CN111304138A - 一种生产β-胡萝卜素的重组大肠杆菌及构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产β‑胡萝卜素的重组大肠杆菌及构建方法与应用，构建方法为：1)敲除产β‑胡萝卜素大肠杆菌中磷酸戊糖途径的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因zwf；2)敲除步骤1)所得菌株中编码磷酸转运蛋白Hpr、磷酸转运酶EI及葡萄糖特异性转运蛋白EIIA的基因簇ptsHIcrr；3)敲除步骤2)所得菌株的编码NADPH强依赖性的醇脱氢酶基因yjgB；4)将含有基因nadK的重组质粒导入步骤3)所得菌株中；本发明重组菌β‑胡萝卜素产量显著提高，产量最高超过2.5g/L，具有潜在工业应用价值；所述构建方法，将基因zwf和ptsHIcrr敲除后增加辅因子NADPH的供应，操作基因位点少，技术简单。

Description

一种生产β-胡萝卜素的重组大肠杆菌及构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生产β-胡萝卜素的重组大肠杆菌及构建方法与应用。

背景技术

β-胡萝卜素(β-carotene)是一种橘黄色脂溶性化合物，属于类胡萝卜素，是一种普遍存在于高等植物的色素，与其他天然类胡萝卜素一起主要被用作食品、饮料、糖果及药物的色素剂。β-胡萝卜素有良好的单线态氧清除性能，因此具有抗氧化、解毒，预防癌症、心血管疾病和白内障以及因细胞老化和衰亡导致的疾病等功效。此外，β-胡萝卜素具有11个共轭双键，带有两个视黄基团，是维生素A源，是一种重要的人体生理功能活性物质，可以治疗由于缺乏维生素A引起的细胞质角质化、干眼病、夜盲症等。

β-胡萝卜素的生产工艺主要有4种：植物体抽提法、化学合成法、天然微生物发酵法和基因工程菌发酵法。虽然β-胡萝卜素在植物体内普遍存在，但由于含量低，抽提中使用大量有机溶剂，工艺复杂，所得到的β-胡萝卜素产率低，重要的是会受植物生长的时空限制，对植物资源也造成严重破坏。目前，商用β-胡萝卜素约90％是通过化学合成法得到，但由于β-胡萝卜素分子是含有多个手性碳原子的复杂结构，因此化学合成工艺流程繁复、能耗高、污染大，不符合可持续发展要求，且合成的产品会残留一些有害成分，不利于人体健康。天然微生物发酵法获得的β-胡萝卜素纯度与生物活性均高于化学合成法产品，产生过程绿色清洁。然而，能够天然生产β-胡萝卜素的微生物种类少，且多为具致密菌丝结构的真菌如三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)，不易大规模培养。杜氏盐藻(Dunaliellasalina)因其β-胡萝卜素产量高而成为工业上最重要的杜氏藻种，此藻类生产的天然β-胡萝卜素是全反式和顺式异构体的混合物，二者之间的比例受环境条件的影响。利用该藻生产β-胡萝卜素已在澳大利亚及以色列实现工业化，但该法生产β-胡萝卜素需要苛刻的自然环境如高浓度的盐水湖、强烈的光照、干旱的气候，推广会受到地域环境限制。随着工业生物技术的发展，多种易培养、遗传背景清晰、分子操作简单的异源合成β-胡萝卜素的基因工程菌被构建，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、大肠杆菌(Escherichia coli)等。

相比其他异源合成β-胡萝卜素的基因工程菌，大肠杆菌遗传背景和代谢途径都非常清楚，培养条件简单，生长迅速，分子生物学操作方法简便，基因编辑工具种类多，基因操作技术成熟，通过代谢工程的理性设计改进菌种便利，大量研究都以大肠杆菌作为宿主菌种进行理性改造生产β-胡萝卜素。

大肠杆菌具有合成β-胡萝卜素生物合成的前体化合物异戊烯焦磷酸(Isopentenyl diphosphate，IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(Dimethylallylpyrophosphate，DMAPP)的甲基赤藓醇(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate，MEP)途径及催化IPP异构成DMAPP的异戊酰焦磷酸异构酶(Isopentenyl diphosphate isomerase,Idi)，引入天然产β-胡萝卜素微生物的β-胡萝卜素合成结构基因簇——crtEBIY，即能实现β-胡萝卜素的大肠杆菌合成。但由于大肠杆菌通过MEP途径合成IPP及DMAPP需要大量的辅因子(合成1分子IPP或DMAPP需要2分子NADPH、1分子ATP及1分子CTP)，因此合成能力较低。

为提高大肠杆菌生产β-胡萝卜素的产量，众多研究组探寻了提高MEP途径碳通量的策略，如探寻限速酶并调控其表达，取得了一系列研究成果。大肠杆菌以葡萄糖为原料，生产β-胡萝卜素途径复杂，MEP途径起始物3-磷酸甘油醛和丙酮酸是中心碳代谢关键中间产物，且合成1分子β-胡萝卜素需要8分子ATP、8分子CTP及16分子NADPH。Zhao等将整个大肠杆菌β-胡萝卜素合成途径分为5个模块，即MEP模块、β-胡萝卜素合成模块、ATP生成模块、磷酸戊糖途径模块及三羧酸循环模块，组合调控各模块基因的表达，解决途径中辅因子不足的问题，最后获得一株β-胡萝卜素细胞含量比出发菌株提高74倍的工程大肠杆菌，在7升发酵罐中高密度发酵，β-胡萝卜素产量最高达2.1g/L。Li等以CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术，以理性设计的5’-UTR序列组合过表达调控β-胡萝卜素合成基因簇、MEP途径及中心碳代谢途径关键基因，提高前体物及辅因子供给，获得一株β-胡萝卜素生产最优菌株ZF237T，5升发酵罐高密度发酵后β-胡萝卜素产量最高达2.0g/L。

所有上述生产β-胡萝卜素的工程大肠杆菌均是在引入β-胡萝卜素合成基因簇后经过多步组合调控后获得，涉及多个基因位点的多重组合，由于关键步骤会随着菌株遗传背景的改变而发生变化，给后续进一步的理性设计改造带来不便。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供能高产的一种β-胡萝卜素的重组大肠杆菌。

本发明的第二个目的是提供一种生产β-胡萝卜素的重组大肠杆菌的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种生产β-胡萝卜素的重组大肠杆菌的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种生产β-胡萝卜素的大肠杆菌菌株构建方法，包括如下步骤：

1)敲除产β-胡萝卜素大肠杆菌中磷酸戊糖途径的6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因zwf；

2)敲除步骤1)所得菌株中编码磷酸转运蛋白Hpr、磷酸转运酶EI及葡萄糖特异性转运蛋白EIIA的基因簇ptsHIcrr(ptsH ptsI crr)；

3)敲除步骤2)所得菌株中编码NADPH强依赖性的醇脱氢酶基因yjgB；

4)将含有基因nadK的重组质粒导入步骤(3)所得菌株中，得到生产β-胡萝卜素的重组大肠杆菌；

所述基因zwf的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述基因簇ptsHIcrr的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述基因yjgB的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述基因nadK的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

上述方法构建的生产β-胡萝卜素的菌株。

上述生产β-胡萝卜素的大肠杆菌在发酵生产β-胡萝卜素的用途。

本发明构建的生产β-胡萝卜素大肠杆菌菌株，5-L发酵罐分批补料发酵，结果显示其产量最高超过2.5g/L，具有潜在工业应用价值；所述构建方法，将基因zwf和ptsHIcrr敲除后增加菌株辅因子NADPH的供应，操作基因位点少，技术简单。

附图说明

图1为基因操作靶点，其中a为代谢途径基因敲除靶点，b为醇脱氢酶敲除靶点，c为过表达NAD⁺激酶基因nadK；

图2为基因zwf及基因簇ptsHIcrr的敲除对菌株生物量和β-胡萝卜素生成的影响；

图3为增加NADPH供给对菌株生物量和β-胡萝卜素产量的影响；

图4为重组大肠杆菌ECW5菌株的5-L发酵罐发酵曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。

大肠杆菌EcKan是在大肠杆菌K-12MG1655(Coli Genetic Stock Center，http://cgsc.biology.yale.edu/)菌株基因组的bio位点整合λ-Red重组系统及卡那霉素抗性基因kan得到，在文献“LiYF，Lin ZQ，et al.(2015).Metabolic engineering of Escherichiacoli using CRISPR–Cas9 meditated genome editing.Metab Eng31：13-21”中公开过。

大肠杆菌ZF43ΔgdhA是将源自成团范菌(Pantoea agglomerans)的β-胡萝卜素合成操纵子crtEBIY整合至菌株EcKan基因组乳酸脱氢酶编码基因ldhA位点后，获得合成β-胡萝卜素能力，再在该位点引入来自古细菌Archaeoglobus fulgidus的双牻牛基焦磷酸合酶编码基因gps，利用理性设计的包含强组成型启动子J23119及RBS B0034序列的5’-UTR序列在基因组上过表达大肠杆菌自身的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合酶编码基因dxs、4-二膦酰-2C-甲基-D-赤藓醇激酶编码基因ispE、4-羟基-3-甲基-2-烯-1-基二磷酸还原酶编码基因ispH、异戊烯焦磷酸异构酶编码基因idi及法尼烯焦磷酸合酶编码基因ispA，然后敲除谷氨酸脱氢酶编码基因gdhA得到。该菌株在文献“Li YF，Lin ZQ，et al.(2015).Metabolicengineering of Escherichia coli using CRISPR–Cas9 meditated genomeediting.Metab Eng31：13-21”中公开过。

质粒pTKRED和pTKS/CS来源为Addgene(Addgene,https://www.addgene.org/)。

质粒p5C是含有pSC101复制子、具氨苄霉素抗性的低拷贝数表达载体，在文献“LinZQ，Xu ZB，etal.(2014).Metabolic engineering of Escherichia coli for theproduction of riboflavin.Microb Cell Fact 13:104”中公开过。

所用限制性内切酶、DNA连接酶、dNTPs等分子生物学试剂从Thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)；高保真扩增聚合酶从南京诺唯赞生物科技有限公司购买(http://www.vazyme.com/)。

所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。

图1为基因操作靶点，其中a为代谢途径基因敲除靶点，b为醇脱氢酶敲除靶点，c为过表达NAD⁺激酶基因nadK；黑色虚线框表示敲除，黑色实线框表示过表达，虚线箭头表示多步反应。

LB液体培养基配方为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L的氯化钠，调节pH至7.0。0.1Mpa压力下灭菌20min。

LB固体培养基配方为：在调节好pH值的LB液体培养基中加入15g/L的琼脂粉，0.1Mpa压力下灭菌20min。

2×YT液体培养基配方为：16g/L胰蛋白胨，10g/L酵母抽提物，5g/L的氯化钠，调节pH至7.0。0.1Mpa压力下灭菌20min。

卡那霉素、齐霉素、四环素、氨苄霉素、异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)及L-阿拉伯糖在相应的培养基中的浓度分别为10μg/mL、100μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、2mM及0.2％(质量体积比)；葡萄糖含量为质量体积比，即m/v。

为进一步提高大肠杆菌ZF43ΔgdhA的β-胡萝卜素产量，对其遗传背景进行改造，具体步骤见实施例。

实施例1

敲除产β-胡萝卜素重组大肠杆菌ZF43ΔgdhA菌株的磷酸戊糖途径中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因zwf的具体操作如下：

利用PCR扩增引物对zwf1/zwf2(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)以质粒pTKS/CS为模板进行PCR扩增，得到大小为1422bp的zwf基因敲除DNA片段(SEQ ID No.7)。

上述扩增得到的zwf基因敲除DNA片段(5’-端至3’-端)组成为：40bp上游同源臂序列(3’-端30bp作为重复序列)、18bp归巢核酸内切酶识别位点序列、1277bp四环素基因表达盒子序列、18bp归巢核酸内切酶识别位点序列、30bp重复序列及39bp下游同源臂序列。

将质粒pTKRED转入大肠杆菌ZF43ΔgdhA菌株中并制作成电转感受态；将zwf基因敲除DNA片段转入本步骤获得的电转感受态，用四环素筛选阳性克隆，并用菌落PCR进行验证。四环素抗性基因通过L-阿拉伯糖诱导归巢核酸内切酶I-SceI的表达将其删掉，并经菌落PCR验证，丢失质粒pTKRED，得到菌株ECW1。

将菌株ECW1与对照菌株ZF43ΔgdhA挑取单菌落于预装3mL含卡那霉素的LB液体培养基的试管中，于30℃、220rpm条件下过夜震荡培养；以1％接种量将培养物接种至预装3mL含卡那霉素的2×YT液体培养基的试管中，于30℃、220rpm条件下过夜震荡培养；然后将过夜培养物接种至预装100mL含卡那霉素和1％葡萄糖的新鲜的2×YT液体培养基的500mL三角瓶里，使起始OD600为0.05，于30℃、220rpm条件下震荡培养；培养48小时后，菌株ZF43ΔgdhA积累生物量5.62g/L，β-胡萝卜素116.17mg/L，胞内含量为20.67mg/g，而菌株ECW1积累生物量4.46g/L，β-胡萝卜素122.03mg/L，胞内含量为27.38gm/g(见图2)；

从发酵结果可以看出，敲除基因zwf，β-胡萝卜素产量提高5.1％，由于生物量降低因而胞内含量提高32.5％，证明敲除基因zwf有利于β-胡萝卜素的生产。

实施例2

敲除ECW1菌株的编码磷酸转运蛋白Hpr、磷酸转运酶EI及葡萄糖特异性转运蛋白EIIA的ptsHIcrr基因簇的具体操作如下：

利用PCR扩增引物对PTS1/PTS2(SEQ ID No.8和SEQ ID No.9)以质粒pTKS/CS为模板进行PCR扩增，得到大小为1422bp的ptsHIcrr基因簇敲除DNA片段(SEQ ID No.10)。

上述扩增得到的ptsHIcrr基因簇敲除DNA片段(5’-端至3’-端)组成为：44bp上游同源臂序列(3’-端30bp作为重复序列)、18bp归巢核酸内切酶识别位点序列、1277bp四环素基因表达盒子序列、18bp归巢核酸内切酶识别位点序列、30bp重复序列及40bp下游同源臂序列。

将质粒pTKRED转入大肠杆菌菌株ECW1中并制作成电转感受态；将ptsHIcrr基因簇敲除DNA片段转入本步骤获得的电转感受态细胞，用四环素筛选阳性克隆，并用菌落PCR进行验证。四环素抗性基因通过L-阿拉伯糖诱导归巢核酸内切酶I-SceI的表达将其删掉，并经菌落PCR验证，丢失质粒pTKRED得到菌株ECW2。

将菌株ECW2挑取单菌落于预装3mL含卡那霉素的LB液体培养基的试管中，于30℃、220rpm条件下过夜震荡培养；以1％接种量将培养物分别接种至预装3mL含卡那霉素的2×YT液体培养基的试管中，于30℃、220rpm条件下过夜震荡培养；然后将过夜培养物分别接种至预装100mL含卡那霉素和1％葡萄糖的新鲜的2×YT液体培养基的500mL三角瓶里，使起始OD600均为0.05，于30℃、220rpm条件下震荡培养；培养48小时后，菌株ECW2积累生物量10.66g/L，β-胡萝卜素197.44mg/L，胞内含量为18.53mg/g(见图2)；

从发酵结果可以看出，在菌株ECW1中敲除ptsHIcrr基因簇，重组菌株ECW2的生物量提高139.1％，β-胡萝卜素产量提高61.8％。

实施例3

敲除ECW2菌株的NADPH强依赖性的醇脱氢酶编码基因yjgB的具体操作如下：

利用PCR扩增引物对yjgB1/yjgB2(SEQ ID No.11和SEQ ID No.12)以质粒pTKS/CS为模板进行PCR扩增，得到大小为1422bp的yjgB基因敲除DNA片段(SEQ ID No.13)。

上述扩增得到的yjgB基因敲除DNA片段(5’-端至3’-端)组成为：83bp上游同源臂序列(3’-端30bp作为重复序列)、18bp归巢核酸内切酶识别位点序列、1277bp四环素基因表达盒子序列、18bp归巢核酸内切酶识别位点序列、30bp重复序列及59bp下游同源臂序列。

将质粒pTKRED转入大肠杆菌菌株ECW2中并制作成电转感受态；将yjgB敲除DNA片段转入本步骤获得的电转感受态细胞，用四环素筛选阳性克隆，并用菌落PCR进行验证。四环素抗性基因通过L-阿拉伯糖诱导归巢核酸内切酶I-SceI的表达将其删掉，并经菌落PCR验证，丢失质粒pTKRED得到菌株ECW4。

将菌株ECW4挑取单菌落于预装3mL含卡那霉素的LB液体培养基的试管中，于30℃、220rpm条件下过夜震荡培养；以1％接种量将菌株ECW4的培养物接种至预装3mL含卡那霉素的2×YT培养基的试管中；然后将菌株ECW4过夜培养物接种至预装100mL含卡那霉素和1％葡萄糖的新鲜的2×YT培养基的500mL三角瓶里，使起始OD600为0.05，于30℃、220rpm条件下震荡培养；培养48小时后，菌株ECW4积累生物量10.00g/L，β-胡萝卜素214.58mg/L，较菌株ECW2提高8.7％，β-胡萝卜素胞内含量为21.45mg/g，较菌株ECW2提高15.8％(见图3)。

实施例4

过表达ECW4菌株的NAD⁺激酶基因nadK的具体操作如下：

利用PCR扩增引物对nadK-F/nadK-R(SEQ ID No.14和SEQ ID No.15)以重组菌株ECW4基因组为模板，扩增出过表达NAD⁺激酶DNA片段(SEQ ID No.16)；

上述过表达片段5’端序列依次为限制性内切酶SacI切割位点序列、组成型启动子apFAB72序列及RBSapFAB848序列，3’末端序列为限制性内切酶HindIII切割位点序列；

上述过表达DNA片段在经SacⅠ和HindⅢ双酶切后克隆到质粒p5C的SacI/HindIII位点，经酶切、酶连、转化、验证等操作后，得到重组质粒p5C-nadK，将该质粒转入到重组菌株ECW4，得到菌株ECW5。

将菌株ECW5挑取单菌落于预装3mL含卡那霉素及氨苄霉素的LB液体培养基的试管中，于30℃、220rpm条件下过夜震荡培养；以1％接种量将菌株ECW5的培养物接种至3mL含卡那霉素及氨苄霉素的2×YT液体培养基中，于30℃、220rpm条件下过夜震荡培养；然后将菌株ECW5过夜培养物接种至预装100mL含卡那霉素、氨苄霉素和1％葡萄糖的新鲜的2×YT液体培养基的500mL三角瓶里，使起始OD600为0.05，于30℃、220rpm条件下震荡培养；培养48小时后，菌株ECW5积累生物量9.83g/L，β-胡萝卜素266.24mg/L，较菌株ECW4提高24.1％，β-胡萝卜素胞内含量27.09mg/g，较菌株ECW4提高26.3％(见图3)。

实施例5

菌株ECW5的5L罐分批补料β-胡萝卜素发酵：

使用初始葡萄糖浓度为1％的发酵培养基对大肠杆菌工程菌株ECW5进行分批补料发酵。

发酵培养基由以下成分组成：

大量元素：10g/L葡萄糖、24g/L磷酸二氢钾、4g/L磷酸氢二铵、1.7g/L柠檬酸、1g/L七水硫酸镁、5g/L酵母抽提物。

微量元素：4.5mg/L维生素B1、2.5mg/L六水氯化钴、15mg/L四水氯化锰、1.5mg/L二水氯化铜、2.5mg/L硼酸、2.5mg/L二水钼酸钠、2.5mg/L二水乙酸锌、12.5mg/L柠檬酸三铁。

ECW5发酵包括以下步骤：

(1)种子培养：挑取活化培养重组大肠杆菌ECW5单菌落接种于3mL含卡那霉素及氨苄霉素的2×YT液体培养基中，于30℃、220rpm条件下过夜震荡培养；然后将菌株ECW5过夜培养物接种至预装100mL含卡那霉素、氨苄霉素和1％葡萄糖的发酵培养基的500mL三角瓶里，使起始OD600为0.05，于30℃、220rpm条件下震荡培养24小时得到种子液。

(2)发酵培养：5L罐中发酵培养基体积为2L，将种子液按照终浓度OD600＝0.5的接种量接种于发酵培养基，30℃，300转/分钟起始发酵。

(3)发酵控制：无菌空气通气流速为1.5vvm；溶氧为30％，溶氧的控制通过转速偶联控制；pH为7.0，当pH低于6.95时，流加饱和氨水使pH稳定在7.0；补料液为500g/L葡糖糖、2.5g/L酵母抽提物及7.5g/L七水硫酸镁，定时取样检测葡萄糖浓度，当低于2.5g/L时补加。

发酵166小时，OD600最大为182，β-胡萝卜素产量最高为2.58g/L。发酵曲线如图4示。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种生产β-胡萝卜素的重组大肠杆菌及构建方法与应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏杆菌( Escherichia coli，)

<400> 1

atggcggtaa cgcaaacagc ccaggcctgt gacctggtca ttttcggcgc gaaaggcgac 60

cttgcgcgtc gtaaattgct gccttccctg tatcaactgg aaaaagccgg tcagctcaac 120

ccggacaccc ggattatcgg cgtagggcgt gctgactggg ataaagcggc atataccaaa 180

gttgtccgcg aggcgctcga aactttcatg aaagaaacca ttgatgaagg tttatgggac 240

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cccagcactt ttggcgcaat ttgcaaaggg cttggcgagg caaaactgaa tgctaaaccg 420

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ctgcaaattc tttgcatgat tgcgatgtct ccgccgtctg acctgagcgc agacagcatc 780

cgcgatgaaa aagtgaaagt actgaagtct ctgcgccgca tcgaccgctc caacgtacgc 840

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ctgccgacca aatgttctga agtcgtggtc tatttcaaaa cacctgaact gaatctgttt 1080

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acccgtgatg gtcgttcctg gaatgagttt gagtaa 1476

<210> 2

<211> 2496

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏杆菌( Escherichia coli，)

<400> 2

atgttccagc aagaagttac cattaccgct ccgaacggtc tgcacacccg ccctgctgcc 60

cagtttgtaa aagaagctaa gggcttcact tctgaaatta ctgtgacttc caacggcaaa 120

agcgccagcg cgaaaagcct gtttaaactg cagactctgg gcctgactca aggtaccgtt 180

gtgactatct ccgcagaagg cgaagacgag cagaaagcgg ttgaacatct ggttaaactg 240

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gacatcggcg gcgacaaaga gctgccatac atgaacttcc cgaaagaaga gaacccgttc 1320

ctcggctggc gcgctatccg tatcgcgatg gatcgtagag agatcctgcg cgatcagctc 1380

cgcgctatcc tgcgtgcctc ggctttcggt aaattgcgca ttatgttccc gatgatcatc 1440

tctgttgaag aagtgcgtgc actgcgcaaa gagatcgaaa tctacaaaca ggaactgcgc 1500

gacgaaggta aagcgtttga cgagtcaatt gaaatcggcg taatggtgga aacaccggct 1560

gccgcaacaa ttgcacgtca tttagccaaa gaagttgatt tctttagtat cggcaccaat 1620

gatttaacgc agtacactct ggcagttgac cgtggtaatg atatgatttc acacctttac 1680

cagccaatgt caccgtccgt gctgaacttg atcaagcaag ttattgatgc ttctcatgct 1740

gaaggcaaat ggactggcat gtgtggtgag cttgctggcg atgaacgtgc tacacttctg 1800

ttgctgggga tgggtctgga cgaattctct atgagcgcca tttctatccc gcgcattaag 1860

aagattatcc gtaacacgaa cttcgaagat gcgaaggtgt tagcagagca ggctcttgct 1920

caaccgacaa cggacgagtt aatgacgctg gttaacaagt tcattgaaga aaaaacaatc 1980

tgctaaatgg gtttgttcga taaactgaaa tctctggttt ccgacgacaa gaaggatacc 2040

ggaactattg agatcattgc tccgctctct ggcgagatcg tcaatatcga agacgtgccg 2100

gatgtcgttt ttgcggaaaa aatcgttggt gatggtattg ctatcaaacc aacgggtaac 2160

aaaatggtcg cgccagtaga cggcaccatt ggtaaaatct ttgaaaccaa ccacgcattc 2220

tctatcgaat ctgatagcgg cgttgaactg ttcgtccact tcggtatcga caccgttgaa 2280

ctgaaaggcg aaggcttcaa gcgtattgct gaagaaggtc agcgcgtgaa agttggcgat 2340

actgtcattg aatttgatct gccgctgctg gaagagaaag ccaagtctac cctgactccg 2400

gttgttatct ccaacatgga cgaaatcaaa gaactgatca aactgtccgg tagcgtaacc 2460

gtgggtgaaa ccccggttat ccgcatcaag aagtaa 2496

<210> 3

<211> 1020

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏杆菌( Escherichia coli，)

<400> 3

atgtcgatga taaaaagcta tgccgcaaaa gaagcgggcg gcgaactgga agtttatgag 60

tacgatcccg gtgagctgag gccacaagat gttgaagtgc aggtggatta ctgcgggatc 120

tgccattccg atctgtcgat gatcgataac gaatggggat tttcacaata tccgctggtt 180

gccgggcatg aggtgattgg gcgcgtggtg gcactcggga gcgccgcgca ggataaaggt 240

ttgcaggtcg gtcagcgtgt cgggattggc tggacggcgc gtagctgtgg tcactgcgac 300

gcctgtatta gcggtaatca gatcaactgc gagcaaggtg cggtgccgac gattatgaat 360

cgcggtggct ttgccgagaa gttgcgtgcg gactggcaat gggtgattcc actgccagaa 420

aatattgata tcgagtccgc cgggccgctg ttgtgcggcg gtatcacggt ctttaaacca 480

ctgttgatgc accatatcac tgctaccagc cgcgttgggg taattggtat tggcgggctg 540

gggcatatcg ctataaaact tctgcacgca atgggatgcg aggtgacagc ctttagttct 600

aatccggcga aagagcagga agtgctggcg atgggtgccg ataaagtggt gaatagccgc 660

gatccgcagg cactgaaagc actggcgggg cagtttgatc tcattatcaa caccgtcaac 720

gtcagcctcg actggcagcc ctattttgag gcgctgacct atggcggtaa tttccatacg 780

gtcggtgcgg ttctcacgcc gctgtctgtt ccggccttta cgttaattgc gggcgatcgc 840

agcgtctctg gttctgctac cggcacgcct tatgagctgc gtaagctgat gcgttttgcc 900

gcccgcagca aggttgcgcc gaccaccgaa ctgttcccga tgtcgaaaat taacgacgcc 960

atccagcatg tgcgcgacgg taaggcgcgt taccgcgtgg tgttgaaagc cgatttttga 1020

<210> 4

<211> 879

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏杆菌( Escherichia coli，)

<400> 4

atgaataatc atttcaagtg tattggcatt gtgggacacc cacggcaccc cactgcactg 60

acaacacatg aaatgctcta ccgctggctg tgcacaaaag gttacgaggt catcgttgag 120

caacaaatcg ctcacgaact gcaactgaag aatgtgaaaa ctggcacgct cgcggagatt 180

gggcaactag ctgatctcgc ggtagtcgtt ggtggcgacg gtaatatgct gggcgcggca 240

cgcacactcg cccgttacga tattaaagtt attggaatca accgtggcaa cctgggtttc 300

ctgactgacc ttgaccccga taacgcccag caacagttag ccgatgtgct ggaaggccac 360

tacatcagcg agaaacgttt tttgctggaa gcgcaagtct gtcagcaaga ttgccagaaa 420

cgcatcagca ccgcgataaa tgaagtggtg cttcatccag gcaaagtggc gcatatgatt 480

gagttcgaag tgtatatcga cgagatcttt gcgttttctc agcgatctga tggactaatt 540

atttcgacgc caacaggctc caccgcctat tccctctctg caggcggtcc tattctgacc 600

ccctctctgg atgcgattac cctggtgccc atgttcccgc atacgttgtc agcacgacca 660

ctggtcataa acagcagcag cacgatccgt ctgcgttttt cgcatcgccg taacgacctg 720

gaaatcagtt gcgacagcca gatagcactg ccgattcagg aaggtgaaga tgtcctgatt 780

cgtcgctgtg attaccatct gaatctgatt catccgaaag attacagtta tttcaacaca 840

ttaagcacca agctcggctg gtcaaaaaaa ttattctaa 879

<210> 5

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctggcttaag taccgggtta gttaacttaa ggagaatgac tagggataac agggtaatat 60

ttacg 65

<210> 6

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggataagcgc agatattact caaactcatt ccaggaacgg tcattctcct taagttaact 60

aacccggtaa ttaccctgtt atccctacta ag 92

<210> 7

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctggcttaag taccgggtta gttaacttaa ggagaatgac tagggataac agggtaatat 60

ttacgttgac accacctttc gcgtatggca tgatagcgcc cggaagagag tcaattcagg 120

gtggtgaata tgaatagttc gacaaagatc gcattggtaa ttacgttact cgatgccatg 180

gggattggcc ttatcatgcc agtcttgcca acgttattac gtgaatttat tgcttcggaa 240

gatatcgcta accactttgg cgtattgctt gcactttatg cgttaatgca ggttatcttt 300

gctccttggc ttggaaaaat gtctgaccga tttggtcggc gcccagtgct gttgttgtca 360

ttaataggcg catcgctgga ttacttattg ctggcttttt caagtgcgct ttggatgctg 420

tatttaggcc gtttgctttc agggatcaca ggagctactg gggctgtcgc ggcatcggtc 480

attgccgata ccacctcagc ttctcaacgc gtgaagtggt tcggttggtt aggggcaagt 540

tttgggcttg gtttaatagc ggggcctatt attggtggtt ttgcaggaga gatttcaccg 600

catagtccct tttttatcgc tgcgttgcta aatattgtca ctttccttgt ggttatgttt 660

tggttccgtg aaaccaaaaa tacacgtgat aatacagata ccgaagtagg ggttgagacg 720

caatcaaatt cggtgtacat cactttattt aaaacgatgc ccattttgtt gattatttat 780

ttttcagcgc aattgatagg ccaaattccc gcaacggtgt gggtgctatt taccgaaaat 840

cgttttggat ggaatagcat gatggttggc ttttcattag cgggtcttgg tcttttacac 900

tcagtattcc aagcctttgt ggcaggaaga atagccacta aatggggcga aaaaacggca 960

gtactgctcg aatttattgc agatagtagt gcatttgcct ttttagcgtt tatatctgaa 1020

ggttggttag atttccctgt tttaatttta ttggctggtg gtgggatcgc tttacctgca 1080

ttacagggag tgatgtctat ccaaacaaag agtcatgagc aaggtgcttt acagggatta 1140

ttggtgagcc ttaccaatgc aaccggtgtt attggcccat tactgtttac tgttatttat 1200

aatcattcac taccaatttg ggatggctgg atttggatta ttggtttagc gttttactgt 1260

attattatcc tgctatcaat gaccttcatg ttgacccctc aagctcaggg gagtaaacag 1320

gagacaagtg cttagtaggg ataacagggt aattaccggg ttagttaact taaggagaat 1380

gaccgttcct ggaatgagtt tgagtaatat ctgcgcttat cc 1422

<210> 8

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccacaacact aaacctataa gttggggaaa tacaatgttc cagctaggga taacagggta 60

atatttacg 69

<210> 9

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttttcactgc ggcaagaatt acttcttgat gcggataacc gctggaacat tgtatttccc 60

caacttatag attaccctgt tatccctact aag 93

<210> 10

<211> 1427

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccacaacact aaacctataa gttggggaaa tacaatgttc cagctaggga taacagggta 60

atatttacgt tgacaccacc tttcgcgtat ggcatgatag cgcccggaag agagtcaatt 120

cagggtggtg aatatgaata gttcgacaaa gatcgcattg gtaattacgt tactcgatgc 180

catggggatt ggccttatca tgccagtctt gccaacgtta ttacgtgaat ttattgcttc 240

ggaagatatc gctaaccact ttggcgtatt gcttgcactt tatgcgttaa tgcaggttat 300

ctttgctcct tggcttggaa aaatgtctga ccgatttggt cggcgcccag tgctgttgtt 360

gtcattaata ggcgcatcgc tggattactt attgctggct ttttcaagtg cgctttggat 420

gctgtattta ggccgtttgc tttcagggat cacaggagct actggggctg tcgcggcatc 480

ggtcattgcc gataccacct cagcttctca acgcgtgaag tggttcggtt ggttaggggc 540

aagttttggg cttggtttaa tagcggggcc tattattggt ggttttgcag gagagatttc 600

accgcatagt ccctttttta tcgctgcgtt gctaaatatt gtcactttcc ttgtggttat 660

gttttggttc cgtgaaacca aaaatacacg tgataataca gataccgaag taggggttga 720

gacgcaatca aattcggtgt acatcacttt atttaaaacg atgcccattt tgttgattat 780

ttatttttca gcgcaattga taggccaaat tcccgcaacg gtgtgggtgc tatttaccga 840

aaatcgtttt ggatggaata gcatgatggt tggcttttca ttagcgggtc ttggtctttt 900

acactcagta ttccaagcct ttgtggcagg aagaatagcc actaaatggg gcgaaaaaac 960

ggcagtactg ctcgaattta ttgcagatag tagtgcattt gcctttttag cgtttatatc 1020

tgaaggttgg ttagatttcc ctgttttaat tttattggct ggtggtggga tcgctttacc 1080

tgcattacag ggagtgatgt ctatccaaac aaagagtcat gagcaaggtg ctttacaggg 1140

attattggtg agccttacca atgcaaccgg tgttattggc ccattactgt ttactgttat 1200

ttataatcat tcactaccaa tttgggatgg ctggatttgg attattggtt tagcgtttta 1260

ctgtattatt atcctgctat caatgacctt catgttgacc cctcaagctc aggggagtaa 1320

acaggagaca agtgcttagt agggataaca gggtaatcta taagttgggg aaatacaatg 1380

ttccagcggt tatccgcatc aagaagtaat tcttgccgca gtgaaaa 1427

<210> 11

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtcggcaggc tgtgctggcg atacgacaaa acagaatatg tgcgaaagag ggcagcgcct 60

cagatcagcg ctgcgaatga ttttagggat aacagggtaa tatttacg 108

<210> 12

<211> 112

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttcagcattg catacagcga tgtgtaacct ttgtcacact ccaggcaccc cgccctgcca 60

aatcattcgc agcgctgatc tgaggcgcta ttaccctgtt atccctacta ag 112

<210> 13

<211> 1485

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtcggcaggc tgtgctggcg atacgacaaa acagaatatg tgcgaaagag ggcagcgcct 60

cagatcagcg ctgcgaatga ttttagggat aacagggtaa tatttacgtt gacaccacct 120

ttcgcgtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga atatgaatag 180

ttcgacaaag atcgcattgg taattacgtt actcgatgcc atggggattg gccttatcat 240

gccagtcttg ccaacgttat tacgtgaatt tattgcttcg gaagatatcg ctaaccactt 300

tggcgtattg cttgcacttt atgcgttaat gcaggttatc tttgctcctt ggcttggaaa 360

aatgtctgac cgatttggtc ggcgcccagt gctgttgttg tcattaatag gcgcatcgct 420

ggattactta ttgctggctt tttcaagtgc gctttggatg ctgtatttag gccgtttgct 480

ttcagggatc acaggagcta ctggggctgt cgcggcatcg gtcattgccg ataccacctc 540

agcttctcaa cgcgtgaagt ggttcggttg gttaggggca agttttgggc ttggtttaat 600

agcggggcct attattggtg gttttgcagg agagatttca ccgcatagtc ccttttttat 660

cgctgcgttg ctaaatattg tcactttcct tgtggttatg ttttggttcc gtgaaaccaa 720

aaatacacgt gataatacag ataccgaagt aggggttgag acgcaatcaa attcggtgta 780

catcacttta tttaaaacga tgcccatttt gttgattatt tatttttcag cgcaattgat 840

aggccaaatt cccgcaacgg tgtgggtgct atttaccgaa aatcgttttg gatggaatag 900

catgatggtt ggcttttcat tagcgggtct tggtctttta cactcagtat tccaagcctt 960

tgtggcagga agaatagcca ctaaatgggg cgaaaaaacg gcagtactgc tcgaatttat 1020

tgcagatagt agtgcatttg cctttttagc gtttatatct gaaggttggt tagatttccc 1080

tgttttaatt ttattggctg gtggtgggat cgctttacct gcattacagg gagtgatgtc 1140

tatccaaaca aagagtcatg agcaaggtgc tttacaggga ttattggtga gccttaccaa 1200

tgcaaccggt gttattggcc cattactgtt tactgttatt tataatcatt cactaccaat 1260

ttgggatggc tggatttgga ttattggttt agcgttttac tgtattatta tcctgctatc 1320

aatgaccttc atgttgaccc ctcaagctca ggggagtaaa caggagacaa gtgcttagta 1380

gggataacag ggtaatagcg cctcagatca gcgctgcgaa tgatttggca gggcggggtg 1440

cctggagtgt gacaaaggtt acacatcgct gtatgcaatg ctgaa 1485

<210> 14

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggagctcttg acatcgcatc tttttgtacc cataattatt tcatgcgtca tctagcatag 60

gaggttttat gaataatcat ttcaagtg 88

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tctaagcttt tagaataatt tttttgacca gccgagc 37

<210> 16

<211> 956

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggagctcttg acatcgcatc tttttgtacc cataattatt tcatgcgtca tctagcatag 60

gaggttttat gaataatcat ttcaagtgta ttggcattgt gggacaccca cggcacccca 120

ctgcactgac aacacatgaa atgctctacc gctggctgtg cacaaaaggt tacgaggtca 180

tcgttgagca acaaatcgct cacgaactgc aactgaagaa tgtgaaaact ggcacgctcg 240

cggagattgg gcaactagct gatctcgcgg tagtcgttgg tggcgacggt aatatgctgg 300

gcgcggcacg cacactcgcc cgttacgata ttaaagttat tggaatcaac cgtggcaacc 360

tgggtttcct gactgacctt gaccccgata acgcccagca acagttagcc gatgtgctgg 420

aaggccacta catcagcgag aaacgttttt tgctggaagc gcaagtctgt cagcaagatt 480

gccagaaacg catcagcacc gcgataaatg aagtggtgct tcatccaggc aaagtggcgc 540

atatgattga gttcgaagtg tatatcgacg agatctttgc gttttctcag cgatctgatg 600

gactaattat ttcgacgcca acaggctcca ccgcctattc cctctctgca ggcggtccta 660

ttctgacccc ctctctggat gcgattaccc tggtgcccat gttcccgcat acgttgtcag 720

cacgaccact ggtcataaac agcagcagca cgatccgtct gcgtttttcg catcgccgta 780

acgacctgga aatcagttgc gacagccaga tagcactgcc gattcaggaa ggtgaagatg 840

tcctgattcg tcgctgtgat taccatctga atctgattca tccgaaagat tacagttatt 900

tcaacacatt aagcaccaag ctcggctggt caaaaaaatt attctaaaag cttaga 956

Claims (3)

1.一种生产β-胡萝卜素的重组大肠杆菌构建方法，其特征是包括如下步骤：

1)敲除产β-胡萝卜素大肠杆菌中磷酸戊糖途径的6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因zwf；

2)敲除步骤1)所得菌株中编码磷酸转运蛋白Hpr、磷酸转运酶EI及葡萄糖特异性转运蛋白EIIA的基因簇ptsHIcrr；

3)敲除步骤2)所得菌株的编码NADPH强依赖性的醇脱氢酶基因yjgB；

4)将含有基因nadK的重组质粒导入步骤3)所得菌株中，得到生产β-胡萝卜素的重组大肠杆菌；

所述基因zwf的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述基因簇ptsHIcrr的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述基因yjgB的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述基因nadK的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.权利要求1的方法构建的生产β-胡萝卜素的大肠杆菌菌株。

3.权利要求2的生产β-胡萝卜素的大肠杆菌菌株在发酵生产β-胡萝卜素中的用途。

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