggc gaggagcgac tgctgtctct gtctcaccga 1560
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ctgaagtcct acaagcacca ctacccctcc cgagcccacg tgggaaactc taagcgagtg 1740
gagatcgccc tgctgtctgt ctacaacctg tacaccgccc ccattgccac ctcttccacc 1800
acccactgtc gacagggtaa aatgcgaaac ctgaacacca tctaa 1845

Claims (10)

1.一株解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)GVD-A，所述菌株已于2020年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国武汉.武汉大学，其生物保藏号为：CCTCC NO:M 2020595。
2.权利要求1所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)GVD-A作为β-胡萝卜素生产工程菌的应用。
3.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A。
4.权利要求1所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)GVD-A，和/或权利要求3所述菌剂在食品工业、饲料工业、医药及化妆品工业领域的应用。
5.权利要求1所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)GVD-A的构建方法，其特征在于，以解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)作为出发菌株，制备所述解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)的潮霉素、尿嘧啶及亮氨酸营养缺陷型，所述营养缺陷型菌株中的β-氧化酶缺失，同时过表达CarB、CarRP、GGPP合成酶GPS、IDI、血红蛋白VHb、GGS1及MVA途径相关酶，最后对β-氧化酶进行敲除；
所述出发菌株解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)，其ATCC编号MYA-2613，其基因型为MATAura3-3021leu2-270xpr2-322axp2-deltaNU49XPR2::SUC2；所述β-氧化酶为乙酰CoA连接酶8；基因号为：GenBank:YALI1_B10231g；
乙酰转移酶基因atoB来自大肠杆菌E.coli，基因号为GenBank:b2224；
乙酰CoA乙酰转移酶基因atoBY，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述GGPP合成酶GPS基因来自Archaeoglobus；其编号为NC_013741.1；其序列如SEQ IDNO：2所示；
所述CarB和CarRP来自Rhizomucor circinelloides；所述CarB的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示；所述CarRP的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述MVA途径相关激酶包括ERG8、ERG12及ERG19；
所述CarB、CarRP的插入位点为解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)基因组的zeta位点处；所述CarRP的拷贝数为两个。
6.权利要求1所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)GVD-A的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法包括采用2XYPD、YPD培养基进行发酵培养。
7.权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述2X YPD培养基包括4％胰蛋白胨，2％酵母提取物，10％葡萄糖。
8.权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述培养方法如下：将菌液接种于YPD培养基中培养一段时间，获取单克隆在30℃、220rpm条件下摇瓶培养获得种子液；发酵培养阶段，温度为30℃，通气量为2.0VVM，溶氧设置为20％，搅拌速度与溶氧偶联。
9.权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述培养方法中，还包括对发酵装置中的葡萄糖浓度进行检测，当葡萄糖浓度低于10g/L时，进行补糖，补至55～65g/L。
10.权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述培养方法中，无需对pH进行调节。
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