CN101880643B - 氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，该细菌是缺失s-ArDH基因的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。本发明还公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，该细菌是缺失s-ArDH基因，且在s-ArDH基因的位置上用XDH基因增强的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。本发明同时公开了上述两种基因工程菌的构建方法。本发明的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌可以阻断生物法转化D-阿拉伯糖醇制备木糖醇过程中木酮糖逆反应生成D-阿拉伯糖醇，进而从根本上解决木糖醇生产过程中副产物伴生的问题，此外，XDH增强菌株提高了木糖醇脱氢酶活力，提高了木糖醇的转化率。

Description

氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其构建方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其构建方法。
背景技术
木糖醇为天然的五碳糖醇，是重要的功能性食品添加剂之一。木糖醇的甜度是蔗糖的1.05倍，热量与蔗糖相当，其代谢不需要胰岛素，可替代蔗糖作为糖尿病患者食用的甜味剂。木糖醇不被细菌发酵，用在口香糖中作为甜味剂，具有维持口腔酸碱平衡、预防龋齿的功能。有研究表明，木糖醇可阻止细菌与人体细胞的结合，预防呼吸道感染；木糖醇还有促进肠道对钙质的吸收，减少骨质流失，维持正常骨密度以及降低肝脏转氨酶等作用。随着人们对健康重视程度的增加，木糖醇的需求量将会越来越高。
目前木糖醇生产方法主要为化学法即采用玉米芯、甘蔗渣等富含聚戊糖(含36～40％的多缩戊糖)的原料，经酸水解成含木糖的糖液，然后经中和、脱色、离子交换、结晶等复杂的净化过程从水解液中分离纯化出木糖，接着化学加氢使木糖生成木糖醇。化学法制备木糖醇存在两大共同问题：(1)资源和环境污染问题严重。研究表明生产1吨木糖醇，会产生6吨酸性玉米芯残渣，而处理这些残渣则需要2吨煤。由于环保问题难以解决，2005年，全球最大的食品添加剂公司-丹尼斯克关闭了一条1万吨/年木糖醇的生产线。(2)原料价格走高，并存在潜在的原料短缺风险。由于近年来我国玉米芯大量用于生产木糖醇、糠醛和食用菌，原料问题已经凸现，这样导致木糖醇的生产成本增加。
为了解决木糖醇生产中的资源和环境问题，许多人致力于开发一种采用来源广泛、价格低廉的淀粉或葡萄糖为原料来生产木糖醇。如Onishi和Suzuki报道了一种从葡萄糖出发制备木糖醇的方法，首先通过高渗酵母D.hansenii将葡萄糖转化为D-阿拉伯糖醇(D-arabitol，D-ara)，然后在Acetobacter suboxydans的作用下氧化为D-木酮糖，最后D-木酮糖在酵母C.guilliermondii作用下还原为木糖醇。如日本味之素株式会社Suzuki等选育到一株将阿拉伯糖醇一步高效生物转化为木糖醇的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)，将木糖醇生物合成路线简化为两菌两步法，第一步利用酵母菌发酵葡萄糖高效制备D-阿拉伯糖醇，第二步由该菌高效转化D-阿拉伯糖醇制备木糖醇，工艺路线如下：
Figure BSA00000146340900021
其中，第二步氧化葡萄糖酸杆菌催化D-阿拉伯糖醇产木糖醇的合成途径如下：
Figure BSA00000146340900022
以上这些方法所提及的生产菌中主产物的转化率较低，满足不了工业化生产的要求。
我们也开发了一种两步法生物转化葡萄糖制备木糖醇的工艺，即第一步利用Kodamaea ohmeri NH-9发酵葡萄糖高效制备D-阿拉伯糖醇，第二步由Gluconobacteroxydans NH-10(CGMCC No.2709)转化D-阿拉伯糖醇产木糖醇。在我们前期工作中发现CGMCC No.2709中存在两种D-阿拉伯糖醇脱氢酶(D-Arabitol dehydrogenase，ArDH)，即膜结合PQQ-依赖型D-阿拉伯糖醇脱氢酶(Membrane-bound PQQ-dependent D-arabitoldehydrogenase，m-ArDH)和可溶性NADP-依赖型D-阿拉伯糖醇脱氢酶(SolubleNADP-dependent D-arabitol dehydrogenase，s-ArDH)。由于s-ArDH的存在，在还原过程中，s-ArDH可将D-木酮糖(D-xylulose)还原为D-阿拉伯糖醇，这不仅影响木糖醇的产率，而且不利于下游产品的分离。此外，该菌中的木糖醇脱氢酶(Xylitol dehydrogenase，XDH)活力相对较低，成为生物法转化葡萄糖产木糖醇工艺的瓶颈。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株高产木糖醇的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，该细菌是缺失NADP-阿拉伯糖醇脱氢酶(s-ArDH)基因的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)，以下简称s-ArDH缺失菌。
上述s-ArDH缺失菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)引物设计：
根据GenBank公布的Gluconobacter oxydans 621H基因s-ardh序列为基础设计两对特异引物，引物如下所示：
s-ardh L-fwd：5’-TATGAATTCCCTCTTGAAAACCTATCATAGC-3’EcoR I，
s-ardh L-rev：5’-CTGTTTATGTAAGCCTCGAGAAACTTGAAGTCC-3’Xho I，
s-ardh R-fwd：5’-AATAAACAAATAGCTCGAGAAAATGGCCGGGAAG-3’Xho I，
s-ardh R-rev：5’-ATGAATTCATGGCGACTGTCGAACTCAAG-3’EcoR I。
s-ardh L-fwd和s-ardh R-rev引物两端加同样的限制性酶切位点EcoR I及保护碱基。s-ardh L-rev和s-ardh R-fwd引物两端加同样的限制性酶切位点Xho I，下划线部分均为酶切位点。
(2)s-ardh L、s-ardh R基因的克隆：
通过PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因组DNA为模板，分别扩增s-ardhL和s-ardh R各800bp左右序列。
s-ardh L基因克隆的方法为：采用PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因组DNA为模板，用引物s-ardh L-fwd、s-ardh L-rev进行PCR扩增；PCR反应条件为：10×PCRbuffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 5μL，引物s-ardh L-fwd和s-ardh L-rev各2μL，exTaq DNApolymerase 1μL，基因组模板1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL；PCR程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60.5℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min，以双蒸水为阴性对照。
s-ardh R基因克隆的方法为：采用PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因组DNA为模板，用引物s-ardh R-fwd、s-ardh R-rev进行PCR扩增；PCR反应条件为：10×PCRbuffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 5μL，引物s-ardh R-fwd和s-ardh R-rev各2μL，exTaq DNApolymerase 1μL，基因组模板1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL；PCR程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min，以双蒸水为阴性对照。
(3)抗性片段Km的获得：
根据GenBank公布的卡纳霉素抗性基因Km序列，设计一对特异性引物km-fwd和km-rev，以pET28a(+)质粒为模板扩增Km的完整CDs，引物如下：
km-fwd：5’-GGACTTCAAGTTTCTCGAGGCTTACATAAACAG-3’Xho I，
km-rev：5’-CTTCCCGGCCATTTTCTCGAGCTATTTGTTTATT-3’Xho I，
km-fwd和km-rev引物两端加同样的限制性酶切位点Xho I及保护碱基，下划线部分均为酶切位点，扩增出900bp左右序列。
Km的获得方法为：采用PCR技术，以pET28a(+)质粒为模板，用引物km-fwd、km-rev进行PCR扩增；PCR反应条件为：10×PCR buffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 5μL，引物km-fwd和km-rev各2μL，exTaq DNA polymerase 1μL，基因组模板1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL；PCR程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，61.5℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min，以双蒸水为阴性对照。
将s-ardh L、s-ardh R和Km分别胶回收纯化备用。
(4)pMD18-KR的构建：
将纯化的s-ardh R和Km片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为1700bp左右的片段KR，与pMD18-T载体连接，转化至感受态E.coli JM109中，通过含Amp和Km抗性平板筛选获得含目标基因的重组质粒pMD18-KR。
片段KR的基因克隆方法为：采用PCR技术，以s-ardh R和Km片段为模板，用引物km-fwd、s-ardh R-rev进行重叠PCR扩增；PCR反应分两步扩增；
第一步体系如下：10×PCR buffer 2.5μL，Mg2+2μL，dNTP 2μL，s-ardh R片段和Km片段各2μL，exTaq DNA polymerase 0.5μL，加ddH2O至反应总体积为25μL；扩增程序如下：95℃预变性4min；94℃变性55s，65℃退火40s，72℃延伸1min，循环5次；72℃延长2min；
第二步在第一步PCR产物中加入：10×PCR buffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 4μL，引物km-fwd和引物s-ardh R-rev各2μL，exTaq DNA polymerase 1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL；扩增程序如下：95℃预变性4min；94℃变性50s，60℃退火40s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min。
(5)pMD18-LKR的构建：
将s-ardh L和KR片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为2500bp左右的片段LKR，与pMD18-T载体连接，转化至感受态E.coli JM109中，通过含Amp和Km的LB平板筛选获得含目标基因的重组质粒pMD18-LKR。
片段LKR的基因克隆方法为：采用PCR技术，以s-ardh L和KR片段为模板，用引物s-ardh L-fwd、s-ardh R-rev进行重叠PCR扩增，PCR反应分两步扩增；
第一步体系如下：10×PCR buffer 2.5μL，Mg2+2μL，dNTP 2μL，s-ardh L片段和KR片段各2μL，exTaq DNA polymerase 0.5μL，加ddH2O至反应总体积为25μL；扩增程序如下：95℃预变性4min；94℃变性55s，65℃退火40s，72℃延伸1min，循环5次；72℃延长2min；
第二步在第一步PCR产物中加入：10×PCR buffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 4μL，引物s-ardh L-fwd和引物s-ardh R-rev各2μL，exTaq DNA polymerase 1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL；扩增程序如下：95℃预变性4min；94℃变性50s，59℃退火40s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min。
(6)s-ardh基因敲除载体pSUP202-s-ardh::Km的构建：
将重组质粒pMD18-LKR用EcoR I酶切；载体pSUP202用EcoR I酶切后用CIAP去磷酸化；将酶切后的LKR片段和去磷酸化后的载体pSUP202用T4连接酶连接，转化至感受态E.coli JM109中，通过含Amp和Km的LB平板筛选获得含目标基因的重组质粒pSUP202-s-ardh::Km。
(7)s-ardh基因敲除突变体G.oxydans s-ardh::Km mutant NSA18的获得：
将含敲除突变载体pSUP202-s-ardh::Km的E.coli JM109作为供体菌用于三亲接合，受体菌为G.oxydans；敲除突变载体在帮助菌pRK2013的帮助下进入G.oxydans，将含Km基因的目标基因片段整合到G.oxydans的染色体上，通过Cefotaxime、Km来筛选三亲接合子。
三亲接合敲除方法为：分别将供体菌E.coli JM109/pSUP202-s-ardh::Km、帮助菌JM109/pRK2013接种在加有25μg/mL卡纳霉素的LB培养基中培养过夜，受体菌G.oxydans接种在G-Ara培养15～20h，A660值为0.6～1.0时进行接合实验；按受体亲本菌∶帮助菌∶供体菌＝3∶1∶3的菌液体积比收集菌体，转移到不加抗生素的固体G-Ara培养基上，倒置30℃培养过夜；用G.oxydans具有的抗性加上重组质粒上带有的抗性，来筛选相应的转化子；将培养过夜的三亲接合菌体用无菌双蒸水从固体G-Ara培养基上洗下，涂到加入5μg/mL头孢噻肟酸和25μg/mL卡纳霉素的G-Ara平板上，培养2～4天，长出接合子进行PCR验证。
一种氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，其特征在于该细菌是缺失s-ArDH基因，且在s-ArDH基因的位置上用XDH基因增强的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)，以下简称XDH基因增强菌。
上述XDH基因增强菌的构建方法，包括如下步骤：
步骤(1)～(7)同s-ArDH缺失菌的构建方法；
(8)引物设计：
根据GenBank公布的Gluconobacter oxydans 621H基因xdh序列为基础设计两对特异引物，引物如下所示：
xdh-fwd：5’-AGGCTCGAGTCGAAGAAGTTTAAG-3’Xho I，
xdh-rev：5’-ATTCTCGAGTCAACCGCCAGCAAT-3’Xho I。
xdh-fwd和xdh-rev引物两端加同样的限制性酶切位点Xho I，下划线部分均为酶切位点。
(9)xdh基因的克隆：
通过PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因组DNA为模板，扩增800bp左右xdh序列。
xdh基因克隆的方法为：采用PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因组DNA为模板，用引物xdh-fwd、xdh-rev进行PCR扩增，PCR反应条件为：10×PCR buffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 5μL，引物xdh-fwd和xdh-rev各2μL，exTaq DNA polymerase 1μL，基因组模板1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL；PCR程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，53.6℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min。
(10)xdh基因增强载体pSUP202-s-ardh::xdh的构建：
将含目标基因的质粒pMD18-xdh用Xho I酶切，胶回收目的片段；载体pSUP202-s-ardh::Km用Xho I酶切后用CIAP去磷酸化；将酶切后的目的片段和去磷酸化后的载体用T4连接酶连接，转化至感受态E.coli JM109中，通过含Amp和Km抗性平板筛选获得含目标基因的重组质粒pSUP202-s-ardh::xdh；
(11)xdh基因增强突变体G.oxydans s-ardh::xdh NSAX31的获得：将含敲除突变载体pSUP202-s-ardh::xdh的E.coli JM109作为供体菌用于三亲接合，受体菌为G.oxydanss-ardh::Km mutant NSA18；敲除突变载体在帮助菌pRK2013的帮助下进入G.oxydansNSA18，将含xdh基因的目标基因片段整合到G.oxydans NSA18的染色体上；通过Cefotaxime、Km来筛选三亲接合子。
三亲接合增强的方法为：将供体菌E.coli JM109/pSUP202-s-ardh::xdh、帮助菌JM109/pRK2013分别接种在加有100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL卡纳霉素的LB培养基中培养过夜，受体菌G.oxydans s-ardh::Km mutant NSA18接种在G-Ara培养15～20h，A660值为0.6～1.0时进行接合实验；按受体亲本菌∶帮助菌∶供体菌＝3∶1∶3的菌液体积比收集菌体，转移到不加抗生素的固体G-Ara培养基上，倒置30℃培养过夜；用G.oxydans具有的抗性加上重组质粒上带有的抗性，来筛选相应的转化子；将培养过夜的三亲接合菌体用无菌双蒸水从固体G-Ara培养基上洗下，涂到加入5μg/mL头孢噻肟酸的G-Ara平板上，培养2～4天，长出接合子进行PCR验证。
有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、本发明成功获得s-ardh基因敲除菌株。s-ardh基因敲除载体pSUP202-s-ardh::Km在帮助菌pRK2013的帮助下进入CGMCC No.2709菌体内，通过同源重组替换掉s-ardh基因，经基因水平筛选和鉴定，成功得到缺失s-ardh基因的G.oxydans菌株，即G.oxydanss-ardh::Km NSA18菌株。该菌株可以阻断D-木酮糖生成D-阿拉伯糖醇的途径，提高木糖醇产率，进而从根本上解决木糖醇生产过程中D-阿拉伯糖醇伴生的问题。
2、本发明成功获得xdh基因增强菌株。xdh基因增强载体pSUP202-s-ardh::xdh在帮助菌pRK2013的帮助下进入CGMCC No.2709 NSA18菌体内，通过同源重组替换掉km基因，经基因水平筛选和鉴定，成功得到xdh增强的CGMCC No.2709菌株，即CGMCC No.2709 s-ardh::xdh NSAX31菌株。该菌株可以用于阻断D-木酮糖生成D-阿拉伯糖醇的途径并加强木糖醇脱氢酶活力，在解决木糖醇生产过程中D-阿拉伯糖醇伴生的问题的同时，极大的提高了木糖醇产率，进而从根本达到木糖醇产品质量和深度开发的目的。
附图说明
图1为G.oxydans s-ardh::Km NSA18菌株构建图谱。基因敲除质粒pSUP202-s-ardh::Km与G.oxydans染色体通过同源重组，获得缺失s-ardh基因的G.oxydans s-ardh::Km NSA18染色体。
图2为G.oxydans s-ardh::xdh NSAX31菌株构建图谱。基因敲除质粒pSUP202-s-ardh::xdh与G.oxydans s-ardh::Km NSA18染色体通过同源重组，获得xdh基因增强的G.oxydans s-ardh::xdh NSAX31染色体。
图3为CGMCCNo.2709基因组DNA为模板PCR扩增约800bp的s-ardh L和s-ardhR基因。泳道M：DL15000 Marker；泳道1、2分别为s-ardh L和s-ardh R基因片段。
图4为以pET28(a+)为模板PCR扩增约900bp的Km基因。泳道M：DL15000 Marker；泳道1为Km基因片段。
图5为重叠PCR扩增约1700bp的KR片段。泳道M：DL2000 Marker；泳道1：KR基因片段。
图6重叠PCR扩增约2500bp的LKR片段。泳道M：DL2000 Marker；泳道1、2：LKR基因片段。
图7为pSUP202-s-ardh::Km的酶切验证图谱。泳道M：DL15000Marker；泳道1、2分别为pSUP202-s-ardh::Km EcoR I单切和EcoR I & Xho I双切。
图8为PCR鉴定s-ardh敲除突变体。泳道M：DL2000 Marker；泳道1为引物s-ardhL-fwd和km-rev的产物，泳道2为引物km-fwd和km-rev的产物。
图9为以CGMCC No.2709基因组DNA为模板PCR扩增约800bp的xdh基因。泳道M：DL2000 Marker；泳道1为xdh基因片段。
图10为pSUP202-s-ardh::xdh的酶切验证图谱。泳道M为DL15000 Marker；泳道1、2为pSUP202-s-ardh::xdh质粒EcoR I单切。
图11为PCR鉴定xdh增强突变体。泳道M为DL15000 Marker；泳道1为引物s-ardhL-fwd和s-ardh R-rev的产物；泳道2为引物s-ardh L-fwd和xdh-rev的产物；泳道3为引物xdh-fwd和s-ardh R-rev的产物。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例所使用的氧化葡萄糖酸杆菌为氧化葡萄糖酸杆菌NH-10(Gluconobacter oxydans NH-10)，其菌种保藏编号CGMCC No.2709。
实施例1：NADP-阿拉伯糖醇脱氢酶基因的敲除载体的构建。
(1)获取s-ardh基因上游s-ardh L和下游s-ardh R及Km基因。
以GenBank公布的Gluconobacter oxydans 621H基因s-ardh序列为基础设计两对引物：
s-ardh L-fwd：5’-TATGAATTCCCTCTTGAAAACCTATCATAGC-3’   EcoR I，
s-ardh L-rev：5’-CTGTTTATGTAAGCCTCGAGAAACTTGAAGTCC-3’ Xho I，
s-ardh R-fwd：5’-AATAAACAAATAGCTCGAGAAAATGGCCGGGAAG-3’Xho I，
s-ardh R-rev：5’-ATGAATTCATGGCGACTGTCGAACTCAAG-3’     EcoR I。
s-ardh L-fwd和s-ardh R-rev引物两端加同样的限制性酶切位点EcoR I及保护碱基。s-ardh L-rev和s-ardh R-fwd引物两端加同样的限制性酶切位点Xho I，下划线部分均为酶切位点。
通过PCR技术，以CGMCC No.2709基因组DNA为模板，以s-ardh L-fwd和s-ardhL-rev、s-ardh R-fwd和s-ardh R-rev为引物分别扩增得到s-ardh基因5’端上游和3’端下游s-ardh L和s-ardh R各800bp左右序列。
s-ardh L基因的PCR反应条件为：10×PCR buffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 5μL，引物s-ardh L-fwd和s-ardh L-rev各2μL，exTaq DNA polymerase 1μL，基因组模板1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL；PCR反应在PCR仪上进行，PCR程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60.5℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min，以双蒸水为阴性对照。(图3)。
s-ardh R基因的PCR反应条件为：10×PCR buffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 5μL，引物s-ardh R-fwd和s-ardh R-rev各2μL，exTaq DNA polymerase 1μL，基因组模板1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL；PCR反应在PCR仪上进行，PCR程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min，以双蒸水为阴性对照。(图3)。
根据GenBank公布的卡纳霉素抗性基因Km序列，设计一对特异性引物km-fwd和km-rev，以pET28a(+)质粒为模板扩增Km的完整CDs：
km-fwd：5’-GGACTTCAAGTTTCTCGAGGCTTACATAAACAG-3’ Xho I，
km-rev：5’-CTTCCCGGCCATTTTCTCGAGCTATTTGTTTATT-3’Xho I，
km-fwd和km-rev引物两端加同样的限制性酶切位点Xho I及保护碱基，下划线部分均为酶切位点，扩增出900bp左右序列。
采用PCR技术，以pET28a(+)质粒为模板，用引物km-fwd、km-rev进行PCR扩增，PCR反应条件为：10×PCR buffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 5μL，引物km-fwd和km-rev各2μL，exTaq DNA polymerase 1μL，基因组模板1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL；PCR反应在PCR仪上进行，PCR程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，61.5℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min，以双蒸水为阴性对照(图4)。
将s-ardh L-fwd和s-ardh L-rev、s-ardh R-fwd和s-ardh R-rev、km-fwd和km-rev三对引物扩增获得相应大小的目的条带分别胶回收纯化备用。
(2)pMD18-KR的构建。
将纯化的s-ardh R和Km片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为1700bp左右的片段KR，即以s-ardh R和Km片段为模板，用引物km-fwd、s-ardh R-rev进行重叠PCR扩增，PCR反应分两步扩增，第一步体系如下：10×PCR buffer 2.5μL，Mg2+2μL，dNTP2μL，s-ardh R片段和Km片段各2μL，exTaq DNA polymerase 0.5μL，加ddH2O至反应总体积为25μL。扩增程序如下：95℃预变性4min；94℃变性55s，65℃退火40s，72℃延伸1min，循环5次；72℃延长2min。第二步在第一步反应基础上再加入：10×PCR buffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 4μL，引物km-fwd和引物s-ardh R-rev各2μL，exTaq DNA polymerase 1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL。扩增程序如下：95℃预变性4min；94℃变性50s，60℃退火40s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min。胶回收纯化1700bp KR片段(图5)，取KR片段4.5μL与pMD18-T 0.5μL和solution I 5μL一同加入一个eppendorf管，混匀后，16℃连接3h，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于含Amp和Km抗性平板上过夜培养，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用EcoR I和Xho I酶切，37℃水浴2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到800bp和900bp条带各一条出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得重组质粒pMD18-KR。
(3)pMD18-LKR的构建
将s-ardh L和KR片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为2500bp左右的片段LKR，即以s-ardh L和KR片段为模板，用引物s-ardh L-fwd、s-ardh R-rev进行重叠PCR扩增，PCR反应分两步扩增，第一步体系如下：10×PCR buffer 2.5μL，Mg2+2μL，dNTP 2μL，s-ardh L片段和KR片段各2μL，exTaq DNA polymerase 0.5μL，加ddH2O至反应总体积为25μL。扩增程序如下：95℃预变性4min；94℃变性55s，65℃退火40s，72℃延伸1min，循环5次；72℃延长2min。第二步在第一步反应基础上再加入：10×PCRbuffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 4μL，引物s-ardh L-fwd和引物s-ardh R-rev各2μL，exTaqDNA polymerase 1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL。扩增程序如下：95℃预变性4min；94℃变性50s，59℃退火40s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min。胶回收纯化2500bp LKR片段(图6)，取LKR片段4.5μL与pMD18-T 0.5μL和solution I5μL一同加入一个eppendorf管，混匀后，16℃连接3h，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于含Amp和Km抗性平板上过夜培养，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用EcoR I单酶切，37℃水浴2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到2500bp条带出现，将酶切鉴定阳性的细菌测序，获得重组质粒pMD18-LKR。
(4)s-ardh基因敲除载体pSUP202-s-ardh::Km的构建
将重组质粒pMD18-LKR用EcoR I酶切；载体pSUP202用EcoR I酶切后用碱性磷酸酶CIAP去磷酸化；分别取LKR片段和载体pSUP202酶切产物各4μL，与T4 DNA连接buffer和T4 DNA连接酶各1μL同时加入一个eppendorf管，混匀后，16℃连接过夜，转化E.coli JM109感受态细胞，在加有适量Amp和Km平板上挑选重组子，菌体电泳挑选条带滞后菌株，再通过EcoR I单酶切和EcoR I & Xho I双酶切验证(图7)。酶切结果表明：EcoR I单酶切重组质粒能够切下约2.5kb大小片段，EcoR I & Xho I双酶切质粒能切下约900bp和800bp大小的片段，与预期结果相符，说明已经将LKR片段连接到了pSUP202载体上，命名为pSUP202-s-ardh::Km。
实施例2：s-ardh基因敲除突变体的获得
将含敲除突变载体pSUP202-s-ardh::Km的E.coli JM109作为供体菌用于三亲接合，受体菌为CGMCC No.2709。敲除突变载体在帮助菌pRK2013的帮助下进入CGMCCNo.2709，将含Km基因的目标基因片段整合到G.oxydans NH-10的染色体上。通过Cefotaxime、Km来筛选三亲接合子。
分别将供体菌E.coli JM109/pSUP202-s-ardh::Km、帮助菌JM109/pRK2013接种在加有卡纳霉素的LB培养基中培养过夜，受体菌G.oxydans接种在G-Ara培养15～20h，A660值为0.6～1.0时进行接合实验；按受体亲本菌∶帮助菌∶供体菌＝3∶1∶3的菌液体积比收集菌体，即受体亲本菌液1.5mL，离心收集菌体，倒掉上清，用生理盐水洗两次后，倒掉液体，加入0.5mL帮助菌液，离心收集菌体后加入1.5mL供体菌，离心收集菌体后用G-Ara洗一次，倒掉液体，在剩下的少量培养基中将细胞用微量移液器混匀，转移到不加抗生素的固体G-Ara培养基上，倒置30℃培养过夜；用G.oxydans具有的抗性加上重组质粒上带有的抗性，来筛选相应的转化子；将培养过夜的三亲接合菌体用无菌双蒸水从固体G-Ara培养基上洗下，涂到加入头孢噻肟酸和卡纳霉素的G-Ara平板上，培养2～4天。
挑取能在含Cefotaxime和Km抗性平板上生长的菌落培养，单菌落培养物离心收集菌体，重悬，加入蛋白酶K，42℃ 2h后，煮沸7min，4℃离心收集上清，即为待检测模板，同时制备CGMCC No.2709的模板上清；用s-ardh L-fwd和km-rev及km-fwd和km-rev引物，分别进行PCR扩增，s-ardh L-fwd和km-rev扩增PCR产物进行测序分析，筛选出重组有Km基因的CGMCC No.2709，经基因水平的鉴定，成功获得s-ardh缺失的CGMCC No.2709菌株，即CGMCC No.2709 s-ardh::Km mutant NSA18菌株(图8)。
实施例3：木糖醇脱氢酶增强载体的构建。
(1)获取xdh基因
以GenBank公布的Gluconobacter oxydans 621H基因xdh序列为基础设计一对特异引物，引物如下所示：
xdh-fwd：5’-AGGCTCGAGTCGAAGAAGTTTAAG-3’Xho I，
xdh-rev：5’-ATTCTCGAGTCAACCGCCAGCAAT-3’Xho I。
通过PCR技术，以CGMCC No.2709菌株基因组DNA为模板，以xdh-fwd和xdh-rev扩增800bp左右xdh序列(图9)。xdh-fwd和xdh-rev引物两端加同样的限制性酶切位点Xho I，下划线部分均为酶切位点。
xdh基因PCR反应条件为：10×PCR buffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 5μL，引物xdh-fwd和xdh-rev各2μL，exTaq DNA polymerase 1μL，基因组模板1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL；PCR反应在PCR仪上进行，PCR程序为：94℃预变性2min、94℃变性30s、53.6℃退火30s、72℃延伸1min，循环30次，72℃延长10min。
将xdh胶回收纯化，取xdh片段4.5μL与pMD18-T0.5μL和solution I 5μL一同加入一个eppendorf管，混匀后，16℃连接3h，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于含Amp抗性平板上过夜培养，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用Xho I酶切，37℃水浴2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到800bp条带出现，将酶切鉴定阳性的细菌测序，获得重组质粒pMD18-xdh。
(2)xdh基因增强载体pSUP202-s-ardh::xdh的构建。
将含目标基因的质粒pMD18-xdh用Xho I酶切，胶回收目的片段；载体pSUP202-s-ardh::Km用Xho I酶切后用碱性磷酸酶CIAP去磷酸化；分别取xdh片段和载体pSUP202-s-ardh::Km酶切产物各4μL，与T4 DNA连接buffer和T4 DNA连接酶各1μL同时加入一个eppendorf管，混匀后，16℃连接过夜，转化E.coli JM109感受态细胞，分别用含Amp和Km抗性平板筛选，筛选能在Amp抗性平板生长而不能在Km抗性平板生长的菌落进行过夜培养，提取质粒，用EcoR I酶切，37℃水浴2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到2500bp条带出现，将酶切鉴定阳性重组质粒命名为pSUP202-s-ardh::xdh(图10)。
实施例4：xdh基因增强突变体CGMCC No.2709 s-ardh::xdh NSAX31的获得。
将含敲除突变载体pSUP202-s-ardh::xdh的E.coli JM109作为供体菌用于三亲接合，受体菌为CGMCC No.2709 s-ardh::Km mutant NSA18。敲除突变载体在帮助菌pRK2013的帮助下进入CGMCC No.2709 NSA18，将含xdh基因的目标基因片段整合到CGMCCNo.2709 NSA18的染色体上。通过Cefotaxime、Km来筛选三亲接合子。
将供体菌E.coli JM109/pSUP202-s-ardh::xdh、帮助菌JM109/pRK2013分别接种在加有氨苄青霉素、卡纳霉素LB培养基中培养过夜，受体菌G.oxydans s-ardh::Km mutantNSA18接种在G-Ara培养15～20h，A660值为0.6～1.0时进行接合实验；按受体亲本菌∶帮助菌∶供体菌＝3∶1∶3的菌液体积比收集菌体，即受体亲本菌液1.5mL，离心收集菌体，倒掉上清，用生理盐水洗两次后，倒掉液体，加入0.5mL帮助菌液，离心收集菌体后加入1.5mL供体菌，离心收集菌体后用G-Ara洗一次，倒掉液体，在剩下的少量培养基中将细胞用微量移液器混匀，转移到不加抗生素的固体G-Ara培养基上，倒置30℃培养过夜；用G.oxydans具有的抗性加上重组质粒上带有的抗性，来筛选相应的转化子；将培养过夜的三亲接合菌体用无菌双蒸水从固体G-Ara培养基上洗下，涂到加入头孢噻肟酸的G-Ara平板上，培养2～4天。
挑取能在含Cefotaxime抗性平板上生长而不能在含Cefotaxime和Km抗性平板上生长的菌落培养，单菌落培养物离心收集菌体，重悬，加入蛋白酶K，42℃ 2h后，煮沸7min，4℃离心收集上清，即为待检测模板，同时制备CGMCC No.2709 s-ardh::Kmmutant NSA18的模板上清；用s-ardh L-fwd和xdh-rev及xdh-fwd和xdh-rev引物，分别进行PCR扩增，s-ardh L-fwd和xdh-rev扩增PCR产物进行测序分析，经基因水平的鉴定，成功获得xdh增强的CGMCC No.2709 s-ardh::Km mutant NSA18菌株，即CGMCCNo.2709 s-ardh::xdh NSAX31菌株(图11)。
实施例5：s-ardh基因敲除突变体转化D-阿拉伯糖醇产木糖醇。
斜面培养基：葡萄糖30g/L，酵母膏10g/L，牛肉膏5g/L，琼脂20g/L。
摇瓶培养基：葡萄糖30g/L，酵母膏25g/L，牛肉膏5g/L，D-阿拉伯糖醇10g/L，KH2PO4 5g/L。
把CGMCC No.2709菌株及突变菌株CGMCC No.2709 s-ardh::Km NSA18在斜面培养基上30℃培养24h，然后接一环此菌于摇瓶培养基中，30℃培养10h，摇瓶转速200r/min。将培养24h的菌体于8000r/min离心10min，并用100mM pH6.0的磷酸钾缓冲液洗涤两次，收集细胞。称取1g离心后的湿细胞加入10mL 30g/L的D-阿拉伯糖醇溶液中(细胞添加量按每100g细胞转化1L 30g/L的D-阿拉伯糖醇溶液计)，在30℃条件下，220rpm下反应9h后，加入5％乙醇30℃下静置反应27h，取样测定底物和产物的量。最终CGMCC No.2709菌株可获得木糖醇14.6g/L，木糖醇对D-ara转化率为48.7％；NSA18菌株可获得木糖醇16.7g/L，木糖醇对D-ara转化率为55.7％(表1)。
表1  s-ardh基因敲除对催化D-阿拉伯糖醇产木糖醇的影响
从表1中可以看出，野生型CGMCC No.2709菌株的转化液在反应终了时，D-阿拉伯糖醇浓度从9h时的1.0g/L上升至13.7g/L，而s-ardh基因敲除菌株的转化液在反应终了时D-阿拉伯糖醇浓度不变，确证筛选到的转化子中s-ardh基因已被破坏和敲除。
实施例6：xdh基因增强突变体转化D-阿拉伯糖醇产木糖醇。
把CGMCC No.2709菌株及增强菌株CGMCC No.2709 s-ardh::xdh NSAX31在斜面培养基上30℃培养24h，然后接一环此菌于摇瓶培养基中，30℃培养10h，摇瓶转速200r/min。将培养24h的菌体于8000r/min离心10min，并用100mM pH6.0的磷酸钾缓冲液洗涤两次，收集细胞。称取1g离心后的湿细胞加入10mL 30g/L的D-阿拉伯糖醇溶液中(细胞添加量按每100g细胞转化1L 30g/L的D-阿拉伯糖醇溶液计)，在30℃条件下，220rpm下反应9h后，加入5％乙醇30℃下静置反应27h，取样测定底物和产物的量。最终NSAX18菌株可获得木糖醇28.7g/L，木糖醇对D(表2)。
表2  s-ardh基因敲除且xdh基因增强对催化D-阿拉伯糖醇产木糖醇的影响
Figure BSA00000146340900141
核苷酸或氨基酸序列
SEQUENCE LISTING
<110>南京工业大学
<120>氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其构建方法
<130>njut20100531
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>s-ardh L-fwd
<400>1
tatgaattcc ctcttgaaaa cctatcatag c                       31
<210>2
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>s-ardh L-rev
<400>2
ctgtttatgt aagcctcgag aaacttgaag tcc                     33
<210>3
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>s-ardh R-fwd
<400>3
aataaacaaa tagctcgaga aaatggccgg gaag                    34
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>s-ardh R-rev
<400>4
atgaattcat ggcgactgtc gaactcaag                          29
<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>km-fwd
<400>5
ggacttcaag tttctcgagg cttacataaa cag                     33
<210>6
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>km-rev
<400>6
cttcccggcc attttctcga gctatttgtt tatt                    34
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>xdh-fwd
<400>7
aggctcgagt cgaagaagtt taag                               24
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>xdh-rev
<400>8
attctcgagt caaccgccag caat                               24

Claims (7)

1.一种氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，其特征在于该细菌是缺失s-ArDH基因的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。
2.权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)引物设计：根据GenBank公布的Gluconobacter oxydans 621H基因为基础设计两对特异引物，引物如下所示：
s-ardh L-fwd：5’-TATGAATTCCCTCTTGAAAACCTATCATAGC-3’   EcoR I，
s-ardh L-rev：5’-CTGTTTATGTAAGCCTCGAGAAACTTGAAGTCC-3’ Xho I，
s-ardh R-fwd：5’-AATAAACAAATAGCTCGAGAAAATGGCCGGGAAG-3’Xho I，
s-ardh R-rev：5’-ATGAATTCATGGCGACTGTCGAACTCAAG-3’     EcoR I；
(2)s-ardh L、s-ardh R基因的克隆：通过PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因组DNA为模板，分别扩增s-ardh L和s-ardh R各800bp序列；
(3)抗性片段Km的获得：根据GenBank公布的卡纳霉素抗性基因Km序列，设计一对特异性引物km-fwd和km-rev，以pET28a(+)质粒为模板扩增Km的完整CDs，引物如下：
km-fwd：5’-GGACTTCAAGTTTCTCGAGGCTTACATAAACAG-3’    Xho I，
km-rev：5’-CTTCCCGGCCATTTTCTCGAGCTATTTGTTTATT-3’   Xho I，
km-fwd和km-rev引物两端加同样的限制性酶切位点Xho I及保护碱基，下划线部分均为酶切位点，扩增出900bp序列；
(4)pMD18-KR的构建：将s-ardh R和Km片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为1700bp的片段KR，与pMD18-T载体连接，转化至感受态E.coli JM109中，通过含Amp和Km抗性平板筛选获得含目标基因的重组质粒pMD18-KR；
(5)pMD18-LKR的构建：将s-ardh L和KR片段通过重叠PCR方法连接，获得大小为2500bp的片段LKR，与pMD18-T载体连接，转化至感受态E.coli JM109中，通过含Amp和Km的LB平板筛选获得含目标基因的重组质粒pMD18-LKR；
(6)s-ardh基因敲除载体pSUP202-s-ardh::Km的构建：将重组质粒pMD18-LKR用EcoR I酶切；载体pSUP202用EcoR I酶切后用CIAP去磷酸化；将酶切后的LKR片段和去磷酸化后的载体pSUP202用T4连接酶连接，转化至感受态E.coli JM109中，通过含Amp和Km的LB平板筛选获得含目标基因的重组质粒pSUP202-s-ardh::Km；
(7)s-ardh基因敲除突变体G.oxydans s-ardh::Km mutant NSA18的获得：将含敲除突变载体pSUP202-s-ardh::Km的E.coli JM109作为供体菌用于三亲接合，受体菌为G.oxydans；敲除突变载体在帮助菌pRK2013的帮助下进入G.oxydans，将含Km基因的目标基因片段整合到G.oxydans的染色体上，通过Cefotaxime、Km来筛选三亲接合子。
3.根据权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤(2)中，
s-ardh L基因克隆的方法为：采用PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因组DNA为模板，用引物s-ardh L-fwd、s-ardh L-rev进行PCR扩增；PCR反应条件为：10×PCRbuffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 5μL，引物s-ardh L-fwd和s-ardh L-rev各2μL，exTaq DNApolymerase 1μL，基因组模板1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL；PCR程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60.5℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min；
s-ardh R基因克隆的方法为：采用PCR技术，以Gluconobacter oxydans菌株基因组DNA为模板，用引物s-ardh R-fwd、s-ardh R-rev进行PCR扩增；PCR反应条件为：10×PCRbuffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 5μL，引物s-ardh R-fwd和s-ardh R-rev各2μL，exTaq DNApolymerase 1μL，基因组模板1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL；PCR程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min。
4.根据权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤(3)中，Km的获得方法为：采用PCR技术，以pET28a(+)质粒为模板，用引物km-fwd、km-rev进行PCR扩增；PCR反应条件为：10×PCR buffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 5μL，引物km-fwd和km-rev各2μL，exTaq DNA polymerase 1μL，基因组模板1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL；PCR程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，61.5℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min。
5.根据权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤(4)中，片段KR的基因克隆方法为：采用PCR技术，以s-ardh R和Km片段为模板，用引物km-fwd、s-ardh R-rev进行重叠PCR扩增；PCR反应分两步扩增；
第一步体系如下：10×PCR buffer 2.5μL，Mg2+2μL，dNTP 2μL，s-ardh R片段和Km片段各2μL，exTaq DNA polymerase 0.5μL，加ddH2O至反应总体积为25μL；扩增程序如下：95℃预变性4min；94℃变性55s，65℃退火40s，72℃延伸1min，循环5次；72℃延长2min；
第二步在第一步PCR产物中加入：10×PCR buffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 4μL，引物km-fwd和引物s-ardh R-rev各2μL，exTaq DNA polymerase 1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL；扩增程序如下：95℃预变性4min；94℃变性50s，60℃退火40s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min。
6.根据权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤(5)中，片段LKR的基因克隆方法为：采用PCR技术，以s-ardh L和KR片段为模板，用引物s-ardh L-fwd、s-ardh R-rev进行重叠PCR扩增，PCR反应分两步扩增；
第一步体系如下：10×PCR buffer 2.5μL，Mg2+2μL，dNTP 2μL，s-ardh L片段和KR片段各2μL，exTaq DNA polymerase 0.5μL，加ddH2O至反应总体积为25μL；扩增程序如下：95℃预变性4min；94℃变性55s，65℃退火40s，72℃延伸1min，循环5次；72℃延长2min；
第二步在第一步PCR产物中加入：10×PCR buffer 5μL，Mg2+2μL，dNTP 4μL，引物s-ardh L-fwd和引物s-ardh R-rev各2μL，exTaq DNA polymerase 1μL，加ddH2O至反应总体积为50μL；扩增程序如下：95℃预变性4min；94℃变性50s，59℃退火40s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延长10min。
7.根据权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤(7)中，三亲接合敲除方法为：分别将供体菌E.coli JM109/pSUP202-s-ardh::Km、帮助菌JM109/pRK2013接种在加有卡纳霉素的LB培养基中培养过夜，受体菌G.oxydans接种在G-Ara培养15～20h，A660值为0.6～1.0时进行接合实验；按受体亲本菌∶帮助菌∶供体菌＝3∶1∶3的菌液体积比收集菌体，转移到不加抗生素的固体G-Ara培养基上，倒置30℃培养过夜；用G.oxydans具有的抗性加上重组质粒上带有的抗性，来筛选相应的转化子；将培养过夜的三亲接合菌体用无菌双蒸水从固体G-Ara培养基上洗下，涂到加入头孢噻肟酸和卡纳霉素的G-Ara平板上，培养2～4天，长出接合子进行PCR验证。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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徐虹等.Gluconobacter oxydans木糖醇脱氢酶基因的克隆表达及木糖醇的转化分析.《中国生物工程杂志》.2009,第29卷(第12期),54-59. *

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