CN102712894B - 导入阿拉伯糖代谢途径的产木糖醇微生物及使用所述微生物生产木糖醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在木糖/阿拉伯糖混合培养基中使用产木糖醇微生物有效生产木糖醇的方法，所述产木糖醇微生物中通过导入阿拉伯糖代谢途径抑制了副产物阿拉伯糖醇的生产，并仅使用阿拉伯糖用于细胞代谢。更确切地，为了在热带假丝酵母中有效地表达L-阿拉伯糖异构酶(araA)、L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶(araD)，对密码子进行了优化。然后，将各基因插入含有甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子和URA3选择标记的基因表达盒中，将该基因表达盒导入假丝酵母微生物中。结果，可抑制妨碍木糖醇纯化和结晶的副产物阿拉伯糖醇，使得本发明的木糖醇生产方法更加有效。本发明的导入了阿拉伯糖代谢途径的产木糖醇微生物通过抑制阿拉伯糖醇的生成，可有效地用于以高生产率生产木糖醇。

Description

导入阿拉伯糖代谢途径的产木糖醇微生物及使用所述微生物生产木糖醇的方法
技术领域
本发明涉及导入阿拉伯糖代谢途径的产木糖醇微生物及使用所述微生物有效生产木糖醇的方法，更确切地说，本发明涉及导入阿拉伯糖代谢途径以抑制妨碍木糖醇纯化和结晶的阿拉伯糖醇的生成、同时使用阿拉伯糖用于细胞生长的产木糖醇微生物；以及使用所述微生物高生产率(high productivity)地生产木糖醇的方法。
背景技术
木糖醇是具有高甜度的戊糖醇，因此，木糖醇已被广泛地用作可代替糖的功能性甜味剂。木糖醇具有类似于糖的甜度，但其在人体内的代谢过程与胰岛素无关。因此，对于糖尿病患者，已将木糖醇用作糖的替代甜味剂。尤其是，木糖醇具有抑制变形链球菌(Streptococcus mutans)(致龋细菌)生长的活性，所以，木糖醇也被广泛地用作防龋齿材料。
木糖醇是通过对含有大量木糖的半纤维素水解物(如玉米芯和甘蔗茎秆)进行化学还原而生产的。然而，这类化学方法不利于从其他戊糖和己糖(如阿拉伯糖和葡萄糖等)中分离并纯化木糖，并且这类方法具有分离和纯化成本高而木糖回收率低(50～60％)的缺点。此外，这类化学方法还以使用氢气和镍催化剂的高温/高压工序为特征，带来高风险和环境问题的难题。
为克服上述常规化学方法的缺点或问题，已积极地开拓了生产木糖醇的生物学方法。不同于所述化学方法，该生物学方法甚至可利用低纯度的木糖作为原材料，并且该工序本身可在室温和常压下完成，表明该生物学方法是环保的生产方法。为使用生物学方法以高生产率和高产率(high yield)地生产木糖醇，已对各种细菌、酵母、真菌、重组酵母等进行了研究(Winkelhausen，E.等，j.Ferment.Bioeng.86：1-14，1998；Granstrom，T.B.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.74：277-281，2007)。然而，已证实细菌和重组酵母不适于木糖醇的工业生产，这是因为细菌和重组酵母的木糖代谢途径太弱或者不是非常有效。另一方面，相比于其他微生物，在众多的酵母/真菌中，假丝酵母(Candida sp.)菌株显示出高的木糖利用能力，使得它们成为用于以高生产率和高产率进行木糖醇的生物学生产的有希望的候选菌株。
根据在先的研究，假丝酵母菌株(如季也蒙假丝酵母(C.guillermondi)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)和热带假丝酵母(C.tropicalis))能借助木糖还原酶将从细胞外部导入的木糖转化为木糖醇，并且能借助木糖醇脱氢酶进一步将生产的木糖醇转化为木酮糖。所述木酮糖可由木酮糖激酶进一步转化为木酮糖-5-磷酸，并经由戊糖磷酸途径被消耗，以用于细胞生长和维持(Laplace，J.M.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，36：158-162，1991；Hahn-Hagerdal，B.等，Enzyme Microb.Technol.，16：933-943，1994)。
此时，木糖还原酶使用NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)作为辅助因子，木糖醇脱氢酶使用NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为辅助因子。由木糖还原酶介导的从木糖转化而成的木糖醇通过木糖醇脱氢酶再次转化为木酮糖。此时，如果限制培养基中的供氧，使溶解氧的浓度为0.5％～2.0％，则诱发胞内氧化还原作用失衡，这意味着木糖醇脱氢酶所需的辅助因子NAD+变得短缺，从而抑制木糖醇转化为木酮糖。结果，木糖醇在细胞和培养基中积累，显示以50-60％的产率由木糖生产木糖醇。即，在使用产木糖醇微生物生产木糖醇的常规方法中，通过限制供氧(限制通气)调节溶解氧至低浓度的程度是必需的。所以，已积极地进行了研究，以通过限制通气维持低的溶解氧浓度来有意诱导细胞中氧化还原电位的失衡，从而以高产率来提高木糖醇的生产率(Kim，S.Y.等，J.Ferment.Bioeng.，83(3)：267-270，1997；韩国专利No.1996-030577)。
韩国专利No.10-0169061描述了使用富集的近平滑假丝酵母菌株并调节溶解氧的浓度为0.8～1.2％来生产木糖醇的方法。然而，当通过使用大体积发酵罐以大的工业规模生产木糖醇时，实际上几乎不可能将溶解氧的浓度调节至上述那么低，而且即使可能的话，产率也不可能超过50-60％。韩国专利No.10-0259470描述了将培养基中的氧水平调节至1％DOT(以％表示的基质中的氧浓度)以下的搅拌速度。然而，在该方法中仍然存在着不便之处。韩国专利申请No.95-37516描述了通过使用近平滑假丝酵母转化体菌株生产木糖醇的方法，该方法描述了通过调节培养基中的氧分压实现木糖醇生产的优化。韩国专利申请No.95-13638描述了由所述转化体菌株生产木糖醇的最佳培养基和培养条件。然而，在这一方法中，甚至在最佳条件下木糖醇的产率也没有超过70％。基于假丝酵母菌株中生产的木糖醇被木糖醇脱氢酶转化为木酮糖这一事实，本发明人等开发出了木糖醇脱氢酶活性完全失活的热带假丝酵母转化体(韩国专利No.10-0730315)。根据在先的方法，为了抑制将木糖醇转化为木酮糖的木糖醇脱氢酶的活性，限制培养基中的通气是诱导胞内氧化还原电位失衡所必需的。然而，在木糖醇脱氢酶失活的转化体中，由木糖产生的木糖醇不再用于细胞生长，表明不需要氧化还原电位失衡。通过这一方法，木糖能够以97-98％的产率转化为木糖醇。
即使将从木糖到木糖醇的产率最大化，还存在着另一个待解决的问题，即用作木糖醇生产原材料的生物质水解物不仅含有木糖，还含有极大量的阿拉伯糖。产木糖醇微生物中的木糖还原酶也作用于阿拉伯糖。所以，直接将生物质水解物用作原材料时，还产生阿拉伯糖醇。阿拉伯糖醇是类似于木糖醇的戊糖醇，具有与木糖醇类似的分子结构和物理性质。因此，阿拉伯糖醇是不需要的副产物，它通过妨碍木糖醇的纯化和结晶而降低木糖醇的生产速率。因而，当将木糖/阿拉伯糖混合培养基用于木糖醇生产时，需要生产木糖醇而不生产阿拉伯糖醇的新技术。
本发明人等进行了密码子优化，以在假丝酵母中有效表达阿拉伯糖代谢途径所涉及的酶(如L-阿拉伯糖异构酶(araA)、L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶(araD))。然后，将各基因插入含有甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子和URA3选择标记的表达盒中。将制备的表达盒导入假丝酵母中。结果，本发明人等证实了通过抑制妨碍木糖醇纯化和结晶的阿拉伯糖醇的生产，可高生产率地生产木糖醇，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供产木糖醇微生物，所述产木糖醇微生物通过诱导阿拉伯糖代谢途径来抑制阿拉伯糖醇生成、并使用阿拉伯糖用于细胞生长，从而促进木糖醇生产产率最大化。
本发明的另一目的是提供所述产木糖醇微生物的生产方法。
本发明的又一目的是提供使用所述产木糖醇微生物在以葡萄糖或甘油作为碳源的培养基中高生产率地生产木糖醇的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物，通过向假丝酵母菌株中导入含有阿拉伯糖代谢途径相关基因的基因表达盒制备所述产木糖醇微生物。
本发明还提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物的生产方法，通过向假丝酵母菌株中导入含有阿拉伯糖代谢途径相关基因的基因表达盒制备所述产木糖醇微生物。
本发明还提供了大量生产木糖醇的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在含有生物质水解物和碳源的培养基中培养产木糖醇微生物；
2)由所培养的微生物生产木糖醇；以及
3)从培养液中分离木糖醇。
如上文所解释的那样，本发明涉及木糖醇的有效生产方法，所述方法的特征在于：使用导入阿拉伯糖代谢途径的产木糖醇微生物，从而抑制副产物阿拉伯糖醇、并在木糖/阿拉伯糖混合培养基中使用阿拉伯糖用于细胞代谢。本发明的这一方法通过抑制妨碍木糖醇纯化和结晶的阿拉伯糖醇的生成，可被有效地用于高生产率地生产木糖醇。
附图说明
参考附图将更好地理解本发明优选实施方式的应用，其中：
图1为表示产木糖醇微生物中的木糖和阿拉伯糖的代谢途径的图。
图2为表示CoAraA表达盒、CoAraB表达盒和CoAraD表达盒的遗传图谱的图。
具体实施方式
下文将对本发明进行详细描述。
本发明提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物，通过向假丝酵母菌株中导入含有阿拉伯糖代谢途径相关基因的基因表达盒制备所述产木糖醇微生物。
本发明还提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物，通过向假丝酵母菌株中导入下述1)-3)的基因表达盒制备所述产木糖醇微生物：
1)含有启动子、编码L-阿拉伯糖异构酶的多核苷酸和终止子的基因表达盒；
2)含有启动子、编码L-核酮糖激酶的多核苷酸和终止子的基因表达盒；以及
3)含有启动子、编码L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶的多核苷酸和终止子的基因表达盒。
上文所述的启动子优选具有SEQ.ID.NO：1所表示的核苷酸序列，上文所述的编码L-阿拉伯糖异构酶的多核苷酸优选具有SEQ.ID.NO：7所表示的核苷酸序列，上文所述的编码L-核酮糖激酶的多核苷酸优选具有SEQ.ID.NO：8所表示的核苷酸序列，上文所述的编码L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶的多核苷酸优选具有SEQ.ID.NO：9所表示的核苷酸序列，上文所述的终止子优选具有SEQ.ID.NO：2所表示的核苷酸序列，但并不总限于此。
本发明还提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物，所述微生物于2010年9月8日保藏于韩国生物科学和生物技术研究所(KoreaResearch Institute of Bioscience and Biotechnology，KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏号为KCTC 11761BP。
可通过以下步骤制备所述阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物PBDAU、LBDAU或EBDAU：构建含有启动子、多核苷酸和终止子的基因表达盒，所述启动子具有SEQ.ID.NO：1所表示的核苷酸序列，所述多核苷酸具有SEQ.ID.NO：7所表示的核苷酸序列，所述终止子具有SEQ.ID.NO：2所表示的核苷酸序列；构建含有启动子、多核苷酸和终止子的基因表达盒，所述启动子具有SEQ.ID.NO：1所表示的核苷酸序列，所述多核苷酸具有SEQ.ID.NO：8所表示的核苷酸序列，所述终止子具有SEQ.ID.NO：2所表示的核苷酸序列；构建含有启动子、多核苷酸和终止子的基因表达盒，所述启动子具有SEQ.ID.NO：1所表示的核苷酸序列，所述多核苷酸具有SEQ.ID.NO：9所表示的核苷酸序列，所述终止子具有SEQ.ID.NO：2所表示的核苷酸序列；并将所述基因表达盒导入假丝酵母菌株中，但并不总限于此。
本文所述的假丝酵母菌株优选选自于由季也蒙假丝酵母(C.guillermondi)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)和热带假丝酵母(C.tropicalis)所组成的组，但并不总限于此。
所述热带假丝酵母优选为木糖醇脱氢酶失活的热带假丝酵母，但并不总限于此。
所述木糖醇脱氢酶失活的热带假丝酵母为以保藏号KCTC 11137BP保藏的微生物，但并不总限于此。
木糖醇脱氢酶完全失活的热带假丝酵母对包含于用作木糖醇生产原材料的生物质水解物中的阿拉伯糖具有活性。所述热带假丝酵母不具有使用阿拉伯糖为碳源的代谢途径。因此，阿拉伯糖一旦进入细胞中，就被木糖还原酶的非特异性活性转化为阿拉伯糖醇，但是不能被进一步代谢和排到细胞外。所以，如果直接将生物质水解物用作基质，将生成阿拉伯糖醇。阿拉伯糖醇是类似于木糖醇的戊糖醇，并具有与木糖醇类似的分子结构和物理性质。所以，阿拉伯糖醇是不需要的副产物，它通过妨碍木糖醇的纯化和结晶而降低木糖醇的生产产率。因此，需要开发使用木糖/阿拉伯糖混合培养基而不生成阿拉伯糖醇的新的木糖醇生产方法。
本发明人等向热带假丝酵母BSXDH-3中导入了细菌的阿拉伯糖代谢途径[L-阿拉伯糖异构酶(araA)、L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶(araD)]，通过所述代谢途径可将阿拉伯糖转化为木酮糖-5-磷酸，木酮糖-5-磷酸可通过戊糖磷酸途径和糖酵解途径用于细胞代谢。
为证实产木糖醇微生物(PBDAU、LBDAU和EBDAU)的阿拉伯糖代谢途径是否能够抑制妨碍木糖醇纯化和结晶的阿拉伯糖醇的生成，在阿拉伯糖基本培养基中培养所构建的微生物，随后研究了阿拉伯糖消耗速率和阿拉伯糖醇生成速率以及随时间的细胞干重(参见表1、表2和表3)。
结果，证实了野生型热带假丝酵母(对照)不能在仅含有阿拉伯糖作为碳源的基本培养基中生长，而产木糖醇微生物LBDAU可在60h内生长出多达1.6g/L细胞干重、同时消耗4.3g/L阿拉伯糖。与此同时，还证实了木糖醇脱氢酶失活的BSXDH-3在仅含有阿拉伯糖作为碳源的基本培养基中不生长，其中的阿拉伯糖没有被消耗并且没有产生阿拉伯糖醇。还证实了产木糖醇微生物PBDAU可在60h内生长出多达2.1g/L细胞干重同时消耗5.4g/L阿拉伯糖，其中阿拉伯糖没有被转化成阿拉伯糖醇，而是用于细胞代谢。证实了另一对照野生型近平滑假丝酵母在仅包含阿拉伯糖作为碳源的基本培养基中不生长，而产木糖醇微生物EBDAU被证实在60h内生长出多达1.4g/L细胞干重同时消耗4.1g/L阿拉伯糖，其中阿拉伯糖没有被转化为阿拉伯糖醇，而是用于细胞代谢。
因此，证实了本发明的导入了阿拉伯糖代谢途径的产木糖醇微生物通过抑制阿拉伯糖醇的生成，可被有效地用于高生产率地生产木糖醇。
本发明还提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物的生产方法，通过向假丝酵母菌株中导入含有阿拉伯糖代谢途径相关基因的基因表达盒制备所述产木糖醇微生物。
本发明还提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物，通过向假丝酵母菌株中导入下述1)-3)的基因表达盒制备所述产木糖醇微生物：
1)含有启动子、编码L-阿拉伯糖异构酶的多核苷酸和终止子的基因表达盒；
2)含有启动子、编码L-核酮糖激酶的多核苷酸和终止子的基因表达盒；以及
3)含有启动子、编码L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶的多核苷酸和终止子的基因表达盒。
上文所述的启动子优选具有SEQ.ID.NO：1所表示的核苷酸序列，上文所述的编码L-阿拉伯糖异构酶的多核苷酸优选具有SEQ.ID.NO：7所表示的核苷酸序列，上文所述的编码L-核酮糖激酶的多核苷酸优选具有SEQ.ID.NO：8所表示的核苷酸序列，上文所述的编码L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶的多核苷酸优选具有SEQ.ID.NO：9所表示的核苷酸序列，上文所述的终止子优选具有SEQ.ID.NO：2所表示的核苷酸序列，但并不总限于此。
本发明还提供了阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物的生产方法，所述微生物于2010年9月8日保藏于韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏号为KCTC11761BP。
本文所述的假丝酵母菌株优选选自于由季也蒙假丝酵母(C.guillermondi)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)和热带假丝酵母(C.tropicalis)所组成的组，但并不总限于此。
所述热带假丝酵母优选为木糖醇脱氢酶失活的热带假丝酵母，但并不总限于此。
所述木糖醇脱氢酶失活的热带假丝酵母为以保藏号KCTC 11137BP保藏的微生物，但并不总限于此。
本发明人等进行了密码子优化，以在假丝酵母中有效地表达阿拉伯糖代谢途径所涉及的酶(如L-阿拉伯糖异构酶(araA)、L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶(araD)等)。然后，将各基因插入含有甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子和URA3选择标记的表达盒中。将制备的表达盒导入假丝酵母中。结果，本发明人等证实了通过抑制妨碍木糖醇纯化和结晶的阿拉伯糖醇的生产，可高生产率地生产木糖醇，从而完成了本发明。
在本发明优选的实施方式中，为优化得到SEQ.ID.NO：7、SEQ.ID.NO：8和SEQ.ID.NO：9所表示的密码子，基于密码子使用数据库(Codon Usage Database，http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)的数据，用假丝酵母的偏爱密码子替换地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)L-阿拉伯糖异构酶(araA)、大肠杆菌L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶(araD)的密码子，从而合成了CoAraA(SEQ.ID.NO：7)、CoAraB(SEQ.ID.NO：8)和CoAraD(SEQ.ID.NO：9)(GENEART，德国)。将这些优化的基因克隆入含有甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、URA3选择标记和用于去除选择标记的重复序列(glu基因或arg基因)的表达盒中，从而构建了PGtrpfs2-CoAraA、PAHfs-CoAraB和PAHfs2-CoAraD。将这些构建的表达盒导入假丝酵母菌株中。结果，得到了热带假丝酵母PBDAU转化体、热带假丝酵母LBDAU转化体和近平滑假丝酵母EBDAU转化体，每个转化体均表达CoAraA、CoAraB和CoAraD。
本发明还提供了通过使用PBDAU、LBDAU或EBDAU转化体在以葡萄糖或甘油作为碳源的培养基中高生产率地生产木糖醇的方法。
尤其是，本发明的木糖醇生产方法优选通过以下步骤进行，但并不总限于此：
1)在含有生物质水解物和碳源的培养基中培养本发明的转化体；
2)由所培养的微生物生产木糖醇；以及
3)从培养液中分离木糖醇。
在上述方法中，步骤1)的生物质水解物优选为选自于由玉米芯水解物、甘蔗水解物、椰子副产物水解物和桦树水解物所组成的组中的一种，但并不总限于此，可使用任何含有木糖的生物质。
在上述方法中，步骤1)的碳源优选为葡萄糖或甘油，但并不总限于此，可使用任何可用于微生物培养的碳源。
为研究PBDAU、LBDAU或EBDAU的木糖醇生产率，本发明人等测定了木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇随时间的浓度(参见表4、表5、表6、表7、表8、表9和表10)。结果，证实PBDAU的木糖醇生产率为0.63g/L/h，BSXDH-3(对照)的木糖醇生产率为0.55g/L/h。所以，PBDAU的木糖醇生产率比对照BSXDH-3的生产率高15％。BSXDH-3在60h内产生了11.4g/L阿拉伯糖醇；PBDAU不产生副产物阿拉伯糖醇，而是仅产生木糖醇。关于LBDAU的木糖醇生产率，野生型菌株显示了0.51g/L/h的木糖醇生产率，而LBDAU示出了0.59g/L/h的生产率。所以，证实LBDAU的木糖醇生产率比野生型菌株的生产率高15％。野生型菌株在60h内产生了10.3g/L阿拉伯糖醇；LBDAU不产生副产物阿拉伯糖醇，而是仅产生木糖醇。关于EBDAU的木糖醇生产率，野生型菌株显示了0.44g/L/h的木糖醇生产率，而EBDAU示出了0.49g/L/h的生产率。因此，证实EBDAU的木糖醇生产率比野生型菌株的生产率高12％。野生型菌株在60h内产生了9.8g/L阿拉伯糖醇；EBDAU不产生副产物阿拉伯糖醇，而是仅产生木糖醇。此外，当在发酵罐中利用PBDAU由生物质水解物大规模生产木糖醇时，BSXDH-3的木糖醇生产率为2.16g/L/h，而PBDAU的木糖醇生产率为2.28g/L/h。BSXDH-3在72h内产生了6.4g/L阿拉伯糖醇；PBDAU根本不产生副产物阿拉伯糖醇，而是仅仅产生木糖醇。
因此，证实了本发明的导入了阿拉伯糖代谢途径的产木糖醇微生物通过抑制阿拉伯糖醇的生成，可被有效地用于高生产率地生产木糖醇。也证实了本发明所述方法通过抑制阿拉伯糖醇的生成，甚至在将生物质水解物用于大量生产木糖醇时也可用于高生产率、高浓度地生产木糖醇。
实施例
通过如下的实施例、实验实施例和制造实施例对本发明中实用的和目前优选的实施方式进行说明。
但是，将要明白的是，本领域技术人员在考虑了本发明所公开的内容后，可在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
实施例1：甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子和终止子的克隆
为了克隆热带假丝酵母的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子和终止子，使用热带假丝酵母基因组DNA和下述引物对进行PCR。结果，得到了1455bp的启动子序列(SEQ.ID.NO：1)和309bp的终止子序列(SEQ.ID.NO：2)。
启动子PCR[94℃30s，(94℃30s；55℃1min，72℃1min 30s)30个循环；72℃7min]：
PGAP-F(BglII)：5′-agatctaacgtggtatggttgtaagaaac-3′(SEQ.ID.NO：3)；以及
PGAP-R(XbaI_BamHI)：5′-ggatccgcgtctagatgtttaaattctttaattg-3′(SEQ.ID.NO：4)。
终止子PCR[94℃30s；(94℃30s，55℃1min，72℃1min)30个循环；72℃7min]：
TGAP-F(XbaI_Xho)：5′-tctagattgctcgagctatccaacaaactctag-3′(SEQ.ID.NO：5)；以及
TGAP-R(BamHI)：5′-ggatcctctggtttagaagtagggactgtatg-3′(SEQ.ID.NO：6)。
实施例2：araA、araB和araD的密码子优化
基于密码子使用数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)的数据，用热带假丝酵母的偏爱密码子替换地衣芽孢杆菌L-阿拉伯糖异构酶(araA)、大肠杆菌L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶(araD)的密码子。结果，合成了由SEQ.ID.NO：7所表示的核苷酸序列组成的CoAraA、由SEQ.ID.NO：8所表示的核苷酸序列组成的CoAraB和由SEQ.ID.NO：9所表示的核苷酸序列组成的CoAraD(GENEART，德国)。
实施例3：CoAraA表达盒、CoAraB表达盒和CoAraD表达盒及表达菌株的构建
将实施例2中合成的优化基因克隆入含有甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子和用于去除选择标记的重复序列(glu基因或arg基因)的表达盒中。结果，得到了PGtrpfs2-CoAraA，PAHfs-CoAraB和PAHfs2-CoAraD(图2)。
<3-1>木糖脱氢酶表达被抑制的转化的热带假丝酵母的构建
使用热带假丝酵母基因组DNA作为模板，用下述引物进行PCR[94℃1min；(94℃30s，58℃30s，72℃30s)25个循环；72℃3min]，以扩增热带假丝酵母木糖醇脱氢酶基因。将扩增的热带假丝酵母木糖醇脱氢酶基因克隆入pGEM-T easy载体(BIONEX，韩国)，随后在该木糖醇脱氢酶基因中部引入BamHI位点。在导入的BamHI的区域上导入ura3基因，从而制备出转化载体pXYL2-Ura3(4.7kb)。
引物F：5′-aatggtcttgggtcacgaatcc-3′(SEQ.ID.NO：10)
引物R：5′-gctctgaccaagtcgtaggcttc-3′(SEQ.ID.NO：11)
将制备的载体pXYL2-Ura3导入热带假丝酵母中，将所述热带假丝酵母涂抹在无尿嘧啶固体选择培养基[酵母氮源(无氨基酸)6.7g/L，葡萄糖20g/L和琼脂粉15g/L]上，随后在30℃培养2天。然后，将该固体培养基上形成的菌落分别接种于含有木糖的固体培养基[酵母氮源(无氨基酸)6.7g/L、木糖20g/L和琼脂粉15g/L]和含有葡萄糖的固体培养基[酵母氮源(无氨基酸)6.7g/L、葡萄糖20g/L和琼脂粉15g/L]上，随后在30℃培养2天。挑选在含有木糖的固体培养基中不能生长但在含有葡萄糖的固体培养基上可生长的菌株。结果，得到了木糖醇脱氢酶失活的热带假丝酵母。
<3-2>尿嘧啶营养缺陷型近平滑假丝酵母的构建
为使用URA3基因作为菌株构建的选择标记，用诱导突变的烷化剂甲磺酸乙酯(EMS)处理近平滑假丝酵母，从而构建出尿嘧啶营养缺陷型近平滑假丝酵母。
将近平滑假丝酵母接种于4ml YM培养基(葡萄糖20g/L，酵母提取物3g/L，麦芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，随后于30℃、150rpm下振荡培养12h。将该培养液接种入50ml YM培养基中，随后于30℃、200rpm下振荡培养12h，然后将30ml该培养液转入50ml的管中，随后用30ml基本缓冲液A(minimal A buffer)(K2HPO4 10.5g/L，KH2PO44.5g/L，(NH4)2SO4 1.0g/L和柠檬酸钠0.5g/L)漂洗两次。将得到的细胞重悬于15ml基本缓冲液A中，向其中添加450μl EMS。当于30℃、200rpm下进行振荡培养时，诱导反应90min。将该细胞用5ml基本缓冲液A漂洗两次，然后将得到的细胞重悬于1ml基本缓冲液A中。将该细胞涂抹在5-FOA固体培养基(酵母氮源6.7g/L，葡萄糖20g/L，5-FOA0.8g/L，尿嘧啶0.1g/L和琼脂粉15g/L)上，随后于30℃下培养2天。在该固体培养基上形成的菌落为URA3失活的菌株，表明构建出了尿嘧啶营养缺陷型的近平滑假丝酵母。
<3-3>由野生型热带假丝酵母构建CoAraA、CoAraB和CoAraD的表达菌株
将上述构建的PGtrpfs2-CoAraA表达盒导入野生型热带假丝酵母中，将所述热带假丝酵母涂抹在无尿嘧啶固体选择培养基(酵母氮源6.7g/L，葡萄糖20g/L和琼脂粉15g/L)上，随后于30℃下培养2天。在该固体培养基上形成的菌落是导入了所述表达盒的菌株。将所述菌落接种入4ml YM培养基(葡萄糖20g/L，酵母提取物3g/L，麦芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，随后于30℃、150rpm下振荡培养12h。然后，将该培养液涂抹在5-FOA固体培养基(酵母氮源6.7g/L，葡萄糖20g/L，5-FOA0.8g/L，尿嘧啶0.1g/L和琼脂粉15g/L)上，随后于30℃下培养2天。
在所述固体培养基上形成的菌落是导入的URA3基因被移除的菌株，然后逐步导入PAHfs-CoAraB和PAHfs2-CoAraD，从而构建出表达CoAraA、CoAraB和CoAraD的热带假丝酵母LBDAU转化体。
<3-4>由移除了木糖醇脱氢酶的热带假丝酵母构建CoAraA、CoAraB和CoAraD的表达菌株
将上述构建的PGtrpfs2-CoAraA表达盒导入木糖醇脱氢酶失活的热带假丝酵母BSXDH-3(保藏号KCTC 11137BP)中，将所述热带假丝酵母涂抹在无尿嘧啶固体选择培养基(酵母氮源6.7g/L，葡萄糖20g/L和琼脂粉15g/L)上，随后于30℃下培养2天。在该固体培养基上形成的菌落是导入了所述表达盒的菌株。将所述菌落接种入4ml YM培养基(葡萄糖20g/L，酵母提取物3g/L，麦芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，随后于30℃、150rpm下振荡培养12h。然后，将该培养液涂抹在5-FOA固体培养基(酵母氮源6.7g/L，葡萄糖20g/L，5-FOA 0.8g/L，尿嘧啶0.1g/L和琼脂粉15g/L)上，随后于30℃下培养2天。
在所述固体培养基上形成的菌落是导入的URA3基因被移除的菌株，然后逐步导入PAHfs-CoAraB和PAHfs2-CoAraD，从而构建出表达CoAraA、CoAraB和CoAraD的热带假丝酵母PBDAU转化体。
<3-5>由近平滑假丝酵母构建CoAraA、CoAraB和CoAraD的表达菌株
将上述构建的PGtrpfs2-CoAraA表达盒导入URA3失活的近平滑假丝酵母中，将所述近平滑假丝酵母涂抹在无尿嘧啶固体选择培养基(酵母氮源6.7g/L，葡萄糖20g/L和琼脂粉15g/L)上，随后于30℃下培养2天。在该固体培养基上形成的菌落是导入了所述表达盒的菌株。将所述菌落接种入4ml YM培养基(葡萄糖20g/L，酵母提取物3g/L，麦芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，随后于30℃、150rpm下振荡培养12h。然后，将该培养液涂抹在5-FOA固体培养基(酵母氮源6.7g/L，葡萄糖20g/L，5-FOA 0.8g/L，尿嘧啶0.1g/L和琼脂粉15g/L)上，随后于30℃下培养2天。
在所述固体培养基上形成的菌落是导入的URA3基因被移除的菌株，然后逐步导入PAHfs-CoAraB和PAHfs2-CoAraD，从而构建出表达CoAraA、CoAraB和CoAraD的近平滑假丝酵母EBDAU转化体。
实施例4：对导入的阿拉伯糖代谢途径的运行的证实
为证实导入实施例3中构建的热带假丝酵母PBDAU、热带假丝酵母LBDAU和近平滑假丝酵母EBDAU中的阿拉伯糖代谢途径是否可适当地运行，在阿拉伯糖基本培养基中培养所述菌株。
<4-1>对导入热带假丝酵母LBDAU中的阿拉伯糖代谢途径的运行的证实
将LBDAU接种于4ml YM培养基(葡萄糖20g/L，酵母提取物3g/L，麦芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，随后于30℃、150rpm下振荡培养12h。然后，将该培养液接种入50ml阿拉伯糖基本培养基(阿拉伯糖20g/L，酵母氮源6.7g/L和琼脂粉15g/L)中，随后于30℃、200rpm下振荡培养60h。
使用分光光度计测定OD600，通过预分析标准曲线表示所得到的值，通过所述标准曲线测定随时间的细胞干重。还测定了随时间的阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度，所述测量方法如下：离心样品，用0.2μm滤器过滤上清液。然后，用HPLC系统分析该滤液[Sugar-Pak I柱、HPLC泵、折射率检测器(Waters，美国)、流动相：水0.5ml/min、温度：90℃]。
表1 阿拉伯糖基本培养基中的细胞生长、阿拉伯糖消耗和阿拉伯糖醇生产
结果，如表1中所示，对照野生型热带假丝酵母在仅含有阿拉伯糖作为碳源的基本培养基中不能生长，因此既不消耗培养基中的阿拉伯糖、也不生成阿拉伯糖醇。另一方面，LBDAU在60h内生长出多达1.6g/L细胞干重，同时消耗了4.3g/L阿拉伯糖。其中的阿拉伯糖没有被转化为阿拉伯糖醇，而是全部用于细胞代谢。
因此，证实了导入LBDAU中的阿拉伯糖代谢途径被成功地运行。
<4-2>对导入热带假丝酵母PBDAU转化体菌株中的阿拉伯糖代谢途径的运行的证实
将PBDAU接种于4ml YM培养基(葡萄糖20g/L，酵母提取物3g/L，麦芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，随后于30℃、150rpm下振荡培养12h。然后，将该培养液接种入50ml阿拉伯糖基本培养基(阿拉伯糖20g/L，酵母氮源6.7g/L和琼脂粉15g/L)中，随后于30℃、200rpm下振荡培养60h。
使用分光光度计测定OD600，通过预分析标准曲线表示所得到的值，通过所述标准曲线测定随时间的细胞干重。还测定了随时间的阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度，所述测量方法如下：离心样品，用0.2μm滤器过滤上清液。然后用HPLC系统分析所述滤液[Sugar-Pak I柱、HPLC泵、折射率检测器(Waters，美国)、流动相：水0.5ml/min、温度：90℃]。随时间的细胞干重、阿拉伯糖消耗和阿拉伯糖醇生产如下。
表2 阿拉伯糖基本培养基中的细胞生长、阿拉伯糖消耗和阿拉伯糖醇生产
结果，如表2中所示，对照BSXDH-3在仅含有阿拉伯糖作为碳源的基本培养基中不能生长，因此既不消耗培养基中的阿拉伯糖、也不生成阿拉伯糖醇。另一方面，PBDAU在60h内生长出多达2.1g/L细胞干重，同时消耗5.4g/L阿拉伯糖。培养基中的阿拉伯糖没有被转化为阿拉伯糖醇，而是全部用于细胞代谢。
因此，证实了导入PBDAU中的阿拉伯糖代谢途径被成功地运行。
<4-3>对导入近平滑假丝酵母EBDAU中的阿拉伯糖代谢途径的运行的证实
将EBDAU接种于4ml YM培养基(葡萄糖20g/L，酵母提取物3g/L，麦芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，随后于30℃、150rpm下振荡培养12h。然后，将该培养液接种入50ml阿拉伯糖基本培养基(阿拉伯糖20g/L，酵母氮源6.7g/L和琼脂粉15g/L)中，随后于30℃、200rpm下振荡培养60h。
使用分光光度计测定OD600，通过预分析标准曲线表示所得到的值，通过所述标准曲线测定随时间的细胞干重。还测定了随时间的阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度，所述测量方法如下。离心样品，用0.2μm滤器过滤上清液。然后用HPLC系统分析所述滤液[Sugar-Pak I柱、HPLC泵、折射率检测器(Waters，美国)、流动相：水0.5ml/min、温度：90℃]。随时间的细胞干重、阿拉伯糖消耗和阿拉伯糖醇生产如下。
表3 阿拉伯糖基本培养基中的细胞生长、阿拉伯糖消耗和阿拉伯糖醇生产
结果，如表3中所示，对照野生型近平滑假丝酵母在仅含有阿拉伯糖作为碳源的基本培养基中不能生长，因此既不消耗培养基中的阿拉伯糖、也不生成阿拉伯糖醇。另一方面，EBDAU在60h内生长出多达1.4g/L细胞干重，同时消耗4.1g/L阿拉伯糖。培养基中的阿拉伯糖没有被转化为阿拉伯糖醇，而是全部用于细胞代谢。
因此，证实了导入EBDAU中的阿拉伯糖代谢途径被成功地运行。
实施例5：通过使用转化体生产木糖醇
<5-1>使用PBDAU转化体和作为辅助底物的葡萄糖生产木糖醇
将构建的PBDAU转化体接种入4ml YM培养基(葡萄糖20g/L、酵母提取物3g/L、麦芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，随后于30℃、150rpm下振荡培养12h。然后，将该培养液接种入50ml含有木糖、阿拉伯糖和葡萄糖的生产培养基(木糖30g/L、阿拉伯糖30g/L、葡萄糖20g/L、酵母提取物10g/L、KH2PO4 5g/L和MgSO4·7H2O 0.2g/L)中，随后于30℃、200rpm下振荡培养60h。在培养开始14h、20h、26h和32h后，向其中添加浓度为2.5g/L的葡萄糖。
测定随时间的木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度，所述测量方法如下：离心样品，用0.2μm滤器过滤上清液。然后用HPLC系统分析所述滤液[Sugar-Pak I柱、HPLC泵、折射率检测器(Waters，美国)、流动相：水0.5ml/min、温度：90℃]。随时间的木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度如下。
表4 随时间的木糖醇和阿拉伯糖醇的浓度
结果，BSXDH-3的木糖醇生产率为0.55g/L/h，PBDAU的木糖醇生产率为0.63g/L/h，表明PBDAU显示出比对照BSXDH-3高15％的木糖醇生产率。与此同时，BSXDH-3在60h内生产了11.4g/L阿拉伯糖醇，而PBDAU仅生产木糖醇，不生产副产物阿拉伯糖醇。
因此，证实了使用本发明的PBDAU生产木糖醇的方法通过抑制妨碍木糖醇纯化和结晶的阿拉伯糖醇的生成，显著地提高了木糖醇生产产率。
<5-2>使用PBDAU转化体和作为辅助底物的甘油生产木糖醇
将构建的PBDAU转化体接种于4ml YM培养基(葡萄糖20g/L、酵母提取物3g/L、麦芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，随后于30℃、150rpm下振荡培养12h。然后，将该培养液接种入50ml含有木糖、阿拉伯糖和甘油的生产培养基(木糖30g/L、阿拉伯糖30g/L、甘油20g/L、酵母提取物10g/L、KH2PO4 5g/L和MgSO4·7H2O 0.2g/L)中，随后于30℃、200rpm下振荡培养42h。
测定随时间的木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度，所述测量方法如下：离心样品，用0.2μm滤器过滤上清液。然后用HPLC系统分析所述滤液[Sugar-Pak I柱、HPLC泵、折射率检测器(Waters，美国)、流动相：水0.5ml/min、温度：90℃]。随时间的木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度如下。
表5 随时间的木糖醇和阿拉伯糖醇的浓度
结果，BSXDH-3的木糖醇生产率为0.65g/L/h，PBDAU的木糖醇生产率为0.74g/L/h，表明PBDAU显示出比对照BSXDH-3高14％的木糖醇生产率。与此同时，BSXDH-3在42h内生产了6.4g/L阿拉伯糖醇，而PBDAU仅生产木糖醇，不生产副产物阿拉伯糖醇。
因此，证实了使用本发明的PBDAU生产木糖醇的方法通过抑制妨碍木糖醇纯化和结晶的阿拉伯糖醇的生成，显著地提高了木糖醇生产产率。
<5-3>使用LBDAU转化体和作为辅助底物的葡萄糖生产木糖醇
将构建的LBDAU转化体接种于4ml YM培养基(葡萄糖20g/L、酵母提取物3g/L、麦芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，随后于30℃、150rpm下振荡培养12h。然后，将该培养液接种入50ml含有木糖、阿拉伯糖和葡萄糖的生产培养基(木糖30g/L、阿拉伯糖30g/L、葡萄糖20g/L、酵母提取物10g/L、KH2PO4 5g/L和MgSO4·7H2O 0.2g/L)中，随后于30℃、200rpm下振荡培养60h。在培养开始14h、20h、26h和32h后，向其中添加浓度为2.5g/L的葡萄糖。
测定随时间的木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度，所述测量方法如下：离心样品，用0.2μm滤器过滤上清液。然后用HPLC系统分析所述滤液[Sugar-Pak I柱、HPLC泵、折射率检测器(Waters，美国)、流动相：水0.5ml/min、温度：90℃]。随时间的木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度如下。
表6 随时间的木糖醇和阿拉伯糖醇的浓度
结果，野生型菌株的木糖醇生产率为0.51g/L/h，LBDAU的木糖醇生产率为0.59g/L/h，表明LBDAU显示出比野生型菌株高15％的木糖醇生产率。与此同时，野生型菌株在60h内生产了10.3g/L阿拉伯糖醇，而LBDAU仅生产木糖醇，不生产副产物阿拉伯糖醇。
<5-4>通过使用LBDAU转化体和作为辅助底物的甘油生产木糖醇
将构建的LBDAU转化体接种于4ml YM培养基(葡萄糖20g/L、酵母提取物3g/L、麦芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，随后于30℃、150rpm下振荡培养12h。然后，将该培养液接种入50ml含有木糖、阿拉伯糖和甘油的生产培养基(木糖30g/L、阿拉伯糖30g/L、甘油20g/L、酵母提取物10g/L、KH2PO4 5g/L和MgSO4·7H2O 0.2g/L)中，随后于30℃、200rpm下振荡培养42h。
测定随时间的木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度，所述测量方法如下：离心样品，用0.2μm滤器过滤上清液。然后用HPLC系统分析所述滤液[Sugar-Pak I柱、HPLC泵、折射率检测器(Waters，美国)、流动相：水0.5ml/min、温度：90℃]。随时间的木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度如下。
表7 随时间的木糖醇和阿拉伯糖醇的浓度
结果，野生型菌株的木糖醇生产率为0.58g/L/h，LBDAU的木糖醇生产率为0.63g/L/h，表明LBDAU显示出比对照野生型菌株高10％的木糖醇生产率。与此同时，野生型菌株在42h内生产了6.7g/L阿拉伯糖醇，而LBDAU仅生产木糖醇，不生产副产物阿拉伯糖醇。
<5-5>使用EBDAU转化体和作为辅助底物的葡萄糖生产木糖醇
将构建的EBDAU转化体接种于4ml YM培养基(葡萄糖20g/L、酵母提取物3g/L、麦芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，随后于30℃、150rpm下振荡培养12h。然后，将该培养液接种入50ml含有木糖、阿拉伯糖和葡萄糖的生产培养基(木糖30g/L、阿拉伯糖30g/L、葡萄糖20g/L、酵母提取物10g/L、KH2PO4 5g/L和MgSO4·7H2O 0.2g/L)中，随后于30℃、200rpm下振荡培养60h。在开始培养14h、20h、26h和32h后，向其中添加浓度为2.5g/L的葡萄糖。
测定随时间的木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度，所述测量方法如下。离心样品，用0.2μm滤器过滤上清液。然后用HPLC系统分析所述滤液[Sugar-Pak I柱、HPLC泵、折射率检测器(Waters，美国)、流动相：水0.5ml/min、温度：90℃]。随时间的木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度如下。
表8 随时间的木糖醇和阿拉伯糖醇的浓度
结果，野生型菌株的木糖醇生产率为0.44g/L/h，EBDAU的木糖醇生产率为0.49g/L/h，表明EBDAU显示出比野生型菌株高12％的木糖醇生产率。与此同时，野生型菌株在60h内生产了9.8g/L阿拉伯糖醇，而EBDAU仅生产木糖醇，不生产副产物阿拉伯糖醇。
因此，证实了使用本发明的EBDAU生产木糖醇的方法通过抑制妨碍木糖醇纯化和结晶的阿拉伯糖醇的生成，显著地提高了木糖醇生产产率。
<5-6>使用EBDAU转化体和作为辅助底物的甘油生产木糖醇
将构建的EBDAU转化体接种入4ml YM培养基(葡萄糖20g/L、酵母提取物3g/L、麦芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，随后于30℃、150rpm下振荡培养12h。然后，将该培养液接种入50ml含有木糖、阿拉伯糖和甘油的生产培养基(木糖30g/L、阿拉伯糖30g/L、甘油20g/L、酵母提取物10g/L、KH2PO4 5g/L和MgSO4·7H2O 0.2g/L)中，随后于30℃、200rpm下振荡培养42h。
测定随时间的木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度，所述测量方法如下：离心样品，用0.2μm滤器过滤上清液。然后用HPLC系统分析所述滤液[Sugar-Pak I柱、HPLC泵、折射率检测器(Waters，美国)、流动相：水0.5ml/min、温度：90℃]。随时间的木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度如下。
表9 随时间的木糖醇和阿拉伯糖醇的浓度
结果，野生型菌株的木糖醇生产率为0.49g/L/h，EBDAU的木糖醇生产率为0.56g/L/h，表明EBDAU显示出比野生型菌株高13％的木糖醇生产率。与此同时，野生型菌株在42h内生产了5.2g/L阿拉伯糖醇，而EBDAU仅生产木糖醇，不生产副产物阿拉伯糖醇。
因此，证实了使用本发明的EBDAU生产木糖醇的方法通过抑制妨碍木糖醇纯化和结晶的阿拉伯糖醇的生成，显著地提高了木糖醇生产产率。
实施例6：使用PBDAU转化体和生物质水解物大量生产木糖醇
为使用所述转化体大规模生产木糖醇，将玉米芯水解物(木糖82.9％，阿拉伯糖11.4％，葡萄糖5.7％)用作底物并将甘油用作辅助底物。玉米芯、甘蔗茎秆、椰子副产物和桦树生物质富含由木糖、阿拉伯糖和葡萄糖构成的半纤维素。尤其是，木糖含量特别高。因此，所述生物质水解物可直接用于生产木糖醇。
将构建的PBDAU转化体接种入50ml YM培养基(葡萄糖20g/L、酵母提取物3g/L、麦芽提取物3g/L和蛋白胨5g/L)中，随后于30℃、200rpm下振荡培养12h。然后，将该培养液接种入含有利用生物质水解物制备的1L木糖醇生产培养基(木糖50g/L、葡萄糖3.5g/L、阿拉伯糖6.9g/L、甘油15g/L、酵母提取物10g/L、KH2PO4 5g/L和MgSO4·7H2O0.2g/L)的发酵罐中，随后振荡培养(30℃，pH 4.0，500-800rpm)。从培养开始12h后，将料液(feeding solution)(木糖503g/L，葡萄糖34.7g/L，阿拉伯糖69.2g/L和甘油150g/L)添加到所述培养基中以将木糖浓度调节至100g/L以下，随后补料分批培养(fed-batch culture)72h。
通过使用分光光度计测定OD600，通过预分析标准曲线表示所得到的值，通过所述标准曲线测定随时间的细胞干重。还测定了随时间的木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度，所述测量方法如下。离心样品，用0.2μm滤器过滤上清液。然后，用HPLC系统分析所述滤液[Sugar-PakI柱、HPLC泵、折射率检测器(Waters，美国)、流动相：水0.5ml/min、温度：90℃]。随时间的木糖、木糖醇、阿拉伯糖和阿拉伯糖醇的浓度及细胞干重如下。
表10 随时间的木糖醇和阿拉伯糖醇的浓度
结果，BSXDH-3的木糖醇生产率为2.16g/L/h，PBDAU的木糖醇生产率为2.28g/L/h，表明PBDAU显示出比对照BSXDH-3高5.6％的木糖醇生产率。与此同时，BSXDH-3在72h内生产了6.4g/L阿拉伯糖醇，而PBDAU仅生产木糖醇，不生产副产物阿拉伯糖醇。
因此，在使用真正的生物质水解物大量生产木糖醇期间，证实了本发明的PBDAU菌株高浓度、高生产率地生产木糖醇，而不生产副产物阿拉伯糖醇。
本领域技术人员将明白，在前述说明书中公开的构思和具体实施方式可容易地被用作修改或设计用于实现本发明相同目的的其他实施方式的基础。本领域技术人员也将明白，这些等同的实施方式并未脱离所附权利要求书中阐明的本发明的范围和精神。

Claims (13)

1.阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物，通过向假丝酵母(Candida sp.)菌株中导入含有阿拉伯糖代谢途径相关基因的基因表达盒制备所述产木糖醇微生物，
其中，所述产木糖醇微生物包含下述1)-3)的基因表达盒：
1)含有启动子、编码L-阿拉伯糖异构酶的多核苷酸和终止子的基因表达盒，其中，所述编码L-阿拉伯糖异构酶的多核苷酸如SEQ.ID.NO：7所示，所述启动子可操作地连接至所述多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至所述终止子；
2)含有启动子、编码L-核酮糖激酶的多核苷酸和终止子的基因表达盒，其中，所述编码L-核酮糖激酶的多核苷酸如SEQ.ID.NO：8所示，所述启动子可操作地连接至所述多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至所述终止子；以及
3)含有启动子、编码L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶的多核苷酸和终止子的基因表达盒，其中，所述编码L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶的多核苷酸如SEQ.ID.NO：9所示，所述启动子可操作地连接至所述多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至所述终止子。
2.如权利要求1所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物，其中，所述假丝酵母菌株选自于由季也蒙假丝酵母(C.guillermondi)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)和热带假丝酵母(C.tropicalis)所组成的组。
3.如权利要求1所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物，其中，所述假丝酵母菌株为木糖醇脱氢酶失活的热带假丝酵母。
4.如权利要求1所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物，其中，所述产木糖醇微生物为以保藏号KCTC 11761BP保藏的微生物。
5.如权利要求3所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物，其中，所述热带假丝酵母为以保藏号KCTC 11137BP保藏的热带假丝酵母。
6.一种用于生产如权利要求1所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物的方法，所述方法包括将下述1)-3)的基因表达盒导入假丝酵母菌株中的步骤：
1)含有启动子、编码L-阿拉伯糖异构酶的多核苷酸和终止子的基因表达盒，其中，所述编码L-阿拉伯糖异构酶的多核苷酸如SEQ.ID.NO：7所示，所述启动子可操作地连接至所述多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至所述终止子；
2)含有启动子、编码L-核酮糖激酶的多核苷酸和终止子的基因表达盒，其中，所述编码L-核酮糖激酶的多核苷酸如SEQ.ID.NO：8所示，所述启动子可操作地连接至所述多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至所述终止子；以及
3)含有启动子、编码L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶的多核苷酸和终止子的基因表达盒，其中，所述编码L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶的多核苷酸如SEQ.ID.NO：9所示，所述启动子可操作地连接至所述多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至所述终止子。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述假丝酵母菌株选自于由季也蒙假丝酵母、近平滑假丝酵母和热带假丝酵母所组成的组。
8.如权利要求6所述的方法，其中，所述假丝酵母菌株为木糖醇脱氢酶失活的热带假丝酵母。
9.如权利要求6所述的方法，其中，所述产木糖醇微生物为以保藏号KCTC 11761BP保藏的微生物。
10.如权利要求8所述的方法，其中，所述热带假丝酵母为以保藏号KCTC 11137BP保藏的热带假丝酵母。
11.大量生产木糖醇的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在含有生物质水解物和碳源的培养基中培养如权利要求1所述的阿拉伯糖醇生成被抑制的产木糖醇微生物；
2)由所培养的微生物生产木糖醇；以及
3)从培养液中分离木糖醇。
12.如权利要求11所述的大量生产木糖醇的方法，其中，步骤1)的所述生物质水解物选自于由玉米芯水解物、甘蔗水解物、椰子副产物水解物和桦树水解物所组成的组。
13.如权利要求11所述的大量生产木糖醇的方法，其中，步骤1)的所述碳源选自于由葡萄糖、甘油、糖蜜、玉米淀粉水解物、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、纤维二糖及它们的混合物所组成的组。
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