CN105062908A - 一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌及其应用 - Google Patents

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陈献忠
张利华
陈振
王均华
强书敏
沈微
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本发明公开了一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌及其应用，属于食品甜味剂生物制造技术领域。本发明通过删除木糖醇脱氢酶基因，从根本上阻止木糖醇脱氢酶基因的表达，阻断木糖醇的代谢途径，从而达到木糖醇的累积，显著提升了木糖醇的转化率。本发明所提供的热带假丝酵母工程菌，在以含有木糖、葡萄糖或甘油或阿拉伯糖等混合碳源的发酵培养基中能够将木糖高效转化为木糖醇，转化率达到95％以上。

Description

一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种高产木糖醇的热带假丝酵母基因工程菌及其应用，属于食品甜味剂生物制造技术领域。
背景技术
木糖醇(Xylitol)，也称戊五醇，是一种五碳多羟基糖醇，化学分子式C5H12O5，外形为结晶性粉末或白色晶体，极易溶于水，微甜与蔗糖相当，微溶于甲醇和乙醇，热稳定性好。木糖醇不需要胰岛素的参与就可以在人体中代谢，不会造成人体血糖的急剧变化，因此可以作为糖尿病人专用食品的甜味剂，并已经广泛应用于口香糖、胶姆糖、太妃糖、软糖、巧克力、果冻、冷饮、口含片、漱口剂、润喉药物、止咳糖浆等食品、日化及医药工业；木糖醇还在卷烟、蓄电池、表面活性剂等方面有许多重要的应用。木糖醇的安全性高，是动物正常代谢的中间产物，人体每天代谢产生5-15g木糖醇。在自然界中，木糖醇也广泛存在于多种果蔬，但含量很少，通常少于900mg/100g。
目前木糖醇生产主要采用化学合成法：将农业植物纤维废料(如玉米芯、棉籽壳、蔗糖渣)水解得到木糖，在高温高压条件下，镍催化剂催化加氢使木糖还原成木糖醇。该方法要求木糖纯度高(95％以上)，生产成本高，设备要求高，副产物成分复杂，环境污染较大。
热带假丝酵母菌可转化木糖生成木糖醇，该生化过程的原料木糖无需纯化设备，反应条件温和，无需耐高压设备，这种绿色、清洁生产技术成为近年研究开发的热点。目前利用热带假丝酵母生产木糖醇最大的缺点是转化率不高，一般以木糖为原料用微生物转化法的木糖醇转化率为65％-85％。国内已有在其内通过增加辅酶基因的拷贝数的方法从而增加木糖醇产量的方法，但效果并不是很理想。
发明内容
本发明提供了首先一株高产木糖醇的热带假丝酵母工程菌，是敲除了热带假丝酵母基因组上的木糖醇脱氢酶的编码基因XYL2，得到XYL2两条等位基因均缺失的热带假丝酵母工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述木糖醇脱氢酶的编码基因XYL2的核苷酸序列如GenBankDQ201637.1所示。
本发明还提供一种构建所述热带假丝酵母工程菌的方法，是以热带假丝酵母的URA3基因作为选择标记，通过同源重组的方式实现XYL2基因的敲除，并且通过5-氟乳清酸(5-FOA)实现URA3基因的弹出和重复利用。
本发明还提供了一种利用上述热带假丝酵母工程菌生产木糖醇的方法，是以含有木糖的发酵培养基，接种所述热带假丝酵母工程菌，进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，是以木糖、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨为组分配制发酵培养基，接种所述热带假丝酵母工程菌，进行好氧发酵。
在本发明的一种实施方式中，是以秸秆原料进行酸水解或酶水解，所得木质纤维素水解液作为发酵培养基，接种所述热带假丝酵母工程菌，进行好氧发酵。
在本发明的一种实施方式中，是以木糖母液为基质配制发酵培养基，接种所述热带假丝酵母工程菌，进行好氧发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基是含有木糖母液200g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO45g/L的培养基；所述木糖母液含有木糖2g/L、葡萄糖0.4g/L。
本发明通过删除木糖醇脱氢酶基因，从根本上阻止木糖醇脱氢酶基因的表达，阻断木糖醇的代谢途径，从而达到木糖醇的累积，显著提升了木糖醇的转化率。本发明所提供的热带假丝酵母工程菌，在以含有木糖、葡萄糖或甘油或阿拉伯糖等混合碳源的发酵培养基中能够将木糖高效转化为木糖醇，转化率达到95％以上。同时，热带假丝酵母工程菌能够利用其余种类碳源生长，细胞生长速度较快。该发明为微生物发酵法生产木糖醇提供了一种有益的方法。
附图说明
图1为木糖醇脱氢酶基因PCR产物和重组质粒pMD19T-XYL2酶切产物电泳图
图2重组质粒pMD19T-XYL2反向PCR产物电泳图
具体实施方式
实施例1构建热带假丝酵母基因工程菌
根据XYL2基因序列设计引物UXYL2:TAAATAGAACCCACGAATCCCT和DXYL2:TTTACTCGTACTATGCACTCC，通过PCR技术从热带假丝酵母DNA模板中扩增XYL2基因，连接到pMD19TSimplevector(大连宝公司)，获得重组质粒pMD-XYL2，酶切电泳结果如图1所示。以该重组质粒为模板，利用引物r1U:AACTGCAGAGTAGTGAATATCGGAACCACA和r1D:GCTCTAGAAACTTCCCAATTTCCGACT进行反向PCR扩增获得含有同源臂的目的载体UDXYL2-Ts-UDXYL2，电泳结果如图2所示。将序列如SEQIDNO.3所示的hisG-URA3-hisG片段，与UDXYL2-Ts-UDXYL2通过PstI、XbaI双酶切位点连接后转化大肠杆菌感受态细胞，获得重组质粒Ts-X1HUHX1，以该质粒为模板，利用引物UXYL2和DXYL2进行PCR扩增获得DNA片段。该PCR产物转化热带假丝酵母XZX，在基本培养基中筛选转化子，经PCR鉴定和测序获得第一条XYL2基因缺失的突变株XZX-1。
将突变株XZX-1涂布于含有5-FOA的完全培养基中，长出的单菌落细胞提取基因组，PCR鉴定得到URA3基因弹出的突变株，命名为XZX-2。
以UXYL2和DXYL2为引物，Ts-X1HUHX1质粒为模板，进行PCR扩增获得DNA片段，该PCR产物转化热带假丝酵母XZX-2，在基本培养基中筛选转化子，经PCR鉴定和测序获得第二条XYL2基因缺失的突变株XZX-3。
将突变株XZX-3涂布于含有5-FOA的完全培养基中，长出的单菌落细胞提取基因组，PCR鉴定得到URA3基因弹出的突变株，命名为XZX-4。该菌株即为XYL2两条等位基因均删除的热带假丝酵母基因工程菌。
实施例2热带假丝酵母基因工程菌发酵生产木糖醇
种子培养基：YPD培养基发酵培养基组成：木糖50g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，KH2PO45g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L。
以YPD培养基作为种子培养基，以5％接种量接种装有50mL发酵培养基的250mL摇瓶，30℃，200rpm发酵培养72h，HPLC鉴定发酵液上清中葡萄糖、木糖和木糖醇的含量。原始菌株XZX生长过程中几乎用尽所有的木糖，木糖醇产量只有14.03g/L，实际转化率只有28.06％。XYL2双拷贝缺失的热带假丝酵母基因工程菌株XZX-4的木糖醇产量达到42.72g/L，木糖实际转化率达到99％
实施例3热带假丝酵母基因工程菌利用木糖母液生产木糖醇
种子培养基：YPD培养基发酵培养基组成：木糖母液(木糖280g/L、葡萄糖85g/L)200g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO45g/L。
以YPD培养基作为种子培养基，以5％接种量接种装有50mL发酵培养基的250mL摇瓶，30℃，200rpm发酵培养96h，HPLC鉴定发酵液上清中葡萄糖、木糖和木糖醇的含量。原始菌株XZX生长过程中几乎用尽所有的木糖，木糖醇产量只有11.2g/L，实际转化率只有28.7％。XYL2双拷贝缺失的热带假丝酵母基因工程菌株XZX-4的木糖醇产量达到34.5g/L，木糖实际转化率达到95％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一株生产木糖醇的热带假丝酵母工程菌，其特征在于，敲除了热带假丝酵母基因组上编码木糖醇脱氢酶的2条等位基因。
2.根据权利要求1所述的热带假丝酵母工程菌，其特征在于，编码所述木糖醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如GenBankDQ201637所示。
3.根据权利要求1-2任一所述的热带假丝酵母工程菌，其特征在于，以热带假丝酵母的URA3基因作为选择标记通过同源重组的方式实现XYL2基因的删除；通过5-氟乳清酸实现URA3基因的弹出和重复利用。
4.构建权利要求1-2任一所述的热带假丝酵母工程菌的方法，其特征在于，以热带假丝酵母的URA3基因作为选择标记通过同源重组的方式实现XYL2基因的删除；通过5-氟乳清酸实现URA3基因的弹出和重复利用。
5.一种应用权利要求1-2任一所述热带假丝酵母工程菌生产木糖醇的方法。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，是以木糖和葡萄糖作为底物配制发酵培养基，接种所述热带假丝酵母工程菌，生产木糖醇。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，是以木质纤维素水解液作为发酵培养基，接种所述热带假丝酵母工程菌，生产木糖醇。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，是以木糖母液为底物配制的发酵培养基，接种所述热带假丝酵母工程菌，生产木糖醇。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基是含有木糖母液200g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO45g/L的培养基；所述木糖母液含有木糖2g/L、葡萄糖0.4g/L。
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