CN102660599B - 一种采用自克隆工程菌发酵生产l-山梨糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用自克隆工程菌发酵生产L-山梨糖的方法，属于采用代谢工程调控策略优化发酵过程技术领域。本发明采用代谢工程的手段，获得自克隆氧化葡萄糖酸杆菌工程菌，以其为生产菌株，通过发酵工艺优化使山梨醇脱氢酶的活性提高了1.33倍；以山梨醇为唯一碳源，发酵36h后，L-山梨糖产量达到225g/L，与出发菌株节相比将发酵时间缩短了12h。本发明通过调控山梨醇脱氢途径，成功实现了山梨醇快速化地导向目标代谢产物山梨糖的目的。为今后利用代谢工程手段改造菌株促进目标产物过量积累提供了一定的借鉴意义。

Description

一种采用自克隆工程菌发酵生产L-山梨糖的方法

技术领域

本发明涉及一种高效发酵生产L-山梨糖的方法，特别是一种采用自克隆工程菌提高细胞膜上山梨醇脱氢酶活性来强化山梨醇氧化脱氢途径，从而调控山梨醇快速化地导向目标代谢产物山梨糖的方法。 

背景技术

L-山梨糖，一种己酮糖，为D-果糖的C-2位和C-3位差向异构体。是工业发酵生产维生素C(VC)的中间体，目前工业上主要用“莱氏法”和“两步发酵法”生产VC，二法初始均经发酵将D-山梨醇转化为L-山梨糖。其中，以D-山梨醇为底物的发酵工艺是唯一用于工业生产的方法，但是现有技术发酵周期长，导致生产成本高、产品质量不易控制。 

国内外关于微生物发酵法生产L-山梨糖的研究主要集中于对发酵条件的优化和控制，但是简单的发酵优化并不能很好地缩短发酵周期等，代谢工程作为一种理性的菌种改造方法能够更加有效地实现目标产物的高产。虽然，目前采用代谢工程手段来强化L-山梨糖积累的研究鲜有报道，但是鉴于山梨醇脱氢酶(sldh)是GluconobacteroxydansATCC621H将D-山梨醇转化为山梨糖的关键酶，强化这一途径，应该能够使D-山梨醇高效脱氢氧化为L-山梨糖，从而成为进一步强化G.oxydans621H生产山梨糖时表现的有效策略。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种采用自克隆工程菌高效发酵生产L-山梨糖的方法，其通过过量表达山梨醇脱氢酶基因，强化山梨醇氧化脱氢的代谢途径，实现L-山梨糖的过量积累。 

以下是本发明技术方案的详细描述。 

目的基因sldh扩增与表达质粒的构建 

根据Genbank:NC_006677.1所示山梨醇脱氢酶基因，通过化学全合成方法获得山梨醇脱氢酶基因，再酶切连接到到含卡那霉素(Kan)抗性标记基因的质粒pBBR1MCS-2(Fournew derivativesofthebroad-host-rangecloningvectorpBBR1MCS,carryingdifferent antibiotic-resistancecassettes)，得到表达载体pBBR1MCS-2-sldh。 

过量表达sldh的G.Oxydans621H重组菌的筛选 

将重组质粒pBBR1MCS-2-sldh经电激法转化G.oxydansATCC621H感受态细胞，将能 

在山梨醇培养基+Ceporex+Kan平板上生长的菌落，在山梨醇+Ceporex+Kan平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子若干提基因组，利用引物sldh-F和sldh-R进行PCR验证，得到大约9.2kb的片段，表明sld基因已成功整合到G.oxydans ATCC 621H基因组中，所得重组菌命名为G.oxydans 621H-sldh。该菌在以山梨醇为唯一碳源的培养基上生长时，山梨醇脱氢酶活性有了显著提高，是出发菌株的1.33倍。 

微生物菌株的种子培养与发酵： 

种子培养基：山梨醇150g，酵母膏6g，CaCO₃ 2g，pH 4.8-5.1，自来水定容至1L。 

发酵培养基：山梨醇250g，酵母膏2g，CaCO₃ 2g，pH 4.8-5.1，自来水定容至1L。 

种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为115-121°C，15min。 

将实验菌株接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，温度为30°C，转速200rpm，培养时间为20-24h。 

按15%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，500mL锥形瓶中发酵培养基为50mL，30°C、200rpm条件下每批培养36h。 

细胞干重的测定：取一定量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加2mL盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，加入去离子水定容至10mL，摇匀，用UV 7500型可见分光光度计，于600nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。 

D-山梨醇与L-山梨糖浓度的测定：高效液相色谱(HPLC) 

仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)。 

色谱柱：Aminex HPX-87H(Bio-Rad)； 

流动相：0.005mol/L H₂SO₄； 

流速：0.6mL/min； 

柱温：35°C； 

进样量：5μL； 

检测器为示差折光检测器。 

样品制备：500μL发酵液在8000rpm下离心10min，取上清液250μL移入5mL容量瓶中，超纯水定容至刻度线，经0.22μm滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。 

本发明提供的自克隆工程菌能以山梨醇唯一碳源，过量积累L-山梨糖。在发酵36h后，与出发菌株节相比将发酵时间缩短了12h。这一调节微生物细胞中山梨醇脱氢途径，促进代谢流快速流向代谢产物，实现代谢产物过量积累的策略，为工业生物技术特别是采用代谢工程手段改造菌株来提高目的产物的生成提供了新的技术思路。 

具体实施方式

实施例1 重组菌G.oxydans 621H-sldh的构建及鉴定 

通过化学全合成法合成sldh基因，并将其克隆到表达载体ppBBR1MCS-2。构建好的重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明重组质粒构建正确。将重组质粒ppBBR1MCS-2-sldh利用电激法转化G.oxydans 621H感受态细胞，将能在山梨醇培养基+Ceporex+Kan平板上生长的菌落，在山梨醇+Ceporex+Kan平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子若干提基因组，进行PCR验证，得到大约9.2kb的片段，表明sldh基因已成功整合到G.oxydans 621H基因组中。所得重组菌命名为G.oxydans621H-sldh。该菌在以山梨醇为唯一碳源的培养基上生长时，山梨醇脱氢酶活性显著提高，是出发菌株的1.33倍。 

其中： 

山梨醇培养基： 

山梨醇150g，酵母膏6g，CaCO₃ 2g，pH 4.8-5.1，固体培养基添加20g琼脂。 

山梨醇+Ceporex+Kan平板 

山梨醇培养基+100mg头孢霉素+100mg卡那霉素，固体培养基添加20g琼脂。 

实施例2 重组菌G.oxydans 621H-sldh底物浓度的优化 

根据G.oxydans 621H-sldh的培养特性，以不同初始浓度的山梨醇为碳源进行发酵实验，并相互比较，根据实验结果和原料成本综合考虑，当山梨醇添加量为250g/L时，山梨糖的生产强度最高，工艺的经济指标最优，此时山梨糖的产量达225g/L。 

实施例3 山梨醇为唯一碳源时重组菌与对照菌发酵特性的比较 

以山梨醇为唯一碳源，发酵36h后，重组菌和对照菌相比：(1)重组菌中山梨醇脱氢酶的活性提高了1.33倍；(2)以山梨醇为唯一碳源，发酵36h后，L-山梨糖产量达到225g/L，与出发菌株节相比将发酵时间缩短了12h。过量表达sldh基因有效地加快了山梨醇脱氢步骤的速度，使L-山梨糖快速生成并过量积累。 

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。 

Claims (3)

1.一种采用自克隆工程菌发酵生产L-山梨糖的方法，其特征在于以氧化葡萄糖酸杆菌工程菌为生产菌株，接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，于30°C、200rpm条件下培养20-24h；按15%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，30°C，200rpm条件下培养36h；所述氧化葡萄糖酸杆菌工程菌过量表达外源山梨醇脱氢酶基因，其构建方法为：通过化学全合成方法获得Genbank:NC_006677.1所示山梨醇脱氢酶基因，克隆到表达载体pBBR1MCS-2，进一步转化氧化葡萄糖酸杆菌获得自克隆基因工程菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于种子培养基组成为：山梨醇150g，酵母膏6g，CaCO₃2g，pH4.8-5.1，自来水定容至1L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于发酵培养基组成为：山梨醇250g，酵母膏2g，CaCO₃2g，pH4.8-5.1，自来水定容至1L。