CN102250821B - 一种改造大肠杆菌产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法 - Google Patents

一种改造大肠杆菌产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102250821B
CN102250821B CN 201110146020 CN201110146020A CN102250821B CN 102250821 B CN102250821 B CN 102250821B CN 201110146020 CN201110146020 CN 201110146020 CN 201110146020 A CN201110146020 A CN 201110146020A CN 102250821 B CN102250821 B CN 102250821B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
klg
sdh
sndh
escherichia coli
Prior art date
Application number
CN 201110146020
Other languages
English (en)
Other versions
CN102250821A (zh
Inventor
陈坚
高丽丽
周景文
堵国成
Original Assignee
江南大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 江南大学 filed Critical 江南大学
Priority to CN 201110146020 priority Critical patent/CN102250821B/zh
Publication of CN102250821A publication Critical patent/CN102250821A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102250821B publication Critical patent/CN102250821B/zh

Links

Abstract

本发明公开了一种改造大肠杆菌产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法,属于遗传工程领域。本发明通过基因工程技术,将来源于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的山梨醇脱氢酶(SLDH)、辅酶吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)基因簇和来源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)的山梨糖脱氢酶(SDH)/山梨酮脱氢酶(SNDH)基因表达于大肠杆菌(Escherichia coli)中,获得了一株利用山梨醇生产2-KLG的E.coli工程菌。目前国内维生素C工业化生产所采用的二步发酵过程工艺复杂,影响因素较多,难以精确控制,同时3种微生物生长消耗了大量的原材料和能源,采用E.coli工程菌利用山梨醇进行发酵生产2-KLG,简化了生产工艺,节约了原材料和能源,2-KLG的产量可达87g/L,具有很好的应用前景。

Description

ー种改造大肠杆菌产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种高产2-KLG的大肠杆菌工程菌及其构建方法,采用分子手段引入SLDH、SDH/SNDH和辅酶PQQ,从而实现代谢山梨糖生产2-KLG,属于遗传工程领域。
背景技术
[0002] 维生素C是ー种重要的有机酸,广泛应用于制药、食品、饮料、化妆品和饲料等エ业中,2-KLG是合成维生素C的重要前体。目前国内维生素Cエ业化生产采用ニ步发酵法,以D-山梨醇为底物的ニ步发酵法是研究得最早、也是研究得最多最深入的生产方法。在这ー过程中,氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)转化D-山梨醇为L-山梨糖,L-山梨糖转变为2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid, 2-KLG)的过程是由一个混菌系统完成的,这ー混菌发酵系统由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium,俗称大菌)和普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare,俗称小菌)组成,其中K.vulgare为产酸菌,单独培养时生长微弱,产酸较少;B.megaterium为伴生菌,不产酸,但促进K.vulgare生长或产酸。尽管目前国内维生素Cエ业化生产所采用的ニ步发酵エ艺具有生产周期短、成本低廉等优点,但同时也存在一些问题,如:(I)能耗物耗较高、成本高;(2)废气、废水和废渣三废排放量大;(3)エ艺复 杂、产品创新品种较少等,制约了维生素C产业的进ー步发展。如何简化发酵エ艺是ー个迫切需要解决的问题。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种高产2-KLG的E.coli工程菌。
[0004] 所述工程菌含有sldh、sdh/sndh、pqq基因。
[0005]所述 sldh、sdh/sndh、pqq 基因核苷酸序列分别如 SEQ ID N0.1,SEQ ID N0.2, SEQID N0.3 所示。
[0006] 所述sldh、sdh/sndh、pqq基因克隆于pET28a(+)表达质粒上。
[0007] 本发明要解决的另一个技术问题是提供一种高产2-KLG的E.coli基因工程菌的构建方法。
[0008] 为解决上述技术问题,本发明的具体方案为:
[0009] I)分别设计引物克隆 Gluconobacter oxydans ATCC 621H 的 sldh 基因和 pqq 基因;根据本实验室对K.vulgare DSM4205的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh基因序列设计引物克隆sdh/sndh基因;
[0010] 2)将sldh、sdh/sndh、pqq基因与载体连接得到重组表达载体;
[0011] 3)将得到的重组表达载体转化大肠杆菌(Escherichia coli)后得到重组菌株。
[0012] 本发明要解决的另一个技术问题是提供ー种发酵生产2-KLG的方法,工程菌种子培养后,按10%比例接种5L发酵罐,发酵16h后,流加量碳源2.5g/L.h,发酵參数:转速500rpm, pH 5.1〜5.4,通气量1.5vvm,控制罐温30°C,罐压0.05MPa,发酵罐溶氧反弹到20% -30%时添加IPTG至终浓度0.5mM。
[0013] 种子和斜面培养基(g/L):酵母膏5,蛋白胨10,氯化钠10 ;琼脂20(斜面培养基),pH 7.0,121°C灭菌15min,卡那霉素终浓度50 u g/mL0
[0014] 发酵培养基(g/L):山梨糖80,蛋白胨12,酵母提取物24,甘油4ml,磷酸ニ氢钾
2.31,磷酸氢ニ钾12.54,pH 7.0,121°C灭菌15min,卡那霉素终浓度50 u g/mL, IPTG终浓度0.5mM。
[0015] 山梨醇、2-KLG含量测定:液相色谱(LC)
[0016] 发酵样品用流动相十倍稀释,0.45 ii m滤膜过滤。Agilent 1100 system, RioRad公司Aminex HPX-87H色谱柱;流动相:2.75 u mol/L浓硫酸;柱温:35°C;流速:0.6mL/min ;进样量:5 y L ;检测器:示差折光检测器。
[0017] 本发明通过基因工程改造,将来源于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)的sldh和pqq基因簇及来源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigeniumvulgare)的sdh/sndh基因表达于大肠杆菌(Escherichia coli)中,获得了一株利用山梨醇生产2-KLG的E.coli工程菌。采用E.coli工程菌利用山梨醇发酵生产2-KLGエ艺简单,2-KLG的产量可达87g/L,具有很好的应用前景。本发明提供的构建方法简单,适于标准化。
具体实施方式
[0018] 实施例1表达载体的构建
[0019]设计引物 Pl:5’ GGAATTCCATATGATGAAACCGACTTCGCTGCTTTGGGC3’ ;P2:5’ CCCAAGCTITTAITGCGGCAGGGCGAAGA·CGTAGA3’,克隆 K.vulgare DSM4205 的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh基因序列扩增后克隆到质粒pET28a(+)上,构建表达载体pET28a_sdh/sndh,将构建好的表达载体转化转化E.coli JM109后,挑选转化子,提取质粒并经HindIII及NdeI酶切后,出现1740bp的条带,证明已经成功构建表达载体pET28a_sdh/sndh ;设计引物P3:5’ CCCAAGCTTATGCCGAATACTTATGGCAGCAGAACCC3’ P4:5’ ATAAGAATGCGGCCGCTCAGCCCTTGTGATCAGGCAGTGC3’,克隆 Gluconobacter oxydans ATCC 621H sldh 基因序列扩增后克隆到pET28a(+) -sdh/sndh上,转化E.coli JMl09,挑选转化子,提取质粒并经HindIII及NotI酶切后,出现2612bp的条带,证明已经成功构建表达载体pET28a-sdh/sndh_sldh ;设计引物 P5:5,ATAAGAATGCGGCCGCATGGCCTGGAACACACCG3,;P6:5,CCGCTCGAGTTACGTATAACGCCTGTAGAAC3’,克隆Gluconobacter oxydans ATCC 621H pqq基因序列扩增后克隆到 pET28a_sdh/sndh-sldh上,转化E.coli JM109,挑选转化子,提取质粒并经NotI及XhoI酶切后,出现3187bp的条带,证明已经成功构建表达载体pET28a (+) -sdh/sndh_sldh-pqq。
[0020] 实施例2E.coli工程菌的构建
[0021]将最后构建好的表达载体pET28a(+)-sdh/sndh-sldh-pqq转化E.coli JM109。由于重组质粒上带有卡那霉素抗性基因,转化E.coli JM109感受态,涂布到含有卡那霉素的LB (酵母膏5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl 10g/L,固体培养基加20g/L琼脂,调节pH 7.0,121。。灭菌15min),挑取转化后平板上正常生长的转化子,提取质粒PCR验证,分别出现1740bp,2612bp, 3187bp的条带,对照未能PCR同样条带,证明成功转化到E.coli中,再将提取的质粒转化 E.coli BL21,得到 E.col1-pET28a-sdh/sndh-sldh-pqq 工程菌。
[0022] 实施例3发酵生产2-KLG[0023] 种子和斜面培养基(g/L):酵母膏5,蛋白胨10,NaCl 10 ;琼脂20 (斜面培养基),pH 7.0,121°C灭菌15min,卡那霉素终浓度50 y g/mL。
[0024] 发酵培养基(g/L):山梨糖80,蛋白胨12,酵母提取物24,甘油4ml,磷酸ニ氢钾
2.31,磷酸氢ニ钾12.54,pH 7.0,121°C灭菌15min,卡那霉素终浓度50 u g/mL, IPTG终浓度0.5mM。
[0025] 培养条件:从斜面中接种重组菌于20mL的种子培养基中,接种菌龄12h,接种量10%,装液量10%;诱导前菌体0D600值0.6,添加IPTG至终浓度0.5mM,于30°C、220rpm进行摇瓶发酵,发酵周期48h。摇瓶2-KLG产量为56g/L。
[0026] 实施例4发酵生产2-KLG
[0027] 5L发酵罐发酵16h后流加山梨醇2.5g/L.h,发酵參数:转速500rpm,pH7.0,通气量1.5vvm,控制罐温30°C,罐压0.05MPa,发酵罐溶氧反弹到20% -30%时添加IPTG至终浓度0.5mM。发酵结束后2-KLG产量达到87g/L。
[0028] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (1)

1.ー种构建高产2-KLG的大肠杆菌基因工程菌的方法,其特征在于包括如下步骤: 1)分别设计引物克隆氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)ATCC621H中sldh基因和pqq基因;根据本实验室对普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)DSM4205的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh基因序列设计引物克隆sdh/sndh基因; 2)将sldh、sdh/sndh、pqq基因与载体pET28a(+)连接得到重组表达载体; 3)将得到的重组表达载体转化大肠杆菌(Escherichia coli )后得到重组菌株;所述sdh/sndh基因核苷酸序列如 SEQ ID N0.2所示。
CN 201110146020 2011-06-01 2011-06-01 一种改造大肠杆菌产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法 CN102250821B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110146020 CN102250821B (zh) 2011-06-01 2011-06-01 一种改造大肠杆菌产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110146020 CN102250821B (zh) 2011-06-01 2011-06-01 一种改造大肠杆菌产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102250821A CN102250821A (zh) 2011-11-23
CN102250821B true CN102250821B (zh) 2013-10-16

Family

ID=44978393

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201110146020 CN102250821B (zh) 2011-06-01 2011-06-01 一种改造大肠杆菌产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102250821B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102653767A (zh) * 2012-05-26 2012-09-05 江南大学 一种新型l-山梨糖/l-山梨酮脱氢酶的基因及其应用
CN103484417B (zh) * 2013-10-08 2015-06-24 江南大学 一种提高生产2-klg发酵产量的葡萄糖酸杆菌及其应用
CN103484418A (zh) * 2013-10-08 2014-01-01 江南大学 一种生产2-klg的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其应用
CN105255960B (zh) * 2015-11-06 2016-09-21 郑州轻工业学院 一种添加人工合成的前体物制备吡咯喹啉醌的方法
CN109234350A (zh) * 2018-11-15 2019-01-18 江南大学 一种发酵生产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6197562B1 (en) * 1993-03-08 2001-03-06 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. L-sorbose dehydrogenase and novel L-sorbosone dehydrogenase obtained from gluconobacter oxydans T-100
CN1351665A (zh) * 1999-03-17 2002-05-29 藤泽药品工业株式会社 山梨糖醇脱氢酶、其编码基因及它们的用途
CN1354794A (zh) * 1999-04-22 2002-06-19 韩国生物科学和生物工艺学研究院 弱氧化葡糖杆菌山梨糖醇脱氢酶、基因及其使用方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6197562B1 (en) * 1993-03-08 2001-03-06 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. L-sorbose dehydrogenase and novel L-sorbosone dehydrogenase obtained from gluconobacter oxydans T-100
CN1351665A (zh) * 1999-03-17 2002-05-29 藤泽药品工业株式会社 山梨糖醇脱氢酶、其编码基因及它们的用途
CN1354794A (zh) * 1999-04-22 2002-06-19 韩国生物科学和生物工艺学研究院 弱氧化葡糖杆菌山梨糖醇脱氢酶、基因及其使用方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Shibata T."Metabolic engineering study on the direct fermentation of 2-keto-L-gulonic acid, a key intermediate of L-ascorbic acid in Pseudomonas putida IFO3738.".《J Biosci Bioeng. 》.2000,第90卷(第2期),
Tomiyama,N.."登录号AB092515.1".《Genbank》.2006,
Yang,X.P.."登录号EF493853.1".《Genbank》.2007,
谢莉."普通生酮基古龙酸菌S2基因文库的构建和筛选".《河北师范大学学(自然科学版)》.2008,第32卷(第1期),
谢莉."普通生酮基古龙酸菌S2基因文库的构建和筛选".《河北师范大学学(自然科学版)》.2008,第32卷(第1期), *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102250821A (zh) 2011-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102317463B (zh) 厌氧微生物发酵生产丁二醇
Limtong et al. Production of fuel ethanol at high temperature from sugar cane juice by a newly isolated Kluyveromyces marxianus
Basak et al. Photofermentative hydrogen production using purple non-sulfur bacteria Rhodobacter sphaeroides OU 001 in an annular photobioreactor: a case study
KR100878050B1 (ko) 피루베이트를 생산하는 효모 균주
KR100267505B1 (ko) 형질전환 대장균 ss373 및 이를 이용한 숙신산의생산방법
Keskin et al. Photofermentative hydrogen production from wastes
Abo-Hashesh et al. Single stage photofermentative hydrogen production from glucose: an attractive alternative to two stage photofermentation or co-culture approaches
Biebl et al. Glycerol conversion to 1, 3-propanediol by newly isolated clostridia
US8129157B2 (en) Anaerobic fermentation of glycerol
Xu et al. Continuous ethanol production using self-flocculating yeast in a cascade of fermentors
CN101693896B (zh) 醛脱氢酶基因
US20070042476A1 (en) Novel gene encoding malic enzyme and method for preparing succinic acid using the same
Kwon et al. Increase of xylitol productivity by cell-recycle fermentation of Candida tropicalis using submerged membrane bioreactor
CN102741417B (zh) 醇的制备方法
Gungormusler et al. Continuous production of 1, 3-propanediol using raw glycerol with immobilized Clostridium beijerinckii NRRL B-593 in comparison to suspended culture
CN104774790B (zh) 一种高效发酵生产l-丙氨酸的大肠杆菌
Sun et al. Advances in bioconversion of glycerol to 1, 3-propanediol: prospects and challenges
Chen et al. Stoichiometric analysis and experimental investigation of glycerol bioconversion to 1, 3-propanediol by Klebsiella pneumoniae under microaerobic conditions
AU2011283282C1 (en) Novel bacteria and methods of use thereof
AU2003292106B2 (en) Metabolically engineered micro-organisms having reduced production of undesired metabolic products
Chookaew et al. Fermentative production of hydrogen and soluble metabolites from crude glycerol of biodiesel plant by the newly isolated thermotolerant Klebsiella pneumoniae TR17
Reimann et al. Production of 1, 3-propanediol by Clostridium butyricum DSM 5431 and product tolerant mutants in fedbatch culture: Feeding strategy for glycerol and ammonium
JP5895004B2 (ja) 組み換え大腸菌及び5−アミノレブリン酸の生産におけるその応用
Biebl Fermentation of glycerol by Clostridium pasteurianum—batch and continuous culture studies
Özkan et al. Photofermentative hydrogen production using dark fermentation effluent of sugar beet thick juice in outdoor conditions

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
C06 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C10 Entry into substantive examination
GR01 Patent grant
C14 Grant of patent or utility model
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: 214122 Jiangsu city of Wuxi Province District Liangxi No. 898 South Road 7 layer beam Creek area of food science and Technology Park

Patentee after: Jiangnan University

Address before: 1800 No. 214122 Jiangsu city of Wuxi Province Li Lake Avenue

Patentee before: Jiangnan University

CP02 Change in the address of a patent holder